BR112020022519A2 - usos e métodos terapêuticos - Google Patents

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BR112020022519A2
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George Tachas
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Antisense Therapeutics Ltd
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Abstract

“usos e métodos terapêuticos''. um método de tratamento de distrofia muscular em um indivíduo ou para melhorar a função muscular ou retardar o declínio na função muscular em um indivíduo com distrofia muscular compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo anti-sentido para vla-4 por um tempo e sob condições suficientes para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de distrofia muscular ou de miofibras distróficas ou para retardar a progressão de distrofia muscular em um indivíduo. em uma modalidade, o método emprega uma dose baixa inferior a cerca de 50 mg/dose de oligonucleotídeo anti-sentido. em uma modalidade, o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido é usado como terapia adjunta ao tratamento de corticosteroides de indivíduos com distrofia muscular tal como dmd.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para: “USOS E MÉTODOS TERAPÊUTICOS” Campo
[001] A presente especificação permite composições e métodos para o tratamento de distúrbios musculares, como distrofia muscular.
Fundamentos
[002] Os detalhes bibliográficos das referências na especificação do assunto também estão listados no final da especificação.
[003] A referência a qualquer técnica anterior nesta especificação não é, e não deve ser tomada como reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que esta técnica anterior faz parte do conhecimento geral comum em qualquer país.
[004] A Distrofia Muscular (DM) é um grupo de doenças caracterizadas por fraqueza progressiva e perda de tecido muscular específico (mionecrose) e substituição dos músculos esqueléticos por tecido fibroso, ósseo ou gorduroso. Existem várias formas diferentes de distrofia muscular que afetam homens ou mulheres, muitas das quais aparecem durante a infância até a meia-idade ou mais tarde.
A forma e a gravidade variam com a idade de início em particular, com indivíduos mais jovens frequentemente apresentando doença progressiva aguda.
[005] As formas mais comuns de DM são distrofia muscular de Duchene (DMD), distrofia muscular de cintura dos membros (LGMD), distrofia muscular de Becker (BMD), distrofia muscular congênita (DMC incluindo DM congênito do tipo Fukuyama e DM congênito com deficiência de miosina, fascioescapulo-humeral, oculofingeal, Emery-Dreifuss e formas distais. Quase todos os tipos de DM surgem de mutações de um único gene.
[006] DMD e BMD envolvem um defeito no gene da distrofina no cromossomo X. A proteína distrofina serve para ligar a maquinaria contrátil (filamentos de actina) da célula muscular (sarcômeros) e o citoesqueleto com a matriz extracelular (ECM) onde os colágenos transmitem a força muscular (Grounds MD, 2008). O ECM é conhecido por desempenhar um papel complexo na função muscular e na regeneração muscular. As miofibras distróficas estão associadas a necrose, inflamação e fibrose. A sequência precisa de eventos que levam à doença progressiva como resultado da deficiência de distrofina não é compreendida no nível molecular. Crianças com DMD têm músculos deficientes em distrofina e são suscetíveis à lesão induzida por contração nos músculos que ativa o sistema imunológico que agrava o dano muscular, conforme resumido em uma publicação do Direct of the FDA CDER (Rosen et al, 2015). A deterioração contínua da força muscular afeta os membros inferiores, levando à mobilidade prejudicada, e, também afeta os membros superiores, levando a uma maior perda de função e capacidade de autocuidado. Embora a terapia genética e abordagens de salto de éxon sejam ideais, os pesquisadores também estão focados em compreender a natureza da doença, a fim de desenvolver estratégias e agentes capazes de amenizar sua gravidade e retardar sua progressão. O modelo de camundongo mdx é amplamente utilizado para investigar mecanismos e intervenções pré-clínicas. Grounds MD, 2008, identificou a necessidade de uma abordagem em dois níveis para atingir as fases crônica e aguda da doença em camundongos mdx.
[007] DMD é uma condição devastadora que afeta principalmente meninos com uma incidência de cerca de 1:3.500 nascidos vivos. Meninos podem perder a capacidade de andar muito cedo e ficar presos à cadeira de rodas, normalmente após a pubescência, e a morte frequentemente por comprometimento cardiopulmonar ocorre frequentemente na terceira década de vida. A BMD é semelhante à DMD, mas muito mais branda.
[008] Os tratamentos atuais com corticosteroides têm como objetivo reduzir a gravidade da doença, reduzindo a inflamação para manter a massa muscular e a função por um período. Os corticosteroides têm um efeito anti- inflamatório agudo que pode ser de curto prazo e seu mecanismo de ação não é conhecido. Eles não são ideais porque os efeitos colaterais limitam severamente seu uso e podem causar atrofia. Prednisolona a 0,75mg/kg/dia e Deflazacorte 0,9mg/kg/dia são terapias padrão para pacientes com DMD ambulantes, mas quando os meninos se tornam não ambulantes, não há consenso quanto aos benefícios da SC, e os meninos podem permanecer em tratamento, às vezes dose fixa que estavam tomando quando perderam a deambulação, que é uma dose reduzida em mg/kg/dia, ou eles podem sair do tratamento de SC.
Edasalonexent é um medicamento anti-inflamatório NF-kappa B em desenvolvimento como monoterapia em meninos ambulatoriais com DMD. Existem vários medicamentos em ensaios clínicos que visam os diferentes aspectos da distrofia. Edasalonexent é um medicamento anti-inflamatório NF-kappa B em desenvolvimento como monoterapia em meninos ambulatoriais com DMD. Existem vários medicamentos em ensaios clínicos que visam os diferentes aspectos da distrofia. Por exemplo, o Tamoxifeno tem como alvo a fibrose, a função respiratória da Idebenona e o Atalureno para interromper o salto do códon estão em testes clínicos para DM. A terapia com oligonucleotídeos para DMD induzindo o salto direcionado do éxon do gene da distrofina foi avaliada com resultados mistos. Eteplirsen, um oligonucleotídeo morfolino progrediu para um estudo confirmatório em 13% das crianças com DMD com uma mutação genética no códon de parada no éxon 51 passível de salto do éxon 51, enquanto o Drisapersen, um oligonucleotídeo 2'-O- metil fosforotioato para o salto do éxon 51 não conseguiu atingir a atividade e a aprovação do FDA.
[009] Essas deficiências na terapia atual sugerem a necessidade de abordagens terapêuticas adicionais.
Sumário
[0010] Ao longo desta especificação, a palavra "compreende", ou variações como "compreende" ou "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.
[0011] Conforme usado neste relatório descritivo, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem aspectos plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma composição" inclui uma única composição, bem como duas ou mais composições; a referência a "um agente" inclui um agente, bem como dois ou mais agentes; a referência à "divulgação" inclui aspectos únicos e múltiplos da divulgação e assim por diante.
[0012] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece métodos para o tratamento de distrofia muscular em um indivíduo, compreendendo a administração de um oligonucleotídeo inibitório ao CD49d humano (a cadeia alfa 4 de VLA-4).
[0013] Em uma modalidade, os oligonucleotídeos inibitórios exemplares incluem RNA ou DNA anti-sentido isolado ou sintético, siRNA ou siDNA, miRNA, miméticos de miRNA, shRNA ou DNA e DNA anti-sentido ou RNA ou DNA: híbridos de RNA.
[0014] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método de tratamento de distrofia muscular em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo a administração periódica ao indivíduo de uma composição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo compreendendo a estrutura: 5' - MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC AMeUMeU MeCMeU - 3' em que, a) cada uma das 19 ligações internucleotídicas do oligonucleotídeo é um diéster de fosforotioato ligado à O,O; b) os nucleotídeos nas posições 1 a 3 da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados com 2'-O-(2- metoxietil); c) os nucleotídeos nas posições 4 a 12 da extremidade
5' são 2'-desoxirribonucleosídeos; d) os nucleotídeos nas posições 13 a 20 da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados com 2'-O-(2- metoxietil); e, e) todas as citosinas são 5-metilcitosinas (MeC), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0015] Em uma modalidade, a administração é por um tempo e sob condições suficientes para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de distrofia muscular ou para atrasar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo.
[0016] Em uma modalidade, a administração é em combinação com o tratamento com corticosteroides padrão.
[0017] Em uma modalidade, o corticosteroide é administrado em uma dose baixa. A referência a um corticosteroide de baixa dose inclui 2/3, 1/2, 1/4 e 1/3 da dose padrão.
[0018] Em uma modalidade, a administração de oligonucleotídeo anti-sentido é terapeuticamente eficaz na presença de uma dose padrão ou baixa de corticosteroide.
[0019] Em uma modalidade, a administração de oligonucleotídeo anti-sentido é terapeuticamente eficaz na ausência de corticosteroide.
[0020] Em uma modalidade, a administração de oligonucleotídeo anti-sentido é terapeuticamente eficaz na ausência de corticosteroide e em que o indivíduo é ambulante.
[0021] Em uma modalidade, a administração de oligonucleotídeo anti-sentido é terapeuticamente eficaz na ausência de corticosteroide e em que o indivíduo não é ambulante.
[0022] Em outra modalidade, a descrição permite um método para melhorar a função muscular ou retardar o declínio da função muscular em um indivíduo com distrofia muscular, o método compreendendo a administração periódica ao indivíduo de uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo compreendendo a estrutura: 5' - MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC AMeUMeU MeCMeU - 3' em que, a) cada uma das 19 ligações internucleotídicas do oligonucleotídeo é um diéster de fosforotioato ligado à O,O; b) os nucleotídeos nas posições 1 a 3 da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados com 2'-O-(2- metoxietil); c) os nucleotídeos nas posições 4 a 12 da extremidade 5' são 2'-desoxirribonucleosídeos; d) os nucleotídeos nas posições 13 a 20 da extremidade
5' são ribonucleosídeos modificados com 2'-O- (2- metoxietil); e) todas as citosinas são 5-metilcitosinas (MeC), ou um sal ou estereoisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, por um tempo e sob condições suficientes para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de miofibras distróficas ou para retardar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo.
[0023] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo é um híbrido RNA-DNA.
[0024] Em uma modalidade, o indivíduo não é ambulatorial devido ao MD.
[0025] Em uma modalidade, o indivíduo é pós- pubescente.
[0026] Em uma modalidade, o método inclui o monitoramento dos níveis de células T CD4+ e/ou CD8+. Em uma modalidade, o método inclui o monitoramento de níveis reduzidos de células T CD4+ e/ou CD8+. Em uma modalidade, o método inclui o monitoramento de macrófagos M1 ou monócitos HLADR+. Em uma modalidade, o método inclui o monitoramento de macrófagos M1 ou monócitos HLADR+ reduzidos.
[0027] Em uma modalidade, o método compreende determinar o nível ou presença de um ou mais marcadores de MD ou miofibras distróficas incluem o nível ou número de células imunes ou fatores imunomoduladores produzidos desse modo, o nível de marcadores inflamatórios ou o nível de marcadores de fibrose ou nível de marcadores de condição muscular.
[0028] Em uma modalidade, um ou mais marcadores de MD ou progressão de MD ou miofibras distróficas incluem o nível ou número de células imunes ou fatores imunomoduladores produzidos, o nível de marcadores inflamatórios ou o nível de marcadores de fibrose ou o nível de marcadores de condição muscular.
[0029] Os marcadores de condição muscular incluem, sem limitação, marcadores de função muscular motora, marcadores indicativos de fibrose muscular ou a ausência dela, marcadores indicativos de degeneração ou regeneração muscular, marcadores de função cardíaca e marcadores de função pulmonar.
[0030] Em uma modalidade, a melhoria de um ou mais sinais de MD ou miofibras distróficas inclui a melhoria da função do membro, função do músculo corporal e função cardíaca e/ou pulmonar.
[0031] Em uma modalidade, o método compreende determinar o nível ou presença de um ou mais sinais de MD ou miofibras distróficas. Os sinais ilustrativos incluem função dos membros, função muscular do corpo, função cardíaca e pulmonar.
[0032] Em uma modalidade, um ou mais sintomas de MD ou miofibras distróficas incluem fatores de qualidade de vida, como níveis de energia, felicidade, facilidade percebida para andar, atividades funcionais dos membros superiores, etc.
[0033] Em uma modalidade, o indivíduo em necessidade inclui indivíduos com um diagnóstico genético e/ou clínico de MD e níveis relativamente baixos de miofibras distróficas e marcadores inflamatórios.
[0034] Em uma modalidade, o indivíduo apresenta níveis normais ou apenas ligeiramente elevados de células inflamatórias. As células inflamatórias incluem células T (CD4, CD8), células B (CD-19), granulócitos (neutrófilos, basófilos e eosinófilos).
[0035] Em uma modalidade, o indivíduo exibe níveis normais ou apenas ligeiramente elevados de células CD49d.
[0036] Em uma modalidade, o indivíduo exibe níveis normais ou apenas ligeiramente elevados de marcadores de diagnosticado com MD apresenta níveis significativamente elevados ou agudos de miofibras distróficas graves acompanhadas por necrose muscular grave e inflamação.
[0039] Em uma modalidade, o indivíduo exibe níveis significativamente elevados de células T CD49d em relação aos controles saudáveis normais.
[0040] Em uma modalidade, a forma de MD em um indivíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em distrofia muscular de Duchene (DMD), distrofia muscular de cintura (LGMD), distrofia muscular de Becker (BMD), distrofia muscular congênita (CMD incluindo MD congênito do tipo Fukuyama e DM congênita com deficiência de miosina), fascioscapulohumeral, oculofageal, Emery-Dreifuss e distrofia muscular distal.
[0041] Em uma modalidade, o indivíduo tem DMD ou BMD e não é ambulante.
[0042] Em uma modalidade, o indivíduo tem DMD ou BMD e é pós-pubescente.
[0043] Em outra forma da presente divulgação, as modalidades são contempladas direcionadas a; composições farmacêuticas quando usadas nos métodos ou usos presentemente descritos, usos das composições aqui descritas na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma distrofia muscular em um indivíduo, composições farmacêuticas para uso nos métodos atualmente descritos.
[0044] Por conseguinte, em uma modalidade, a presente divulgação fornece o uso de um oligonucleotídeo compreendendo a estrutura: 5 '- MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC AMeUMeU MeCMeU - 3' em que, a) cada uma das 19 ligações internucleotídicas do oligonucleotídeo é um diéster de fosforotioato ligado à O,O; b) os nucleotídeos nas posições 1 a 3 da extremidade 5 'são ribonucleosídeos modificados com 2'-O-(2-metoxietil); c) os nucleotídeos nas posições 4 a 12 da extremidade 5 'são 2'-desoxirribonucleosídeos; d) os nucleotídeos nas posições 13 a 20 da extremidade 5 'são ribonucleosídeos modificados com 2'-O-(2- metoxietil); e e) todas as citosinas são 5-metilcitosinas (MeC), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da distrofia muscular ou para retardar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo.
[0045] Em outra modalidade, a descrição permite um oligonucleotídeo compreendendo a estrutura: 5 '- MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC AMeUMeU MeCMeU - 3' em que,
a) cada uma das 19 ligações internucleotídicas do oligonucleotídeo é um diéster de fosforotioato ligado à O,O; b) os nucleotídeos nas posições 1 a 3 da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados com 2'-O-(2- metoxietil); c) os nucleotídeos nas posições 4 a 12 da extremidade 5' são 2'-desoxirribonucleosídeos; d) os nucleotídeos nas posições 13 a 20 da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados com 2'-O- (2- metoxietil); e) todas as citosinas são 5-metilcitosinas (MeC), ou um sal ou estereoisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no tratamento ou prevenção ou para retardar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo.
[0046] Em uma modalidade, a presente divulgação permite um método de tratamento de distrofia muscular em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo a administração periódica ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo inibitório para CD49d humano para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de distrofia muscular ou para atrasar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo.
[0047] Em uma modalidade, a administração de oligonucleotídeo anti-sentido é em combinação ou um tratamento adjuvante com tratamento com corticosteroide padrão ou de baixa dosagem.
[0048] Em uma modalidade, o corticosteroide é administrado em uma dose baixa.
[0049] Em uma modalidade, a administração de oligonucleotídeo anti-sentido é eficaz na ausência de terapia com corticosteroides.
[0050] Em outra modalidade, é divulgado o uso de um oligonucleotídeo inibidor para CD49d humano na preparação de um medicamento para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de distrofia muscular ou para atrasar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo com distrofia muscular.
[0051] Em uma modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo inibitório para CD49d humano para uso no tratamento de distrofia muscular ou no retardo da progressão da distrofia muscular em um indivíduo.
[0052] O sumário acima não é e não deve ser visto de forma alguma como uma recitação exaustiva de todas as modalidades da presente divulgação.
[0053] Muitas modificações serão evidentes para técnicos no assunto sem se afastar do escopo da presente divulgação.
[0054] Será apreciado por técnicos no assunto que numerosas variações e/ou modificações podem ser feitas nas modalidades descritas acima, sem se afastar do amplo escopo geral da presente divulgação. As presentes modalidades devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.
CHAVE PARA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0055] SEQ ID NO: 1 composto anti-sentido de integrina a4 humana(ATL1102)
[0056] SEQ ID NO: 2 composto anti-sentido de integrina a4 murino (ISIS348574) Discussão detalhada das modalidades
[0057] A divulgação em questão não se limita a procedimentos de triagem específicos para agentes, formulações específicas de agentes e várias metodologias médicas, pois podem variar. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm os mesmos significados como comumente entendidos por técnicos no assunto à qual esta divulgação pertence. Quaisquer materiais e métodos semelhantes ou equivalentes aos descritos neste relatório podem ser usados para praticar ou testar a presente divulgação. Os praticantes são particularmente direcionados a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 47, John Wiley & Sons, New York, 1999; Colowick e Kaplan, eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc .; Weir e
Blackwell, eds., Handbook of Experimental Immunology, Vols.
I-IV, Blackwell Scientific Publications, 1986; Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª ed., Mack Easton, Pa. (1990)), para definições e termos da técnica e outros métodos conhecidos pelo técnico no assunto.
[0058] O termo "indivíduo" inclui um indivíduo humano ou indivíduo com diagnóstico de DM ou um animal modelo de estudo clínico.
[0059] A DMD, por exemplo, é frequentemente diagnosticada clinicamente quando os marcos motores infantis são atrasados em 18 meses. As características iniciais da fraqueza muscular incluem uma marcha ampla, hiperlordose da espinha ao caminhar com os dedos dos pés, quedas frequentes, hipertrofia de músculos, como panturrilha, deltoide, quadríceps, masseter de língua, dificuldade em se levantar, fraqueza nos braços. A perda da deambulação normalmente ocorre entre 7 e 13 anos de idade na DMD, enquanto a deambulação posterior é característica da DMD. A perda da deambulação normalmente ocorre entre 7 e 13 anos de idade na DMD, enquanto a deambulação posterior é característica da DMD. Os déficits cardiopulmonares também podem ser aparentes. O desenvolvimento da fadiga e da fala também pode ser retardado. No entanto, nenhum sinal do neurônio motor superior ou fasciculação muscular é observado.
[0060] O diagnóstico de DMD pode ser confirmado por teste de imunofluorescência de distrofina e/ou imunoblot mostrando deficiência de distrofina e um quadro clínico consistente com DMD típica. Alternativamente, as deleções gênicas testam positivo (faltando um ou mais éxons) do gene da distrofina, onde o quadro de leitura pode ser previsto como 'fora do quadro' e um quadro clínico consistente com DMD típico é indicativo. Em uma modalidade, o sequenciamento completo do gene da distrofina pode mostrar uma mutação pontual, duplicação ou outra mutação resultando em uma mutação de códon de parada que pode ser definitivamente associada com DMD. Uma história familiar positiva de DMD confirmada por um dos critérios listados acima em um irmão ou tio materno também é útil. Também são utilizadas avaliações de sintomas ou sinais clínicos característicos de DMD (por exemplo, fraqueza muscular proximal, manobra de Gowers, nível elevado de creatinina quinase sérica).
[0061] Marcadores, sinais e sintomas melhorados adequados de MD ou miofibras distróficas/função muscular melhorada serão conhecidas por técnicos no assunto.
[0062] Os testes adequados incluem aqueles para aumento da função motora, muscular, cardíaca, sanguínea e pulmonar ao longo do tempo durante o tratamento.
[0063] Em indivíduos com cardiomiopatia pré-clínica, a eficácia cardíaca com base na resposta do biomarcador sérico pode ser determinada. Outras funções cardíacas podem ser avaliadas por telemetria ou anormalidades de ritmo avaliadas por monitoramento contínuo de telemetria móvel.
[0064] Outros testes incluem testes para parâmetros de oxigenação muscular e fenótipo mitocondrial.
[0065] A redução da fibrose pode ser avaliada por ressonância magnética. Gordura muscular reduzida, fibrose cardíaca reduzida, força de aperto aumentada, força de preensão, testes de função cardíaca e pulmonar melhorados.
Outras avaliações procuram uma desaceleração na taxa de declínio das funções acima.
[0066] Os questionários de qualidade de vida são muito úteis para determinar o efeito dos tratamentos.
[0067] Os resultados clínicos podem envolver, por exemplo, a determinação da alteração percentual na área de superfície alcançável da extremidade superior normalizada, a alteração percentual na deformação circunferencial cardíaca por ressonância magnética, avaliação da deformação cardíaca lateral e da parede posterior. Outro teste útil é medir a capacidade vital forçada, perda retardada da função respiratória, como mudança na CVF 5p da linha de base por medidas de espirometria.
[0068] Os testes de função motora incluem a determinação da mudança média no teste de subida de 4 degraus padrão antes e após o tratamento, tempo para se levantar do chão, espectroscopia de ressonância magnética, mudança média na fração de gordura do músculo vasto lateral na MRS, teste muscular do quadríceps, medição de pico de torque extensor do joelho , suprimento de sangue microvascular do músculo de ultrassom para o antebraço.
[0069] Avaliações clínicas importantes incluem tempo para caminhar/correr 6 ou 10 metros, tempo para subir 4 degraus, tempo para descer 4 degraus, tempo para se levantar da posição supina. Mudanças de peso, altura e IMC também podem ser avaliadas.
[0070] Alternativamente ou adicionalmente, biomarcadores de avaliações de biópsia muscular, marcadores farmacodinâmicos que medem a alteração no painel de biomarcadores plasmáticos medidos por ELISA ou proteômica, ou alteração nos marcadores de células imunes circulantes são avaliados.
[0071] O termo "composto anti-sentido", como aqui utilizado, refere-se a um composto oligomérico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia de integrina α4 de VLA-4 (α4β1) e/ou integrina α4β7.
A cadeia de integrina α4 em humanos é CD49d. O composto anti-sentido pode interferir com a expressão de CD49d, integrina βl e/ou integrina β7.
[0072] O termo "molécula de ácido nucleico que codifica integrina alfa4", como aqui utilizado, abrange DNA que codifica a cadeia de integrina α4 de VLA-4 ou integrina α4β7, RNA (incluindo pré-mRNA e mRNA ou porções dos mesmos) transcrito a partir de tal DNA e, ainda, cDNA derivado a partir de tal RNA.
[0073] O termo "VLA-4", conforme aqui utilizado, refere-se a um heterodímero de uma integrina α4 e uma integrina β1. O VLA-4 é expresso em níveis substanciais nas células B e T do sangue periférico normal, timócitos, monócitos e outras células, bem como nas células-tronco hematopoiéticas e progenitoras. O VLA-4 também é expresso em células progenitoras mesenquimais e endoteliais e células-tronco mesenquimais e potencialmente células-tronco endoteliais. Ligantes para VLA-4 incluem molécula-1 de adesão de células vasculares (VCAM-1) e CS-1, um domínio de splicing alternado dentro da região Hep II da fibronectina.
[0074] O termo "integrina α4β7" como aqui utilizado refere-se a um heterodímero de uma integrina α4 e uma integrina β7. A integrina α4β7 identifica um subconjunto de células T de memória com tropismo para o trato intestinal.
integrina α4β7 e também é expressa em um subconjunto de células progenitoras de mastócitos, linfócitos e NK. A integrina α4β7 é expressa em algumas células-tronco e progenitoras. Os ligandos para a integrina α4β7 incluem MAdCam-1 e VCAM-1.
Ácidos nucleicos
[0075] A presente divulgação abrange o uso de vários oligonucleotídeos que também são referidos como ácidos nucleicos. Ácidos nucleicos exemplificativos incluem DNA (por exemplo, DNA complementar (cDNA), DNA genômico (gDNA)), RNA (por exemplo, RNA de mensagem (mRNA), RNA curto do gancho de cabelo (do inglês short hairpin RNA) (shRNA), RNA interferente curto (siRNA), RNA ribossomal (rRNA) , tRNA, microRNA, DNA ou análogos de RNA (por exemplo, contendo análogos de base, análogos de açúcar e/ou uma estrutura não nativa e semelhantes), híbridos de RNA/DNA e ácidos nucleicos de poliamida (PNAs), todos os quais podem estar em um único - ou forma de fita dupla.
[0076] O termo "oligonucleotídeo" significa amplamente uma molécula de ácido nucleico curta. Os oligonucleotídeos ligam-se prontamente, de uma maneira específica para a sequência, aos seus respectivos oligonucleotídeos complementares, DNA ou RNA para formar um duplex. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos são cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos ou mais em comprimento.
[0077] Em uma modalidade, os oligonucleotídeos da presente divulgação são oligonucleotídeos inibidores. Em um exemplo, o termo "oligonucleotídeo inibitório" refere-se a qualquer oligonucleotídeo que reduza a produção, expressão ou atividade biológica de uma ou mais proteínas. Por exemplo, um oligonucleotídeo inibitório pode interferir com a tradução de mRNA em proteína em um ribossomo. Em outro exemplo, um oligonucleotídeo inibitório pode ser suficientemente complementar a um gene ou um mRNA que codifica uma ou mais proteínas para se ligar a (hibridizar com) um (s) gene (s) ou mRNA direcionado, reduzindo assim a expressão ou atividade biológica da proteína alvo. Em outro exemplo, um oligonucleotídeo inibidor inibe a atividade biológica de um ácido nucleico intracelular que não codifica para uma proteína. Por exemplo, um oligonucleotídeo inibitório pode inibir a atividade biológica de um RNA não codificante.
[0078] O termo "anti-sentido", como aqui utilizado, significa uma sequência de nucleotídeos complementar e, portanto, capaz de se ligar a uma sequência de codificação, que pode ser a da fita de uma dupla hélice de DNA que sofre transcrição, ou aquela de uma molécula de RNA mensageiro. O DNA anti-sentido é a fita não codificadora complementar à fita codificadora do DNA de fita dupla.
[0079] Os termos "RNA curto do gancho de cabelo" ou "shRNA" referem-se a uma estrutura de RNA possuindo uma região duplex e uma região de alça.
[0080] O termo RNA interferente curto (siRNA), às vezes conhecido como RNA de interferência curto ou RNA de silenciamento, é uma classe de moléculas de RNA de fita dupla ou de fita simples, com cerca de 19-25 pares de bases de comprimento. Um siRNA que inibe ou evita a tradução para uma proteína específica é indicado pelo nome da proteína acoplado ao termo siRNA.
[0081] Tipicamente, um siRNA em várias modalidades é uma molécula de ácido nucleico de fita dupla ou fita simples com cerca de 19 a cerca de 28 nucleotídeos (ou seja, cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 nucleotídeos).
[0082] O termo "microRNA" (miRNA abreviado) é uma pequena molécula de RNA não codificante (contendo cerca de 22 nucleotídeos) encontrada em plantas, animais e alguns vírus, que funciona no silenciamento do RNA e regulação pós-transcricional da expressão gênica. O prefixo "miR" é seguido por um travessão e um número, o último geralmente indicando a ordem de nomenclatura. Diferentes miRNAs com sequências quase idênticas, exceto por um ou dois nucleotídeos, são anotados com uma letra minúscula adicional. Numerosos miRNAs são conhecidos na técnica (nomenclatura miRBase V.21; ver Kozomara et al. 2013; Griffiths-Jones, S. 2004). As sequências desses miRNAs são bem conhecidas na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, na internet em mirbase.org.
[0083] Em uma modalidade, "oligonucleotídeos inibitórios" mimetizam a atividade de um ou mais miRNA. O termo "mimetizador de miRNA", como aqui utilizado, refere- se a pequenas moléculas de RNA de fita dupla projetadas para imitar moléculas de miRNA maduras endógenas quando introduzidas nas células. Os miméticos de miRNA podem ser obtidos de vários fornecedores, como Sigma Aldrich e Thermo Fisher Scientific.
[0084] Na modalidade, "oligonucleotídeos inibitórios" inibem a atividade de um ou mais miRNA. Várias espécies de miRNA são adequadas para este propósito. Os exemplos incluem, sem limitação, antagomirs, RNA de interferência, ribozimas, esponjas de miRNA e máscaras de miR. O termo "antagomir" é usado no contexto da presente divulgação para se referir a oligonucleotídeos anti-sentido quimicamente modificados que se ligam a um miRNA alvo e inibem a função do miRNA evitando a ligação do miRNA ao seu gene alvo cognato. Antagomirs podem incluir qualquer modificação de base conhecida na técnica. Em um exemplo, as espécies de miRNA acima referenciadas têm cerca de 10 a 50 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, os antagomirs podem ter porções anti-sentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49 ou 50 nucleotídeos de comprimento.
[0085] Em uma modalidade, as espécies de miRNA são oligonucleotídeos quiméricos que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma composta por pelo menos um nucleotídeo. Esses oligonucleotídeos normalmente contêm pelo menos uma região de nucleotídeos modificados que confere uma ou mais propriedades benéficas (como, por exemplo, aumento da resistência de nuclease, aumento da absorção nas células, aumento da afinidade de ligação para o alvo) e uma região que é um substrato para enzimas capaz de clivar RNA: DNA ou RNA: híbridos de RNA.
[0086] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos abrangidos pela presente divulgação são sintéticos. O termo "ácido nucleico sintético" significa que o ácido nucleico não tem uma estrutura química ou sequência de um ácido nucleico de ocorrência natural. Os nucleotídeos sintéticos incluem uma molécula de ácido nucleico projetada. Em outro exemplo, a estrutura do ácido nucleico também pode ser modificada em um ácido nucleico bloqueado (LNA) com uma ponte de metileno entre o oxigênio 2' e o carbono 4' para bloquear a ribose na conformação 3'-endo (Norte) no Conformação do tipo A de ácidos nucléicos (Lennox et al 2011; Bader et al 2011). No contexto de miRNAs, esta modificação pode aumentar significativamente a especificidade do alvo e as propriedades de hibridização da molécula.
[0087] Os ácidos nucleicos para uso nos métodos aqui divulgados podem ser concebidos usando métodos de rotina, conforme necessário. Por exemplo, no contexto de oligonucleotídeos inibitórios, segmentos alvo de 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotídeos de comprimento compreendendo um trecho de pelo menos cinco (5) nucleotídeos consecutivos dentro da sequência semente (do inglês seed sequence), ou imediatamente adjacente a ela, são considerados adequados para direcionar um gene. Os segmentos alvo exemplares podem incluir sequências que compreendem pelo menos os 5 nucleotídeos consecutivos do terminal 5' de uma das sequências semente (os nucleotídeos restantes sendo um trecho consecutivo do mesmo RNA começando imediatamente a montante do terminal 5' da sequência semente e continuando até que o ácido nucleico contenha cerca de 5 a cerca de 30 nucleotídeos). Em outro exemplo, os segmentos alvo são representados por sequências de RNA que compreendem pelo menos os 5 nucleotídeos consecutivos do terminal 3' de uma das sequências semente (os nucleotídeos restantes sendo um trecho consecutivo do mesmo RNA começando imediatamente a jusante do 3' -terminal do segmento alvo e continuando até que o ácido nucleico contenha cerca de 5 a cerca de 30 nucleotídeos). O termo "sequência semente" é usado no contexto da presente divulgação para se referir a uma sub cadeia longa de 6-8 nucleotídeos (nt) dentro dos primeiros 8 nt na extremidade 5 do miRNA (ou seja, sequência semente) que é um importante determinante da especificidade do alvo.
Uma vez que uma ou mais regiões, segmentos ou locais alvo tenham sido identificados, os compostos de ácido nucleico inibitórios são escolhidos de forma que são suficientemente complementares ao alvo, isto é, que hibridizam suficientemente bem e com especificidade suficiente (isto é, não se ligam substancialmente a outros não alvo sequências de ácido nucleico), para dar o efeito desejado.
Compostos anti-sentido para integrina α4
[0088] Em uma modalidade, os métodos da presente divulgação dependem do uso de um composto anti-sentido para integrina α4. Tais compostos anti-sentido são direcionados a ácidos nucleicos que codificam a cadeia de integrina α4 de VLA-4 (α4β1) ou integrina α4β7. Em uma modalidade, o composto anti-sentido é um oligonucleotídeo. No entanto, outros compostos oligoméricos anti-sentido, incluindo, mas não se limitando a miméticos de oligonucleotídeos, são contemplados.
[0089] A hibridização de um composto anti-sentido com seu ácido nucleico alvo é geralmente referida como "anti- sentido". A hibridização do composto anti-sentido com seu ácido nucleico alvo inibe a função do ácido nucleico alvo.
Tal "inibição anti-sentido" é tipicamente baseada na hibridização baseada em ligações de hidrogênio do composto anti-sentido com o ácido nucleico alvo de modo que o ácido nucleico alvo seja clivado, degradado ou de outra forma tornado inoperável. As funções do DNA alvo a serem interferidas podem incluir replicação e transcrição. A replicação e a transcrição, por exemplo, podem ser de um molde celular endógeno, um vetor, uma construção de plasmídeo ou outro. As funções do RNA a serem interferidas podem incluir funções como translocação do RNA para um local de tradução da proteína, translocação do RNA para locais dentro da célula que estão distantes do local da síntese de RNA, tradução da proteína do RNA, splicing do RNA para produzir uma ou mais espécies de RNA, e atividade catalítica ou formação de complexo envolvendo o RNA que pode ser envolvido ou facilitado pelo RNA.
[0090] "Hibridização", como aqui utilizado, significa emparelhamento de bases complementares do oligonucleotídeo e ácido nucleico alvo. O emparelhamento de bases tipicamente envolve ligações de hidrogênio, que podem ser ligações de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen invertida, entre nucleosídeos complementares ou bases de nucleotídeos (nucleobases). Guanina (G) e citosina (C) são exemplos de nucleobases complementares que emparelham através da formação de 3 ligações de hidrogênio.
Adenina (A) e timina (T) são exemplos de nucleobases complementares que emparelham através da formação de 2 ligações de hidrogênio. A hibridização pode ocorrer em várias circunstâncias.
[0091] Um "nucleosídeo" é uma combinação de base- açúcar. A porção de base do nucleosídeo é normalmente uma base heterocíclica. As duas classes mais comuns dessas bases heterocíclicas são as purinas e as pirimidinas.
"Nucleotídeos" são nucleosídeos que incluem ainda um grupo fosfato covalentemente ligado à porção de açúcar do nucleosídeo. Para aqueles nucleosídeos que incluem um açúcar pentofuranosil, o grupo fosfato pode ser ligado à porção 2 ', 3' ou 5' hidroxila do açúcar.
[0092] "Especificamente hibridizável" e "complementar" são termos que são usados para indicar um grau suficiente de complementaridade de modo que a ligação estável e específica ocorra entre o composto anti-sentido e o ácido nucleico alvo. Entende-se que o composto anti-sentido não precisa ser 100% complementar à sua sequência de ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. Um composto anti-sentido é especificamente hibridizável quando a ligação do composto anti-sentido ao ácido nucleico alvo interfere com a função normal da molécula alvo para causar uma perda de atividade, e há um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do anti-sentido composto para sequências não alvo sob condições em que a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de tratamento terapêutico.
[0093] "Complementar", conforme usado neste relatório, refere-se à capacidade de emparelhamento preciso entre uma nucleobase do composto anti-sentido e o ácido nucleico alvo. Por exemplo, se uma nucleobase em uma determinada posição do composto anti-sentido é capaz de se ligar a uma nucleobase em uma determinada posição do ácido nucleico alvo, então a posição da ligação de hidrogênio entre o composto anti-sentido e o ácido nucleico alvo é considerada como ser uma posição complementar. O composto anti-sentido pode hibridizar sobre um ou mais segmentos, de modo que segmentos intervenientes ou adjacentes não estejam envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura de alça ou estrutura em gancho). Em uma modalidade, o composto anti-sentido compreende pelo menos 70% de complementaridade de sequência com uma região alvo dentro do ácido nucleico alvo.
[0094] Por exemplo, um composto anti-sentido no qual 18 de 20 nucleobases são complementares a uma região alvo dentro do ácido nucleico alvo e, portanto, hibridizaria especificamente, representaria complementaridade de 90%.
Neste exemplo, as nucleobases não complementares restantes podem ser agrupadas ou intercaladas com nucleobases complementares e não precisam ser contíguas umas às outras ou às nucleobases complementares. Como tal, um composto anti-sentido que tem 18 nucleobases de comprimento com 4 nucleobases não complementares que são flanqueadas por 2 regiões de complementaridade completa com o ácido nucleico alvo teria 77,8% de complementaridade total com o ácido nucleico alvo e, portanto, cairia dentro do âmbito da presente divulgação. A complementaridade percentual de um composto anti-sentido com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada rotineiramente usando programas BLAST (ferramentas básicas de pesquisa de alinhamento local) e programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., 1990; Zhang e Madden, 1997).
Oligonucleotídeos anti-sentido
[0095] A presente divulgação fornece oligonucleotídeos anti-sentido para inibir a expressão de integrina α4 e/ou VLA-4 e/ou integrina α4β7. Esses oligonucleotídeos anti- sentido são direcionados para ácidos nucleicos que codificam a cadeia de integrina α4 de VLA-4 ou integrina α4β7.
[0096] O termo "inibe", como aqui utilizado, significa qualquer diminuição mensurável (por exemplo, 10%, 20%, 50%, 90% ou 100%) na expressão de VLA-4 ou α4β7integrina.
[0097] Conforme usado aqui, o termo "oligonucleotídeo" refere-se a um oligômero ou polímero de RNA ou DNA ou miméticos, quimeras, análogos e homólogos dos mesmos. Este termo inclui oligonucleotídeos compostos por nucleobases de ocorrência natural, açúcares e ligações covalentes de internucleosídeos (estrutura), bem como oligonucleotídeos tendo porções de ocorrência não natural que funcionam de forma semelhante. Esses oligonucleotídeos modificados ou substituídos são frequentemente preferidos em relação às formas nativas por causa das propriedades desejáveis, como, por exemplo, absorção celular aumentada, afinidade aumentada para o ácido nucleico alvo e estabilidade aumentada na presença de nucleases.
[0098] Os oligonucleotídeos podem conter centros quirais (assimétricos) ou a molécula como um todo pode ser quiral. Os estereoisômeros individuais (enantiômeros e diastereoisômeros) e as misturas destes estão dentro do escopo da presente divulgação. Pode ser feita referência a Wan et al. Nucleic Acids Research 42 (22: 13456-13468, 2014 para uma divulgação de oligonucleotídeos anti-sentido contendo ligações de fosforotioato quirais.
[0099] Na formação de oligonucleotídeos, os grupos fosfato ligam covalentemente nucleosídeos adjacentes uns aos outros para formar um composto polimérico linear. Por sua vez, as respectivas extremidades deste composto polimérico linear podem ser ainda unidas para formar um composto circular; no entanto, os compostos lineares são geralmente preferidos. Além disso, os compostos lineares podem ter complementaridade de nucleobases internas e podem, portanto, dobrar-se de maneira a produzir um composto de cadeia dupla total ou parcialmente. No que diz respeito aos oligonucleotídeos, os grupos fosfato são comumente referidos como formadores da estrutura internucleosídica do oligonucleotídeo. A ligação normal ou estrutura de RNA e DNA é uma ligação fosfodiéster 3' a 5'.
[00100] Os oligonucleotídeos anti-sentido da divulgação incluem, por exemplo, ribozimas, siRNA, oligonucleotídeos de sequência guia externa (EGS), splicers alternativos, iniciadores, sondas e outros oligonucleotídeos que hibridizam com pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo. Os oligonucleotídeos anti-sentido da divulgação podem ser administrados na forma de fita simples, fita dupla, circular ou em gancho e podem conter elementos estruturais, tais como protuberâncias ou laços internos ou terminais. Uma vez administrados, os oligonucleotídeos anti-sentido podem induzir a ação de uma ou mais enzimas ou proteínas estruturais para efetuar a modificação do ácido nucleico alvo.
[00101] Um exemplo não limitativo de tal enzima é a RNAse H, uma endonuclease celular que cliva a fita de RNA de um duplex RNA:DNA. É conhecido na técnica que compostos anti-sentido de fita simples que são "semelhantes a DNA"
induzem RNAse H. A ativação de RNase H, portanto, resulta na clivagem do RNA alvo, aumentando assim muito a eficiência da inibição da expressão gênica mediada por oligonucleotídeo. Papéis semelhantes foram postulados para outras ribonucleases, como aquelas na família de enzimas RNase III e ribonuclease L.
[00102] Foi demonstrado que a introdução de moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) induz uma redução potente e específica, mediada por anti-sentido, da função de um gene ou de seus produtos gênicos associados. Este fenômeno ocorre em plantas e animais e acredita-se que tenha uma conexão evolutiva com a defesa viral e o silenciamento do transposon. A primeira evidência de que o dsRNA poderia levar ao silenciamento de genes em animais veio em 1995, com o trabalho com o nematóide Caenorhabditis elegans (Guo e Kempheus, 1995). Montgomery et al. (1998) mostraram que os efeitos de interferência primários do dsRNA são pós-transcricionais. O mecanismo anti-sentido pós-transcricional definido em Caenorhabditis elegans resultante da exposição a RNA de fita dupla (dsRNA) foi, desde então, designado por RNA de interferência (RNAi).
Este termo foi generalizado para significar silenciamento de genes mediado por anti-sentido envolvendo a introdução de dsRNA levando à redução específica da sequência dos níveis de mRNA endógenos direcionados (Fire et al., 1998).
Recentemente, foi demonstrado que são, de fato, os oligômeros de RNA de fita simples de polaridade anti- sentido dos dsRNAs que são os indutores potentes de RNAi (Tijsterman et al., 2002).
[00103] Uma pessoa com habilidade comum na técnica poderia, sem experimentação indevida, identificar oligonucleotídeos anti-sentido úteis nos métodos da presente divulgação.
Ligações internucleosídicas modificadas (esqueletos)
[00104] Os compostos anti-sentido da presente divulgação incluem oligonucleotídeos com esqueletos modificados ou ligações internucleosídicas não naturais. Os oligonucleotídeos com esqueletos modificados incluem aqueles que retêm um átomo de fósforo em seu esqueleto e aqueles que não possuem um átomo de fósforo em seu esqueleto.
[00105] Esqueletos de oligonucleotídeos modificados contendo um átomo de fósforo incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil e outros alquil fosfonatos, incluindo 3'-alquileno fosfonatos, 5'- alquileno fosfonatos, fosfonatos de 5'-alquileno fosfonatos, '-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres,
selenofosfatos e boranofosfatos com ligações 3'-5' normais, análogos ligados 2'-5' destes e aqueles com polaridade invertida em que uma ou mais ligações internucleotídicas são ligações de 3' para 3', 5' para 5' ou 2' para 2'.
[00106] As patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, mas não estão limitadas a, US
3.687.808, US 4.469.863, US 4.476.301, US 5.023.243, US
5.177.196, US 5.188.897, US 5.264.423, US 5.276.019, US
5.278.302, US 5.286.717, US 5.321.131, US 5.399.666, US
5.405.939, US 5.264.423, US 5.276.019, US 5.278.302, US
5.286.717, US 5.321.131, US 5.399.666, US 5.405.939, US
5.453.496, US 5.453.667, US 5.453.496, US 5.453.496 , US
5.519.126, US 5.536.821, US 5.541.306, US 5.550.111, US
5.563.253, US 5.571.799, US 5.587.361, US 5.194.599, US
5.565.555, US 5.527.899, US 5.721.218, US 5.672.697 e US
5.625.050.
[00107] Esqueletos de oligonucleotídeo modificados que não incluem um átomo de fósforo neles mesmos incluem, por exemplo, esqueletos formados por ligações de internucleosídeo de cadeia curta alquil ou cicloalquil, heteroátomo misturado e ligações de internucleosídeo alquil ou cicloalquil, ou uma ou mais ligações internucleosídeos de cadeia curta heteroatômica ou heterocíclica. Estes incluem aqueles que possuem ligações morfolino (formados em parte da porção de açúcar de um nucleosídeo); esqueleto de siloxano; esqueleto de sulfeto, sulfóxido e sulfona; esqueleto de formacetil e tioformacetil; esqueletos de metileno formacetil e tioformacetil; esqueletos de riboacetil; alceno contendo esqueletos; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenoimino e metileno- hidrazino; esqueletos de sulfonato e sulfonamida; esqueletos de amida; e outros tendo partes componentes N, O, S e CH2 misturadas.
[00108] As patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação dos oligonucleotídeos acima incluem, mas não estão limitadas a, US 5.034.506, US
5.166.315, US 5.185.444, US 5.214.134, US 5.216.141, US
5.235.033, US 5.264.562, US 5.264.564, US 5.405.938, US
5.405.957, US 5466677, US 5470967, US 5489677, US 5541307, US 5561225, US 5596086, US 5602240, US 5610289, US 5602240, US 5608046, US 5610289, US 5618704, US 5623070, US 5663312, US 5633360, US 5677437, US 5792608 , US 5.646.269 e US
5.677.439.
Açúcar modificado e ligações internucleosídicas
[00109] Os compostos anti-sentido da presente divulgação incluem miméticos de oligonucleotídeos em que tanto o açúcar quanto a ligação internucleosídica (isto é, o esqueleto) das unidades de nucleotídeos são substituídos por novos grupos. As unidades de nucleobase são mantidas para hibridização com o ácido nucleico alvo.
[00110] Um mimético de oligonucleotídeo que mostrou ter excelentes propriedades de hibridização é referido como um ácido nucleico de peptídeo (PNA). Em compostos de PNA, o esqueleto de açúcar de um oligonucleotídeo é substituído por um esqueleto contendo amida, em particular, um esqueleto de aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e ligadas direta ou indiretamente aos átomos de nitrogênio aza da porção amida do esqueleto. As patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de compostos de PNA incluem, mas não estão limitadas a, US
5.539.082, US 5.714.331 e US 5.719.262. Mais informações sobre compostos de PNA podem ser encontradas em Nielsen et al., 1991.
[00111] Os compostos anti-sentido da presente divulgação também incluem oligonucleotídeos com esqueleto de fosforotioato e oligonucleotídeos com esqueleto de heteroátomo, por exemplo, -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N (CH3) -O- CH2- [conhecido como metileno (metilimino) ou esqueleto MMI], -CH2-ON (CH3) -CH2-, -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2- and -ON (CH3) -CH2-CH2- [em que o esqueleto de fosfodiéster nativo é representada como -OPO-CH2 -] de US 5.489.677 e os esqueletos de amida de US 5.602.240.
[00112] Os compostos anti-sentido da presente divulgação também incluem oligonucleotídeos com estruturas de esqueleto de morfolino de US 5.034.506.
Açúcares modificados
[00113] Os compostos anti-sentido da presente divulgação incluem oligonucleotídeos tendo uma ou mais porções de açúcar substituídas.
[00114] Os exemplos incluem oligonucleótidos compreendendo um dos seguintes na posição 2': OH; F; O-, S- ou N-alquil; O-, S- ou N-alcenilo; O-, S- ou N-alcinilo; ou O-alquil-O-alquil, em que o alquil, alquenil e alquinil podem ser alquil C1 a C10 substituídos ou não substituídos ou alquenil e alquinil C2 a C10.
[00115] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo compreende um dos seguintes na posição 2': O [(CH2) nO] mCH3, O (CH2) nOCH3, O (CH2) nNH2, O (CH2) nCH3, O (CH2) nONH2, e O (CH2) nON [(CH2) nCH3] 2, onde n e m são de 1 a cerca de 10.
[00116] Outros exemplos incluem oligonucleotídeos modificados, incluindo oligonucleotídeos compreendendo um dos seguintes na posição 2': C1 a C10 alquil inferior, alquil inferior substituído, alquenil, alquinil, alcaril, aralquil, O-alcaril ou O-aralquil, SH, SCH3, OCN , Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquil, heterocicloalcaril, aminoalquilamino, polialquilamino, silil substituído, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleotídeo, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleotídeo e outros substituintes com propriedades semelhantes.
[00117] Em uma modalidade, a modificação inclui 2'- metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3 (também conhecido como 2'-O- (2-metoxietil) ou 2'-MOE) (Martin et al., 1995), isto é, um grupo alcoxialcoxi. Em outra modalidade, a modificação inclui 2'-dimetilaminooxietoxi, isto é, um grupo O (CH2) 2ON (CH3) 2 (também conhecido como 2'-DMAOE), ou 2'- dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica como 2'-O-dimetil-amino-etoxi-etil ou 2'-DMAEOE), isto é, 2'-O- CH2-O-CH2-N (CH3) 2.
[00118] Outras modificações incluem 2'-metoxi (2'-O- CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alil (2'-CH2- CH=CH2), 2'-O-alil (2'-O-CH2-CH=CH2) e 2'-fluoro (2'-F). A modificação 2 'pode estar na posição arabino (para cima) ou posição ribo (para baixo). Em uma modalidade, uma modificação 2'-arabino é 2'-F.
[00119] Modificações semelhantes também podem ser feitas em outras posições no oligonucleotídeo, particularmente na posição 3' do açúcar no nucleotídeo 3' terminal ou em oligonucleotídeos 2'-5 'ligados e na posição 5' do nucleotídeo 5 'terminal.
[00120] Os oligonucleotídeos também podem ter miméticos de açúcar, tais como porções ciclobutil no lugar do açúcar pentofuranosil.
[00121] Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificadas incluem, mas não estão limitadas a, US 4,981,957, US 5,118,800, US 5,319,080, US 5,359,044, US 5,393,878, US 5,446,137, US 5,466,786, US 5,514,785, US 5,519,134, US 5,567,811 , US 5.576.427, US 5.591.722, US
5.597.909, US 5.610.300, US 5.627.053, US 5.639.873, US
5.646.265, US 5.658.873, US 5.670.633, US 5.792.747 e US
5.700.920.
[00122] Uma modificação adicional do açúcar inclui ácidos nucléicos bloqueados (LNAs) em que o grupo 2'- hidroxila está ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' do anel de açúcar, formando assim uma porção de açúcar bicíclica.
Em uma modalidade, a ligação é um grupo metileno (-CH2-) n ligando o átomo de oxigênio 2' e o átomo de carbono 4', em que n é 1 ou 2. LNAs e sua preparação são descritos em WO 98/39352 e WO 99/14226.
Nucleobases naturais e modificadas
[00123] Os compostos anti-sentido da presente divulgação incluem oligonucleotídeos com modificações ou substituições de nucleobases. Como aqui utilizado, nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina, timina (T), citosina (C) e uracila (U).
[00124] Nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais, tais como, por exemplo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halouracil e citosina, 5-propinil (-CC-CH3) uracil e citosina e outros derivados de alcinil de bases de pirimidina, 6-azo uracil, citosina e timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8- tioalquil, 8-hidroxil e outras adeninas e guaninas 8- substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo , 5- trifluorometil e outros uracilos e citosinas 5- substituídos, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7- desazaguanina e 7-desazaguanina e 3-desazaguanina e 3- desazaadenina.
[00125] Nucleobases modificadas adicionais incluem pirimidinas tricíclicas, tais como fenoxazina citidina (1H- pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina(1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), grampo-G, como, por exemplo, uma fenoxazina substituída citidina (por exemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4- b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-
pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H- pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d] pirimidin-2-ona).
[00126] As nucleobases modificadas também podem incluir aquelas em que a base de purina ou pirimidina é substituída por outros heterociclos, por exemplo, 7-desaza- adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona.
Outras nucleobases incluem aquelas divulgadas em US
3.687.808, aquelas divulgadas em J.I. Kroschwitz (editor), The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, páginas 858-859, John Wiley and Sons (1990), os divulgados por Englisch et al. (1991), e aqueles divulgados por Y.S. Sanghvi, Capítulo 15: Antisense Research and Applications, páginas 289-302, S.T. Crooke, B.
Lebleu (editores), CRC Press, 1993.
[00127] Algumas dessas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação do oligonucleotídeo. Estes incluem pirimidinas 5- substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5- propiniluracil e 5-propinilcitosina. As substituições de 5- metilcitosina mostraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6-1,2 °C. Em uma modalidade, essas substituições de nucleobases são combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietil.
[00128] As patentes representativas dos Estados
Unidos que ensinam a preparação de algumas das nucleobases modificadas acima mencionadas, bem como outras nucleobases modificadas incluem, mas não estão limitadas a, US
3.687.808, US 4.845.205, US 5.130.302, US 5.134.066, US
5.175.273, US 5.367.066, US 5.432.272 , US 5.457.187, US
5.459.255, US 5.484.908, US 5.502.177, US 5.525.711, US
5.552.540, US 5.587.469, US 5.594.121, US 5.596.091, US
5.614.617, US 5.645.985, US 5.830.653, US 5.552.540, US
5.587.469, US 5.594.121, US 5.596.091, US 5.614.617, US
5.645.985, US 5.830.653, US 5.683.651, US 5.005.981, US
5.781.696, US 5.781.691, US 5.781.696, US 5.781.981 e US
5.781.696.
Conjugados
[00129] Os compostos anti-sentido da presente divulgação podem ser conjugados a uma ou mais frações ou grupos que aumentam a atividade, distribuição celular ou absorção celular do composto anti-sentido.
[00130] Estas porções ou grupos podem ser covalentemente ligados a grupos funcionais, tais como grupos hidroxila primários ou secundários.
[00131] Porções ou grupos exemplares incluem intercaladores, moléculas repórteres, poliaminas, poliamidas, polietilenoglicóis, poliéteres, grupos que aumentam as propriedades farmacodinâmicas dos oligômeros e grupos que aumentam as propriedades farmacocinéticas dos oligômeros. Grupos conjugados típicos incluem colesteróis, lípideos, fosfolípideos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes.
[00132] Porções ou grupos que aumentam as propriedades farmacodinâmicas incluem aqueles que melhoram a absorção, aumentam a resistência à degradação e/ou fortalecem a hibridização específica de sequência com o ácido nucleico alvo.
[00133] Porções ou grupos que aumentam as propriedades farmacocinéticas incluem aqueles que melhoram a absorção, distribuição, metabolismo ou excreção dos compostos da presente divulgação. Porções ou grupos representativos são divulgados em PCT/US92/09196 e US
6.287.860. As porções ou grupos incluem, mas não estão limitados a, porções de lipídios, como uma porção de colesterol, ácido eólico, um tioéter, por exemplo, hexil-S- tritiltiol, um tiocolesterol, uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resíduos de undecil, um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamônio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato, uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol, ou ácido adamantano acético, uma fração de palmitil, ou uma porção octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
Compostos quiméricos
[00134] Como seria apreciado por técnicos no assunto, não é necessário que todas as posições em um determinado composto sejam uniformemente modificadas e, de fato, mais de uma das modificações acima mencionadas pode ser incorporada em um único oligonucleotídeo ou mesmo em um único nucleosídeo dentro de um oligonucleotídeo.
[00135] Os compostos anti-sentido da divulgação incluem oligonucleotídeos quiméricos. "Oligonucleotídeos quiméricos" contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma composta por pelo menos uma unidade monomérica, isto é, um nucleotídeo no caso de um composto de oligonucleotídeo. Estes oligonucleotídeos contêm tipicamente pelo menos uma região em que o oligonucleotídeo é modificado de modo a conferir ao oligonucleotídeo resistência aumentada à degradação da nuclease, absorção celular aumentada, estabilidade aumentada e/ou afinidade de ligação aumentada para o ácido nucleico alvo. Uma região adicional do oligonucleotídeo pode servir como substrato para enzimas capazes de clivar RNA:DNA ou RNA:híbridos de RNA. A título de exemplo, a RNAse H é uma endonuclease celular que cliva a fita de RNA de um duplex RNA:DNA. A ativação da RNase H, portanto, resulta na clivagem do RNA alvo, aumentando muito assim, a eficiência da inibição da expressão gênica mediada por oligonucleotídeos. A clivagem de híbridos de RNA:RNA pode, da mesma forma, ser realizada por meio da ação de endoribonucleases, como a RNAseL, que cliva tanto o RNA celular quanto o viral. A clivagem do RNA alvo pode ser rotineiramente detectada por eletroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridização de ácido nucleico associadas, conhecidas na técnica.
[00136] Os compostos quiméricos anti-sentido da divulgação podem ser formados como estruturas compostas de dois ou mais oligonucleotídeos, oligonucleotídeos modificados e/ou miméticos de oligonucleotídeos. Esses compostos também foram referidos na técnica como híbridos ou gapmers. Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de tais estruturas híbridas incluem, mas não estão limitadas a, US 5.013.830, US 5.149.797, US
5.220.007, US 5.256.775, US 5.366.878, US 5.403.711, US
5.491.133, US 5.565.350, US 5.623.065, US 5.652.355, US
5.652.356 e US 5.700.922.
Oligonucleotídeos exemplares
[00137] Plataformas anti-sentido ilustrativas conhecidas na técnica incluem, sem limitação, morfolino, oligos de 1 ª geração, oligos de segunda geração, gapmer, siRNA, LNA, BNA ou oligo miméticos como ácidos nucleicos de peptídeo. Os oligonucleotídeos podem ser nus ou formulados em lipossomas. Os oligonucleotídeos podem ser ligados a um meio de entrega às células ou não. Os oligonucleotídeos podem usar um agente de liberação de endossoma ou não.
[00138] Em uma modalidade, o composto anti-sentido é um esqueleto de fosforotioato de segunda geração, gapmer de oligonucleotídeo quimérico modificado por 2'-MOE projetado para hibridizar com a região 3'-não traduzida do mRNA de VLA-4. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo inibe seletivamente a expressão de VLA-4 em células humanas primárias e em várias linhas de células humanas por hibridização com o RNA que codifica CD49, que é a subunidade de integrina α4 de VLA-4 e integrina α4β7.
[00139] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo é o sal de sódio-19 de um oligonucleotídeo de fosforotioato 3'→ 5' 20mer também referido como um gapmer 3-9-8 MOE tendo um peso molecular de 7230 Daltons, em que os nucleotídeos nas posições 1 a 3 da extremidade 5' são 2'-O-(2-metoxietil) (2'MOE) ribonucleosídeos modificados (2'-O-(2-metoxietil ribose); os nucleotídeos nas posições 4 a 12 da extremidade 5' são 2'-desoxirribonucleosídeos, dos quais todas as citosinas são 5-metilcitosinas; os nucleotídeos nas posições 13 a 20 da extremidade 5' são 2'-O-(2-metoxietil) ribonucleosídeos modificados.
[00140] Em uma modalidade, a sequência do oligonucleotídeo é (SEQ ID NO: 1): 5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC AMeUMeU MeCMeU - 3'.
[00141] A fórmula empírica do oligonucleotídeo é: C233H327N60O129P19S19Na19.
[00142] O oligonucleotídeo anti-sentido ATL1102 demonstrou anteriormente ser eficaz no distúrbio do sistema nervoso central, MS e em doses significativamente maiores do que as propostas aqui (Limmroth et al). A capacidade do oligonucleotídeo anti-sentido para a cadeia alfa de CD49d de VLA-4 para inibir seletivamente VLA-4 em células imunes evita eventos de segurança significativos, como PML, que caracterizou a administração de anticorpos e inibidores de moléculas pequenas de VLA-4, que são inibidores de pan VLA- 4 afetando todas as células que expressam VLA-4.
[00143] Em uma modalidade, todos os uracilos são 5- metiluracilos (MeU). Normalmente, o oligonucleotídeo é sintetizado usando timidinas modificadas com 2-metoxietil e não 5-metiluracilos.
[00144] Em uma modalidade, todas as pirimidinas são C5 metiladas (isto é, U, T, C são C5 metiladas).
[00145] Em uma modalidade, a sequência do oligonucleotídeo pode ser nomeada pela nomenclatura de oligonucleotídeo aceita, mostrando cada ligação internucleotídica de fosforotioato ligada à O-O: sal de sódio 2'-O-metoxietil-5-metilcitidilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)- 2'-O-metoxietil-5-metiluridilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)- 2'-O-metoxietilguanosilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-O- desoxiadenosilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-O-
desoxiguanosilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-timidilil- (3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-desoxi-5-metilcitidilil- (3'®5'O,O-fosforotioil)-timidilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)- 2'-desoxiguanosilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-timidilil- (3'®5'O,O-fosforotioil)-timidilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)- timidilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-O-metoxietil-5- metiluridilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-metoxietil-5- metilcitidilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-metoxietil-5- metilcitidilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-O-metoxietil-5- adenosilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-O-metoxietil-5- metiluridilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-O-metoxietil-5- metiluridilil-(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-O-metoxietil-5- metilcitosina,(3'®5'O,O-fosforotioil)-2'-O-metoxietil-5- metiluridilil-19.
[00146] O oligonucleotídeo pode ser sintetizado por um processo de múltiplas etapas que pode ser dividido em duas operações distintas: síntese em fase sólida e processamento a jusante. Na primeira operação, a sequência de nucleotídeos do oligonucleotídeo é montada através de um sintetizador de fase sólida controlado por computador. O processamento a jusante subsequente inclui etapas de desprotecção, purificação cromatográfica preparativa de fase reversa, isolamento e secagem para produzir a substância fármaco oligonucleotídica. A síntese química do oligonucelotídeo utiliza a química de acoplamento de fosforamidita seguida de sulfurização oxidativa e envolve o acoplamento sequencial de monômeros ativados a um oligômero alongado, cujo terminal 3' é covalentemente ligado ao suporte sólido.
Detritilação (reação a)
[00147] Cada ciclo da síntese em fase sólida começa com a remoção do grupo protetor 5'-O-4, 4'-dimetoxitritil (DMT) lábil em ácido do nucleosídeo terminal 5 'do oligonucleotídeo ligado ao suporte. Isto é conseguido por tratamento com uma solução ácida (por exemplo ácido dicloroacético (DCA) em tolueno). Após a destritilação, o excesso de reagente é removido do suporte por lavagem com acetonitrila em preparação para a próxima reação.
Acoplamento (reação b)
[00148] O alongamento da cadeia é alcançado pela reação do grupo 5'-hidroxila do oligonucleotídeo ligado ao suporte com uma solução de fosforamidita correspondente a essa posição de base particular (por exemplo, para a base2:amidita MOE-MeC) na presença de um ativador (por exemplo, lH-tetrazol). Isso resulta na formação de uma ligação fosfito triéster entre o sínton de nucleotídeo de entrada e a cadeia de oligonucleotídeo ligada ao suporte.
Após a reação de acoplamento, o excesso de reagente é removido do suporte por lavagem com acetonitrila em preparação para a próxima reação.
Sulfurização (reação c)
[00149] A ligação fosfito triéster recém-formada é convertida no correspondente triéster [O,O,O)-trialquil fosforotioato por tratamento com uma solução de um reagente de transferência de enxofre (por exemplo, dissulfeto de fenilacetila). Após a sulfuração, o excesso de reagente é removido do suporte por lavagem com acetonitrila em preparação para a próxima reação.
Capeamento (reação d)
[00150] Uma pequena proporção dos grupos 5'-hidroxi disponíveis em qualquer ciclo dado não se estende. O acoplamento desses grupos em qualquer um dos ciclos subsequentes resultaria na formação de impurezas relacionadas ao processo ("DMT-on(n-l)-mers") que são difíceis de separar do produto desejado. Para prevenir a formação dessas impurezas e para facilitar a purificação, um "reagente de capeamento" (por exemplo, anidrido acético e N-metilimidazol/acetonitrila/piridina) é introduzido no vaso do reator para dar sequências capeadas. As sequências de falha resultantes ("shortmers DMT-off") são separadas do produto desejado por purificação por HPLC de fase reversa.
Após a reação de cobertura, o excesso de reagente é removido do suporte por lavagem com acetonitrila na preparação da próxima reação.
[00151] A reiteração deste ciclo básico de quatro etapas usando o fosforamidito de nucleosídeo protegido apropriado permite a montagem de toda a sequência de oligonucleotídeo protegida.
Desproteção do esqueleto (reação e)
[00152] Após a conclusão da porção de montagem do processo, os grupos cianoetil que protegem as ligações internucleotídeo triéster (O,O,O)-trialquil fosforotioato são removidos por tratamento com uma solução de trietilamina (TEA) em acetonitrila. O reagente e o acrilonitrila gerados durante esta etapa são removidos lavando a coluna com acetonitrila.
Clivagem de suporte e desproteção de base (reação f)
[00153] A desproteção dos grupos amino exocíclicos e a clivagem do produto bruto do suporte é conseguida por incubação com hidróxido de amônio aquoso (reação f). A purificação do produto bruto protegido com 5'-O-DMT é realizada por HPLC de fase reversa. A etapa de HPLC de fase reversa remove as sequências de falha DMT-off. O perfil de eluição é monitorado por espectroscopia de absorção de UV.
As fracções contendo o produto oligonucleótido DMT-on são recolhidas e analisadas.
Desproteção ácida (reação g)
[00154] As frações de HPLC de fase reversa contendo oligonucleotídeo 5'-O-DMT-protegido são reunidas e transferidas para um tanque de precipitação. Os produtos obtidos a partir da purificação de várias sínteses são combinados nesta etapa do processo. O oligonucleotídeo DMT- on purificado é tratado com ácido (por exemplo, ácido acético) para remover o grupo DMT ligado ao terminal 5'.
Após a exposição ao ácido pelo tempo prescrito e neutralização, o oligonucleotídeo fármaco é isolado e seco.
[00155] A seguir ao passo final de desproteção ácida, a solução é neutralizada por adição de hidróxido de sódio aquoso e o fármaco oligonucleotídico é precipitado da solução por adição de etanol. O material precipitado é deixado assentar no fundo do recipiente de reação e o sobrenadante etanólico é decantado. O material precipitado é redissolvido em água purificada e o pH da solução ajustado para um valor entre 7,2 e 7,3. A etapa de precipitação é repetida. O material precipitado é dissolvido em água e a solução filtrada através de um filtro de 0,45 mícrons e transferida para bandejas de polipropileno descartáveis que são carregadas em um liofilizador. A solução é arrefecida a -50°C. A secagem primária é realizada a 25°C durante 37 horas. A temperatura é aumentada para 30°C e uma etapa de secagem secundária realizada por 5,5 horas. Após a conclusão do processo de liofilização, o fármaco é transferido para frascos de polietileno de alta densidade e armazenado a -200°C.
Ácido nucleico alvo
[00156] "Direcionar" um composto anti-sentido para um ácido nucleico específico pode ser um processo de várias etapas. O processo geralmente começa com a identificação de um ácido nucleico alvo, cuja função deve ser modulada. Na presente divulgação, o ácido nucleico alvo codifica a cadeia de integrina alfa4 de VLA-4 ou integrina α4β7.
[00157] O processo de direcionamento geralmente também inclui a determinação de pelo menos uma região, segmento ou local alvo dentro do ácido nucleico alvo para que a interação anti-sentido ocorra de modo que o efeito desejado, resultará, por exemplo, na inibição da expressão. O termo "região", conforme aqui utilizado, é definido como uma porção do ácido nucleico alvo tendo pelo menos uma estrutura, função ou característica identificável. Dentro das regiões dos ácidos nucleicos alvo estão os segmentos. "Segmentos" são definidos como menores ou sub-porções de regiões dentro de um ácido nucleico alvo.
"Locais", como aqui utilizado, significa posições dentro do ácido nucleico alvo.
[00158] Uma vez que o "códon de iniciação da tradução" é tipicamente 5'-AUG (em moléculas de mRNA transcritas; 5'-ATG na molécula de DNA correspondente), o códon de iniciação da tradução também é referido como o "códon AUG", o "códon inicial" ou o "códon de início AUG".
Uma minoria de genes tem um códon de iniciação da tradução com a sequência de RNA 5'-GUG, 5'-UUG ou 5'-CUG, e 5'-AUA, 5'-ACG e 5'-CUG demonstraram funcionar in vivo. Assim, os termos "códon de iniciação da tradução" e "códon de início" podem abranger muitas sequências de códons, embora o aminoácido iniciador em cada caso seja tipicamente metionina (em eucariotos) ou formilmetionina (em procariotos). Também é conhecido na técnica que os genes eucarióticos e procarióticos podem ter dois ou mais códons de início alternativos, qualquer um dos quais pode ser utilizado preferencialmente para a iniciação da tradução em um tipo de célula ou tecido particular, ou sob um conjunto particular de condições. Os termos "códon de início" e "códon de iniciação da tradução", conforme aqui utilizados, referem-se ao códon ou códons que são usados in vivo para iniciar a tradução de um mRNA transcrito de um gene que codifica, por exemplo, a cadeia de integrina α4 de VLA-4 ou α4β7 integrina, independentemente da(s) sequência(s) de tais códons.
[00159] Um "códon de terminação de tradução" também referido como um "códon de parada" pode ter uma das três sequências de RNA: 5'-UAA, 5'-UAG e 5'-UGA (5'-TAA, 5'-TAG e 5'- TGA, respectivamente na molécula de DNA correspondente). Os termos "códon de terminação da tradução" e "códon de parada", conforme aqui utilizados,
referem-se ao códon ou códons que são usados in vivo para terminar a tradução de um mRNA transcrito de um gene que codifica a cadeia de integrina α4 de VLA-4 ou integrina α4β7, independentemente da(s) sequência(s) de tais códons.
[00160] Os termos "região do códon de início" e "região do códon de iniciação da tradução" referem-se a uma porção do mRNA ou gene que abrange de cerca de 25 a cerca de 50 nucleotídeos contíguos em qualquer direção (ou seja, 5'ou 3') a partir do códon de iniciação da tradução . Da mesma forma, os termos e "região de códon de parada" e "região de códon de terminação de tradução" referem-se a uma porção do mRNA ou gene que abrange de cerca de 25 a cerca de 50 nucleotídeos contíguos em qualquer direção (ou seja, 5' ou 3') a partir do códon de terminação da tradução. Consequentemente, a "região do códon de início" ou "região do códon de iniciação da tradução" e a "região do códon de parada" ou "região do códon de terminação da tradução" são todas regiões que podem ser direcionadas de forma eficaz com os compostos anti-sentido da presente divulgação.
[00161] O "quadro de leitura aberta" (ORF) ou "região de codificação", que é conhecido na técnica por se referir à região entre o códon de iniciação da tradução e o códon de terminação da tradução, é também uma região que pode ser direcionada de forma eficaz. Em uma modalidade, a região intragênica que abrange o códon de iniciação ou terminação da tradução da ORF de um gene é direcionada.
[00162] Outras regiões alvo incluem a região 5 'não traduzida (5'UTR), conhecida na técnica por se referir à porção do mRNA na direção 5' do códon de iniciação da tradução e, assim, incluindo nucleotídeos entre o local cap 5' e o códon de iniciação da tradução do mRNA (ou nucleotídeos correspondentes no gene), e a região 3' não traduzida (3'UTR), conhecida na técnica por se referir à porção do mRNA na direção 3' do códon de terminação da tradução, e assim incluindo nucleotídeos entre o códon de terminação da tradução e a extremidade 3' do mRNA (ou nucleotídeos correspondentes no gene). O local cap 5' de um mRNA compreende um resíduo de guanosina metilado N7 unido ao resíduo mais 5' do mRNA por meio de uma ligação trifosfato 5'-5'. A região cap 5' de um mRNA é considerada como incluindo a própria estrutura cap 5', bem como os primeiros 50 nucleotídeos adjacentes ao local cap. Em uma modalidade, a região cap 5' é direcionada.
[00163] Embora alguns transcritos de mRNA eucarióticos sejam traduzidos diretamente, muitos contêm uma ou mais regiões, conhecidas como "íntrons", que são excisadas de um transcrito antes de ser traduzido. As regiões restantes (e, portanto, traduzidas) são conhecidas como "éxons" e são unidas para formar uma sequência de mRNA contínua. Os transcritos de mRNA produzidos através do processo de splicing de dois (ou mais) mRNAs de diferentes fontes de genes são conhecidos como "transcritos de fusão".
Em uma modalidade, os íntrons, ou locais de splice, isto é, junções íntron-éxon ou junções éxon-íntron ou junções de fusão aberrantes devido a rearranjos ou deleções são direcionados. Transcrições alternativas de RNA podem ser produzidas a partir da mesma região genômica do DNA. Essas transcrições alternativas são geralmente conhecidas como "variantes".
[00164] "Variantes de pré-mRNA" são transcritos produzidos a partir do mesmo DNA genômico que diferem de outros transcritos produzidos a partir do mesmo DNA genômico em sua posição inicial ou final e contêm tanto a sequência intrônica quanto a exônica. Após a excisão de uma ou mais regiões de éxon ou íntron, ou porções das mesmas durante o splicing, as variantes de pré-mRNA produzem "variantes de mRNA" menores. Consequentemente, as variantes de mRNA são variantes de pré-mRNA processadas e cada variante de pré-mRNA única deve sempre produzir uma variante de mRNA única como resultado do splicing. Estas variantes de mRNA também são conhecidas como "variantes de splice alternativas". Se nenhum splicing da variante do pré-mRNA ocorrer, então a variante do pré-mRNA é idêntica à variante do mRNA.
[00165] As variantes podem ser produzidas através do uso de sinais alternativos para iniciar ou parar a transcrição, ou seja, através do uso de um códon de início ou códon de parada alternativo. Variantes que se originam de um pré-mRNA ou mRNA que usam códons de início alternativos são conhecidas como "variantes de início alternativas" desse pré-mRNA ou mRNA. Esses transcritos que usam um códon de parada alternativo são conhecidos como "variantes de parada alternativa" daquele pré-mRNA ou mRNA.
Um tipo específico de variante de parada alternativa é a "variante poliA" em que os múltiplos transcritos produzidos resultam da seleção alternativa de um dos "sinais de parada poliA" pela maquinaria de transcrição, produzindo assim transcritos que terminam em locais poliA únicos. Em uma modalidade, o pré-mRNA ou variantes de mRNA são direcionados.
[00166] A localização no ácido nucleico alvo ao qual o composto anti-sentido hibridiza é referida como o "segmento alvo". Como usado neste relatório, o termo "segmento alvo" é definido como pelo menos uma porção de 8 nucleobases de uma região alvo para a qual um composto anti-sentido é direcionado. Embora não desejando estar limitado pela teoria, atualmente acredita-se que esses segmentos alvo representam porções do ácido nucleico alvo que são acessíveis para hibridização.
[00167] Uma vez que uma ou mais regiões alvo, segmentos ou locais foram identificados, os compostos anti- sentido são escolhidos que são suficientemente complementares a um segmento alvo, isto é, compostos anti- sentido que hibridizam suficientemente bem e com especificidade suficiente, para dar o efeito desejado.
[00168] O segmento alvo também pode ser combinado com seu respectivo composto anti-sentido complementar para formar oligonucleotídeos de fita dupla (duplexados) estabilizados. Demonstrou-se na técnica que tais frações de oligonucleotídeo de fita dupla modulam a expressão alvo e regulam a tradução, bem como o processamento de RNA por meio de um mecanismo anti-sentido. Além disso, as frações de fita dupla podem estar sujeitas a modificações químicas (Fire et al., 1998; Timmons e Fire, 1998; Timmons et al., 2001; Tabara et al., 1998; Montgomery et al., 1998; Tuschl et al., 1999; Elbashir et al., 2001a; Elbashir et al., 2001b). Por exemplo, tais frações de fita dupla mostraram inibir o alvo pela hibridização clássica da fita anti- sentido do duplex ao alvo, desencadeando assim a degradação enzimática do alvo (Tijsterman et al., 2002).
Composições
[00169] Os compostos anti-sentido da divulgação podem ser misturados, encapsulados, conjugados ou de outra forma associados a outras moléculas, estruturas de moléculas ou misturas de compostos, resultando em, por exemplo, lipossomas, moléculas direcionadas ao receptor, orais, retais, tópicos ou outras formulações, para auxiliar na captação, distribuição e/ou absorção. Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de tais formulações para auxiliar a absorção, distribuição e/ou absorção incluem, mas não estão limitadas a, US
5.108.921, US 5.354.844, US 5.416.016, US 5.459.127, US
5.521.291, US 5.543.158, US 5.547.932, 5.583.020, US
5.591.721, US 4.426.330, US 4.534.899, US 5.013.556, US
5.108.921, US 5.213.804, US 5.227.170, US 5.264.221, US
5.356.633, US 5.395.619, US 5.416.016, US 5.417.978, US
5.273.804, US 5.227.170, US 5.264.221, US 5.356.633, US
5.395.619, US 5.416.016, US 5.417.554, US 5.417.554, US
5.417.554, US 5.442.554, US 5.447.554 US 5.534.259, US
5.543.152, US 5.556.948, US 5.580.575 e US 5.595.756.
[00170] os compostos anti-sentido da divulgação podem ser administrados em um transportador farmaceuticamente aceitável. O termo "transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares que não produzem uma reação alérgica, tóxica ou adversa de outra forma quando administrado a um indivíduo, particularmente um mamífero, e mais particularmente um humano. O transportador farmaceuticamente aceitável pode ser sólido ou líquido. Exemplos úteis de transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, diluentes, solventes, surfactantes, excipientes, agentes de suspensão, agentes tamponantes, agentes lubrificantes, adjuvantes, veículos, emulsionantes, absorventes, meios de dispersão, revestimentos, estabilizadores, coloides protetores, adesivos , espessantes, agentes tixotrópicos, agentes de penetração, agentes sequestrantes, agentes isotônicos e retardadores de absorção que não afetam a atividade dos agentes ativos da divulgação.
[00171] Em uma modalidade, o transportador farmacêutico é água para injeção (WFI) e a composição farmacêutica é ajustada para pH 7.4, 7.2-7.6.
[00172] Em uma modalidade, o sal é um sal de sódio ou potássio.
[00173] Os oligonucleotídeos podem conter centros quirais (assimétricos) ou a molécula como um todo pode ser quiral. Os estereoisômeros individuais (enantiômeros e diastereoisômeros) e as misturas destes estão dentro do escopo da presente divulgação.
[00174] Os compostos anti-sentido da divulgação podem ser sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres ou sais dos ésteres, ou quaisquer outros compostos que, após administração são capazes de fornecer (direta ou indiretamente) o metabólito biologicamente ativo.
[00175] O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis", como aqui utilizado, refere-se a sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos anti-sentido que retêm as atividades biológicas desejadas dos compostos originais e não transmitem efeitos toxicológicos indesejados após a administração. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis e seus usos são descritos adicionalmente em US 6.287.860.
[00176] Os compostos anti-sentido da divulgação podem ser pró-fármacos ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos pró-fármacos ou outros bioequivalentes. O termo "pró- fármaco", como aqui utilizado, refere-se a agentes terapêuticos que são preparados em uma forma inativa que é convertida em uma forma ativa (isto é, droga) após administração pela ação de enzimas endógenas ou outros produtos químicos e/ou condições. Em particular, as formas de pró-fármaco dos compostos anti-sentido da divulgação são preparadas como derivados de SATE [(S acetil-2-tioetil) fosfato] de acordo com os métodos divulgados em WO 93/24510, WO 94/26764 e US 5.770.713.
[00177] Um pró-fármaco pode, por exemplo, ser convertido dentro do corpo, por exemplo, por hidrólise no sangue, em sua forma ativa que tem efeitos médicos. Os pró- fármacos farmaceuticamente aceitáveis são descritos em T.
Higuchi e V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems,
Vol. 14 da A. C. S. Symposium Series (1976); "Design of Prodrugs" ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985; e em Edward B.
Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association e Pergamon Press, 1987, que são aqui incorporados por referência.
Terapia convencional
[00178] A corticoterapia é a base do tratamento da DMD em pacientes ambulatoriais. "Corticosteróide" refere-se a qualquer uma das várias substâncias sintéticas ou naturais com a estrutura química geral dos esteróides que imitam ou aumentam os efeitos dos corticosteróides naturais. Exemplos de corticosteróides sintéticos incluem prednisona, prednisolona (incluindo prednisona, um precursor da prednisolona, metilprednisolona), dexametasona triancinolona, budesonida e betametasona.
[00179] Em uma modalidade, o tratamento da presente invenção para MD em um indivíduo humano com MD compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico, tal como o oligonucleotídeo anti- sentido para CD49d (cadeia alfa de VLA-4), e ainda compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um segundo medicamento, que é um corticosteroide.
Em uma modalidade, o corticosteroide é prednisona (ou um equivalente de prednisona), deflazacorte (um derivado ou prednisolona). Outros corticosteróides são conhecidos na técnica como mencionado acima.
[00180] A administração combinada aqui inclui a coadministração, usando formulações separadas (ou uma única formulação farmacêutica) e a administração consecutiva em qualquer ordem, em que geralmente há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.
[00181] O tratamento com corticosteroides em doses padrão é usado em pacientes com DMD enquanto eles estão deambulando, pois demonstrou ter algum efeito na manutenção da deambulação em alguns pacientes. O tratamento prolongado com doses padrão (0,75 mg/kg/dia de prednisona ou 0,9 mg/kg/dia de deflazacorte), entretanto, pode resultar em atrofia muscular e/ou ter outros efeitos colaterais. Não existe um padrão de cuidado para pacientes com DMD não deambuladores que podem permanecer em CS, às vezes na dose fixa de CS que estavam recebendo quando perderam a deambulação, que é uma dose reduzida em mg/kg/dia de CS, ou eles podem vir interromper o tratamento de CS por causa dos efeitos colaterais e/ou ausência de benefício. Conforme proposto e mostrado aqui, o tratamento anti-sentido para CD49d em conjunto com o tratamento com corticosteroides, incluindo níveis reduzidos de tratamento com corticosteroides, em indivíduos não deambuladores, redução ou atraso na progressão da função muscular. Não está claro se o tratamento de CS estava proporcionando algum benefício em tal indivíduo, portanto, isso apoia a monoterapia com ATL1102 ou o tratamento de combinações.
[00182] Como aqui utilizado, o termo "combinação" no contexto da administração de uma terapia refere-se à utilização de mais do que uma terapia ou agente terapêutico. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias ou agentes terapêuticos são administrados a um indivíduo. Uma terapia ou agente terapêutico pode ser administrado antes, concomitantemente ou subsequentemente à administração de uma segunda terapia ou agente terapêutico a um indivíduo.
Administração
[00183] Em uma modalidade, o composto anti-sentido da divulgação é administrado sistemicamente. Conforme usado aqui, "administração sistêmica" é uma via de administração que é enteral ou parenteral.
[00184] Como aqui utilizado, "enteral" refere-se a uma forma de administração que envolve qualquer parte do trato gastrointestinal e inclui a administração oral de, por exemplo, o oligonucleotídeo anti-sentido na forma de comprimido, cápsula ou gota; tubo de alimentação gástrica, tubo de alimentação duodenal ou gastrostomia; e administração retal de, por exemplo, o composto anti- sentido na forma de supositório ou enema.
[00185] Como usado aqui, "parenteral" inclui a administração por injeção ou infusão. Os exemplos incluem, intravenoso (em uma veia), intra-arterial (em uma artéria), intramuscular (em um músculo), intracardíaco (no coração), subcutâneo (sob a pele), infusão intraóssea (na medula óssea), intradérmico, (na própria pele), intratecal (no canal espinhal), intraperitoneal (infusão ou injeção no peritônio), intravesical (infusão na bexiga urinária).
transdérmico (difusão através da pele intacta), transmucosal (difusão através de uma membrana mucosa), inalatório.
[00186] Em uma modalidade, a administração da composição farmacêutica é subcutânea.
[00187] O composto anti-sentido pode ser administrado como dose única ou como doses repetidas em uma base de período, por exemplo, diariamente, uma vez a cada dois dias, três, quatro, cinco, seis sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze ou quatorze dias, uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, ou a cada duas semanas, ou a cada três semanas.
[00188] Em uma modalidade, a administração é de 1 a 3 vezes por semana, ou uma vez por semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas ou uma vez a cada dois meses.
[00189] Em uma modalidade, a administração é uma vez por semana.
[00190] Em uma modalidade, uma dose baixa administrada por 3 a 6 meses, tal como cerca de 25-50 mg/semana por pelo menos três a seis meses e depois até 12 meses e cronicamente.
[00191] Doses ilustrativas estão entre cerca de 10 a 300 mg. Doses ilustrativas incluem 25, 50, 100, 150, 200 mg. Doses ilustrativas incluem 1,5 mg/kg (cerca de 50 a 100 mg) e 3 mg/kg (100-200 mg) e 4,5 mg/kg (150-300 mg). Em uma modalidade, as doses são administradas uma vez por semana.
Assim, em uma modalidade, uma dose baixa de aproximadamente 10 a 30, ou 20 a 40, ou 20 a 28 mg pode ser administrada a indivíduos com peso tipicamente entre cerca de 25 e 65 kg.
Em uma modalidade, o oligonucleotídeo anti-sentido é administrado em uma dose inferior a 50 mg, ou inferior a 30 mg, ou cerca de 25 mg por dose para produzir um efeito terapêutico. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo anti- sentido, ATL1102, é administrado em uma dose inferior a 50 mg, ou inferior a 30 mg, ou cerca de 25 mg por dose para produzir um efeito terapêutico.
[00192] Em uma modalidade, um efeito terapêutico, tal como um atraso na progressão é visto dentro de cerca de três meses após a administração da primeira dose. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", como aqui utilizado, refere-se a uma dose do composto anti-sentido suficiente, por exemplo, para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de distrofia muscular ou para atrasar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo, ou para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de miofibras distróficas ou para atrasar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo sob as condições de administração.
[00193] Em outra modalidade, a administração é eficaz para fornecer um Cmax do oligonucleotídeo no plasma do indivíduo humano acima de 2890ng/mL e em uma modalidade, cerca de 10.000-11.000 ng/mL.
[00194] Em outra modalidade, a administração é eficaz para fornecer um Cmin ou Ctrough do oligonucleotídeo no plasma do indivíduo humano de pelo menos 2,5 ng/mL, em uma modalidade de pelo menos 20 ng/mL ou pelo menos 45ng/mL.
[00195] Estudos são conduzidos para demonstrar o tratamento da distrofia muscular com um oligonucleotídeo inibidor da integrina VLA-4 que reduz o nível de VLA-4 no sangue ou músculo de seres humanos. A redução no nível de VLA-4 pode ser detectada em subconjuntos de células em um ou mais órgãos, incluindo sangue, músculo ou pulmão. Em uma modalidade, os indivíduos são retirados dos corticosteroides aproximadamente 24 horas antes da administração.
[00196] Isso permite uma avaliação dos efeitos do oligonucleotídeo anti-sentido inibitório para a cadeia alfa
CD49d da integrina VLA-4 em células imunes na ausência de corticosteroide, que não está presente em níveis significativos na corrente sanguínea 24 horas após a administração para ter um efeito nas células imunes circulantes.
EXEMPLO 1
[00197] Em uma modalidade, ATL1102 é administrado a meninos não ambulantes juvenis (ou púberes) de 10 anos ou mais com DMD semanalmente em cerca de 1,5 mg/kg (cerca de 50 a 100 mg) e 3 mg/kg (100-200 mg) e 4,5 mg/kg (150-300mg) por até 12 semanas. Os efeitos do oligonucleotídeo administrado, por exemplo, na função motora/muscular e marcadores inflamatórios são medidos. Marcadores de degeneração-regeneração muscular e fibrose também são avaliados. Os marcadores podem ser detectados in situ ou amostras, como plasma, urina ou biópsia muscular. As pressões inspiratória e expiratória, o pico de fluxo da tosse e a CVF são avaliados para avaliar a mudança no desempenho respiratório. A alteração percentual na área de superfície alcançável da extremidade superior normalizada, a alteração percentual na pontuação da Avaliação do Desempenho do Membro Superior, a alteração percentual na pontuação da capacidade funcional da Medida de Resultado Relatada por Pessoa (PROM-UL) são usadas para avaliar a função muscular. Os questionários de qualidade de vida são úteis para determinar o efeito dos tratamentos. O corticosteróide pode ser administrado diariamente ou com menos frequência. Prednisolona pode ser administrada em 0,75 mg/kg/dia e Deflazacorte 0,9 mg/kg/dia como terapias padrão para pacientes com DMD ambulantes, em dois terços das doses padrão, metade da dose ou um terço da dose.
EXEMPLO 2
[00198] Em uma modalidade, ATL1102 é administrado a meninos pediátricos ambulantes de 4-11 anos de idade com DMD semanalmente em cerca de 1,5 mg/kg (cerca de 10 a 100 mg) e 3 mg/kg (20-200 mg) e 4,5 mg/kg (30-300 mg) por até 12 semanas. Os efeitos do oligonucleotídeo administrado, por exemplo, na função motora/muscular e marcadores inflamatórios são determinados. Meninos pediátricos ambulantes podem ser bons ou maus caminhantes. A manutenção ou redução da perda de capacidade de locomoção pode ser avaliada pelos métodos conhecidos por técnicos no assunto.
EXEMPLO 3
[00199] Em uma modalidade, 10 pacientes com DMD não deambulantes de 12 a 18 anos de idade recebem ATL1102 em uma dose inicial de 3 mg/kg uma vez por semana durante 4 semanas. Os primeiros 5 pacientes continuam com a dosagem de 3mg/kg/semana por mais 4 semanas e a dose dos 5 pacientes restantes aumenta para 4,5mg/kg/semana (duas vezes por semana 2,25mg/kg) por 4 semanas. Após 8 semanas de tratamento, é realizado um período de monitoramento de 4 semanas. No período de tratamento e monitoramento, as avaliações são iniciais, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas e 10 e 12 semanas. O resultado da atividade primária é avaliar o número de linfócitos circulantes, células T CD4+ e CD8+ e células T hi CD49d em 4 e 8 semanas de tratamento vs linha de base e segurança, incluindo reações nos locais de injeção, alterações plaquetárias, enzima hepática GGT-bilirrubina, CRP e albumina, mudanças na relação A/G. As avaliações clínicas dos desfechos secundários são medidas de força, função dos membros superiores e capacidade funcional, qualidade de vida e marcadores respiratórios e avaliação por ressonância magnética de fibrose muscular, inflamação-edema de gordura e atrofia e farmacocinética. As medidas de resultados exploratórios incluirão resposta de biomarcadores de soro/plasma, como aqueles relacionados à inflamação muscular, fibrose muscular, apoptose/degeneração muscular e regeneração muscular, incluindo citocinas, proteômica e matriz de RNA de células mononucleares e exossomo de RNA.
EXEMPLO 4 Administração de baixa dose de oligonucleotídeo inibitório
[00200] Em uma modalidade, 9 pacientes com DMD não ambulantes de 10 a 18 anos de idade, 25 a 60 kg de peso,
recebem ATL1102 em uma dose inicial de 25 mg uma vez por semana durante 24 semanas.
Após 24 semanas de tratamento, é realizado um período de monitoramento de 8 semanas.
No período de tratamento e monitoramento, as avaliações são iniciais e a cada 2 semanas durante o período de tratamento e a cada 4 semanas no período de monitoramento pós-
tratamento.
O resultado da atividade primária é avaliar o número de linfócitos circulantes, células T CD4+ e CD8+ e células T hi CD49d em 4 e 8 semanas de tratamento versus linha de base e segurança, incluindo reações nos locais de injeção, alterações plaquetárias, enzima hepática GGT-
bilirrubina, CRP e albumina, mudanças na relação A/G.
Os desfechos secundários para avaliações clínicas são medidas de força, na função do membro superior medida por myoset e capacidade funcional medida por PUL-2 (desempenho do módulo de membro superior para DMD 2.0), qualidade de vida e marcadores respiratórios e avaliação de ressonância magnética de fibrose muscular, inflamação-edema de gordura e atrofia e farmacocinética.
As medidas de resultados exploratórios incluirão respostas de biomarcadores de soro/plasma, como aqueles relacionados à inflamação muscular, fibrose muscular, apoptose/degeneração muscular e regeneração muscular, incluindo citocinas, uma ou mais das quais podem ser marcadores de lesão muscular e proteômica e matriz de RNA de células mononucleares e RNA potencialmente exossômico.
EXEMPLO 5 Resultados
[00201] Uma dose baixa de 25mg/semana de ATL1102 foi administrada por 12 semanas a um indivíduo não ambulante de 13 anos de idade e 62kg de peso, em uma dose diária de 30mg de corticosteroide (CS) Deflazacorte (0,48mg/kg/dia).
ATL1102 foi eficaz na redução do número de células por microlitro de células CD8+ circulantes e células CD8+ que expressam altos níveis de CD49d observados neste paciente no início do estudo (semana 1) antes de sua dose diária de CS, reduzindo marcadores de lesão muscular conforme medido por marcadores exploratórios bioquímicos, força muscular medida pelo myoset e, principalmente, função medida pelo PUL-2. Este indivíduo havia perdido a deambulação há aproximadamente 2,5 anos e estava em ~50% da dose padrão de tratamento de 0,90 mg/kg/dia de Deflazacorte para tratar indivíduos com DMD quando deambulam. A dose equivalente de prednisolona usada como tratamento padrão é 0,75mg/kg/dia na DMD quando deambulando.
Células imunes
[00202] Os efeitos do ATL1102 nas células imunes foram medidos por citometria de fluxo e hematologia na linha de base (semana 1), semana 5 (3 dias após a dose de ATL1103) e semanas 8 e 12 (7 dias após as doses da semana 8 e 12). Os efeitos do ATL1102 nas células CD8+ foram relativamente seletivos em comparação com experiências anteriores com ATL1102 mais alto na esclerose múltipla (MS) (Limmroth et al 2014). Os efeitos também foram mais prolongados do que 3 dias após a dosagem, conforme medido anteriormente no estudo de MS, com efeitos mostrados pela primeira vez 7 dias após a dosagem de ATL1102.
Myoset - dados de força muscular
[00203] Os dados preliminares do Myoset deste indivíduo 1 sugerem que após 12 semanas de dosagem em comparação com a linha de base, ele teve perda de força na mão dominante medida por myogrip, mas nenhuma perda de força no polegar medida por miopinch, nem perda na força do dedo, conforme determinado por moviplate com o número de toques sendo o mesmo após 12 semanas em relação ao valor da linha de base. Os dados, por outro lado, não sugerem perda de força na mão ou nos dedos e uma força numericamente maior no polegar na semana 12 em comparação com a linha de base. Ricotti et al (2016) analisaram 15 pacientes (14 tratados com CS) tratados por 12 semanas ou mais com CS e myoset e observaram uma tendência de redução média de 0,22 kg no miogrip e 0,1 kg na miopinch em comparação com a linha de base, e aumento na moviplate.
Dados de função PUL-2
[00204] PUL-2 para DMD é uma versão atualizada do
PUL-1 usada para medir a função dos membros superiores. O PUL-2 mede a função de ombro de nível superior com uma pontuação máxima de 12, função de cotovelo de nível médio com pontuação máxima de 17 e função distal de punho e mão com pontuação máxima de 13. Uma pontuação de entrada de 3 a 6 significa (6 sendo o mais alto e 1 o mais baixo) indica que um indivíduo pode ser avaliado quanto à função do ombro. O indivíduo um tinha uma função de nível de entrada de 5 e as medições registradas indicam que ele teve mais de 12 semanas de dosagem, sem perda na função no ombro com uma pontuação de 8 no início do estudo e na semana 12. O indivíduo 1 ganhou função no cotovelo de nível médio com uma pontuação de 14 na semana 12 vs 13 no início do estudo e ganhou função no punho distal e dimensão da mão com uma pontuação de 12 na semana 12 vs 10 no início do estudo. Em 12 semanas de dosagem em comparação com a linha de base, a pontuação PUL-2 foi de 34 em comparação com 31. A pontuação de entrada do paciente também aumentou do nível 5 na linha de base para o nível 6 consistente com os resultados de PUL-2 registrados.
[00205] A terapia adicional com ATL1102 pode ajudar a reter a força muscular medida pelo myoset e parece manter a função medida pelo PUL-2, senão, melhorar a função neste indivíduo. A terapia com ATL1102 pode, portanto, retardar a progressão da doença.
[00206] Os resultados validam o uso do anti-sentido para CD49d (cadeia alfa de VLA-4) em geral e ATL1102 especificamente para tratar pacientes com DMD e progressão lenta da doença de distrofia muscular como uma monoterapia ou em combinação com CS.
Medidas exploratórias de resultados farmacodinâmicos de lesão muscular
[00207] Creatina quinase (CK), Aspartato aminotransferase (AST) e Lactato desidrogenase (LDH) são medidas de lesão muscular em meninos com DMD principalmente relacionadas a baixos níveis de distrofina ou sem distrofina e lesão ao músculo após a contração, e secundariamente relacionada a processos inflamatórios e outros danos a jusante ao músculo. Creatina quinase (CK), Aspartato aminotransferase (AST) e Lactato desidrogenase (LDH) são medidas de lesão muscular em pacientes jovens ambulantes com DMD, que têm mais inflamação e massa muscular do que os pacientes não ambulantes.
[00208] No entanto, as amostras de sangue e soro foram coletadas para investigar as alterações nos marcadores de lesão muscular no indivíduo 1. No indivíduo 1 CK, ALT, AST, LDH foram reduzidos na semana 8 e 12 em comparação com a linha de base e com a semana 5. Os níveis da linha de base/semana 5 em unidades/litro para CK, ALT, AST, LDH respectivamente foram em 5860/6881, 304/404, não testado/184 e 632/681 em comparação com os níveis da semana 8/12 de 4606/5358, 265/250, 116/134 e 564/498. Os níveis de LDH foram reduzidos do que é considerado alto para dentro da faixa normal. Isso sugere que os sinais de lesão muscular, relacionados à perda de distrofina ou inflamação ou outros danos foram reduzidos neste paciente não deambulador.
[00209] Muitas modificações são englobadas como conhecidas por técnicos no assunto.
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Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de tratamento de distrofia muscular em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar periodicamente ao indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo que compreende a estrutura: 5' - MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC AMeUMeU MeCMeU - 3' em que, a) cada uma das 19 ligações internucleotídicas do oligonucleotídeo é um diéster de fosforotioato ligado à O,O; b) os nucleotídeos nas posições 1 a 3 a partir da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados por 2'-O- (2-metoxietila); c) os nucleotídeos nas posições de 4 a 12 da extremidade 5' são 2'-desoxirribonucleosídeos; d) os nucleotídeos nas posições de 13 a 20 da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados por 2'-O- (2-metoxietila); e e) todas as citosinas são 5-metilcitosinas (MeC), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, por um tempo e sob condições suficientes para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de distrofia muscular ou para retardar a progressão da distrofia muscular em um indivíduo.
2. Método para melhorar a função muscular ou retardar o declínio na função muscular em um indivíduo com distrofia muscular, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar periodicamente ao indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo que compreende a estrutura: 5' - MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC AMeUMeU MeCMeU - 3' em que, a) cada uma das 19 ligações intemucleotídicas do oligonucleotídeo é um diéster de fosforotioato ligado à O,O; b) os nucleotídeos nas posições 1 a 3 a partir da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados por 2'-O- (2-metoxietila); c) os nucleotídeos nas posições de 4 a 12 da extremidade 5' são 2'-desoxirribonucleosídeos; d) os nucleotídeos nas posições de 13 a 20 da extremidade 5' são ribonucleosídeos modificados por 2'-O- (2-metoxietila); e e) todas as citosinas são 5-Metilcitosinas (MeC), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero dos mesmos, por um tempo e sob condições suficientes para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de miofibras distróficas ou para retardar a progressão de distrofia muscular em um indivíduo.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a administração periódica é uma ou duas vezes ou três vezes por semana ou quinzenalmente ou mensal.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz é de lOmg a 300 mg.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz é selecionada a partir do grupo que consiste em 25 mg a 50 mg, 50 mg a l00mg, l00mg a 200 mg e l50mg a 300 mg.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é um sal de sódio ou de potássio.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o carreador farmacêutico é WFI e a composição é ajustada ao pH 7,2-7,6.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a MD é selecionada a partir do grupo que consiste em distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular do tipo cinturas (LGMD), distrofia muscular de Becker (BMD), distrofia muscular congénita (CMD incluindo MD congênita do tipo Fukuyama e MD congênita com deficiência de miosina), distrofia muscular facio-escápulo-humeral, oculofaríngea, de Emery-Dreifuss e distal.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a MD envolve uma mutação no gene de distrofina.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado com MD e é de ambulatório ou não ambulatório.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um menino juvenil ou púbere de 10 anos ou mais.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada subcutaneamente.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a administração é em combinação com o tratamento com corticosteroides.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13,
caracterizado pelo fato de que o corticosteroide é administrado em uma baixa dose.
15. Método de tratamento de distrofia muscular em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar periodicamente ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo inibitório para CD49d humano para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de distrofia muscular ou para retardar a progressão de distrofia muscular em um indivíduo.
16. Uso de um oligonucleotídeo inibidor para CD49d humano, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para melhorar um ou mais marcadores, sinais ou sintomas de distrofia muscular ou para retardar a progressão de distrofia muscular em um indivíduo com distrofia muscular.
17. Composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo inibitório para CD49d humano para uso no tratamento de DMD ou para retardar a progressão da DMD em um indivíduo.
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