JP3012923B2

JP3012923B2 - Ｃａｇリピート病の治療薬

Info

Publication number: JP3012923B2
Application number: JP10027739A
Authority: JP
Inventors: 省次辻
Original assignee: 新潟大学長
Priority date: 1998-01-26
Filing date: 1998-01-26
Publication date: 2000-02-28
Anticipated expiration: 2018-01-26
Also published as: CA2260311A1; EP0950406A2; JPH11209304A; EP0950406A3; CA2260311C; AU733910B2; AU1319199A; US6355690B1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＣＡＧリピート病
の治療薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリグルタミン鎖をコードするＣＡＧト
リヌクレオチド反復の伸長は、脊髄・延髄性筋萎縮症
（ＳＢＭＡ）¹、ハンチントン病（ＨＤ）²、１型脊髄
小脳運動失調症（ＳＣＡ１）³、歯状核赤核淡蒼球ルイ
体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）^4,5、アーシャード・ジョセフ
病（ＭＪＤ）⁶、ＳＣＡ２^7-９、ＳＣＡ６¹⁰、および
ＳＣＡ７¹¹という８種類の神経変成疾患に共通する病原
性変異であることが確認されており、同じ機序に起因す
ることが見いだされる疾患の数は今後さらに増えると予
想される。この一連の疾患には多くの共通した特徴があ
る。第一に、中枢神経系が主に冒され、それぞれの疾患
に特有な明瞭な分布の神経細胞損失を伴う。第二に、臨
床像には同一家系内でも高度の不均一性が認められ、こ
れにはＣＡＧ反復の伸長サイズが関係する。第三に、表
現促進効果、すなわち世代を経るに連れて若年発症化す
る。これはＣＡＧ反復の伸長サイズに世代間の増加が生
じる結果でもある。

【０００３】遺伝子産物の間にはポリグルタミンの連鎖
を除いて共通の相同ドメインはみられず^1-14変異遺伝子
の産物の発現レベルは野生型遺伝子と類似することが示
されている^15-18。これらの観察結果は、ポリグルタミ
ンの連鎖それ自体が「毒性機能の増加」の役目を果たす
可能性が高いことを示している。この考え方を裏付ける
所見として、伸長型ＣＡＧ反復を含み、Ｌ７プロモータ
ーの制御下にある完全長ＳＣＡ１のｃＤＮＡを導入した
トランスジェニックマウスは、小脳性運動失調、および
小脳ブルキンエ細胞の変性を来すことが示されてい
る¹⁹。さらに興味深いことに、ＭＪＤ１遺伝子の伸長し
たＣＡＧ反復が大部分を占める遺伝子²⁰、または伸長し
たＣＡＧ反復を含むhuntingtin遺伝子のエクソン１²¹を
導入したトランスジェニックマウスは、神経疾患の表現
型および神経変性を生じることも示されている。ごく最
近になって、伸長したＣＡＧ反復を含むＨＤ遺伝子のエ
クソン１を導入したマウスは神経細胞に核内封入体を生
じることが示されている。また、ＭＪＤ１蛋白質の伸長
したポリグルタミン鎖が大部分を占めるペプチドが毒性
を持つことは、ＣＯＳ細胞を用いた一時的発現系でも示
されている²²。このように、伸長したポリグルタミン鎖
が毒性機能を有することを示す所見は徐々に蓄積されつ
つある。

【０００４】伸長したポリグルタミン鎖が毒性を及ぼす
機序を説明するためにさまざまな仮説が提出されてい
る。Perutzらは、ポリグルタミン鎖は水素結合を会して
相補的な蛋白質同士を会合させることによって極性ジッ
パー(polar zipper)として機能し、ポリグルタミン鎖の
伸長が起こると異常蛋白質の会合および凝集は強固にな
るとの仮説を提唱した^23,24。Kahlemらは最近、興味深
い別の仮説を提出している²⁵。Kahlemらは、ポリグルタ
ミン鎖の伸長部を有する蛋白質は、野性型の蛋白質より
もトランスグルタミナーゼの基質として優れており、ポ
リグルタミン鎖の伸長部はリジル基を含むポリペプチド
との架橋によって共有結合した凝集体を形成しやすいと
の仮説を提唱した。

【０００５】しかしながら、ポリグルタミン鎖の伸長を
有する完全長または切断型の蛋白質が凝集体を形成し、
細胞毒性を示すかどうか、またトランスグルタミナーゼ
が凝集体形成または細胞毒性に関与するかどうかについ
ては何ら解明されていない。従って、また、変異型蛋白
質の細胞毒性を軽減する方法についても何ら知見がない
のが現状である。すなわち、ＣＡＧリピート病の治療法
については今日まで全く存在しなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＣＡＧリピ
ート（CAG repeat expansion disease) においてポリグ
ルタミン鎖の伸長がもたらす「毒性機能の増加」の分子
的機序を解明し、これによりＣＡＧリピート病に対する
治療薬を提供することを課題とする。すなわち、ＣＡＧ
リピート病においては、ＣＡＧリピートはタンパクへの
翻訳領域に存在し、ポリグルタミン鎖をコードしてい
る。ＣＡＧリピートが伸長すると、ポリグルタミン鎖が
長くなり、その結果、細胞に対する毒性を発揮するよう
になる。この細胞毒性の機構を解明し、その毒性を緩和
する方法を確立できれば、本疾患の治療法を開発するこ
とができる。本発明の目的は、このような方法によるＣ
ＡＧリピート病の治療法を開発することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲ
ＰＬＡ）に関する完全長および切断型のｃＤＮＡの発現
系を確立して検討を行った結果、ポリグルタミン鎖の伸
長を有する切断型のＤＲＰＬＡ蛋白質が核周辺および核
内に繊維性凝集物を形成するとともにアポトーシスを誘
発するが、完全型のＤＲＰＬＡタンパク質ではこの現象
は生じないことを見いだした。また、検討した全てのＤ
ＲＰＬＡ患者の小脳歯状核に繊維性凝集物が形成されて
いることを見出した。即ち、本発明者らは、切断型のＤ
ＲＰＬＡタンパク質とＤＲＰＬＡとの相関関係を見出し
た。

【０００８】さらに、本発明者らは、この繊維性凝集物
の形成およびアポトーシスにおけるトランスグルタミナ
ーゼ反応の関与も解明すべく、トランスグルタミナーゼ
阻害活性を有する、シスタミンおよびモノダンシルカダ
ベリンによる抑制効果を検討した結果、これらの薬物が
凝集物の形成やアポトーシス性細胞死の抑制効果を有す
ることを見出し、これによりＤＲＰＬＡにおいてトラン
スグルタミナーゼ反応が関与していることを解明した。

【０００９】そして、この一連の結果から、ＤＲＰＬＡ
を始めとするＣＡＧリピート病の治療にトランスグルタ
ミナーゼの活性阻害剤であるシスタミンおよびモノダン
シルカダベリンが有効に利用できることを見出した。即
ち、本発明は、シスタミンおよびモノダンシルカダベリ
ンのＣＡＧリピート病の治療への利用に関し、より具体
的には、（１）シスタミンまたはモノダンシルカダベリンを有効
成分とする、ＣＡＧリピート病の治療薬。（２）ＣＡＧリピート病が、脊髄・延髄性筋萎縮症、ハ
ンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、マーシ
ャード・ジョセフ病、１型脊髄小脳運動失調症、２型脊
髄小脳運動失調症、６型脊髄小脳運動失調症、および７
型脊髄小脳運動失調症からなる群より選択される、
（１）に記載の治療薬、に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は、トランスグルタミナー
ゼの活性の阻害剤である、シスタミンまたはモノダンシ
ルカダベリンを有効成分とする、ＣＡＧリピート病の治
療薬に関する。本発明において治療の対象となるＣＡＧ
リピート病としては、例えば、脊髄、延髄性筋萎縮症、
ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼ルイ体萎縮症、マーシ
ャード・ジョセフ病、１型脊髄小脳運動失調症、２型脊
髄小脳運動失調症、６型脊髄小脳運動失調症、および７
型脊髄小脳運動失調症が挙げられる。本発明の治療薬
は、シスタミンまたはモノダンシルカダベリンを有効成
分とする限り、公知の製剤学的方法により製剤化されて
いてもよい。製剤化のための他の成分としては、例え
ば、薬理学的に許容される担体または媒体、例えば、生
理食塩水、滅菌水、植物油、乳化剤、懸濁剤、安定剤等
が挙げられるが、これらに制限されない。本発明の治療
薬のＣＡＧリピート病患者への投与は、公知の投与方
法、例えば、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与などの
方法で投与することが可能である。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものでは
ない。（実施例１）ポリグルタミン鎖伸長部を含む切断型ＤＲ
ＰＬＡ蛋白質による凝集体形成およびアポトーシス性細
胞死の誘発完全長もしくは切断型のＤＲＰＬＡ変異蛋白質が凝集体
形成などの構造異常または細胞毒性を示すかどうかを調
べるために、完全長の野性型ＤＲＰＬＡ（グルタミン１
９個をコードする）および変異型ＲＰＬＡ（グルタミン
８２個をコードする）のｃＤＮＡのさまざまな欠失変異
体を作製した（図１）。これらｃＤＮＡを含むブラスミ
ドの構築は以下のように行った。

【００１２】正常長のＣＡＧ反復（ＣＡＧ反復１５回）
を含む完全長のヒトＤＲＰＬＡｃＤＮＡ（ｐＤＲＰＬＡ
Ｎ）は、部分的ＤＲＰＬＡｃＤＮＡクローン（Ｆ１およ
びＦ１５〜２０）¹⁸をｐＢluescript ＳＫ（−）ベクタ
ーに連結することによって作製した。伸長型のＣＡＧ反
復（ＣＡＧ反復７８回）を含む完全長のヒトＤＲＰＬＡ
ｃＤＮＡ（ｐＤＲＰＬＡＥ）はｐＤＲＰＬＡＮ中の９６
３ｂｐのＥｃｏＴ２２１−Ｓｐ１〔セグメントを、ＤＲ
ＰＬＡ患者のゲノムＤＮＡから構築したゲノムコスミド
ライブラリーから単離したコスミドＤＲＰＬＡゲノムク
ローン中の対応するＥ_COＴ２２１−Ｓｐｌ１セグメント
と置換することによって作製した。ｐＤＲＰＬＡＮまた
はｐＤＲＰＬＡＥまたはｐＤＲＰＬＡのＮｏｔｌ−ＢＢ
ｂｓｌ断片を除去した後、ＦＬＡＧタグおよびＢｂｓＩ
部分（配列番号：１／５′−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡ
ＧＡＧＣＣＧＣＣＡＺＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧ
ＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＣ−
３′）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）ベクター
と連結した（ｐＳＫ−ＡＦＮおよびｐＳＫ−ＡＦＥ）。
転写開始メチオニン、ＦＬＡＧタグおよびＤＲＰＬＡ
ｃＤＮＡの全体をコードするセグメントを含むｐＳＫ−
ＡＦＮまたはｐＳＫ−ＡＦＥのＮｏｔＩ−ＢｂｓＩ断片
を、哺乳類発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ³⁸にサブクロー
ニングした（ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＮおよびｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ−ＡＦＥ）。ＤＲＰＬＡｃＤＮＡのＣＡＧ反復の
上流には配列５′−ＣＡＧ−ＣＡＡ−ＣＡＧ−ＣＡＡ
（この部分はＣＡＧ反復数には含めていない）が位置す
るため、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＮおよびｐＥＦ−ＢＯＳ
−ＡＦＥはそれぞれ１９個および８２個のグルタミンを
コードする。

【００１３】伸長型ＣＡＧ反復および種々の長さの下流
セグメントを含む欠失変異体の構築においては、まず、
ＣＡＧ反復の上流の２１ｂｐ，ＣＡＧ反復の下流３０５
ｂｐの断片を含むｐＤＲＰＬＡＮのセグメントを、ＦＬ
ＡＧタグおよびＮｏｔＩリンカー配列を含むプライマー
（配列番号：２／５′−ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧ
ＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣ
ＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣ
ＡＡＣＡＧＣＡＡ−３′）および配列（配列番号：３／
５′−ＡＣＣＧＧＴＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＡＧＧＧＣ−
３′）のプライマーを用いるＰＣＲによってまず増幅し
た。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＮｏｒＩによって
消化した後、対応するＮｏｔＩおよびＮｏｒＩ断片を除
去したｐＤＲＰＬＡＥ中にサブクローニングした（ｐＢ
ＦＥ）。ＣＡＧ反復の下流セグメントの欠失体を、Ｅｘ
ｏＩＩＩ／ＭｕｎｇＢｅａｎヌクレアーゼによるｐＢ
ＦＥの消化、またはｐＤＲＰＬＡＥをテンプレートとし
て用いるＰＣＲによって作製した。この欠失型ＤＮＡセ
グメントを、３′端に複数停止部を持つリンカーととも
にｐＦＥ−ＢＯＳ発現ベクター中にサブクローニングし
た。この結果得られたプラスミドであるｐＥＦ−ＢＯＳ
−ＦＱ₈₂−４４７、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−３７６、
ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−１７４、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｆ
Ｑ₈₂−１２９、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ −１０１、ｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−４０およびｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ
₈₂−１９は、ヒスチジン３個、グルタミン８２個および
ポリグルタミン鎖の下流に種々の長さのアミノ酸（それ
ぞれ４４７、３７６、１７４、１２９、１０１、４０お
よび１９アミノ酸）を含む。グルタミン１９個をコード
する欠失変異体も同様の方法を用いて作製した。

【００１４】一方、ＣＡＧ反復および種々の長さの上流
セグメントを含む欠失変異体の構築においては、まず、
伸長型のＣＡＧ反復およびさまざまな長さの上流セグメ
ントを含むＤＮＡセグメントを、以下のセンスプライマ
ーのいずれか１つ「Ａ１ＦＬＡＧ」（配列番号：４／
５′−ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡ
ＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡ
ＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＴＡＡＡ
−３′）、「Ｃ１ＦＬＡＧ」（配列番号：５／５′−Ｇ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴ
ＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣ
ＣＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣ−３′）ま
たは「Ｃ２ＦＬＡＧ」（配列番号：６／５′−ＧＧＣＧ
ＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡ
ＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＡ
ＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＣＣＣ−３′）および
センスプライマー「ＥＢＲ」（配列番号：７／５′−Ｇ
ＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＡＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧ
ＧＴＧＧＧＧＡＡＡＴ−３′）を用いるＰＣＲによって
入手した。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＳａｌＩに
よって消化した後ｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクター中にサブ
クローニングした。この結果、得られたプラスミドであ
るｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｆ４８３−Ｑ₈₂、ｐＥＦ−ＢＯＳ−
Ｆ３２２−Ｑ₈₂およびｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｆ４８３−Ｑ₈₂
は、ＦＬＡＧＥＩ：グルタミン８２個、ポリグルタミン
鎖の下流の１８個のアミノ酸、およびポリグルタミン鎖
の上流に位置するそれぞれ４８３個、３２２個および１
７４個のアミノ酸をコードするセグメントを含む。

【００１５】これにより構築したプラスミドをＣＯＳ７
細胞へ導入した。具体的には、遺伝子導入の前日に、１
０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）中に懸濁したＣＯＳ７細胞を、１ウェル当たり
３×１０⁴個となるように８ウェル培養皿（Nunc 1nc.,
Naperville, IL)に播いた。このＣＯＳ７細胞に対し
て、Superfect トランスフェクション試薬（Quiagen, H
ilden, Germany) を製造者の指示に従って用いて、プラ
スミドＤＮＡ０．５μｇによる遺伝子導入を行った。

【００１６】この遺伝子導入細胞に関して、導入から７
２時間後に抗ＦＬＡＧＭ５モノクローン抗体を用いて
上記のさまざまなＤＲＰＬＡ蛋白質の発現パターンを分
析するとともに、アポトーシス性細胞死の起こりやすさ
を調べた。なお、細胞の抗ＦＬＡＧＭ５モノクローン
抗体を用いた免疫化学的染色においては、細胞を、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した４％バラホルム
アルデヒドにて３０分間固定し、０．０２％Triton X-1
00を含むＰＢＳによって透過化処理を施した後に、１０
％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中において室温（ＲＴ）で
３０分間インキュベートした。続いて細胞を１：５００
に希釈した抗ＦＬＡＧＭ５モノクローン抗体（Eastma
n Kodak, New Heaven, CT)とともに室温で２時間インキ
ュベートした後、ローダミンを結合させた抗マウスＩｇ
Ｇ（Dako, Glostrup, Denmark)とともに１時間インキュ
ベートし、蛍光顕微鏡を用いて観察した。アビジン・ビ
オチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）法を用いて、
３，３′−ジアミノベンジン・テトラヒドロクロライド
による免疫染色も実施した。細胞にヘマトキシリンによ
る対比染色を施した後に、光学顕微鏡を用いて観察し
た。

【００１７】その結果、正常長（グルタミン１９個）の
ポリグルタミン鎖を含む完全長のＤＲＰＬＡ蛋白質をコ
ードするｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＮによる遺伝子導入を施
した細胞では、ＤＲＰＬＡ蛋白質は均一または微粒子状
のパターンを示して細胞質中にひまん性に発現したが
（図２ｂ）、偽遺伝子導入細胞では抗体による染色は認
められなかった（図２ａ）。伸長したポリグルタミン鎖
（グルタミンＢ２個）を含む完全長のＤＲＰＬＡ蛋白質
をコードするｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＮによる遺伝子導入
を施した細胞（図２ｃ）、および正常長のポリグルタミ
ン鎖（グルタミン１９個）が大部分を占める切断型のＤ
ＲＰＬＡ蛋白質をコードするｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−
１９による遺伝子導入を施した細胞（図２ｄ）も、ｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−ＡＦＮを導入した細胞（図２ｂ）と同様の
発現パターンを示した。しかし、伸長したポリグルタミ
ン鎖（グルタミン８２個）が大部分を占める切断型蛋白
質をコードするｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−１９による遺
伝子導入を施した細胞では、主に核周辺の細胞質領域に
凝集体が認められた（図２ｅ，ｆ）。この凝集体は、一
部の細胞集団ではユビキチンに関して免疫陽性であった
が、ビメンチンおよびコンゴーレッド染色に関しては陰
性であった。時間の経過に従って、この凝集体を含む細
胞は萎縮し、ＴＵＮＥＬアッセイ（terminal deoxynucl
eotidyltransferase-mediated dUTP-biotinnick end-la
beling)で陽染されるようになる（図２ｇ）。遺伝子導
入から７２時間後にはこのようなＴＵＮＥＬ陽性細胞が
高頻度に認められる（細胞の５２％に凝集体が生じ
る）。これに対して、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＮ、ｐＥＦ
−ＢＯＳ−ＡＦＥまたはｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₁₉−１９
による遺伝子導入を施した細胞の中にアポトーシス性細
胞は認められなかった（図２ｊ）。また、切断型の変異
蛋白質からなる凝集物の存在下において、伸長したポリ
グルタミン鎖を含む完全長の変異型ＤＲＰＬＡ蛋白質が
凝集体に組み込まれているかどうかを調べるために、伸
長したポリグルタミン鎖とＧＦＰ（グリーン蛍光蛋白
質）との融合物が大部分を占める切断型の変異蛋白質を
コードするもう１つのプラスミド構築物（ｐＥＧＦＰ−
Ｑ −１９）を作製した。

【００１８】その結果、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＥとｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−ＦＱ −１９による同時遺伝子導入を施し
た細胞では、ＦＬＡＧタグを付加した完全長の変異型Ｄ
ＲＰＬＡ蛋白質が凝集体に組み込まれていることが明確
に示された（図２ｈ，ｉ）。ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＥの
みを導入した細胞ではこのような凝集は全く認められな
かった（図２ｃ）。

【００１９】凝集体の形成が変異蛋白質の長さによって
決まるかどうかを明らかにするため、完全長の野生型Ｄ
ＲＰＬＡおよび変異型ＤＲＰＬＡのｃＤＮＡのさまざま
な欠失変異体を作製した（図１）。ポリグルタミン鎖お
よび１２９アミノ酸未満の下流領域（ＦＱ −１２９、
ＦＱ −１０１、ＦＱ −４０またはＦＱ −１２９）
を含む切断型ＤＲＰＬＡ蛋白質を発現している細胞内で
は、高い頻度（７１〜８８％）で凝集体形成が認められ
た（図３ｂ）。頻度は低かったものの、さまざまな長さ
の上流領域および伸長したポリグルタミン鎖（Ｆ４８３
−Ｑ、Ｆ３２２−ＱまたはＦ１７４−Ｑ）を発現
している細胞内でも凝集体形成が認められた（図３
ａ）。ＴＵＮＥＬ反応によって染色された細胞の割合
は、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−１２９、ｐＥＦ−ＢＯＳ
−ＦＱ −１０１、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ −４０また
はｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−１２９を導入した細胞で高
かった。凝集体を生じた細胞では、ＴＵＮＥＬ反応によ
って検出されるアポトーシス性細胞死が認められたこと
から、凝集体形成がアポトーシス性細胞死の原因となる
ことが強く示された。

【００２０】（実施例２）凝集体形成の時間依存性凝集体の形成の時間依存性につき検討した。免疫化学的
染色は、実施例１と同様に細胞を固定して行った。その
結果、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ −１９による遺伝子導入
から２４時間後に、ＦＬＡＧエピトープを発現している
細胞のうち５３％で凝集体の形成が認められた（図４
ａ，ｄ）。凝集体を生じた細胞の割合は、遺伝子導入か
ら４８および７２時間後には、それぞれ６５％（図４
ａ，ｄ）および８９％（図４ｂ，ｄ）に増加した。ＴＵ
ＮＥＬ陽性細胞の頻度は、遺伝子導入から２４時間後に
はわずか１％であったが、遺伝子導入から４８および７
２時間後には、それぞれ９％および５２％に増加した
（図４ｄ）。

【００２１】（実施例３）凝集体の詳細な構造の解析凝集体の詳細な構造をさらに解明するために、ｐＥＦ−
ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−１９による遺伝子導入を施した細胞を
電子顕微鏡を用いて観察した。具体的には、まず、細胞
を４％パラホルムアルデヒド−０．１％グルタールアル
デヒドを含むｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液中にて
室温で１５分間固定した。続いて、段階的ジメチルホル
ムアルデヒド処理による脱水の後、細胞をＬＲＷｈｉ
ｔｅ樹脂（london Rasin Company）中に包埋した。超薄
切片を作成し、ニッケルグリッド上に載せた。１０％正
常ヤギ血清を含むＰＢＳ中にて室温で１０分間インキュ
ベートした後、切片を１：４０００に希釈した抗ＦＬＡ
ＧＭ５モノクローン抗体とともに４℃で一晩インキュ
ベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片を径１０ｎｍの
金粒子を結合させたヤキ抗マウス１ｇＧ（British Bioc
ell International、Cardiff 、UK；１：３０希釈）と
ともに室温で３０分間インキュベートした。続いて切片
をＰＢＳで洗浄し、２％グルタールアルデヒドを含むｐ
Ｈ７．４の０．１Ｍカコジル酸緩衝液中にてインキュ
ベートした。蒸留水で洗浄した後、切片を酢酸ウラニル
およびクエン酸鉛によって染色し、日立Ｈ−７１００電
子顕微鏡を用いて観察した。

【００２２】この免疫電子顕微鏡法による観察の結果、
凝集体は繊維性凝集物からなり、主に核周辺の細胞質領
域に存在することが判明した（図５ａ，ｂ）。この繊維
性凝集物は、分岐のない直線状またはわずかに湾曲した
直径約１０〜１２ｎｍの繊維の放射状配列からなる（図
５ｂ，ｃ）。凝集体の内部には特定の細胞内オルガネラ
は認められなかった。このような凝集体は核周辺領域だ
けでなく、核内にも時折認められた（図５ｂ，ｃ）。ま
た凝集物の繊維と類似した形態を持つ非凝集性の繊維が
細胞質にも核内にも散在していた。このような細胞内で
は、凝集物の繊維が核膜を貫通し、その一部が核孔を通
過している像が比較的高い頻度で認められた（図５
ｃ）。この繊維性構造が認められたのはｐＥＦ−ＢＯＳ
−ＦＱ₈₂−１９を導入した細胞のみであり、ｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ−ＡＦＮ，ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＥおよびｐＥＦ−
ＢＯＳ−ＦＱ₁₉−１９による遺伝子導入を施した細胞で
はこれは認められなかった。遺伝子導入後の培養時間が
経過すると、凝集物を含むアポト−シス性構造体が多数
認められるようになった（図５ｄ）。

【００２３】実施例４ＤＲＰＬＡ患者の小脳歯状核に
おける核内封入体の検出ＤＲＰＬＡ患者の脳内に同じような凝集体が存在するか
どうかを調べるために、抗ＤＲＰＬＡ蛋白質ポリクロー
ン抗体を用いて、ＤＲＰＬＡ患者５例および対照例５例
の小脳歯状核の免疫組織学的分析を行った。まず、剖検
脳をリン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド液中にて固定
し、組織学的検査のためにパラフィン包埋した。免疫染
色は、ウサギ抗ユビキチン抗体（Dakopatts ；１：２０
０希釈）、またはＤＲＰＬＡ蛋白質の１７２〜２５３ア
ミノ酸残基を含むＧＳＴ融合蛋白質に対して作製した
後、ＧＳＴ−融合蛋白質を結合させた Affigel−１０カ
ラム(Bio−Rad)を用いてアフィニティ精製を施したウサ
ギ抗ＤＲＰＬＡ蛋白質ポリクローン抗体（１：３００希
釈）を用いて実施した。その結果、抗ＤＲＰＬＡ蛋白質
抗体（図６ａ）および抗ユビキチン抗体（図６ｂ）によ
って染色される核内封入体が、ＤＲＰＬＡ患者５例全例
に存在することが確かめられた。同様の封入体は対照群
（前吸収処理を受けた抗ＤＲＰＬＡタンパク質抗体）で
は全く認められなかった。

【００２４】また、この核内封入体を電子顕微鏡を用い
て検討した。具体的には、３％グルタールアルデヒド−
１％パラホルムアルデヒドを含むｐＨ７．４の０．１Ｍ
リン酸緩衝液によって細胞を固定し、１％四酸化オスミ
ウム中にて後固定を行った後に、段階的エタノール処理
によって脱水し、Ｅｐｏｎ８１２中に包埋した。超薄片
を作成し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛によって染色
した後に、日立Ｈ−７１００電子顕微鏡を用いて観察し
た。その結果、この核内封入体は微粒子で構成され、繊
維性構成を一部含むことが明らかになった（図６ｃ）。
以上の結果は、核内封入体の形成が神経変性疾患の発症
に重要であるとの可能性が高いことを示す。

【００２５】実施例５トランスグルタミナーゼ阻害剤
による凝集体形成およびアポトーシス性細胞死の抑制凝集体の形成およびアポトーシス性細胞死に対するトラ
ンスグルタミナーゼ反応の関与を検討するために、遺伝
子導入を施したＣＯＳ７細胞をトランスグルタミナーゼ
阻害剤（シスタミン²⁸、モノダンシルカダベリン（ＭＤ
Ｃ）²⁹およびプトレッシン³⁰）の存在下で培養した。こ
の目的のために、本発明者らは切断製ＤＲＰＬＡ蛋白質
をグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質として
発現させ、生きた細胞を高感度で観察できるようにし
た。これはｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−１９およびｐＥＦ
−ＢＯＳ−ＦＱ₁₉−１９の挿入部を、ＧＦＰのコード領
域を含むｐＥＧＦＰ中に移行することによって行った。
この結果得られたプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−ＦＱ
₈₂−１９およびｐＥＧＦＰ−ＦＱ₁₉−１９）をＣＯＳ細
胞に遺伝子導入した。このプラスミドＤＮＡの作成方法
は、次の通りであった。ヒスチジン３個、ポリグルタミ
ン鎖およびポリグルタミン鎖の下流に位置する１９アミ
ノ酸をコードするＤＲＰＬＡｃＤＮＡのセグメント
（ｐＤＲＰＬＡＥまたはｐＤＲＰＬＡＮ）を、ＥｃｏＲ
Ｉのリンカー配列を含むプライマー（配列番号：８／
５′−ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣ
ＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧ−３′、配列番
号：９／５′−ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＡ
ＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＴ−３′）を用いる
ＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩによって消化した後、ｐＥＦＰ−Ｎ１
発現ベクター中にサブクローニングした（Clontech, Pa
lo Alto, CA)。構築物の核酸配列はＤＮＡ自動シークエ
ンサーを用いて確認した（PE Applied Biosystems, Fog
ter City, CA）。

【００２６】ｐＥＧＦＰ−Ｑ₁₉−１９による遺伝子導入
を施した細胞では、細胞質中にびまん性にＧＦＰ融合蛋
白質が発現したが（図７ａ）、ｐＥＧＦＰ−ＦＱ −１
９を導入した細胞では凝集体が形成され（図７ｃ）、そ
れぞれｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₁₉−１９およびｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ−ＦＱ₈₂−１９を導入した細胞と類似していた。シ
スタミンの投与により、ｐＥＧＦＰ−ＦＱ₁₉−１９導入
細胞における融合蛋白質の発現パターンは変化しなかっ
た（図７ｂ）。しかし、１ｍＭシスタミン中にてｐＥＧ
ＦＰ−ＦＱ_mz−１９導入細胞を６０時間培養すると、凝
集体の形成は４２％から３３％に有意に抑制された（ｐ
＜０．０１）（図７ｃ，ｄ，ｅ）。１ｍＭシスタミンの
存在下では、核断片化も３８％から２４％に抑制された
（ｐ＜０．０１）（図７ｆ）。遺伝子導入から２４およ
び４８時間後にも同様の結果が認められた（図７ｅ，
ｆ）。これに対して、凝集体の形成を伴わずに細胞質中
にびまん性の発現を認めた細胞の頻度は、遺伝子導入の
６０時間後では３２％（シスタミン非投与）から５５％
（１ｍＭシスタミン）に増加した（ｐ＜０．０１）。凝
集体形成および核断片化の抑制はシスタミン濃度が１０
０μＭの場合にも認められ、この抑制効果は用量依存的
な様式を示した（図８ａ，ｄ）。

【００２７】凝集体形成およびアポト−シス性細胞死に
対するその他のトランスグルタミナーゼ阻害剤（ＭＤＣ
およびプトレッシン）の作用も調べた。アポト−シス性
細胞死の定量的アッセイには、in situ 細胞死検出キッ
ト（Boehinger Mannheim, Mannheim, Germany)を製造者
の指示に従って用いてＴＵＮＥＬアッセイを実施した。
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
反応には、ＦＩＴＣを結合させたｄＵＴＰを用いた。核
断片化に関するアッセイは、５μＭのWoechst33342 を
用いた細胞の染色によって行った。定量的評価はＦＬＡ
Ｇエピトーブを発現している細胞１００個を分析するこ
とによって実施した。統計的分析にはStudent のｔ検定
を用いた。

【００２８】その結果、ＭＤＣにより、核断片化は用量
依存的な様式で強く抑制された（図８ａ）。ＭＤＣの存
在下で遺伝子導入細胞を培養した場合には、凝集体のサ
イズはＭＤＣ非投与時と比べて小さくなったが、凝集体
の形成を伴う細胞の頻度には有意の変化はみられなかっ
た（図８ｂ）。プトレッシンは、凝集体形成（図８ｃ）
および核断片化（図８ｆ）をいずれも抑制しなかった。

【００２９】

【発明の効果】本発明によりシスタミンまたはモノダン
シルカダベリンを有効成分とする、ＣＡＧリピート病に
対する治療薬が提供された。

【００３０】

【引用文献】

【表１】

【００３１】

【表２】

【００３２】

【表３】

【００３３】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】さまざまな長さの欠失を伴う完全長のＤＲＰＬ
ＡｃＤＮＡおよび切断型のＤＲＰＬＡｃＤＮＡの構
造を示す図である。ＦＬＡＧエピトープおよびポリグル
タミン鎖はそれぞれ黒く塗りつぶした部分および斜線部
分で示した。蛋白質コード配列は塗りつぶしていない部
分として示した。

【図２】ＣＯＳ７細胞で発現した完全長および切断型の
ＤＲＰＬＡ蛋白質の免疫組織化学的分布を示す顕微鏡写
真（図２ａ〜２ｉ）、並びに凝集体陽性細胞およびＴＵ
ＮＥＬ陽性細胞の割合を示す（グラフ図２ｊ）図であ
る。（ａ）偽遺伝子導入、（ｂ）ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦ
Ｎ、（ｃ）ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＡＦＮ、（ｃ）ｐＥＦ−Ｃ
ＯＳ−ＡＦＥ、（ｄ）ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₁₉−１９、
（ｅ）ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ_mz−１９による遺伝子導入
を施し、導入から７２時間後に抗ＦＬＡＧＭＳモノクロ
ーン抗体による染色を施した。（ｅ）はローダミン結合
抗マウスＩｇＧ染色または（ｆ）はＡＢＣ法によって検
出した。（ｇ）は、ＦＩＴＣ結合ｄＵＴＰを用いるＴＵ
ＮＥＬ反応による陽染を示す。（ｈ）は、ｐＥＦ−ＢＯ
Ｓ−ＡＦＥおよびｐＥＦＦＰ−Ｑ₈₂−１９を導入した細
胞のＧＦＰ像、（ｉ）は抗ＦＬＡＧ抗体による検出を示
す。（ｊ）は凝集体を含む細胞の割合（塗りつぶしてい
ない部分）、および凝集体を有する細胞の中でＴＵＮＥ
Ｌ反応で染色されあ細胞の割合（塗りつぶした部分）を
平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。

【図３】凝集体を生じた細胞の割合、および凝集体を有
する細胞の中でＴＵＮＥＬ反応で染色された細胞の割合
を示す図である。ＣＯＳ７細胞に、ＤＲＰＬＡｃＤＮ
Ａのさまざまな欠失変異体を含むｐＥＧＦＰベクターに
よる遺伝子導入を施した後、凝集体の形成（塗りつぶし
ていない部分）およびＴＵＮＥＬ反応（ぬりつぶした部
分）に関してアッセイした。各数値は平均±ＳＥＭ（ｎ
＝３）として示した。

【図４】凝集体の時間依存的発現を示す顕微鏡写真であ
る。ＣＯＳ７細胞にｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−１９によ
る遺伝子導入を施した後、抗ＦＬＡＧＭ５モノクロー
ン抗体を用いて免疫組織学的分析を行った。（ａ）は遺
伝子導入から２４時間後のＣＯＳ７細胞、（ｂ，ｃ）は
それぞれ遺伝子導入から４８および７２時間後のＣＯＳ
細胞を示す。（ｄ）は各時間における凝集体陽性細胞お
よびＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を示す図である。各数値
は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。

【図５】ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＦＱ₈₂−１９による遺伝子導
入を施したＣＯＳ７細胞に生じた凝集体の電子顕微鏡写
真を示す。（ａ）は抗ＦＬＡＧＭ５モノクローン抗体
を用いたイムノゴールド染色像であり、抗体がＣＯＳ７
細胞内で凝集物を形成する放射状に配列した繊維と結合
することが観察される。（ｂ，ｃ）では、凝集物は核内
で形成される頻度は低いが、核周辺の細胞質には高い頻
度で認められ、直径約１０〜１２ｎｍの直線状またはわ
ずかに彎曲した繊維から構成されていることが観察され
る。（ｃ）では凝集体形成性繊維が核膜を貫通する像も
認められた。（ｄ）ではアポトーシス性構造体の一部は
周囲の細胞によって包み込まれていた。スケールバー＝
２００ｎｍ（ａ）、１μm （ｂ）、４００ｎｍ（ｃ）お
よび２μm （ｄ）。

【図６】ＤＲＰＬＡ患者の小脳歯状核における核内封入
体の顕微鏡像である。（ａ）はＤＲＰＬＡ患者の小脳歯
状核における神経細胞核内封入体を、ＤＲＰＬＡ蛋白質
の１７２〜２５３残基に対して作製した抗ＤＲＰＬＡ蛋
白質ポリクローン抗体によって染色したものである。
（ｂ）は抗ユビキチン抗体で染色したものである。
（ｃ）は電子顕微鏡写真である。スケールバー＝１μm
（ａ，ｂ，ｃ）。核内封入体は矢印で示した。

【図７】ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｑ₈₂−１９による遺伝子導入
を施したＣＯＳ７細胞の凝集体形成およびアポトーシス
性細胞死に対するシスタミンの作用を示す顕微鏡写真、
並びにグラフを示す。（ａ）は１ｍＭシスタミンの非存
在下、（ｂ）は存在下においてｐＥＧＦＰ−ＦＱ₁₉−１
９による遺伝子導入を施したＣＯＳ７細胞を５０時間培
養し、凝集体形成およびHoechst ３３３４２による染色
で検出したものである。（ｃ）は１ｍＭシスタミンの非
存在下、（ｄ）は存在下においてｐＥＧＦＰ−ＦＱ₈₂−
１９による遺伝子導入を施したＣＯＳ７細胞を５０時間
培養し、凝集体形成およびHoechst ３３３４２による染
色で検出したものである。（ｅ）はｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｑ
₈₂−１９による遺伝子導入を施したＣＯＳ７細胞におけ
る凝集体形成の程度に対するシスタミンの作用を示すグ
ラフである。（ｆ）はｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｑ₈₂−１９によ
る遺伝子導入を施したＣＯＳ７細胞における核断片化の
程度に対するシスタミンの作用を示すグラフである。各
数値は平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として示した。

【図８】ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｑ₈₂−１９による遺伝子導入
を施したＣＯＳ７細胞の凝集体形成およびアポトーシス
性細胞死に対するシスタミン、モノダンシルカダベリン
（ＭＤＣ）およびプトレッシンの作用を示すグラフであ
る。ｐＥＧＦＰ−ＦＱ₈₂−１９による遺伝子導入を施し
たＣＯＳ７細胞を、さまざまな濃度のシスタミン（ａ，
ｄ）、ＭＤＣ（ｂ，ｅ）またはプトレッシンとともにイ
ンキュベートし、凝集体形成（ａ，ｂ，ｃ）および核断
片化（ｄ，ｅ，ｆ）に関してアッセイした。各数値は平
均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表示した。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】シスタミンまたはモノダンシルカダベリ
ンを有効成分とする、ＣＡＧリピート病の治療薬。
【請求項２】ＣＡＧリピート病が、脊髄・延髄性筋萎
縮症、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮
症、マーシャード・ジョセフ病、１型脊髄小脳運動失調
症、２型脊髄小脳運動失調症、６型脊髄小脳運動失調
症、および７型小脳運動失調症からなる群より選択され
る、請求項１に記載の治療薬。