KR20080031164A

KR20080031164A - ＳＲ 단백질의 결합의 방해에 의해 그리고 이차 ＲＮＡ구조의 방해에 의한 ｐｒｅ－ｍＲＮＡ에서 엑손 인식의조절

Info

Publication number: KR20080031164A
Application number: KR1020077026619A
Authority: KR
Inventors: 주디스 크리스티나 데오도라 반 듀테콤; 안네미케 아르츠마-러스; 가리트-얀 보드와인 반 오멘
Original assignee: 아카데미슈 지켄후이스 라이덴
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2006-04-21
Publication date: 2008-04-08
Also published as: US20090312532A1; CA2605512A1; NZ563206A; EP1877555A2; AU2006237727A1; JP2008538500A; WO2006112705A3; CN101184841A; WO2006112705A2; AU2006237727B2

Abstract

본 발명은 엑손이 pre-mRNA에서 스킵핑될 수 있고 그리하여 그것의 생산된 mRNA로부터 배제되어 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 방법을 제공한다. 나아가 SR 단백질이 결합을 변경하기 위한 방법 및/또는 스플라이싱 공정들로 방해하기 위한 mRNA의 이차 구조를 변경하기 위한 방법, 그리고 질병의 치료에 있어 올리고뉴클레오티드 및 방법들의 용도가 제공된다. 나아가 pre-mRNA에서 여러 엑손의 스킵핑을 유도하기 위한 약제학적 제조물, 및 방법과 수단이 제공된다.

엑손, 올리고뉴클레오티드, 스플라이싱

Description

ＳＲ 단백질의 결합의 방해에 의해 그리고 이차 ＲＮＡ 구조의 방해에 의한 ｐｒｅ－ｍＲＮＡ에서 엑손 인식의 조절{Modulation of exon recognition in pre-mRNA by interfering with the binding of SR proteins and by interfering with seconcary RNA structure}

본 발명은 분자 생물학 및 약제의 분야에 관한 것이다. 더욱 자세히는 본 발명은 pre-mRNA로부터 생산된 mRNA의 재구성, 및 그것의 약제학적 용도에 관한 것이다.

생물학의 센트럴 도그마는, 유전 정보가 세포의 DNA에 있고 이 정보의 전사로 발현되며, 그 후 암호화된 단백질의 생산이 세포의 번역 기관에 의해 뒤따르게 된다는 것이다. 이러한 견지의 유전 정보의 흐름은 세포의 단백질 함량으로 방해할 우세 DNA 기반 접근법을 촉구해온다. 이러한 견지는 천천히 변하고 있고, DNA 수준에서 방해에 대한 대안들이 수행되고 있다.

더 고차 진핵생물들(higher eukaryotes)에서, 세포의 DNA에서 단백질에 대한 유전 정보는 인트론 서열에 의해 서로 분리된 엑손에서 암호화된다. 이들 인트론들은 일부 경우에서 매우 길다. 전사 기관은 엑손 및 인트론을 함유하는 pre-mRNA를 생성하는데, 반면 스플라이싱(splicing) 기관은, 종종 pre-mRNA의 생산 동안 이미, pre-mRNA에 존재하는 엑손들을 함께 스플라이싱함에 의해 단백질을 위한 실제 코딩 부위를 생성한다.

비록 pre-mRNA로부터 mRNA의 생산에 관련된 실제 과정에 관해 더 많이 알려질수록, 또한 더 많은 것이 숨겨져서 남아있다. 본 발명에서 다른 mRNA가 생산되는 것 같이 스플라이싱 과정에 영향을 줄 수 있음이 나타났다. 그 과정은 스플라이싱 기관에 의해 생산된 mRNA의 예견가능하고 재현가능한 재구성을 고려한다. 성숙 mRNA에 보통 포함되는 엑손의 위치에서 pre-mRNA으로 하이브리드화 될 수 있는 올리고뉴클레오티드는 표적화된 엑손 또는 그것의 부분의 배제를 겨냥할 수 있다(또한 엑손-스킵핑(skipping)으로 일컬어짐).

본 발명은 엑손 스킵핑 과정들에 적합한 올리고뉴클레오티드를 확인하는 선택 과정에 사용되는 대체 방법들을 제공한다. 본 발명은 추가로, 그중 특히 전에 스킵핑될 수 없었던 엑손들을 스킵핑할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 발명자들은 앞서 인간 대조구 근육대롱세포 배양에서 14 뒤시엔느 근이영양증(duchenne muscular dystrophy, DMD)의 스킵핑을 유도하도록 37개 엑손-내부 역배열(antisense)의 올리고뉴클레오티드들 (AON들)을 확인하였다. 발명자들은 총 35개 엑손의 스킵핑을 유도할 수 있는 신규한 AON들을 제시한다.

발명자들의 WO 2004/083432 특허 출원서에서, 발명자들은, 상기 RNA의 또 다른 부분으로 하이브리드되는 구조(폐쇄 구조)로 추정하는 영역 및 상기 구조에서 하이브리드되지 않는(개방 구조) 영역을 결정하는 것을 포함하는, 엑손으로부터 RNA의 (예견된) 2차 구조로부터의, 올리고뉴클레오티드를 생성하고, 이어서 적어도 일부는 상기 폐쇄 구조에 상보성이고 적어도 일부는 상기 개방 구조에 상보성인 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 방법을 설명하였다.

발명자들은 지금 올리고뉴클레오티드를 고안하고 생성하기 위한 대체 방법을 개시하는데, 방법은 임의로 WO 2004/083432의 방법과 조합될 수 있다.

발명자들은 실험 부분에서, 엑손 스킵핑을 유도함에 있어 엑손-내부 역배열 올리고뉴클레오티드(AON)의 효과성과, 상기 AON의 표적 pre-mRNA에서 예견된 SR 결합 부위의 (예를 들어 ESE파인더) 존재 사이에 상관관계의 존재를 개시한다. 그 결과 발명자들은 엑손의 RNA에서 SR 단백질을 위한 (추정;putative) 결합 부위를 결정하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성하고, 상기 RNA에 상보성이고 상기 (추정) 결합 부위와 적어도 부분적으로 중복되는 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위한 대체 방법을 제시한다. 용어 "적어도 부분적으로 중복"은 여기에서, 상기 결합 부위의 완전한 중복뿐만 아니라 상기 결합 부위의 복합 뉴클레오티드만큼이나 SR 결합 부위의 단지 하나의 단일 뉴클레오티드의 중복을 포함하는 것으로 정의된다. 바람직한 구현에서 본 발명은 추가로 상기 RNA의 2차 구조, 상기 RNA의 또 다른 부분으로 하이브리드되는 영역(폐쇄 구조) 및 상기 구조에서 하이브리드되지 않는 영역(개방 구조)로부터 결정하는 것, 그리고 이어서 상기 (추정) 결합 부위과 적어도 부분적으로 중복되고 상기 폐쇄 구조의 적어도 일부와 중복되고 상기 개방 구조의 적어도 일부와 중복되는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것을 포함한다. 이러한 방법에서 발명자들은 pre-mRNA로부터 mRNA로의 엑손 봉입(inclusion)을 방해할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 얻을 기회를 증가시킨다. 첫 번째 선택된 SR-결합 영역는 요청된 개방-폐쇄 구조를 가지지 않는 것이 가능한데, 이 경우에 또 다른 (두 번째) SR 단백질 결합 부위는 그 후 이어서 개방-폐쇄 구조의 존재에 대해 시험되어 선택된다. 이들 과정은, 서열이 (부분적으로 중복되는) 개방-폐쇄 구조뿐만 아니라 SR 단백질 결합 부위를 함유한다고 확인될 때까지 계속된다. 이러한 서열은 그 후 상기 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드를 고안하기 위해 사용된다.

올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 그러한 방법은 설명된 순서를 역으로도 또한 시행하였는데, 즉, 먼저 엑손으로부터의 2차 RNA의 구조로부터, 상기 RNA의 또 다른 부분으로 하이브리드되는 구조로 추정하는 영역(폐쇄 구조) 및 상기 구조에서 하이브리드되지 않는 영역(개방 구조)를 결정하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성하고, 뒤이어서 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부는 상기 폐쇄 구조에 상보성이고 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 또 다른 일부는 상기 개방 구조에 상보성인 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 그 후 SR 단백질 결합 부위가 상기 개방/폐쇄 구조와 적어도 중복되는지 아닌지를 결정하는 것이 뒤따른다. 이러한 방법으로 WO 2004/083432의 방법이 개선된다. 또 다른 구현에서 선택은 동시에 행해진다.

용어 상보성(complementarity)은 여기에서 생리학적 조건들 하에서 핵산의 또 다른 범위로 하이브리드될 수 있는 핵산의 범위를 일컫는데 사용된다. 그리하여 상보성의 부위에서 모든 염기들은 대립 가닥에서 염기와 쌍을 이룰 수 있음이 전혀 요구되지 않는다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 고안할 때, 예를 들어 상보성 가닥 상에 염기와 염기쌍을 이루지 않는 잔기를 통합하고 싶어할 수 있다. 불일치는 어느 정도는 허용될 수 있는데, 만약 세포에서의 상황하에서라면, 뉴클레오티드의 범위는 상보성 부분으로 하이브리드될 수 있다. 바람직한 구현에서, 상보성 부분은 3 이상, 더욱 바람직하게는 4 이상 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 상보성 영역는 바람직하게는, 조합될 때, 그들이 pre-mRNA에서 엑손에 대해 특이하도록 고안된다. 그러한 특이성은, 계에서의 다른 (pre-)mRNA에서 실제 서열들에 의존함에 따른 상보성 영역의 다양한 길이들로서 야기될 수 있다. 하나 이상 다른 pre-mRNA가 올리고뉴클레오티드로 하이브리드될 수 있을 위험은, 올리고뉴클레오티드의 증가하는 크기로 감소된다. 상보성의 영역에서 불일치를 포함하는, 그러나 pre-mRNA에서 표적이 된 영역(들)로 하이브리드될 능력을 보유하는 올리고뉴클레오티드가, 본 발명에서 사용될 수 있음이 명백하다. 그러나, 이들은 보통, 하나 이상 상보성 영역에서 그러한 불일치들을 가진 올리고뉴클레오티드보다 더 높은 효율 및 더 높은 특이성을 가지므로, 바람직하게는 적어도 상보성 부분들이 그러한 불일치들을 포함하지 않는다. 더 높은 하이브리드화 강도(즉, 대립 가닥과의 상호작용의 증가하는 수)는 계의 스플라이싱 기관으로 방해하는 과정의 효율을 증가시킴에 있어 바람직하다고 생각된다.

바람직하게는, 상보성은 90 내지 100% 사이이다. 일반적으로 이것은 약 20개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드에서 약 1개 또는 2개 불일치(들)를 허용한다.

2차 (개방-폐쇄) 구조는 엑손이 존재하는 pre-mRNA의 상황에서 가장 잘 분석된다. 그러한 구조는 실제 RNA에서 분석될 수 있다. 그러나, 최근에는 구조-모형화 프로그램을 사용하여 상당히 만족스럽게 RNA 분자의 2차 구조(가장 낮은 에너지 비용에서)를 예견하는 것이 가능하다. 적합한 프로그램의 비-한정적 예는 RNA mfold 버전 3.1 server (Methew et al 1999, J. Mol. Biol. 288: 911-940)이다. 당업자들은 적절한 재현성으로, 뉴클레오티드 서열을 주었던, 엑손의 유사한 구조를 예견할 수 있을 것이다. 그러한 모형화 프로그램을 엑손 및 인접 인트론 서열 둘 모두와 제공하였을 때 최고의 예측이 얻어졌다. 일반적으로 전체 pre-mRNA의 구조를 모형화하는 것은 필요하지않다.

상기한 것은 SR 단백질 결합 부위의 존재 또는 부재에 대해 진실이다. 적합한 프로그램의 비-한정적 예는 ESEfinder이다.

올리고뉴클레오티드가 겨냥되는 개방 및 폐쇄 구조는 바람직하게는 서로 인접한다. 이러한 방법에서 개방 구조에 올리고뉴클레오티드의 아닐링(annealing)은 폐쇄 구조의 개방을 유도하고, 그 결과 아닐링은 이들 폐쇄 구조로 진행한다고 생각된다. 이들 활동을 통해서 이전 폐쇄 구조는 다른 배치(conformation)를 나타낸다. 다른 배치는 엑손 봉입 신호의 파괴를 초래한다. 그러나, 잠재 (잠적) 스플라이스(splice) 수용체 및/또는 공여체 서열이 표적화된 엑손 내에 존재할 때, 때때로 새로운 엑손 봉입 신호는 다른 (네오, neo) 엑손을 한정하여, 즉, 다른 5' 말단, 다른 3' 말단, 또는 둘 모두로 생성된다. 이들 유형의 활성은, 표적화된 엑손이 mRNA로부터 배제되기 때문에 본 발명의 범위 내에 있다. 표적화된 엑손의 부분을 포함하여, mRNA에서 새로운 엑손의 존재는 표적화된 엑손이, 그 자체로,배제된다는 사실을 바꾸지 않는다. 네오-엑손의 봉입은 단지 가끔 일어나는 역효과로 보일 수 있다. 엑손 스킵핑이 돌연변이의 결과로써 붕괴되는 (일부의) 개방 리딩 프레임(open reading frame)을 복구하는데 사용될 때 두 가지 가능성이 있다. 하나는 네오-엑손이 리딩 프레임의 복구에 기능하는 것이고, 다른 경우에서는 리딩 프레임이 복구되지않는다. 엑손-스킵핑에 의해서 리딩 프레임을 복구하기 위해 올리고뉴클레오티드를 선택할 때, 당연히 네오-엑손이 있거나 또는 없거나 이들 조건 하에서 개방 리딩 프레임을 복구하는 엑손-스킵핑을 확실히 초래하는 올리고뉴클레오티드들이 선택됨이 명백하다.

이론으로 연결되기를 바람 없이, SR 단백질 결합 부위을 겨냥한 올리고뉴클레오티드의 사용은, 붕괴되거나 손상된 스플라이싱을 초래하는, SR 단백질의 결합 부위에 SR 단백질의 결합을 (적어도 부분적으로) 손상하는 것을 초래한다.

바람직하게는, 개방/폐쇄 구조 및 SR 단백질 결합 부위는 부분적으로 중복되고, 더욱더 바람직한 개방/폐쇄 구조는 완전히 SR 단백질 결합 부위와 중복되거나 또는 SR 단백질 결합 부위가 완전히 개방/폐쇄 구조와 중복된다. 이것은 엑손 봉입의 향상된 붕괴를 허용한다.

pre-mRNA는 다양한 스플라이싱 경우들을 겪게, 예를 들어 선택적 스플라이싱(alternative splicing)을 통해서 할 수 있다. 그러한 경우들은 세포 또는 인공 스플라이싱 계의 환경에 의해 유도되거나 촉진될 수 있다. 그리하여, 동일한 pre-mRNA로부터 여러 다른 mRNA들이 생산될 수 있다. 엑손의 정의 그대로, 다른 mRNA 모두는 엑손의(exonic) 서열들을 포함하였다. 그러나, mRNA 함량의 유동성은 본 발명에서 용어 엑손의 정의를 필요로 한다. 본 발명에 따른 엑손은 pre-mRNA 및 그것으로부터 생산된 mRNA 둘 모두에 존재하는 서열인데, 여기서 mRNA에 포함된 서열은, pre-mRNA에서, 서열들이 mRNA에 존재하지않음에 의해 한 면 (첫 번째 및 마지막 엑손)또는 두 면 모두 (첫 번째 및 마지막 엑손 외에 다른 엑손)에 인접된다. 원칙적으로 pre-mRNA로부터 생산된 어떤 mRNA는 이 정의에 맞는다. 그러나, 본 발명을 위해, 소위 우성 mRNA들, 즉 설정된 조건하에서 pre-mRNA로부터 생산된 mRNA의 5% 이상을 만들어내는 mRNA가 바람직하다. 인간 면역-결핍 바이러스는 특히 극도로 선택적 스플라이싱을 사용한다. 몇몇 매우 중요한 단백질 산물들은 상기 바이러스로부터 생산된 총 mRNA의 5% 미만을 만들어내는 mRNA로부터 생산된다. 레트로바이러스들의 게놈의 RNA는 그것으로부터 파생된 스플라이스된 산물을 위한 pre-mRNA로서 보일 수 있다. 선택적 스플라이싱은 다른 세포 유형들에서 다양할 수 있기 때문에, 엑손들은 그 계에서 사용된 스플라이싱 조건들의 관계에서의 엑손들로 한정된다. 가상적 예로써; 근육 세포에서 mRNA는 신경 세포에서 동일한 pre-mRNA로부터 생산된 mRNA에서 부재인 엑손을 함유할 수 있다. 유사하게, 암 세포에서 mRNA는 정상 세포에서 동일한 mRNA로부터 생산된 mRNA에 존재하지 않는 엑손을 함유할 수 있다.

선택적 스플라이싱은 동일한 pre-mRNA로부터 스플라이싱에 의해 발생할 수 있다. 그러나, 선택적 스플라이싱은 pre-mRNA에서 돌연변이, 예를 들어 추가적인 스플라이스 수용체 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 생성하는 것을 통해서 또한 발생할 수 있다. 그러한 선택적 스플라이스 서열은 종종 잠적 스플라이스 수용체/공여체 서열로 일컬어진다. 그러한 잠적 스플라이스 부위들은 새로운 엑손들(네오-엑손들)을 초래할 수 있다. 생산된 mRNA로의 네오-엑손들의 봉입은 본 발명의 방법을 사용하여 적어도 일부에서 예방될 수 있다. 네오-엑손이 잠적 및 "정상" 스플라이스 공여체/수용체 서열에 의해 인접된 경우에서, 네오-엑손은 오래된(구, paleo) 엑손을 포위한다. 이러한 경우에서 원(original) 스플라이스 공여체/수용체 서열은, 잠적 스플라이스 공여체/수용체가 그것의 위치를 가지기 위해, 여전히 pre-mRNA에 존재할 때, 네오-엑손의 엑손-인식 신호로의 방해에 의해 구-엑손을 함유하는 mRNA의 생산을 강화할 수 있다. 이러한 방해는 구-엑손에 상응하는 네오-엑손의 부분, 또는 그러한 네오-엑손들의 추가적인 부분 둘 모두에서 있을 수 있다. 엑손 스킵핑의 이러한 유형은 스플라이스 교정으로 보일 수 있다.

바람직한 구현에서, 생성된 올리고뉴클레오티드는 14 내지 50 뉴클레오티드의 연속 부분에 상응하고, 더욱 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오티드는 RNA를 포함하고, 더욱더 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메틸 RNA이고 전장(full-length) 포스포로티오에이트 백본(phosphorothioate backbone)을 가진다. 올리고뉴클레오티드 길이의 일반적인 예는, 표 1 및/또는 2로부터 얻을 수 있다: 15 내지 24 뉴클레오티드들. 2'-O-메틸 RNA는 천연 핵산에 비해 효소 분해에 대한 증가된 안정성뿐만 아니라 상보성 DNA 또는 RNA를 첨가하는, 특별한 하이브리드화 특성으로 특징지어지는 핵산 유사체이다. 임상적 발달에 있어 최근 대부분 역배열 올리고뉴클레오티드는, 리보뉴클레아제 (RNase) H에 의해 mRNA 표적의 분열을 자극하는 능력을 보존하는 반면 뉴클레아제에 대한 저항성을 증진시키기 위해, 포스포로티오에이트 백본 변형을 통합한다.

엑손 스킵핑 기술은 여러 다른 목적을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 엑손 스킵핑은 개체에서 원치않는 스플라이싱을 나타내는 pre-mRNA로부터 생산된 mRNA를 재구성하기 위해 사용된다. 재구성은 세포에 의해 생산된 단백질을 양을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 이것은 세포가 원치않은 특정 단백질을 생산할 때 유용하다. 바람직한 구현에서는 그러나, 재구성은 세포에서 기능성 단백질의 생산을 촉진하기 위해 사용되는데, 즉 재구성은 기능성 단백질을 위한 코딩 영역의 생성으로 이끈다. 나중의 구현은 바람직하게는 돌연변이의 결과로써 잃어버린 오픈 리딩 프레임을 복구하기 위해 사용된다. 바람직한 유전자들은 뒤시엔느 근이영양증 유전자 (DMD), 콜라겐 VI 알파 1 유전자 (COL6A1), 근세관성 근병증(myotubular myopathy) 1 유전자 (MTM1), 디스퍼린(dysferlin) 유전자 (DYSF), 라미닌-알파 2 유전자 (LAMA 2), 에머리-드레이푸스 근 이영양증(emery-dreyfuss muscular dystrophy) 유전자 (EMD), 및/또는 칼파인 3 유전자 (CAPN3)를 포함한다. 본 발명은 추가로 뒤시엔느 근이영양증 (DMD) 유전자로부터 도출된 예에 의해서 앞으로 서술된다. 비록 이 유전자가 본 발명에서 특히 바람직한 유전자를 구성하지만, 본 발명이 이 유전자에 한정되지는 않는다.

뒤시엔느 근이영양증 (DMD) 및 벡커(Becker) 근이영양증 (BMD)은 둘 다, X 염색체상에 위치되고 이양소(dystrophin) (1-6)을 암호화하는, DMD 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된다. DMD는 남자 신생아 1:3500의 발생률을 가진다. 환자들은 13세 전에 휠체어에서 생활하게 되고 30대 전에 종종 죽는, 진행성 근육 약화로 고통받는다(7). 보통 더 경증 BMD는 1:20,000의 발병률을 가진다. BMD 환자는 종종 40세 이상까지 여전히 보행가능하며, DMD 환자에 비교할 때 기대 수명이 더 길다(8).

이양소는 다른 것들 중에서 근섬유의 막 안정성을 유지하는, 이양소-당단백질 복합체 (DGC)의 필수 성분이다(9, 10). DMD 유전자에서 프레임-시프트(frame-shifting) 돌연변이는 근 세포에서 이양소 결핍을 초래한다. 이것은 다른 DGC 단백질의 감소된 수준에 의해 수반되고, DMD 환자들에서 발견된 중증 표현형을 초래한다(11, 12). 리딩 프레임 무손상을 유지하는 DMD 유전자에서 돌연변이는, 덜 심한 BMD와 조합된, 더 짧은, 그러나 부분적으로 기능적인 이양소를 생성한다(13, 14).

비록 질병 소견들의 발병 및/또는 진행의 지연이 글루코코르티코이드 치료법에 의해 달성될 수 있지만(16), 광범위한 노력에도 불구하고, DMD 환자들에게 임상적으로 적합하고 효과적인 치료법은 아직 개발되지 않았다(15). mdx 마우스 모형 및 DMD 환자들로부터의 세포들에서 이양소 pre-mRNA의 리딩 프레임을 복구하는 것을 겨냥한 유전적 치료법 상에 전도유망한 결과들이 최근에 발명자들 및 다른 이들에게 보고되었다(17-23). 특이 엑손의 표적화된 스킵핑에 의해, DMD 표현형은 더 경증인 BMD 표현형으로 전환될 수 있다. 엑손의 스킵핑은 스플라이스 부위, 또는 엑손-내부 서열들의 하나 또는 둘을 겨냥하는 역배열 올리고리보뉴클레오티드들(AON들)의 결합에 의해 유도될 수 있다. 두 스플라이스 부위들이 스플라이시오솜 복합체에 의해 인식될 때, 엑손은 mRNA에서만 포함될 것이기 때문에, 스플라이스 부위들은 AON들에 대한 분명한 표적이다. 이것은 비록 가변적 효능 및 효율을 가지지만 성공적인 것으로 보인다(17, 18, 20, 21).

교감 스플라이스 부위들 서열들 외에도, 많은 (전부가 아니라면) 엑손들은 스플라이시오솜(spliceosome)에 의해 진성(genuine) 스플라이스 부위들의 인식을 촉진하기 위한 엑손의 스플라이싱 증강제 (ESE) 서열들과 같은 스플라이싱 조절 서열들을 포함한다(Cartegni, Chew, 및 Krainer 285-98). SR 단백질로 불리는, 스플라이싱 인자들의 서브그룹은 이들 ESE들에 결합하고 (약하게 한정된) 스플라이스 부위들에 대해 U1 및 U2AF와 같은, 다른 스플라이싱 인자들을 보충할 수 있다. 가장 많은 네 가지 SR 단백질들 (SF2/ASF, SC35, SRp40 및 SRp55)의 결합 부위들이 자세하게 분석되었고, 이들 결과들은 ESEfinder, 이들 SR 단백질들에 대해 잠재 결합 부위들을 예측하는 웹 소스에서 구현되었다(Cartegni et al. 3568-71). 여기에서 실험 부분 개시된 대로 AON의 유효성 및 SF2/ASF, SC35 또는 SRp40 결합 부위의 존재/부재 사이에 상관관계가 있다. 바람직한 구현에서, 본 발명은 그리하여 상기 설명된 대로 방법을 제공하는데, 여기서 상기 SR 단백질은 SF2/ASF 또는 SC35 또는 SRp40이다. 더욱더 바람직한 상기 SR 단백질은 DMD의 엑손 8, 46, 48, 52, 54-56, 58, 60-63 또는 71-78을 암호화하는 mRNA에 결합한다.

본 발명의 요청을 충족하는 어떤 올리고뉴클레오티드는 DMD 유전자에서 엑손 스킵핑을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 상기 설명된 대로 방법에 의해 달성가능한 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물, 또는 표 2에 묘사된 엑손 스킵핑을 유도할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물을 제공한다. 본 발명은 추가로, 인간 DMD 유전자의 엑손들 8, 46, 48, 52, 54-56, 58, 60-63 또는 71-78에 상보성인, 표 2의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 등가물은 유사한, 바람직하게는 양에서 꼭 그런 것이 아니라, 본질적으로 동일한 하이브리드화 능력을 포함하고, 예를 들어 상기 올리고뉴클레오티드의 단편, 점돌연변이를 가진 올리고뉴클레오티드, 결손 또는 추가적인 뉴클레오티드를 가진 올리고뉴클레오티드 또는 그것들의 어떤 조합일 수 있다.

본 발명의 방법을 통해서 생성된 상보성 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 상기 엑손 RNA의 13 내지 50 뉴클레오티드의 연속 부분에 상보성이다. 또 다른 구현에서 본 발명의 방법을 통해서 생성된 상보성 올리고뉴클레오티드는 상기 엑손 RNA의 16 내지 50 뉴클레오티드의 연속 부분에 상보성이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 상기 엑손 RNA의 13 내지 25 뉴클레오티드의 연속 부분에 상보성이다. 바람직하게는 상기 엑손 RNA의 14 내지 25 뉴클레오티드이다. 다른 유형의 핵산이 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 RNA/RNA 하이브리드가 매우 안정적이기 때문에, RNA를 포함한다. 엑손 스킵핑 기술의 목표들 중 하나는 개체에 스플라이싱을 겨냥하는 것이기 때문에, 올리고뉴클레오티드 RNA가 추가적인 특징, 예를 들어 엔도뉴클레아제 및 RNaseH에 대한 저항성, 추가적인 하이브리화 세기, 증가된 안정성 (예를 들어 체액에서), 증가 또는 감소된 유연성, 줄어든 독성, 증가된 세포내 수송, 조직-특이성, 등을 가진 RNA를 제공하는 변형을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 변형이 2'-O-메틸-포스포로티오에이트 올리고리보뉴클레오티드 변형을 포함한다. 바람직하게는 상기 변형이 2'-O-메틸-포스포로티오에이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드 변형을 포함한다. 한 구현에서 본 발명은 2'-O-메틸-포스포로티오에이트 올리고(데옥시)리보뉴클레오티드 변형 및 잠긴(locked) 핵산을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하이브리드 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 특정 조합은 잠긴 핵산의 등가물에 비해 더 우수한 서열 특이성을 포함하고, 2'-O-메틸-포스포로티오에이트 올리고(데옥시)리보뉴클레오티드 변형으로 구성된 올리고뉴클레오티드와 비교했을 때 향상된 효율성을 포함한다.

핵산 모방 기술의 출현으로, 핵산 자신에 대해 양에서 꼭 그런 것이 아니라 본질적으로 유사한, 바람직하게는 동일한 하이브리드화 특성을 가지는 분자들을 생성하는 것이 가능해졌다. 물론 그러한 등가물은 또한 발명의 일부이다. 그러한 모방 등가물의 예들은 펩티드 핵산, 잠긴(locked) 핵산 및/또는 모폴리머 포스포로디아미데이트(morpholino phosphorodiamidate)이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 등가물의 적합하지만 비-한정적인 예들은 Wahlestedt, C. et al. (2000), Elayadi, A.N. & Corey, D.R. (2001), Larsen, H.J., Bentin, T. & Nielsen, P.E. (1999), Braasch, D.A. & Corey, D.R. (2002), Summerton, J. & Weller, D. (1997)에서 발견될 수 있다. 하나 이상의 등가물 사이의 하이브리드 및/또는 핵산과의 하이브리드 또한 물론 본 발명의 일부이다. 잠긴 핵산이 더 높은 표적 친화력 및 감소된 독성을 나타내고, 그리하여 엑손 스킵핑의 더 높은 효율성을 보여주기 때문에, 바람직한 구현에서 등가물은 잠긴 핵산을 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 엑손의 스플라이스 공여체 또는 스플라이스 수용체와 중복을 가지지 않는다.

스플라이싱 계를 포함하는 전사 계는 생체 외에서 생성될 수 있다. 당업계는 유용한 적합 계를 가진다. 그러나, mRNA 재구성에 대한 필요는 물론, 살아있는 세포의 조작에 대해 현저하게 느껴진다. 바람직하게는, 원하는 효과가 mRNA의 재구성을 통해서 달성될 수 있는 세포들이다. 재구성되는 바람직한 mRNA는 여기에서 위에 나열된다. 바람직하게는, 근 세포에서의 유전자 활성이 본 발명에서 사용된다. 근 세포(즉, 근 세관)는, 다수지만 전부는 아닌 근 세포 특이 유전자들이 장(長) pre-mRNA를 통해 전사되는 다핵 세포이다. 그러한 장 mRNA로부터 생산된 mRNA의 재구성이 특히 효과적이기 때문에, 그러한 장 pre-mRNA는 본 발명을 위해 바람직하다. 비록 꼭 그렇게 되어야 하는 것은 아니지만, 공정이 진행될 더 많은 시간이 허용되기 때문에, 완전한 pre-mRNA를 생성하는데 필요한 상대적으로 긴 시간이, 본 발명의 방법 또는 수단을 이용하는 재구성의 효율을 촉진한다고 생각된다. mRNA가 바람직하게 본 발명의 방법에서 재구성되는 유전자의 바람직한 군은 다음을 포함한다: Bethlem 근병증(myopathy)을 일으키는 COL6A1, 근세관성 근병증을 일으키는 MTM1, DYSF (Miyoshi 근병증 및 LGMD를 일으키는 디스퍼린), Merosin-결핍 근이영양증을 일으키는 LAMA2(라미닌 알파 2), 에머리-드레이푸스 근이영양증을 일으키는 EMD (에머린), 뒤시엔느 근이영양증 및 벡커 근이영양증을 일으키는 DMD 유전자, 및 LGMD2A를 일으키는 CAPN3 (칼파인). 언급된 대로 어떤 세포라도 사용될 수 있지만, 바람직한 세포는 DMD 환자로부터 유래된 세포이다. 세포들은 생체 외에서, 즉 개체의 몸 밖에서 조작될 수 있다. 그러나, 원칙적으로 세포들은 생체 내 재구성 능력으로 공급된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물을 가진 세포들을 제공하기 위한 적합한 수단은 당업계에 존재한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 발현 벡터의 형태에서 세포에 제공되는 것일 수 있는데, 여기서 발현 벡터는 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 전사물(transcripts)을 암호화한다. 발현 벡터는 바람직하게는 유전자 전달 매개체를 통해서 세포 내로 도입된다. 바람직한 전달 매개체는 아데노 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이고, 더욱 바람직하게는 아데노-연합 바이러스 벡터이다. 본 발명은 그리하여 그러한 발현 벡터 및 전달 매개체를 또한 제공한다. 그것은 적합한 전사물을 고안하기 위한 당업자의 기술에 속한다. 본 발명을 위해 바람직한 것은 PolIII 유도된 전사물들이다. 바람직하게는 U1 또는 U7 전사를 가진 융합 전사물의 형태에서이다. 그러한 융합들은 참고문헌 53 및 54에서 설명된 대로 생성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물을 가진 세포들을 제공하기 위한 수단에서의 향상은 지금까지 이미 달성된 진보를 고려하는 것을 예상하고 있다. 그러한 장래의 향상은 물론, 본 발명의 방법을 사용하는 mRNA의 재구성 상에 언급된 효과를 달성하기 위해 통합될 수 있다. 오늘날 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 등가물 또는 합성물을 생체 내 세포로 전달하기 위한 적합한 수단은 핵산 트랜스펙션을 위해 적합한 폴리에틸렌이민 (PEI) 또는 합성 양친매성 물질(amphiphils, SAINT-18)을 포함한다. 양친매성 물질들은 증가된 전달 및 감소된 독성을 보여주고, 생체 내 전달에 사용될 때 또한 그렇다. 바람직하게는 합성물들은 Smisterova, J., et al (2001)에서 언급되었다. 사용된 합성 양친매성 물질은 바람직하게는 쉽게 합성적으로 유용한 '긴 꼬리의' 피리디늄 헤드 기 기반 물질 상에 기반된다. 합성된 양친매성 물질의 거대한 군 내에서, 여럿이 전체 세포 생존에 관하여 낮은 독성으로 조합된 눈에 띄는 트랜스펙션 가능성을 보여준다. 구조적 변형의 용이성은 추가 변형 및 그것들의 추가 (생체 내) 핵산 전달 특징 및 독성의 분석을 허용하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물은 pre-mRNA에서 상기 엑손의 인식을 적어도 일부는 변경하기 위해 사용될 수 있다. 본 구현에서 스플라이싱 기관은 엑손 경계들을 mRNA로 연결하는 것이 적어도 일부는 차단된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물은 pre-mRNA에서 엑손-인식을 적어도 일부는 변경할 수 있다. 그리하여 이러한 용도가 또한 본 발명에서 제공된다. mRNA에서 표적이 된 엑손의 봉입의 방지는 또한 pre-mRNA에서 엑손 스킵핑을 적어도 일부는 자극하기 위한 용도로써 또한 제공된다. 상기 언급된 대로, 표적이 된 엑손은 생성된 mRNA에서 포함되지 않는다. 그러나, 엑손의 부분 (네오-엑손)은 생산된 mRNA에서 때때로 보유될 수 있다. 이것은 가끔, 표적이 된 엑손이 잠재 스플라이스 수용체 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 함유할 때 발생한다. 본 구현예에서 스플라이싱 기관은 이전의 스플라이스 수용체/공여체 서열을 이용하지 않도록(또는 저용(underuse)하도록), 그로 인해 새로운 엑손(네오-엑손)을 만들어 내도록 방향이 바뀐다. 비록 이것은 꼭 그렇게 되어야 하는 것은 아니지만, 네오-엑손은 구-엑손과 공통으로 하나의 말단을 가진다. 그리하여 한 측면에서 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 그것으로의 등가물은 스플라이스 공여체 또는 스플라이스 수용체가 스플라이싱 기관에 의해 사용될 때 효과성을 변경하기 위해 사용된다.

또 다른 구현에서 본 발명은 약물의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 그것의 등가물의 용도를 제공한다.

언급된 대로, mRNA를 재구성하기 위한 바람직한 유전자는 DMD 유전자이다. DMD 유전자는 여러 다른 엑손들을 가진 거대한 유전자이다. 유전자가 X-염색체에 위치한다는 것을 고려하여, 비록 소녀들 또한 이 질병에 감염될 수 있지만, 그들은 양쪽 부모로부터 유전자의 하나의 열성 본을 받을 수 있기 때문에, 그들의 근 세포에서 특히 편재된 X 염색체 비활성화 때문에 기능상 대립유전자의 특히 편재된 비활성화로 감염되거나 고통받는 것은 대부분이 소년들이다. 단백질은 적어도 2,6 Mb의 범위를 넘어서 대다수의 엑손들(79)에 의해 암호화된다. 결손은 DMD 유전자의 어떤 부분에서 발생할 수 있다. 특정 엑손 또는 특정 엑손들의 스킵핑은, 매우 자주, 정상보다 더 짧은, 그러나 적어도 부분적으로는 기능상 이양소 단백질을 암호화하는 재구성된 mRNA를 초래할 수 있다. 엑손-스킵핑 기술에 기초한 약물의 개발에 있어 실제적 문제는, 세포에서 기능상 이양소 단백질에서의 결핍을 초래할 수 있는 대다수의 돌연변이이다. 이미 다수의 다른 돌연변이들이 단일 엑손의 스킵핑에 의해 수정될 수 있다는 사실에도 불구하고, 다른 돌연변이들을 위해 다른 엑손들이 스킵될 필요가 있기 때문에 이러한 대다수의 돌연변이는 많은 다른 약제들의 생성을 요구한다.

더욱더 바람직한 구현에서, 본 발명에 따른 다수의 (둘 이상) 올리고뉴클레오티드는 하나 이상 엑손이 단일 약제로 스킵될 수 있는 약물의 제조에 사용된다. 한정된 수의 약제들만이 여러 다른 뒤시엔느 또는 벡커 돌연변이들을 치료하기 위해 생성될 필요가 있다는 점에서, 이러한 특성은 단지 실제적으로만 매우 유용한 것이 아니다. 당업자들에게 지금 공개되는 또 다른 선택은, 특히 기능상 재구성된 이양소 단백질을 선택하고 이들 바람직한 이양소 단백질을 생성할 수 있는 합성물을 생산하는 것이다. 그러한 바람직한 결과 생성물들은 앞으로 경증 표현형 이양소로 일컬어진다. 보통 이양소 단백질의 구조는, 긴, 적어도 부분적으로 유연한 막대에 의해 서로 연결된, 구조적 기능(비드들(beads))을 가지는 두 종말점(endpoint)들로서 개략적으로 표현될 수 있다. 이러한 막대는 많은 벡커 환자들에서는 짧아진다. 특히 바람직한 구현에서 본 발명은, 첫 번째 행에서 언급된 엑손의 엑손-스킵핑을 유도함에 있어 유효한 올리고뉴클레오티드, 또는 그것의 등가물을 상기 환자에게 제공하는 것을 포함하여, 표 3에 나타낸 대로 돌연변이를 포함하는 DMD 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 구현에서 상기 올리고뉴클레오티드는 표 2에서 언급된 엑손-스킵핑을 유도하는 데 있어 유효한 올리고뉴클레오티드, 또는 그것의 등가물을 포함한다.

상기 관점에서, 본 발명은 추가로 약물의 제조를 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 그것의 등가물 또는 합성물의 용도를 제공한다. 추가로 본 발명에 따른 약제학적 제조물이 제공된다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드, 또는 그것의 등가물은 유전병(예를 DMD)의 치료를 위한 약물의 제조를 위해 사용될 수 있다. 유사하게 pre-mRNA에서의 엑손이 스플라이싱 기관에 의해 인식될 때 효과성을 변경하기 위한 방법이 제공되는데, 여기서 상기 pre-mRNA는 둘 이상 엑손 및 하나 이상 인트론을 포함하는 유전자에 의해 암호화되고, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드, 그것의 등가물 또는 본 발명에 따른 합성물과 함께 상기 스플라이싱 기관 및 상기 유전자를 포함하는 전사 계를 제공하는 것을 포함하고, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드, 그것의 등가물 또는 합성물은 상기 엑손 중 하나 이상으로 하이브리드화 될 수 있고, 상기 전사 계에서 발생하기 위한 전사 및 스플라이싱을 허용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자는 3 이상 엑손들을 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드, 또는 그것의 등가물은 물론, mRNA의 구조로 방해하기 위한 다른 방법들과 조합될 수 있다. 예를 들어 방법에서 pre-mRNA에서 하나 이상 다른 엑손에 상보성인 하나 이상 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이 가능하다. 이것은 이러한 pre-mRNA로부터 생산된 mRNA에서 pre-mRNA의 둘 이상 엑손의 봉입을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현에서, 상기 하나 이상 다른 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 방법을 통해서 생성된, 올리고뉴클레오티드, 또는 그것의 등가물이다. 본 발명의 이러한 부분은 앞으로 이중- 또는 다중-엑손 스킵핑으로 일컬어진다. 대개 경우들에서, 이중-엑손 스킵핑은 pre-mRNA로부터의 단지 두 표적이 된 (상보성) 엑손들의 배제를 초래한다. 그러나, 다른 경우들에서 표적이 된 엑손 및 상기 pre-mRNA에서 상기 엑손 사이에서의 전체 영역은, 다른 엑손들 (개입 엑손들)이 그러한 영역에 존재할 때조차, 생산된 mRNA에서 존재하지 않음이 발견된다. 이러한 다중-스킵핑은 DMD 유전자로부터 파생된 올리고뉴클레오티드들의 조합에 대해 특히 그러한데, 여기서 엑손 45에 대해 한 올리고뉴클레오티드 및 엑손 51에 대해 한 올리고뉴클레오티드가 DND 유전자를 전사하는 세포에 더해졌다. 그러한 배열은 엑손 45에서 51을 함유하지 않고 생산되는 mRNA를 초래하였다. 분명히, 상기한 올리고뉴클레오티드들의 존재에서 pre-mRNA의 구조는 스플라이싱 기관이 엑손 44 및 52를 서로 연결되도록 자극되는 것이었다.

두 상보성 올리고뉴클레오티드들 사이에 연결을 제공함에 의해 또한 개입 엑손들의 스킵핑을 특히 증진할 수 있음이 발견되었다. 이 때문에, 본 발명은 유전자에 의해 암호화된 pre-mRNA에서 둘 이상 엑손으로 하이브리드될 수 있는 합성물을 제공하는데, 여기서 상기 합성물은, 첫 번째 부분이 상기 둘 이상 엑손들의 첫 번째에 상보성인 8 이상 연속 뉴클레오티드들을 가진 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 두 번째 부분이 상기 pre-mRNA에서 두 번째 엑손에 상보성인 8 이상 연속 뉴클레오티드를 가진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 부분을 둘 이상 포함한다. 둘 이상 부분들은 단일 분자를 형성하도록 상기 합성물에 결합된다. 결합은 어떤 수단을 통해서도 있을 수 있지만 바람직하게는 뉴클레오티드 결합을 통해서 이루어진다. 나중의 경우에서 하나 또는 다른 상보성 엑손 사이에 중복을 포함하지 않는 뉴클레오티드의 수는 0이 될 수 있지만, 바람직하게는 4 내지 40 뉴클레오티드이다. 결합하는 모이어티(moiety)는 올리고뉴클레오티드를 결합할 수 있는 어떤 유형의 모이어티일 수 있다. 일반적으로, 많은 다른 합성물들이 그 올리고뉴클레오티드의 모방 하이브리드화 특성에 유용하다. 그러한 합성물은, 그러한 등가물이 본질적으로 양에서 필수적이지 않은 유사한 하이브리드화 특성을 포함한다면 또한 본 발명에 적합하다. 적합한 등가물은 본 설명에서 앞서 언급되었다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 방법에 의해, 합성물에서 하나 또는 바람직하게는 그 이상의 올리고뉴클레오티드들이 생성된다. 언급되었듯이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드들은 표적이 된 엑손으로의 하이브리드에 기여하는 올리고뉴클레오티드만으로 구성되어야 하는 것은 아니다. 첨가되는 추가적인 물질 및/또는 핵산이 있을 수 있다. 본 발명은 추가로 유전자의 pre-mRNA에서 엑손으로 하이브리드될 수 있는 본 발명의 첫 번째 올리고뉴클레오티드 또는 상기 첫 번째 올리고뉴클레오티드의 등가물, 및 유전자의 pre-mRNA에서 또 다른 엑손으로 하이브리드될 수 있는 본 발명의 두 번째 올리고뉴클레오티드 하나 이상 또는 상기 두 번째 올리고뉴클레오티드의 등가물을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현에서 상기 첫 번째 및 상기 두 번째 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물은 동일한 pre-mRNA상에서 다른 엑손들로 하이브리드될 수 있다. 조성물은 각각의 엑손들의 엑손 스킵핑을 유도하도록 사용될 수 있다. 조성물이 인간 DMD 유전자의 엑손 45 및 51, 또는 42 및 55를 향해 겨냥된 올리고뉴클레오티드들 또는 그것의 등가물을 포함할 때, 표적이 된 엑손들만이 생성된 mRNA로부터 배제되는 원칙에 대한 예외로써, 표적이 된 엑손들 대신에 전체 개입(intervening) 영역이 생성된 mRNA로부터 배제되는 것이 관찰되었다. 본 발명에서 이러한 특징은 DMD 유전자의 여러 가지 다른 쇠약화 돌연변이를 교정하기 위해 사용된다. 그리하여 한 구현에서, 본 발명은, 상기 언급된 대로 조성물을 상기 개체에 제공하는 것을 포함하는, 인간 DMD 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 개체의 치료를 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 돌연변이의 결과로서 DMD 유전자는 기능상 이양소 단백질로 적절하게 번역되지 않는다. 이러한 방법에서 교정될 수 있는 돌연변이들은 일반적으로 표적이 된 엑손 안에 또는 근접하여, 또는 개입 부위에 있는 돌연변이들이다. 그러나, 나아가 언급된 엑손 및 개입 부위 밖으로 있는 프레임-시프트 돌연변이들을 교정하는 것도 가능하다.

본 발명은 다음 설명에서 더 자세하게 설명될 것인데, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

도 1. 유효 대 무효 AON들의 대표 및 비교 분석. 다른 엑손 46 AON들로 처리된 대조구 근세관 배양들의 이양소 mRNA 단편들의 RT-PCR 분석. 총 전사물의 25% 이상의 분명한 엑손 스킵핑 수준이 AON들 8, 22, 23 및 26에 대해 관찰될 수 있다(두 개의 플러스(++)로 나타냄). AON들 4, 6, 20, 24 및 25는 25% 미만의 스킵핑 수준들을 유도하는데(하나의 플러스(+)로 나타냄), 여기서 AON들 6 및 24는 매우 약한 스킵핑들을 유도한다. AON들 9 및 21로 처리 후에는 스킵핑이 관찰되지 않았다(마이너스(-)로 나타냄).

도 2. 엑손 46 및 엑손 46 특이 AON들의 개략도. 엑손 46의 서열은 선들로 지시된 AON들의 위치로 그려진다. SF2/ASF, SC35 및 SRp40과 SRp55에 대해 ESEfinder에 의해 예측된 대로 위치 및 역치 이상의 값들이 막대로 나타난다. ESEfinder에서 주어진 대로 각각의 SR 단백질들에 대한 역치 값들이 괄호들 안에 나타난다. 가장 효과적인 AON들(# 8, 22, 23 및 26)은 추정 ESEsites를 포함하는데, 무효인 AON #25는 추정 ESEsites와 완전히 중복하지 않는다. 그러나, 무효 AON #9는 잠재 SRp40 및 SRp55 결합 부위 또한 겨냥한다.

도 3. 엑손 46 및 m-fold에 의해 예견된 대로의 인접 서열들의 2차 pre-mRNA 구조의 예. 2차 구조는, 뉴클레오티드들이 표적 RNA 내에서 다른 뉴클레오티드들에 결합된 폐쇄 구조들 및, 비결합 뉴클레오티드들로 구성된 개방 구조들로 구성된다. 두 엑손 46 특이 AON들의 위치가 나타난다 (즉 #6 및 #26); 20-mer #6은 비결합 뉴클레오티드들 3을 겨냥하고, 그리하여 유효 염기쌍의 부분은 3/20 (0.15)이다. AON #26은 19-mer이고 그것의 뉴클레오티드들 중 15는 비결합 뉴클레오티드를 겨냥하며, 그리하여 유효 염기쌍의 부분은 15/19 (0.79)이다.

도 4. SF2/ASF, SC35, SRp40과 SRp55, 그리고 AON 길이의 예견된 값들, 유효 뉴클레오티드들의 부분 및 GC 함량에 대한 AON들의 다른 군들의 박스플롯(boxplot). A) 유효 대 무효 AON들의 비교. SF2/ASF 및 SC35에 대한 값들은 무효 AON들에 대해서 보다 유효 AON들에 대해 상당히 더 높다 (윌콕슨 순위합 검정). 다른 변수들에 대해서는 큰 차이가 관찰되지 않았다. B) 무효 AON들, 대(vs) 전사물의 25% 미만에서의 스킵핑을 유도하는 AON들(<25%), 대(vs) 전사물의 25 초과에서의 스킵핑을 유도하는 AON들(>25%)의 비교. 개별 군은 어떤 변수들에 대해서도 다른 군들과 상당한 차이가 없었다 (크루스칼-왈리스 순위합 검정). 군들 중 둘만 서로 비교했을 때, >25% 군에서 SF2/ASF 및 SRp40 값들은 무효 및 <25% 군 둘 모두의 것보다 상당히 더 높았다; >25% 군은 SC35에 대한 무효 군보다 상당히 더 높은 값들을 포함하고 >25% 군의 GC-함유된 것은 무효 군보다 상당히 더 높았다.

* 군들 사이의 차이는 p-값 <0.1로 상당하다, ** p-값 <0.05.

재료 및 방법들

AONs , 트렌스펙션 및 RT - PCT 분석

AON 고안은 m-fold 프로그램 (Mathew et al. 911-40)에 의해 예견된 대로 표적 RNA의 (부분적으로) 중복하는 예견된 개방 이차 구조에 기반되었다. 몇몇 이전에 설명된 AON들 (표 1)은 추가로 겔 이동도 변환 분석(gel mobility shift assays, van Deutekom et al. 1547-54;Aartsma-Rus et al. S71-S77)에 의해 분석되었다.

모든 AON들 (표 1 참조)은 Eurogentec(벨기에)에서 합성되었고, 2'-O-메틸 RNA 및 전장 포스포로티오에이트 백본들을 포함한다. 인간 대조구로부터 유래된 근 세관 배양들은 앞서 설명된 대로 트랜스펙트되었다(van Deutekom et al. 1547-54). 각각의 AON은 다른 농도(㎍ AON당 ExGen 500 (MBI Fermentas) 2 ㎕ - 3.5 ㎕를 가진 200 nM 내지 1 μM까지로 다양함)에서 두 번 이상 트랜스펙트되었다. 5' 플루오로세인(fluorescein) 표지를 가진 대조구 AON이 최적 트랜스펙션 효율(일반적으로 90% 이상)을 확인하기 위해 사용되었다. RNA 분리 및 RT-PCT 분석이, 제조자의 지시에 따라 Transcriptor 역 전사효소(Roche diagnostics)를 사용하여, 이전에 설명된 대로 시행되었다(Aartsma-Rue et al. S71-S77). PCR 프라이머들(Eurogentec, 벨기에)은 이전에 설명되었거나(Aartsma-Rus et al. S71-S77), 또는 AON들(청구하는 대로의 서열들)에 의해 표적이 된 엑손에 인접하는 엑손들에서 선택되었다.

통계적 분석

통계적 분석이 R 소프트웨어 및 exactRankTests 패키지(R Development Core Team; Hothorn and Hornik)를 사용하여 시행되었다. 윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon signed rank sum test)이 AON들의 두 군들을 비교할 때 상당히 더 높은 값들을 확인하기 위해 사용되었다. 크루스칼 왈리스 순위합 검정(Kruskal Wallis signed rank sum test)이 세 군들 중 하나가 다른 군들과 상당히 다른지 아닌지를 결정하기 위해 시행되었다.

결과

새로운 AON 들의 효능

새롭게 고안된 일련의 77 AON들의 효능은 아직 보고되지 않았다. 이들 AON들은 다른 농도에서 두 번 이상 시험되었고, 그들의 효과성은 RT-PCR 분석으로 결정되었다. 모든 AON들 및 그들의 효능의 특성이 표 1에 나타난다. 서열 분석에 의해 확인된 대로, 특이 엑손 스킵핑은 각각의 시험된 농도에서 77 신규한 AON들(66%)의 51로 유도되었다. 스킵핑할 수 없게 남아있는 엑손 47 및 엑손 57을 제외하고, 각각의 표적이 된 엑손을 위해 하나 이상 AON이 효과적이다.

발명자들은 엑손 스킵핑을 유도하는 AON들을 두 개의 군들, 전사물의 25% 미만에서 엑손 스킵핑을 유도하는 AON들(표 1에서 하나의 "플러스(+)"로 나타냄)과 전사물의 25%이상에서 엑손 스킵핑을 유도하는 AON들(표 2에서 두 개의 "플러스(++)"로 나타냄)로 추가로 세분하였다. 엑손 46 스킵핑의 다양한 수준들의 예를 도 1에 나타낸다. 전체로, 새로운 AON들 중 25는 25% 미만의 스킵핑 수준을 유도했 고 26은 25% 이상의 스킵핑 수준을 유도했다.

유효한 AON들의 대부분은 표적이 된 엑손 만의 스킵핑을 유도했다. 특히, 엑손 8을 표적하는 AON들은 엑손 8 및 프레임-내 엑손 9 둘 모두의 이중 엑손 스킵핑을 유도했고 결코 단일 엑손 8 스킵핑만을 유도하지는 않았다(데이터는 제시되지 않음). 단일 엑손 40, 58 및 73 스킵핑에 더하여, 엑손 40, 58 및 73 스킵핑을 표적하는 AON들은 때때로 각각 엑손 40과 41, 또는 58과 59 또는 73과 74 스킵핑의 낮은 수준을 유도했다(데이터는 제시되지 않음). 발명자들의 새로 고안된 엑손 51 특이 AON들에 응하여 엑손 41에서 잠적 스플라이스 부위이, 이전 엑손 51 특이 AON들에 대해 설명되었던 대로(Aartsma-Rus et al. S71-S77;Aartsma-Rus et al. 907-14), 때때로 사용되었다.

AON 들의 평가

발명자들은 그리하여 총 114의 AON들을 시험하였다(표 1에 나타냄); 이들 중 76(67%)은 엑손 스킵핑을 유도했는데(전사물의 25% 이상에서 41, 그리고 전사물의 25% 미만에서 35), 38(33%)은 무효했다. 효능과 AON 특징 사이에 상관 관계가 있는지를 보기 위해서, 발명자들은 유효 및 무효의 군들에 대한 다수의 파라미터를 평가했다. 잠재 SR 결합 부위들은 역치(threshold) 없이 ESEfinder 소프트웨어를 사용하여 각각의 엑손에 대해 계산되었다. AON 표적 부위과 중복하는 모든 결합 부위에 대해, 각각의 SR 단백질의 가장 높은 예측 값만을 표 1에 나타낸다. 엑손 46에 존재하는 추정 SR 결합 부위들의 예는 도 2에 나타난다(명료함을 위해, 그 소프트 웨어에 의해 제공된 평균 역치 값 이상만 나타냄). AON에 의해 부분적으로만 덮이는 잠재 SR 결합 부위들은 고려되지 않았다(예를 들어 도 2에서 AON들 20과 25 및 두 번째 추정 SRp40 부위). 추가로, AON 길이, 유효 뉴클레오티드들 및 GC-함량을 비교하였다(표 1). 유효 뉴클레오티드들의 부분은, AON의 길이에 의해 분할된 예측 2차 RNA 구조에서 해방된 뉴클레오티드를 표적으로 하는 뉴클레오티드들의 양으로서 결정되었다(도 3).

각각의 다른 변수들을 위한 유효 및 무효 AON들의 박스플롯(boxplot)들은 도 4A에 도시된다. 두드러지게, ESEfinder에 의해 예견된 대로 SF2/ASF 및 SC35에 대한 값들은 무효 AON들에 대해서보다 유효 AON들에 대해 명백히 더 높다. 이러한 차이는 SF2/ASF 및SC35, 각각에 대해, 윌콕슨 순위합 검정으로 계산된 대로, p-값 <0.1 및 <0.05로 통계적으로 상당하다. 예측된 SRp40 및 SRp55 값들에 대해 상당한 차이는 발견되지 않았다. AON들의 길이, 유효 뉴클레오티드들의 부분 또는 AON들의 GC-함량은 또한 AON 능률과 관련이 없었다.

발명자들은 유효 AON들을 두 하위군(전사물의 25% 이상 또는 미만 중에서 스킵핑을 유도하는)으로 세분하였고, 그에 따라 박스플롯을 만들었다(도 4B). 크루스칼-왈리스 순위합 검정을 사용하는 어떤 변수들에 대한 군들 사이에 통계적으로 상당한 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, 두 군들이 윌콕슨 순위합 검정을 사용하여 비교할 때, 발명자들은 >25% 스킵핑 군에서 SF2/ASF에 대해, 무효 군 (p-값 <0.05) 및 <25% 스킵핑 군 (p-값 <0.1)에 비교할 때 통계적인 증가를 관측하였다. SC35 값들에만 대해, 무효 및 <25% 스킵핑 군 사이에 차이는 상당했다 (p-값 <0.05). >25% 스킵핑 군의 예측된 값은 SRp40에 대해 무효 및 <25% 스킵핑 군 둘 모두보다 상당히 더 높았다 (p-값 <0.1). 마지막으로, >25% 스킵핑 군의 GC-함량은 무효 군보다 더 높았다 (p-값 <0.1).

엑손 스킵핑은 5' 스플라이스 부위 또는, 대안으로, 엑손 내부 서열들을 표적으로 하는 AON들에 의해 효과적으로 유도될 수 있다 (Wilton et al. 330-8;Dunckley et al. 1083-90;Mann et al. 42-7;De Angelis et al. 9456-61; Mann et al. 644-54;Lu et al. 6;Goyenvalle et al. 1796-99;Lu et al. 198-203)(Takeshima et al. 515-20;van Deutekom et al. 1547-54;Takeshima et al. 788-90;Aartsma-Rus et al. S71-S77;Aartsma-Rus et al. 907-14;Aartsma-Rus et al. 83-92;Takeshima). 그러나, 엑손-내부 AON들은 스플라이스 부위 AON들에 비해 몇몇 장점을 가질 수 있다. 먼저, 엑손-내부 AON들은, 그들이 코딩 서열을 표적으로 하고, 부분적으로 공통서열(consensus sequence)에 의해 결정되는 스플라이스 부위이 아니기 때문에, 일반적으로 더 특이적이다. 이것은 모든 스플라이스 부위에 대해 들어맞지는 않을 수 있다. 예를 들어, 많은 엑손 스킵핑에서 표적으로 된 뮤린(murine) DMD 엑손 23의 5' 스플라이스 부위은 mdx 마우스에서 연구하는데, 공통 스플라이스 부위과는 크게 다르다. 그러나, 평균적으로 스플라이스 부위 특이 AON의 적어도 일부는, 잠재적으로 다른 엑손들의 역 표적화를 허용하는 공통 서열들로 구성될 것이다. 게다가, Mann과 동료들은 스플라이스 부위 AON 고안에서 가장 중요한 변수는 표적 서열이라고 결론지었다(Mann et al. 644-54;Mann et al 42-7). 뮤린 엑손 23에 대한 유효 5' 스플라이스 부위 AON을 찾는 것은 광범위한 최적화를 요한다(Mann et al. 644-54). 대조적으로, 표적 서열의 더 큰 창(window)이 있기 때문에, 엑손-내부 AON들의 고안은 다소 수월하다(straightforward)는 것이 입증되었다. 평균적으로 예견된 pre-mRNA에서 개방 구조를 겨냥하는 세 DMD AON들 중 둘이 유효했다. 이것은 본 연구에서 설명된 엑손-내부 AON들 114 중 76이 유효하다는 관측에 의해 나타내며, 표적이 된 DMD 엑손들 37 중 총계 35의 스킵핑을 함께 유도한다.

ESEfinder는 최근 공개되었기 때문에, 발명자들은 발명자들의 AON들이 예견된 SF2/ASF, SC35, SRp40 또는 SRp55 결합 부위를 겨냥하는지를 분석하였다. 흥미롭게도, 발명자들은 무효(ineffective) AON들에 비교했을 때, 유효(effective) AON들에 대해 가장 많은 두 SR 단백질들(즉 SF2/ASF 및 SC35)에 대한 상당히 더 높은 값들을 관찰하였는데, 발명자들은 예측된 SRp40 및 SRp55 결합 부위들에 대해서는 상당한 차이를 관찰하지 못했다. 그러나, 발명자들이 유효 AON들을 유효 AON들(<25% 스킵핑)과 매우 유효 AON들(>25% 스킵핑)로 세분하였을 때, 발명자들은 무효 및 유효 군들에 비해 매우 유효 군에 대해 SRp40에 대한 상당히 더 높은 값들을 관측하였다. 모든 유효 AON이 이들 SR 단백질에 대해 높은 값들을 가지는 것은 아니라는 점을 주의해야하는데, 몇몇 무효 AON들은 높은 값들을 가진다. ESEfinder 값들이 추정 ESE 부위들에 대한 예측을 반영함을 명심해야 한다. 그럼에도 불구하고, 유효 AON들에 대해 더 높은 SR 값들로의 상당한 추세가 있는 것으로 보이고, 발명자들은 그리하여 발명자들의 장래 AON들을 우선 예견된 SF2/ASF, SC35 및 SRp40 결합 부위들로 고안할 것이다. 대조적으로, 길이, 유용한 뉴클레오티드들의 부분 또는 GC-함량에 대해서는 유효 및 무효 AON들 사이에 상당한 차이가 관측되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 25% 이상의 스킵핑 수준을 유도하는, AON들의 GC-함량은 무효 AON들의 것보다 상당히 더 높다. 이것은 더 높은 GC-함량을 가진 AON들이 더 높은 녹는점을 가지고, 그리하여 그들의 표적 RNA에 더 많이 결합하는 것 같다는 사실에 의해 설명될 수 있다.

발명자들의 AON들이 유효하다는 사실은 인상적이며, 일반적으로 30 kb 길이 이상인 인트론을 함유하며 24 Mb 길이인 DMD 유전자의 복합도 때문일 수 있다. 그리하여, 이러한 유전자의 스플라이싱은 이미 문제가 될 수 있으며 다른 유전자들보다 더 엑손의 스플라이싱 증강 서열들에 의존할 수 있다. 게다가, 몇몇 극도로 큰 인트론들의 발생은 유전자가 연속적으로 스플라이스되는 가능성을 희박하게 한다. 예를 들어 인트론 7은 110 kb 길이인데, 인트론 8은 1113 bp일 뿐이다. 발명자들 및 다른 이들 (Dr. Steve Wilton, 개별 연락; Luis Garcia, 개별 연락)은 단일 엑손 8 표적화 후에 엑손 8 및 9 둘 모두의 동시 스킵핑만을 관찰하였기 때문에, 대부분의 DMD 전자들에서 인트론 8이 거대 인트론 7에 앞서 스플라이스되는 것 같다. 유사하게, 엑손들 40, 58 및 73을 겨냥하는 AON들에 대해 발명자들은 때때로 표적이 된 엑손의 스킵핑에 더하여 근접 엑손의 스킵핑을 관찰하였다. 이것은 전사물의 부분에서 원위(遠位) 인트론이 근위(近位)인 것에 앞서 스플라이스된다는 징후이며, 이들 인트론들의 지연 스플라이싱을 제안할 수 있다.

DMD 환자들에 대한 돌연변이가 광범위하기 때문에, 많은 개별 내부 엑손들(즉, 엑손 2-63 및 71-78)에 대한 특이적 AON들이 요구될 것이다. 이양소 기능성에 필수적인, 엑손들 64-70은 시스테인 풍부 영역의 유전암호를 지정하기 때문에, 이 러한 구역에서 리딩 프레임을 복구하는 것은 기능성 단백질을 초래하지 않을 것이다. 예견된 2차 pre-mRAN 표적 구조 및/또는 SR 단백질 결합 부위의 예견된 존재/부재를 사용하여 DMD 엑손-내부 AON들을 고안하는 것이 현저하게 효과적이다.

표

참조문헌

Claims

엑손의 RNA에서 SR (Ser-Arg) 단백질의 (추정) 결합 부위를 결정하고, 상기 RNA에 상보성이고 적어도 부분적으로 상기 (추정) 결합 부위와 중복되는 올리고뉴클레오티드를 생산하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 방법.
제 1항에 있어서, 추가로 상기 RNA, 상기 RNA의 또 다른 부분에 하이브리드되는 영역 (폐쇄 구조) 및 상기 구조에서 하이브리드되지 않는 영역 (개방 구조)의 2차 구조로부터 결정하고, 이어서 적어도 부분적으로 상기 (추정) 결합 부위와 중복되고 상기 폐쇄 구조의 적어도 일부와 중복되고 상기 개방 구조와 적어도 일부와 중복되는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
제 2항에 있어서, 상기 개방 및 폐쇄 구조가 서로 근접하는 것인 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 상기 RNA의 14 내지 50의 뉴클레오티드들 연속(consecutive) 부분에 상보성인 것인 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 RNA를 포함하는 것인 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 2'-O-메틸 RNA이고 전장 포스포로티오에이트 백본을 가지는 것인 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑손을 포함하는 pre-mRNA가 개체(subject)에서 원하지않은 스플라이싱을 나타내는 것인 방법.
제 7항에 있어서, 상기 pre-mRNA로부터 생산된 mRNA로부터 상기 엑손의 부재가 단백질을 위한 코딩 영역를 생성하는 것인 방법.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 엑손을 포함하는 상기 RNA가 전사되는 것으로부터의 유전자가, 이상(aberrant) 뒤시엔느 근이영양증 유전자(DMD), 콜라겐 VI 알파 1 유전자(COL6A1), 근세관성 근병증 1 유전자 (MTM1), 디스퍼린 유전자 (DYSF), 라미닌-알파 2 유전자 (LAMA 2), 에머리-드레이푸스 근이영양증 유전자 (EMD), 및/또는 칼파인 3 유전자 (CAPN3)를 암호화하는 것인 방법.
제 9항에 있어서, 상기 유전자가 뒤시엔느 근이영양증 유전자인 것인 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SR 단백질이 SF2/ASF 또는 SC35 또는 SRp40인 것인 방법.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 엑손이 엑손 8, 46, 48, 52, 54-56, 58, 60-63 또는 71-78을 포함하는 것인 방법.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 의해 달성가능한 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물(equivalent).
표 2에서 나타낸 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물.
pre-mRNA에서 엑손의 인식을 적어도 일부 변경하기 위한, 제 13항 또는 제 14항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물의 용도.
약제의 제조를 위한, 제 13항 또는 제 14항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물의 용도.
제 13항 또는 제 14항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물을 포함하는 약제학적 제조물.
유전병의 치료용 약제의 제조를 위한, 제 13항 또는 제 14항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물의 용도.
pre-mRNA에서 엑손 스킵핑(skipping)을 유도하기 위한, 제 13항 또는 제 14항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물의 용도.
pre-mRNA에서 엑손-인식을 변경하기 위한, 제 13항 또는 제 14항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물의 용도.
pre-mRNA에서의 엑손이 스플라이싱 기관에 의해 인식되는 효율을 변경하기 위한 방법으로, 상기 pre-mRNA가 둘 이상 엑손 및 하나 이상 인트론을 포함하는 유전자에 의해 암호화되고, 상기 방법은, 상기 스플라이싱 기관 및 상기 유전자를 포함하는 전사계에 제 13항 또는 제 14항에 따른 첫 번째 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물을 제공하고, (여기서 상기 첫 번째 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물은 하나 이상 상기 엑손에 하이브리드될 수 있다), 상기 전사계에서 전사 및 스플라이싱이 일어나는 것을 허용하는 것을 포함하는 방법.
제 21항에 있어서, 상기 유전자가 3 이상 엑손들을 포함하는 것인 방법.
제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 방법이 추가로 제 13항 또는 제 14항에 따른 하나 이상 두 번째 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물을 상기 전사 계에 제공하는 것을 포함하고, 여기서 상기 두 번째 올리고뉴클레오티드 또는 그것 의 등가물은 상기 엑손들 중 적어도 다른 하나에 하이브리드될 수 있는 것인 방법.
제 23항에 있어서, 상기 첫 번째 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물 및 상기 두 번째 올리고뉴클레오티드 또는 그것의 등가물이 서로 물리적으로 연결되어 있는 것인 방법.