CN101184841A - 通过干扰SR蛋白的结合以及干扰RNA二级结构调节前mRNA中的外显子识别 - Google Patents

通过干扰SR蛋白的结合以及干扰RNA二级结构调节前mRNA中的外显子识别 Download PDF

Info

Publication number
CN101184841A
CN101184841A CNA2006800188724A CN200680018872A CN101184841A CN 101184841 A CN101184841 A CN 101184841A CN A2006800188724 A CNA2006800188724 A CN A2006800188724A CN 200680018872 A CN200680018872 A CN 200680018872A CN 101184841 A CN101184841 A CN 101184841A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exon
oligonucleotide
rna
equivalent
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800188724A
Other languages
English (en)
Inventor
朱迪思·克里斯蒂娜·西奥多拉·范多伊特科姆
安内米克·阿尔特斯马-鲁斯
加里-让·布德韦恩·范奥姆门
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
OctoPlus Technologies BV
Original Assignee
OctoPlus Technologies BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OctoPlus Technologies BV filed Critical OctoPlus Technologies BV
Publication of CN101184841A publication Critical patent/CN101184841A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种产生寡核苷酸的方法，通过该寡核苷酸，外显子可以在前mRNA中被跳跃并且从而被排除在前mRNA产生的mRNA之外。另外本发明还提供了改变SR蛋白的结合的方法和/或改变mRNA二级结构以干扰剪接程序的方法和寡核苷酸的使用，以及治疗疾病的方法。另外还提供了药物组合物和诱导前mRNA中几种外显子的跳跃的方法和装置。

Description

通过干扰SR蛋白的结合以及干扰RNA二级结构调节前mRNA中的外显子识别
技术领域
本发明涉及分子生物学和医药领域。更确切地，本发明涉及由前mRNA(前信使RNA)产生的mRNA的重建及应用其的治疗。
背景技术
生物学的中心法则是遗传信息存在于细胞的DNA中并在这个信息的转录上得到表达，其中在产生编码的蛋白质后紧跟着细胞的翻译机制。这种遗传信息流动的观点已经促进了基于类似干扰细胞蛋白质含量的主要的DNA。这种观点正在慢慢改变，取而代之的是追求在DNA水平上进行干扰。
在高等真核生物中，细胞的DNA中的蛋白质遗传信息是在外显子中编码，该外显子通过内含子序列被彼此分开。在一些情况下，这些内含子非常长。转录机制产生同时含有外显子和内含子的前mRNA，而剪接机制，通常在前mRNA产生的过程中已经通过将存在于前mRNA中的外显子拼接在一起从而产生蛋白质的有效编码区。
发明内容
虽然关于由前mRNA产生mRNA相关的实际过程很多都是已知的，仍有大量的是未知的。在本发明中，已经显示了影响剪接过程从而产生不同的mRNA是可能的。该过程允许通过剪接机制产生的mRNA的可预测性和可重复性重构。可以在通常包括在成熟mRNA中的外显子位置与前mRNA杂交的寡核苷酸可以引导这样的靶外显子或该靶外显子的一部分被排除(还被称为外显子跳跃)。
本发明提供了用于确认适合外显子跳跃过程的寡核苷酸的筛选过程的代替方法。本发明还提供了在其它寡核苷酸中可以跳跃之前不能被跳跃的外显子的寡核苷酸。我们之前已经确认了37个外显子内反义寡核苷酸(AON)以诱导人类对照肌管培养中的14个杜氏型肌营养不良症(DMD)的跳跃。本文中我们展示了可以用来诱导总共35种外显子的跳跃的新型AON。
在我们的WO2004/083432的专利申请中，已经披露了产生寡核苷酸的方法，该方法包含由外显子的RNA(预测的)二级结构确定具有可与所述RNA的其它部分进行杂交的结构的区域(闭合结构)以及不能与所述结构杂交的区域(打开结构)，并随后产生寡核苷酸，该寡核苷酸至少部分与所述的闭合结构互补并且至少部分与所述的打开结构互补。
现在我们公开了设计和产生寡核苷酸的代替方法，该方法可以可选地与WO2004/083432的方法进行结合。
在实验部分，我们公开了引起外显子跳跃的外显子内反义寡核苷酸(AONs)的功效和在所述AON的靶前mRNA的位点中的预测SR结合位点的存在(例如通过ESEfinder)之间存在相关性。因此，我们在本文中指出了产生包含确定SR(丝氨酸-精氨酸，Ser-Arg)蛋白在外显子RNA中的(假定)结合位点以及产生互补于所述RNA并且至少部分与所述(假定)结合位点重叠的寡核苷酸的替代方法。术语“至少部分重叠”在本文中被定义为包含SR结合位点的单一核苷酸的重叠、所述结合位点多核苷酸的重叠以及所述结合位点的完全重合。在本发明的一个优选的具体实施方式中，还包含由所述RNA的二级结构确定可以与所述RNA其它部分杂交的区域(闭合结构)以及与所述结构不能杂交的区域(打开结构)，以及随后产生至少能和所述(假定)结合位点部分重叠并且至少能和所述封闭结构部分重叠并且至少能和所述开放结构部分重叠的寡核苷酸。这样，我们提高了获得能够干扰由前mRNA到mRNA的外显子内含物(exon inclusion)的寡核苷酸的机会。第一个选择的SR-结合区域不具备所要求的打开-闭合结构是可能的，在这种情况下选择另外一个(第二)SR蛋白结合位点，随后检测打开-闭合结构的存在。这个过程一直持续到含有SR蛋白结合位点以及(部分重叠)打开-闭合结构的序列被确定。随后，该序列被用于设计与所述序列互补的寡核苷酸。
这样产生寡核苷酸的方法也可以通过颠倒所述顺序来进行，即首先产生包含由外显子RNA的二级结构确定的具有可以与所述RNA的其它部分杂交的区域(闭合结构)和与所述结构不能杂交的区域(打开结构)的寡核苷酸；随后产生的寡核苷酸至少部分与所述闭合结构互补并且其中至少所述寡核苷酸的其它部分能与所述的打开结构互补。在此之后为决定SR蛋白结合位点是否至少与所述的打开/关闭结构重叠。这样就对WO2004/083432中的方法进行了改良。在另外一个具体实施方式中，同时进行选择。
本文中使用的术语“互补”是指在生理条件下一段伸展的(stretch)核酸能与另外一段伸展的核酸杂交。因此，互补区中的所有碱基都能够与相对链(opposing strand)中的碱基进行配对不是绝对必需的。例如，当设计寡核苷酸时，可能会想要结合例如一个不能与互补链中的碱基进行碱基配对的残基。如果在细胞内环境下，伸展的核苷酸可以和互补部分杂交，错配在某种程度上是可以允许的。在一个优选具体实施方式中，互补部分包含至少3个，更加优选至少4个连续的核苷酸。互补区域优选被设计为当其被组合时，它们对于前mRNA中的外显子是特异性的。这种特异性可以通过不同长度的互补区域来实现，因为这取决于系统中其它(前)mRNA中的实际序列。随着寡核苷酸的长度(size)增加，一个或多个其它前mRNA也可以被杂交到该寡核苷酸中的风险就会降低。在互补区含有错配的寡核苷酸仍然保持着与前mRNA的靶区域杂交的能力，该寡核苷酸可以用于本发明是很清楚的。但是，优选至少互补部分不包含这样的错配，因为其通常比在一个或多个互补区域具有这样的错配的寡核苷酸具有更高的效率和更好的特异性。我们认为，高杂交力(即增加与反向链反应的数量)有利于提高干扰系统剪接机制的加工效率。
优选地，互补性是在90％到100％之间。一般而言，在大约20个核苷酸的寡核苷酸中允许有大约1或2个错配。
最好在存在有外显子的前mRNA的背景下分析二级(打开-闭合)结构。这样的结构可以在实际的RNA(actual RNA)中进行分析。但是，使用结构模拟程序来很准确地预测RNA分子(处于最低能量消耗)的二级结构目前是可能的。合适的程序的一个非限定性例子为RNA mfold version 3.1 server(Mathews et al 1999，J.MoI.Biol.288：911-940)。所属领域的一般技术人员在给定核苷酸序列的条件下，可以适当可重复性地预测外显子的可能结构。当提供具备外显子和旁侧内含子序列的模拟程序时，可以获得最准确的预测。通常没有必要模拟整个前mRNA的结构。
对于存在或缺失SR蛋白结合位点也是同样的。合适的程序的一个非限定性例子为ESEfinder。
寡核苷酸所定向的打开和闭合结构，优选是互相接近的。在这种情况下认为，寡核苷酸退火到打开结构会引起闭合结构打开，从而退火进入到闭合结构中。通过这种作用，以前闭合的结构具有了不同的构象。这种不同的构象会导致外显子内含物信号的破坏。然而，当潜在(隐含)剪接受体和/或供体序列存在于靶外显子中，偶尔会产生确定不同的(新)外显子，即具有不同的5’末端，3’末端或者两者均有的新的外显子内含物信号。这种类型的活性(activity)在本发明的范围内，因为靶外显子被排除于mRNA之外。mRNA中存在含有部分靶外显子的新的外显子不会改变靶外显子同样被排除的事实。新外显子的增加可以被看作只会偶尔发生的副作用。当外显子跳跃被用于恢复作为突变结果被破坏的(部分)开放阅读框时，存在两种可能性。一种是新外显子在恢复该阅读框中是功能性的，反之在其它情况下，该阅读框不能被恢复。当通过外显子跳跃的方法选择用于恢复阅读框的寡核苷酸时，显然在这些条件下，只选择那些在有或没有新外显子的情况下确实能导致恢复开放阅读框的外显子跳跃的寡核苷酸。
不希望被任何理论所束缚，目前我们认为使用定位于SR蛋白结合位点的寡核苷酸会导致SR蛋白对于SR蛋白结合位点的结合(至少部分地)被削弱，这会造成剪接被破坏或被削弱。
优选地，打开/闭合结构和SR蛋白结合位点部分重叠，更加优选打开/闭合结构完全重叠SR蛋白结合位点或者SR蛋白结合位点完全重叠打开/闭合结构。这考虑到了改善的外显子增加的破坏。
前mRNA可以经受不同的剪接方式(splicing events)，例如经受选择性剪接(alternative splicing)。这种方式是由细胞环境或者人工剪接系统所诱导或催化的。因此，从同样的前mRNA可以产生几种不同的mRNA。这些不同的mRNA都包括外显子序列，因为这是外显子的定义。然而，mRNA含量的流动性使在本发明中有必要对术语“外显子”进行定义。根据本发明的外显子为在前mRNA和由其产生的mRNA中都存在的序列，其中包括在mRNA中的该序列在前mRNA的一侧(第一个和最后一个外显子)或者两侧(除了第一个和最后一个外显子的其它外显子)为mRNA中不存在的序列。原则上，由前mRNA产生的任何mRNA都符合这个定义。但是，对于本发明，优选的是所谓的显性mRNA(dominant mRNA)，也就是构成在设定条件下由前mRNA产生的mRNA至少5％的mRNA。特别地，人类免疫缺陷病毒在末端使用选择性剪接。一些很重要的蛋白产物是由构成甚至少于所述病毒的总RNA的5％的mRNA产生的。反转录病毒的基因组RNA可以被看作由其得到的任何剪接产物的前mRNA。由于选择性剪接在不同的细胞类型中会进行变化，外显子被定义为该系统使用的剪接条件的环境中的外显子。一个假设的例子是肌细胞中的mRNA可以含有神经细胞中由相同的前mRNA产生的mRNA中不存在的外显子。相似地，癌细胞中的mRNA可以含有正常细胞中由相同前mRNA产生的mRNA中不存在的外显子。
选择性剪接可以通过相同前mRNA的剪接发生。然而，选择性剪接也可以通过前mRNA的突变来发生，例如产生附加的剪接受体和/或剪接供体序列。这种选择性剪接序列通常被称为隐蔽剪接受体/供体序列。这样的隐蔽剪接位点会产生新的外显子(新外显子)。使用本发明的方法可以至少部分防止新外显子包含到产生的mRNA中。如果隐蔽和“正常”剪接供体/受体序列在新外显子的旁侧，该新外显子包围原有(旧，paleo)外显子。如果在这种情况下，被隐蔽剪接供体/受体取代其位置的原先剪接供体/受体序列仍然存在于前mRNA中，通过干扰新外显子的外显子识别信号来提高含有原有外显子的mRNA的产量是可能的。这种干扰可以在新外显子对应于原有外显子的部分，或者这样的新外显子的其它部分。这种类型外显子跳跃可被视为剪接校正。
在一个优选具体实施方式中，产生的寡核苷酸互补于14到50个之间的核苷酸的连续部分，并且更优选所述的寡核苷酸包含RNA，进一步优选所述的寡核苷酸是2’-O-甲基RNA并且具有全长硫代磷酸酯主链。寡核苷酸长度的代表性实施例可以从表1和/或表2中得到：15到24个核苷酸。2’-O-甲基RNA为核酸类似物，其特点在于其赋予互补DNA或RNA的特殊杂交特性以及与天然的核酸相比更强的抗酶解的稳定性。目前大多数临床应用的反义寡核苷酸结合了硫代磷酸酯主链修饰，从而提高对核酸酶的抗性而保存通过核糖核酸酶(RNase)H刺激靶mRNA的分裂的能力。
外显子跳跃技术可以基于不同的目的使用。然而，优选外显子跳跃用于重建在受试者中由表现出不希望的剪接的前mRNA产生的mRNA。重建可以用于降低细胞产生的蛋白质的量。当细胞产生一种特殊的不希望得到的蛋白质时，这是有用的。但是，在一个优选的具体实施方式中，重建被用于提高细胞中一种功能性蛋白的产量，也就是重建导致功能性蛋白质的编码区的产生。后一个具体实施方式优选用于恢复由于突变失去的开放阅读框。优选的基因包含杜氏型肌营养不良症基因(DMD)、胶原蛋白VIα1基因(COL6A1)、肌小管病变1基因(MTM1)、dysferlin基因(DYSF)、层粘连蛋白-α2基因(LAMA2)、埃-德(emery-dreyfuss)肌营养不良症基因(EMD)，和/或钙蛋白酶3基因(CAPN3)。通过由杜氏型肌营养不良症(DMD)基因得到的实施例来对本发明进行进一步描述。虽然该基因构成了本发明中的特别优选的基因，但本发明不限于该基因。
杜氏型肌营养不良症(DMD)和贝克尔(氏)型肌营养不良症(BMD)都是由于DMD基因中的突变造成的，DMD基因位于X染色体上并且编码肌营养不良蛋白(1-6)。DMD在新生男婴中的发病率为1∶3500。患渐进性(进行性)肌肉无力的患者，13岁前就不得不依赖轮椅并且通常在30岁之前死亡(7)。通常较温和的BMD的发病率为1∶20,000。BMD患者通常保持能走动超过40年并且预期寿命比DMD患者长(8)。
抗肌萎缩蛋白是抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物(dystrophin-glycoprotein complex，DGC)的主要成分，在其它成分之中其维持肌纤维的膜稳定性(9，10)。DMD基因中的框移动突变导致肌细胞中的营养不良缺陷。其伴随着其它DGC蛋白的水平降低并且导致在DMD患者中发现的严重的表型(11，12)。保持阅读框完整的DMD基因中的突变产生较短、但是具有部分功能的肌营养不良蛋白，其与不太严重的BMD相关(13，14)。
虽然进行了广泛的努力，尽管通过糖皮质激素治疗可以达到延缓疾病表现的发作和/或发展(16)，仍然没有发现对于DMD患者在临床上可应用并有效的治疗方法(15)。最近，我们和其他人已经报道了在针对于恢复mdx模型鼠和DMD患者细胞中的营养不良前mRNA的阅读框的遗传治疗上的充满希望的结论(17-23)。通过靶向跳跃特异性外显子，DMD表型可以被转变为较温和的BMD表型。该外显子跳跃可以通过结合靶向一个或者两个剪接位点，或者靶向外显子内序列的反义寡核糖核苷酸(AONs)来诱导。因为当剪接位点都被剪接复合体识别时外显子只被包括在mRNA中，对于AONs剪接位点是明显的目标。即使功效和效率是可变的，但已经显示了这种方法是成功的(17，18，20，21)。
除了一致的剪接位点序列，许多(否则就是全部)外显子含有剪接调控序列，例如外显子剪接增强因子(ESE)序列，以促进剪接体对真正的剪接位点的识别(Cartegni，Chew，and Krainer 285-98)。剪接因子的亚类，被称为SR蛋白，可以与ESE结相合并且募集例如U1和U2AF的其它剪接因子到(弱定义)剪接位点。丰度最高的四种SR蛋白(SF2/ASF、SC35、SRp40和SRp55)的结合位点已经被详细分析并且这些结果已经被应用于ESEfinder中，其为一种预测这些SR蛋白的潜在结合位点的网络资源(Cartegni et al.3568-71)。正如本文中的实验部分所公开的，AON的效力与SF2/ASF，SC35和SRp40结合位点的存在/缺失具有相关性。在一个优选的具体实施方式中，本发明提供了上述方法，其中所述的SR蛋白为SF2/ASF或SC35或SRp40。更加优选地，所述SR蛋白与编码DMD的外显子8、46、48、52、54-56、58、60-63或71-78的mRNA相结合。
满足本发明的要求的任何寡核苷酸可以用于诱导DMD基因中的外显子跳跃。本发明提供了由以上所披露的方法获得的寡核苷酸或其等同物，或者表2中所描述的能够诱导外显子跳跃的寡核苷酸或其等同物。本发明还提供了表2中互补于人类DMD基因的外显子8、46、48、52、54-56、58、60-63或71-78的寡核苷酸。等同物包含在种类上而不必在数量上，相似的、优选相同的杂交能力(hybridisation capacity)并且可以是例如所述的寡核苷酸的片断或者具有点突变、删除的寡核苷酸，乃至具有附加核苷酸的寡核苷酸，或者它们的任何组合。
通过本发明的方法产生的互补寡核苷酸优选是互补于所述外显子RNA的13到50个之间的核苷酸的连续片断。在另外一个具体实施方式中，通过本发明的方法产生的互补寡核苷酸优选是互补于所述外显子RNA的16到50个之间的核苷酸的连续片断。优选地，该寡核苷酸是互补于所述外显子RNA的13到25个核苷酸的连续片断。优选所述外显子RNA的14和25个核苷酸之间。不同类型的核酸可以用于产生寡核苷酸。优选地，该寡核苷酸包含RNA，因为RNA/RNA杂交非常稳定。由于外显子跳跃技术的目的之一是在受试者中进行剪接，优选寡核苷酸RNA包含提供该RNA额外特性的修饰例如对于核酸内切酶和RNA酶H的抗性、额外的杂交力、提高稳定性(例如在体液中)，升高或降低柔性、减少毒性、提高胞内运输、组织特异性等等。优选的所述修饰包含2’-O-甲基-硫代磷酸酯寡核糖核苷酸修饰。优选的所述修饰包含2’-O-甲基-硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸修饰。在本发明的一个具体实施方式中提供了包含寡核苷酸的杂交寡核苷酸，该寡核苷酸包含2’-O-甲基-硫代磷酸酯寡(脱氧)核糖核苷酸修饰和锁核酸(locked nucleic acid)。这种特殊的组合与由锁核酸组成的等同物相比具有更好的序列特异性，并且与由2’-O-甲基-硫代磷酸酯寡(脱氧)核糖核苷酸修饰组成的寡核苷酸相比具有更高的有效性。
随着核酸模拟技术(nucleic acid mimicking technology)的出现，产生具有与核酸本身种类上而不必在数量上相似的、优选相同的杂交特性的分子已经成为可能。这样的等同物当然也是本发明的一部分。这样的模拟等同物的实施例为肽核酸、锁核酸和/或吗啉代磷酰二胺盐(morpholino phosphorodiamidate)。本发明寡核苷酸等同物合适的但是非限制性的实施例可以在(Wahlestedt，C.et al.(2000)、Elayadi，A.N.&Corey，D.R.(2001)、Larsen，H.J.，Bentin，T.&Nielsen，P.E.(1999)、Braasch，D.A.&Corey，D.R.(2002)、Summerton，J.&Weller，D.(1997)中找到。一种或多种等同物之间的杂交和/或与核苷酸的杂交当然也是发明的一部分。在一个优选具体实施方式中，等同物包含锁核酸，因为锁核酸表现出更高的靶亲和性和降低的毒性，并因此表现出更高效率的外显子跳跃。
本发明的寡核苷酸一般不必与外显子的剪接供体或剪接受体重叠。
含有剪接系统的转录系统可以在体外产生。该技术具有合适的有效系统。然而，对于操作活细胞，重建mRNA当然是非常需要的。优选地，通过重建mRNA可以获得期望效果的细胞。在前文中已列出优选的被重建的mRNA。优选地，在肌细胞中的活性基因被用在本发明中。肌细胞(也就是肌管)为多核细胞，其中很多、但不是全部的肌细胞的特异基因是由长链前RNA转录的。这样的长链前RNA对于本发明是优选的，因为由这样的长链mRNA产生的mRNA的重建是特别有效的。我们认为，因为允许更多的时间用于进行加工，使用相对长的时间去产生全长的前mRNA有助于提高使用本发明的方法或手段来重建的效率，虽然没有必要这样做。优选的基因组，其中的mRNA以本发明的方法优选重建，包括：造成Bethlem肌病的COL6A1、造成肌小管肌肉病变的MTM1、造成Miyoshi肌病和LGMD的DYSF(dysferlin)、造成Merosin缺陷肌肉营养不良的LAMA2(层粘连蛋白α2)、造成Emery-Dreyfuss肌肉营养不艮的EMD(emerin)、造成杜氏型肌营养不良和贝克尔型肌营养不良的DMD基因、和造成LGMD2A的CAPN3(钙蛋白酶)。任何细胞都可以使用，然而，正如提到的，优选的细胞是来自DMD患者的细胞。细胞可以在体外操作，也就是在受试者的体外。但是，理想的细胞具有在体内重建的能力。用于提供给细胞本发明的寡核苷酸或其等同物的适合方法在所属领域中是已有的。本发明的寡核苷酸，可以通过例如表达媒介的形式提供给细胞，其中该表达媒介编码了包含所述寡核苷酸的转录本。该表达媒介优选通过基因输送载体引入细胞中。优选的输送载体是病毒媒介，例如腺病毒媒介，更加优选的是腺伴随病毒媒介。因此，本发明还提供了这样的表达媒介和输送载体。设计适合的转录本是技术人员的技能范围内的。本发明优选的是Pol III驱动的转录本。优选与U1或U7转录本的融合转录本的形式。如参考文献53和54中所披露的产生这样的融合。考虑到迄今为止所取得的进展，我们预期对向细胞中提供寡核苷酸或其等同物的方法进行改进。当然可以结合这种将来的改进从而获得使用本发明的方法重建mRNA的提到的效果。目前适合在体内输送本发明的寡核苷酸、等同物或化合物到细胞中的方法包含适合于核酸转染的聚乙烯亚胺(PEI)或合成两亲性分子(synthetic amphiphils)(SAINT-18)。两亲性分子表现出增加的转运和降低的毒性，当用于体内转运时也是如此。优选为在
Figure S2006800188724D00111
J.，et al(2001)提到的化合物。优选使用的合成两亲性分子是基于易于合成获得的“长尾”吡啶首基基质。在合成两亲性分子的大类群中，有几种显示出显著的在整个细胞存活周期中具有低毒性的转柒潜力。结构修饰的便利可以用于进一步的修饰和分析它们进一步(体内)的核酸转移特性和毒性。
根据本发明的寡核苷酸或其等同物可以用于，至少部分地，改变前mRNA中所述外显子的识别。在这个具体实施方式中，至少部分地阻止剪接机制将外显子边缘连接于mRNA上。本发明的寡核苷酸或其等同物至少部分地可以改变前mRNA中的外显子识别。本发明也提供了这种用途。阻止mRNA中靶向外显子增加也可以被提供以用于，至少部分地激发前mRNA中的外显子跳跃。如前所述，靶外显子不包括在产生的mRNA(resulting mRNA)中。但是部分该外显子(新外显子)偶尔会被保留在所产生的mRNA中。当靶外显子含有潜在的剪接受体和/或剪接供体序列时，这种情况有时会发生。在这个具体实施方式中，剪接机制转而使用以前不是(或者未充分利用的)剪接受体/供体序列，从而产生新的外显子(新外显子)。该新外显子可以具有一个与原有外显子相同的末端，尽管不总是这样。因此，在一个方面，本发明的寡核苷酸或其等同物被用于改变剪接机制使用的剪接供体或剪接受体的效率。
在另外一个具体实施方式中，本发明提供了将本发明的寡核苷酸或其等同物用于药品制备的应用。
正如提到的，优选的用于重建mRNA的基因是DMD基因。DMD基因是一个具有很多不同的外显子的大基因。考虑到该基因位于X染色体上，因为孩子从父母双方都可能获得该基因的坏拷贝，或者由于其肌肉细胞中显著地位移X染色体失活导致的功能性等位基因的显著的位移失活而患病，因此患病的主要是男孩，当然女孩也会患病。该蛋白是由容量超过至少2.6Mb的多个外显子编码(79)。在DMD基因的任何部分都可能出现缺陷。一个特殊的外显子或几个特殊外显子的跳跃常常会产生编码比正常短，但是至少具有部分功能性的肌营养不良蛋白的重建mRNA。在基于外显子跳跃技术的药物开发中的一个特殊问题是多个突变可能会导致细胞中功能性肌营养不良蛋白的缺乏。尽管事实上已经发生的多个不同突变可以通过单个外显子的跳跃进行校正，但是因为不同的突变需要不同的外显子被跳跃，该多个突变需要形成大量不同的药品。
在一个更加优选的具体实施方式中，根据本发明的多个(至少2个)寡核苷酸用于药物制备，从而使用单一一种药物就可以跳跃多于1个外显子。这种特性不仅非常实用，因为只需要产生有限种类的药品用于治疗许多不同类型的杜氏型或贝克尔型突变。现在，对于所属领域的一般技术人员另一项可做的选择是选择特殊功能性重建肌营养不良蛋白并且生产能够产生这些优选肌营养不良蛋白的化合物。这样的优选终产物也被称为轻度表型肌营养不良蛋白。正常的肌营养不良蛋白的结构可被图示为具有结构功能的两个端点(珠状)，二者通过一个长的、至少部分柔性的棒状结构(rod)彼此连接起来。这个棒状结构在许多贝克尔型患者中是缩短的。在本发明的一个特别优选的具体实施方式中，提供了一种治疗包含表3列出的突变的DMD患者的方法，其包含向所述患者提供能有效地诱导在第一列所提到的外显子中的外显子跳跃的寡核苷酸或其等同物。在一个优选具体实施方式中，所述的寡核苷酸包含能有效地诱导表2中提到的外显子跳跃的寡核苷酸或等同物。
在以上观点中，本发明还提供了本发明中用于药物制备的寡核苷酸、其等同物或化合物的使用。还提供了根据本发明的药物的制备。本发明中所述的寡核苷酸或其等同物可以用于制备用于治疗遗传性疾病(例如DMD)的药物。类似地，提供了改变效率的方法，利用该方法，通过剪接机制识别前mRNA中的外显子所述的前mRNA由一个包含至少2个外显子和至少1个内含子的基因编码，所述的方法包含提供包含所述剪接机制和所述基因，以及根据本发明的寡核苷酸、其类似物或化合物的转录系统，其中所述的寡核苷酸、其等同物或化合物可以与所述外显子中的至少1个杂交，以及允许转录和剪接在所述的转录系统中发生。优选地，所述基因包含至少3个外显子。
本发明的寡核苷酸、或其等同物当然可以与干扰mRNA结构的其它方法进行结合。例如，在一个方法中包括与前mRNA中至少一个其它外显子互补的至少一种的其它的寡核苷酸是可能的。这种方法可以用于防止由这种前mRNA产生的mRNA中增加该前mRNA中的2个或多个外显子。在一个优选具体实施方式中，所述的至少一个的其它的寡核苷酸为通过本发明的方法产生的寡核苷酸或其等同物。本发明的这部分还被称为双或多外显子跳跃。在大多数情况下，双外显子跳跃会导致只有2个靶(互补)外显子被从前mRNA中被排除。然而，在另外一些情况下，甚至当该区域存在其它外显子(间插外显子)时，发现所述前mRNA中的靶外显子和所述外显子之间的整个区域在所产生的mRNA中不存在。对于由DMD的得到的寡核苷酸的联合，这种多外显子跳跃尤其是这样，其中外显子45的一个寡核苷酸和外显子51的一个寡核苷酸被加入到转录DMD基因的细胞中。这样的设定导致产生的mRNA不含有外显子45到51。显然，在所提到的寡核苷酸存在的情况下，该前mRNA的结构为剪接机制被激发将外显子44和52彼此连接。
发现通过在两个互补寡核苷酸之间提供一个连接物来特别促进间插外显子也被跳跃是可能的。最后，本发明提供了能与前mRNA中被一个基因编码的至少2个外显子杂交的化合物，所述的化合物包含至少两部分，其中第一部分包含具有至少8个连续的与所述的至少2个外显子中的第一个互补的核苷酸的寡核苷酸，其中第二部分包含具有至少8个连续的与所述的前mRNA的第二个外显子互补的核苷酸的寡核苷酸。该至少两个部分在所述的化合物中被连接起来形成一个单一的分子。其连接可以通过任何方式，但是优选通过核苷键来实现。在后一种情况中，不含有一个或另一个互补外显子之间重叠的核苷酸的数量可以为0，但是优选4到40个核苷酸。该结合基团可以为任何类型能连接寡核苷酸的基团。目前，许多不同的模拟寡核苷酸的杂交性质的化合物是可用的。如果这样的等同物包含在种类上(in kind)而不必在数量上相似的杂交性质，这样的化合物也适合于本发明。合适的等同物在本说明书中已经提到过。该化合物中的一个、优选多个寡核苷酸可通过本发明中产生寡核苷酸的方法来产生。正如已提到的，本发明的寡核苷酸不必只由促进与靶外显子杂交的寡核苷酸组成。可以添加额外的物质和/或核苷酸。本发明还提供了一种组合物，其含有：能与基因前mRNA中的外显子杂交的本发明的第一寡核苷酸或所述第一寡核苷酸的等同物，以及至少一种能与基因前mRNA中其它外显子杂交的本发明的第二寡核苷酸或所述第二寡核苷酸的等同物。在一个优选具体实施方式中，所述的第一和至少所述的第二寡核苷酸或其等同物可以与相同前mRNA上的不同的外显子进行杂交。该组合物可以用于诱导各自外显子的外显子跳跃。已经观察到当该组合物包含定向于人类DMD基因的外显子45和51，或者42和55的寡核苷酸或其等同物时，它是只有靶外显子被排除于产生的mRNA之外这条规律的例外，代替的是靶外显子和整个间插区域都被排除于产生的mRNA之外。在本发明中，这个特性被用于校正DMD基因的多种不同的衰弱突变(debilitating mutation)。因此，在本发明的一个具体实施方式中提供了治疗含有人类DMD基因突变的受试者的方法，其中作为所述突变的结果是该DMD基因不能被适当地翻译为功能性肌营养不良蛋白，该方法包含为所述受试者提供前面提到的组合物。可以通过这种方式矫正的突变通常为位于靶外显子中或附近或者间插区域中的突变。然而，校正在所提到的外显子和间插区域之外的移码突变也是可能的。
本发明会通过随后的说明书中进行详细地解释，但是不会限制本发明。
附图说明
图1：有效和无效AON的代表性和比较性分析。对用具有不同外显子的46种AON处理的对照肌管培养物的肌营养蛋白mRNA片段进行RT-PCR分析。可以观察到对于AON 8、22、23和26超过总转录本的25％的清楚的外显子跳跃水平(以双加号表示)。AON4、6、20、24和25诱导少于25％的外显子跳跃水平(以单加号表示)，其中AON 6和24诱导非常微弱的跳跃。以AON 9和21处理后，未观察到跳跃(以减号表示)。
图2：外显子46和外显子46特殊AON的图示概况。外显子46的序列与以线表示的AON描绘在同一位置上。该位置和通过ESEfinder预测的高于SF2/ASF、SC35和SRp40和SRp55阈值的值以条形表示。由ESEfinder提供的每一种SR蛋白的阈值示于括弧中。最有效的AON(#8、22、23和26)真正地覆盖了假定的ESE位点，然而无效的AON 25不能完全覆盖推定的ESE位点。但是，无效的AON#9同时靶向潜在的SRp40和SRp55结合位点。
图3.外显子46的前mRNA二级结构的实施例以及通过m-fold预测的侧翼序列。显示了3’和5’剪接位点的位置。该二级结构由闭合结构和打开结构组成，闭合机构中核苷酸结合于靶RNA中的其它核苷酸，打开结构由未结合的核苷酸组成。显示了两个外显子46特异性AON(即#6和#26)的位置；20-mer的#6靶向3个未结合的核苷酸，因此可用碱基对的分数比为3/20(0，15)。AON#26为19-mer，它的核苷酸中的15个靶向未结合的核苷酸，因此可用碱基对的分数比为15/19(0.79)。
图4.根据SF2/ASF、SC35、SRp40和SRp55的预测值、AON长度、可用碱基对的分数比和GC含量划分AON的不同组的箱线图。A)有效和无效AON的比较。对于有效AON，SF2/ASF和SC35的值显著高于无效AON(Wilcoxon符号秩和检验)。对于其它变量未发现具有显著性差异。B)无效的AON和在少于25％转录本(＜25％)中诱导跳跃的AON的比较，以及与在多于25％转录本(＞25％)中诱导跳跃的AON的比较。对于任何一种变量，没有一个单独的组相较于其它组存在着显著性差异(Kruskal-Wallis符号秩和检验)。但只有组中的两个进行互相比较时，＞25％组的SF2/ASF和SC35的值显著高于无效的和＜25％组的SF2/ASF和SC35的值；＜25％组含有的SC35的值显著高于无效组的并且＞25％组的GC含量显著高于无效组的。
*两组之间的差异在p-值＜0.1时为显著的，**p-值＜0.05
具体实施方式
材料和方法：
AON，转染和RT-PCR分析
AON设计是基于(部分)重叠通过m-fold程序(Mathews et al.911-40)预测的靶RNA的预测的开放二级结构。一些以前已经披露过的AON(表1)通过凝胶迁移率变动试验来进行进一步的分析(vanDeutekom et al.1547-54；Aartsma-Rus et al.S71-S77)。
所有的AON(见表1)是通过Eurogentec(比利时)来合成的并且含有2′-O-甲基RNA和全长的硫代磷酸酯主链。根据以前所披露的(van Deutekom et al.1547-54)对从人类对照获得的肌管培养物进行转染。每一个AON以不同的浓度(从200nM到1μM不同)，用每μg的AON 2μl-3.5μl ExGen 500(MBI Fermentas)至少转染两次。具有5’荧光素标记的对照的AON用于确定最佳转染效率(通常超过90％)。RNA分离和RT-PCR分析通过以前披露的(Aartsma-Rus et al.S71-S77)来进行，根据使用说明来使用转录器(Transcriptor)逆转录酶(Roche diagnostics)。PCR引物(Eurogentec，Belgium)为以前所披露过的(Aartsma-Rus et al.S71-S77)，或者从AON靶向的外显子旁侧的外显子中选择(根据需要的序列)。
统计分析
使用R软件和exactRankTests软件包(R Development CoreTeam；Hothorn和Hornik)来进行统计分析。当比较两组AON时，Wilconxon符号秩和检验用于确定显著高的值。Kruskal Wallis符号秩和检验用于确定3组中一组是否与其它组显著不同。
结论
新型AON的功效
新设计的77种AON的系列的功效还未被报道过。这些AON以不同的浓度进行了至少两次的检验，它们的效力通过RT-PCR分析来确定。所有的AON的性质和功效都在表1中列出。特异性的外显子跳跃，正如通过序列分析(数据未显示)所确定的，受到由这77种新型AON中的51种(66％)以所检验的每一个浓度诱导。对于每一个靶外显子，除了外显子47和外显子57仍然是不可跳跃的，至少一个AON是有效的。
我们还将诱导外显子跳跃的AON进一步细分为两组：在少于25％的转录本中诱导外显子跳跃的AON(通过表1中的一个“加号”表明)和在超过25％的转录本中诱导外显子跳跃的AON(通过表1中的2个“加号”表明)。外显子46跳跃的不同水平的实施例在图1中显示。总的来说，新型AON中的25种诱导的跳跃水平少于25％，26种诱导的跳跃水平超过25％。
多数有效的AON只诱导靶外显子的跳跃。值得注意的是，靶向外显子8的AON总是诱导外显子8和框内外显子9的双外显子跳跃并且从来没有外显子8的单独跳跃(数据未显示)。除了单独的外显子40、58和73的跳跃，靶向外显子40、58和73的AON偶尔会分别诱导两个外显子40和41、或者58和59或者73和74的低水平跳跃(数据未被显示)。对应于我们新设计的特异AON的外显子51，外显子51中的隐蔽剪接位点有时会被使用，正如以前已经被披露的特异于AON的外显子51(Aartsma-Rus et al.S71-S77；Aartsma-Rus et al.907-14)。
AON的评价
迄今为止，我们已经检验过总共114种AON(如表1所示)；其中76种(67％)诱导外显子跳跃(41种超过25％的转录本，35种少于25％转录本)，而38种(33％)是无效的。为了了解功效与AON性质之间是否存在联系，我们对于有效AON组和无效AON组进行了一些参数的评价。通过ESEfinder软件计算对于每个外显子的潜在的SR结合位点而没有阈值。对于所有与AON靶位点重叠的结合位点，表1中仅列出对于每一个SR蛋白的最高预测值。外显子46中存在的假定的SR结合位点的一个实施例在图2中示出(为了清楚起见，只显示了高于软件提供的标准阈值的位点)。仅有部分被AON覆盖的潜在SR结合位点未纳入考虑(例如AON 20和25以及图2中的第二假定SRp40位点)。另外，对AON的长度、有效的核苷酸以及GC含量进行了比较(表1)。由靶定于预测的RNA二级结构中未键合的核苷酸的核苷酸的量确定的有效的核苷酸部分被AON的长度分开(图3)。
有效的和无效的AON的各个不同变量的箱线图在图4A中绘出。应注意的是，对于有效的AON，其SF2/ASF和SC35的由ESEfinder预测的数值明显高于无效的AON的。这种差异具有统计学意义，其通过Wilcoxon秩和检验计算分别得到：SF2/ASF的p-值＜0.1，SC35的p-值＜0.05。对于预测SRp40和SRp55的值，未发现显著差异。AON的长度、有效核苷酸部分或者AON的GC含量也与AON的功效无关。
我们将有效的AON细分为两个小组(包括跳跃超过或少于25％转录本的)并且相应地绘制了箱线图(图4B)。使用Kruskal-Wallis秩和检验，未观察到组间的任一变量存在显著统计学差异。但是，当使用Wilcoxon秩和检验只比较两组之间时，我们确实观察到在与无效组(p-值＜0.05)和＜25％跳跃的组(p-值＜0.05)对比时，＞25％跳跃的组中的SF2/ASF值的统计学的升高。对于SC35值，只有无效的和＜25％跳跃组之间的差异是显著的(p-值＜0.05)。＞25％跳跃组的SRp40的预测值显著高于无效组和＜25％跳跃组(p-值＜0.1)。最后，＞25％跳跃组的GC含量高于无效组(p-值＜0.1)。
靶向5’剪接位点或者，可选择地，靶向外显子内序列的AON可以有效地诱导外显子跳跃(Wilton et al.330-8；Dunckley et al.1083-90；Mann et al.42-7；De Angelis et al.9456-61；Mann et al.644-54；Lu et al.6；Goyenvalle et al.1796-99；Lu et al.198-203)(Takeshima et al.515-20；van Deutekom et al.1547-54；Takeshima et al788-90；Aartsma-Rus et al.S71-S77；Aartsma-Rus et al.907-14；Aartsma-Rus et al.83-92；Takeshima)。但是，外显子内AON可以具有一些超越剪接位点AON的优势。首先，外显子内AON通常更为特殊，因为它们靶向编码序列而不是剪接位点，剪接位点是被共有序列所部分决定的。并不是对所有剪接位点都是这样。例如，靶向max型鼠中大多数外显子研究中的鼠科动物DMD的外显子23的5’剪接位点，与共有剪接位点相差很大。但是，平均起来，至少部分的剪接位点特异性AON会由共有序列组成，有可能允许其它外显子的反向靶向。另外，Mann和其同事推断在剪接位点AON设计中最重要的变量是靶序列(Mann et al.644-54；Mann et al.42-7)。找到对于鼠科动物外显子23有效的5’剪接位点AON需要广泛的优化(Mann et al.644-54)。相反，外显子内AON的设计被证明是相当简单的，因为有靶序列更大的窗口。平均起来，预测的前mRNA中三分之二的靶向打开结构的DMDAON是有效的。观察到本研究中披露的114个外显子内AON中的76个是有效的并且共同诱导37个靶DMD外显子中总共35个的跳跃，这强调了这个说法。
因为ESEfinder最近已经成为公众可得到的，我们分析了我们的AON是否靶向预测的SF2/ASF，SC35，SRp40或SRp55结合位点。有趣的是，我们观察到对于有效的AON，当它与无效AON比较时，两个最高丰度SR蛋白(即SF2/ASF和SC35)具有显著高的值，而我们没有观察到预测的SRp40和SRp55结合位点有显著性的差异。但是，当我们把有效AON细分为有效AON(＜25％跳跃)和非常有效AON(＞25％跳跃)时，我们确实观察到对于非常有效组，与无效和有效组相比，SRp40具有显著高的值。应该注意，不是每一个有效AON具有对于这些SR蛋白的高值，一些无效的AON确实也具有高值。但是，应切记ESEfinder值反映了对假定ESE位点的预测。然而，有效AON具有趋于较高SR值的显著趋势，因此我们设计未来的AON主要是为了预测的SF2/ASF、SC35和SRp40结合位点。通过比较，观察到有效和无效AON在长度、有效核苷酸部分或GC含量上没有显著性差异。但是，可以诱导超过25％的跳跃水平的AON的GC含量，显著地高于无效的AON的GC含量。这可以通过高GC含量的AON具有高的熔化温度(解链温度，meltingtemperature)，从而更有可能与它们的靶RNA相结合的事实来解释。
我们的AON的67％是有效的事实是令人印象深刻的，并且可能是由于DMD基因的复杂性，DMD基因的长度为2.4Mb并且含有长度通常超过30kb的内含子。因此，该基因的剪接可能已经是有问题的并且与其它基因相比更依赖于外显子剪接增强子序列。另外，一些非常大的内含子(＞100kb)的出现使该基因不太可能被连续剪接。例如内含子7的长度为110Kb，然而内含子8只有1113bp。因为我们和其他人(Dr.Steve Wilton，个人交流(personalcommunication)；Luis Garcia，个人交流)观察到在单独靶向外显子8后只有外显子8和9同时都被跳跃，才有可能在的绝大多数的DMD转录本中内含子8在巨大内含子7之前被剪接出去。同样地，对于靶向外显子40、58和73的AON，我们有时观察到除了跳跃靶外显子，其附近的外显子的跳跃。这表明在转录本部分中，远端的内含子先于近端的内含子被剪接出去并且可能暗示这些内含子的延迟剪接。
因为对于DMD患者有很大范围的突变，特异于多种单个的内部外显子(即外显子2-63和71-78)的AON是必需的。由于外显子64-70编码对于肌营养蛋白功能性必需的半胱氨酸富集区，修复这个区域的阅读框不会产生功能性蛋白质。使用预测的前mRNA二级靶结构和/或预测的SR蛋白结合位点(优选SF2/ASF或SC35)的存在/缺失来设计DMD外显子内AON是非常有效的。
附表
表1.使用的AON的性质
AON 序列  靶向外显子 跳跃1           超过阈值的ESEfinder值2 长度  打开部分3 ％GC
   SF2/ASF   SC35   SRp40  SRp55
h2AON16h2AON28h2AON36 gaaaauugugcauuuacccauuuu     222  ++--     1.491.491.59   1.541.441.44   3.371.401.40   1.122.712.71   242224   0.290.320.29   29％36％29％
h8AON1h8AON3     cuuccuggauggcuucaauguacauuaagauggacuuc     88  ++++     1.31-1.19   0.120.70   2.571.82   2.573.22   1919   0.530.53   47％37％
h17AON1h17AON2     ccauuacaguugucuguguuuaaucugccucuucuuuugg     1717  +++     3.771.76   2.92-0.68   3.043.83   2.911.54   2020   0.400.60   40％40％
h19AON4     ucugcuggcaucuugc     19  +     2.83   1.92   2.26   2.46   16   0.56   56％
h29AON16h29AON26h29AON4h29AON6h29AON9h29AON10h29AON11 ccaucuguuagggucugugucugugccaauaugcgaaucuuaaaugucucaaguuccguaguucccuccaacgcauguaguucccucc     29292929292929  +++++++++-+     5.745.743.091.261.831.610.13   1.071.073.243.281.410.791.95   4.604.802.402.331.091.683.63   3.532.042.914.331.39-0.113.16   20201920181615   0.300.400.580.550.280.440.67   46％50％53％45％33％56％53％
h40AON18h40AON26     4040  ++++     1.312.81   -0.392.76   1.443.93   0.771.21   1919   0.580.47   37％53％
h41AON18h41AON26     4141  +++     3.822.39   -0.392.62   1.531.32   0.930.86   1920   0.740.50   47％35％
h42AON16h42AON28     4242  ++     2.893.23   3.203.37   5.761.98   3.141.19   1718   0.470.00   47％50％
h43AON15h43AON28h43AON3h43AON4h43AON57 uguuaacuuuuucccauuggcauuuuguuaacuuuuuccc     4343434343  -+--++     1.83-0.780.50-0.71.37   1.471.061.081.062.97   3.61-0.244.151.111.43   2.830.100.100.062.57   1819202019   0.390.630.550.450.37   50％26％35％30％53％
h44AON17h44AON27     4444  ++++     0.25-0.64   0.641.47   0.862.01   2.512.41   1920   0.260.40   58％35％
h45AON18h45AON26h45AON3h45AON4h45AON57h45AON9 ucuguuuuugaggauugcccaccgcagauucaggcuuugcagaccucuugcc     454545454545  ----+-     1.793.030.373.270.503.96   1.010.821.821.452.303.20   3.072.071.971.811.190.86   2.410.931.853.390.352.56   191918171717   0.370.740.390.470.290.65   42％42％39％65％85％59％
h46AON45h46AON65h46AON85h46AON95h46AON20 gaaauucugacaagauauucu     4646464646  ++++-+     2.342.34-1.140.661.35   2.822.821.081.301.08   1.681.683.520.612.07   0.012.461.042.831.48   1520201521   0.070.150.601.000.48   6％50％40％40％29％
h46AON21h46AON22h46AON23h46AON24h46AON25h46AON26     uaaaacaaauucauuuccagguucaagugggauacuuccagguucaagugucaagcuuuucuuuuagcugacaagauauucuuagguucaagugggauacua     464646464646 -++++++++     -2.282.391.61-1.19-0.802.39   -0.403.471.03-1.091.083.47   -0.723.701.473.520.743.70   0.830.780.780.181.482.09   152015171619   0.400.600.530.350.880.79   13％50％47％29％31％42％
h47AON18h47AON28h47AON3h47AON4h47AON5h47AON6 uccaguuucauuuaauuguuugcugcuugagcuuauuuucaaguuagcacuuacaagcacggguuucaaguuuaucuugcucuuc     474747474747 ------     3.82-0.891.700.74-1.371.11   1.552.170.222.172.050.96   3.682.202.762.201.250.74   1.210.631.020.532.07-0.40   12122231921   0.220.480.450.390.530.33   50％29％27％36％53％33％
h48AON16h48AON26h48AON3h48AON4h4AON6h48AON7h4AON8h48AON9h48AON10 ggucuuuauuugagcuuccuucaagcuuuuuuucaagcugcuucaauuucuccuuguuuuuauuugagcuucaauuugcugcccaaggucuuuucuucaaggucuucaagcuuuuuaacugcucuucaaggucuuc     464848484848484848 ----++-++     0.830.640.01-1.340.830.010.910.910.91   0.081.501.721.320.341.721.961.961.96   2.442.332.832.321.621.620.252.322.32   1.381.311.580.422.572.571.902.212.21   162119211919172121   0.810.480.740.620.630.680.530.620.48   38％24％37％33％37％21％53％3％43％
h49AON16h49AON28     4949 ++++     3.020.56   0.520.05   1.960.70   3.411.38   1919   0.420.32   47％47％
h50AON16h50AON26     5050 +++     1.691.10   3.021.37   2.711.41   -0.032.83   1715   0.240.47   47％67％
h51AON10h51AON24h51AON27h51AON26h51AON29 gaaagccagucgguaaguuccacccaccaucacccugauauccucaaggucaccc     5151515151 ++--++++     -0.311.770.392.681.67   1.481.141.742.271.91   1.354.900.383.842.88   0.412.041.312.912.82   2020152320   0.700.800.000.220.25   40％50％67％30％50％
h52AON1h52AON2     uugcuggucuuguuuuucccguaaugauuguucu     5252 +-     1.56-0.07   3.611.11   2.442.28   0.52-0.80   1816   0.500.25   39％38％
h53AON15h53AON28     5353 +-     3.062.20   2.264.04   1.633.40   0.770.21   1818   0.780.50   61％61％
h54AON1h54AON2     uacauuugucugccacuggcccggagaaguuucaggg     5454 ++++     3.773.14   1.641.80   4.003.64   1.881.34   1819   0.560.58   50％68％
h55AON1h55AON2h55AON3h55AON5h55AON6     cuguugcaguaaucuaugagugccauuguuucaucagcucuuuugcaguaaucuaugaguuucuccuguaggacauuggcagugagucuucuaggagccuu     5555555555 +++++++     0.742.700.743.030.87   4.822.294.822.675.77   4.923.464.925.663.36   2.921.272.412.340.33   2023202018   0.650.520.600.360.28   40％39％36％50％50％
h56AON1h56AON2h56AON3     uuuuuuggcuguuuucauccguucacuccacuugaaguucccuuccagggaucucagg     565656 +-+     2.770.781.81   1.561.885.52   2.524.043.68   2.221.520.27   202018   0.550.350.56   35％45％61％
h57AON1h57AON2h57AON3     uaggugccugccggcuucugaacugcuggaaagucgccuucagcuguagccacacc     575757 ---     2.112.472.83   3.301.954.73   2.542.774.81   2.032.414.10   172118   0.410.570.28   65％57％56％
h58AON1h58AON2     uucuuuaguuuucaauucccucgaguuucucuaguccuucc     5858 -+     0.631.65   1.703.45   2.522.18   1.600.68   2219   0.640.37   32％47％
h59AON1h59AON2     caauuuuucccacucaguauuuugaaguuccuggagucuu     5959 -++     1.771.31   0.344.84   3.533.26   2.231.34   2119   0.570.47   33％42％
h60AON1h60AON2     guucucuuucagaggcgcgugcugagguuauacggug     6060 +-     0.662.87   3.662.56   2.294.08   3.002.78   1819   0.560.84   58％53％
h61AON1h61AON2     gucccugugggcuucauggugcugagaugcuggacc     6161 -+     5.262.28   2.923.32   5.974.43   2.573.64   1918   0.370.56   56％61％
h62AON1h62AON2     uggcucucucccaggggggcacuuuguuuggcg     6262 ++-     1.061.70   0.330.56   1.891.71   -0.500.09   1617   0.500.47   69％59％
h63AON1h63AON2     ggucccagcaaguuguuugguagagcucugucauuuuggg     6363 ++     1.702.81   0.972.57   3.163.12   1.250.93   1921   0.790.38   53％48％
h71AON1h71AON2     gccagaaguugaucagaguucuacuggccagaaguug     7171 ++++     0.121.37   3.354.61   4.364.36   1.471.47   1918   0.790.50   47％50％
h72AON1h72AON2     ugaguaucaucgugugaaaggcauaauguucaaugcgug     7272 +++     6.590.77   0.602.43   6.021.26   0.252.14   2018   0.600.47   40％42％
h73AON1h73AON2     gauccauugcuguuuuccgagaugcuaucauuuagauaa     7373 +++     1.220.48   0.890.88   2.162.28   2.473.64   1821   0.380.29   44％29％
h74AON1h74AON2     cuggcucaggggggaguuccccucuuuccucacucu     7474 +++     1.353.04   2.390.33   2.351.88   1.392.82   1719   0.590.16   71％53％
h75AON1h75AON2     ccuuuauguucgugcugcuggcggccuuuguguugac     7575 ++++     3.641.51   1.411.11   3.393.71   2.831.12   1918   0.210.39   47％61％
h76AON1h76AON2     gagagguagaaggagaggaauaggcugacugcugucgg     7676 -+     0.083.23   1.281.47   3.534.30   3.221.58   1919   0.320.32   53％58％
h77AON1h77AON2     uuguguccuggggaggugcuccaucaccuccucu     7777 ++++     4.262.43   3.500.32   3.57-0.21   0.181.65   1718   0.470.39   59％56％
h78AON1h78AON2     gcuuuccagggguauuuccauuggcuuuccagggg     7878 ++++     1.811.81   4.042.95   3.323.32   0.620.27   1817   0.780.71   50％59％
++在正常对照肌管培养物的超过25％的转录本中检测出外显子跳跃；+在达到25％的转录本中检测出外显子跳跃；-未检测出外显子跳跃
2对于每一种SR蛋白质给出每一种AON的最高值
3在预测的RNA二级结构中被AON所靶向的经过该AON总体长度的有效核苷酸部分
4AON靶向在缺失Kobe中被删除的部分ESE(Matsuo et al.963-7；Matsuoet al.2127-31)
5已公开(van Deutekom et al.1547-54)
6已公开(Aartsma-Rus et al S71.)
7已公开( Aartsma-Rus et al.83-92)
表2.新型AON的选择
AON 序列   靶向外显子 跳跃1              超过阈值的ESEfinder值2 长度   打开部分3 ％GC
   SF2ASF   SC35   SR40   SRp55
h8AON1h8AON3     cuuccuggauggcuucaauguacauuaagauggacuuc     88   ++++     1.31-1.19   0.120.70   2.571.82   2.673.22   1919   0.530.53 47％37％
h46AON20h46AON22h46AON23h46AON24h46AON25     gaaauucugacaagauauucuuccagguucaagugggauacuuccagguucaagugucaagcuuuucuuuuagcugacaagauauucuu     4646464646   +++++++     1.352.391.81-1.19-0.80   1.083.471.03-1.091.08   2.073.701.473.520.74   1.480.780.780.181.48   2120151716   0.480.600.530.350.88 29％50％47％29％31％
h48AON9h48AON10     cuucaaggucuucaagcuuuuuaacugcucuucaaggucuuc     4848   ++     0.910.91   1.961.98   2.322.32   2.212.21   2121   0.620.48 38％43％
h52AON1     uugcuggucuuguuuuuc     52   +     1.56   3.81   2.44   0.52   18   0.60 39％
h54AON1h54AON2     uacauuugucugccacuggcccggagaaguuucaggg     5454   ++++     3.773.14   1.641.80   4.003.54   1.881.34   1819   0.560.58 50％58％
h55AON1h55AON2h55AON3h55AON5h55AON6     cuguugcaguaaucuaugagugccauuguuucaucagcucuuuugcaguaaucuaugaguuucuccuguaggacauuggcagugagucuucuaggagccuu     5555555555   +++++++     0.742.700.743.030.87   4.822.294.822.675.77   4.923.464.925.663.36   2.821.272.412.340.33   2023202018   0.650.520.600.350.28 40％39％35％50％50％
h56AON1h56AON3     uuuuuuggcuguuuucauccccuuccagggaucucagg     5656   ++     2.771.81   1.565.52   2.523.68   2.220.27   2018   0.550.56 35％61％
h58AON2     gaguuucucuaguccuucc     68   +     1.65   3.45   2.18   0.68   19   0.37 47％
h60AON1     guucucuuucagaggcgc     60   +     0.66   3.66   2.29   3.00   18   0.56 56％
h61AON2     gugcugagaugcuggacc     61   +     2.28   3.32   4.43   3.64   18   0.56 81％
h62AON1     uggcucucucccaggg     62   ++     1.08   0.33   1.89   -0.50   16   0.50 69％
h63AON1h63AON2     ggucccagcaaguuguuugguagagcucugucauuuuggg     6363   ++     1.702.81   0.972.57   3.163.12   1.250.93   1921   0.790.38 53％48％
h71AON1h71AON2     gccagaaguugaucagaguucuacuggccagaaguug     7171   ++++     0.121.37   3.354.61   4.364.36   1.471.47   1918   0.790.50 47％50％
h72AON1h72AON2     ugaguaucaucgugugaaaggcauaauguucaau9cgug     7272   +++     6.580.77   0.602.43   6.021.28   0.252.14   2019   0.600.47 40％42％
h73AON1h73AON2     gauccauugcuguuuuccgagaugcuaucauuuagauaa     7373   +++     1.22-0.48   0.890.68   2.162.28   2.473.64   1821   0.390.29 44％29％
h74AON1h74AON2     cuggcucaggggggaguuccccucuuuccucacucu     7474   +++     1.353.04   2.390.33   2.351.68   1.392.82   1719   0.590.16 71％53％
h75AON1h75AON2     ccuuuauguucgugcugcuggcggccuuuguguugac     7575   ++++     3.641.51   1.411.11   3.393.71   2.831.12   1918   0.210.39 47％61％
h76AON2     auaggcugacugcugucgg     76   +     3.23   1.47   4.30   1.58   18   0.32 58％
h77AON1h77AON2     uuguguccuggggaggaugcuccaucaccuccucu     7777   ++++     4.262.43   3.500.32   3.57-0.21   -0.181.65   1718   0.470.38 59％56％
h78AON1h78AON2     gcuuuccagggguauuuccauuggcuuuccagggg     7878   ++++     1.811.81   4.042.95   3.323.32   0.620.27   1817   0.780.71 50％59％
++在正常对照肌管培养物的超过25％的转录本中检测出外显子跳跃；+在达到25％的转录本中检测出外显子跳跃；-未检测出外显子跳跃
2对于每一种SR蛋白质给出每一种AON的最高值
3在预测的RNA二级结构中被AON所靶向的经过该AON总体长度的有效核苷酸部分
4AON靶向在缺失Kobe中被删除的部分ESE(Matsuo et al 963-7；Matsuoet al.2127-31)
表3目前可以通过AON诱导的单外显子跳跃修复其阅读框的突变类型总览
外显子跳跃1                           适用于 占所有DMD突变的百分比
 缺失  重复  点突变
  28171929404142434445464849505152535455565859606162637172737475767778  3-7；3-7；4-7；5-7；6-718；18-20；18-25；18-27；18-33；18-41；18-4420；20-27；20-2944；44-47；44-48；44-49；44-51；3-43；5-43；6-43；10-43；13-43；14-43；17-43；28-43；30-43；35-43；36-43；38-43；40-43；42-43；43；45；45-54；45-6844；46；46-47；46-48；46-49；46-51；46-53；46-55；46-6021-45；43-45；46；47-54；47-5651；51-53；51-55；51-5713-50；29-50；43-50；45-50；47-50；48-50；49-50；50；52；52-6351；53；53-55；53-59；53-6010-52；43-52；45-52；47-52；48-52；49-52；50-52；5244-53；46-53；5545-54；47-54；48-54；49-54；52-54；54；5646-55；55；57；57-6051-576574  28；8-92174344454850515253545661 29404142484960727477 1.4％1.9％0.6％0.1％0.2％0.1％0 3％0.1％2.9％5.8％7.4％4.3％0.5％0.1％4.1％9.7％3.9％6.0％0.6％1.6％0.4％0.04％0％0.2％0.04％0％0％0％0.04％0％0.4％0.04％0％0.04％0％
1只列出已经显示为可被跳跃的外显子
2靶向外显子8的AON还诱导框内外显子9的跳跃，意味着这些AON也可以被应用于修复具有外显子8-9复制的患者的cDNA。
参考文献
1.Hoffman，E.P.，Brown，R.H.，Jr.，Kunkel，L.M.(1987)Dystrophin：the protein product of the Duchenne muscular dystrophylocus.Cell，51，919-928.
2.Hoffman，E.P.，Fischbeck，K.H.，Brown，R.H.，Johnson，M.，Medori，R.，Loike，J.D.，Harris，J.B.，Waterston，R.，Brooke，M.，Specht，L.，et al.(1988)Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne′s or Becker′s musculardystrophy.N.Engl.J.Med.，318，1363-1368.
3.Den Dunnen，J.T.，Grootscholten，P.M.，Bakker，E.，Blonden，L.A.，Ginjaar，H.B.，Wapenaar，M.C，van Paassen，H.M.，vanBroeckhoven，C，Pearson，P.L.，van Ommen，G.J.(1989)Topographyof the Duchenne muscular dystrophy(DMD)gene：FIGE and cDNAanalysis of 194 cases reveals 115 deletions and 13 duplications.Am.J.Hum.Genet.，45，835-847.
4.Koenig，M.，Beggs，A.H.，Moyer，M.，Scherpf，S.，Heindrich，K.，Bettecken，T.，Meng，G.，Muller，C.R.，Lindlof，M.，Kaariainen，H.，et al，(1989)The molecular basis for Duchenne versus Becker musoulardystrophy：correlation of severity with type of deletion.Am.J.Hum.Genet.，45，498-506.
5.Tuffery-Giraud，S.，Chambert，S.，Demaille，J.，Claustres，M.(1999)Point mutations in the dystrophin gene：evidence for frequentuse of cryptic splice sites as a result of splicing defects，Hum.Mutat.，14，359-368.
6.Prior，T.W.，Bartolo，C，Pearl，D.K.，Papp，A.C，Snyder，P.J.，Sedra，M.S.，Burghes，A.H.，Mendell，J.R.(1995)Spectrum of smallmutations in the dystrophin coding region.Am.J.Hum.Genet.，57，22-33.
7.Moser，H.(1984)Duchenne muscular dystrophy：pathogeneticaspects and genetic prevention.Hum.Genet.，66，17-40.
8.Emery，A.E.(2002)The muscular dystrophies.Lancet，359，687-695.
9.Yoshida，M.，Ozawa，E.(1990)Glycoprotein complexanchoring dystrophin to sarcolemma.J.Biochem.(Tokyo)，108，748-752.
10.Ervasti，J.M.，Campbell，K.P.(1991)Membrane organizationof the dystrophin-glycoprotein complex.Cell，66，1121-1131.
11.Di Blasi，C，Morandi，L.，Barresi，R.，Blasevich，F.，Cornelio，F.，Mora，M.(1996)Dystrophin-associated protein abnormalities indystrophin-deficient muscle fibers from symptomatic and asymptomaticDuchenne/Becker muscular dystrophy carriers.Acta Neuropathol.(Berl)，92，369-377.
12.Ervasti，J.M.，Ohlendieck，K.，Kahl，S.D.，Gaver，M.G.，Campbell，K.P.(1990)Deficiency of a glycoprotein component of thedystrophin complex in dystrophic musele.Nature，345，315-319.
13.Matsumura，K.，Burghes，A.H.，Mora，M.，Tone，F.M.，Morandi，L.，Cornelio，F.，Leturcq，F.，Jeanpierre，M.，Kaplan，J.C，Reinert，P.，et al.(1994)Immunohistochemical analysis ofdystrophin-associated proteins in Becker/Duchenne muscular dystrophywith huge in-frame deletions in the NH2-terminal and rod domains ofdystrophin.J.Clin.Invest.，93，99-105.
14.Monaco，A.P.，Bertelson，C.J.，Liechti-Gallati，S.，Moser，H.，Kunkel，L.M.(1988)An explanation for the phenotypic differencesbetween patients bearing partial deletions of the DMD locus.Genomics，2，90-95.
15.Clemens，P.R.，Duncan，F.J.(2001)Progress in gene therapyfor Duchenne muscular dystrophy.Curr.Neurol.Neurosci.Rep.，1，89-96.
16.Khan，M.A.(1993)Corticosteroid therapy in Duchennemuscular dystrophy.J.Neurol.ScL，120，8-14.
17.De Angelis，F.G.，Sthan dier，O.，Berarducci，B.，Toso，S.，Galluzzi，G.，Ricci，E.，Cossu，G.，Bozzoni，I.(2002)Chimeric snRNAmolecules carrying antisense sequences against the splice junctions ofexon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping andrestoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，9456-9461.
18.Mann，C.J.，Honeyman，K，Cheng，A.J.，Ly，T.，Lloyd，F.，Fletcher，S.，Morgan，J.E.，Partridge，T.A.，Wilton，S.D.(2001)Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in themdx mouse.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，42-47.
IfV 1/！ML OJUO/UUU^US 35
19.van Deutekom，J.C，Bremmer-Bout，M.，Janson，A.A.，Ginjaar，I.B.，Baas，F.，den Dunnen，J.T.，van Ommen，G.J.(2001)Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression inDMD patient derived muscle cells.Hum.MoI.Genet.，10，1547-1554.
20.Wilton，S.D.，Lloyd，F.，Carville，K.，Fletcher，S.，Honeyman，K，Agrawal，S.，KoIe，R.(1999)Specific removal of the nonsensemutation from the mdx dystrophin mRNA using antisenseoligonucleotides.Neuromuscul.Disord.，9，330-338.
21.Dunckley，M.G.，Manoharan，M.，Villiet，P.，Eperon，I.C，Dickson，G.(1998)Modification of splicing in the dystrophin gene incultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides.Hum.MoI.Genet.，7，1083-1090.
22.Takeshima，Y.，Wada，H.，Yagi，M.，Ishikawa，Y.，Minami，R.，Nakamura，H.，MatSuo，M.(2001)Oligonucleotides against a splicingenhancer sequence led to dystrophin production in muscle cells from aDuchenne muscular dystrophy patient.Brain Dev.，23，788-790.
23.Aartsma-Rus，A.，Bremmer-Bout，M.，Janson，A.，den Dunnen，J.，van Ommen，G.，van Deutekom，J.(2002)Targeted exon skipping asa potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy.Neuromuscul.Disord.，12，S71.
24.Aartsma-Rus，A.et al.″Targeted exon skipping as a potentialgene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy.″Neuromuscul Disord 12.Suppl(2002)：S71-S77.
25.Aartsma-Rus，A.et al.″Therapeutic antisense-induced exonskipping in cultured muscle cells from six different DMD patients.″Hum MoI Genet 12.8(2003)：907-14.
26.Aartsma-Rus，A.et al.″Antisense-induced multiexon skippingfor duchenne muscular dystrophy makes more sense.″Am J Hum Genet74.1(2004)：83-92.
27.Braasch，D.A.&Corey，D.R.Novel antisense and peptidenucleic acid strategies for controlling gene expression.Biochemistry 41，4503-10.(2002).
28.Cartegni，L.，S.L.Chew，and A.R.Krainer.″Listening tosilence and understanding nonsense：exonic mutations that affectsplicing.″Nat Rev Genet 3.4(2002)：285-98.
29.Cartegni，L.et al.″ESEfinder：A web resource to identifyexonic splicing enhancers.″Nucleic Acids Res 31.13(2003)：3568-71.
30.De Angelas，F.G.et al.″Chimeric snRNA molecules carryingantisense sequences against the splice junctions of exon 51 of thedystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of adystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells.″Proc Natl Acad Sci USA 99.14 (2002)：9456-61.
31. Dunckley，M.G.et al.″Modification of splicing in thedystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisenseoligoribonucleotides.″Hum MoI Genet 7.7(1998)：1083-90.
32.Elayadi，A.N.&Corey，D.R.Application of PNA and LNAoligomers to chemotherapy.Curr Opin Investig Drugs 2，558-61.(2001).
33.Ginjaar，I.B.et al.″Dystrophin nonsense mutation inducesdifferent levels of exon 29 skipping and leads to variable phenotypeswithin one BMD family[In Process Citation].″Eur J Hum Genet 8.10(2000)：793-6.
34.Goyenvalle，A.et al.″Rescue of dystrophic muscle through U7snRNA-mediated exon skipping.″Science 306.5702(2004)：1796-99.
35.Hothorn，T and Hornik，K.Exact Distributions for Rank andPermutation Tests.[0.8-9].19-10-2004.
36.Larsen，H.J.，Bentin，T.&Nielsen，P.E.Antisense propertiesof peptide nucleic acid.Biochim Biophys Acta 1489，159-66.(1999).
37.Lu，Q.L.et al.″Functional amounts of dystrophin produeed byskipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.″Nat Med 6(2003)：6.
38.Lu，Q.L.et al.″Systemic delivery of antisenseoligoribonucleoti.de restores dystrophin expression in body-wideskeletal muscles.″Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102.1(2005)：198-203.
39.Mann，C.J.et al.″Antisense-induced exon skipping andsynthesis of dystrophin in the mdx mouse.″Proc Natl Acad Sci USA98.1(2001)：42-7.
40.Mann，C.J.et al.″Improved antisense oligonucleotide inducedexon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy.″J GeneMed 4.6(2002)：644-54.
41.Mathews，D.H.et al.″Expanded sequence dependence ofthermodynamic parameters  improves prediction of RNA secondarystructure.″J MoI Biol 288.5(1999)：911-40.
42.Monaco，A.P.et al.″An explanation for the phenotypicdifferences between patients bearing partial deletions of the DMDlocus.″Genomics 2.1
(1988)：90-5.
43.R Development Core Team.R：A language and environmentfor statistical computing.[2.0.1].2005
44.Smisterova，J.，Wagenaar，A.，Stuart，M.C.A.，Polushkin，E.，ten Brinke，G.，Hulst，R.，Engberts，J.B.F.N.，Hoekstra，D.，′Molecularshape of the
Cationic Lipid Controls the Structure of the Cationic Lipid/Dioleylphosphatidylethanolamine-DNA Complexes and the Efficienicyof Gene Delivery′，J.Biol.Chem.2001，276，47615
45.Summerton，J.&Weller，D.Morpholino antisense oligomers：design，preparation，and properties.Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7，187-95(1997)
46.Takeshima，Y.et al.″Modulation of in vitro splicing of theupstream intron by modifying an intra-exon sequence which is deletedfrom the dystrophin gene in dystrophin Kobe.″J Clin Invest 95.2(1995)：515-20.
47.Takeshima，Y.et al. ″Oligonucleotides against a splicingenhancer sequence led to dystrophin production in muscle cells from aDuchenne muscular dystrophy patient.″Brain Dev 23.8(2001)：788-90.
48.van Deutekom，J.C.et al.″Antisense-induced exon skippingrestores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells.″Hum Mol Genet 10.15(2001)：1547-54.
49.Wahlestedt，C.et al.Potent and non-toxic antisenseoligonucleotides containing locked nucleic acids.Proc Natl Acad Sci USA 97，5633-8.(2000).
50.Wilton，S.D.et al.″Specific removal of the nonsense mutationfrom the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides.″Neuromuscul Disord 9.5(1999)：330-8.
51.WO2004/083432

Claims (24)

1.一种用于产生寡核苷酸的方法，包括确定外显子RNA中对于SR(丝氨酸-精氨酸)蛋白的(假定)结合位点，以及产生互补于所述RNA并至少部分重叠所述(假定)结合位点的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，还包含由所述RNA的二级结构确定与所述RNA(闭合结构)的其它部分杂交的区域以及在所述结构(打开结构)中不能杂交的区域，并且随后产生至少部分重叠所述(假定)结合位点并且重叠至少部分所述的闭合结构和重叠至少部分所述的打开结构的寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述打开和闭合结构是彼此接近的。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸互补于所述RNA的14到50个核苷酸之间的连续部分。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含RNA。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸为2’-O-甲基RNA并且具有全长的硫代磷酸酯主链。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中包含所述外显子的前mRNA在受试者中表现出所不希望的剪接。
8.根据权利要求7所述的方法，其中由所述前mRNA产生的mRNA的所述外显子缺失产生一用于蛋白质的编码区域。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中包含被转录的所述外显子的所述RNA的基因，编码异常的杜氏型肌营养不良症基因(DMD)、胶原蛋白VIα1基因(COL6A1)、肌管性病变1基因(MTM1)、dysferlin基因(DYSF)、层粘连蛋白-α2基因(LAMA2)、埃-德肌营养不良症基因(EMD)和/或钙蛋白酶3基因(CAPN3)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述基因为杜氏型肌营养不良症基因。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述SR蛋白为SF2/ASF或者SC35或者SRp40。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述外显子包含外显子8、46、48、52、54至56、58、60至63或者71至78。
13.一种根据权利要求1到12中任一项所述的方法可获得的寡核苷酸或其等同物。
14.一种包含表2所示序列的寡核苷酸或其等同物。
15.根据权利要求13或14所述的寡核苷酸或其等同物用于至少部分改变前mRNA中的外显子的识别的应用。
16.根据权利要求13或14所述的寡核苷酸或其等同物用于制备药物的应用。
17.一种包含根据权利要求13或14所述的寡核苷酸或其等同物的药物制剂。
18.根据权利要求13或14所述的寡核苷酸或其等同物在制备用于治疗遗传性疾病的药物中的应用。
19.根据权利要求13或14所述的寡核苷酸或其等同物用于诱导前mRNA中的外显子跳跃中的应用。
20.根据权利要求13或14所述的寡核苷酸或其等同物用于改变前mRNA中的外显子识别的应用。
21.一种用于改变通过剪接机制来识别前mRNA中的外显子的效率的方法，其中所述由基因编码的所述前mRNA包含至少两个外显子和至少一个内含子，所述方法包含提供包含所述剪接机制和所述基因以及根据权利要求13或14所述的第一寡核苷酸或其等同物的转录系统，其中所述第一寡核苷酸或其等同物能够与所述外显子中的至少一个进行杂交并且允许在所述转录系统中发生转录和剪接。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述基因包含至少3个外显子。
23.根据权利要求21或22所述的方法，进一步包含为所述转录系统提供至少一种根据权利要求13或14的第二寡核苷酸或其等同物，其中所述第二寡核苷酸或其等同物能够与至少另一个所述外显子杂交。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或其等同物和所述第二寡核苷酸或其等同物相互自然连接。
CNA2006800188724A 2005-04-22 2006-04-21 通过干扰SR蛋白的结合以及干扰RNA二级结构调节前mRNA中的外显子识别 Pending CN101184841A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05075968.7 2005-04-22
EP05075968 2005-04-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101184841A true CN101184841A (zh) 2008-05-21

Family

ID=34938210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800188724A Pending CN101184841A (zh) 2005-04-22 2006-04-21 通过干扰SR蛋白的结合以及干扰RNA二级结构调节前mRNA中的外显子识别

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20090312532A1 (zh)
EP (1) EP1877555A2 (zh)
JP (1) JP2008538500A (zh)
KR (1) KR20080031164A (zh)
CN (1) CN101184841A (zh)
AU (1) AU2006237727B2 (zh)
CA (1) CA2605512A1 (zh)
NZ (1) NZ563206A (zh)
WO (1) WO2006112705A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102747083A (zh) * 2012-07-03 2012-10-24 首都医科大学附属北京儿童医院 剪切因子癌蛋白sf2/asf在制备白血病治疗药物中的应用
CN104975044A (zh) * 2015-05-22 2015-10-14 浙江大学 一种靶向srsf6的慢病毒干扰载体的构建及其在结直肠癌治疗中的应用
CN110055243A (zh) * 2011-12-28 2019-07-26 日本新药株式会社 反义核酸

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3228711A1 (en) * 2004-06-28 2017-10-11 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
AU2006213686A1 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Avi Bio Pharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
WO2008018795A1 (en) 2006-08-11 2008-02-14 Prosensa Technologies B.V. Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders
PT2203173E (pt) 2007-10-26 2016-03-15 Academisch Ziekenhuis Leiden Resumo
USRE48468E1 (en) 2007-10-26 2021-03-16 Biomarin Technologies B.V. Means and methods for counteracting muscle disorders
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
CN105779453A (zh) 2008-10-24 2016-07-20 萨雷普塔治疗公司 用于dmd的多外显子跳跃组合物
SI2607484T1 (sl) * 2008-10-27 2016-11-30 Biomarin Technologies B.V. Metode in sredstva za učinkovito preskakovanje eksona 45 v pre-mRNA Duchennove mišične distrofije
CN102459595A (zh) 2009-04-24 2012-05-16 普罗森那技术公司 用于治疗dmd的包含肌苷的寡核苷酸
US8586560B2 (en) 2009-10-16 2013-11-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Exon skipping therapy for dysferlinopathies
US20120270930A1 (en) 2009-10-29 2012-10-25 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Methods and compositions for dysferlin exon-skipping
JP5963678B2 (ja) 2009-11-12 2016-08-03 ジ ユニバーシティ オブ ウェスタン オーストラリア 病状を治療するためのアンチセンス分子及び方法
JP6141018B2 (ja) 2009-12-24 2017-06-07 バイオマリン テクノロジーズ ベー．フェー． 炎症性障害を治療するための分子
IT1400425B1 (it) * 2010-06-08 2013-05-31 Amsterdam Molecular Therapeutics Bv Modified snrnas for use in therapy.
FR2962041B1 (fr) * 2010-07-01 2012-07-27 Genethon Inhibiteurs de la calpaine 3 pour le traitement de dystrophies musculaires et de cardiomyopathies
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
CA2831827A1 (en) 2011-04-05 2012-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Compounds and methods for altering activin receptor-like kinase signalling
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
CA3120918A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Biomarin Technologies B.V. Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy
BR112014033004B1 (pt) * 2012-07-03 2021-10-19 Biomarin Technologies B.V. Oligonucleotídeo para tratamento de pacientes com distrofia muscular
JP6449231B2 (ja) 2013-03-14 2019-01-09 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィを処置するためのエキソンスキッピング組成物
MX2015013117A (es) 2013-03-15 2016-07-14 Sarepta Therapeutics Inc Composiciones mejoradas para tratar distrofia muscular.
TR201901939T4 (tr) * 2014-03-12 2019-03-21 Nat Center Neurology & Psychiatry Antisens nükleik asit.
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
MA45819A (fr) 2015-10-09 2018-08-15 Sarepta Therapeutics Inc Compositions et méthodes pour traiter la dystrophie musculaire de duchenne et troubles associés
KR20180056766A (ko) 2015-10-09 2018-05-29 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법
CN109311919A (zh) 2016-06-30 2019-02-05 萨勒普塔医疗公司 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体
IL301091A (en) 2016-07-05 2023-05-01 Biomarin Tech Bv Oligonucleotides containing a bicyclic skeleton and their use for the treatment of genetic diseases
DK3554552T3 (da) 2016-12-19 2022-10-24 Sarepta Therapeutics Inc Exon-skipping-oligomerkonjugater mod muskeldystrofi
DK4122497T3 (da) 2016-12-19 2024-06-10 Sarepta Therapeutics Inc Exonskipping-oligomerkonjugater til muskeldystrofi
CN110290812B (zh) 2016-12-19 2023-06-02 萨勒普塔医疗公司 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物
GB201711809D0 (en) * 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
EA201991450A1 (ru) 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
US10758629B2 (en) 2018-05-29 2020-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EP3959319A4 (en) * 2019-04-25 2023-06-07 Avidity Biosciences, Inc. NUCLEIC ACID COMPOSITIONS AND MULTI-EXON SKIPPING METHODS
EP4337264A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating tissue distribution of intracellular therapeutics
EP4359006A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Entrada Therapeutics, Inc. Antisense compounds and methods for targeting cug repeats

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5766847A (en) * 1988-10-11 1998-06-16 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions
US5608046A (en) * 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
FR2675803B1 (fr) * 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
CA2082411A1 (en) * 1991-06-28 1992-12-29 Robert D. Rosenberg Localized oligonucleotide therapy
US6200747B1 (en) * 1992-01-28 2001-03-13 North Shore University Hospital Research Corp. Method and kits for detection of fragile X specific, GC-rich DNA sequences
US5869252A (en) * 1992-03-31 1999-02-09 Abbott Laboratories Method of multiplex ligase chain reaction
US5418139A (en) * 1993-02-10 1995-05-23 University Of Iowa Research Foundation Method for screening for cardiomyopathy
US5741645A (en) * 1993-06-29 1998-04-21 Regents Of The University Of Minnesota Gene sequence for spinocerebellar ataxia type 1 and method for diagnosis
US5627263A (en) * 1993-11-24 1997-05-06 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5962332A (en) * 1994-03-17 1999-10-05 University Of Massachusetts Detection of trinucleotide repeats by in situ hybridization
US5968909A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6300060B1 (en) * 1995-11-09 2001-10-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for predicting the risk of prostate cancer morbidity and mortality
JP3950480B2 (ja) * 1996-07-18 2007-08-01 株式会社エスアールエル 脊髄小脳変性症２型の原因遺伝子の検出方法及びそのためのプライマー
US5853995A (en) * 1997-01-07 1998-12-29 Research Development Foundation Large scale genotyping of diseases and a diagnostic test for spinocerebellar ataxia type 6
US6329501B1 (en) * 1997-05-29 2001-12-11 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to muscle
US6280938B1 (en) * 1997-08-19 2001-08-28 Regents Of The University Of Minnesota SCA7 gene and method of use
US6130207A (en) * 1997-11-05 2000-10-10 South Alabama Medical Science Foundation Cell-specific molecule and method for importing DNA into a nucleus
JP3012923B2 (ja) * 1998-01-26 2000-02-28 新潟大学長 Ｃａｇリピート病の治療薬
KR100280219B1 (ko) * 1998-02-26 2001-04-02 이수빈 삼핵산 반복 서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 시약
US6322978B1 (en) * 1998-04-20 2001-11-27 Joslin Diabetes Center, Inc. Repeat polymorphism in the frataxin gene and uses therefore
US6172216B1 (en) * 1998-10-07 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL-X expression
US6399575B1 (en) * 1998-11-10 2002-06-04 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to the central nervous system
US6133031A (en) * 1999-08-19 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of focal adhesion kinase expression
US20040226056A1 (en) * 1998-12-22 2004-11-11 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
US20020049173A1 (en) * 1999-03-26 2002-04-25 Bennett C. Frank Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
JP2000325085A (ja) * 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
WO2000078813A2 (en) * 1999-06-18 2000-12-28 Emory University Huntington disease cellular model: stably transfected pc12 cells expressing mutant huntingtin
US6653467B1 (en) * 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
WO2001085751A1 (en) * 2000-05-09 2001-11-15 Reliable Biopharmaceutical, Inc. Polymeric compounds useful as prodrugs
US6727355B2 (en) * 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
WO2005003350A2 (en) * 2003-06-27 2005-01-13 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF ALZHEIMER’S DISEASE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP1191097A1 (en) * 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
AU2002236499A8 (en) * 2000-11-30 2009-12-03 Uab Research Foundation Receptor-mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor
JP4777777B2 (ja) * 2002-11-25 2011-09-21 雅文 松尾 ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬
AU2003225410A1 (en) * 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
WO2009134418A2 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Fox Chase Cancer Center Assay for identifying agents that modulate epigenetic silencing, and agents identified thereby

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110055243A (zh) * 2011-12-28 2019-07-26 日本新药株式会社 反义核酸
CN110055243B (zh) * 2011-12-28 2024-03-26 日本新药株式会社 反义核酸
CN102747083A (zh) * 2012-07-03 2012-10-24 首都医科大学附属北京儿童医院 剪切因子癌蛋白sf2/asf在制备白血病治疗药物中的应用
CN104975044A (zh) * 2015-05-22 2015-10-14 浙江大学 一种靶向srsf6的慢病毒干扰载体的构建及其在结直肠癌治疗中的应用
CN104975044B (zh) * 2015-05-22 2018-12-21 浙江大学 一种靶向srsf6的慢病毒干扰载体的构建及其在结直肠癌治疗中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2006237727B2 (en) 2012-06-28
KR20080031164A (ko) 2008-04-08
US20090312532A1 (en) 2009-12-17
EP1877555A2 (en) 2008-01-16
JP2008538500A (ja) 2008-10-30
CA2605512A1 (en) 2006-10-26
WO2006112705A2 (en) 2006-10-26
AU2006237727A1 (en) 2006-10-26
NZ563206A (en) 2009-09-25
WO2006112705A3 (en) 2006-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101184841A (zh) 通过干扰SR蛋白的结合以及干扰RNA二级结构调节前mRNA中的外显子识别
US10544416B2 (en) Modulation of exon recognition in pre-mRNA by interfering with the secondary RNA structure
RU2683772C2 (ru) Композиции и способы модуляции smn2 сплайсинга у субъекта
Aartsma-Rus et al. Functional analysis of 114 exon-internal AONs for targeted DMD exon skipping: indication for steric hindrance of SR protein binding sites
Mcclorey et al. Induced dystrophin exon skipping in human muscle explants
AU2006336624B2 (en) Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA
EP2569431B1 (en) Methods for identifying compounds which modulate interleukins 17 and 23 signaling activity
EP2547768B1 (en) Modified u7 snrnas for treatment of neuromuscular diseases
AU2014306416A9 (en) Compositions and methods for modulating RNA
McClorey et al. Splicing intervention for Duchenne muscular dystrophy
KR20150133751A (ko) 근육 이영양증의 치료를 위한 엑손 스키핑 조성물
WO2009144481A2 (en) Conjugates for delivery of biologically active compounds
CA2735167A1 (en) Composition of asymmetric rna duplex as microrna mimetic or inhibitor
JP2016531570A (ja) ユークロマチン領域を標的とするオリゴヌクレオチド
JP2010537640A5 (zh)
EP3687547A1 (en) Combination therapies for treating muscular dystrophy
WO2019067981A1 (en) POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
EP3687519A1 (en) Combination therapies for treating muscular dystrophy
Bizot et al. Current status of antisense oligonucleotide-based therapy in neuromuscular disorders
Weng et al. Improvement of muscular atrophy by AAV–SaCas9-mediated myostatin gene editing in aged mice
Wilton et al. Splice modification to restore functional dystrophin synthesis in Duchenne muscular dystrophy
CA2796440C (en) Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1119203

Country of ref document: HK

AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20080521

C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1119203

Country of ref document: HK