JP4283342B2 - レチノイド代謝蛋白質 - Google Patents

Description

本出願は、1996年10月１日に提出された米国特許出願第08/724,466号および1996年６月21日に提出された米国特許出願第08/667,546号からの優先権を主張するものであり、その明細書は本明細書に参照として組み入れられる。
発明の背景
ビタミンA代謝により、レチノイン酸（RA）の活性型がいくつか生成されるが、これらは、発生、再生の際の遺伝子発現の制御、および上皮組織［メイデン（Maden）、1992；シャンボン（Chambon）、1995；マンゲルスドルフ（Mangelsdorf）、1995；グダス（Gudas）、1994；ロタン（Lotan）、1995；モリス・ケイ（Morriss-Kay）、1996］の増殖および分化に関与し；多くの細胞タイプにおけるアポトーシスまたはプログラムされた細胞死に関連し；ならびに抗癌および抗腫瘍特性［ロタン（Lotan）、1996］を有する。
レチノール欠損症に関する初期の研究から、ビタミンA枯渇と、癌の高発生率および化学発癌に対する易罹患性の増加との間に相関があることが示された［カイチル（Chytil）、1984］。いくつかの動物モデルを用いて、皮膚、乳房上皮、口腔、気管消化管（aerodigestive tract）、肝臓、膀胱、および前立腺を含む様々な組織の発癌抑制におけるレチノイドの有効性が示されている［ムーン（Moon）、1994］。これらの研究から、二次的な頭頸部腫瘍および肺の非小細胞癌再発、ならびに基底細胞癌の予防と共に、紫外線角化症および口腔白板症を含む前悪性段階の病変の治療にレチノイドが予防的に用いられるようになった［ホン（Hong）、1994；リップマン（Lippman）、1995］。RAそのものは、前悪性段階の紫外線角化症、ざ瘡、乾癬、および魚鱗癬のような皮膚疾患の治療と共に、特に急性前骨髄性白血病（APL）、頭頸部腫瘍、および皮膚癌を含む癌の治療において、治療的に有用であることがわかっている。抗腫瘍剤としてのRAの有効性は、少なくとも部分的に細胞分化および／または増殖阻害の誘導によるという証拠がある［ロタン（Lotan）、1996］。過去数年間の研究により、急性前骨髄性白血病（APL）患者が、全トランス型RAによる短期間の治療後に高い割合で完全寛解を得ることが示されている。残念なことに、この高い寛解率はほとんどの場合短期間である。再発後、患者はRAによるさらなる治療に臨床的に耐性となる［ワレル（Warrell）、1994；ワレルら（Warrell）、1994；チヨミエン（Chomienne）、1996；ムインジ（Muindi）、1992］。この耐性の本質は不明である。興味深いことに、RAに対して臨床的耐性を示す患者から採取した白血病細胞は、インビトロで増殖させると、RAの分化誘導作用に対して感受性であることが示された［ムインジ（Muindi）、1992；ムインジ（Muindi）、1994］。このことは、RAに対する耐性獲得の原因は薬物動態メカニズムである可能性があることを示唆している。この可能性は、初回投与後の患者では、再発後に治療した患者よりRAの最高血漿濃度がはるかに高いことを示す試験によって支持されている。RAの最高血漿濃度の減少は、尿中の4-オキソ-レチノイン酸濃度の10倍増加を伴った。さらに、チトクロームP450機能の広域スペクトル阻害剤であるケトコナゾールは、インビボでRAの薬物動態を制御することが示された［ムインジ（Muindi）、1992；ムインジ（Muindi）、1994］。したがって、RAが自身の代謝速度を増加させ、その結果RAの治療的有効量を維持することができなくなった可能性がある。RAを治療的に投与すると、様々な望ましからぬ副作用が起こり得るため、治療におけるRAの最小必要量を確立および維持することが重要である。例えば、妊娠中のRA治療により、胎児に重度の催奇形作用を生じることがあり得る。RA治療の副作用には、頭痛、悪心、ケライティス（Chelitis）、顔の皮膚炎、結膜炎および鼻粘膜の乾燥も含まれる。RAを継続的に投与すると、トリグリセリド血清濃度が大きく上昇することがあり、肝腫、肝硬変および門脈高血圧症を含む肝機能の重度異常を引き起こしうる。
また、RA代謝により、RA治療に対して特定の腫瘍が反応しないことの説明がつく。例えば、最近の研究により、RA代謝を阻害してその結果RAの組織濃度を増加させるチトクロームP450阻害剤が、前立腺癌の治療において有用な治療剤である可能性があることが示された［ウーターズ（Wouters）、1992；デコスター（De Coster）、1996］。このように、RA代謝性チトクロームP450は多くの異なるタイプの癌の治療に対する有用な標的となる可能性がある。
ビタミンA代謝の古典的な考え方は、最も活性の強い代謝物である全トランス型RAが２つの酸化段階を経てレチノールからレチンアルデヒドおよびRAへの変換に由来すること、およびRAは極性誘導体4-ヒドロキシRAおよび4-オキソRAへとさらに代謝されることを支持している［ブラナー（Blaner）、1994；ナポリ（Napoli）、1995；フォルメリ（Formelli）、1996；ナポリ（Napoli）、1996］。4-オキソおよび4-ヒドロキシ代謝物がRA異化経路の単なる中間物に過ぎないのか、またはそれらが全トランス型RAおよび9-シスRAの活性とは異なる特殊な活性を有することができるか否かはわかっていない。ピナッペルら［Pijnappel、1993］は、アフリカツメガエルにおいて、4-オキソRAが初期胚における位置の特定化を効率よく制御することができ、全トランス型RAより強力な、Hoxb-9およびHoxb-4遺伝子発現の制御能を示すことを示した。4-オキソ-RAは、レチノイン酸受容体-β（RAR-β）に対して全トランス型RAと同等の親和性で結合する［ピナッペル（Pijnappel）、1993］が、RAR-γには結合しない［レディ（Reddy）、1992］ことが判明し、この代謝物が何らかの受容体選択性を示すことが示唆される。4-オキソ-RAはまた、細胞性レチノイン酸結合蛋白質（CRABP）に結合するが、親和性は全トランス型RAよりわずかに低い［フィオレラ（Fiorella）、1993］。タカツカら［Takatsuka、1996］は、RAの増殖阻害作用がRA代謝活性と相関することを示したが、RA代謝物の生成と増殖阻害との間に因果関係が認められるか否かは不明である。発生中の胚にこれらの代謝物が非対称に分布することは、それらが組織特異的イソメラーゼによって選択的に分解または生成される可能性があることを示唆している［クリーク・クラフト（Creech Kraft）、1994］。これらの代謝物の正常なバランスは、代謝前駆体であるレチノールおよびレチンアルデヒドの生成速度［レオ（Leo）、1989］および異化速度に左右される。現在のところ、この代謝スキーム、特にRAの異化に関与する酵素についてはほとんどわかっていない。
RAの異化は、RAのβイオノン環のC4-またはC18-位のいずれかでのヒドロキシル化によって始まると考えられる［ナポリ（Napoli）、1996］。C4-ヒドロキシル化段階は、ケトコナゾールおよびリアラゾールのような広域スペクトルP450阻害剤の4-ヒドロキシル化阻害能力によって判断すると、チトクロームP450活性によって媒介される［ウィリアム（William）、1987、バンオーウェ（Van Wauwe）、1988；バンオーウェ（Van Wauwe）、1990、バンオーウェ（Van Wauwe）、1992、ウーターズ（Wouters）、1992］。精巣、皮膚および肺を含む特定の組織ならびにNIH 3T3繊維芽細胞、HL-60骨髄単球性白血病細胞、F9およびP19マウス胎児性癌細胞系ならびにMCF7のような多くの細胞系では、RA代謝は、RA前処置によって誘導することができる［フロリク（Frolik）、1979、ロバーツ（Roberts）、1979aおよびb；デュエル（Duell）、1992；ウーターズ（Wouters）、1992］。F9細胞におけるRAR遺伝子の標的破壊に関する研究により、RAR-αおよびRAR-γイソ型は、この代謝増加の原因となる酵素の制御に重要な役割を果たす可能性があることが示唆されている［ボイラン（Boylan）、1995］。
RAのグルクロン酸抱合は、RAの不活化における重要な代謝段階である［ブラナー（Blaner）、1994；フォルメリ（Fomelli）、1996］。RAの消失には、4-オキソへの酸化が必要であり、その後抱合を受けて4-オキソ全トランス型RAグルクロニドを形成する可能性がある。これは、4-オキソRAグルクロニドが尿中に認められる唯一のレチノイド抱合物であることを示す、霊長類およびヒトの双方における試験によって支持されている［ムインジ（Muindi）、1992；ムインジ（Muindi）、1994］。RA療法後、4-オキソRAが血清中に存在しない、またはほとんど検出されないという事実は、酸化がこの過程における律速段階であることを示唆している。
最近、4-オキソレチノール（4-オキソ-ROL）がレチノールより強い生物活性を有することが示された。4-オキソ-ROLは、F9およびP19マウス奇形癌細胞においてRAによって誘導可能である［ブルンバーグら（Blumberg）、1995；アッカーら（Achkar）、1996］。
ゼブラダニオのひれは、初期脊椎発生に関与する多くの遺伝子制御経路を使用するRA感受性プロセスを通じて再生されることが知られている［ホワイト（White）、1994；アキメンコ（Akimenko）、1995a＆b］。
本発明者らの知る限り、肝臓外組織におけるRAの代謝に関係するチトクロームP450は、分子レベルでの特徴付けがまだなされていない。
発明の概要
本発明者らは、ヒトにおいてRA誘導可能なcDNAを含む、レチノイン酸誘導可能なレチノイン酸代謝蛋白質をコードする遺伝子を初めて同定、クローニングおよびシークエンシングする。この蛋白質は上皮において発現されることが判明した。
cDNAはゼブラダニオから単離してシークエンシングした。このcDNAによってコードされる蛋白質を発現させると、この蛋白質はレチノイン酸のβ-イオノン環の４位でレチノイン酸をヒドロキシル化する能力を有することが示された。この蛋白質はレチノイン酸に暴露した上皮細胞において誘導可能であることが判明した。
同様の機能を有する蛋白質をコードするヒトcDNAもまた単離してシークエンシングした。
cDNAはまた、マウスからも単離してシークエンシングした。
３つの種から得た配列間の相同性は、それらが蛋白質をコードする核酸であれ、蛋白質のアミノ酸配列であれ、比較的高いことが判明し、３つの蛋白質は全て、チトクロームP450として知られる蛋白質のグループの特徴であるヘム結合モチーフを含む。これらの新たに得られた蛋白質のアミノ酸配列と既知のチトクロームP450との全体的な相同性は30％未満である。この全体的な相同性が比較的低いにもかかわらず、特定のその他のP450のヘム結合領域において高度の相同性が認められた。例えば、ゼブラダニオの新規蛋白質のそれぞれのヘム結合領域を規定するアミノ酸約20個とCYP4503A12との相同性は約50％で、ゼブラダニオの新規蛋白質とhCYTFAOHとの相同性は65％である。本発明の蛋白質のヘム結合領域と別のP450との相同性は、おそらく70％、75％、80％、85％、90％、95％、または100％となるであろう。
したがって、本発明の第一の局面は、レチノイドを酸化する能力を有し、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：32と同定されたアミノ酸配列またはその機能的に同等な相同体と比較して少なくとも約30％保存されているアミノ酸配列を有する精製蛋白質である。配列番号：２と同定されたアミノ酸配列は、ゼブラダニオから得られた蛋白質で、本明細書において「zP450RAI」と呼ぶ。配列番号：４とするヒト蛋白質のアミノ酸配列および蛋白質は、本明細書において「hP450RAI」と称する。マウス蛋白質の配列は配列番号：32とし、この蛋白質を本明細書においてmP450RAIと呼ぶ。
配列番号：２（ゼブラダニオ）、配列番号：４（ヒト）、もしくは配列番号：32（マウス）とされたアミノ酸配列、またはその機能的に同等な相同体と比較して少なくとも約35％保存されているそのような蛋白質もまた、本明細書に開示する本発明の一部を成す。同様に、蛋白質の配列保存の程度は、配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：32または機能的に同等なその相同体のいずれかの40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または当然のこととして100％となることが可能で、変異体は本来の蛋白質のレチノイド酸化能が保持される限り、可能である。β-イオノン環の４位でレチノイン酸をヒドロキシル化する能力を有するいかなるそのような蛋白質も本発明の範囲内である。当然のこととして、開示の蛋白質が保存的に置換された変異体は本発明の範囲内である。
本発明の蛋白質によって酸化されるレチノイドはレチノイン酸であってもレチノールであってもよく、蛋白質はレチノイドのβ-イオノン環の４位の炭素を酸化する能力を有してもよい。特に全トランス型レチノイドは本発明の蛋白質による代謝を受けてもよい。
本明細書において、「保存された」という用語は、配列間の類似性を示す。２つの配列間の保存の程度は、当技術分野に一般的に既知のように、比較できるよう配列を最適に配置し、第一の配列における１つの位置を第二の配列における対応する位置と比較することによって決定することができる。比較した位置に同じヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する場合、場合によっては２つの配列はその位置で保存される。２つの配列間の保存の程度はしばしば、本明細書のように、２つの配列において比較した位置の総数に対する、適合する位置の数の比を示す百分率として表記される。
「レチノイド」という一般的用語は、レチノイン酸、ビタミンA（レチノール）、ならびに多様なシステムにおける発生および分化に対して十分な作用を発揮することができる一連の天然および合成誘導体を含む一群の化合物を意味する。本開示の目的では、「レチノイド」はまた、例えば、計算機化学によって生成されうる同じ機能的特徴を有するその同等物も含むものとする。
もう一つの局面において、本発明は、本発明の蛋白質をコードする単離された核酸分子である。
このように、本発明は、配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：32としたアミノ酸配列、またはその機能的に同等な相同体と比較して少なくとも約30％保存されているアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする単離された核酸分子、例えば、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸分子とハイブリダイズすることができる核酸鎖を含む。当然のこととして、核酸がコードする蛋白質の保存の程度はより高く、すなわち35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％以上となることができる。
特に、本発明はレチノイド環のβ-イオノン環の４位の炭素においてレチノイドを酸化する能力を有する蛋白質、より詳しく述べると全トランス型レチノイン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質をコードする単離された核酸分子である。体発明の目的のため、「単離された」とは、組換えDNA技法によって産生した場合にはその他の細胞材料もしくは培養培地、または化学合成によって産生した場合には化学前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない核酸を指す。
好ましい態様は下記により詳しく記述するが、本発明の好ましい蛋白質の細胞発現は、特定のタイプの細胞に関して、細胞をレチノイド、特にレチノイン酸に暴露することによって誘導することが可能である。本発明の蛋白質は、「レチノイン酸誘導可能蛋白質」として記述される場合には、細胞のDNAによって通常コードされる蛋白質であり、細胞によるその発現がレチノイン酸に対する細胞の暴露によって誘導することができる蛋白質である。たとえそのような蛋白質をコードするDNAを含んでいても、必ずしも全ての細胞がRAへの暴露時に蛋白質を発現するために必要な全ての属性を有するわけではないことが理解されると思われる。
蛋白質に関連したプロモーター活性を有するヌクレオチド配列もまた、本発明者らによって単離および同定されている。プロモーター活性を有するヒトヌクレオチド配列は、配列番号：33とする。プロモーター活性を有するマウスヌクレオチド配列は、配列番号：34とする。プロモーター活性を有するゼブラダニオヌクレオチド配列は、配列番号：35とする。
実際、本発明はヒト（配列番号：36および37）およびマウス（配列番号：38）についてのゲノム配列を含む。
もう一つの局面において、本発明はこのように、全トランス型レチノイン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するレチノイン酸誘導可能蛋白質をコードする異種DNAを含有し発現する微生物細胞である。
本発明の核酸分子の配列は、ヒトゲノム、魚のゲノム、またはマウスゲノムの一部に相当することができ、遺伝子コードの縮重のためにそれらと異なりうる。より詳しく述べると、本発明の核酸分子は、配列番号：３（zP450RAI）、配列番号：５（hP450RAI）、または配列番号：31（mP450RAI）とする配列を有するDNA分子であることができ、または配列は遺伝子コードの縮重のためにこれらの配列の１つから変化している配列となることができ、または高ストリンジェンシーもしくは低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でこれらの核酸分子の少なくとも１つとハイブリダイズすることが可能な核酸鎖であることができる。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、本明細書では当業者に対してその一般的な意味である。核酸のハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば約45℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）が当業者に既知である。以下の実施例は、「分子生物学の最新のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィリー＆サンズ、ニューヨーク（1989）、6.3.1〜6.3.6.に認められる。第一の適当なハイブリダイゼーション溶液50mlでは、ホルムアミド24ml、20×SSC 12ml、２Mトリス塩酸pH7.6 0.5ml、100×デンハード液0.5ml、脱イオン水2.5ml、50％硫酸デキストラン10ml、および10％SDS 0.5mlと混合する。第二の適当なハイブリダイゼーション溶液は、１％結晶BSA（分画V）、１mM EDTA、0.5M Na₂HPO₄ pH7.2、７％SDSとなりうる。洗浄段階での塩濃度は50℃で約２×SSCという低ストリンジェンシーから50℃での約0.2×SSCの高ストリンジェンシーまでの中から選択することができる。これらの洗浄液はいずれも0.1％SDSを含んでもよい。さらに、洗浄段階の温度は室温、約22℃での低ストリンジェンシー条件から約65℃での高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。引用した参考文献はより詳細に記述しているが、適当な洗浄ストリンジェンシーは、プローブの相同性および長さの程度に依存する。相同性が100％の場合、高温（65℃〜75℃）を用いてもよい。相同性が低い場合は、より低い洗浄温度を用いなければならない。しかし、プローブが非常に短い場合（＜100bp）では、相同性が100％の場合でも低い温度を用いなければならない。一般に、低温（37℃〜40℃）で洗浄を開始し、バックグラウンドがオートラジオグラフィーにおける主要な要素とならないほど低くなるまで、３〜５℃の間隔で温度を上昇させる。
本発明のもう一つの局面は、本発明の蛋白質をコードする配列を有するDNAから転写された単離mRNAである。
もう一つの局面において、本発明は組換え型クローニングベクターにおいて機能的に結合された上記ヌクレオチド配列による配列を有する単離DNAである。本発明において、「機能的に結合された」という用語は、調節配列が問題の核酸の発現を可能にするために十分量のエレメントを含むこと、および核酸が調節配列に適切にリンクしていることの双方を意味する。例えば、本発明の核酸は適当な方向にあり、開始コドンと相が一致している。このように、本発明はレチノイン酸のβ-イオノン環の４位でレチノイン酸をヒドロキシル化する能力を有する蛋白質を発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系を含む。本発明は、レチノイン酸のβ-イオノン環の４位でレチノイン酸をヒドロキシル化する能力を有する蛋白質をコードする核酸配列を有する組換えDNA分子で形質転換された細胞培養物を含む。
本発明のもう一つの局面は、上記の本発明の蛋白質を産生するよう遺伝子操作された宿主細胞、該蛋白質をコードする異種DNAをその中で発現するよう組み入れられた細胞である。レチノイド、好ましくはレチノイン酸に細胞を暴露することによって、蛋白質の産生が誘導可能となる細胞を選択してもよい。細胞は真核生物であってもよい。
本発明はまた、本発明の上記蛋白質を製造する方法を含む。該方法には以下の段階が含まれる：
蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を調製する段階、
DNA断片を含み、複製を受けることが可能な組換えDNA分子を得るために発現ベクターの中にDNA断片を組み入れる段階、
蛋白質を発現することができる形質転換体を作製するために該組換えDNA分子で宿主細胞を形質転換する段階、
形質転換体を培養して蛋白質を産生させる段階、および
得られた培養混合物から蛋白質を回収する段階。
本発明は本発明の蛋白質に対する抗体を含む。ここで、「抗体」という用語はFab断片を含むものであり、モノクローナル抗体であることができる。抗体は配列番号：４とするアミノ酸配列、すなわちhP450RAIに対して特異的に作製することができる。
本発明は、そのような代謝を必要とする生物または細胞におけるレチノイン酸の代謝に用いられる精製蛋白質を含む。同様に、本発明は、上記のように本発明の蛋白質を投与することを含む、レチノイン酸代謝を必要とする生物または細胞においてレチノイン酸を代謝する方法を含む。
本発明は配列番号：５とする配列の少なくとも一部と実質的に相補的であるアンチセンスRNAまたはオリゴヌクレオチドの有効量を生物の細胞に導入することを含む、レチノイン酸ヒドロキシル化の阻害を必要とする生物においてレチノイン酸ヒドロキシル化を阻害する方法を含む。生物はヒトであることができ、および／または生物は、癌、紫外線角化症、口腔白板症、頭および／または頸部の二次腫瘍、肺の非小細胞癌、基底細胞癌、急性前骨髄性白血病、皮膚癌、および紫外線角化症、ざ瘡、乾癬および／または魚鱗癬に関連した前悪性疾患状態からなる群より選択される癌様疾患または疾患に対する治療が必要でありうる。そのような方法は、一組のウイルスベクター、マイクロインジェクション、電気穿孔、共沈降、リポソーム、エアロゾル輸送および洗浄からなる群より選択される少なくとも１つの輸送媒体または技法の使用を含むことができる。配列の部分は、５塩基長、５〜50塩基長、５〜30塩基長、10〜20塩基長であってもよく、または別の適当な長さを用いてもよい。生物はヒト患者であってもよく、方法は癌様疾患に対する患者の治療を含むことができる。
本発明はまた、レチノイン酸ヒドロキシル化の阻害を必要とする生物において、抗体、上記のような抗体の有効量を生物に投与することによってレチノイン酸ヒドロキシル化を阻害する方法を含む。ヒトの治療に対して特に有用な抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列またはその一部を有する蛋白質に対する抗体である。そのような抗体は、当業者に理解されるように、抗体を「ヒト化する」ことによってヒトへの投与に適応されることが利点である［ホズミ（Hozumi）、1993］。
本発明は、レチノイドへの暴露に反応して内因性蛋白質を産生することができる細胞を提供する段階、所望の蛋白質をコードするDNA配列を、内因性蛋白質をコードするDNA配列が通常存在する位置またはその付近で、細胞のDNAに組み入れる段階、および所望の蛋白質の産生を誘導するようにレチノイドに細胞を暴露する段階を含む、所望の蛋白質の製造法を含む。
もう一つの態様において、本発明は、レチノイド酸化能を有し、および配列番号：２、または配列番号：32のアミノ酸配列に関して少なくとも約30％保存されているアミノ酸配列を有する蛋白質の有無を調べるキット、とりわけ配列番号：４のアミノ酸配列を有する蛋白質（またはそのペプチド断片）、すなわちヒト蛋白質の有無を調べるキットである。キットには、蛋白質の既定量と抗体を共に結合させると検出可能な反応を生じるリポーターシステムに結合した蛋白質に対する抗体を含む。
もう一つの局面において、本発明は、本発明の蛋白質をコードする核酸、または配列番号：３、配列番号：５、もしくは配列番号：31の配列を有する核酸、または遺伝子コードの縮重のために配列から変化した核酸、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で少なくとも１つの該核酸とハイブリダイズすることが可能な核酸鎖の有無を調べるキットである。キットは、核酸または核酸鎖の規定量と核酸分子を互いにハイブリダイズさせると検出可能な反応を生じるリポーターシステムに該核酸分子が結合している、該核酸または核酸鎖の少なくとも一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な１つの核酸分子を含む。該分子は長さが５塩基以上；長さが５〜50塩基以上、長さが５〜30または40塩基、または長さが10〜20塩基の間であることができる。当然のこととして、より適した塩基の長さが発見されうる。
本発明は、
（a）配列番号：33；
（b）配列番号：34；
（c）配列番号：35；および
（d）（a）（b）または（c）の断片、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する単離されたDNA分子であってからなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する単離されたDNA分子であって、プロモーター活性を有するDNA分子を含む。
より詳しい局面において、本発明は、xが５までの値である配列TGAACT(N)_xTGAACTを含む、記載の配列の１つのDNA分子を含む。この配列は、特にxが５である場合、プロモーター活性を有することが確認されたヌクレオチド配列の３つ全てにおいて保存されている。さらにより詳しく述べると、本発明は、配列TCTGASSAAGKTAACが配列TGAACT(N)_xTGAACTより下流で起こるDNA分子を含む。さらにより詳しく述べると、配列は、配列TGAACT(N)_xTGAACTと配列TCTGASSAAGKTAACとの間に配列AATTを含み、AATTは配列TGAACT(N)_xTGAACTに隣接した下流に認められる。配列TGAACT(N)_xTGAACTと配列TCTGASSAAGKTAACとの間にはヌクレオチド６個まで存在できることが認められている。配列TGAACT(N)_xTGAACTの上流に配列CAATTAAAGAが存在することもできる。特定の局面において、プロモーター活性を有するヌクレオチド配列は、配列CAATTAAAGATGAACTTTGGGTGAACTAATTおよび配列TATAAを含む。特に配列TATAAは配列TGAACT(N)_xTGAACTの下流であり、より詳しく述べると配列TATAAは配列TCTGASSAAGKTAACの下流で、それは配列TGAACT(N)_xTGAACTから約55ヌクレオチド下流まで広がることができる。
本発明は、プロモーター活性を有するそのようなDNA配列を有する組換えDNAを含む。組換えDNAもまた、１つ以上の構造遺伝子を含むことができる。構造遺伝子はチトクロームP450蛋白質をコードすることができる。本発明は、そのような組換え型DNAを含む発現プラスミドおよび組換えDNAを含む単離細胞を含む。細胞は通常真核細胞である。
本発明は、組換えDNAを含む本発明の細胞を培養する段階、および産生された蛋白質を回収する段階を含む、組換え蛋白質の製造法を含む。蛋白質は、チトクロームP450でありうるが、必ずしもそうである必要はない。蛋白質は融合蛋白質でありうる。
本発明はさらに、精製した該蛋白質を該薬物に暴露することおよび活性に及ぼすその効果を決定することを含む、レチノイン酸誘導可能蛋白質の活性に及ぼすそれらの効果に関する薬物のスクリーニング法を含む。活性はレチノイン酸、特に全トランス型レチノイン酸のヒドロキシル化であることができる。特に活性はヒドロキシル化であることができる。
本発明は、本発明のP450RAI活性を有する蛋白質の活性に及ぼす効果について薬物をスクリーニングする、特にレチノイン酸、特に全トランス型レチノイン酸の酸化に対して薬物が有すると思われる効果を確認する方法を提供する。
さらにもう一つの局面において、本発明は、上記の組換えDNAを活性があると考えられる薬物に暴露する段階、および遺伝子発現に及ぼすその効果を決定する段階を含む、レチノイドによって誘導可能である遺伝子の発現に及ぼすそれらの効果に関して薬物をスクリーニングする方法を含む。これは、該レチノイドの存在下で組換えDNAを暴露する段階を含みうる。遺伝子はレチノイン酸を代謝しないリポーター遺伝子でありうる。遺伝子の転写に及ぼす効果を確認する方法を含みうる。
本発明は、レチノイドの代謝に及ぼす薬物の効果を明らかにするためにレチノイドの存在下で薬物にシステムを暴露する段階を含む、該チトクロームP450に対して本来のプロモーター活性を有するヌクレオチド配列の制御下であるように、発現系に組み入れられる本発明のヌクレオチド配列によってコードされるチトクロームP450によって、レチノイドの代謝に及ぼす効果に関して薬物をスクリーニングする方法を含む。
レチノイドはレチノイン酸であってもよく、全トランス型レチノイン酸であってもよい。
本発明は、該蛋白質の活性を調節する、好ましくは減少させる効果を有する、または遺伝子発現を調節する、好ましくは減少させる作用を有する方法に従って同定されたいかなる薬物も含む。
本発明は、本発明の方法によって同定された薬物の有効量を生物に投与することを含む、そのような阻害を必要とする生物においてレチノイン酸の代謝を阻害する方法を含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、mRNAの示差表示を用いてレチノイド調節遺伝子を単離するために用いられた工程の略図である。工程の略図は、示差表示技法を用いてレチノイド調節遺伝子の単離に関係している。段階６において単離されたクローニング産物を次遺伝子の単離に関係している。段階６において単離されたクローニング産物を次にシークエンシング、ノザンブロットまたはcDNAライブラリのスクリーニングに用いることができる。P1、P2、およびP3はRA誘導mRNAからの断片に相当する。P4は、ダウンレギュレートされたmRNAからのPCR産物を表す。
図２（a）は、レチノイン酸処置魚（レーン１および２）およびジメチルスルホキシド（DMSO-）処置対照魚（レーン３および４）を用いて得られたPCR増幅mRNAの二連でのポリアクリルアミドゲルを示す。矢印はPCR増幅バンドがRA処置サンプル中には存在するが、対照には認められないことを示している。
図２（b）は、図２（a）のバンド（矢印）から単離した337塩基対のPCR増幅産物のヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。矢印は、示差表示PCR増幅のための上流および下流のプライミング部位がzP450RAIの3’-非翻訳部分に位置したヌクレオチド配列を示している。
図２（c）は、cDNA（492アミノ酸オープンリーディングフレーム）に対応するアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。四角で囲んだ残基はチトクロームP450の特徴であるヘム結合モチーフを示す。
図２（d）は、スーパーファミリーにおいて認められる保存されたヘム結合モチーフの領域におけるzP450RAIと他のいくつかのチトクロームP450（配列番号：６、７、８、９、10）とのアミノ酸配列の比較を示す。ヘム結合に直接関与していることが示されている［ゴトウ（Gotoh）、1989］図中で0と示されているシステインは、高度に保存されたいくつかのアミノ酸によって取り囲まれている。
図３（a）は、zP450RAI cDNAプローブを用いて、レーン５にRA処置魚の再生組織、およびレーン４に対照（DMSO処置魚）から得られたmRNAのノザンブロット分析を示す。RNAラダー（レーン１）との比較により、主要なzP450RAI転写物が1.4〜2.4kbの範囲であることが示されている。
図３（b）は、全量のインサイチューハイブリダイゼーションによって切断後72時間での尾ひれ組織の再生におけるzP450RAI転写物の局在を示す。（i）zP450RAI転写物はDMSO処置再生体では検出不可能であることが判明した。最初の切断平面を白い矢印の先で示す：m（軟間葉組織）およびr（骨様鰭条）は標識されている。（ii）RA処置魚から得られたサンプルでは、黒い矢印の先で示すzP450RAI転写物が、再生体の遠位先端にかけて伸長する１群の細胞に局在することが判明した。zP450RAI発現が低レベルであることはまた、黒い矢印の先で示すように、単離したひれの近位基底部での非再生組織においても明らかであった。切断平面は図３（b）（i）のように白い矢印の先によって示す。（iii）平面を通じて得られた組織学的切片を直線で示す。（iv）ハイブリダイゼーション後のRAで処置したひれの組織学的切片を示す。zP450RAIの局所発現は、再生体の遠位先端に存在する上皮細胞のサブセット（黒い矢印の先）において検出された。密な再生芽および創傷上皮を分離する基底膜は灰色の矢印の先で示す。
図４は、pSG5-zP450RAIトランスフェクトCOS-1細胞およびpSG5トランスフェクト対照細胞の処置培地から得られた脂溶性抽出物の溶出プロフィールを示す。図４（a）および４（b）は、575pM［11,12-³H］RAと共に４時間および24時間インキュベートした細胞の画分数に対するcpmのプロットで、それぞれpSG5-zP450RAI COS-1細胞（−）および対照細胞（---）である。［11,12-³H］RAの水溶性総代謝物への代謝（総cpmの％）は、β-シンチレーション計数を行った水溶性抽出物の一部を用いて測定した。図４（a）および（b）の下の図を参照のこと。図４（c）および４（d）は、１μM RAと共にそれぞれ、４および24時間インキュベートした細胞の保持時間に対する吸光度のプロットである。zP450RAIトランスフェクト細胞において認められた最大値を黒色で示す。４〜６分のクロマトグラムの領域は拡大している（図４（c）および（d）の下の図を参照のこと）。zP450RAI cDNAでトランスフェクトした細胞では、4-オキソRAおよび4-ヒドロキシRAに相当するピークの生成が認められた。
図５は、配列番号：11とした配列を有するα-［³²P]-dATP標識プローブで調べたヒト細胞系について得られた結果を示す：HEK293；EL-E；HL-60；MCF10A；LC-T；SK-LC6；およびMCF7。（+）は、10^-6M RAによる前処置を示し、（-）はRA前処置を行っていないことを示す。ブロットはまた、ゲルにRNAを加えた対照とするためにhGAPDHでも調べ、これを下段のパネルに示す。
図６は、図５と同様で、細胞系U937およびHepG2に関する結果である。
図７は、図５と同様で、NT2細胞系に関する結果である。
図８は、図５と同様で、正常なNB4細胞系（最初の２レーン）およびレチノイン酸耐性NB4派生細胞系にそれぞれ由来する３種の細胞系に関する結果である。
図９は、ヒトP450RAIアミノ酸配列（中段；配列番号：４）およびゼブラダニオcDNAアミノ酸配列（下段；配列番号：２）と共に配置したマウスcDNAアミノ酸配列（上段、配列番号：32）を示す。
図10（a）は、pSG5-hP450RAIトランスフェクトCOS-1細胞およびpSG5cトランスフェクト対照細胞の処置培地から得られた脂溶性抽出物の溶出プロフィールである。［11,12-³H］RAと共に24時間インキュベートしたpSG5-hP450RAI COS-1細胞（---）および対照細胞（−）の細胞分画数に対するcpmのプロットを示す。図10（b）は、水溶性総代謝物への「11,12-³H」RAの代謝を測定するために行ったβ-シンチレーション計数を行った水溶性抽出物のアリコートの測定値を示す。図10（c）は、１μM RAと共に24時間インキュベートしたhP450RAIトランスフェクト細胞（---）および対照細胞（−）の保持時間に対する吸光度のプロットを示す。挿入した図は10分付近を明瞭に見えるよう拡大している。
図11（a）は、pSG5-hP450RAIトランスフェクトCOS-1細胞およびpSG5トランスフェクト対照細胞の4-オキソ-RA産生を示している。
図11（b）は、pSG5-hP450RAIトランスフェクトCOS-1細胞およびpSG5トランスフェクト対照細胞の4-ヒドロキシ-RA産生を示している。
図11（c）は、pSG5-hP450RAIトランスフェクトCOS-1細胞およびpSG5トランスフェクト対照細胞の水溶性代謝物の生成を示している。
図11（d）は、pSG5-hP450RAIトランスフェクトCOS-1細胞およびpSG5トランスフェクト対照細胞の未代謝RAを示している。
図12（a）は、RAに暴露したMCF 10A細胞および非暴露MCF 10A対照細胞の培地から得られた脂溶性抽出物の溶出プロフィールを示している。［11,12-³H］RAと共に24時間インキュベートしたRA-誘導MCF10A細胞（---）および対照（−）細胞の細胞分画数に対するcpmのプロットを示す。
図12（b）は、RAに暴露したMCF7細胞および非暴露MCF7対照細胞の処置培地から得られた脂溶性抽出物の溶出プロフィールを示している。［11,12-³H］RAと共に24時間インキュベートしたRA誘導MCF7細胞（---）および対照（−）細胞の分画数に対するcpmのプロットを示す。
図12（c）は、β-シンチレーション計数を行った図12（a）および（b）に記述した細胞系の水溶性抽出物のアリコートを用いて測定した水溶性総代謝物を示している。左の２つの棒グラフはそれぞれ、非暴露MCF7細胞およびRAに暴露したMCF7細胞のものである。第３および第４の棒グラフはそれぞれ、非暴露MCF 10A細胞およびRAに暴露したMCF 10A細胞のものである。
図13（a）は、実施例7に記述のように、放射性標識RAと共に90分インキュベートした後のミクロソーム調製物から得た脂溶性抽出物の溶出プロフィールを示す。Hela Pミクロソーム（■、▲）およびHela RAIミクロソ-ム（▼、◆）の分画数に対するdpmのプロット。
図13（b）は、図13（a）の分画５〜15をより大きいスケールで示す。
図14（a）は、GST-hP450RAI融合蛋白質のSDS-PAGEを示す。レーン１は、誘導を行わない場合の、融合蛋白質を含むプラスミドを発現する大腸菌の全細胞溶解物を示す。レーン２は、0.1mM IPTGによる誘導後の融合蛋白質を含むプラスミドを発現する大腸菌の全細胞溶解物を示す。
図14（b）は、0.1mM IPTGによる誘導後の精製GST-hP450RAI融合蛋白質のSDS-PAGEを示し、右側の分子量マーカーは、融合蛋白質が分子量約75kDaを有することを示している。
図15は、ヒト、マウス、およびゼブラダニオのP450RAIのプロモーター配列を示す。四角で囲んだ領域は高度保存領域を示し、矢印は互いに離れたRAREのコンセンサス配列を示す。
図16は、mP450RAIの推定プロモーターの一部をその中にクローニングしたルシフェラーゼベクターを含む細胞において誘導された相対的なルシフェラーゼ活性を示す。ルシフェラーゼ活性は、センスまたはアンチセンスプロモーター配列のいずれかを含む、またはプロモーター配列を含まないルシフェラーゼ骨格のリポーター遺伝子と共に、RXRαおよびRARγをコードするcDNAを含む発現ベクターの３種類の濃度（100ng、500ng、および１μg）でトランスフェクトさせ、RAの存在下および非存在下で増殖させた細胞の細胞抽出物上清において測定した。
図17は、4-ヒドロキシ-フェニルレチンアミド（4-HPR）によるMCF7細胞におけるP450RAI mRNAの阻害を示す。細胞は、全トランス型レチノイン酸（atRA）および4-HPRの表示の濃度で12時間処置した。総RNAをTRIzolを用いて抽出し、その後電気泳動を行った。ノザンブロットは記述のように実施した。ニトロセルロースは、放射性標識P450RAIで調べ、次にGAPDHで調べた。
図18は、全トランス型レチノイン酸の投与後のMCF7細胞におけるチトクロームP450RAIの経時的な発現を、ノザンブロット分析によって示す。
図19は、全トランス型レチノイン酸のみの投与後、および全トランス型レチノイン酸とケトコナゾールの存在下でのMCF7細胞におけるチトクロームP450RAIの経時的な発現を、ノザンブロット分析によって示す。
図20は、全トランス型レチノイン酸の投与後およびAm580投与後のMCF7細胞におけるチトクロームP450RAIの経時的な発現を、ノザンブロット分析によって示す。
好ましい態様の説明
図１は、mRNAの示差表示を用いてレチノイン酸調節遺伝子の単離に用いた工程を概略する。図１の段階６において単離されたクローニング産物をダニオ・レリオ（Danio rerio）cDNAライブラリのシークエンシングおよびスクリーニングに用いた。P1、P2、およびP3はRA誘導mRNAからの断片に相当する。P4は、ダウンレギュレートしたmRNAからのPCR産物である。遺伝子配列の決定に関して手本とした方法の詳細は本明細書において後述する。
ダニオ・レリオ（Danio rerio）種
D.レリオ（D.rerio）は、14時間明期10時間暗期で40Lタンクに１タンク当たり25〜30匹の魚を28.5℃で維持した。水道水に20L当たり水質調整剤（セラ・アクタン（Sera Aqutan））10ml、および250g/L水槽用塩類（ニュートラフィン（Nutra Fin））10mlを加えて調整した。水は２〜３Lを毎日取り替えた。ひれの切断は、調整水に0.2％エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸（ICN）溶液を加えて魚を麻酔した後に実施した。レチノイン酸処置は、切断後、全トランス型RAを、最終濃度10^-6Mとなるようにタンク内の水に直接加えることによって実施した。対照魚およびRA処置魚は両者とも、実験中暗所で維持した。
mRNAの示差表示
示差mRNA表示は、本明細に記述のように適切な改変を加えたが、本質的にリアン＆パルディ（Liang and Pardee、1992）が記述したように実施した。再生組織は切断後３日目（RA処置後24時間）に回収し、液体窒素中で急速に凍結した。ポリ（A）⁺RNAは、マイクロファスト・トラックキット（Micro Fast-Track kit）を用いて単離した。用いたそれぞれの特異的3’ポリ-Tプライマー（5’-T₁₂VN-3’）に関して処置および非処置サンプル双方からの独立逆転写反応を二連で実施した。シンボル「V」はAまたはCもしくはGを表し、TまたはUではない。3’ポリ-Tプライマーのいくつかの組み合わせを表１の最初の欄に示し、第二の欄に示した上流のプライマーをPCR増幅に用いた。各反応について、0.1μgポリ（A）⁺RNAを、300Uスーパースクリプト逆転写酵素（ギブコ/BRL）、１×緩衝液、dGTP、dATP、dCTPおよびdTTPをそれぞれ20μM、10μMジチオスレイトール（DTT）および5’-T₁₂VN-3’プライマー５pmolを含む反応用量20μlにおいて逆転写した。反応液を混合して35℃で60分インキュベートし、95℃で５分インキュベートした。PCR増幅は、パーキン・エルマー・シータスPCR機において以下のように実施した：cDNA合成反応液１μl、５U Taq DNAポリメラーゼ（ギブコ/BRL）、１×PCR緩衝液、dGTP、dATP、dCTPおよびdTTPをそれぞれ２μM、10μCiα-［³⁵S］dATP（レジビュー、アマシャム社）、1.2mM MgCl₂、0.5μM上流プライマーおよび対応する0.5μM 5’-T₁₂VN-3’プライマー。PCR条件は以下の通りであった：94℃で５分を１サイクル；94℃で30秒、42℃で１分、72℃で30秒を40サイクル；その後72℃で５分間最終的な伸長を行った。PCR反応液４μlを６％非変性ポリアクリルアミドゲルに載せて60ワット、45℃で電気泳動を行った。ゲルを乾燥させ、室温でコダックXARフィルム上に12〜24時間露光した。

表１では、第一の欄の配列はそれぞれ、配列番号：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22および23とする。第二の欄の配列はそれぞれ、配列番号：24、25、26、27および28とする。
ゲル精製および再増幅
再現可能な示差増幅（図２aを参照のこと）を示すバンドは、5’-TGCCAGTGGA-3’-ポリ-T-プライマー、5’-TTT TTT TTT TTT AG-3’（それぞれ、配列番号：26および16）の上流-下流プライマーの組み合わせについて認められた。これらのバンドはX線フィルムを重ねることによってゲルから切除し、乾燥したゲルの対応する小片およびフィルターを切除する。本明細書で記述した蛋白質の断片に相当するPCR産物を図２（a）のバンドから単離した。サンプルをヌクレアーゼ・フリーの水100μlに加え、室温で10分インキュベートし、その後15分沸騰させた。上清は12,000×gで15分遠心した後回収した。
PCR産物のクローニングを容易にするため、反応にいくつかの変更を加えた。Eagl制限エンドヌクレアーゼ部位を含むプライマーを再増幅に用いた。示差表示分析において得られた結果に基づき、上流の5’-TGCCAGTGGA-3’プライマーを5’-GTAGCGGCCGCTGCCAGTGGA-3’（配列番号：29）に変更し、下流のポリ-Tプライマー、5’-TTT TTT TTT TTT AG-3’を5’-GTAGCGGCCGCT₁₂-3’（配列番号：30）に変更した。さらに、反応用量を40μlに増加して同位体を排除し、40サイクルに対して20サイクルを実施した。PCR反応液5μlアリコートを採取して、産物を、１％アガロースゲルにおける電気泳動し、続いてエチジウム・ブロマイド染色およびUV照射を行うことにより可視化した。
PCR産物のクローニング
再増幅産物はフェノール／クロロホルム抽出によって精製し、その後エタノール沈殿を行った。得られたDNAペレットを滅菌水17μlに再懸濁し、10U Eagl（ニューイングランドバイオラブズ）および１×NEB３緩衝液を加えて37℃で１時間消化させた。Eagl制限エンドヌクレアーゼは65℃で20分インキュベートすることによって熱不活化した。pBluescript SK⁺ベクターはEaglによる消化によって調製し、仔ウシ腸アルカリフォスファターゼ（CAP、プロメガ社）を用いて脱リン酸化を行った。制限酵素消化物をジーンクリーンIIキット（バイオ101）を用いて精製した後、１％アガロースゲルにおいて電気泳動を行った。ライゲーションの総量10μlにおいて、消化したPCR産物２μl、消化したSK⁺１μg、１U T4 DNAリガーゼ（ギブコ／BRL）および１×緩衝液を16℃で一晩インキュベートした。大腸菌株JM109をバイオラドジーンパルサーを用いてライゲーション産物１μlで形質転換し、LB+アンピシリンプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。
コロニーの選択
個々のコロニーを新鮮なLBプレートに２個ずつ移し、37℃で一晩増殖させた。コロニーをニトロセルロース膜に移し、1.5M NaCl、0.5M NaOHの溶液中で５分間変性させ、1.5M NaCl、0.5Mトリス塩酸、pH8.0で５分中和し、２×SSCで５分の洗浄を２回実施した。次に膜をUVクロスリンクさせた（ストラタリンカーUVクロスリンカー、ストラタジーン社）。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、クイックハイブ（ストラタジーン社）を用いて製造元の指示に従って実施した。各コロニーは、ゲル再増幅および精製段階の際に単離された対応するPCR産物をプローブとして調べた。α-［³²P］-dATP標識プローブは、プライムイットキットII（Prime-It KitII）（ストラタジーン社）を用いて作製した。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを室温で２×SSC、0.1％SDS溶液中で20分間を２回洗浄し、-70℃で一晩コダックX-omatオートラジオグラフィーフィルムに露光した。２枚ずつのプレートから陽性コロニーを選択し、LB+アンピシリン（100μg/ml）中で一晩増殖させ、キアプレップ・スピンプラスミドキット（キアゲン社）を用いてプラスミドDNAを単離した。
T7シークエンシングキットを用いてクローンをシークエンシングした（ファルマシア・バイオテック社）。ジーンワークス・ソフトウェアパッケージ（インテリジェネティックス社）を用いて配列比較を行った。
D.レリオcDNAライブラリのスクリーニング
ユニザップ（UniZAP II、ストラタジーン社）において構築したランダムにプライミングしたD.レリオの６〜18時間胚cDNAライブラリを作製した。4.5×10⁵個の独立したpfuを、プローブとしてmRNA示差表示によって単離した、ランダムにプライミングしたα-［³²P］-dATP標識337bp PCR断片を用いてスクリーニングした。フィルターを50％ホルムアミド、５×SSPE、１×デンハード溶液、0.2mg/ml変性サケ精子DNAにおいて42℃で１〜４時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイゼーション溶液に変性プローブを加えることによって、42℃で実施した。フィルターは室温で２×SSC、0.05％SDS溶液中で20分間の洗浄を２回行い、-70℃でコダックXARフィルムに一晩露光した。陽性プラークを500μl SM緩衝液に採取し、精製するまで再スクリーニングを繰り返した。製造元（ストラタジーン社）の指示に従って、陽性プラークにインビボ切除プロトコルを行った。pBluescript含有コロニーをLB+アンピシリンプレート上に播種し、37℃で一晩増殖させた。T7シークエンシングキット（ファルマシア社）を用いて配列データを得て、ジーンワークスソフトウェアパッケージ（インテリジェネティックス社）を用いて分析した。
ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーション
RA-およびDMSO処置再生体を切断後72時間目（RA/DMSO添加後24時間）に単離し、PBSで洗浄し、ホールマウント（whole mount）インサイチューハイブリダイゼーション用に調製した。インサイチューハイブリダイゼーションは、これまでに記述されているように実施した［ホワイト（White）、1994］。
ノザンブロット分析
72時間魚の尾ひれを再生させた。48時間目に、DMSO溶媒に溶解した10^-6M全トランス型RAまたはDMSO単独をタンクの水に直接加えた。mRNAは、製造元の指示に従って、マイクロファスト・トラックmRNA単離キット（インビトロゲン社）を用いて調製した。3.0〜5.0μgポリA⁺RNAを電気泳動し、ブロットし、これまでに記述の方法を用いて調べ［ホワイト（White）、1994］、下記のように全長のzP450RAI cDNAを得た。エチジウムブロマイド染色を施したアガロースゲルにより、mRNAの等量をブロッティング実験に用いたことが示された。図３（a）のレーン２および３を参照のこと。
HPLC分析
575pM［11,12-³H］RA（図４（a）および４（b））、または１μM RA（図４（c）および４（d））と共に４時間（図４（a）および４（c））または24時間（図４（b）および４（d））インキュベートしたトランスフェクト細胞からの培地を、0.1％酢酸で酸性にした。培地の全脂質抽出を用いて脂溶性代謝物を水溶性代謝物から分離した［ブライ（Bligh）、1957］。［11,12-³H］RAの水溶性総代謝物への代謝は、β-シンチレーション計数を行う水溶性抽出物のアリコートを用いて測定した（図４（a）および４（b）の下の図を参照）。脂溶性抽出物を窒素流下で蒸発堅固し、93.5/5/1/0.5ヘキサン／イソプロパノール／メタノール／酢酸（H/I/M/AA）に再懸濁した。代謝物は、ゾルバックス-SIL（３μ、８×0.62cm）カラムを用いて流速１ml/分で溶媒系93.5/5/1/0.5H/I/M/AAで溶出するHPLCによって分離した。
実施例１
新規チトクロームP450の特徴付け
RAの存在下または非存在下において再生するひれ組織に存在する転写物は、リアン＆パルディ（Liang＆Pardee）［Liang、1992］が開発した示差表示PCR技法を用いて比較した（図２（a））。図２（a）の矢印で示す、発現がRAの存在に依存する示差表示産物の１つを単離し、シークエンシングした。この配列を配列番号：１とし、図２（b）にも示す。本明細書において「zP450RAI」と呼ぶcDNAに対応するアミノ酸配列を図２（c）に示し、配列番号：２とする。BLAST調査分析により、zP450RAIとチトクロームP450スーパーファミリーの多数のメンバーとの間に配列相同性があることが明らかになった。zP450RAI cDNA推定アミノ酸配列とその他のチトクロームP450のアミノ酸配列とを整列すると、zP450RAIがこれまでに定義されたサブファミリーのメンバーとの全体的なアミノ酸同一性は30％未満であることが示された［ネルソン（Nelson）、1993］。zP450RAIは、蛋白質のC末端部分に位置するヘム結合ドメインを含む、チトクロームP450ファミリーメンバーに共通している構造モチーフの多くを含んでいる。図２(d）を参照のこと。P450RAIファミリーは「CYP26」と呼ばれている。
実施例２
全トランス型RAによるzP450RAIの細胞特異的誘導
対照（ジメチルスルホキシド-処置）およびRA処置魚から単離した再生組織において発現されたmRNAのノザンブロット分析は、全長のzP450RAI cDNAプローブを用いて実施した。zP450RAI転写物は、対照魚からの再生組織では検出されなかったが（図３（a）、レーン４）、RAに24時間暴露した魚から単離した組織では非常に著明に存在した（図３（a）、レーン５）。
ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションを用いて、再生しつつあるひれ組織におけるzP450RAI発現の細胞内位置を決定した。図３（b）は対照およびRA処置魚からの再生ひれを示す。zP450RAI転写物は対照ひれ組織では検出されない（図３（b）（i））。RA処置魚からの組織の再生において、zP450RAI転写物は、図３（b）（ii）の黒い矢印の先で示すように創傷上皮の遠位先端を超えて広がる上皮細胞の層に豊富に認められた。図３（b）（ii）の黒い矢印の先の線で示すように、鰭条間組織にはいくらか低レベルの染色も認められら。図３（b）（iii）に示す線に沿ってRAで処置したひれの組織学的切片を図３（b）（iv）に示す。切片は、zP450RAIを発現する細胞が芽体間葉細胞の遠位先端で上皮層の深部に位置することを示している。このようにホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションにより、全組織におけるチトクロームP450RAI mRNAの位置に関して本発明の核酸プローブの有用性が示される。
実施例３
zP450RAIトランスフェクト細胞による全トランス型RAの代謝
レチノイン酸をzP450RAIの基質として調べた。全長のゼブラダニオzP450RAI cDNAを真核発現ベクターpSG5にクローニングした［グリーン（Green）、1988］。COS-1細胞をpSG5またはpSG5-zP450RAIのいずれかで一過性にトランスフェクトし、［11,12-³H］全トランス型RAのピコモル濃度または非放射性全トランス型RAのマイクロモル濃度のいずれかと共にインキュベートした。COS-1細胞は、アフリカミドリザルの腎「繊維芽細胞様」細胞株である。COS-1細胞にzP450RAIが発現されると、脂溶性および水溶性代謝物の双方においてRAの速やかな変換を促進した。図４（a）および４（b）を参照のこと。トランスフェクト細胞の総脂質抽出物の分画はまず、ゾルバックス-SILを用いた正常相のHPLCによって分離した。pSG5およびpSG5-zP450RAI-トランスフェクト細胞からの抽出物を比較すると、zP450RAIがRA代謝を有意に増加させることが示された。zP450RAIトランスフェクト細胞を575pM［11,12-³H］全トランス型RAで４または24時間インキュベートするとRA代謝物の蓄積が起こり、その一つは4-ヒドロキシ-RAおよび18-ヒドロキシ-RAの合成標準物質と共にカラム上を移動し、もう一つのわずかに極性の低い代謝物は4-オキソ-RA標準物質と共に移動した（図４（a）および４（b））。その他のHPLCシステムを用いたRA代謝物の再クロマトグラフィーにより、これらの２つの代謝物が4-ヒドロキシ-RAおよび4-オキソ-RAであることが確認された（表２）。水溶性放射活性はRA代謝物のグルクロニドまたはRAそのもののグルクロニドを表す可能性がある。哺乳類細胞抽出物における4-および18-ヒドロキシ-RAの速やかなグルクロン酸抱合は、他の研究者によって報告されている［ウーターズ（Wouters）、1992；タカツカ（Takatsuka）、1996］。

RAのより高濃度（１μM）を用いた場合にもzP450RAI依存型代謝に同様のパターンが認められた。zP450RAIトランスフェクトCOS-1細胞を１μM RAと共に４または24時間インキュベートすると、図４（c）および４（d）に示すように350nm HPLCトレースにおいて識別できない２本のほぼ重なり合うピークを生じたが、これは対照pSG5-トランスフェクト細胞では本質的に検出不可能であった（図４（c）および４（d）の下の図を参照）。これらのピークはそれぞれ、4-オキソ-RAおよび4-ヒドロキシ-RA標準物質と共に移動した。zP450RAIが生じたピークのダイオード配列分光光度分析検出により、２つの代謝物ピークのスペクトル特性がレチノイド標準物質と一致したことを示した［ヘキサン基剤の溶媒において：4-ヒドロキシ-RA、λ_max＝350nm；4-オキソ-RA、λ_max＝355nm；メタノール基剤溶媒では、4-ヒドロキシ-RA、λ_max＝340nm；4-オキソ-RA、λ_max＝360nm］。
このように、本発明は、CYP26と呼ばれるチトクロームP450のファミリーに属するレチノイン酸代謝蛋白質を含み、RA処置に反応して誘導されるゼブラダニオの尾ひれ創傷上皮における蛋白質の生成を含む。RA代謝活性はいくつかの種の上皮組織においてすでに検出されており［フロリク（Frolik）、1979；ロバーツ（Roberts）、1979；ウーターズ（Wouters）、1992；デュエル（Duell）、1992］、そのような活性に関与する実際の酵素はこれまでのところわかっていない。
zP450RAIはRA治療によってアップレギュレートされ、このアップレギュレーションは明らかに、再生しつつあるゼブラダニオ尾ひれの創傷上皮中の特定の細胞において起こっている。
RARが選択的に除去されているF9細胞による実験により、RAR-αおよびRAR-γがRA代謝の制御に何らかの役割を果たす可能性があることが示されていることは、この酵素のインビボ生成の制御と関連する可能性がある。再生しつつある尾ひれにRAR-αおよびRAR-γがいずれも発現されていることは、RAによるP450RAI発現の制御にそれらが関与する可能性があるという示唆と一致する。
実施例４
ヒトP450RAIのクローニング
ゼブラダニオP450RAI（zP450RAI）のDNAに対応するアミノ酸配列（配列番号：２）を用いて、発現配列tag（EST）データベースを検索した。zP450RAIのC-末端部分（配列番号：２のグルタミン酸292位〜フェニルアラニン410位まで）と高度の相同性を有する市販のESTクローン（配列番号：11）を購入した（リサーチジェネティクス、ハンツビル、アラバマ州）。クローンはヒト幼児脳cDNAライブラリ（ベントソアールス＆M.ファティマボナルド（Bento Soares and M.Fatima Bonaldo））に由来するとのことであるが、それ以外は公表されていないようである。購入したクローンをT7シークエンシングキット（ファルマシア）を用いてシークエンシングし、ジーンワークスソフトウェアパッケージ（インテリジェネティクス）を用いて、配列データを作製した。
レチノイン酸で処置したNT2細胞系から作製したcDNAライブラリは市販されており（ストラタジーン社、カタログ番号939231）、この製品を以降の研究に用いた。cDNAライブラリは配列番号：11とする配列を有する核酸をプローブとして調べた。陽性ハイブリダイズクローン11個を単離し、製造元の指示に従って精製した。これらのクローンの配列データはT7シークエンシングキット（ファルマシア社）を用いて作製し、ジーンワークスパッケージ（インテリジェネティクス社）を用いて分析した。ヒトDNA配列は配列番号：５とし、対応するポリペプチドを配列番号：４とする。
実施例５
マウスP450RAIの単離
ブルンバーグら［Blumberg、1995；Achkarら、1996］が記述したように、4-ヒドロキシラーゼ活性を有するF9およびP19マウス細胞系のいずれかにおいて、RAが、hP450RAI cDNAプローブとクロスハイブリダイズするmRNA転写物を誘導することができることは本発明者らによって発見されている（結果は示していない）。
ラムダUnizap XR（ストラタジーン社）におけるレチノイン酸処置P19奇形癌cDNAライブラリを、³²P-標識全長ヒトP450RAIをプローブとして用いてスクリーニングした。ニトロセルロースフィルターを50％ホルムアミド、１×デンハード溶液、５×SSPE、0.1％SDS、および100μg/ml熱処理サケ精子DNAを含む緩衝液中で37℃で一晩ハイブリダイズし、２×SSC、0.1％SDS中で室温で15分間２回洗浄し、その後37℃で20分洗浄した。ファージの延べ600,000個のプラーク形成単位から、陽性単位72個を単離した。これらのうち、上記のように18個を精製し、１つはこれまでに単離された全長のヒトクローンと相同で、長さが1.7kbの全長cDNAインサートを有することが判明した。マウスDNA配列を配列番号：31とし、対応するポリペプチドを配列番号：32とする。図９は、ヒト蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：４）およびゼブラダニオ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：２）と共にマウス蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：32）の一部を整列する。
実施例６
一過性のトランスフェクション分析
COS-1細胞は、標準的なDEAEデキストラン法［サムブルック（Sambrook）、1989；マニアティス（Maniatis）、1982］に従って実施するトランスフェクションの前に20時間サブカルチャーした。pSG5（対照）またはhP450RAI-pSG5（実験）のいずれかをプレート１枚あたり３μg加えて、細胞をpE-AR（アドレノドキシン発現ベクター、１μg/P100プレート）およびpE-ADX（アドレノドキシンレダクターゼ発現ベクター、１μg/P100プレート）にトランスフェクトさせた。［11,12-³H］全トランス型レチノイン酸（60,000cpm/プレート）をトランスフェクションの24時間後に加えた。実施例３に記述のように分析を行い、得られた結果を図10および11（a）〜11（d）に示す。図に示すように、COS-1細胞にhP450RAIが発現されると、RAの4-ヒドロキシ-RAおよび4-オキソ-RAへの変換を促進した。対照細胞での産生量と比較したトランスフェクト細胞での4-オキソ-RAおよび4-ヒドロキシ-RAの総量をそれぞれ、図11（a）および（b）に示す。全体として、トランスフェクト細胞では水溶性代謝物の産生量がより多く（図11（c））、対照細胞では未代謝RAの検出量がより多かった（図11（d））。
いくつかの細胞系：HEK293；EL-E；HL-60；MCF10A；LC-T；SK-LC6；MCF7；U937；HepG2；NT2におけるRAによるhP450RAIの誘導可能性を調べるために、［³²P］-dATP標識プローブとしてクローン配列（配列番号：11）を調製した（図５〜７参照）。図からわかるように、多様な発現パターンが認められた。SK-LC6ヒト肺（上皮）細胞系は、対応するmRNAを構成的に発現するように思われた。HEK293（ヒト胎児腎）、LC-T（ヒト肺上皮）、HepG2（ヒト肝、形態は上皮）、NT2（多能性ヒト胎児癌）、およびU937（ヒト単球骨髄球）細胞系では、RAの添加に反応して明らかにある程度の発現の増加が認められた。MCF7（ヒト乳癌（上皮）細胞系）ではRAへの暴露に大きく依存した。いくつかの細胞系：EL-E；HL-60およびMCF10AはRAの有無によらず発現を示さなかった。
［³²P］-dATP標識プローブを用いて、ヒト急性前骨髄性白血病細胞系におけるhP450RAI mRNA発現もまた調べた。実験は、ヒト急性前骨髄性白血病患者から単離したNB4細胞系を用いて実施し、３つのレチノイン酸耐性細胞系は個別にNB4細胞から誘導した。結果を図８に示す。図からわかるように、正常細胞は10^-6M RAによる処置後にhP450RAI mRNAを発現したが、そのような発現は、その他の細胞系ではRAの非存在下および存在下のいずれの場合でも存在しないように思われた。
RAに暴露したMCF10AおよびMCF7細胞系の代謝物の分析を行ったところ、MCF10A細胞はmRNAの発現を示さず、後者の細胞は、mRNAの発現がRAに対する暴露に大きく依存することを示した。図12（a）〜12（c）に結果を示す。図５に示す結果と一致して、図12（a）に示す結果はRAに暴露したMCF10A細胞系と対照細胞系の脂溶性活性プロフィールにほとんど差がなかったことを示している。図12（c）の最後の２つの棒グラフは、誘導および対照MCF10A細胞のいずれの場合も総水溶性代謝物の総量がほぼ同じであることを示した。図12（b）に示すように、RAに暴露したMCF7細胞系は、RAに暴露していない同じ細胞系より4-ヒドロキシ-RAおよび4-オキソ-RA濃度が有意に高い溶出プロフィールを示した。図12（c）は、RAに暴露したMCF7細胞系の水溶性代謝物の総量が、対照細胞の総量よりはるかに大きいことを示している。この場合も、これらの結果はMCF7細胞系について図５に示すノザンブロット分析で得られた結果と一致している。
実施例７
ヒトP450RAIを用いた安定な細胞系の作製：センス構築物を発現するHela細胞
Hela細胞の発現に関して、ヒトチトクロームP450RAI cDNA（配列番号：５）を、エプスタイン・バーウイルス骨格ベクターpCEBV7［ウィルソン（Wilson）、1995］の多クローニング部位のXhoI-NotI部位に挿入した。安定なトランスフェクションはリン酸カルシウム法［サムブルック（Sambrook）、1989］によって実施した。トランスフェクション日の前に、Hela細胞を100mmプレート当たり3.0×10⁶個播種した。プレートあたりDNA約12μgをトランスフェクトさせ、トランスフェクションにはプレート３枚ずつを用いた。ヒグロマイシンBを用いた選別は、トランスフェクションの３日後に開始し、プレート上に細胞増殖巣の発生が認められるまで約３週間継続した。構築物の発現量が多い細胞を選別できるよう、ヒグロマイシンB（100μg/ml）の濃度を選択した。選別の前に、ヒグロマイシンの50μg/mlが４日間で細胞の50％を殺すのに十分であることを示す殺細胞曲線を決定した。選択したHela細胞がセンス構築物を発現するか否かの確認は、ノザンブロット分析によって、全長のhP450RAI cDNAをプローブとして調べることによって行った（データは示していない）。
pCEBV7のみでトランスフェクトさせたHela細胞（Hela P）から、またはP450RAI（Hela RAI）を発現し、放射性標識RAに90分間暴露したHela細胞からミクロソームを調製した。結果を図13（a）および13（b）に示し、これにより、これらの細胞から調製したミクロソームをRAと共にインキュベートすると、Hela RAIからのミクロソームのみがレチノイン酸の4-ヒドロキシ-レチノイン酸または4-オキソ-レチノイン酸への何らかの変換を示したことがわかる。
実施例８
ヒトP450RAIを含む融合蛋白質の発現
hP450RAIのcDNAを、Sma1部位を用いてGST遺伝子融合ベクターであるpGEX3Xに挿入した。構築物は、シグナル配列の特徴である疎水性領域をコードする、hP450RAI cDNAのN-末端部分の177bpの欠損体を生成した。大腸菌（JM109）細胞をベクターおよび構築物の発現に用いた。正しい方向に構築物を発現する陽性コロニーをスクリーニングした後、ファルマシア社が提供したマニュアルに従って融合蛋白質の発現を行った。
GST-hP450RAI融合蛋白質は、大腸菌（JM109）細胞の電気穿孔を通じて産生し、その後遺伝子発現を誘導した。融合蛋白質の発現は、乳糖類似体であるイソプロピルベータ-チオガラクトシド（IPTG）によって誘導可能なtacプロモーターの調節下で行う。
培養物はLB-アンピシリンブロス中で一晩増殖させた。翌日、一晩培養物の約１：100倍希釈物をLB-アンピシリンブロスを含む新鮮なチューブに移した。培養物を３時間増殖させ、最終濃度0.1mMのIPTGでさらに2.5時間誘導した。誘導後、培養を7,700×gで４℃で10分遠心し、細胞を沈降させた。ペレットを培養液50μlに対し氷冷１×PBS １mlの比で再懸濁した。ペレットを氷浴中で超音波発生装置で30秒間隔で溶解させた。トライトンX-100を、溶解した細胞に最終濃度１％となるように加え、混合物を４℃で30分間インキュベートして可溶化した。懸濁液を12,000×gで４℃で10分遠心した。
融合蛋白質のGST部分のグルタチオンビーズへの結合を用いて、蛋白質を精製した。１×PBSで平衡にした還元グルタチオンビーズの50％スラリーを上記の超音波混合物100mlあたり２ml用いた。ビーズを加えた後、材料を室温で静かに攪拌して、融合蛋白質をビーズに結合させた。懸濁液を500×gで５分遠心し、結合した融合蛋白質を有するグルタチオンビーズを他の細胞成分と分離した。グルタチオンビーズは氷冷PBSで３回洗浄し、非特異的結合材料を除去した。
還元グルタチオンを含む溶出緩衝液を用いて、融合蛋白質をグルタチオンビーズから溶出させた。超音波懸濁液100mlあたりグルタチオン溶出緩衝液約1.0mlを用いた。結合したグルタチオンビーズを室温で10分混合させ、融合蛋白質を溶出させた。溶出したビーズの遠心分離は500×gで５分間実施した。溶出および遠心は共に３回行った。図14（a）および（b）はGST-hP450RAI融合蛋白質のSDS-PAGEの結果を示す。
関係蛋白質と共有結合したGST蛋白質に関して何らかの機能的検査を行うことは一般に可能であるが、抗体を産生させるためには除去が好ましい。GST-hP450RAI融合蛋白質は、第Xa因子によって認識される部位を含む。溶出された融合蛋白質を第Xa因子で処置すると、GST蛋白質およびhP450RAI蛋白質を共に生じる。または、ビーズから溶出する前に融合蛋白質を開裂することが可能であるが、不適切な開裂が多く起こる。融合蛋白質１mgあたり第Xa因子約10μgを用いる。材料を静かに混合し、室温でおよそ２〜16時間インキュベートする。消化が完了したか否かは、様々な時点でのゲル電気泳動によってチェックする。関係蛋白質をGST蛋白質から精製するために、開裂した融合蛋白質懸濁液とグルタチオンビーズとの結合を行い、その後遠心する。関係蛋白質は上清に残る。
GST融合蛋白質は免疫学的、または生化学的にアッセイすることができる。生化学的アッセイでは、GST融合蛋白質をGST基質である1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン（CDNB）で処置すると、融合蛋白質の量が示される。GST蛋白質はCDNBのグルタチオンとの結合を触媒し、その結果340nmで強いモル吸光度を示すCDNBグルタチオン産物を生じる。免疫学的アッセイでは、融合蛋白質のウェスタンブロットは、抗ヤギIgGアルカリフォスファターゼ結合体のような二次抗体を用いて容易に検出することができる抗GST抗体をプローブとして、および標準的な比色反応によって調べることができる。
実施例９
ヒトP450RAIのマッピング
hP450RAIの1.3kb cDNAは、P-1由来人工染色体（PAC）ライブラリを用いてマッピングした。cDNAおよびゲノムPACクローンのマッピングは、ヨウ化プロピジウムおよびDAPIで対染色した正常なヒトリンパ球染色体との蛍光インサイチューハイブリダイゼーション［リヒター（Lichter）、1990］によって行った。ビオチン結合プローブは、アビジン-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）によって検出した。分裂中期標本の画像は、熱電気的冷却電荷カップリングカメラ（フォトメトリクス社、ツーソン、アリゾナ州）によってとらえた。DAPIバンドを有する染色体［ヘン（Heng）、1993］およびFITC標的染色体の個々の画像を得た。ハイブリダイゼーションシグナルを得て、画像分析ソフトウェアを用いて、偽青色（DAPI）および黄色（FITC）［ボイル（Boyle）、1992］を融合させ、電子的に重ねた。
陽性ハイブリダイゼーションシグナルは10q23-24に局在することが判明した。バンドの割付は染色体分画の長さの測定およびDAPI対染色画像によって得られたバンドパターンの分析によって決定した。
実施例10
P450RAI転写の制御−P450RAIプロモーターのクローニング
ゼブラダニオP450RAIプロモーターのクローニング。成魚ゼブラダニオゲノムライブラリ（1.0×10⁶pfu）を、zP450RAIに対応する全長のcDNAでスクリーニングし、二次および三次スクリーニングによって陽性プラークを精製した。陽性プラークに対応するラムダDNAを調製し、これらのクローンからのインサートをNotIによる制限酵素消化によって切除し、プラスミドSK+（ストラタジーン社）にサブクローニングした。SK+のポリリンカーからの酵素を用いて制限酵素消化することによってゲノムクローンを分析し、その後zP450RAI cDNAのN-末端をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（5’-GTAGCACGGATGGTG-3’）を用いてサザンブロッティングを行い、N-末端領域をコードするゲノムクローンの断片を同定した。オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする772塩基対のPstl断片を精製し、ベクターSK+にライゲーションしてカナダ、キングストンにあるクイーンズ大学の蛋白質/DNA化学用中心設備（the Core Facility for Protein/DNA Chemistry）を用いてシークエンシングした。配列分析により、このクローンが、推定開始メチオニンの後にコード配列129塩基対プラス651ヌクレオチド上流（5’）を含むことが確認された。この772塩基対の断片の中に、402塩基対Hind III断片が推定レチノイン酸反応エレメント（RARE）を含むことが判明した。この断片を、一過性のトランスフェクション分析のために、pGL3Bルシフェラーゼベクター（プロメガ社）に正逆両方向にサブクローニングした。
ヒトP450RAIプロモーターのクローニング 全長のhP450RAI cDNAをプローブとして用いてhP450RAI遺伝子を含むPAC（P1人工染色体）クローンを同定した。PACライブラリをスクリーニングするため、カナダ、オンタリオ州トロントにある小児病院（Hospital for Sick Chiledren）のカナダゲノム分析およびテクノロジープログラム（Canadian Genome Analysis and Technology Program）に、hP450RAIからのcDNAを送付した。５つのPACクローンをこのスクリーニングから得て、制限酵素消化および全長のhP450RAI cDNAをプローブとして用いたサザンブロッティングによって、それらがhP450RAI遺伝子を含むことを確認した。これらのクローンの１つ、245C7はhP450RAIからのN-末端プローブとハイブリダイズすることが判明した。用いたプローブはhP450RAI cDNAから生じた約130bpのNotl断片であった。クローン245C7の消化およびサザンブロッティングにより、Notl断片とハイブリダイズする約3.5kbのBamHI断片が同定された。この断片をプラスミドSK+にサブクローニングし、カナダ、キングストンにあるクイーンズ大学（Queen’s University）の蛋白質/DNA化学用中心設備を用いて、配列データを得た。hP450RAI cDNAについて得られた配列データの比較により、この3.5kbクローンが推定開始メチオニンおよび約675bp上流（5’）を含むことが確認された。
マウスP450RAIプロモーターのクローニング 長さが約17kbであるマウスP450RAIゲノムDNAのクローンをSV129λDASHライブラリから単離し、SKにサブクローニングした。このプラスミドから調製したDNAを様々な制限エンドヌクレアーゼによって消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース上にてサザンブロッティングを行った。得られたブロットをマウスP450RAI cDNAクローンのN-末端領域からの³²P-標識230塩基対プローブとハイブリダイズさせた。長さが約520塩基対であるSacl断片はプローブと強くハイブリダイズすることが判明した。この断片をSaclで開裂したSKにサブクローニングした。配列分析により、DR5-型のRAREが近位プロモーターに存在することが明らかになった。このRAREには193塩基対離れて２つのBssHII部位が隣接した。この193塩基対BssHII断片をpGL3BのMlul部位にサブクローニングした。XhoIによる診断的制限酵素消化を行って、正逆両方向にBssHII断片を有するクローンを単離した。193塩基対断片の中には、TATAボックスがRAREの45塩基対下流に存在することが判明した。DR5 RAREの上流のDNA83塩基対もまた193塩基対BssHII断片に含まれる。
レチノイン酸受容体（RARs）およびレチノイド-x-受容体RXRsに結合するレチノイン酸反応エレメント（RAREs）の存在は知られている。このように、上記の異なる種からのP450RAIの３つのプロモーターにRAREsが存在するか否かを調べ、存在すれば、P450RAIの発現の制御が転写レベルで起こっていることを示す可能性がある。RAREsはヘテロダイマーの形でRARsに結合し、典型的にコンセンサスモチーフ5’-（A/G）G（T/G）TCA-3’の直列反復を含む。反復配列は１、２、または５ヌクレオチド離れていることが可能である。図15はゼブラダニオ、ヒトおよびマウスP450RAI遺伝子のプロモーター配列を示す。矢印で示すように、高度に保存されたモチーフが存在し、これは５ヌクレオチド離れたモチーフAGTTCAの直列反復を含む、DR5として知られるコンセンサスレチノイン酸反応エレメントに対応する。P450RAIプロモーターにおけるこのモチーフはTGAACT（ACTTCAの相補鎖）を超えて広がっている。DR5のいずれの側にも広がる高度保存領域もまた存在し、その全領域を四角で囲んだ。３つ全ての種におけるプロモーターのこの領域の保存の程度から、この領域がRA反応の調節に重要であること、およびRAR/RXRsが、その実体が現在はわかっていないこの領域と結合するその他の要因と結合して、または競合して作用していることが示唆される。保存領域の一部は、ホメオドメイン結合モチーフに非常に厳密に対応する配列5’-CAATTAAA-3’に対応し、このことはホメオボックス蛋白質がP450RAI発現の制御においてRAR/RXRsヘテロダイマーを促進する、またはこれと競合する可能性があることを示唆している。
実施例11
マウスP450RAIプロモーターによるトランスフェクション
mP450RAIの推定プロモーターの一部を含むゲノムDNAの195塩基対断片をルシフェラーゼベクター、pGL3B（プロメガ社）にクローニングした。プロモーター活性の分析のために、HepG2細胞を、６穴培養皿において、実施例10に記述のように、リポフェクトAMINE試薬（ギブコ、BRL）５μlを用いてBssHI-pGL3Bセンスまたはアンチセンス構築物２μgでトランスフェクトさせた。
第一日目、すなわちトランスフェクションの48時間前に、細胞を６穴プレートに最小基本培地（MEM）（ギブコ、BRL）＋10％ウシ胎児血清（ギブコ、BRL）2.5〜３mlと共に再び播種した。３日目に、細胞は概して約50％コンフルエントとなる（HepG2）。トランスフェクションを開始する前に、培地を新鮮な培地と交換し、細胞を増殖させ、その間にDNA/リポフェクタミン混合物を調製した。48穴プレートの個々のウェルにおいて、optiMEM（ギブコ、BRL）100μlに対して１〜５μg DNAおよびoptiMEM 100μl中に対してリポフェクトAMINE試薬５μlを混合し、リポフェクトAMINE/optiMEMにDNA/optiMEMを加えて静かに混合した。これを室温で15分〜１時間静置した。各ウェルに、optiMEM 800μlを加えて最終容量を１mlとした。細胞を１×PBSで２回洗浄し、optiMEMで１回洗浄した。DNA/リポフェクトAMINE/optiMEM混合物１mlを細胞に加えて、37℃で20時間インキュベートした。
プロモーター活性に及ぼすレチノイン酸の作用は、ゼブラダニオレチノイン酸受容体ガンマ（RAR-γ）およびゼブラダニオレチノイドx受容体アルファ（RXR-α）をコードするcDNA配列を含む発現ベクターの量を変化させて（100ng〜１μg）共トランスフェクトさせることによって分析した。DMSOでトランスフェクトさせた１組の細胞と10^-6M RAのDMSO溶液でトランスフェクトさせたもう１組の細胞をインキュベートすることによって、対照pGL3Bベクターでトランスフェクトさせた細胞、センス構築物を有する細胞およびアンチセンス構築物を有する細胞間の比較を行った。
第４日目に、培地を除去して、新鮮な培地（+10％FBS）と交換した。RAまたは溶媒を必要に応じてウェルに加え、プレートを旋回させて静かに混合した。６穴プレートには10^-3M RAのDMSO溶液３μlを加えた。対照ウェルにはDMSO ３μlを加えた。プレートをホイルで覆って37℃で24時間インキュベートした。
第５日目に、培地を除去して１×PBSで２回洗浄することによって細胞を回収した。次に、氷中で溶解緩衝液100μl（１％トライトンX-100、25ｍＭグリシルグリシン、pH7.8、15mM MgSO₄、４mM EGTA、１mM DTT（使用直前に加える））を加え、細胞を培養皿の底から剥離させて、1.5ml微量遠心チューブに移し、12000×gで５分遠心し、上清を回収した。
ルシフェラーゼ活性をアッセイするために、溶解してペレットにした細胞から得た上清20μlを新鮮なチューブに移した。ルシフェラーゼアッセイ緩衝液80μlを加えて、ルミノメーターにて１ミリボルト単位での記録値を直ちに得た。ルシフェラーゼアッセイ緩衝液は20mMトリシン、1.07mM（MgCO₃）₄Mg（OH）₂*5H₂O、2.67mM MgSO₄、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、0.27mMコエンザイムA、0.47mMルシフェリン、0.53mM ATPであった。結果を図16に示し、これにより、センス構築物では増強は大きいように思われるが、プロモーター配列の両方向について、RA、RXRαおよびRARγの存在下でルシフェラーゼ活性の増強が認められたことがわかる。
実施例12
4-ヒドロキシフェニルレチンアミドによるP450RAI誘導の阻害
4-ヒドロキシフェニルレチンアミド（4-HPR）がNB4細胞によるRA-誘導RA異化を阻害することが最近報告されている［タイミ（Taimi）、1997］。4-HPRは、RAの異化を競合的に阻害するRA酸化に関与するチトクロームP450酵素を阻害する可能性があることが示唆された。しかし、そのようないかなる酵素も同定されず、RA異化の4-HPRによる阻害の本質を説明するいかなる証拠も提供されておらず、4-HPR代謝のいかなる証拠も認められなかった。
このように、P450RAIの誘導に及ぼす4-HPRの効果を明らかにする実験を実施した。図17は、合成レチノイドである4-HPRの、RAによるP450RAI誘導の阻害能について図示している。MCF7細胞は、10％ウシ胎児血清、インスリン（0.01mg/mL）、MEM非必須アミノ酸（製造元−ギブコの指示通り）、ピルビン酸ナトリウム（500nM）、L-グルタミン（２mM）、ゲンタマイシン（10μg/ml）、ペニシリン（５μg/mL）、ストレプトマイシン（５μg/mL）およびファンギゾン（200ng/mL）を加えた最小基本培地（MEM）（ギブコ、BRL）で培養して増殖させた。平行して培養したMCF7細胞を、10μM 4HPR；１μM 4HPR；１μM RA；１μM RA＋10μM 4-HPR；または１μM RA＋１μM 4-HPRで12時間処置した。12時間処置終了後、TRIzol試薬を用いて細胞から総RNAを抽出した（製造元−ギブコの概要通り）。総RNA調製物中のP450RAIメッセージは、ノザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。ブロットの各レーンにRNAの同等量を加えたことの対照とするために、GAPDH cDNAに対応するプローブを用いてブロットを再度調べた。結果は、4-HPR処置のみがP450RAIメッセージを誘導しないことを示している。予想されたように、MCF7細胞をRA処置すると、インキュベート12時間後にP450RAIメッセージの顕著な誘導が起こる。しかし、10μM 4-HPRの存在下で細胞をRAにより処置すると、P450RAI誘導の顕著な抑制が起こる。
実施例13
レチノイン酸の存在下でのP450RAI発現
図18は、MCF7乳房上皮腺癌細胞を１μM全トランス型レチノイン酸で処置後のチトクロームP450RAIの発現の時間経過を示す。このノザンブロット分析において、総RNAを表示の時点で抽出し、ニトロセルロースに移して、１％アガロース、0.66Mホルムアルデヒドゲル中で電気泳動した。次に、mRNAを同等量加えていることの対照とするために、ニトロセルロースを放射性標識ヒトチトクロームP450RAI cDNAまたはGAPDH cDNAをプローブとして調べた。これにより、レチノイン酸と共に３時間インキュベートした後ではMCF7細胞は高レベルのP450RAIメッセージを発現し、暴露の12時間後ではメッセージは急激に減少することが示されており、これは誘導されたP450RAI蛋白質の代謝活性が周囲の培地中の活性レチノイン酸濃度を減少させていることを示している。このことから、MCF7細胞におけるP450RAIの誘導が自己制御性ネガティブフィードバックループを形成することが強く示唆される。
実施例14
レチノイン酸およびケトコナゾールの存在下でのP450RAI発現
図19は、広域スペクトルのチトクロームP450阻害剤であるケトコナゾールのP450RAI発現に及ぼす作用を調べることを除いては、図18に記述の結果と同様の、MCF7細胞におけるP450RAI mRNA発現の時間経過を示す。ケトコナゾールの非存在下では、図19のレーン１〜５は、図18に示される時間経過と同様の時間経過を示している。１μMケトコナゾール（初回処置後12時間毎に新鮮なものと取り替える）に暴露した細胞では、チトクロームP450RAIメッセージが24および48時間で高レベルで検出可能であることは、レチノイン酸の分解をチトクロームP450阻害剤が阻害できること、およびケトコナゾールの非存在下でのP450RAIメッセージの急激な減少に、P450RAI代謝が関与している可能性があることを示している。実施例はP450RAI阻害剤の同定法を図示している。
実施例15
Am580の存在下でのP450RAI発現
図20は、レチノ安息香酸誘導体であるAm580と全トランス型レチノイン酸との間で比較を行ったことを除いては、図18での記述と同様のMCF7細胞におけるP450RAI mRNA発現の時間経過を示す。レチノイン酸は、図20、レーン１〜４にP450RAIメッセージ誘導の典型的な時間経過を示す。Am580はレチノイン酸による処置後に認められたレベルと同等のP450RAIメッセージを誘導する。特に、レチノイン酸処置細胞では、P450RAIメッセージが24〜48時間の間に急激に減少するが、Am580処置細胞におけるP450RAIのレベルはこの時点では高いままである。このことは、合成レチノイドであるAm580がこれらの細胞における代謝に弾力性を示すことを示し、治療的用途を目的としたそのような化合物同定の有用性を示している。例えば、急性前骨髄性白血病において認められる、レチノイン酸代謝の増加によるレチノイン酸処置に対する耐性［ワレル（Warrell）、1994］は、代謝抵抗性レチノイドによる処置によって回避される可能性がある。P450RAI蛋白質は、これらのタイプの化合物のスクリーニングに有用な物質となる可能性がある。
実施例16
P450RAIに対するモノクローナル抗体
P450RAIに特異的なモノクローナル抗体（Mab’s）は、例えば、RAを代謝する正常および腫瘍組織の同定の際のP450RAI蛋白質レベルの測定のような診断目的に、有用である。これらの抗体を産生するために、精製P450RAI蛋白質を調製する。ヒトP450RAI蛋白質は、ベクターpGEX2（ファルマシア社）を用いてグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合蛋白質として細菌細胞に産生される。これにより、GSHアフィニティクロマトグラフィーによる融合蛋白質の精製が可能となる。もう一つのアプローチにおいて、P450RAIは細菌のマルトース結合ドメインとの融合蛋白質として発現される。このように融合蛋白質は、抽出物をアミロース樹脂カラムを通過させてマルトースとの融合蛋白質を溶出させることによって細菌抽出物から回収する。この融合構築物に関しては、ニューイングランドバイオラブスから販売されているベクターpMalC2を用いる。このベクターは過去に、例えば、機能的試験および受容体特異的抗血清の産生の際に高収率で回収された核受容体蛋白質を過剰発現するために用いられたことがある［オオノ（Ohno）、1993］。第二の融合蛋白質の調製もまた、Mab’sの予備的スクリーニングにおいて有用である。
P450RAI蛋白質を認識するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマの作製は以下のように実施する：BALB/cマウスに蛋白質／アジュバントを１ヶ月間隔で３回腹腔内注射し、最後の注射は細胞融合の直前に尾静脈に行った。脾細胞を回収して、標準的なプロトコル［ケネット（Kennett）、1979；ミルスキー（Mirski）、1989］に従ってポリエチレングリコール4000を用いて、NS-1骨髄腫細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州）と融合させた。細胞融合プロセスは下記により詳細に記述するように実施する。
融合細胞は、フィーダー層として腹腔滲出細胞および放射線照射したBALB/cマウスの脾細胞と共に96ウェルプレートに播種し、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT培地）による選別を行った。
ELISAアッセイを初回スクリーニング技法として用いる。精製P450RAI（融合蛋白質から開裂）１〜10μgのPBS溶液を用いて個々のウェルをコーティングし、ハイブリドーマ上清50〜100μl／ウェルをインキュベートする。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体を比色アッセイに用いる。
二次スクリーニングとして、乳房上皮癌MCF-7細胞をP450RAI測定源として用いる。上記のように、無処置のMCF-7細胞はP450RAIメッセージの検出可能な発現を示さず、また検出可能なRA代謝活性を示さないが、RA処置細胞では両者の急速かつ顕著な誘導が認められる。無処置MCF-7細胞はこのように、バックグラウンドの陰性対照としての役割を果たす。MCF-7細胞をアッセイの１日前に96ウェルに分注する。細胞を固定してメタノールで透過性にする。ハイブリドーマ上清を加えてフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗マウス抗体を用いて標準的な蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングする。
陽性ハイブリドーマを限界希釈によってクローニングし、凍結および抗体産生用に大規模に増殖させる。様々な陽性ハイブリドーマを、異なる種からのP450RAI蛋白質との交叉反応性と共に、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学における有用性に関して選別する。
選別したMab’sは、培養細胞および組織におけるRA処置後のP450RAI蛋白質の発現レベルのモニターに有用である。P450RAI蛋白質発現は、特定の腫瘍がRA処置に反応するか否かを決定するための予後的指標となる可能性がある。ベースラインRA代謝にも被験者間で広い多様性があり、RA代謝が高速である被験者は、肺の扁平上皮癌または大細胞癌の発生率が高いことを示唆する証拠がある［リガス（Rigas）、1996］。有用な抗体の特徴付けを行った後、これらの抗体を用いて腫瘍組織試料のP450RAI発現を調べる。
マウスハイブリドーマ作製のためのプロトコル
融合。フィーダー細胞（脾臓および腹腔滲出細胞）を播種する。融合の24〜48時間前、マウス骨髄腫細胞から薬物（8-アザグアニン20μg/ml）を除去し、計数して細胞が少なくとも50×10⁶個存在することを確認する。PEG4000２gをガラスチューブに入れて15分間オートクレーブし、使用するまで60℃に維持する、または室温で保存して必要時に60℃の温浴中で再溶解させる。
BALB/cマウスを望ましいスケジュールで免役する。最後の注射は尾静脈に静脈内注射する。免役した脾細胞の融合は、静脈内注射の３または４日後に行う。各動物の脾臓を個別に採取する；望ましければ、眼、血清をELISA用に採取する。
テフロン乳棒を用いて単細胞懸濁液を調製し、結合組織をデカントする。懸濁液を血清不含培地で１回洗浄する。各脾臓は約10×10⁶個の細胞を含む。骨髄腫細胞を回収し、計数して血清不含培地で洗浄する。
次に細胞を融合する。水または血清不含培地（37℃）を加えた小さいビーカーを用意し、PEGを50〜60℃に溶解する。免役した脾細胞および骨髄腫細胞を50ml TCチューブで混合（推奨混合比は１：１〜２：１）し、血清不含培地で細胞を１回洗浄する。上清を注意深く捨てる。予め暖めた血清不含培地2.4mlを溶解したPEGに加えて直ちにピペッティングして混合し、温水を入れたビーカーで37℃に維持する。PEGは薄いピンク色になるはずである。もし黄色になれば、別のアリコットを用いること。PEG 0.5〜1.0mlを１分間かけて細胞ペレットに滴下してチューブを静かに旋回させるか、または十分に混合できるよう静かに攪拌する。加えたピペットの先端を細胞のペレット上に直接載せる。チューブを37℃の温浴中で３mlピペットの鋭利でない先端で90秒間静かに旋回させ、チューブを静かに旋回させながら温血清不含培地10mlを６〜10分かけて徐々に加え、容量を20〜50mlとする。チューブを37℃で少なくとも20分維持して細胞融合を得て、次に細胞を血清不含培地で２回洗浄する。細胞を遠心して、予め暖めた培地＋10〜20％FBS 100mlに静かに再懸濁する。96ウェルプレートに100μl/ウェルを播種する。１つの脾臓が100×10⁶個の骨髄腫融合パートナーと融合すると仮定すると、プレート約10枚が必要である。翌日に培地100μlを除去して２×HAT培地100μl100μlを加えた。１×HAT培地で１〜３週間培養した後、HT培地（すなわちHAT培地を1/2量除去し、等量のHT培地を加える）で培養する。
腹腔滲出液および脾臓フィーダー細胞の調製。屠殺したマウスに70％アルコールをスプレーし、皮膚に切れ目を入れて、腹膜を切断しないように注意して引き裂く。腹膜を鉗子で持ち上げ、針を挿入する；血清不含培地５mlをゆっくり注射する。腹部をマッサージして、液体を徐々に吸引し、滅菌チューブに採取して氷中で維持する。容量を５mlにする。脾臓を採取し、血清不含培地を含む滅菌チューブに入れる。滅菌したテフロン乳棒で脾臓を丁寧に細切する。凝集物を沈降させ、繊維芽細胞の増殖を最小限にとどめるために、結合組織が混入しないように細胞をきれいなチューブにデカントする。試料を4500Rで放射線照射する。細胞を血清不含培地で１回洗浄し、96ウェルプレートに加え［脾臓１個／プレート10枚（約２〜５×10⁶個/ウェル）および腹腔滲出細胞懸濁液（PECS）（＜３×10³個/ウェル）を全量で100μl/ウェル］、使用する準備ができるまで37℃でインキュベートする。それらは滅菌チューブに入れて４℃で一晩保存することができる。
考察
上記のように450RAI、mP450RAIおよびhP450RAI配列を比較することが可能である。zP450RAIのアミノ酸492個（配列番号：２）のうち、アミノ酸334個をhP450RAIのアミノ酸497個（配列番号：４）と整列することが可能である。図９を参照のこと。これに基づくと、ヒトと魚の蛋白質の間には約68％の相同性が存在する。２つのアミノ酸配列の相同性の程度は、N-末端領域よりC-末端領域に向かってわずかに大きい。また、保存配列メチオニン-リジン-アルギニン-グルタミン-リジン（zP450RAIのアミノ酸番号70〜74）をコードする核酸配列をプローブとして用いて、他の種のcDNAライブラリから対応する蛋白質を得ることができるのように思われる。ヒトとマウスのP450RAI配列のアミノ酸同一性は93％以上である。
上記のように、本明細書に記述の細胞による蛋白質のRA誘導発現は、それが調節するDNAのコード配列の上流に位置する調節配列を含む。天然に起こるように、ゼブラダニオ、ヒト、マウスまたは他の生物の細胞であれ、蛋白質はP450RAIである。そのような細胞は、ルシフェラーゼをコードするDNAに関して上記に例示するように、P450RAIをコードする遺伝子の領域に異なる蛋白質をコードするDNAを組み込むことによって修飾することができる。このように、本発明の局面は、RAの存在に反応し、蛋白質コード配列に機能的にリンクし、従来の遺伝子操作した蛋白質産生細胞に組み込まれた制御DNA配列である。望ましい蛋白質の産生は、細胞をRAに暴露することによって誘導することができる。
細胞性RA誘導P450RAI産生を阻害するアンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチド（RNAまたは好ましくはDNA）を用いて、P450RAIによるRAの代謝を阻害することができる［モニア（Monia）、1996］。典型的に15〜20塩基の長さであるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、結合したmRNAの蛋白質への翻訳を阻害することができる、関係蛋白質をコードするセンスmRNAまたはプレmRNA領域に結合する。このように、hP450RAIをコードするcDNA配列を用いて、共に大きい部分に及ぶ一連のオリゴヌクレオチド、または全cDNA配列すらデザインすることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、蛋白質の発現に及ぼす最大の阻害効果を示すか否かを調べるために試験することができる［スチュワート（Stewart）、1996］。これは、様々なオリゴヌクレオチドに細胞を暴露し、hP450RAI活性におけるその後の変化を測定することによって、またはP450RAI合成の阻害に関してスクリーニングするために抗体を用いることによって、行うことができる。最も適したmRNA標的部位は、開始コドンと共に5’-および3’-非翻訳領域を含む。他の領域は多かれ少なかれ有効であることが判明するかもしれない。またはアンチセンス核酸またはオリゴヌクレオチドは、P450RAI DNAコードまたは調節配列に結合してもよい。
核酸レベルでP450RAI遺伝子発現を阻害することによってRA代謝を減少させるよりむしろ、例えば、適した小分子またはモノクローナル抗体のような物質に結合させることによってP450RAI蛋白質の活性を直接阻害してもよい。
このように、本発明はレチノイン酸誘導可能蛋白質の活性に及ぼすそれらの効果に関して薬物をスクリーニングする方法を含む。方法は、蛋白質を可能性がある阻害剤に暴露し、蛋白質活性に及ぼす効果を測定することを含む。測定された活性は、レチノイド、特に全トランス型レチノイン酸のヒドロキシル化、またはレチノイン酸、特に全トランス型レチノイン酸のそのβ-イオノン環の４位でのヒドロキシル化であってもよい。ヒトでの使用を目的とした薬物をスクリーニングするためには、hP450RAI自身がそのような薬物の有効性の試験に特に有用である。可能性がある薬物はまた、阻害されないことが望ましい他のP450チトクローム活性の阻害に関して試験することもできる。このように、他のP450と比較して選択的にhP450RAIを阻害する薬物を特定することができる。
可能性があるP450RAI蛋白質阻害剤をスクリーニングするもう一つの系は、その中にリポーター遺伝子（例えば、β-ガラクトシダーゼ、蛍のルシフェラーゼ等）およびP450RAIのDNAを組み込み、その中で両遺伝子の発現が細胞をRAに暴露することによって誘導可能である、安定的にトランスフェクトされた細胞系を含む。リポーター遺伝子の発現は、発現系の誘導に関する測定値となり、したがって、存在するRA量の指標となる。細胞をRAに暴露するとRA代謝が起こり、時間と共に、リポーター蛋白質によって示されるそのような代謝誘導の程度は減少する。RAのP450RAI代謝を阻害する薬物の存在下で細胞をRAに暴露すると、RA代謝の減少が起こるが、P450RAI代謝を阻害しない薬物の存在下で細胞をRAに暴露しても、RA代謝は影響を受けない。このように、RAのみの存在下でのリポーター遺伝子の発現と、RAおよび可能性がある阻害剤双方の存在下での発現とを比較すると、P450RAI蛋白質によるRAの代謝阻害における薬物の有効性に関する測定値が得られる。
P450RAI蛋白質の可能性がある阻害剤をスクリーニングするための１つの系は、内因性P450RAI遺伝子が存在しない、もしくは機能的でない、または発現されていない細胞系を含む。この細胞系において、RAに対する細胞系の暴露の結果、発現されたP450RAI蛋白質によるRA代謝が起こり、リポーター遺伝子誘導の程度が残存している活性RAに基づくように、チトクロームP450RAI発現ベクターおよびRA誘導可能リポーター遺伝子を組み込む。P450RAIの阻害剤を加えると、RAの代謝／分解速度が減少し、したがって、RA感受性リポーター遺伝子の活性化／誘導が増加する。
マウス、ヒトおよびゼブラダニオP450RAIプロモーター領域の保存が高度であると仮定すると、RAは３種全てのプロモーターにおいて保存されているRAREを含む転写メカニズムを通じて、P450RAI発現を制御する可能性が高い。これは、多くの細胞系におけるP450RAIの急激なRA依存的発現を示す試験によって支持される。P450RAIメッセージは強く誘導されるため、リポーター遺伝子はインビトロと共にインビボにおけるRA活性の有用な指標となる可能性がある。このように、リポーター遺伝子にリンクしたP450RAIプロモーターは、P450RAI誘導を遮断または阻害する能力を有するレチノイドまたはその他の化合物をスクリーニングするためのツールとなる。例えば、P450RAIリポーター遺伝子は、細胞を特定のレベルのレチノイドまたは他の薬物に暴露すると、濃度がリポーター遺伝子活性に反映されるように、細胞系に安定または一過性的に導入することができる。そのようなトランスフェクションアッセイは、例えばペトコビッチら［Petkovich、1987；オオノ（Ohno）、1994］が記述したアッセイと同様の方法で実施することができる。
このように本発明は、P450RAI蛋白質によるRA異化の可能性のある阻害剤のスクリーニング系を提供する。この系は、細胞をRAに暴露することによってその中での発現が誘導可能であるリポーター遺伝子、例えば、上記に例示のルシフェラーゼ遺伝子、のDNAが組み込まれたトランスフェクト細胞系を含む。この系では、P450RAI遺伝子は排除され、すなわちリポーター遺伝子はP450RAI遺伝子の本来のプロモーターの調節下にある。リポーター遺伝子の発現は発現系の誘導の測定値となり、したがって細胞のRAに対する暴露に反応して産生されたmRNA量の指標となる。発現系の誘導を阻害する薬物の存在下で細胞をRAに暴露すると、その薬物がRA異化の強力な阻害剤である、すなわちP450RAI遺伝子発現を阻害し、したがってRA代謝を阻害する物質の薬物としての有効性を測定できることが示される。
細胞性レチノイン酸結合蛋白質（CRABP）［アダムソン（Adamson）、1993］が、本発明のP450RAI蛋白質に対するレチノイド基質の結合に関係する可能性がある。CRABP、その誘導体、合成断片、または類似体の存在の効果はこのように、本発明のスクリーニング法によって決定することができる；RA代謝の増強におけるそのような薬物の有効性もまた決定することができる。
本明細に開示の蛋白質のレチノイド代謝活性に関与する構造を保持しながら、多様なアミノ酸置換が可能であることは、それによって本発明が制限されることなく、当然理解されると思われる。保存的置換は、例えば、米国特許第5,264,558号のような特許文献において記述されている。したがって、例えば、非極性脂肪族中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシンにおける相互交換が可能であろうと予測される。同様に、極性脂肪族中性アミノ酸であるセリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンにおける置換もおそらく可能であると考えられる。荷電塩基性アミノ酸であるリジンおよびアルギニンにおける置換と共に、荷電酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸における置換もまたおそらく可能である。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンを含む芳香族アミノ酸における置換もまた可能であると考えられる。これらの種の置換および互換は、当業者には周知である。その他の置換も当然可能である。当然のこととして、変異蛋白質と天然に生じる蛋白質との相同性、すなわち配列類似性の割合が高ければ、代謝活性の保持は大きくなることも予想される。当然のこととして、本明細に記述のP450RAIの活性を有する蛋白質変異体が本発明の範囲内であると解釈されるように、そのような変異体をコードする核酸も本発明の範囲内であると解釈される。
当技術分野で既知のように、蛋白質のキメラ型により、さらなる利点を得ることができる。したがって全蛋白質または蛋白質の一部をコードするDNA配列を、例えば融合蛋白質を製造するために、大腸菌β-ガラクトシダーゼのC-末端部分をコードする配列と結合させることができる。GST-CYPRAI融合蛋白質は、上記実施例において記述されている。ヒト呼吸器系合胞体ウイルス糖蛋白質FおよびGの発現系は、1994年２月22日に公表され、例示目的で本明細に参照として組み入れられる米国特許第5,288,630号に記述されている。
本発明の組換え発現ベクターは上記のようにプラスミドとなりうる。本発明の組換え発現ベクターはさらに、ウイルス核酸の中に導入された核酸の発現を可能にする、ウイルスまたはその一部であることができる。例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスを用いることができる。
本発明は、アンチセンス方向に発現ベクターをクローニングした本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、該DNA分子は、DNA分子の転写、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：31のヌクレオチド配列に対してアンチセンスであるRNA分子の転写によって発現が可能となるよう、調節配列に機能的に結合されている。様々な細胞タイプにおいてアンチセンスRNA分子の持続的な発現を指向する、アンチセンス核酸に機能的にリンクした調節配列、例えばウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーを選択することができ、またはアンチセンスRNAの組織または細胞タイプ特異的発現を指向するその他の調節配列を選択することができる。
本発明の組換え発現ベクターを用いて、組換え発現ベクターを含む形質転換宿主細胞を作製することができる。「形質転換宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞を含むものである。「で形質転換された」、「でトランスフェクトされた」、「形質転換」、および「トランスフェクション」という用語は、当技術分野で既知の多くの可能性のある技法の１つによって、１つの細胞内に核酸（例えば、ベクター）を導入することを含むものである。原核細胞は例えば、電気穿孔、または塩化カルシウム媒介形質転換によって核酸で形質転換することができる。核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降、DEAE-デキストラン-媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、または微量注射のような従来の技法によって哺乳類細胞内に導入することができる。宿主細胞の形質転換およびトランスフェクトに適した方法は既知である［サムブルック（Sambrook）、1989］。
上記のような技法による本発明の組換え発現ベクターによって形質転換された宿主細胞の数は、用いる組換え発現ベクターのタイプおよび用いる形質転換技法のタイプに依存する。哺乳類細胞に導入されたプラスミドベクターは、宿主細胞DNAに組み込まれる頻度が非常に低い。これらの組み込み体を確認するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）を含む遺伝子を一般的に関係遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーとしては、G418およびヒグロマイシンのような特定の薬物に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択マーカーは関係核酸とは異なるプラスミド上に導入することができるが、好ましくは同じプラスミド上に導入する。本発明の核酸を含む１つ以上の組換え発現ベクターおよび選択マーカーに対する遺伝子で形質転換された宿主細胞は、選択マーカーを用いて細胞を選別することによって確認することができる。例えば、選択マーカーがネオマイシン耐性を付与する遺伝子（pRc/CMVのような）をコードするならば、形質転換細胞はG418で選択することができる。選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存し、その他の細胞は死滅する。
本発明の特定の核酸は、「チトクロームP450RAIの生物活性を有する」蛋白質をコードする。チトクロームP450RAIの生物活性は、レチノイド酸化能である。そのような活性は上記のように試験することができる。
本発明はP450RAIの生物活性を有する精製蛋白質を提供する。「単離された」および「精製された」という用語は、組換えDNA技法によって作製された場合には、細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まない蛋白質、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない蛋白質を指す。特定の好ましい態様において、P450RAIの生物活性を有する蛋白質は、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：32としたアミノ酸配列を含む。または上記のように、配列番号：３、配列番号：５、もしくは配列番号：31としたヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる好ましい蛋白質は、本発明に含まれる。さらに、上記のようにストリンジェントな条件下で、配列番号：３、配列番号：５、または配列番号：31としたヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸によってコードされるP450RAIの生物活性を有する蛋白質もまた本発明に含まれる。本発明のP450RAIは当技術分野で既知の技法を用いて適した宿主細胞での発現によって得ることができる。適した宿主細胞には原核もしくは真核生物、または例えば、酵母、大腸菌、昆虫細胞およびCOS-1細胞のような細胞系が含まれる。上記のように、本発明の組換え発現ベクターを用いて、蛋白質を単離するために宿主細胞においてP450RAI活性を有する蛋白質を発現することができる。本発明は、蛋白質をコードする組換え核酸を宿主細胞に導入すること、宿主細胞において蛋白質を発現させること、および蛋白質を単離して精製することを含む、本発明の精製蛋白質を調製する方法を提供する。好ましくは組換え核酸は組換え発現ベクターである。蛋白質は、蛋白質を発現する宿主細胞から単離して、硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等）、電気泳動および最終的には結晶化を含む当技術分野で標準的な技法に従って精製することができる［全般的に、「酵素の精製と関連技術（Enzyme Purification and Related Techniques）」、Methods in Enzymology、22、237〜577（1971）を参照のこと］。
または、蛋白質またはその一部は、固相合成［メリフィールド（Merrifield）、1964］、または均一溶液中での合成［ホウベンシル（Houbenwcyl）、1987］のような蛋白化学において周知の技法を用いて化学合成によって調製することができる。
本発明の蛋白質またはその一部を用いて、蛋白質の特異的な抗体を調製することができる。特定の蛋白質の非保存領域における明確なエピトープに結合する抗体を調製することができる。蛋白質の非保存領域は、その他の蛋白質、例えば、チトクロームP450ファミリーのその他のメンバーと実質的な配列相同性を示さない領域である。従来の方法を用いて、抗体を作製することができる。例えば、P450RAI蛋白質のペプチドを用いて、標準的な方法によりポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を作製することができる。実施例16に示すように、哺乳類（例えば、マウス、ハムスター、またはウサギ）を、哺乳類において抗体反応を誘導するペプチドの免疫原性型で免疫することができる。ペプチドに免疫原性を付与する技法には、担体との結合または当技術分野で周知のその他の技法が含まれる。例えば、ペプチドはアジュバントの存在下で投与することができる。免疫の進行度は、血漿または血清中の抗体価の検出によってモニターすることができる。標準的なELISAまたはその他のイムノアッセイを用いて抗体のレベルを評価することができる。免疫後、抗血清を用い、必要に応じてポリクローナル抗体を血清から単離することができる。
モノクローナル抗体を作製するため、抗体産生細胞（リンパ球）を、免疫した動物から回収して、標準的な体細胞融合法によって骨髄腫細胞と融合し、したがってこれらの細胞を不死化して、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技法は当技術分野で周知である。例えば、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法［コズバー（Kozbor）、1983］、ヒトモノクローナル抗体を産生するEBV-ハイブリドーマ技法［コール（Cole）、1985］、および組み合わせ抗体ライブラリのスクリーニング［ヒューズ（Huse）、1989］のようなその他の技法、ならびにコーラー＆ミルスタイン（Kohler and Milstein）が最初に開発したハイブリドーマ技法［Kohler,1975］。ハイブリドーマ細胞は、ペプチドと特異的に反応する抗体の産生に関して免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離する。
本明細書で用いられる抗体という用語は、P450RAIの生物活性を有する蛋白質と特異的に反応するその断片、またはそのペプチド断片をも含むものである。従来の技法を用いて抗体を断片にすることができ、抗体全体について上記と同じ方法で断片の有用性に関してスクリーニングすることができる。例えば、F（ab’）₂断片は、抗体のペプシン処理によって作製することができる。得られたF（ab’）₂断片を処理してジスルフィド結合を還元すると、Fab’断片を作製することができる。
ヒト定常領域とのキメラ抗体分子を作製することも当技術分野で既知である。例えば、モリソンら、タケダら、キャビリーら、ボスら、タナグチら、テンら［Morrison、1985；Takeda、1985；Cabilly；Boss；Tanaguchi；Teng、1982］、欧州特許第0173494号、英国特許第2177096B号、国際公開広報第92/06193号、および欧州特許第0239400号を参照のこと。そのようなキメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりヒト被験者における免疫原性が低いであろうと予測される。
P450RAIの生物活性を有する蛋白質に対して反応する、特異的抗体、または抗体断片、またはそのペプチド断片を作製するもう一つの方法は、本発明の核酸分子から産生したペプチドを用いて、細菌において発現させた免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリをスクリーニングすることである。例えば、完全なFab断片、VH領域、およびFV領域は、ファージ発現ライブラリを用いて細菌で発現させることができる。例えば、ワードら、ヒューズら、およびマッカファーティら［Ward、1989；Huse、1989；McCafferty、1990］を参照のこと。そのようなライブラリの例えばP450RAIペプチドによるスクリーニングにより、P450RAIと反応する免疫グロブリン断片を特定することができる。または、ゲンファーム社（Genpahrm）が開発したSCID-huマウスを用いて、抗体またはその断片を作製することができる。
ポリクローナル、モノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体を用いて、様々な生物材料において本発明の蛋白質、その一部、またはその密接に関連するイソ型を検出することができる、例えば、それらはELISA、ラジオイムノアッセイ、または組織化学試験において用いることができる。このように、特定の細胞事象または病理状態におけるP450RAI蛋白質の役割を明らかにするために、抗体を用いて、試料中の本発明のP450RAI蛋白質、その一部、または密接に関連したイソ型を定量することができる。本明細書において先に記述した方法を用いて、P450RAIの非保存領域に対するポリクローナル、モノクローナル抗体、またはキメラモノクローナル抗体を作製することができ、他の蛋白質と特定のP450RAIを区別するために用いることができる。
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、検出可能な物質またはリポーター系にカップリングすることができる。「カップリングされた」という用語は検出可能な物質が抗体に物理的にリンクしていることを意味するために用いられる。適した検出可能な物質には、様々な酵素、補綴物、蛍光材料、発光材料および放射性材料が含まれる。適した酵素の例には、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれる；適した補綴物複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる；適した蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、およびフィコエリスリンが含まれる；発光材料の例には、ルミノールが含まれ；および適した放射性材料の例には¹²⁵I、¹³¹I、³⁵Sおよび³Hが含まれる。好ましい態様において、リポーター系は存在する蛋白質（抗原）量の定量を可能にする。
そのような抗体にリンクしたリポーター系は、被験者の体液または組織試料に欠損量または過剰量の蛋白質が含まれるか否かを決定する方法において用いることができる。したがって所定のタイプの被験者に関してそのような蛋白質の正常閾値濃度を設定すれば、試験キットを開発することができる。
本発明により、当業者は二重特異性抗体および４量体抗体複合体を調製することができる。二重特異性抗体は、ハイブリッドハイブリドーマの形成によって調製することができる［スターズ（Staerz）、1986 a＆b］。
本発明はレチノイドに関連する３つのタイプの化合物を含む：P450RAIの酵素活性を阻害し、それによってRAの代謝を阻害する化合物；P450RAI、例えば上記に示すAm580による代謝を回避するレチノイド；および例えば上記の4-HPRのようにP450RAI遺伝子発現の誘導を抑制する化合物。
本発明の組成物は、インビボでの薬物投与に適した生物学的適合型で被験者に投与される。「インビボでの投与に適した生物学的適合型」という用語は、組成物の治療効果が何らかの毒性効果を上回る、投与する組成物の型を意味する。「被験者」という用語は、望ましい治療反応を誘導することができる生体、例えば哺乳類を含むものである。被験者の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種が含まれる。本発明の治療的組成物の治療的活性量の投与は、望ましい結果を得るために必要な用量および期間での有効量と定義される。例えば、P450RAI蛋白質によるRAの異化を阻害する化合物の治療的活性量は、標的組織および輸送方法と共に、個人の疾患の状態、年齢、性別、および体重のような要因によって変化しうる。投与レジメは、最適な治療反応が得られるよう調整できる。例えば、治療状況の緊急性によって示されるように、用量をいくつかに分割して毎日投与してもよく、または用量を比例的に減少させてもよい。
本発明の化合物は、P450RAI酵素によるRAの代謝を阻害することが判明した化合物、および抗癌剤として有用な化合物、ならびにレチノイン酸が有用である皮膚疾患の治療、軽減、または予防において有用な化合物のように、例えば局所的に用いてもよい。この点において、上皮細胞における腫瘍の促進に対する予防、ならびに魚鱗癬、小胞状疾患、良性上皮疾患などの皮膚病、およびざ瘡、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎、非特異的皮膚炎等のような他の増殖性皮膚病皮膚疾患の治療として、ヒトを含む動物において前悪性段階の上皮細胞病変に対する治療を目的とする組成物にそれらを含めてもよい。
局所組成物は通常、液体、半固体、または固体の形状において薬学的に許容される担体と共に処方される。薬学的に許容される担体は、毒性を示さず、一般に不活性で、有効成分の機能性に有害な影響を及ぼさない材料である。そのような材料は周知であり、薬学的製剤技術において時に希釈剤または溶媒（賦形剤）と呼ばれる材料が含まれる。担体は本質的に有機であっても無機であってもよい。薬学的に許容される担体の例は、水、ゼラチン、乳糖、デンプン、鉱物油、ココアバター、デキストロース、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、ゴム、アカシア、アルギン酸塩、セルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン、および他の一般的に用いられる薬学的担体である。有効成分および担体に加えて、製剤は香料、着色剤、濃化剤またはゲル化剤、乳化剤、湿潤剤、緩衝液、安定化剤、および抗酸化剤のような保存剤を含んでもよい。
特定の組成物は腸内に投与してもよい。経口投与に関しては、適した形状は例えば、錠剤、丸剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、溶液、粉末および顆粒である。
抗腫瘍剤または抗腫瘍製剤の一部として、例えば本発明の化合物は、全トランス型レチノイン酸のように、様々な腫瘍の治療に用いられるレチノイドと同様の方法で用いることができる。投与すべき用量は１回投与であれ、複数回投与または毎日投与であれ、当然のこととして有効成分の異なる強度、選択した投与経路、賦形剤の大きさ、腫瘍のタイプ、および患者の疾患の特性のために、用いる特定の化合物によって変化する。投与量は、確定した範囲内に従属するわけではないが、それは通常有効量、または望ましい薬理学的および生理学的効果を得るために、有効薬物の代謝的放出に基づいて投与剤形から生成された薬理学的に活性な遊離型のモルベースでの等量であると考えられる。癌治療の当業者である腫瘍学者は、過度の実験を行うことなく、本発明の化合物の有効な投与に関する適当なプロトコルを確認することができると思われる。
P450RAI蛋白質の生物活性を有する蛋白質をコードする核酸を用いて、次に、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用となる、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製することができる。トランスジェニック動物（例えば、マウス）とは、動物または動物の祖先に、出生前、例えば胚芽の段階で導入遺伝子を組み込んだ、導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子はそこからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれるDNAである。１つの態様において、配列番号：５に示すヌクレオチド配列、または適当な変異体もしくはサブ配列を含むヒトP450RAI cDNAを用いて、ヒトP450RAI蛋白質を発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作製する方法は、例えば、米国特許第4,736,866号および第4,870,009号に記述されている技術分野では常套手段となった。好ましい態様において、本発明の組換え分子を含むプラスミドをマウス胚に微量注射する。特に、プラスミドは、単細胞マウス受精卵の雄性前核に微量注射する；注入した卵を偽妊娠代理雌性マウスに注入する；および代理雌性マウスにおいて卵を満期まで発生させる［ホーガン（Hogan）、1986］。または、胎児幹細胞をP450RAI活性を有する蛋白質をコードする核酸を含む発現ベクターでトランスフェクトすることができ、核酸を含む細胞を用いて適したレシピエントマウス系統からの胚との集合キメラを形成することができる。次にキメラ胚を適当な系統の適した偽妊娠雌性マウスに植え込み、胚を満期まで発生させる。その生殖細胞にトランスフェクトされたDNAを有する子孫を用いて、均一にトランスジェニックマウスを飼育することができる。
典型的に、特定の細胞は、遺伝子をコードするP450RAIと機能的に結合した組織特異的エンハンサーを用いることによって、P450RAI導入遺伝子取り込みの標的となると考えられる。例えば、選択的に心筋細胞において機能的にリンクした遺伝子の発現を指向するプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いて、心筋組織において選択的にP450RAI蛋白質を発現するトランスジェニック動物を作製することができる。適したプロモーターおよびエンハンサーの例は、心ミオシンおよび心アクチンの遺伝子発現を制御するものを含む。胚芽期に動物の生殖系に導入されたP450RAI導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を用いて、様々な組織におけるP450RAI発現の増加の効果を調べることもできる。
トランスジェニックマウスにおける本発明の組換え型分子発現のパターンおよび程度は、両遺伝子が同時に転写されて多シストロン性mRNAを形成するように組換え分子とリポーター遺伝子とを融合させることによって促進される。リポーター遺伝子はサムブルックら［Sambrook、1989］が記述したように、従来の方法を用いて組換え分子の中に導入することができる。本発明の蛋白質およびリポーター蛋白質をコードする多シストロン性mRNAの両シストロンの効率的な発現は、ボリオウイルスmRNAに存在する場合のように、既知の内部翻訳開始配列を含めることによって得ることができる。リポーター遺伝子は本発明の組換え分子の調節配列の調節下にあるべきで、したがって、本発明の蛋白質をコードする遺伝子発現のパターンおよび程度は、リポーター遺伝子の表現型をアッセイすることによって決定することができる。リポーター遺伝子は好ましくは、宿主細胞が示さない表現型をコードしており、その表現型を定量的にアッセイすることができる。適したリポーター遺伝子の例はlacZ（β-ガラクトシダーゼ）、neo（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、CAT（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）、dhfr（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、aphlV（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、lux（ルシフェラーゼ）、uidA（β-グルクロニダーゼ）を含む。好ましくは、リポーター遺伝子はβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZである。β-ガラクトシダーゼは、β-ガラクトシダーゼによって開裂を受けて青色の産物を生じる乳糖類似体X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-Dガラクトピラノシド）を用いてアッセイすることができる［オールド（Old）］。
開示の好ましい態様において用いられる実験動物はマウスであるが、本発明はこれに制限されるべきではない。例えば、ラット、ハムスター、ウサギおよびヒツジのようなその他の種を用いることが望ましいこともある。
本発明のトランスジェニック動物を用いて、RA代謝の分子的基礎を調べることができる。本発明のトランスジェニック動物を用いて、物質がRA代謝を防止する、遅らせる、または増強するか否かを試験することもできる。無処置対照トランスジェニック動物と並行して、トランスジェニック動物を、その物質で処置することができる。
本発明のトランスジェニック動物からの細胞は、標準的な組織培養技法を用いて培養することができる。特に、本発明の組換え分子を有する細胞を培養して、これを用いて物質がRA代謝を防止する、遅らせる、または増強するか否かを試験することができる。
さらに、P450RAI活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のヒト以外の相同体を用いて、P450RAI遺伝子が欠損または変化している「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、確立された技法を用いて、マウスゲノムP450RAI DNAの一部（例えば、エキソン）を欠失させるか、または組み込みのモニターに用いることができる選択マーカーをコードする遺伝子のような、別の遺伝子と置換することができる。次に、変化したP450RAI DNAを胎児幹細胞系にトランスフェクトすることができる。変化したP450RAI DNAは、特定の細胞において内因性P450RAI遺伝子と相同的に組換えし、変化した遺伝子を含むクローンを選択することができる。変化した遺伝子を含む細胞を、マウスのような動物の胚盤胞に注入し、トランスジェニック動物に関して記述したように集合キメラを作製する。キメラ胚を上記のように植え込む。変化した遺伝子の子孫動物の生殖系への伝達は標準的な技法を用いて確認することができ、この動物を用いて、変化したP450RAI遺伝子を全ての細胞に有する動物を飼育することができる［レモイン（Lemoine）、1996］。したがって、機能的P450RAI蛋白質を発現できないノックアウト動物を作製することができる。そのようなノックアウト動物は例えば、P450RAI蛋白質の非存在下で薬物の有用性を調べるために用いることができる。
本発明のアンチセンス核酸およびオリゴヌクレオチドは、P450RAI活性を有する蛋白質をコードする核酸（例えば、mRNA）の発現の阻害に有用である。P450RAI活性を有する蛋白質は細胞上で作用することができる薬物、例えばRA、の代謝と関連しているため、そのような蛋白質の発現が減少すれば、そのような薬物に対する細胞の感受性が増加することがありうる。アンチセンス核酸はP450RAI発現を阻害するために薬物耐性培養細胞に導入することができる。オリゴヌクレオチドのような１つ以上のアンチセンス核酸は、典型的には例えば200μg/mlで培養培地中の細胞に加えることができる。
したがって、本発明のアンチセンス核酸またはそのオリゴヌクレオチドは、被験者におけるレチノイン酸またはその他のレチノイド耐性を修正または予防する遺伝子療法において用いることができる。例えば、アンチセンス配列を用いて、レチノイン酸またはその他のレチノイド耐性悪性細胞を、化学療法剤に対して感受性にすることができる。アンチセンス核酸の被験者への投与は、アンチセンス核酸が、アンチセンスRNAの持続的な産生を可能にする組換え発現ベクターに含まれる場合には、より効果的となる可能性がある。アンチセンス核酸またはそのオリゴヌクレオチドを含む組換え分子は、リポソーム、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびDNAウイルスベクターのような輸送媒体を用いて、インビボでの肺組織を含む組織に直接導入することができる。被験者中の関係細胞を標的とすることができる輸送媒体を選択することができる（例えば、レチノイド耐性腫瘍細胞）。アンチセンス核酸はまた、エクスビボでウイルスベクターまたは微量注射および電気穿孔のような物理的技法、または共沈降およびDNAのリポソームへの組み込みのような化学的方法を用いて、造血系の細胞のように単離された細胞に導入することができ、そのような細胞はドナーに戻すことができる。組換え分子はエアロゾルの形または洗浄によって輸送することができる。
したがって、本発明は、配列番号：２、配列番号：32、または特にヒト細胞の場合には配列番号：４とする蛋白質をコードする核酸に対してアンチセンスである核酸を耐性細胞に導入することによって、耐性細胞のレチノイン酸または他のレチノイド耐性を阻害する方法を提供する。
本発明の核酸をさらに用いて、mRNAのようなP450RAI活性を有する蛋白質をコードする一本鎖核酸を開裂することができるリボザイムをデザインすることができる。本発明の核酸の配列に基づいてP450RAIコードmRNAの特異性を有するリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA（リボザイム）をデザインすることができる。例えば、活性部位の塩基配列がP450RAIコードmRNAにおいて開裂を受ける塩基配列と相補的であるテトラヒメナL-19IVS RNAの誘導体を構築することができる［チェク（Chech）a＆b］。または、本発明の核酸を用いて、RNA分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的RNAを選択することができる［バーテル（Bartel）、1993］。
本発明の単離された核酸およびアンチセンス核酸を用いて、すでに記述したように組換え発現ベクターを構築することができる。これらの組換え発現ベクターは、すでに記述したように、組換え発現ベクターを含む形質転換宿主細胞の作製、本発明の核酸によってコードされる蛋白質の発現、および本発明の蛋白質の単離に有用である。本発明の単離された核酸およびアンチセンス核酸を用いて、すでに記述したトランスジェニックおよびノックアウト動物を構築することもできる。
本発明の単離された蛋白質はすでに記述したようにP450RAI活性を有する蛋白質に対して反応する抗体を作製するために有用である。または本発明の抗体は標準的な免疫アフィニティ技法による本発明の蛋白質の単離に用いることができる。さらに、二重特異性抗体を含む本発明の抗体は、診断目的に有用である。
配列番号：４に示すアミノ酸配列を含む蛋白質に結合する分子はまた、分子を取り込んだ、蛋白質を発現する細胞を死滅させる方法において用いることができる。好ましくは細胞は、腫瘍細胞である。そのような細胞の破壊は毒性または治療活性を有する物質で分子を標識することによって得ることができる。本明細書で用いられる「毒性または治療活性を有する物質」という用語は、細胞障害性細胞のように、その作用により細胞を破壊することのできる細胞と共に、放射性同位元素、毒素（例えば、ジフテリア毒素またはリシン）、または化学療法剤のような、その作用により細胞を破壊できる分子を含むものである。P450RAIに結合する分子は、毒性または治療活性を有する物質に直接カップリングすることができ、または物質に間接的にリンクすることができる。１つの例において、細胞によって取り込まれた分子の毒性はP450RAI活性によって活性化される。
本発明はまた、例えば、腫瘍細胞の試料と共にインキュベートするため、配列番号：４に示すアミノ酸配列を含む蛋白質、非反応性蛋白質、もしくは非結合性蛋白質に結合する分子を含む腫瘍細胞を同定するための診断キット；蛋白質に結合した分子を検出するための手段；試料中の蛋白質量を測定する手段；および試料中の蛋白質量を標準物質と比較するための手段を提供する。好ましくは分子はモノクローナル抗体である。本発明のいくつかの態様において、P450RAIに結合する分子の検出可能性は該結合（例えば、蛍光スペクトルの変化、放射性同位元素標識の消失）によって活性化される。診断キットはまた、キット使用のための手引きマニュアルを含むことができる。
本発明はさらに、配列番号：３に示す配列またはそのオリゴヌクレオチド断片と相補的なヌクレオチドプローブを含む腫瘍細胞を特定するための診断キット、例えば、腫瘍細胞の試料からのmRNAとのハイブリダイゼーションのための手段；標準と共に、試料中のmRNAと結合したヌクレオチドプローブを検出する手段を提供する。診断キットはまた、キット使用のための手引きマニュアルを含むことができる。
当業者は単なるルーチン実験を用いて、本明細書に記述の本発明の特殊な態様の多くの同等物を確認することができるであろう。そのような同等物は以下の請求の範囲に含まれると解釈される。
参考文献
上記で引用された参照の詳細について以下に提示する。列挙される参考文献は全て、参照として本明細書に組み入れられる。

配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：QUEEN’S UNIVERSITY AT KINGSTON
（B）街路名：
（C）市名：Kingston
（D）州名：Ontario
（E）国名：CA
（F）郵便番号：K7L 1J7
（A）名称：PETKOVICH,P. Martin
（B）街路名：875 Everitt Avenue
（C）市名：Kingston
（D）州名：Ontario
（E）国名：CA
（F）郵便番号：K7M 4R1
（A）名称：WHITE,Jay A.
（B）街路名：913 Purcell Crescent
（C）市名：Kingston
（D）州名：Ontario
（E）国名：CA
（F）郵便番号：K7P 1C1
（A）名称：BECKETT,Barbara R.
（B）街路名：112 Westmorland Road
（C）市名：Kingston
（D）州名：Ontario
（E）国名：CA
（F）郵便番号：K7M 1J7
（A）名称：JONES,Glenville
（B）街路名：66 Inverness Crescent
（C）市名：Kingston
（D）州名：Ontario
（E）国名：CA
（F）郵便番号：K7M 6N7
（ii）発明の名称：レチノイド代謝蛋白質
（iii）配列数：38
（iv）コンピュータ読み取りフォーム：
（A）メディア形式：Diskette,3 1/2 inch,1.4 Mb storage
（B）コンピュータ：COMPAQ,IBM PC compatible
（C）運転システム：MS-DOS 5.1
（D）ソフトウェア：WORD PERFECT
（v）現出願データ：
出願番号：
（vi）親出願データ：
（A）出願番号：US 08/667,546; US 08/724,466
（B）出願日：21-JUN-1996; 01-OCT-1996
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：337塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１：

（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：492アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トボロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２：

（3）配列番号：３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1850塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３：

（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：497アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：４：

（2）配列番号：５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1494塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポＲジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：５：

（2）配列番号：６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：６：

（2）配列番号：７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：７：

（2）配列番号：８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：８：

（2）配列番号：９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：９：

（2）配列番号：１０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：20アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１０：

（2）配列番号：１１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：351塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１１：

（2）配列番号：１２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１２：

（2）配列番号：１３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１３：

（2）配列番号：１４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１４：

（2）配列番号：１５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１５：

（2）配列番号：１６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１６：

（2）配列番号：１７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１７：

（2）配列番号：１８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１８：

（2）配列番号：１９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：１９：

（2）配列番号：２０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２０：

（2）配列番号：２１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２１：

（2）配列番号：２２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２２：

（2）配列番号：２３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：14塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２３：

（2）配列番号：２４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：10塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２４：

（2）配列番号：２５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：10塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２５：

（2）配列番号：２６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：10塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２６：

（2）配列番号：２７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：10塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２７：

（2）配列番号：２８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：10塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２８：

（2）配列番号：２９の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：２９：

（2）配列番号：３０の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：12塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３０：

（2）配列番号：３１の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1725塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３１：

（2）配列番号：３２の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：497アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３２：

（2）配列番号：３３の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：273塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３３：

（2）配列番号：３４の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：274塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３４：

（2）配列番号：３５の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：319塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３５：

（2）配列番号：３６の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３６：

（2）配列番号：３７の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３７：

（2）配列番号：３８の情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：塩基対
（B）配列の型：核酸
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号：３８：

Claims (83)

1. 配列番号３又は５として示されるヌクレオチド配列に対して、50℃での約0.2×SSCの洗浄段階を包含する高い緊縮条件下でハイブリダイズし、そしてレチノイドを酸化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
2. 配列番号３又は５として示されるヌクレオチド配列に対して、50℃での約0.2×SSCの洗浄段階を包含する高い緊縮条件下でハイブリダイズし、そしてβ−ヨノン環の４−位でレチノイン酸をヒドロキシル化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
3. 配列番号２又は４として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列の同一性を有する、レチノイドを酸化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
4. 配列番号２又は４として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列の同一性を有する、β−ヨノン環の４−位でレチノイン酸をヒドロキシル化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
5. 配列番号２又は４として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列の同一性を有する、レチノイドを酸化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
6. 配列番号２又は４として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列の同一性を有する、β−ヨノン環の４−位でレチノイン酸をヒドロキシル化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
7. 配列番号３又は５として同定されるか、又は遺伝子コードの縮重によりコード領域における前記配列とは異なるヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。
8. 請求項７記載の核酸分子を含んで成るDNAから転写された、前記ヌクレオチド配列の全長である単離されたmRNA。
9. 組換えクローニングベクターに請求項７記載の核酸分子を含んで成る単離されたDNA。
10. 前記核酸分子が、魚ゲノム又はヒトゲノムの一部を含んで成るか、又は遺伝子コードの縮重のためにそれらとは異なる請求項１記載の核酸分子。
11. 前記核酸分子が、魚ゲノム又はヒトゲノムの一部を含んで成るか、又は遺伝子コードの縮重のためにそれらとは異なる請求項２記載の核酸分子。
12. 配列番号２又は４のアミノ酸配列を含んで成る蛋白質をコードする単離された核酸分子。
13. 前記レチノイドが、レチノール又はレチノイン酸である請求項１記載の核酸分子。
14. 前記蛋白質が、前記レチノイドのβ−ヨノン環の４−位で前記炭素を酸化する請求項１記載の核酸分子。
15. 前記レチノイドが、全トランス型レチノイドである請求項１記載の核酸分子。
16. 前記レチノイン酸が全トランス型である請求項２記載の核酸分子。
17. 請求項１記載の全長の核酸分子に対してアンチセンスである単離された核酸分子。
18. 請求項２記載の全長の核酸分子に対してアンチセンスである単離された核酸分子。
19. 配列番号３又は５として示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子に対してアンチセンスである単離された核酸分子。
20. 請求項１〜７及び10〜18のいずれか１項記載の核酸分子及び前記核酸分子に作用可能に連結される少なくとも１つの調節配列を含んで成る宿主細胞の形質転換のために適切な組換え発現ベクター。
21. 前記核酸分子が、前記コードされる蛋白質の発現を可能にするために、前記少なくとも１つの調節配列に対して作用可能に連結される請求項20記載の組換え発現ベクター。
22. 前記核酸分子が、前記核酸分子に対してアンチセンスであるRNA分子の発現を可能にするために、前記少なくとも１つの調節配列に対して操作可能的に連結される請求項20記載の組換え発現ベクター。
23. 請求項21記載の組換え発現ベクターを含む形質転換宿主細胞。
24. 請求項22記載の組換え発現ベクターを含む形質転換宿主細胞。
25. 哺乳類細胞である請求項23又は24記載の形質転換宿主細胞。
26. 請求項１〜７及び９〜16のいずれか１項記載のヌクレオチド配列を含んで成る、１つの蛋白質をコードする異種DNAを含み、そしてそれを発現する微生物細胞。
27. 前記蛋白質がレチノイドを酸化する請求項26記載の微生物細胞。
28. 前記蛋白質が、全トランス型レチン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する請求項26記載の微生物細胞。
29. 請求項１〜７及び10〜16のいずれか１項記載の核酸分子の全長コード領域に対して相補的である異種DNAを含み、そしてそれを発現する微生物細胞。
30. 前記蛋白質をコードし、そして請求項１、３、５、７、９、10、及び12〜15のいずれか１項記載の核酸分子を含んで成るトランスフェクトされたDNAを組み込んでいる、レチノイドを酸化する蛋白質を発現する安定してトランスフェクトされた細胞系。
31. 前記蛋白質をコードし、そして請求項２、４、６、７、11、12及び16のいずれか１項記載の核酸分子を含んで成るトランスフェクトされたDNAを組み込んでいる、β−ヨノン環の４−位でレチノイン酸をヒドロキシル化する蛋白質を発現する安定してトランスフェクトされた細胞系。
32. 哺乳類細胞系である請求項30又は31記載の細胞系。
33. レチノイド代謝蛋白質の生成方法であって、
    請求項１〜７及び10〜16のいずれか１項記載の核酸分子を含んで成るDNAフラグメントを調製し；
    DNAフラグメントを含んで成り、そして細胞における複製を受ける組み換えDNA分子を得るために、発現ベクター中に前記DNAフラグメントを組込み；
    前記蛋白質を発現する形質転換細胞を、予備−選択された条件下で生成するために、前記組換えDNA分子により宿主細胞を形質転換し；
    前記蛋白質を生成するために、前記形質転換細胞を培養し；そして
    その得られる培養混合物から前記蛋白質を回収する；
    段階を含んで成る方法。
34. 請求項９、20又は21記載の組換え発現ベクターを含む形質転換宿主細胞を、蛋白質が形成されるまで、適切な培地において培養し、そして前記蛋白質を単離することを含んで成る蛋白質の調製方法。
35. レチノイドを酸化する組換え蛋白質をコードする核酸分子によりトランスフェクトされた細胞により、又はその子孫細胞により発現される組換え蛋白質を含んで成る微生物調製物であって、前記核酸分子が配列番号３又は５として示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対して、50℃での約0.2×SSCの洗浄段階を包含する高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成ることを特徴とする調製物。
36. β−ヨノン環のC4位でレチノイドをヒドロキシル化する組換え蛋白質をコードする核酸分子によりトランスフェクトされた細胞により、又はその子孫細胞により発現される組換え蛋白質を含んで成る微生物調製物であって、前記核酸分子が配列番号３又は５として示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子に対して、50℃での約0.2×SSCの洗浄段階を包含する高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んで成ることを特徴とする調製物。
37. 前記酸化が、前記レチノイドのβ−ヨノン環のC4位で存在する請求項35記載の調製物。
38. 前記レチノイドが全トランス型レチノイン酸である請求項35、36又は37記載の調製物。
39. 前記蛋白質と配列番号２又は４との間のアミノ酸配列同一性が、少なくとも約93％である請求項35〜38のいずれか１項記載の調製物。
40. 前記蛋白質が、配列番号２又は４として同定されるアミノ酸配列を含んで成る請求項39記載の調製物。
41. 前記核酸分子が、配列番号２又は４に関して、少なくとも90％保存されているアミノ酸配列をコードする請求項35〜38のいずれか１項記載の調製物。
42. 前記核酸分子が、配列番号２又は４に関して、少なくとも95％保存されているアミノ酸配列をコードする請求項41記載の調製物。
43. 前記蛋白質が、全トランス型レチノイン酸のC18位を酸化する請求項35〜42のいずれか１項記載の調製物。
44. β−ヨノン環のC4位で全トランス型レチノイン酸を酸化する組換え蛋白質をコードする核酸分子によりトランスフェクトされた細胞により、又はその子孫細胞により発現される組換え蛋白質を含んで成る微生物調製物であって、前記核酸分子が、配列番号２又は４に関して、少なくとも60％保存されているアミノ酸配列をコードすることを特徴とする調製物。
45. 前記微生物調製物が、表皮細胞により発現されるチトクロームである他の蛋白質を実質的に有さない請求項35〜44のいずれか１項記載の調製物。
46. 前記調製物が、トランスフェクトされていない前記細胞から同じ条件下で得られた微生物調製物に関して、少なくとも6.4倍、前記オキシダーゼ活性を富化されている請求項35及び39〜45のいずれか１項記載の調製物。
47. 前記調製物が、トランスフェクトされていない前記細胞から同じ条件下で得られた微生物調製物に関して、少なくとも7.8倍、前記ヒドロキシラーゼ活性を富化されている請求項36〜45のいずれか１項記載の調製物。
48. （i）配列番号５の塩基１〜884及び1257〜1494から選択された少なくとも20個の連続した塩基の配列又はその相補体、或いは（ii）配列番号３から選択された少なくとも20個の連続した塩基の配列又はその相補体を含んで成る単離された核酸分子を含んで成り、レチノイドを酸化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列又はその相補体に特異的にハイブリダイズするプローブ。
49. 前記配列が、配列番号５の塩基１〜884及び1257〜1494から選択された少なくとも30個の連続した塩基を含んで成る配列又はその相補体、或いは配列番号３から選択された少なくとも30個の連続した塩基を含んで成る配列又はその相補体を含んで成る請求項48記載のプローブ。
50. 前記配列が、配列番号５の塩基１〜884及び1257〜1494から選択された少なくとも40個の連続した塩基を含んで成る配列又はその相補体、或いは配列番号３から選択された少なくとも40個の連続した塩基を含んで成る配列又はその相補体を含んで成る請求項49記載のプローブ。
51. 前記配列が、配列番号５の塩基１〜884及び1257〜1494から選択された少なくとも50個の連続した塩基を含んで成る配列又はその相補体、或いは配列番号３から選択された少なくとも50個の連続した塩基を含んで成る配列又はその相補体を含んで成る請求項50記載のプローブ。
52. 核酸鎖の存在を決定するためのキットであって、請求項48〜51のいずれか１項記載のプローブを含んで成るキット。
53. レポーターシステムをさらに含んで成り、ここで前記レポーターシステムは、予定された量の核酸鎖及び核酸分子がお互いハイブリダイズされる場合、検出できる応答を生成する請求項52記載のキット。
54. レチノイド代謝蛋白質の活性に対する薬剤の効果についてそれらの薬剤をスクリーニングするための方法であって、請求項35〜47のいずれか１項記載の微生物調製物を、前記薬剤に暴露し、そして前記蛋白質の活性に対する効果を決定することを含んで成る方法。
55. 前記活性がレチノイドの酸化である請求項54記載の方法。
56. 前記活性がレチノイドのヒドロキシル化である請求項54記載の方法。
57. 前記レチノイドがレチノイン酸である請求項55又は56記載の方法。
58. 前記レチノイン酸が全トランス型レチノイン酸である請求項57記載の方法。
59. レチノイド代謝蛋白質の活性に対する薬剤の効果についてそれらの薬剤をスクリーニングするための方法であって、請求項30〜32のいずれか１項記載のトランスフェクトされた細胞系を、前記薬剤に暴露し、そして前記蛋白質の活性に対する効果を決定することを含んで成る方法。
60. 前記活性がレチノイドの酸化である請求項59記載の方法。
61. 前記活性がレチノイドのヒドロキシル化である請求項59記載の方法。
62. 前記レチノイドがレチノイン酸である請求項60又は61記載の方法。
63. 前記レチノイン酸が全トランス型レチノイン酸である請求項62記載の方法。
64. チトクロームP450のための生来のプロモーター活性を有するヌクレオチド配列の制御下に存在するよう、発現システム中に組み込まれる請求項１〜７及び10〜16のいずれか１項記載の核酸分子によりコードされるチトクロームP450によるレチノイドの代謝に対する薬剤の効果についてその薬剤をスクリーニングするための方法であって、
    前記レチノイドの代謝に対する前記薬剤の効果を決定するために、レチノイドの存在下で前記薬剤に前記システムを暴露することを含んで成る方法。
65. 前記レチノイドが全トランス型レチノイドである請求項64記載の方法。
66. 前記レチノイン酸が全トランス型レチノイン酸である請求項65記載の方法。
67. 配列番号３又は５として示されるヌクレオチド配列に対して、50℃での約0.2×SSCの洗浄段階を包含する高い緊縮条件下でハイブリダイズし、そしてレチノイドを酸化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子によりコードされる蛋白質の領域であって、レチノイドを酸化しないサイトクローム中で保存されていない領域に対する抗体。
68. 配列番号３又は５として示されるヌクレオチド配列に対して、50℃での約0.2×SSCの洗浄段階を包含する高い緊縮条件下でハイブリダイズし、そしてβ−ヨノン環の４−位でレチノイン酸をヒドロキシル化する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子によりコードする蛋白質の領域であって、レチノイン酸をヒドロキシル化しないサイトクローム中で保存されていない領域に対する抗体。
69. 配列番号３又は５として同定されるか、又は遺伝子コードの縮重によりコード領域における前記配列とは異なるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子によりコードされる蛋白質に対して特異的な抗体。
70. （i）配列番号２のアミノ酸１〜432のアミノ酸配列、又は（ii）配列番号４のアミノ酸１〜436のアミノ酸配列に対して特異的な抗体。
71. 前記レチノイドが、レチノール又はレチノイン酸である請求項67、69及び70のいずれか１項記載の抗体。
72. 前記蛋白質が、前記レチノイドのβ−ヨノン環の４−位で前記炭素を酸化する請求項71記載の抗体。
73. 前記レチノイドが、全トランス型レチノイドである請求項67、69及び70のいずれか１項記載の抗体。
74. 前記レチノイン酸が全トランス型である請求項68又は72記載の抗体。
75. 前記蛋白質が組換え蛋白質である請求項67〜74のいずれか１項記載の抗体。
76. 前記蛋白質と配列番号２との間のアミノ酸配列同一性が少なくとも約93％であり、又は前記蛋白質と配列番号４との間のアミノ酸配列同一性が少なくとも約93％である請求項67又は75記載の抗体。
77. 前記核酸分子が、配列番号２に関して、少なくとも90％保存されているアミノ酸配列、又は配列番号４に関して、少なくとも90％保存されているアミノ酸配列をコードする請求項67、68又は75記載の抗体。
78. 前記核酸分子が、配列番号２に関して、少なくとも95％保存されているアミノ酸配列、又は配列番号４に関して、少なくとも95％保存されているアミノ酸配列をコードする請求項77記載の抗体。
79. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項67〜78のいずれか１項記載の抗体。
80. レチノイン酸の代謝の必要な生物又は細胞におけるレチノイン酸の代謝への使用のための請求項35〜47のいずれか１項記載の蛋白質。
81. レチノイン酸代謝の必要な生物又は細胞におけるレチノイン酸を代謝するための組成物の調製のためへの請求項35〜47のいずれか１項記載の蛋白質の使用。
82. 請求項35〜48のいずれか１項により定義されるか又は請求項１〜７及び10〜16のいずれか１項に定義されるような核酸分子によりコードされるような蛋白質の存在を決定するためのキットであって、蛋白質の規定量と抗体とが結合すると検出可能な反応を生じるようなレポーターシステムに結合された前記蛋白質に対する抗体を含んで成るキット。
83. レチノイドを酸化する蛋白質の存在を決定するためのキットであって、蛋白質の規定量と抗体とが結合すると検出可能な反応を生じるようなレポーターシステムに結合された前記蛋白質に対する、請求項67〜79のいずれか１項に記載される抗体を含んで成るキット。

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