ES2924479T3 - Composiciones para rejuvenecer las células madre del músculo esquelético - Google Patents

Abstract

Se describen métodos y composiciones para rejuvenecer las células madre del músculo esquelético. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para rejuvenecer las células madre del músculo esquelético

APOYO GUBERNAMENTAL

La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de las UO1 HL100402, RO1 AG033053, R01 AG032977 y R01 AG040019 otorgadas por los "National Institutes of Health". El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

La disfunción dependiente de la edad de las células madre adultas es atribuible a los aportes tanto intrínsecos como extrínsecos celulares. Los mecanismos críticos subyacentes del declive funcional de las células madre viejas continua sin ser fácil de encontrar. Por consiguiente, existe una necesidad de identificar los factores que son capaces de fomentar o invertir los cambios asociados a la edad en tejidos tan diversos como el músculo esquelético, el hígado y el SNC (Wagers y Conboy, Cell 2005; 122, 659; Ruckh et al. Cell Stem Cell 2005; 10, 96).

Sumario de la invención

Los métodos y composiciones descritas en el presente documento son útiles para rejuvenecer las células madre del músculo esquelético, fomentar la regeneración del músculo esquelético, mejorar la resistencia al ejercicio, regenerar la degeneración del músculo esquelético asociada a un trastorno relacionado con la edad del músculo esquelético, y tratar, prevenir o invertir las afecciones musculares esqueléticas.

La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende el polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 para su uso en el tratamiento de una afección muscular esquelética en un sujeto que lo necesita, en donde la afección muscular esquelética se selecciona de entre caquexia, miositis inflamatoria, enfermedad neuromuscular, debilidad muscular después de la cirugía, debilidad muscular postraumática y exposición a toxinas, o para su uso para aumentar la frecuencia o número de las células madre del músculo esquelético, aumentar la eficacia de la formación de colonia miogénica, aumentar el porcentaje de núcleos intactos, y disminuir el porcentaje de ADN gravemente dañado en un sujeto que lo necesita que tiene denervación o distrofia.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método no terapéutico para tratar o prevenir la fatiga del músculo esquelético inducida por ejercicio en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que aumente el nivel del polipéptido de GDF11 en el sujeto, en donde la composición comprende el polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11.

En una realización del segundo aspecto de la presente invención, el método no terapéutico es para rejuvenecer las células madres del músculo esquelético en un sujeto que lo necesita, en donde la composición provoca el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de las miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de núcleos intactos, y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado.

En algunas realizaciones del primer o el segundo aspecto de la presente invención, se aumenta el nivel de polipéptido de GDF11 en el tejido muscular esquelético del sujeto.

En algunas realizaciones del primer o el segundo aspecto de la presente invención, la composición comprende un polipéptido de GDF11.

En algunas realizaciones del primer o el segundo aspecto de la presente invención, la composición comprende un polipéptido de GDF11 que comprende la secuencia de aminoácidos de un GDF11 maduro humano, la secuencia de aminoácidos de un propéptido de GDF11 humano, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido precursor de GDF11 humano, o la secuencia de aminoácidos de un polipéptido N-terminal de GDF11 humano.

En algunas realizaciones del primer o el segundo aspecto de la presente invención, la composición comprende homodímeros de polipéptidos de GDF11 que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido precursor de GDF11 humano, un propéptido de GDF11 humano, un GDF11 maduro humano o un polipéptido N-terminal de GDF11 humano.

En algunas realizaciones del primer o el segundo aspecto de la presente invención, la composición comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11.

Breve descripción de los dibujos

El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. La Oficina proporcionará copias de esta publicación patente o de solicitud de patente con dibujos a color, previa solicitud y pago de la tasa correspondiente.

La Figura 1 muestra alteraciones dependientes de la edad en función de células madre del músculo esquelético viejas. (A) Imágenes representativas de las secciones transversales del músculo tibial anterior (TA) regenerante teñidas con H&E el día 7 después de la criolesión de ratones jóvenes y viejos. (B) Distribución de frecuencia del tamaño de miofibrilla en musculo regenerante (día 7 después de la criolesión) de ratones jóvenes y viejos. (C) Eficacia formadora de colonia miogénica de células satélite aisladas de ratones jóvenes (columna blanca) o viejos (columna negra). (D) Cuantificación del daño del ADN en células satélite recién aisladas de ratones jóvenes y viejos mediante ensayos cometa alcalinos. Los diferentes colores representan las diferentes puntuaciones de los cometas como se indica (véase también la Figura 4). (E) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de los focos de H2AX fosforilada (verde) en células satélite recién aisladas de ratones jóvenes y viejos. (aumento 100x, núcleos teñidos con DAPI (azul)). A continuación, se muestra la cuantificación. Todos los gráficos representan la media /- las desviaciones estándar de 5-8 experimentos independientes. Se realizó la prueba de la t de Student para el análisis estadístico en C, D y E. Se usó el método Bonferroni descendente para el análisis estadístico en B.

La Figura 2 muestra el rejuvenecimiento de la función y la integridad genómica en células madre musculares viejas. (A) Frecuencia de célula satélite analizada por citometría de flujo para células extraídas de compañeros viejos de ratones unidos de manera heterocrónica (Het) (n=7 parejas) y compañeros jóvenes o viejos de ratones unidos de manera isocrónica (iso) (n=5 parejas Iso-jóvenes y 5 parejas Iso-viejos). (B) Eficacia formadora de colonia miogénica de células satélite aisladas de compañeros viejos o jóvenes de ratones unidos Iso o Het. (C) Análisis del daño del ADN en células satélites recién aisladas de compañeros jóvenes o viejos de ratones unidos Iso o Het, detectado por ensayos cometa alcalinos. (D) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de focos de H2AX fosforilada (verde) en células satélite recién aisladas de compañeros jóvenes o viejos de parejas unidas Iso o Het (n=3 ratones analizados por grupo). Los datos mostrados como imágenes proyectadas de pilas z confocales de núcleos teñidos con DAPI (azul) y H2AX fosforilada (verde) a un aumento de 100x. A continuación, se muestra la cuantificación. Todos los gráficos representan la media /- las desviaciones estándar de 5-7 experimentos independientes. Se usó la prueba de la t de Student para el análisis estadístico.

La Figura 3 muestra el rejuvenecimiento de músculo viejo y la función de las células madre musculares mediante el tratamiento in vivo con rGDF11. (A) Tinciones con H&E representativas del músculo tibial anterior regenerante el día 7 después de la criolesión para ratones viejos tratados con vehículo (panel superior) o con GDF11 (panel inferior). (B) Distribución de frecuencia del tamaño de miofibrilla en el musculo regenerante el día 7 después de la criolesión en ratones viejos tratados con vehículo o con GDF11. Se usó el método de Bonferrori descendente para el análisis estadístico. (C) Frecuencia de células satélite (% de células vivas) analizado mediante citometría de flujo para machos viejos tratados con vehículo (n=7) o GDF11 (n=8). (D) Eficacia formadora de colonia miogénica de células satélite aisladas de ratones viejos tratados con vehículo o GDF11. (E) Cuantificación del daño del ADN en células satélite recién aisladas de ratones jóvenes o de ratones viejos tratados con vehículo o GDF11, detectado por ensayos cometa alcalinos. Los diferentes colores representan las diferentes puntuaciones de los cometas como se indica. Los gráficos C y D representan la media /- las desviaciones estándar de 6-7 experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante una prueba de la t de Student.

La Figura 4 muestra los resultados de los ensayos cometa realizados sobre células satélite recién clasificadas (es decir, células madre del músculo esquelético). (A) Clave de puntuación visual de los ensayos cometas. Las puntuaciones se muestran en la esquina superior derecha y representan el alcance del daño a una escala de 0 a 4, siendo 0 sin daño y 4 daño máximo. Los números también están codificados por color para la cuantificación como en la Figura 1D. (B) Imágenes cometa representativas de los núcleos celulares satélite de jóvenes (parte superior, 2 meses de edad) y viejos (parte inferior, 24 meses de edad). Los núcleos de las células madre musculares de ratones viejos muestran daño aumentado del ADN en comparación con las células madre musculares de ratones jóvenes.

La Figura 5 muestra células madre musculares teñidas con Pax7 sobre las miofibrillas aisladas que también presentaron inmunoreactividad aumentada para la forma fosforilada de la histona variante H2AX (pH2AX). (A) Imágenes inmunofluorescentes representativas de pH2AX (verde) en núcleos Pax7+ viejos y jóvenes en miofibrillas aisladas. Aumento 20x, con recuadro a 63X. (B) Cuantificación del % de núcleos pH2AX+ entre células satélite de jóvenes o viejos teñidas como en (A). Los datos están compilados de 3 experimentos independientes. Cada diamante negro representa los datos de una fibra sencilla (n=30 fibras analizadas por grupo). Las líneas naranjas representan la media ± SD; El valor p indicado se calculó mediante la prueba de Mann-Whitney.

La Figura 6 muestra el análisis de expresión de transcritos génicos asociados a la diferenciación miogénica, el ciclo celular o el daño del ADN por qRT-PCR (A) o el ensayo de SA-pGal para detectar las células senescentes en las secciones musculares (sección TA), las células madre musculares clasificadas (células satélite) o fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiados como control (B). Las células madre musculares de ratones viejos muestran niveles superiores de MyoD y niveles inferiores de p21 y Reddl en comparación con las células satélites de jóvenes (A). La senescencia celular no se detectó en las secciones musculares o en las células madre musculares clasificadas de ratones viejos (B).

La Figura 7 representa un alineamiento del polipéptido precursor de GDF11 humano (secuencia query: residuos 62-407 de GDFl1 humano) y el polipéptido precursor de GDF8 humano.

La Figura 8 representa un alineamiento del péptido precursor de GDF11 humano (secuencia query: residuos 47 407 del polipéptido precursor de GDF11 humano) y el péptido precursor de GDF11 murino.

La Figura 9 representa el injerto reducido de células satélite GFP+ jóvenes irradiadas en ratones mdx. (A) Imágenes representativas de criosecciones transversales de TA de receptores mdx que se trasplantaron con células satélite GFP+ no irradiadas (0 rad) o irradiadas (50 o 100 rad) (de donantes transgénicos GFP- machos de 8 semanas) por inyección intramuscular. (B) Gráfico de barras que representa el número máximo de fibras GFP+ por receptor, analizado por epifluorescencia directa en secciones transversales seriales. Los datos se muestran como media ± SEM de n=3 animales por grupo y los valores p se calcularon usando la prueba de la t de Student.

(C) Cuantificación de ensayos de electroforesis en gel de célula única alcalina realizados con células satélite GFP+ usadas para el trasplante, mostrando daño del ADN aumentado entre las células irradiadas. Los datos representan la media ± SD de 3 réplicas experimentales. La clave de la puntuación visual codificada por color de los ensayos del daño del ADN y los valores p, que indican únicamente diferencias estadísticamente significativas, se muestran en la parte superior derecha.

La Figura 10 ilustra los animales parabióticos que estuvieron unidos durante 4-5 semanas, y se confirmó la circulación cruzada en un subconjunto de animales mediante el análisis de los antígenos de superficie leucocítica congénicos. Se muestran gráficas representativas que indican el injerto cruzado de células derivadas del compañero en parabiontes isocrónicos y heterocrónicos, en los cuales un compañero joven está marcado por la expresión de CD45.1 (azul) y el otro compañero por la expresión de CD45.2 (marrón claro). CD45 es un marcador panleucocítico que permite la discriminación del origen de los glóbulos blancos en circulación en la circulación quimérica. El porcentaje de los marcadores sanguíneos congénicos CD45.1 frente a CD45.2 en esplenocitos de compañeros jóvenes (azul o marrón claro) o viejos (marrón oscuro) de parejas parabióticas jóvenes-isocrónica, jóvenes-heterocrónica y viejos-isocrónica o viejos-heterocrónica está indicado para cada grupo. Los presentes investigadores no pudieron valorar el quimerismo en las parejas viejos-isocrónica debido a la indisponibilidad de ratones CD45.1 de 22 meses; sin embargo, nuestra extensa experiencia con este modelo, incluyendo los estudios anteriores que usan ratones marcados con GFP han demostrado previamente que la circulación cruzada se establece eficazmente en estas parejas completamente isogénicas. Las parejas heterocrónicas siempre se compararon con las parejas isocrónicas emparejadas por edad (joven-joven o viejo-viejo) para excluir cualquier impacto de la propia cirugía de parabiosis.

La Figura 11 muestra esa incorporación de BrdU en células satélite jóvenes o viejas. Estudios que usan ratones marcados con histona indican que una fracción aumentada de células satélite en el músculo restante entran en el ciclo celular en los ratones viejos, en comparación con jóvenes, y surge la posibilidad de que la acumulación del daño del ADN en las células satélite viejas pueda dar como resultado un número aumentado de tenedores de replicación parados o colapsados en el conjunto de células satélite viejas más proliferativo. Para ensayar si la reparación del daño del ADN en las células satélite viejas expuestas a una circulación joven podría ocurrir debido a un retorno de estas células a su estado quiescente habitual después de exponerse a señales sistémicas jóvenes, se marcaron todas las células en reproducción en los parabiontes isocrónicos o heterocrónicos alimentando animales con BrdU durante la duración de la unión parabiótica (4 semanas). (A) Imágenes inmunofluorescentes representativas de la tinción de BrdU en los núcleos de células satélite extraídas de compañeros jóvenes o viejos de ratones unidos de manera heterocrónica o compañeros jóvenes o viejos de ratones unidos de manera isocrónica. En todos los casos, la frecuencia de núcleos BrdU+ es extremadamente baja, y no se podrían detectar diferencias entre los 4 grupos de ratones. (B) Frecuencia de células satélite BrdU+ analizadas mediante citometría de flujo para células extraídas de músculos de extremidad posterior ilesos o lesionados por cardiotoxina de 5 ratones viejos y 5 ratones jóvenes (no unión en parabiosis). Los datos se presentan como la media ± SD, con valor p calculado por la prueba de Mann-Whitney e indicado únicamente para las diferencias significativas. Las incorporación de BrdU no fue diferente en músculo ileso, y se redujo en las células satélite extraídas de músculo de viejos, en comparación con jóvenes, después de la lesión. Estos datos indican que los cambios en el historial proliferativo de célula satélite es poco probable que explique las alteraciones en la integridad genómica o la función de la célula satélite que se observaron después de la parabiosis heterocrónica, y apoyan la idea de que las células satélite viejas muestran activación afectada en respuesta a los estímulos regenerativos.

La Figura 12 representa las alteraciones dependientes de la edad a niveles sistémicos y locales de TGF-p1, miostatina y GDF11. Para comenzar a descubrir las señales sistémicas que restauran la función de la célula madre muscular en ratones viejos expuestos a una circulación juvenil, se investigaron los factores de sangre-hueso variantes por la edad en ratones jóvenes y viejos, enfocándonos particularmente en miembros de la familia de TGF-p. (A) Niveles de TGF-p1 en plasma (panel izquierdo, dilución 1:40) o extracto muscular triturado (panel derecho, dilución 1:10) evaluado por ELISA en ratones macho jóvenes y viejos. (B) Niveles de miostatina (MSTN) en plasma (panel izquierdo, dilución 1:40) o extracto muscular triturado (panel derecho, dilución 1:3) evaluado por ELISA en ratones macho jóvenes y viejos. Todos los gráficos representan la media ± SEM y los valores p, que indican únicamente diferencias estadísticamente significativas, se calcularon usando la prueba de la t. (C) Análisis Western de los niveles de GDF11 en plasma y músculos de ratones tratados con vehículo o rGDF11 después de 28 días de inyecciones diarias. Se cargaron cantidades iguales (100 |jg) de proteínas plasmáticas en cada calle, con GDF11 recombinante (rGDF11) cargado a la izquierda como control. Se muestran los datos para 3 (parte superior) o 4 (parte inferior) animales individuales en cada categoría experimental. Estos datos demuestran que los niveles endógenos de GDF11 se reducen con la edad en el músculo esquelético, como en el plasma, y que la inyección de rGDF11 durante 28 días es suficiente para aumentar los niveles de GDF11 maduro (12,5 kDa) en el plasma de animales jóvenes y viejos (parte superior) y en el músculo de ratones viejos (parte inferior). Los niveles plasmáticos de GDF11 en los ratones viejos administrados con rGDF11 a 0,1 mg/kg al día generalmente permanecieron inferiores a los de en ratones jóvenes (2 meses de edad), sugiriendo así que la reposición completa de GDF11 a niveles juveniles puede no ser esencial para algunos factores de sus efectos de rejuvenecimiento. La Figura 13 ilustra que rGDF11 aumenta el área transversal de las fibras regenerantes en el músculo viejo, pero no afecta al tamaño de las miofibrillas en el músculo ileso en ratones jóvenes o viejos. (A) Gráfico de barras que representa el área transversal media en pm2 de todas la fibras regenerantes analizadas para la Figura 3B. El número de animales usados para el análisis se muestra dentro de cada barra. (B) Distribución de frecuencia (izquierda) de fibras musculares y área transversal media en pm2 (derecha) del músculo tibial anterior (TA) control contralateral joven, que no está lesionado. (C) Distribución de frecuencia (izquierda) de fibras musculares y el área transversal media en pm2 (derecha) (TA) control contralateral viejo, que no está lesionado. Los datos del área transversal media representan la media ± SEM y los valores p mostrados se calcularon usando la prueba de la t de Student. La distribución de frecuencia se analizó mediante el ensayo exacto de Wilcoxon y no mostró diferencias estadísticamente significativas para jóvenes+vehículo frente a jóvenes+rGDF11 o para viejos+vehículo frente a viejos+rGDF11, para músculos ilesos. Por tanto, rGDF11 estimula la recuperación acelerada del tamaño de miofibrilla en el músculo regenerante después de la lesión, pero a la dosis estudiada en este caso, no impacta sobre el tamaño de la miofibrilla o sobre la masa muscular en el tejido ileso.

La Figura 14 muestra la frecuencia de los componentes nicho después del tratamiento con GDF11. Análisis por citometría de flujo de la frecuencia de células hematopoyéticas (CD45+CD11b+Ter119+), fibrógenos-adipógenas y endoteliales (CD45-CD11b-Ter119-Sca-1+) o mioblastos diferenciados y fibroblastos (cD45-CD11b-Ter119-Sca-1-p1-I ntegrina+CXCR4-) del músculo esquelético de ratones jóvenes y viejos tratados con vehículo o rGDF11. Los datos representan la media ± SD, con valor p calculado por la prueba de la t de Student e indicado únicamente para las diferencias significativas. El tratamiento con rGDF11 no indujo los cambios significativos en las frecuencias de estos componentes nicho musculares en o bien ratones jóvenes o viejos.

La Figura 15 muestra el rejuvenecimiento de las células madre musculares mediante suplemento de rGDF11. (A) Imágenes representativas de criosecciones transversales de músculos tibiales anteriores (TA) 2 semanas después del trasplante. (B) Cuantificación de los datos del trasplante como número máximo de miofibrillas GFP+ encontradas en cada músculo injertado. El gráfico representa la media ± SD y los valores de p se calcularon mediante la prueba de la t de Student. "n=" indica el número de ratones usados para cada análisis.

La Figura 16 ilustra que rGDF11 aumenta el área transversal de las fibras regenerantes, injertadas en el músculo viejo. (A) Diagrama esquemático que representa el diseño experimental. Se clasificaron células satélite GFP+ de ratones transgénicos GFP y se trasplantaron en receptores viejos (n=4 por grupo) que se trataron con rGDF11 o solo vehículo durante 4 semanas antes y 2 semanas tras el trasplante. (B) Imágenes representativas de criosecciones transversales de músculo tibial anterior (TA) extraído 2 semanas después del trasplante con 30.000 células satélites GFP+ doblemente clasificadas aisladas de ratones jóvenes (4-6 semanas de edad). Las células satélite se inyectaron en los músculos TA de ratones viejos tratados con vehículo (parte superior) o rGDF11 (parte inferior), los cuales se lesionaron previamente con inyección de cardiotoxina 1 día antes del trasplante de las células satélite. Se analizó la expresión de GFP en los músculos mediante epifluorescencia directa a un aumento 40x. (C) Cuantificación del área transversal de miofibrilla para las fibras GFP+ recién regeneradas (mostrado en B). Los datos representan la media ± SD y el valor p se calculó mediante la prueba de la t de Student.

La Figura 17 ilustra alteraciones no detectables en el peso corporal, la masa corporal o la masa muscular después del suplemento de rGDF11 en animales jóvenes o viejos. (A) Representación en gráfico de barras del peso corporal en gramos después de 30 días de tratamiento con vehículo o rGDF11 en ratones macho jóvenes o viejos. Todos los ratones se guardaron y trataron en la misma instalación. (B) Representación de gráfico de barras de la masa grasa normalizada al peso corporal (panel izquierdo) o la longitud tibial (panel derecho) como se indica. La masa grasa representa la suma de los cuerpos adiposos blancos en las localizaciones inguinales, gonadales y axilares de ambos lados de cada animal. (C) Representación de gráfico de barras de masa muscular normalizada al peso corporal (panel izquierdo) o la longitud tibial (panel derecho) como se indica. La masa muscular representa una suma de la masa muscular de TA y EDL de ambas extremidades posteriores de cada animal. El número de animales usados para el análisis se muestra dentro de cada barra como "n=". Los datos representan la media ± SD. Los valores p, calculados por la prueba de la t de Student, se muestran únicamente para las diferencias estadísticamente significativas.

La Figura 18 muestra que rGDF11 aumenta el tamaño de las NMJ en el músculo viejo. (A) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de uniones neuromusculares (NMJ) de los músculos tibiales anteriores (TA) de ratones viejos tratados con vehículo o rGDF11. En los recuadros superiores derechos se muestra a mayor aumento (lentes del objetivo 40X). Los receptores de acetilcolina postsinápticos están marcados con a-Bungarotoxina conjugada con AlexaFluor 555 (rojo) y los mionúcleos están teñidos con DAPI (azul). (B) Cuantificación del área superficial de los receptores de acetilcolina postsinápticos. El número total de animales usados para el análisis se muestra dentro de cada barra como "n=". Los datos se presentan como la media ± SEM y los valores p se calcularon mediante la prueba de la t de Student.

La Figura 19 ilustra la fisiología muscular mejorada y la función física después del suplemento con rGDF11. (A) Micrografías electrónicas de las secciones transversales del músculo tibial anterior (TA) de ratones viejos tratados con vehículo o rGDF11 (representativo de n=4 por grupo). Las flechas indican la mitocondria hinchada. (B, C) Transferencia Western de pGC-1a (B) y formas I y II de LC3 (C) en extractos del músculo TA de ratones viejos tratados con vehículo o rGDF11 lesionados con cardiotoxina o ilesos. Para cada grupo experimental se muestran tres animales. La cuantificación densitométrica de los datos Western se proporcionan a continuación en cada transferencia, normalizada para GAPDH (B) o Actina (C). (D) Diagrama de dispersión de la resistencia al ejercicio, el tiempo de carrera en cinta de correr máximo en una ventana de 90 minutos de ratones viejos tratados con vehículo o con rGDF11. Los datos se presentan para ratones individuales (símbolos negros) superpuestos con la media ± SD (líneas naranjas) y los valores p se calcularon mediante el análisis de Mann-Whitney. "n=" indica el número de ratones usados para cada análisis.

La Figura 20 muestra que rGDF11 fomenta la diferenciación miogénica y la función mitocondrial in vitro. (A) Imágenes de campo brillante representativas (parte superior) o inmunofluorescencia (parte inferior) de células satélite extraídas de ratones jóvenes (3 meses) o viejos, proliferadas con vehículo (control) o rGDF11 a la concentración indicada durante 5 días en el medio de crecimiento seguido de medio de diferenciación durante 5 días (jóvenes) o 7 días (viejos). Las células se tiñeron después del cultivo para identificar los núcleos (DAPI, azul), actina celular (Faloidina, verde), y cadena pesada de miosina (MyHC, rojo). Los cultivos de las células satélite viejas expuestas a rGDF11 a 25 o 100 ng/ml mostraron diferenciación miogénica aumentada. (B) Imágenes de inmunofluorescencia representativas de miotubos teñidos con MitotrackerTM, diferenciados en presencia de vehículo solo y 100 ng/ml de rGDF11. Mitotracker es un tinte dependiente del potencial de membrana mitocondrial y las flechas indican puncta de mitocondria en miotubos diferenciados. (C) Gráfico de barras de la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR) en los ensayos de flujo metabólico de caballito de mar de células satélite jóvenes o viejas diferenciadas durante 7 días en presencia de vehículo solo o de 100 ng/ml de rGDF11. Las células expuestas a rGDF11 muestran tinción con Mitotracker aumentada y OCR aumentada, indicativo del aumentado contenido mitocondrial y las sustancias bioenergéticas. Los datos representan la media de 5 réplicas técnicas ± SD y únicamente se muestran los valores p significativos, calculados usando la prueba de la t de Student.

La Figura 21 ilustra el aclaramiento de lactato aumentado y los niveles de glucosa disminuidos durante el ejercicio en ratones viejos tratados con rGDF11. (A, B) Cuantificación de los niveles de lactato (A) o glucosa (B) en sangre de ratones viejos tratados con vehículo (línea negra) o rGDF11 (línea gris), muestreados en los momentos indicados durante el ejercicio en la cinta de correr, como en la Figura 19D. Los datos se presentan como media ± SD. El número total de animales usados para el análisis se muestra entre paréntesis como "n=" y los valores p se calcularon mediante la prueba de la t de Student.

La Figure 22 ilustra la fuerza de presión mejorada de ratones viejos tras el suplemento de rGDF11. El diagrama de dispersión de la fuerza de presión de la extremidad anterior de ratones viejos tratados con vehículo o rGDF11 se representó en la gráfica como la fuerza máxima normalizada al peso corporal (Newton/gramo (N/g)) ejercida en ensayos triples. La línea roja representa la fuerza de presión máxima normalizada de ratones macho jóvenes de 33-39 semanas de edad. Los datos se presentan para ratones individuales (símbolos negros) superpuestos con la media ± SD (líneas naranjas) y los valores p calculados por el análisis de Mann-Whitney y "n=" indica el número de ratones usados para este análisis. Los ratones viejos tratados con rGDF11 muestran fuerza de presión normalizada aumentada.

La Figura 23 es una representación del mapa caliente de genes miogénicos expresados en células satélite viejas recién aisladas. Los datos se representan en un gradiente de azul a rosa (el azul indica bajo nivel de expresión y el rosa alto nivel de expresión), para células satélite de jóvenes (2 meses de edad, columnas de la izquierda) o de viejos (22-24 meses de edad, columnas derechas) aisladas por FACS (n=5 muestras independiente por grupo). Los símbolos génicos individuales están indicados a la derecha en células satélite de jóvenes y viejos. Las células satélite de viejos generalmente muestran un aumento de la expresión génica miogénica.

La Figura 24 ilustra similar detección de 53BP1 y 53BP1 fosforilada en células satélite jóvenes y viejas. (A) Imágenes de inmunofluorescencia confocal representativas (sumas de pilas z) de focos de 53BP1 (marcados con puntas de flecha blancas) de células satélite jóvenes y viejas como se indica. Barra de escala =10 pm. (B) Gráficos de flujo representativos del análisis de un ratón joven que ilustran la estrategia de selección para el análisis por citometría de flujo de fosfo-53BP1 en células satélite CD45-Sca-1-CD11b-Ter119-CXCR4+p1-Integrina+. (C) Cuantificación del análisis por citometría de flujo presentado como frecuencia de células satélite 53BP1 fosforilada+ entre las células satélite totales de animales jóvenes o viejos (n=9 animales por grupo). Los datos se normalizaron a la frecuencia media de células satélite 53BP1 fosforilada+ para ratones jóvenes y se presentan como media relativa ± SD. Las diferencias no son estadísticamente significativas, calculadas usando el análisis de Man-Whitney.

La Figura 25 ilustra la inmunoreactividad aumentada para caspasa-3 activada en núcleos de célula satélite vieja.

(A) Imágenes inmunofluorescentes confocales (sumas de pilas z-) representativas de la tinción por caspasa-3 en células satélite extraídas de ratones jóvenes o viejos. Barra de escala =10 pm. (B) Gráficos de flujo representativos de un ratón joven que ilustran la estrategia de selección para el análisis por citometría de flujo de caspasa-3 activada en células satélite CD45-Sca-1-CD11b-Ter1119-CXCR4+p1-Integrina+. (C) Cuantificación del análisis por citometría de flujo presentado como frecuencia de células satélite caspasa3 activada+ entre las células satélite totales de animales jóvenes o viejos (n=7 animales por grupo). Los datos se normalizaron a la frecuencia media de células satélites caspasa3 activada+ para ratones jóvenes y se presentan como media relativa ± SD y el valor p se calculó usando el análisis de Man-Whitney.

La Figura 26 muestra los efectos de bFGF, rTGF-p1, rM-STN y rGDF11 sobre la proliferación de la célula satélite in vitro. La cuantificación del número celular después del cultivo in vitro de células satélite durante 5 días en presencia de concentraciones indicadas de bFGF, o TGF-p1 recombinante, MSTN recombinante o rGDF11 (como se indica). Inicialmente se sembraron 200 células satélite doblemente clasificadas por pocillo (> 98 % de pureza) de ratones jóvenes (8-12 semanas) o viejos (24 meses) y se cultivaron en medio de crecimiento que contenía un 20 % de reemplazo de suero de inactivación ("knock-out") que carecía de miembros de la superfamilia de factores de crecimiento TGF-p. Los datos presentados como la media ± SD y los valores p calculados mediante la prueba de la t de Student, se muestran únicamente para las diferencias estadísticamente significativas.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento, se describen métodos y composiciones basados en el hallazgo de que a medida que se envejece, el nivel del polipéptido de GDF11 en su sangre disminuye y da como resultado potencial regenerativo disminuido del músculo esquelético debido al deterioro de las células madre del músculo esquelético. Los métodos y composiciones descritas en el presente documento son útiles para rejuvenecer las células madre del músculo esquelético, fomentar la regeneración del músculo esquelético, mejorar la resistencia al ejercicio, y regenerar la degeneración del músculo esquelético asociada a un trastorno relacionado con la edad del músculo esquelético. Los métodos y composiciones descritos en el presente documento generalmente se refieren al aumento del nivel del polipéptido de GDF11 en un sujeto para tratar, prevenir o invertir las afecciones musculares esqueléticas descritas en el presente documento.

Por conveniencia, determinados términos empleados en el presente documento, en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se recogen aquí. A menos que se indique lo contrario, o esté implícito en el contexto, los siguientes términos y expresiones incluyen los significados proporcionados a continuación. A menos que se indique explícitamente lo contrario, o sea evidente en el contexto, los términos y expresiones de a continuación no excluyen el significado que el término o expresión ha adquirido en la técnica a la que pertenece. Las definiciones se proporcionan para ayudar en la descripción de realizaciones particulares, y no pretenden limitar la invención reivindicada, debido a que el alcance de la invención está limitado únicamente por las reivindicaciones. A menos que se defina de otra manera, todos los términos y expresiones técnicas y científicas usadas en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Como se usa en el presente documento, "afección muscular esquelética" se refiere a una afección en el músculo esquelético mediada o caracterizada por una reducción en el polipéptido de GDF11 en circulación en un sujeto. Ejemplos no limitantes de afecciones musculares esqueléticas incluyen atrofia, fracturas óseas asociadas a la pérdida muscular o debilidad, caquexia, denervación, diabetes, distrofia, fatiga del músculo esquelético inducida por el ejercicio, fatiga, fragilidad, miositis inflamatoria, síndrome metabólico, enfermedad neuromuscular, obesidad, debilidad muscular después de la cirugía, debilidad muscular postraumática, sarcopenia, exposición a toxinas, atrofia y debilidad.

Como se usa en el presente documento, la "fragilidad" es un síndrome caracterizado por satisfacer al menos uno de los siguientes cinco atributos: pérdida de peso no pretendida, debilidad muscular, velocidad de paseo lenta, agotamiento y baja actividad física.

Como se usa en el presente documento, "caquexia" significa una enfermedad con frecuencia asociada al cáncer u otras enfermedades o afecciones graves, (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, nefropatía crónica), que se caracteriza por pérdida de peso progresiva, atrofia muscular y fatiga, debido a la pérdida de tejido adiposo y músculo esquelético.

Como se usa en el presente documento, "debilidad muscular después de la cirugía" se refiere a una reducción en la fuerza de uno o más músculos tras la cirugía. La debilidad puede ser generalizada (es decir, debilidad corporal total) o localizada en un área específico, lado del cuerpo, extremidad o músculo.

Como se usa en el presente documento, "debilidad muscular postraumática" se refiere a una reducción en la fuerza de uno o más músculos tras un episodio traumático (por ejemplo, lesión corporal). La debilidad puede ser generalizada (por ejemplo, debilidad corporal total) o localizada en un área específico, lado del cuerpo, extremidad o músculo.

Como se usa en el presente documento, "enfermedad neuromuscular" significa cualquier enfermedad o afección que afecte a cualquier parte del nervio y del músculo. La enfermedad neuromuscular abarca polineuropatía de enfermedad crítica, bloqueo neuromuscular prolongado, miopatía aguda así como polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), neuropatía autónoma, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y otras neuropatías motoras y sensoriales hereditarias, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, dermatomiositis/polimiositis, neuropatía diabética, distrofinopatías, miopatías endocrinas, atrofias musculares focales, espasmo hemifacial, neuropatías hereditarias del tipo de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad de Kennedy, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, distrofia muscular (por ejemplo, cinturón de extremidad, de Duchenne, de Becker, miotónica, facioescapulohumeral, etc.), miopatías metabólicas, neuropatía metabólica, neuropatía motora multifocal con bloques de conducción, miastenia grave, neuropatía de Friedreich Ataxia, neuropatía de lepra, neuropatía nutricional, parálisis periódica, esclerosis lateral primaria, enfermedad pulmonar restrictiva, sarcoidosis y neuropatía, síndrome de Schwartz-Jampel, atrofia muscular espinal (AME), síndrome de la persona rígida, enfermedad de tiroides, lesiones traumáticas del nervio periférico, neuropatía vasculítica, entre otros.

Como se usa en el presente documento, "sarcopenia" significa una pérdida de masa del músculo esquelético, calidad y fuerza. Con frecuencia la sarcopenia está asociada al envejecimiento, pero también puede ocurrir en asociación con la infección de VIH y diversas afecciones crónicas. La sarcopenia puede conducir a fragilidad, por ejemplo, en los ancianos. La sarcopenia también puede abarcar una afección o síntoma asociado a la sarcopenia que incluye, pero sin limitación, pérdida de masa del músculo esquelético, debilidad muscular, fatiga, discapacidad y morbilidad.

Las expresiones "disminuir", "reducir", "reducido", "reducción", "disminución", e "inhibir" todas se usan en el presente documento, en general, para significar una disminución en una cantidad estadísticamente significativa relativa a una referencia. Sin embargo, para disipar cualquier duda, "reducir", "reducción" o "disminución" o "inhibición" significa una disminución de al menos un 10% en comparación con un nivel de referencia y puede incluir, por ejemplo, una disminución de al menos alrededor de un 20 %, al menos alrededor de un 25 %, al menos alrededor de un 30 %, al menos alrededor de un 35 %, al menos alrededor de un 40 %, al menos alrededor de un 45 %, al menos alrededor de un 50 %, al menos alrededor de un 55 %, al menos alrededor de un 60 %, al menos alrededor de un 65 %, al menos alrededor de un 70 %, al menos alrededor de un 75 %, al menos alrededor de un 80 %, al menos alrededor de un 85 %, al menos alrededor de un 90 %, al menos alrededor de un 95 %, al menos alrededor de un 98 %, al menos alrededor de un 99 %, hasta, e incluso, por ejemplo, la ausencia completa de la entidad o el parámetro dado en comparación con el nivel de referencia, o cualquier disminución entre un 10-99 % en comparación con la ausencia de un tratamiento dado.

Las expresiones "aumentado", "aumentar", "potenciar" o "activar" todas se usan en el presente documento, en general, para significar un aumento en una cantidad estadísticamente significativa; para evitar cualquier duda, las expresiones "aumentado", "aumentar" "potenciar" o "activar" significan un aumento de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un aumento de al menos alrededor de un 20 %, o al menos alrededor de un 30 %, o al menos alrededor de un 40 %, o al menos alrededor de un 50 %, o al menos alrededor de un 60 %, o al menos alrededor de un 70 %, o al menos alrededor de un 80 %, o al menos alrededor de un 90 % o hasta e incluido un aumento de un 100 % o cualquier aumento entre 10-100 % en comparación con un nivel de referencia, o al menos un aumento de alrededor de 2 veces, o al menos alrededor de 3 veces, o al menos alrededor de 4 veces, o al menos alrededor de 5 veces o al menos alrededor de 10 veces, o cualquier aumento entre 2 veces y 10 veces o superior en comparación con un nivel de referencia.

La expresión "aislado" o "parcialmente purificado" como se usa en el presente documento se refiere, en el caso de un ácido nucleico o polipéptido, a un ácido nucleico o polipéptido separado de al menos otro componente (por ejemplo, ácido nucleico o polipéptido) que está presente con el ácido nucleico o polipéptido como se encuentra en su fuente natural y/o que estaría presente con el ácido nucleico o polipéptido cuando es expresado por una célula, o secretado en el caso de polipéptidos secretados. Un ácido nucleico o polipéptido químicamente sintetizado o uno sintetizado usando transcripción/traducción in vitro se considera "aislado".

La expresión "muestra biológica" como se usa en el presente documento indica una muestra tomada o aislada de un organismo biológico, por ejemplo, muestra del músculo esquelético, muestra de sangre, lisado de células, un homogeneizado de una muestra tisular de un sujeto, o una muestra de fluido de un sujeto. Muestras biológicas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, biopsias de tejido muscular esquelético o muestras de sangre y/o suero. En algunas realizaciones, la muestra es de una extirpación, biopsia o biopsia con aguja gruesa. Además, pueden usarse muestras aspiradas por aguja fina. Las muestras pueden incluir tejido incrustado en parafina y congelado. La expresión "muestra biológica" también incluye muestras biológicas sin tratar o pretratadas (o preprocesadas). En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra biológica sin tratar. La muestra puede obtenerse extrayendo una muestra de células de un sujeto, pero también pueden conseguirse usando células previamente aisladas (por ejemplo, aisladas en un momento anterior y aisladas por la misma persona u otra).

Como se usa en el presente documento, un "sujeto" significa un ser humano o un animal. Por lo general, el animal es un vertebrado, tal como un primate, roedor, animal doméstico o animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cynomolgous, monos araña y macacos, por ejemplo, Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, especies felinas, por ejemplo, gato doméstico, especies caninas, por ejemplo, perro, zorro, lobo, especies avícolas, por ejemplo, pollo, emú, avestruz, y peces, por ejemplo, trucha, bagre y salmón. El paciente o el sujeto incluye cualquier subconjunto de los anteriores, por ejemplo, todos los anteriores, pero excluyendo uno o más grupos o especies tales como seres humanos, primates o roedores. En determinadas realizaciones, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano. Los términos "paciente", "individuo" y "sujeto" se usan en el presente documento indistintamente. Preferentemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca, pero no se limitan a estos ejemplos. De manera ventajosa pueden utilizarse mamíferos distintos de seres humanos, por ejemplo, como sujetos que representan modelos animales de, por ejemplo, sarcopenia. Además, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar animales domésticos y/o mascotas. Un sujeto puede ser macho o hembra. Un sujeto puede ser uno al que previamente se le ha diagnosticado o se ha identificado que padece o que tiene una afección que necesita tratamiento (por ejemplo, una afección muscular esquelética, por ejemplo, sarcopenia) una o más complicaciones relacionadas con dicha afección y, opcionalmente, pero no necesariamente, ya se ha sometido a tratamiento para una afección o la complicación o complicaciones relacionadas con la afección. De manera alternativa, un sujeto también puede ser uno al que previamente no se le ha diagnosticado que tiene una afección que necesite tratamiento o una o más complicaciones relacionadas con dicha afección. En cambio, un sujeto puede incluir uno que presente uno o más factores de riesgo para una afección o una o más complicaciones relacionadas con una afección. Un "sujeto que necesita" tratamiento para una afección particular puede ser un sujeto que tiene esa afección, diagnosticado que tiene esa afección, o en riesgo aumentado de desarrollar esa afección en relación con una población de referencia dada.

Como se usa en el presente documento, la expresión "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a las composiciones, los métodos y el(los) respectivo(s) componente(s) de los mismos, que son esenciales para el método o la composición., pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

La expresión "que consiste en" se refiere a composiciones, métodos y componentes correspondientes de los mismos como se describe en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realización.

Como se usa en el presente documento, la expresión "que consiste esencialmente en" se refiere a los elementos requeridos para una realización dada. La expresión permite la presencia de elementos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas o funcionales de esa realización.

La expresión "estadísticamente significativo" o "de manera significativa" se refiere a la significancia estadística y, en general, significa un valor p mayor que 0,05 (calculado por la prueba estadística relevante). Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que la prueba estadística relevante para cualquier experimento particular depende del tipo de datos que hay que analizar. En el texto de las secciones individuales de a continuación se proporcionan definiciones adicionales.

Definiciones de términos comunes en biología celular y biología molecular pueden encontrarse en "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19a edición, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), "The Encyclopedia of Molecular Biology", publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); La guía de ELISA ("Methods in molecular biology" 149) de Crowther J. R. (2000); "Immunology" de Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006. También pueden encontrarse definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, "Genes X", publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), "Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference", publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) y "Current Protocols in Protein Sciences" 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds.

A menos que se indique lo contrario, la presente invención se realizó utilizando procedimientos estándares, como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE. UU. (2001) y Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology", Elsevier Science Publishing, Inc., Nueva York, EE. UU. (1995)

En el presente documento, se describen métodos que comprenden administrar a un sujeto una composición que aumente el nivel del polipéptido de GDF11 en el sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es uno que tiene, o se le ha diagnosticado que tiene una afección muscular esquelética debido al envejecimiento. Como se usa en el presente documento, una "afección muscular esquelética" debido al envejecimiento se refiere a una afección muscular esquelética descrita en el presente documento que es atribuible a la edad de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es uno que está en riesgo de desarrollar una afección muscular esquelética debido al envejecimiento. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto de edad avanzada. En algunas realizaciones, un sujeto de edad avanzada tiene más de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 100 años.

En algunas realizaciones, la composición que aumenta el nivel del polipéptido de GDF11 es para su uso en un sujeto que tiene o se le ha diagnosticado una enfermedad neuromuscular descrita en el presente documento.

En algunos casos, el nivel de polipéptido de GDF11 es el nivel de GDF11 en la circulación de un sujeto. En algunos casos, el nivel de polipéptido de GDF11 es el nivel de GDF11 en el tejido del músculo esquelético de un sujeto. En algunos casos, el nivel de polipéptido de GDF11 se determina midiendo el nivel de un ARNm que codifica un polipéptido de GDF11. El nivel de GDF11 en un sujeto se puede determinar obteniendo una muestra biológica del sujeto y determinando el nivel de GDF11 en dicha muestra. Los métodos para determinar el nivel de un polipéptido en un sujeto o en una muestra obtenida de un sujeto, son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, ELISA, radioinmunoensayo, inmunohistoquímica, métodos que implican un anticuerpo marcado específico para GDF11, análisis de inmunotransferencia por puntos, bioensayos funcionales, transferencia Northern, hibridación in situ y RT-PCR, tecnología proteómica basada en aptámeros (por ejemplo, SOMAscan ™ disponible en el mercado de SomaLogic, Inc.) entre otros. Los anticuerpos específicos a GDF11 están disponibles en el mercado, (por ejemplo, el N.° de Cat. ab71347 de Abcam: Cambridge, MA). En algunos casos, los anticuerpos son anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada con GDF8. En algunos casos, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales selectivos de GDF11. El nivel de GDF11 puede medirse como se describe en Souza et al., Molecular Endocrinology 2008 22:2689-2702.

A medida que se envejece, el músculo esquelético con frecuencia se atrofia y experimenta disminución del potencial regenerativo debido al deterioro de las células madre del músculo esquelético, que con frecuencia está acompañado de una o más afecciones musculares esqueléticas (por ejemplo, sarcopenia). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que el deterioro de las células madre del músculo esquelético y la masa muscular esquelética reducida relacionada característica da como resultado parte de los niveles disminuidos del polipéptido de GDF11 en circulación. Mientras que el trabajo previamente descrito por los inventores mostró que la hipertrofia cardíaca o el aumento del músculo cardíaco debido al envejecimiento se correlacionaron con los niveles disminuidos del polipéptido de GDF11 en circulación, el trabajo descrito en el presente documento demuestra que los niveles disminuidos del polipéptido de GDF11 en circulación da como resultado la disminución del potencial regenerativo del músculo esquelético debido al deterioro de las células madre del músculo esquelético. En trabajos anteriores, los inventores encontraron que niveles crecientes del polipéptido de GDF11 en circulación en un sujeto invertían eficazmente la hipertrofia cardíaca y el tejido cardíaco realmente contraído. En cambio, el trabajo descrito en el presente documento sorprendente e inesperadamente demuestra que el polipéptido de GDF11 rejuvenece las células madre del músculo esquelético y realmente agranda el músculo esquelético, mejorando de este modo el potencial regenerativo del músculo esquelético.

Sorprendentemente, el trabajo descrito en el presente documento demuestra que en los ratones viejos tratados in vivo con inyección IP diaria de GDF11 recombinante (rGDF11) se produjo el aumento de las células madre del músculo esquelético de los sujetos en cuanto a frecuencia o número, el aumento del tamaño de miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de núcleos intactos de célula madre muscular, y la disminución del porcentaje del ácido desoxirribonucleico (ADN) gravemente dañado (es decir, el tratamiento con rGDF11 rejuveneció las células madre del músculo esquelético). En particular, el tratamiento con rGDF11 alteró la distribución de tamaños del área transversal de las fibras regenerantes de alrededor de 300-700 pm a alrededor de 400-1000 pm (Figura 3B), aumentó la frecuencia de las células madre del músculo esquelético (por ejemplo, aumentó la presencia de células regenerativas) en músculos viejos en entre alrededor de un 33 % y 66 % (Figura 3C), aumentó la eficacia de formación de colonia miogénica en alrededor de 2 veces (Figura 3D), aumentó el porcentaje de núcleos intactos (barrar verdes, Figura 3E), disminuyó el porcentaje de células madre del músculo esquelético con ADN gravemente dañado en 4 veces (barras rojas, Figura 3E).

En el presente documento, se describe un método para rejuvenecer las células madre del músculo esquelético en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que aumente el nivel del polipéptido de GDF11 en el sujeto. En algunos casos, la composición provoca el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de los núcleos intactos de las células madre del músculo esquelético, y la disminución del porcentaje de ácido desoxirribonucleico (ADN) gravemente dañado, rejuveneciendo de este modo las células madre del músculo esquelético en el sujeto.

En el presente documento, también se describe un método para fomentar la regeneración de las células madre del músculo esquelético en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que aumente el nivel del polipéptido de GDF11 en el sujeto, en donde la composición provoca el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de los núcleos intactos, y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado, fomentando de este modo la regeneración del músculo esquelético en el sujeto.

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento se refieren al aumento del nivel del polipéptido de GDF11 en un sujeto. Como se usa en el presente documento, "GDF11" se refiere al "factor de crecimiento y diferenciación 11" (N.° ID del gen del NCBI: 10220), un miembro de la superfamilia de factores de crecimiento del factor de crecimiento transformante beta. Se sabe que GDF11 se une a receptores de tipo I de la superfamilia de TGFp3, incluido ALK4, ALK5 y ALK7. Para la señalización en el desarrollo de mamíferos, GDF11 utiliza predominantemente ALK4 y ALK5. En algunos casos, la señalización de GDF11 también puede producirse a través del receptor de ACVR2B. GDF11 también está muy relacionado con GDF8 (también conocido como miostatina). GDF11 también se denomina proteína morfogénica ósea 11 o BMP11. Como se usa en el presente documento, "GDF11" puede incluir el polipéptido precursor humano (Sec. de ref. de NCBI: NP_005802); el propéptido humano; el polipéptido N-terminal humano, y las formas maduras humanas de GDF11, así como homólogos de otras especies, incluyendo, pero sin limitación, bovinas, perro, gato, pollo, murinas, rata, porcinas, bovinas, pavo, caballo, peces, babuínos y otros primates. Las expresiones también se refieren a fragmentos o variantes de GDF11 que conservan al menos un 50 % del efecto de rejuvenecimiento de las células madre del músculo esquelético de longitud completa de un propéptido de GDF11 humano, un polipéptido precursor de GDF11, o un GDF11 maduro, por ejemplo, como se mide en un modelo animal apropiado (por ejemplo, parabiosis heterocrónica de ratones viejos).

Las variantes de sustitución conservativa que conservan el efecto de rejuvenecimiento de las células madre del músculo esquelético del GDF11 tipo silvestre, incluirán una sustitución conservativa como se define en el presente documento. La identificación de aminoácidos con mayor probabilidad de tolerar la sustitución conservativa conservando al mismo tiempo al menos un 50 % de la actividad de GDF11 tipo silvestre, está guiada por, por ejemplo, el alineamiento de secuencias con homólogos o parálogos de GDF11 de otras especies. Los aminoácidos que son idénticos entre los homólogos de GDF11 tienen menos probabilidades de tolerar el cambio, mientras que los que muestran diferencias conservativas son obviamente mucho más propensos a tolerar cambios conservativos en el contexto de una variante artificial. De manera similar, las posiciones con diferencias no conservativas tienen menos probabilidades de ser críticas para funcionar y más probabilidades de tolerar la sustitución conservativa en una variante artificial. Se puede analizar la actividad de las variantes, por ejemplo, administrando la variante a un modelo animal apropiado (por ejemplo, ratones viejos criolesionados para inducir la regeneración postlesión).

En el caso de GDF11 humano, el propéptido más la secuencia señal (por ejemplo, el polipéptido precursor) tiene una longitud de 407 aminoácidos. La escisión del péptido señal de 24 aminoácidos genera un propéptido de 383 aminoácidos y la escisión del propéptido da como resultado un polipéptido de GDF11 maduro de 109 aminoácidos que corresponde a los 109 aminoácidos del extremo C del propéptido. El polipéptido maduro forma un homodímero unido por disulfuro. La escisión del propéptido también genera el polipéptido N-terminal que comprende los aminoácidos 25-298 del polipéptido precursor de GDF11. El polipéptido N-terminal de GDF11 puede antagonizar la actividad de, por ejemplo, los polipéptidos del propéptido de GDF11 humano y el GDF11 maduro humano, al menos in vitro formando un complejo con otras formas de polipéptidos de GDF11 y, por tanto, puede usarse para modular la actividad de las composiciones de GDF11 descritas en el presente documento. Por tanto, en medida en que los polipéptidos de GDF11 como se describen en el presente documento rejuvenecen las células madre del músculo esquelético o fomentan la regeneración del músculo esquelético, y en medida en que el polipéptido de GDF11 N-terminal puede antagonizar dichos efectos, el polipéptido N-terminal de GDF11 humano puede excluirse del significado de "polipéptido de GDF11" tal como se usa esa expresión en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, los términos "proteínas" y "polipéptidos" se usan indistintamente para designar una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos entre los grupos alfa amino y carboxilo de residuos adyacentes. Los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a un polímero de aminoácidos proteicos, incluyendo aminoácidos modificados (por ejemplo, fosforilados, glicados, glicosilados, etc.) y análogos de aminoácidos, independientemente de su tamaño o función. "Proteína" y "polipéptido" se usan a menudo en referencia a polipéptidos relativamente grandes, mientras que el término "péptido" se usa a menudo en referencia a polipéptidos pequeños, pero el uso de estos términos en la técnica se superpone. Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento cuando se refieren a un producto génico y a sus fragmentos.

Por tanto, como ejemplos de polipéptidos o proteínas se incluyen productos génicos, proteínas de origen natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes, fragmentos y análogos de los mencionados anteriormente.

Como se usa en el presente documento, "propéptido" usado en referencia a GDF11 se refiere a un polipéptido de GDF11 en el que el dominio señal (por ejemplo, los aminoácidos 1-24 del polipéptido precursor de GDF11 humano) se ha escindido durante la formación de las formas maduras y/o activas de GDF11. Como se usa en el presente documento, "péptido precursor" usado en referencia a un polipéptido de GDF11 que comprende el dominio señal, por ejemplo, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del polipéptido precursor de GDF11 humano.

La composición de acuerdo con la presente invención comprende un polipéptido de GDF11 y/o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de GDF11. El polipéptido de GDF11 puede comprender un polipéptido de GDF11 como se ha descrito anteriormente en el presente documento, por ejemplo, una forma propéptido o madura. En algunas realizaciones, el polipéptido de GDF11 comprende la secuencia de aminoácidos del polipéptido precursor de GDF11 humano. En algunas realizaciones, el polipéptido de GDF11 comprende la secuencia de aminoácidos del propéptido de GDF11 humano. En algunas realizaciones, el polipéptido de GDF11 comprende la secuencia de aminoácidos de GDF11 maduro humano. En algunas realizaciones, el polipéptido de GDF11 comprende la secuencia de aminoácidos del polipéptido N-terminal de GDF11 humano.

En algunas realizaciones, la composición puede comprender homodímeros del polipéptido de GDF11 que comprenden polipéptidos de la secuencia de aminoácidos de un GDF11 maduro humano. En algunas realizaciones, la composición puede comprender homodímeros del polipéptido de GDF11 que comprenden polipéptidos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido N-terminal de GDF11 humano. En algunas realizaciones, la composición puede comprender homodímeros del polipéptido de GDF11 que comprenden polipéptidos de la secuencia de aminoácidos de un propéptido de GDF11 humano. En algunas realizaciones, la composición administrada al sujeto puede comprender homodímeros del polipéptido de GDF11 que comprenden la secuencia de aminoácidos de un polipéptido precursor de GDF11 humano. En algunas realizaciones, la composición puede comprender heterodímeros del polipéptido de GDF11 que comprenden polipéptidos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido N-terminal de GDF11, el GDF11 humano, un propéptido de GDF11 humano, y/o un polipéptido precursor de GDF11 humano.

En algunos casos, puede administrarse a un sujeto una variante o fragmento de un polipéptido de GDF11. En algunos casos, la variante de GDF11 es una variante conservativamente modificada. En algunos casos, al sujeto se le puede administrar una variante o fragmento (por ejemplo, una variante conservativamente modificada o un fragmento funcional o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido) de un polipéptido seleccionado de entre Colectina riñón 1 (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 78989), Catespina D (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 1509), Proteína relacionada con Dickkopf 4 (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 27121), Proteína de membrana de eritrocito 4.1 (por ejemplo, N.° ID del gen de ^{N c B I :} 2035), esterasa D (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 2098), hemoglobina (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 3043 o 3047), proteína accesoria receptora de interleucina-1 (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 3556), miembro D del grupo 2 de linfocitos citolíticos naturales (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 22914), sustrato 1 de toxina botulínica C3 relacionada con ras (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 5879), proteína nuclear de unión a GTP Ran (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 5901), inhibidor tisular de las metaloproteasas 3 (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 7078), y timidilato sintasa (por ejemplo, N.° ID del gen de NCBI: 7298).

En algunos casos, el polipéptido de GDF11 puede ser una variante de una secuencia descrita en el presente documento, por ejemplo, una variante de un polipéptido de GDF11 que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido N-terminal de GDF11, un GDF11 maduro humano, un propéptido de GDF11 humano o un polipéptido precursor de GDF11 humano. En algunos casos, la variante es una variante de sustitución conservadora. Las variantes pueden obtenerse mediante mutaciones de secuencias nucleotídicas nativas, por ejemplo. Una "variante", como se hace referencia en el presente documento, es un polipéptido sustancialmente homólogo a un polipéptido nativo o de referencia, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la del polipéptido nativo o de referencia debido a un gran número de deleciones, inserciones o sustituciones. Las secuencias de ADN que codifican el polipéptido abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con una secuencia de ADN nativa o de referencia, pero que codifican una proteína variante o fragmento de la misma que conserva la actividad biológica relevante relativa a la proteína de referencia, por ejemplo, pueden rejuvenecer las células madre del músculo esquelético al menos un 50 % así como el GDF11 tipo silvestre. En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia proteica que altera un aminoácido único o un pequeño porcentaje, (por ejemplo, un 5 % o inferior, por ejemplo, un 4 % o inferior, o un 3 % o inferior, o un 1 % o inferior) de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Se contempla que algunos cambios pueden mejorar potencialmente la actividad relevante, de tal modo que una variante, ya sea conservativa o no, tiene más del 100 % de la actividad del GDF11 tipo silvestre, por ejemplo, el 110 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 500 %, 1000 % o más.

Un método para identificar los residuos de aminoácidos que pueden sustituirse es alinear, por ejemplo, el GDF11 humano a un homólogo de GDF11 de una o más especies no humanas. El alineamiento puede proporcionar la guía con relación no solo a residuos probables de ser necesarios para funcionar, sino también, por el contrario, a aquellos residuos probables de tolerar el cambio. Cuando, por ejemplo, un alineamiento muestra dos aminoácidos idénticos o similares en las correspondientes posiciones, es más probable que ese sitio sea funcionalmente importante. Cuando, por el contrario, el alineamiento muestra que los residuos en las correspondientes posiciones difieren significativamente en tamaño, carga, hidrofobicidad, etc., es más probable que ese sitio pueda tolerar la variación en un polipéptido funcional. De manera similar, el alineamiento con un polipéptido relacionado de la misma especie, por ejemplo, GDF8, que no muestra la misma actividad, también puede proporcionar la guía con respecto a las regiones o estructuras requeridas para la actividad de GDF11. La Figura 7 representa un ejemplo de alineamiento entre el péptido precursor de GDF11 humano (secuencia query; residuos 62-407 de un polipéptido precursor de GDF11 humano) y el péptido precursor de GDF8 humano creado usando los ajustes predeterminados de la herramienta de alineamiento del programa BLASTP, gratuito en la página http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/. La Figura 8 representa un ejemplo de alineamiento entre el péptido precursor de GDF11 humano (secuencia query; residuos 47-407 de un polipéptido precursor de GDF11 humano) y el péptido precursor de GDF11 murino creado usando los ajustes predeterminados de la herramienta de alineamiento del programa BLASTP, gratuito en la página http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/. El aminoácido o la secuencia de ADN variante puede ser de al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o más, idéntica a una secuencia nativa o de referencia, por ejemplo, un polipéptido N-terminal de GDF11, un GDF11 maduro humano, un propéptido de GDF11 humano o un polipéptido precursor de GDF11 humano o un ácido nucleico que codifica una de aquellas secuencias de aminoácidos. El grado de homología (porcentaje de identidad) entre una secuencia nativa y una mutante puede determinarse, por ejemplo, comparando las dos secuencias usando programas informáticos gratuitos comúnmente empleados para este fin en internet. El aminoácido o la secuencia de ADN variante puede ser de al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o más, similar a la secuencia de la cual procede (referida en el presente documento como secuencia "original"). El grado de similitud (porcentaje de identidad) entre una secuencia original y una mutante puede determinarse, por ejemplo, usando una matriz de similitud. Las matrices de similitud son bien conocidas en la técnica y un número de herramientas para comparar dos secuencias usando matrices de similitud son gratuitas online, por ejemplo, BLASTp (disponible en la página http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), con el ajuste de parámetros predeterminados.

Se observa que el polipéptido de GDF11 maduro incluye probablemente enlaces disulfuro intercatenarios entre, los aminoácidos 313 y 372; 341 y 404; y 345 y 406 (enumerados en relación con el polipéptido completo, incluyendo la secuencia señal) y el aminoácido 371 probablemente participa en el enlace disulfuro intercatenario.

Un aminoácido dado puede ser reemplazado por un residuo que tiene características fisioquímicas similares, por ejemplo, sustituyendo un residuo alifático por otro (tal como, Ile, Val, Leu, o Ala por otro), o la sustitución de un residuo polar por otro (tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn). Otras de dichas sustituciones conservativas, por ejemplo, las sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas. Los polipéptidos que comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas pueden analizarse en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento para confirmar que se retiene una actividad apoptótica deseada de un polipéptido nativo o de referencia. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas conservativamente son adicionales, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos interespecíficos, y los alelos coherentes con la divulgación. Las sustituciones normalmente conservativas para otro incluyen: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del polipéptido también puede sustituirse, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el reticulado aberrante. Por el contrario, pueden añadirse enlace o enlaces de cisteína al polipéptido para mejorar su estabilidad para facilitar la oligomerización.

En algunos casos, el polipéptido de GDF11 administrado a un sujeto puede comprender una o más sustituciones o modificaciones de aminoácidos. En algunos casos, las sustituciones y/o modificaciones pueden prevenir o reducir la degradación proteolítica y/o prolongar la semivida del polipéptido en el sujeto. En algunas realizaciones, un polipéptido de GDF11 puede modificarse conjugándose o fusionándose a otro polipéptido o dominios de polipéptido tales como, a modo de ejemplo no limitante, transferrina (documento WO06096515A2), albúmina (Yeh et al., 1992), hormona del crecimiento (documento US2003104578AA); celulosa (Levy y Shoseyov, 2002); y/o fragmentos Fc (Ashkenazi y Chamow, 1997). Un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento puede comprender al menos un reemplazo de enlace peptídico. Pueden reemplazarse un enlace peptídico sencillo o enlaces peptídicos múltiples, por ejemplo, 2 enlaces, 3 enlaces, 4 enlaces, 5 enlaces o 6 o más enlaces, o todos los enlaces peptídicos. Un péptido aislado como se describe en el presente documento puede comprender un tipo de reemplazo de enlace peptídico o múltiples tipos de reemplazos de enlace peptídico, por ejemplo, 2 tipos, 3 tipos, 4 tipos, 5 tipos o más tipos de reemplazos de enlace peptídico. Ejemplos no limitantes de reemplazos de enlace peptídico incluyen urea, tiourea, carbamato, sulfonilurea, trifluoroetilamina, ácido orto-(aminoalquil)-fenilacético, ácido para-(aminoalquil)-fenilacético, ácido meta-(aminoalquil)-fenilacético, tioamida, tetrazol, éster borónico, grupo olefínico y derivados de los mismos.

Un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento puede comprender aminoácidos de origen natural comúnmente encontrados en polipéptidos y/o proteínas producidas por organismos vivos, por ejemplo, Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Glu (E), Lys (K), Arg (R) e His (H). El polipéptido de AGDF11 como se describe en el presente documento puede comprender aminoácidos alternativos. Ejemplos no limitantes de los aminoácidos pueden incluir, ácidos D-anilino; aminoácidos beta; homocisteína, fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina, hidroxiprolina, gammacarboxiglutamato; ácido hipúrico, ácido octahidroindol-2-carboxílico, estatina,

ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, penicilamina (3-mercapto-D-valina), ornitina, citrulina, alfametilalanina, parabenzoilfenilalanina, paraamino fenilalanina, p-fluorofenilalanina, fenilglicina, propargilglicina, sarconsina, y ferc-butilglicina), ácido diaminobutírico, ácido 7-hidroxitetrahidroisoquinolina carboxílico, naftilalanina, bifenilalananina, ciclohexilalanina, ácido aminoisobutírico, norvalina, norleucina, terc-leucina, ácido tetrahidroisoquinolina carboxílico, ácido pipecólico, fenilglicina, homofenilalanina, ciclohexilglicina, deshidroleucina, 2,2-dietilglicina, ácido 1-amino-1-ciclopentanocarboxílico, ácido 1-amino-1-ciclohexanocarboxílico, ácido aminobenzoico, ácido aminonaftóico, ácido gamma-aminobutírico, difluorofenilalanina, ácido nipecótico, ácido alfaanlino butírico, tienilalanina, t-butilglicina, trifluorovalina; hexafluoroleucina; análogos fluorados; aminoácidos azida modificados; aminoácidos alquino modificados; aminoácidos ciano modificados; y derivados de los mismos.

Un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento puede modificarse, por ejemplo, mediante la adición de un resto a uno o más de los aminoácidos que comprenden el péptido. En algunas realizaciones, un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento puede comprender una más moléculas resto, por ejemplo, 1 o más moléculas resto por péptido, 2 o más moléculas resto por péptido, 5 o más moléculas resto por péptido, 10 o más moléculas resto por péptido o más moléculas resto por péptido. Un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento puede comprender uno o más tipos de modificaciones y/o restos, por ejemplo, 1 tipo de modificación, 2 tipos de modificaciones, 3 tipos de modificaciones o más tipos de modificaciones. Ejemplos no limitantes de modificaciones y/o restos incluyen PEGilación; glucosilación; HESilación; ELPilación; lipidación; acetilación; amidación; modificaciones de la protección del extremo ("end-capping"); grupos ciano; fosforilación; albúmina y ciclización. Una modificaciones de la protección del extremo puede comprender acetilación en el extremo N, acilación N-terminal y/o formilación N-terminal. Una modificación de la protección del extremo puede comprender la amidación en el extremo C, introducción de restos de alcohol, aldehído, éster y tioéster C-terminales. La semivida de un polipéptido de GDF11 puede aumentarse mediante la adición de restos, por ejemplo, PEG o albúmina.

En algunos casos, el polipéptido de GDF11 administrado al sujeto puede ser un fragmento funcional de una de las secuencias de aminoácidos de GDF11 descritas en el presente documento. Como se usa en el presente documento, un "fragmento funcional" es un fragmento o segmento de un péptido que puede rejuvenecer las células madre del músculo esquelético en un sujeto de acuerdo con el trabajo descrito en el presente documento. Un fragmento funcional puede comprender sustituciones conservativas de las secuencias descritas en el presente documento. En algunos casos, un fragmento funcional puede comprender el extremo C de 12,5 kDa de GDF11. En algunos casos, el extremo C de 12,5 KDa de GDF11 puede funcionar como un monómero. En algunos casos, el extremo C de 12,5 KDa de GDF11 puede funcionar como un homodímero. En algunos casos, el extremo C de 12,5 KDa de GDF11 puede funcionar como un heterodímero con el polipéptido de GDF11.

Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos pueden conseguirse mediante cualquier cantidad de técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las mutaciones pueden introducirse, por ejemplo, en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueados por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada. De manera alternativa, los procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótido pueden emplearse para proporcionar una secuencia nucleotídica alterada que tiene codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, deleción o inserción requerida. Las técnicas para realizar dichas alteraciones incluyen aquellas divulgadas por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. ("Genetic Engineering: Principles and Methods", Plenum Press, 1981); y las Patentes de Estados Unidos N.° 4.518.584 y 4.737.462. Un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento puede sintetizarse químicamente y las mutaciones pueden incorporarse como parte del proceso de síntesis química.

Un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento se puede formular como profármaco farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, un "profármaco" se refiere a compuestos que se pueden convertir por cualquier proceso químico o fisiológico (por ejemplo, procesos enzimáticos e hidrólisis metabólica) en un agente terapéutico. Por tanto, el término "profármaco" también se refiere a un precursor de un compuesto biológicamente activo que es farmacéuticamente aceptable. Un profármaco puede estar inactivo cuando se administra a un sujeto, es decir, un éster, pero se convierte in vivo en un compuesto activo, por ejemplo, por hidrólisis al ácido carboxílico libre o hidroxilo libre. El compuesto de profármaco suele ofrecer ventajas de solubilidad, compatibilidad con tejidos o liberación retardada en un organismo. El término "profármaco" también pretende incluir cualquier vehículo unido covalentemente, que libere el compuesto activo in vivo cuando se administre dicho profármaco a un sujeto. Los profármacos de un compuesto activo se pueden preparar modificando los grupos funcionales presentes en el compuesto activo de manera que se escindan las modificaciones, por manipulación rutinaria o in vivo, para dar el compuesto activo precursor. Los profármacos incluyen compuestos de la invención en los que un grupo hidroxi, amino o mercapto se une a cualquier grupo que, cuando el profármaco del compuesto activo se administra a un sujeto, se escinde para formar un grupo hidroxi libre, amino libre o mercapto libre, respectivamente. Los ejemplos de profármacos incluyen, pero sin limitación, derivados de acetato, formato y benzoato de un alcohol o derivados de acetamida, formiato y benzoato de un grupo funcional amina en el compuesto activo, y similares. Véase Harper, "Drug Latentiation" en Jucker, ed. Progress in Drug Research 4:221-294 (1962); Morozowich et al, "Application of Physical Organic Principles to Prodrug Design" en E. B. Roche ed. Design of Biophamzaceutical Properties through Prodrugs and Analogs, ApHA Acad. Pharm. Sci. 40 (1977); "Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design, Theory and Application", E. B. Roche, ed., APHA Acad. Pharm. Sci. (1987); "Design of Prodrugs", H. Bundgaard, Elsevier (1985); Wang et al. "Prodrug approaches to the improved delivery of peptide drug" en Curr. Pharm. Design. 5( 4):265-287 (1999); Pauletti et al. (1997) "Improvement in peptide bioavailability: Peptidomimetics and Prodrug Strategies", Adv. Drug. Delivery Rev. 27:235-256; Mizen et al. (1998) "The Use of Esters as Prodrugs for Oral Delivery of (3-Lactam antibiotics", Pharm. Biotech. 11,:345-365; Gaignault et al. (1996) "Designing Prodrugs and Bioprecursors I. Carrier Prodrugs", Pract. Med. Chern. 671-696; Asgharnejad, "Improving Oral Drug Transport", en Transport Processes in Pharmaceutical Systems, G. L. Amidon, P. I. Lee and E. M. Topp, Eds., Marcell Dekker, p. 185-218 (2000); Balant et al., "Prodrugs for the improvement of drug absorption via different routes of administration", Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet., 15(2): 143-53 (1990); Balimane y Sinko, "Involvement of multiple transporters in the oral absorption of nucleoside analogues", Adv. Drug Delivery Rev., 39(1-3): 183-209 (1999); Browne, "Fosphenytoin (Cerebyx)", Clin. Neuropharmacol. 20(1): 1-12 (1997); Bundgaard, "Bioreversible derivatization of drugs-principle and applicability to improve the therapeutic effects of drugs", Arch. Pharm. Chemi 86(1): 1-39 (1979); Bundgaard H. "Improved drug delivery by the prodrug approach", Controlled Drug Delivery 17: 179-96 (1987); Bundgaard H. "Prodrugs as a means to improve the delivery of peptide drugs", Adv. Drug Deliv Rev. 8(1): 1-38 (1992); Fleisher et al. "Improved oral drug delivery: solubility limitations overcome by the use of prodrugs", Adv. Drug Delivery Rev. 19(2): 115-130 (1996); Fleisher et al. "Design of prodrugs for improved gastrointestinal absorption by intestinal enzyme targeting", Methods Enzymol. 112 (Drug Enzyme Targeting, Pt. A): 360-81, (1985); Farquhar D, et al., "Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups", Pharm. Sci., 72(3): 324-325 (1983); Freeman S, et al., "Bioreversible Protection for the Phospho Group: Chemical Stability and Bioactivation of Di( 4-acetoxybenzyl) Methylphosphonate with Carboxyesterase", Chern. Soc., Chern. Commun., 875-877 (1991); Friis y Bundgaard, "Prodrugs of phosphates and phosphonates: Novel lipophilic alphaacyloxyalkyl ester derivatives of phosphate- or phosphonate containing drugs masking the negative charges of these groups", Eur. J. Pharm. Sci. 4: 49-59 (1996); Gangwar et al., "Pro-drug, molecular structure and percutaneous delivery", Des. Biophamz. Prop. Prodrugs Analogs, [Symp.] Fecha del encuentro 1976,409-21. (1977); Nathwani y Wood, "Penicillins: a current review of their clinical pharmacology and therapeutic use", Drugs 45(6): 866­ 94 (1993); Sinhababu y Thakker, "Prodrugs of anticancer agents", Adv. Drug Delivery Rev. 19(2): 241-273 (1996); Stella et al., "Prodrugs. Do they have advantages in clinical practice?", Drugs 29(5): 455-73 (1985); Tan et al. "Development and optimization of anti-HIV nucleoside analogs and prodrugs: A review of their cellular pharmacology, structure-activity relationships and pharmacokinetics", Adv. Drug Delivery Rev. 39(1-3): 117-151 (1999); Taylor, "Improved passive oral drug delivery via prodrugs", Adv. Drug Delivery Rev., 19(2): 131-148 (1996); Valentino y Borchardt, "Prodrug strategies to enhance the intestinal absorption of peptides", Drug Discovery Today 2(4): 148-155 (1997); Wiebe y Knaus, "Concepts for the design of anti-HIV nucleoside prodrugs for treating cephalic HIV infection", Adv. Drug Delivery Rev.: 39(1-3):63-80 (1999); Waller et al., "Prodrugs", Br. J. Clin. Pharmac. 28: 497-507 (1989).

Un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento puede ser un solvato farmacéuticamente aceptable. El término "solvato" se refiere a un péptido como se describe en el presente documento en estado sólido, en donde las moléculas de un disolvente adecuado se incorporan en la red cristalina. Un disolvente adecuado para la administración terapéutica es fisiológicamente tolerable a la dosis administrada. Ejemplos de disolventes adecuados para la administración terapéutica son etano y agua. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina "hidrato". En general, los solvatos se forman disolviendo el compuesto en el disolvente apropiado y aislando el solvato mediante enfriamiento o usando un antidisolvente. El solvato normalmente se seca o se forma como azeótropo en condiciones ambientales.

Los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse usando métodos bien conocidos que incluyen métodos recombinantes y síntesis química. Los métodos recombinantes para producir un péptido a través de la introducción de un vector que incluye el ácido nucleico que codifica el péptido en una célula hospedadora adecuada son bien conocidos en la técnica, tal como se describe en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed, volúmenes 1 a 8, Cold Spring Harbor, NY (1989); M.W. Pennington y B.M. Dunn, "Methods in Molecular Biology: Peptide Synthesis Protocols", Vol 35, Humana Press, Totawa, NJ (1994).

Los péptidos también pueden sintetizarse químicamente usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Merrifield et al., J. Am. Chern. Soc. 85:2149 (1964); Bodanszky, M., "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Nueva York, NY (1984); Kirnrnerlin, T. y Seebach, D. J. Pept.Res. 65:229-260 (2005); Nilsson et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2005) 34:91-118; W.C. Chan y P.D. White (Eds.) "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", Oxford University Press, Cary, NC (2000); N.L. Benoiton, "Chemistry of Peptide Synthesis", CRC Press, Boca Ratón, FL (2005); J. Jones, "Amino Acid and Peptide Synthesis", 2a Ed., Oxford University Press, Cary, NC (2002); y P. Lloyd-Williams, F. Albericio, y E. Giralt, "Chemical Approaches to the synthesis of pep tides and proteins", CRC Press, Boca Ratón, FL (1997).

Los derivados peptídicos pueden prepararse también como se describe en las Patentes de Estados Unidos N.° 4.612.302; 4.853.371; y 4.684.620, y la publicación de patente de Estados Unidos N.° 2009/0263843.

La tecnología descrita en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento. Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula, preferentemente, una molécula polimérica, que incorpora unidades de ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico o un análogo de los mismos. El ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. Un ácido nucleico monocatenario puede ser un ácido nucleico de una hebra de un ADN bicatenario desnaturalizado. De manera alternativa, puede ser un ácido nucleico monocatenario no derivado de ningún ADN bicatenario. En un aspecto, el ácido nucleico molde es ADN. En otro aspecto, el molde es ARN. Las moléculas de ácido nucleico adecuadas son ADN, incluido ADN genómico o ADNc. Otras moléculas de ácido nucleico adecuadas son ARN, incluido ARNm. La molécula de ácido nucleico puede ser de origen natural, como en el ADN genómico o puede ser sintética, es decir, preparada basándose en la acción humana, o puede ser una combinación de las dos. La secuencia de ácido nucleico puede tener también determinada modificación tal como adición 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2-O-MOE), 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2-O-dimetilaminopropilo (2'-0-Dm Ap ), 2'-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA), de colesterol, y la cadena principal de fosforotioato como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos 20070213292; y determinado ribonucleósido que se une entre los átomos de 2'-oxígeno y 4'-carbono con una unidad de metileno como se describe en el la patente de Estados Unidos N.° 6.268.490.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 puede comprender la secuencia de nucleótidos. En algunos casos, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento comprende un vector. En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento, o cualquier módulo de la misma, se une de forma operativa a un vector. El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para administrar a una célula hospedadora o para transferirse entre diferentes células hospedadoras. Como se usa en el presente documento, un vector puede ser vírico o no vírico. El término "vector" abarca cualquier elemento genético que es capaz de replicación cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias génicas a las células. Un vector puede incluir, pero sin limitación, un vector de clonación, un vector de expresión, un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc.

Como se usa en el presente documento, la expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que dirige la expresión de un ARN o polipéptido de secuencias unidas a secuencias reguladoras transcripcionales sobre el vector. Las secuencias expresadas con frecuencia, pero no necesariamente, serán heterólogas a la célula. Un vector de expresión puede comprender elementos adicionales, por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación, lo que permite así que se mantenga en dos organismos, por ejemplo, en células humanas para la expresión y en un hospedador procariota para la clonación y amplificación. El término "expresión" se refiere a los procesos celulares implicados en la producción de ARN y proteínas y si es apropiado, secreción de proteínas, incluyendo cuando es aplicable, pero sin limitación, por ejemplo, transcripción, procesamiento del transcrito, traducción y plegamiento de proteínas, modificación y procesamiento. Los "productos de expresión " incluyen ARN transcritos a partir de un gen, y polipéptidos obtenidos por traducción de ARNm transcrito a partir de un gen. El término "gen" significa la secuencia de ácido nucleico que se transcribe (ADN) a ARN in vitro o in vivo cuando se liga operativamente a secuencias reguladoras apropiadas. El gen puede incluir o no regiones que preceden y siguen la región codificadora, por ejemplo, secuencias no traducidas 5' (5' UTR) o "líder" y secuencias 3' UTR o "remolque", así como secuencias intermedias (intrones) entre los segmentos codificadores individuales (exones).

Como se usa en el presente documento, la expresión "vector vírico" se refiere a una construcción de vector de ácido nucleico que incluye al menos un elemento de origen vírico y tiene la capacidad de empaquetarse en una partícula vector vírica. El vector vírico puede contener el ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento en lugar de genes víricos no esenciales. El vector y/o partícula puede utilizarse con el fin de transferir cualquier ácido nucleico en células in vitro o in vivo. Se conocen en la técnica numerosas formas de vectores víricos.

Por "vector recombinante" se quiere decir un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico heteróloga, o "transgén " que es capaz de la expresión in vivo. Debe entenderse que los vectores descritos en el presente documento, en algunas realizaciones, se combinan con otras composiciones adecuadas y terapias. En algunas realizaciones, el vector es episómico. El uso de un vector episómico adecuado proporciona un significado de conservar el nucleótido de interés en el sujeto en alto número de copias de ADN extracromosómico eliminando de este modo los efectos potenciales de integración cromosómica.

En algunos casos el nivel de GDF11 en el sujeto aumenta en al menos un 20 % por encima del nivel de GDF11 en el sujeto antes del tratamiento, por ejemplo, un 20 % o más, un 30 % o más, un 40 % o más, un 50 % o más, un 100 % o más, un 150 % o más, un 200 % o más, un 250 % o más, un 300 % o más o un 350 % o más. En algunos casos el nivel de GDF11 en el sujeto aumenta en al menos un 100% por encima del nivel de GDF11 en el sujeto antes del tratamiento. En algunos casos el nivel de GDF11 en el sujeto aumenta en al menos un 200 % por encima del nivel de GDF11 en el sujeto antes del tratamiento. En algunos casos el nivel de GDF11 en el sujeto aumenta en alrededor de un 250 % por encima del nivel de GDF11 en el sujeto antes del tratamiento. En algunos casos, el nivel de GDF11 en el sujeto aumenta hasta al menos un 50 % de un nivel de referencia sano, por ejemplo, un 50 % o más, un 60 % o más, un 70 % o más, un 80 % o más, un 90 % o más o un 100 % o más del nivel de referencia sano. En algunos casos, el nivel de GDF11 en sujeto aumenta hasta al menos un 60 % de un nivel de referencia sano. En casos, el nivel de GDF11 en

sujeto aumenta hasta al menos un 75 % de un nivel de referencia sano. En casos, el nivel de GDF11 en el sujeto aumenta hasta al menos un 90 % de un nivel de referencia sano. Un referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos (por ejemplo, individuos jóvenes) que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas.

Como se usa en el presente documento, "deterioro de las células madre del músculo esquelético" se refiere a una disminución en el número celular, una disminución en el tamaño de miofibrilla regenerante, una disminución en la eficacia de formación de colonia miogénica, una disminución en el porcentaje de núcleos intactos, y un aumento en el porcentaje del ADN gravemente dañado valorado mediante un ensayo cometa, en las células madre del músculo esquelético.

Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 70 años. Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 65 años. Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 60 años. Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 55 años.

Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 50 años. Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 45 años. Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 40 años. Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 35 años.

Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 30 años. Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 25 años. Un nivel de referencia sano puede ser el nivel medio de GDF11 en una población de sujetos humanos que no presentan ninguna señal o síntoma de deterioro de las células madre del músculo esquelético, o afecciones relacionadas y que son menores de 20 años.

Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender seleccionar un sujeto con un nivel de GDF11 que es inferior al de un nivel de referencia sano y administrar un tratamiento como se describe en el presente documento.

En algunos casos, se aumenta el nivel de GDF11 en un sujeto con el fin de tratar una afección muscular esquelética (por ejemplo, sarcopenia o una afección asociada a sarcopenia o síntoma como se describe en el presente documento). En algunos casos, se aumenta el nivel de GDF11 en un sujeto con el fin de prevenir una afección muscular esquelética (por ejemplo, sarcopenia o una afección asociada a sarcopenia o síntoma como se describe en el presente documento).

Las afecciones musculares esqueléticas relacionadas con baja o disminuida tendencia del polipéptido de GDF11 a desarrollarse con la disminución en los niveles de GDF11 que ocurren con el incremento de la edad. Por tanto, se espera que dichas afecciones puedan prevenirse o, como mínimo, retardarse, manteniendo los niveles de GDF11 en o cerca del nivel encontrado en los adultos jóvenes sanos, normales (por ejemplo, administrando un polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 con el avance de la edad, pero no antes del inicio de una afección muscular esquelética).

En el presente documento, se describe un método para tratar o prevenir la afección muscular esquelética en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que aumente el nivel del polipéptido de GDF11 en el sujeto, en donde la composición provoca el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de las miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de los núcleos intactos, y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado, tratando o previniendo de este modo la afección del músculo esquelético. En algunos casos, la afección muscular esquelética se selecciona del grupo que consiste en atrofia, fracturas óseas asociadas a la pérdida muscular o debilidad, caquexia, denervación, diabetes, distrofia, fatiga del músculo esquelético inducida por el ejercicio, fatiga, fragilidad, miositis inflamatoria, síndrome metabólico, enfermedad neuromuscular, obesidad, debilidad muscular después de la cirugía, debilidad muscular postraumática, sarcopenia, exposición a toxinas, atrofia y debilidad.

La sarcopenia clase I se ha definido como un índice de masa corporal magra apendicular (ALBMI) <o= 6,44 kg.m(-2) (masa/altura corporal magra apendicular) (Messier V, Karelis AD, Lavoie ME, Brochu M, Faraj M, Strychar I, Rabasa-Lhoret R. "Metabolic profile and quality of life in class I sarcopenic overweight and obese postmenopausal women: a MONET study". Appl Physiol Nutr Metab. febrero de 2009;34(1): 18-24.) Esta definición requiere el escaneo de las piernas y/o brazos para determinar la masa muscular. También se ha argumentado que estos escaneos pueden no ser necesarios y la sarcopenia puede definirse midiendo las medidas antropométricas tipo circunferencia del músculo del brazo y circunferencia de la pantorrilla para determinar una cantidad por debajo de lo normal del músculo esquelético de la extremidad (Bauer JM, Kaiser MJ, Sieber CC. "Sarcopenia in nursing home residents". J Am Med Dir Assoc. octubre de 2008; 9(8):545-51). Se ha dado una definición de trabajo que identifica la sarcopenia cuando la masa muscular esquelética en un sujeto mayor es más de 2 desviaciones estándar por debajo de la media de los adultos más jóvenes sanos (Baumgartner RN, Koehler KM, Gallagher D, et al (abril de 1998). "Epidemiology of sarcopenia among the elderly in New Mexico". Am. J. Epidemiol. 147 (8): 755-63).

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento son útiles para tratar o prevenir la sarcopenia o una afección o síntoma asociado a sarcopenia (por ejemplo, pérdida de masa muscular esquelética asociada a sarcopenia; fatiga asociada a sarcopenia; discapacidad asociada a sarcopenia; morbilidad asociada a sarcopenia; debilidad muscular asociada a sarcopenia) o para aumentar la fuerza del músculo esquelético en sarcopenia o para reducir el riesgo de fracturas óseas en un paciente con sarcopenia; o para la prevención o el tratamiento de pérdida muscular asociada al envejecimiento; debilidad muscular asociada a pérdida muscular asociada al envejecimiento; atrofia por desuso; debilidad muscular asociada a atrofia por desuso; o para la prevención o prevención secundaria de fracturas óseas asociadas a la pérdida o debilidad muscular asociada al envejecimiento o sarcopenia.

En el presente documento se describe un método para tratar o prevenir la sarcopenia en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que aumente el nivel del polipéptido de GDF11 en el sujeto, en donde la composición provoca el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de las miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de los núcleos intactos, y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado, tratando o previniendo de este modo la sarcopenia en el sujeto.

Los aspectos de la tecnología descrita en el presente documento se refieren a composiciones que comprenden un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento y/o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica. Como se usa en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" se refiere al principio activo junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable comúnmente usado en la industria farmacéutica. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que, dentro del alcance del buen criterio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin producir demasiada toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

En algunos aspectos, una composición descrita en el presente documento que comprende un polipéptido de GDF11 puede usarse para rejuvenecer las células madre del músculo esquelético en un sujeto que lo necesita, en donde los niveles del polipéptido de GDF11 en el sujeto rejuvenecen las células madre del músculo esquelético en el sujeto. En algunas realizaciones, la composición provoca el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de las miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de los núcleos intactos, y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado, rejuveneciendo de este modo las células madre del músculo esquelético en el sujeto.

En algunos aspectos, una composición descrita en el presente documento que comprende un polipéptido de GDF11 puede usarse para fomentar la regeneración del músculo esquelético en un sujeto que lo necesita, en donde los niveles aumentados del polipéptido de GDF11 en el sujeto proporciona el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de las miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de los núcleos intactos, y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado, fomentando de este modo la regeneración del músculo esquelético en el sujeto.

En algunos aspectos, una composición descrita en el presente documento que comprende un polipéptido de GDF11 puede usarse para tratar o prevenir una afección muscular esquelética en un sujeto que lo necesita, en donde los niveles aumentados del polipéptido de GDF11 proporcionan el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de las miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de los núcleos intactos, y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado, tratando o previniendo de este modo la afección muscular esquelética en el sujeto. En algunos casos, la afección muscular esquelética se selecciona del grupo que consiste en atrofia, fracturas óseas asociadas a la pérdida muscular o debilidad, caquexia, denervación, diabetes, distrofia, fatiga del músculo esquelético inducida por el ejercicio, fatiga, fragilidad, miositis inflamatoria, síndrome metabólico, enfermedad neuromuscular, obesidad, debilidad muscular después de la cirugía, debilidad muscular postraumática, sarcopenia, exposición a toxinas, atrofia y debilidad.

En el presente documento, se describe una composición que comprende un polipéptido de GDF11 o un fragmento o variante funcional del mismo puede usarse para tratar o prevenir la sarcopenia en un sujeto que lo necesita, en donde los niveles aumentados del polipéptido de GDF11 o fragmento o variante funcional del mismo proporcionan el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de las miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de los núcleos intactos, y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado, tratando o previniendo de este modo la sarcopenia en el sujeto.

En algunos casos de este y otros aspectos descritos en el presente documento, al sujeto se le ha diagnosticado una afección muscular esquelética debido al envejecimiento.

En el presente documento, se describe además una composición farmacéutica o kit de partes para su uso en el tratamiento o la prevención de la sarcopenia o la pérdida de masa del músculo esquelético asociada a sarcopenia; fatiga asociada a sarcopenia; discapacidad asociada a sarcopenia; morbilidad asociada a sarcopenia; debilidad muscular asociada a sarcopenia; o para aumentar la fuerza del músculo esquelético en sarcopenia o para reducir el riesgo de fracturas óseas en un paciente con sarcopenia; o para la prevención o el tratamiento de pérdida muscular asociada al envejecimiento; debilidad muscular asociada a la pérdida muscular asociada al envejecimiento; atrofia por desuso; debilidad muscular asociada a atrofia por desuso; o para la prevención o prevención secundaria de fracturas óseas asociadas a la pérdida o debilidad muscular asociada al envejecimiento o sarcopenia.

La preparación de una composición farmacológica que contiene principios activos disueltos o dispersos en la misma es bien conocida en la materia y generalmente no necesita limitarse a la formulación. Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectable en forma de soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en líquido antes de su uso. La preparación también se puede emulsionar o presentar como una composición de liposomas. El principio activo puede mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo y en cantidades adecuadas para usar en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades mínimas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampón del pH y similares, que potencian la eficacia del principio activo. La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína y similares. Los vehículos fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de vehículos líquidos son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los principios activos y agua, o contienen un tampón tal como fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina tamponada con fosfato.

Aún más, los vehículos acuosos pueden contener más de una sal tampón, así como sales tales como cloruro de sodio y de potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y excluyendo el agua. Ejemplos de dichas fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón y emulsiones de agua y aceite. La cantidad de un principio activo usado en la invención que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales.

Un polipéptido de GDF11 o ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento puede administrarse por medios de liberación controlada o retardada. Los productos farmacéuticos de liberación controlada tienen el objetivo común de mejorar la farmacoterapia con respecto a lo que se consiguió por sus equivalentes de liberación no controlada. Idealmente, el uso de una preparación de liberación controlada diseñada de manera óptima en el tratamiento médico se caracteriza porque se va a emplear un mínimo de sustancia medicinal para curar o controlar la afección en una mínima cantidad de tiempo. Las ventajas de las formulaciones de liberación controlada incluyen: 1) ampliación de la actividad del fármaco; 2) reducción de la frecuencia de dosis; 3) aumento del cumplimiento por parte del paciente; 4) uso de menos fármaco total; 5) reducción de los efectos secundarios locales o sistémicos; 6) minimización de la acumulación de fármaco; 7) reducción en las fluctuaciones del nivel sanguíneo; 8) mejora de la eficacia del tratamiento; 9) reducción de la potenciación o la pérdida de la actividad del fármaco; y 10) mejora de la velocidad de control de las enfermedades o afecciones. Kim, Chemg-ju, "Controlled-release Dosage Form Design", 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000).

Las formas farmacéuticas convencionales generalmente proporcionan liberación rápida o inmediata del fármaco desde la formulación. Dependiendo de la farmacología y las farmacocinéticas del fármaco, el uso de formas farmacéuticas convencionales puede conducir a amplias fluctuaciones en las concentraciones del fármaco en la sangre y otros tejidos de un sujeto. Estas fluctuaciones pueden impactar en un número de parámetros, tales como la frecuencia de dosis, el inicio de la acción, la duración de la eficacia, el mantenimiento de los niveles sanguíneos terapéuticos, la toxicidad, los efectos secundarios y similares.

De manera ventajosa, las formulaciones de liberación controlada pueden usarse para controlar el inicio de la acción de un fármaco, la duración de la acción, los niveles plasmáticos dentro de la ventana terapéutica y los niveles sanguíneos pico. En particular, las formas o formulaciones farmacéuticas de liberación controlada o ampliada pueden usarse para asegurar que se alcance la máxima eficacia de un fármaco mientras se minimiza los efectos adversos potenciales y los problemas de seguridad, que pueden ocurrir tanto por una subdosificación de un fármaco (es decir, por debajo de los niveles terapéuticos mínimos) así como por superar el nivel de toxicidad para el fármaco.

La mayoría de las formulaciones de liberación controlada se diseñan para liberar inicialmente una cantidad de fármaco (principio activo) que produzca inmediatamente el efecto terapéutico deseado, y para liberar gradual y continuamente otras cantidades de fármaco para mantener este nivel del efecto terapéutico o profiláctico durante un periodo de tiempo prolongado. Con el fin de mantener este nivel constante del fármaco en el organismo, el fármaco debe liberarse de la forma farmacéutica con una velocidad que sustituya la cantidad de fármaco que se metaboliza y excreta del organismo. La liberación controlada de un principio activo puede estimularse mediante distintas condiciones que incluyen, pero sin limitación, pH, fuerza iónica, presión osmótica, temperatura, enzimas, agua y otras condiciones o compuestos fisiológicos.

Diversas formas farmacéuticas de liberación controlada o ampliada, formulaciones y dispositivos pueden ser adaptada para su uso con las sales y las composiciones de la divulgación. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, los descritos en las patente de los Estados Unidos. N.°: 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3.598.123; 4.008.719; 5.674.533; 5.059.595; 5.591.767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556; 5.733.566; y 6.365.185 B1. Estas formas farmacéuticas pueden usarse para proporcionar una liberación lenta o controlada de uno o más principios activos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos (tales como OROS® (Alza Corporation, Mountain View, Calif. EE. UU.) o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables.

En algunos casos, la tecnología descrita en el presente documento se refiere a una jeringuilla que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición, por ejemplo, una preparación farmacéutica que comprende un polipéptido de GDF11 como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", "cantidad eficaz" o "dosis eficaz" se refiere a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o estético en el tratamiento, prevención o manejo de, por ejemplo, sarcopenia, por ejemplo, una cantidad que proporciona una disminución estadísticamente significativa en al menos un síntoma, señal o marcador de sarcopenia.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la materia. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar con el historial del sujeto, la edad, la condición, el sexo, así como la gravedad y el tipo de afección médica en el sujeto, y la administración de otros principios farmacéuticamente activos.

En el presente documento, se describe un método que comprende administrar un polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 a un sujeto. En algunos casos, el sujeto necesita tratamiento para la afección muscular esquelética o una afección relacionada descrita en el presente documento. En algunos casos, el método es un método para tratar un sujeto. En algunos casos, el método es un método para tratar o prevenir sarcopenia en un sujeto. Dichas afecciones se describen en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "tratar", "tratamiento", "que trata", o "mejora" cuando se usa en referencia a una enfermedad, trastorno o afección médica, se refiere a tratamientos terapéuticos para una afección, en donde el objetivo es revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o parar la progresión o la gravedad de un síntoma o afección. El término "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o síntoma de una afección. El tratamiento es en general "eficaz" si se reducen uno o más síntomas o marcadores clínicos. De manera alternativa, el tratamiento es "efectivo" si se reduce o para la progresión de una afección. Es decir, "tratamiento" incluye no solo la mejora de los síntomas o los marcadores, sino también un cese o al menos una ralentización del progreso o empeoramiento de los síntomas que se esperarían en ausencia del tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, alivio de uno o más síntomas, disminución del alcance del déficit, una patología estabilizada (es decir, que no empeora), por ejemplo, sarcopenia, retardo o ralentización de la sarcopenia, y un aumento de la esperanza de vida en comparación con lo esperado en ausencia del tratamiento.

Como se usa en el presente documento, el término "administrar", se refiere a la disposición de la composición que comprende un polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 como se divulga en el presente documento en un sujeto mediante un método o vía que da como resultado la administración a un sitio de acción. La composición farmacéutica que comprende un polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 puede administrarse mediante cualquier vía apropiada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto.

Los datos descritos en el presente documento indican que la administración sistémica por el sistema vascular puede ser eficaz. Por tanto, específicamente se contempla la administración por la vía intravenosa. Sin embargo, con la formulación apropiada, se contemplan otras vías, que incluyen, por ejemplo, vía intranasal, intraarterial; intraarterias coronarias; oral, por inhalación, vía intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad, u otros medios conocidos por los expertos en la materia. Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación farmacéutica, y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad que se va a administrar y el momento dependen del sujeto que se vaya a tratar, la capacidad del sistema del sujeto de utilizar el principio activo y el grado de efecto terapéutico deseado.

Las composiciones terapéuticas que contienen al menos un agente pueden administrarse convencionalmente en una dosis unitaria, por ejemplo. La expresión "dosis unitaria", cuando se usa en referencia a una composición terapéutica, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente fisiológicamente aceptable requerido, es decir, excipiente o vehículo.

Los intervalos de dosis para el agente dependen de la potencia, y son cantidades lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado, por ejemplo, rejuvenecimiento de las células madre del músculo esquelético de un sujeto o una inversión de la afección muscular esquelética (por ejemplo, sarcopenia). La dosis no debe ser tan grande como para provocar importantes efectos secundarios adversos.

Generalmente, la dosis variará con la edad, la afección y el sexo del paciente y puede determinarse por un experto en la materia. La dosis también puede ser ajustada por el médico en caso de cualquier complicación. Normalmente, la dosis puede variar de 0,001 mg/kg de peso corporal a 0,5 mg/kg de peso corporal. En un caso, el intervalo de dosis varía de 5 pg/kg de peso corporal a 30 pg/kg de peso corporal.

La administración de las dosis mencionadas anteriormente puede repetirse. En algunos casos, las dosis se administran una vez al día o varias veces al día, por ejemplo, pero sin limitación, tres veces al día. En algunos casos, las dosis mencionadas anteriormente se administran diariamente durante semanas o meses. La duración del tratamiento depende del progreso clínico del sujeto y de la capacidad de respuesta a la terapia. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, donde el polipéptido de GDF11 disminuye aparentemente con la edad en los individuos afectados, se espera que se requiera terapia a largo plazo para establecer y conservar el beneficio del tratamiento basado en GDF11, por ejemplo, de una afección muscular esquelética, tal como sarcopenia.

Las cantidades exactas de principio activo que se necesitan administrar dependen del criterio del facultativo y son específicas para cada individuo. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados para aplicación sistémica se divulgan en el presente documento y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida por dosis repetidas en uno o más intervalos por una administración posterior. De manera alternativa, se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para tratamientos in vivo. En algunos casos, el intervalo de dosis es lo suficiente para mantener concentraciones en la sangre en el intervalo encontrado en la sangre de una población de sujetos sanos humanos normales (por ejemplo, aquellos con señales, síntomas o marcadores del deterioro de células madre del músculo esquelético) menores de 50. En algunos casos, el intervalo de dosis es lo suficiente para mantener concentraciones en la sangre en el intervalo encontrado en sujetos humanos sanos normales menores de 40 años. En algunos casos, el intervalo de dosis es lo suficiente para mantener concentraciones en la sangre en el intervalo encontrado en sujetos humanos sanos normales menores de 30 años.

Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de un agente que es suficiente para producir un cambio medible, estadísticamente significativo, en, por ejemplo, una afección muscular esquelética (por ejemplo, sarcopenia). Dichas cantidades eficaces se pueden medir en ensayos clínicos y en estudios con animales. La eficacia de un agente puede determinarse evaluando los indicadores físicos de, por ejemplo, el deterioro de las células madre del músculo esquelético como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En sistemas experimentales, los ensayos para la eficacia incluyen también la medición de la masa del músculo esquelético, la determinación del tamaño de miofibrilla determinado por microscopía histológica, y/o una reducción en la expresión del marcador de célula madre del músculo esquelético vieja tal como inmunoreactividad para la forma fosforilada de la histona variante H2AX (pH2AX). Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica y se describen en detalle en los ejemplos del presente documento. Los métodos clínicamente aceptables para detectar o monitorizar el rejuvenecimiento de las células madre del músculo esquelético se describen en el presente documento. Además, la eficacia de un agente puede medirse mediante un aumento en los polipéptidos de GDF11 o fragmentos de los mismos en un sujeto que se está tratando con un agente que comprende un polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de GDF11.

La eficacia de un tratamiento dado para una afección muscular esquelética (por ejemplo, sarcopenia) puede ser determinada por un médico experto. Sin embargo, un tratamiento se considera "tratamiento eficaz", como se usa el término en el presente documento, si alguna o todas las señales o síntomas de, por ejemplo, una afección muscular esquelética se altera de una manera beneficiosa, se favorecen o mejoran otros síntomas clínicamente aceptados, por ejemplo, en al menos un 10 % tras el tratamiento con un agente como se describe en el presente documento. La eficacia también puede medirse mediante la incapacidad de un individuo de empeorar según la evaluación de la hospitalización o la necesidad de intervenciones médicas (es decir, la progresión de la enfermedad se detiene). Los expertos en la materia conocen métodos para medir estos indicadores y/o se describen en el presente documento.

En algunos casos, los métodos comprenden además administrar la composición farmacéutica descrita en el presente documento junto con uno o más agentes adicionales, sustancias biológicas, fármacos o tratamientos beneficiosos a un sujeto que padece de deterioro de las células madre del músculo esquelético o una afección muscular esquelética como parte de una terapia combinada. En algunos de dichos casos, el agente, compuesto biológico, fármaco o tratamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en: moduladores de uno o más de miosina esquelética, actina esquelética, tropomiosina esquelética, troponina esquelética C, troponina esquelética I, troponina esquelética T y músculo esquelético, incluidos los fragmentos e isoformas de los mismos, y el sarcómero esquelético y otros agentes terapéuticos adecuados útiles en el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas que incluyen: agentes antiobesidad, agentes antisarcopenia, agentes antisíndrome de desgaste, agentes antifragilidad, agentes anticaquexia, agentes antiespasmos musculares, agentes contra la debilidad muscular después de cirugía y postraumática, así como los agentes descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos. N.° 2005/0197367.

Agentes medicinales y farmacéuticos adicionales adecuados incluyen, por ejemplo: orlistat, sibramina, dietilpropión, fentermina, benzafetamina, fendimetrazina, estrógeno, estradiol, levonorgestrel, acetato de noretindrona, valerato de estradiol, etinilestradiol, norgestimato, estrógenos conjugados, estrógenos esterificados, acetato de medroxiprogesterona, factor de crecimiento derivado de insulina, una hormona del crecimiento humano, riluzol, cannabidiol, prednisona, beta agonistas (por ejemplo, albuterol), inhibidores de miostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, fármacos no esteroides antiinflamatorios y toxina botulínica.

Otros agentes medicinales y farmacéuticos adecuados incluyen TRH, dietilestilbesterol, teofilina, encefalinas, prostaglandinas de la serie E, compuestos divulgados en la patente de Estados Unidos N.° 3.239.345 (por ejemplo, zeranol), compuestos divulgados en la patente de Estados Unidos N.° 4.036.979 (por ejemplo, sulbenox), péptidos divulgados en la patente de Estados Unidos N.° 4.411.890, secretagogos de la hormona del crecimiento tales como GHRP-6, GHRP-1 (divulgados en la patente de Estados Unidos N.° 4.411.890 y las publicaciones WO 89/07110 y WO 89/07111), GHRP-2 (divulgado en el documento WO 93/04081), NN703 (Novo Nordisk), Y444711 (Lilly), MK-677 (Merck), CP424391 (Pfizer) y B-HT920, factor de liberación de la hormona del crecimiento y sus análogos, hormona del crecimiento y sus análogos y somatomedinas que incluyen IGF-1 y IGF-2, factor inhibidor de la leucemia, factor neurotrófico ciliar, factor neurotrófico derivado del cerebro, interleucina 6, interleucina 15, agonistas afa-adrenérgicos, tales como clonidina o serotonina, agonistas de 5-HT^d, tales como sumatriptán, agentes que inhiben somatostatina o su liberación, tales como fisostigmina, piridostigmina, hormona paratiroidea, PTH(1-34) y bifosfonatos, tales como MK-217 (alendronato).

Aún otros agentes medicinales y farmacéuticos adecuados incluyen estrógeno, testosterona, moduladores selectivos del receptor de estrógenos, tales como tamoxifeno o raloxifeno, otros moduladores del receptor de andrógenos, tales como los divulgados en Edwards, J. P. et. al., Bio. Med. Chem. Let., 9, 1003-1008 (1999) y Hamann, L. G. et al., J. Med. Chem., 42, 210-212 (1999), y agonistas del receptor de progesterona ("PRA"), tales como levonorgestrel, acetato de medroxiprogesterona (MPA).

Aún otros agentes medicinales y farmacéuticos adecuados incluyen inhibidores de aP2, tales como los divulgados en el N.° de Ser. de Estados Unidos 09/519.079 presentado el 6 de marzo de 2000, antagonistas de PPAR gamma, agonistas de PPAR delta, agonistas adrenérgicos beta 2, agonistas adrenérgicos beta 3, tales como AJ9677 (Takeda/Dainippon), L750355 (Merck), o CP331648 (Pfizer), otros agonistas beta 3 como se divulgan en las patentes de Estados Unidos N.° 5.541.204, 5.770.615, 5.491.134, 5.776.983 y 5.488.064, un inhibidor de lipasa, tal como orlistat o ATL-962 (Alizyme), un inhibidor de la recaptación de serotonina (y dopamina), tal como sibutramina, topiramato (Johnson & Johnson) o axocina (Regeneron), un fármaco receptor tiroideo beta, tal como un ligando del receptor tiroideo desvelado en los documentos WO 97/21993, WO 99/00353 y GB98/284425 y agentes anorécticos, tales como dexamfetamina, fentermina, fenilpropanolamina o mazindol.

Aún otros agentes medicinales y farmacéuticos adecuados incluyen terapias frente al VIH y del SIDA, tales como sulfato de indivanir, saquinavir, saquinavir mesilato, ritonavir, lamivudina, zidovudina, combinaciones de lamivudina/zidovudina, zalcitabina, didanosina, estavudina, y acetato de megestrol.

Aún otros agentes medicinales y farmacéuticos adecuados incluyen agentes antiresorción, terapias de reemplazo hormonal, análogos de la vitamina D, calcio elemental y suplementos de calcio, inhibidores de catepsina K, inhibidores de MMP, antagonistas del receptor de vitronectina, antagonistas de Src SH² , inhibidores de H+-ATPasa vascular, ipriflavona, fluoruro, tibolona, proestanoides, inhibidores de hidroxiesteroide deshidrogenasa 17-beta e inhibidores de Src cinasa.

Los otros agentes terapéuticos anteriores, cuando se emplean junto con las entidades químicas descritas en el presente documento, pueden usarse, por ejemplo, en las cantidades indicadas en el "Physicians' Desk Reference" (PDR) o como se determine de otro modo por un experto en la materia.

La descripción de las realizaciones de la divulgación no tiene la intención de ser exhaustiva o limitar la divulgación a las formas precisas desveladas. Aunque las realizaciones específicas de, y los ejemplos para, la divulgación se describen en el presente documento con fines ilustrativos, son posibles diferentes modificaciones dentro del alcance de la divulgación, como reconocerán los expertos en la técnica relevante. Por ejemplo, aunque las etapas o las funciones del método estén presentes en un orden dado, realizaciones alternativas pueden realizar funciones en un orden diferente, o las funciones pueden realizarse básicamente al mismo tiempo. Los descubrimientos de la divulgación proporcionada en el presente documento pueden aplicarse a otros procedimientos o métodos como sea apropiado. Las diferentes realizaciones descritas en el presente documento se pueden combinar para proporcionar realizaciones adicionales. Los aspectos de la divulgación pueden modificarse, si es necesario, para emplear las composiciones, las funciones y los conceptos de las anteriores referencias y la aplicación para proporcionar realizaciones más adicionales de la divulgación. Estos y otros cambios pueden realizarse a la divulgación considerando la descripción detallada anteriormente.

Los elementos específicos de cualquiera de las anteriores realizaciones pueden combinarse o sustituirse para los elementos en otras realizaciones. Por otra parte, aunque se han descrito las ventajas asociadas a determinadas realizaciones de la divulgación en el contexto de estas realizaciones, otras realizaciones también pueden presentar tales ventajas, y no todas las realizaciones necesitan presentar tales ventajas para estar dentro del alcance de la divulgación.

Todas las patentes y otras publicaciones identificadas se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este sentido debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a preceder a dicha divulgación en virtud de una invención anterior o publicación anterior, o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones sobre la fecha o la representación sobre el contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen un reconocimiento en cuanto a la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.

Un experto en la materia aprecia fácilmente que la presente invención está bien adaptada para conseguir los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados. Los detalles de la descripción y los ejemplos en el presente documento son representativos de determinadas realizaciones, son ejemplos y no pretenden ser limitaciones en el alcance de la invención. Las modificaciones en los mismos y otros usos se les ocurrirán a aquellos expertos en la materia. Será fácilmente evidente para un experto en la materia que pueden realizarse varias sustituciones y modificaciones a la invención divulgada en el presente documento sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Los artículos "un" y "uno/a", como se usan en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse que incluyen los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otro modo relevantes para un producto o un proceso dado a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es de otro modo relevante para un producto o proceso dado. La invención incluye también realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplea en, o es de otro modo relevante para un producto o proceso dado. Se contempla que todas las realizaciones descritas en el presente documento son aplicables a todos los diferentes aspectos de la invención cuando sea apropiado. También se contempla que cualquiera de las realizaciones o aspectos puede combinarse libremente con una u otras más de tales realizaciones o aspectos cuando sea apropiado. Cuando los elementos se presentan como listados, por ejemplo, en formato de grupo Markush o similar, ha de entenderse que también se desvela cada subgrupo de los elementos y cualquier elemento o elementos pueden retirarse del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando la invención, o los aspectos de la invención, se refiere, o refieren, a comprender elementos particulares, características, etc., determinadas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, dichos elementos, características, etc. Por motivos de simplicidad, estas realizaciones no se han establecido de forma específica en todos los casos en el presente documento con tantas palabras. También debe entenderse que cualquier realización o aspecto de la invención puede excluirse explícitamente de las reivindicaciones, independientemente de si la exclusión específica se menciona en la memoria descriptiva. Por ejemplo, pueden excluirse uno o más principios activos, aditivos, ingredientes, agentes opcionales, tipos de organismo, trastornos, sujetos, o combinaciones de los mismos.

Cuando se proporcionan intervalos en el presente documento, ha de entenderse que se incluyen todos los valores extremos, se excluyen los dos valores extremos y se incluye un valor extremo y se excluye el otro. Ha de suponerse que, a menos que se indique lo contrario, se incluyen los dos valores extremos. Por otra parte, ha de entenderse que, a menos que se indique lo contrario o que sea evidente de otro modo por el contexto y la comprensión de un experto en la materia, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos indicados en casos diferentes de la invención, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto dictamine claramente otra cosa. También se entiende que cuando, en el presente documento, se indica una serie de valores numéricos, la divulgación incluye casos que se refieren análogamente a cualquier valor o intervalo intermedio definido por dos valores cualesquiera de la serie, y que el valor más bajo puede tomarse como mínimo y el valor más alto como máximo. Valores numéricos, como se usa en el presente documento, incluye los valores expresados como porcentajes. Para cualquier caso de la divulgación en la que un valor numérico esté precedido por "alrededor de" o "aproximadamente", la invención incluye un caso en el que se indica el valor exacto. Para cualquier caso de la divulgación en la que un valor numérico no esté precedido por "alrededor de" o "aproximadamente", la divulgación incluye un caso en el que el valor está precedido por "alrededor de" o "aproximadamente".

"Aproximadamente" o "alrededor de" generalmente incluye números que se encuentran en un intervalo de un 1 % o, en algunos casos dentro de un intervalo de un 5 % de un número, o en algunos casos dentro de un intervalo de un 10 % de un número en cualquier dirección (mayor o menor que el número) a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otra manera a partir del contexto (excepto cuando dicho número supere inadmisiblemente el 100 % de un valor posible). Debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquiera método divulgado en el presente documento, que incluya más de una acción, el orden de las acciones del método no se limita necesariamente al orden en el que se mencionan las acciones del método, aunque la divulgación incluya casos en los que el orden está limitado. También debe entenderse que, a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto, cualquier producto o composición que se describa en el presente documento puede considerarse "aislado(a)".

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no se deben interpretar como limitantes.

Ejemplos

Materiales y métodos

Ratones y procedimientos in vivo

Se obtuvieron ratones C57BL/6 viejos (22-24 meses) de los "National Institutes of Aging (NIA)" y los ratones C57BL/6 jóvenes (2-3 meses) se adquirieron de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, EE. UU. Los ratones se guardaron y trataron de acuerdo con el protocolo aprobado por "Institutional Animal Care and Use Committees" en la Universidad de Harvard.

Para experimentos de parabiosis, las cirugías se realizaron como se ha descrito anteriormente (Bunster y Meyer, 1933; Ruckh et al., 2012). El quimerismo sanguíneo se confirmó en un subconjunto de parejas parabióticas isocrónicas y heterocrónicas midiendo por citometría de flujo la frecuencia de células sanguíneas procedentes del donante desde un compañero (CD45.1+) en el bazo del otro compañero (CD45.2+) después de 4 semanas de unión. Las células procedentes del compañero normalmente representaban un 40-50 % de los esplenocitos, indicativo del establecimiento de la circulación cruzada parabiótica. El método podría usarse para verificar el establecimiento del quimerismo en parejas isocrónicas viejas, debido a que los ratones CD45.1+ viejos no están disponibles para adquirirse del NIA. Después de 4 semanas de unión, se sacrificaron los ratones parabióticos y se extirparon los músculos para posteriores experimentos.

Para el tratamiento con GDF11, los animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos: 1 grupo de ratones se trató con GDF11 por inyección IP diaria a 0,1 mg/kg de peso corporal de ratón mientras que el otro grupo de ratones control se inyectó con el vehículo (PBS con 0,1 % de BSA y HCl 4 mM). En los lotes individuales de rGDF11 se controló la calidad por espectrofotómetro, electroforesis en gel y ensayo de la bioactividad de diferenciación eritroide de K562 de acuerdo con las recomendaciones del proveedor, antes de su uso en los ensayos in vivo. Después de 30 días de tratamiento, a menos que se especifique lo contrario, se sacrificaron los ratones y se extirparon los músculos para posteriores experimentos. Para la marcación por BrdU in vivo de células proliferantes, los ratones se alimentaron con BrdU (0,5 mg/ml) en el agua de beber que contenía 5 % de sacarosa durante 4-6 semanas antes de que se sacrificaran y se extirparan los tejidos para el análisis.

Aislamiento de células madre musculares

Las células madre musculares se aislaron de músculos de extremidades intactos (extensor digitorum longus, gastrocnemio, cuádriceps, sóleo, tibial anterior, y tríceps braquial) como se ha descrito previamente. (Cerletti et al., 2008; Conboy et al., 2003; Sherwood et al., 2004). Después del aislamiento, se incubaron todas las células asociadas a miofibrilla en la solución salina tamponada de Hank (Gibco) que contenía 2 % de suero bovino de ternera en hielo durante 20 min con los siguientes anticuerpos: 30-F11 (1:200, anti-CD45 de ratón, conjugado de ficoeritrina (PE) o aloficocianina (APC) (eBioscience, San Diego, CA)); M1/70 (1:200, anti-CD11b de ratón, conjugado de PE, (eBioscience); o 1:800, anti-CD11b de ratón, conjugado de APC, (eBioscience)); D7 (1:800, anti-Sca-1, Ly-6A/E, conjugado de APC (eBioscience)), (31-integrina (1:200, anti-CD29 de ratón, purificado, (BD Pharmingen, San José, CA; o 1:400, anti-CD29 de ratón/rata, conjugado de PE(Biolegend, San Diego, CA); CXCR4 (1:100, anti-CD184 de ratón biotinilado (BD Pharmingen)), Streptavidina (1:100, conjugado Cy7 y PE (eBioscience)), anti-Ig de hámster armenio, conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:100, eBioscience). Las células madre musculares, identificadas como CD45-Sca-1-Mac-1-CXCR4+p1-integrina+ (Cerletti et al., 2008; Sherwood et al., 2004) se clasificaron mediante el método de clasificación celular activada por fluorescencia usando Aria II, MoFlo o Bertha (BD Life Sc.) Las células vivas se identificaron como azul calceína positivas (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA) y yoduro de propidio negativas (PI, 1 mg/ml).

Las células madre musculares se clasificaron doblemente para maximizar la pureza. Para la tinción intracelular, primero se tiñeron los marcadores de antígeno de superficie en las células asociadas a miofibrilla y, a continuación, se fijaron y permeabilizaron usando tampón citofix/citoperm (APC BrdU Flow Kit, BD PharmingenTM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente las células se tiñeron con APC-anti-BrdU (APC BrdU Flow Kit, BD PharmingenTM) o conjugado de anti-caspasa-3 activada (escindida) (Asp175) y Alexa-488 (1:50, señalización celular), o anti-fosfo-53BP1 (S25) (1:50, Bethyl laboratories). Si se requería una tinción de anticuerpo secundario, primero las células se sometían a bloqueo con suero de cabra (1/100) y anti-CD16/32 NA/LE (2.4G2, BD) y, a continuación, se teñían con anticuerpo de cabra anti-Alexa488 de conejo (1:100, Invitrogen). Para los estudios de la expresión de caspasa-3 activada o fosfo-53BP1, se trató un subconjunto de células asociadas a miofibrilla con 950 pM de H²O² a 37 °C durante 2 horas para generar un control positivo para la tinción, y un subconjunto distinto se tiñó con anticuerpo secundario solo para servir como control negativo, como se indica. Los datos de FACS se recogieron usando DIVA (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ) y se analizaron sin conexión usando el programa informático Fowjo (Tree Star, Inc., versión 8.6.1, Ashland, OR) para determinar el rendimiento como el número total de células CD45-Sca1-Mac1-CXCR4+p1-integrina+ clasificadas por gramo del tejido muscular o la frecuencia de células vivas.

Electroforesis en gel de célula única o ensayo cometa

Para el ensayo cometa, se clasificaron doblemente aproximadamente 3.000 células madre musculares en tubos Eppendorf que contenían 350 ul de solución salina tamponada de Hank (Gibco) con 2 % de suero bovino de ternera. El ensayo cometa se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA). Resumiendo, las células se centrifugaron a 700 rcf durante 3 min a temperatura ambiente y el sedimento celular se resuspendió con agarosa fundida con punto de fusión bajo preincubada a 37 °C durante al menos 20 min. La suspensión de célula-agarosa, a continuación, se aplicó sobre los portaobjetos cometa suavemente permitiendo formarse una fina capa y la capa de agarosa se dejó solidificar sobre hielo antes de sumergirse en el tampón de lisis. La lisis de las células se llevó a cabo durante 12 horas a 4 °C y, a continuación, el ADN se sometió a electroforesis en tampón neutro o alcalino como se indica. Se tomó cuidado extremo para minimizar la exposición a la luz durante la clasificación o el posterior procesamiento y manejo de las células hasta que se sometieron a electroforesis. Finalmente, el ADN sometido a electroforesis y teñido con VistaDye se visualizó bajo microscopio de fluorescencia Zeiss Imager M1 (Carl Zeiss, Thornwood, NY) y se puntuaron visualmente 100-250 núcleos por animal de acuerdo con los protocolos publicados. Se ha documentado que este planteamiento de puntuación es igualmente eficaz para detectar las diferencias con otros métodos (por ejemplo, el cálculo del momento de cola).

Tinción por inmunofluorescencia de células madre musculares, miofibrillas sencillas y criosecciones musculares

Para la inmunotinción, se clasificaron directamente aproximadamente 5.000 células madre musculares en una gota pequeña de PBS y se dejaron que se asentaran sobre los portaobjetos posando suavemente los portaobjetos sobre hielo durante 30 minutos antes de la fijación con PFA al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. La inmunotinción de miofibrillas sencillas se realizó sobre músculos de extremidades posteriores diseccionadas de ratones jóvenes (2 meses) y viejos (24 meses). Los músculos diseccionados se digirieron con colagenasa tipo II al 0,2 %, se picaron y se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS. Las células clasificadas, las miofibrillas sencillas o las criosecciones musculares se lavaron con PBS, se permeabilizaron y se sometieron a bloqueo usando 2 % de BSA/0,5 % de Suero de cabra/0,5 % de Triton X en PBS durante 60 min a temperatura ambiente. Para la inmunotinción con anticuerpos primarios surgidos de ratones, se usó el kit de inmunodetección M.O.M (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos primarios (anti-Pax7 monoclonal de ratón (1:100 DSHB, Universidad de Iowa) y anti-yH2AX policlonal de conejo (1:500, Abcam), anti-CD31 (1:250) de ratón, anti-laminina policlonal de conejo (1:500)) se incubaron con las muestras durante 12-16 horas a 4 °C y los anticuerpos secundarios (1:200, AlexaFluor 555 o AlexaFluor 488, Invitrogen) durante 60 min, a temperatura ambiente (con 3-4 lavados en PBS tras cada incubación). Para la inmunotinción de 53BP1, se incluyeron un bloqueo por suero (10 % de suero de cabra) y detergente (0,1 % de Tween20) durante las incubaciones de tanto el anticuerpo primario como el secundario. Para las miofibrillas sencillas, después de la incubación del anticuerpo secundario y el lavado con DPBS se introdujo un lavado extra con DPBS que contenía Tween20 al 0,01 %. Del mismo modo, para las criosecciones musculares, después de la fijación con PFA al 4 % y lavado con PBS, se realizó la recuperación del antígeno con SDS al 2 % en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Todas las muestras se montaron sobre portaobjetos en medio de montaje VECTASHIELD® que contenía DAPI. Se obtuvieron imágenes de fluorescencia bajo microscopio de fluorescencia Zeiss Imager M1 (Carl Zeiss, Thornwood, NY) y se cuantificaron usando ImageJ. Se obtuvieron 50-100 imágenes confocales de las células clasificadas por muestra usando LSM 510 Meta invertido o LSM 700 Meta invertido (Carl Zeiss, Thornwood, NY) y se cuantificaron usando el programa informático AIM y ImageJ.

Inmunofluorescencia de unión neuromuscular.

Se fijaron los músculos extensor digitorum longus (EDL) durante 1 hora a temperatura ambiente (paraformaldehído al 4 % en PBS). A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. Los músculos EDL se separaron en manojos de fibras musculares. Los músculos se lavaron dos veces durante 15 minutos en PBS, se incubaron 15 min con glicina 100 mM en PBS, y se aclararon en PBS. Después de la eliminación del tejido conectivo subyacente, los músculos se permealizaron y se sometieron a bloqueo durante 1 h en PBS que contenía 2 % de albúmina de suero bovino, 4 % de suero de cabra normal y 0,5 % de Triton X-100. Para cuantificar el número y la densidad de los receptores de acetilcolina (AChRs), los músculos se tiñeron con AlexaFluor 594 a-Bungarotoxina (BTX), primero durante 1 h a temperatura ambiente y, a continuación, durante la noche a 4 °C. Después de tres lavados de 30 min en PBS, los músculos se aclararon en PBS, se fijaron 30 min con formaldehído al 1 % en PBS, se lavaron tres veces durante 10 min en PBS y se montaron en plano en Vectashield con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las imágenes se adquirieron usando un microscopio confocal Zeiss M1 o LSM 510.

Ensayos de miogénesis

Ensayos de miogénesis. Las células satélite musculares de ratones jóvenes o viejos se clasificaron por clon (célula única/pocillo) o se clasificaron por volumen (200 células/pocillo) en placas de 96 pocillos que contenían medio de crecimiento (F10, 20 % de suero de caballo, 1 % de Glutamax y 1 % de pen/strep), usando la unidad de deposición celular automatizada (ACDU) de Aria II (BD Biosciences). Antes de la clasificación, se recubrieron las placas de 96 pocillos con colágeno/laminina incubando los pocillos con PBS que contenía colágeno (1 mg/ml, Sigma) y laminina (10 mg/ml, Invitrogen) durante al menos una hora a 37 °C. Las células satélite se cultivaron en medio de crecimiento que comprendía F10, 1 % de glutamax, 1 % de Penstrep y 20% de suero de caballo o reemplazo de suero de inactivación (KOSR, Invitrogen), cuando era indicado, con bFGF fresco añadido diariamente a 5 ng/ml de concentración final. El GDF11 recombinante purificado (rGDF11, N.° de catálogo 120-11, PeproTech), resuspendido en PBS que contenía BSA al 0,1 % y HCl 4 mM, se añadió diariamente a las concentraciones indicadas. En los lotes individuales de rGDF11 se controló la calidad por espectrofotómetro, electroforesis en gel y ensayo de la bioactividad de diferenciación eritroide de K562 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, antes de su uso en los ensayos in vitro. Los pocillos que contenían colonias miogénicas se recontaron por microscopía de campo brillante o se fijaron con PFA al 4 % y se recontaron el número de células por pocillo sobre un microscopio automatizado Celigo como núcleos teñidos con Hoechst en los momentos indicados. Para los ensayos de diferenciación, las células satélite se clasificaron en una placa de 24 pocillos a 5000 células por pocillo. Las células se cultivaron en medios de crecimiento (descritos anteriormente) suplementado con bFGF durante 5 días. A los 5-8 días después de la siembra en placa, los medios se cambiaron a medios de diferenciación (DMEM, 1 % de glutamax, 1 % de pen-strep, y 2 % de FBS) y se cultivaron durante unos 3-7 días adicionales. Para los análisis de diferenciación, los miotubos se tiñeron con antimiosina grasa (Sigma), DAPI, y Faloidina conjugada con AlexaFluor 488 (Life Technologies). Para la tinción mitocondrial sobre los miotubos, se proliferaron y diferenciaron células satélite en miotubos sobre placa de 24 pocillos compatible para la obtención de imágenes por microscopio (ibidi p-placa). Después de 5 días en los medios de diferenciación, se lavaron los miotubos en PBS y se incubaron en naranja Mitotracker 250 nM durante 1 h a 37 °C. Las células se lavaron dos veces y se fijaron en paraformaldehído al 2 % durante 10 min a temperatura ambiente. Los miotubos se contratiñeron con DAPI y Faloidina (Life Technologies). Las imágenes se adquirieron usando un microscopio invertido Zeiss Observer D1.

Lesión muscular y seccionamiento del músculo

Una semana antes de la extirpación, se criolesionaron o lesionaron con cardiotoxina (a 0,3 mg/ml) los músculos tibiales anteriores (TA) de ratones anestesiados. Los músculos extirpados se fijaron en PFA al 4 % y se incrustaron en parafina para el seccionamiento. La tinción con H&E se realizó sobre secciones incrustadas en parafina de 8-10 pm para la cuantificación de miofibrillas regenerantes centralmente nucleadas de músculos TA lesionados e ilesos, contralaterales. Para cada muestra, se midió por estudio ciego el área transversal de 120-150 miofibrillas regenerantes de 4 portaobjetos con 3 secciones consecutivas sobre cada portaobjeto.

Trasplante de células de satélites.

A ratones mdx anestesiados se inyectaron 25 pl (0,03 mg/ml) de cardiotoxina de Naja mossambica mossambica (Sigma) en músculos TA 1 día antes del trasplantes celular. Al día siguiente, las células satélite doblemente clasificadas aisladas de ratones transgénicos GFP de 6-8 semanas (C57BL/Ka-p-actina-EGFP (3-5)) e irradiados con gamma-irradiación a las dosis indicadas (0, 50 o 100 rad) se resuspendieron en 5-10 pl de PBS y se inyectaron directamente en estos músculos prelesionados. Los músculos TA inyectados se extirparon 4 semanas después del trasplante, se congelaron rápido en metilbutano enfriado con nitrógeno líquido, y se seccionó serialmente a través del músculo TA desde el tendón hasta la barriga usando criostato Microm HM550(Thermo Scientific). Para los experimentos de trasplante en ratones viejos, se aleatorizaron ratones macho (22 meses de edad) en grupos control (PBS, n=4) o rGDF11 (n=4) y se trataron como se ha descrito anteriormente. Después de 4 semanas de tratamiento con vehículo o rGDF11, los músculos TA se lesionaron con cardiotoxina y las células satélite GFP+ (30.000 por pata) se trasplantaron al día siguiente. Los músculos TA inyectados se extirparon 2 semanas después del trasplante, las secciones musculares congeladas se procesaron para inmunofluorescencia como se ha descrito anteriormente. Resumiendo, las secciones se fijaron en PFA al 4 % durante 1 h y se lavaron tres veces en PBS durante 10 min a TA. Las secciones se contratiñeron con anti-GFP conjugado con Alexa488 y Faloidina conjugada con AlexaFluor 555 (Life Technologies) y se montaron con Vectashield con DAPI (Vector Laboratory). Se prepararon 7-8 portaobjetos por músculo y 10-12 secciones por portaobjetos de cada grupo experimental y se analizaron por ensayo ciego para determinar el número máximo de fibras injertadas y el área transversal de fibras injertadas (GFP+) y el área transversal de fibras injertadas usando el programa informático Axiovision (Zeiss).

Ensayo de resistencia física.

Para el ensayo de la resistencia al ejercicio, se ejercitaron ratones macho C57B1/6 viejos (24 meses de edad) tratados con vehículo o rGDF11 usando una cinta de correr de velocidad variable ajustable (AccuPacer, AccuScan Instruments, Inc). Primero los animales se acostumbraron a la cinta de correr caminando a 5 metros por minuto (mpm) con ajuste de la inclinación a 0° durante 5 minutos. Gradualmente se aumentó la velocidad y la inclinación de la cinta de correr poco a poco hasta un máximo de 20 mpm y 15° respectivamente. Los animales se ejercitaron sobre la cinta de correr durante un máximo de 90 minutos o hasta que estaban exhaustos. El agotamiento se determinó por el rechazo por parte de los ratones a permanecer sobre la cinta de correr durante al menos 20 segundos.

Medida de los metabolitos bioquímicos después del ejercicio en la cinta de correr.

Inmediatamente después de aproximadamente 20 min de ejercicio, se hizo una muesca en las colas de los ratones ejercitados con un escalpelo y se masajeó la vena de la cola para obtener un volumen apropiado de sangre (aproximadamente 3 pl) durante ambas medidas de glucosa y lactato. La glucosa en sangre se midió usando un medidor de glucosa en sangre OneTouch® Ultra (Lifescan). El lactato en sangre se midió usando el medidor Lactato Plus (Nova Biomedical). Las mediciones de los niveles de glucosa y lactato durante el ejercicio se realizaron en el momento indicado (es decir, a 0, 20, 40, 60 minutos de carrera, y en el agotamiento).

Prueba de la fuerza de presión.

Para medir la fuerza muscular in vivo y la función muscular, se dejó que los ratones macho C57B1/6 viejos (25 meses de edad) tratados con vehículo o rGDF11 (durante 4 semanas) se agarraran sobre la rejilla metálica horizontal del medidor de la fuerza de presión (Columbus Instruments, Columbus, Ohio) usando solo las extremidades anteriores y empujándolos hacia atrás 3 veces. La fuerza aplicada sobre la rejilla cada vez antes de que el animal pierda sus agarres se registraron en Newton. La fuerza máxima en Newton también se normalizó al peso corporal de cada animal y se representó en los datos.

PCR cuantitativa

Para el aislamiento de ARN de las células satélite, se clasificaron directamente al menos 10.000 células en 500 ul de reactivo Trizol (Life technologies) y se siguieron las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se convirtió en ADNc usando el kit Superscript III Reverse Transcriptase Supermix (Invitrogen, 11752-050). Las reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real se llevaron a cabo en una máquina ABI 7900HT, usando mezcla de PCR de verde SYBR (Applied Biosystems, 4309155). Se usó p-actina como un gen constitutivo, y los niveles de transcrito de ARNm de los genes de interés se normalizaron a los niveles de ARNm p-actina. Se obtuvieron secuencias de cebador experimentalmente validadas diseñadas para abarcar intrones de PrimerBank.

ELISA y Western.

Para el ELISA, se diluyeron extractos de músculo (tibial anterior) triturado (10 mg/ml) o plasma extraído de ratones C57BL/6 machos jóvenes (2-3 meses) y viejos (24 meses) como se indica y se usó en el inmunoensayo con TGF-p1 Quantikine® ELISA N.° de Catálogo MBl00B y el inmunoensayo con miostatina Quantikine® ELISA N.° de Catálogo DGDF80 (R&D systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis Western, se cargaron 100 |jg de extractos de plasma o músculo completo (cuádriceps o gastrocnemio) sobre los geles de poliacrilamida Criterion Tris-HCl de gradiente apropiado (4-20 %) ((Biorad Labs), y se inmunotransfirieron para proteínas como se indica usando los siguientes anticuerpos: anti-GDFll (Abcam mAb de conejo 1:1000), anti-GDF11 (mAb de ratón 1:500, obtenidos de Richard Lee), anti-pGc-1a (1:1000, Santa Cruz), y anti LC3B (1:1000, Novus). La cuantificación densitométrica de los datos del análisis Western se normalizaron a GAPDH (1:2000, Santa Cruz) o Actina (1:1000, Sigma) sirviendo como controles de carga.

Ensayo de la función mitocondrial.

La tasa de consumo de oxígeno (OCR) se midió usando el analizador de flujo extracelular Seahorse Bioscience(XF24). Las células satélite aisladas por FACS se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5.000/pocillo y se diferenciaron en miotubos como se ha descrito anteriormente. Las tasas de consumo de oxígeno (OCR) basales y máximas se calcularon comparando los valores con o sin el desacoplador mitocondrial, FCCP (5jM). Los valores OCR finales (pmol/min) se normalizaron a la concentración proteica total por pocillo.

Análisis del transcriptoma de ARN.

El análisis del transcriptoma de ARN se realizó usando la matrices 2.0 de genoma 430 de ratón Affymetrix GeneChip. Los datos de la micromatriz en bruto se han depositado en la base de datos "Gene Expression Omnibus". www.ncbi.nlm.nih.gov/geo (GSE50821). Se eligieron un subconjunto de trascritos miogénicos diferencialmente expresados para generar un mapa caliente del conjunto de datos originales normalizados por el algoritmo gcRMA y valor de corte SAM (valores q <10 %) usando el programa estadístico R.

Discusión

La disfunción dependiente de la edad en células madre de tejido adulto se ha citado como un contribuidor significativo a los déficits en la función y el potencial regenerativo que surge en muchos órganos como resultado del envejecimiento fisiológico. Se ha publicado que la sangre, el SNC y otros tejidos muestran números alterados números de células madre y reducida función de la célula madre con la edad.

En muchos tejidos, se requiere las poblaciones de células madre residentes para conservar la función apropiada, la estructura y el potencial regenerativo, y la disfunción relacionada con la edad con frecuencia está acompañada de una reducción de la actividad y/o el número de estas células.

La disfunción dependiente de la edad de las células madre adultas es atribuible a los aportes tanto intrínsecos como extrínsecos celulares, incluyendo factores solubles sistémicos que regulan la función regenerativa (Liu and Rando. J. Cell Biology 2011; 193, 257). Entre las propiedades intrínsecas celulares, se ha realizado la hipótesis de que la integridad genómica comprometida es uno de los mecanismos críticos subyacentes del declive funcional de las células madre viejas, y entre las señales extrínsecas celulares, recientes esfuerzos se han centrado particularmente en factores sistémicos y su capacidad para fomentar o invertir los cambios asociados a la edad en la regeneración en tejidos tan diversos como el músculo esquelético, el hígado y el SNC (Wagers y Conboy. Cell 2005; 122, 659; Ruckh et al. Cell Stem Cell 2005; 10, 96). De manera importante, aunque los medidores moleculares de estos efectos sistémicos claramente representan objetivos prometedores para la intervención terapéutica, sus identidades moleculares están ahora comenzando a revelarse.

En este caso, los presentes inventores emplearon parabiosis heterocrónica para investigar el impacto de los factores extrínsecos (sistémicos) sobre las propiedades intrínsecas (integridad genómica) de las células madre tisulares. Usando el músculo esquelético como un sistema experimental, con su población de células madre bien caracterizadas y sus respuestas regenerativas, se demostró que las células madre viejas, también conocidas como células satélite, adquieren niveles aumentados de daño del ADN en una edad avanzada y que la exposición a una circulación juvenil restaura la integridad genómica de la célula satélite y la función miogénica. Además, se demostró que la función similar y la reprogramación genómica pueden conseguirse mediante la restauración de los niveles juveniles de la hormona factor de diferenciación del crecimiento 11 (GDF11) en circulación, con normalmente declives con la edad.

El músculo esquelético presenta déficits relacionados con la edad en la actividad regenerativa, demostrado por el análisis de la histología del músculo esquelético en ratones jóvenes (2 meses) y viejos (24 meses) enfrentados a criolesión muscular. El tejido regenerante en ratones viejos presenta una disminución marcada en el número total de fibras (recién regeneradas) centralmente nucleadas (Figura 1A, analizado 7 días después de la lesión) (Cerletti, et al. Cell Stem Cell 2012; 10, 515), que son significativamente más pequeñas a través de un intervalo de áreas transversales (Figura 1B, p < 0,05 por el análisis de Bonferroni descendente) en comparación con el tejido regenerante en ratones jóvenes. Estos hallazgos indican una eficacia o robustez de la reparación muscular reducida en animales viejos, que ralentizan la recuperación del daño y puede contribuir a la disfunción muscular relacionada con la edad.

El potencial regenerativo muscular se determina en gran parte por un subconjunto especializado de células mononucleares asociadas a fibra muscular denominadas "células satélite" (Jang et al. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2011; 76, 101). Las células satélite se localizan debajo de la lámina basal, junto a la membrana plasmática de las fibras musculares, y actúan como células madre musculares con capacidad de autorenovación y diferenciación. Las células satélite pueden aislarse usando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) basándose en su perfil de marcador de superficie celular único (CD45-Sca-1-Mac-1-CXCR4+p1-integrina+) (Sherwood et al. Cell 2004; 119.543). De manera importante, estos marcadores fenotípicos que identifican las células satélite son distintos de aquellos que marcan las células musculares esqueléticas maduras o mioblastos, y > 95 % de las células satélite clasificadas por FACS expresan el marcador de célula satélite canónico Pax7. Esta población celular también contiene toda la actividad miogénica autónoma celular del músculo esquelético de ratón adulto (Sherwood et al. 2004), indicando que los cambios en el número o la función de esta población celular son probablemente para traducirse directamente en cambios en el potencial regenerativo muscular.

El músculo viejo presenta una disminución del número de células satélite, una función celular satélite afectada y una reducción del potencial regenerativo. Para evaluar los posibles cambios relacionados con la edad en células satélite musculares, los presentes investigadores usaron un ensayo miogénico clonal (Cerletti et al. 2012) que permite el análisis por célula de la función de la célula satélite. Las células satélite, identificadas por el fenotipo marcador CD45-Sca-1-Mac-1-CXCR4+p1-integrina+ descrito anteriormente se clasificaron doblemente (> 98% de pureza), y las células individuales se sembraron y cultivaron ex vivo en una placa de 96 pocillos. Estos ensayos revelaron una alteración grave de las células satélite viejas, que mostraron hasta una reducción de 4 veces de la eficacia formadora de colonia en comparación con las células jóvenes (Figura 1C, p < 0,05 por la prueba de la t de Student). Esta actividad miogénica disminuida de las células satélite viejas estaba acompañada de una reducción del marcador en la integridad del ADN, como puntuación de los ensayos cometa realizados sobre células satélite recién clasificadas (Figura 1D y Figuras 4A y 4B). Únicamente un 8-20 % de núcleos de célula satélite contenían el ADN absolutamente intacto (barras verdes, Figura 1D), mientras que aproximadamente un 60% de las células viejas presentaban integridad del ADN gravemente comprometida (barras rojas, Figura 1D, p < 0.05 por la prueba de la t de Student en comparación con las células satélite jóvenes). Del mismo modo, cerca de un 60% de las células satélite del músculo viejo (Figura 1E) o identificadas por la tinción con Pax7 sobre miofibrillas aisladas (Figura 5) también presentaron aumento de la inmunoreactividad para la forma fosforilada de la histona variante H2AX (pH2AX), un marcador ampliamente usado del daño del ADN en células. En cambio, aproximadamente un 40 % de las células satélite recién aisladas estaban desprovista de roturas de ADN (Figura 1D) y los núcleos de célula satélite joven raramente contenían más de 2 focos de pH2AX cuando se ensayaron después de la clasificación celular (Figura 1E) o sobre las miofibrillas sencillas (Figura 5). La inducción del daño del ADN por irradiación X redujo la función miogénica de las células satélite jóvenes en ensayos de trasplante (Figura 9), sugiriendo que el aumento del daño del ADN podría causar regeneración afectada. Estos datos indican que las deficiencias asociadas a la edad en la regeneración muscular, probablemente surjan de los defectos funcionales en las células satélite musculares y están asociadas a integridad del ADN comprometida. De manera notable, esta acumulación aparente de daño del ADN no parece inducir senescencia en las células satélite viejas, evaluado por el análisis de expresión de los transcritos génicos asociados a la senescencia por qRT-PCR (Figura 6A) o ensayo de SA-pGal (Figura 6B, panel de la derecha), ni hicieron que las células viejas residieran en un microambiente muscular senescente (Figura 6B, panel del medio).

Como se ha mencionado anteriormente, el deterioro asociado a la edad en la regeneración muscular se invirtió mediante la exposición de los músculos viejos a un ambiente sistémico juvenil por parabiosis heterocrónica (Conboy et al. Nature 2005; 433, 760), que expone los tejidos viejos a un ambiente sistémico juvenil y restaura la activación de las células satélite inducida por lesión mediante la regulación al alza de la señalización de Notch. Para analizar la hipótesis de que el declive del número, la actividad y la integridad genómica de las células satélite viejas puede restaurarse después de la exposición sistémica a un ambiente juvenil, se generaron parabiontes heterocrónicos (Figura 10), en los que, se unieron quirúrgicamente machos C57BL/6 de 2 meses con compañeros de 22 meses para desarrollar una circulación sanguínea común y se compararon con los controles parabióticos isocrónicos (joven-joven o viejo-viejo). Después de mantener los parabiontes durante 4-5 semanas, se observó que la frecuencia de células satélite en los compañeros viejos de las parejas heterocrónicas viejo-joven aumentaron significativamente en comparación con los compañeros viejos de animales isocrónicos viejo-viejo (Figura 2A). Asimismo, las células satélite doblemente clasificadas aisladas de compañeros viejos de parejas heterocrónicas viejo-joven presentaron recuperación significativa en la eficacia de formación de colonia miogénica en comparación con las de compañeros viejos de parejas isocrónicas viejo-viejo (Figura 2B). Paralelamente a este hallazgo de la función miogénica, la integridad del ADN de las células satélite aisladas de compañeros viejos de parejas heterocrónicas viejo-joven volvió a adquirir la integridad "juvenil" de las células jóvenes aisladas de las parejas joven-joven (Figura 2C), evaluado por el ensayo cometa. Del mismo modo, 3 veces menos las células satélites viejas de los compañeros viejos de las parejas heterocrónicas viejo-joven contenían más de 2 focos de H2AX fosforilada que las células observadas aisladas de los compañeros viejos de parejas isocrónicas viejo-viejo (Figura 2D). Estos hallazgos sugieren que el declive relacionado con la edad en la función de las células madre musculares, que, a su vez, se correlaciona con la integridad genómica comprometida de estas células, es reversible y está controlado al menos en parte por factores sistémicos.

Para determinar si el aumento del daño del ADN en células satélite viejas es un resultado de tenedores de replicación parados o colapsados en el conjunto de células satélite viejas más proliferativo (Chakkalakal et al. Nature 2012; 490, 355), que puede volver a su fase quiescente habitual después de estar expuesto al ambiente sistémico joven, se marcaron todos las células en reproducción alimentando las parejas parabióticas con BrdU durante el tiempo en el que las parejas estaban unidas. Cabe destacar que, la restauración de la integridad genómica no estaba acompañada de cambios detectables en la proliferación de células satélite o el historial proliferativo, evaluado por la incorporación de BrdU (Figura 11). Al contrario que el hallazgo reciente (Chakkalakal et al. 2012), el conjunto de células satélite aislado por la combinación marcadora de Sca1-, CD45-, Macl-, p1-integrina+ y CXCR4+ de animales no fue proliferativo ni en ratones jóvenes ni en viejos, hasta que se activaron por la lesión muscular inducida por inyección de cardiotoxina (Figura 11). Como se esperaba, tampoco se observó ninguna célula satélite en reproducción ni en los compañeros jóvenes ni en los viejos de ninguna pareja parabiótica por lo que se descarta cualquier alteración de la naturaleza quiescente del conjunto de células satélite como resultado de las cirugías parabióticas.

Considerados en conjunto, estos datos demuestran que la exposición a una circulación joven es suficiente para invertir las alteraciones funcionales inducidas por la edad y restaurar la integridad genómica en las células satélite regenerativas musculares. Para comenzar a descubrir las señales sistémicas que rejuvenecen la función de la célula madre muscular en ratones viejos expuestos a una circulación juvenil, se investigaron los factores de sangre-hueso variantes con la edad en ratones jóvenes y viejos. Estudios anteriores del músculo esquelético de ratón han implicado las citocinas en circulación, incluyendo el factor de crecimiento transformante-p1 (TGF-p1), miostatina y moléculas tipo Wnt como reguladores negativos potentes del crecimiento muscular y la reparación con la edad (Conboy et al., Nature 433:760, 2005; Brack et al., Science 317:807, 2007); sin embargo, los potenciadores sangre-hueso de la reparación del músculo esquelético no se ha descrito.

En un estudio reciente del envejecimiento del músculo cardíaco, se informó de un declive significativo en los niveles sistémicos del factor de diferenciación del crecimiento 11 (GDF11), un miembro de la superfamilia TGF-p con alta homología a miostatina (MSTN), en ratones viejos (Loffredo et al., Cell 153:828, 2013). A diferencia de GDF11, los niveles de miostatina son iguales y el TGF-p1 aumentó en el plasma de los ratones viejos (Figura 12A y Figura 12B, paneles izquierdos). Los niveles de GDF11 descienden también en el músculo de los ratones viejos (Figura 12C), mientras que los niveles de TGF-p1 y miostatina no están alterados (Figura 12A y Figura 12B, paneles derechos). Además, se demostró que la restauración de los niveles juveniles del GDF11 sistémico podría invertir la hipertrofia cardíaca del envejecimiento (Loffredo et al., Cell 153:828, 2013). Para determinar si el suplemento de GDF11 desde el compañero joven en parabiontes heterocrónicos podría sustentar la capacidad de esta intervención para rejuvenecer el músculo esquelético viejo, a continuación, se realizó un estudio controlado por vehículo, aleatorio en el que ratones viejos se trataron con inyección intraperitoneal diaria de GDF11 recombinante (rGDF11, 0,1 mg/kg de peso corporal del ratón), una pauta posológica que restaura los niveles de GDF11 en ratones viejos a niveles juveniles. Después de 4 semanas, un corte de ratones tratados y control se expusieron a criolesión del músculo tibial anterior (TA) para evaluar los posibles efectos sobre la regeneración muscular. El tratamiento con rGDF11 se continuó durante 7 días después de la lesión, en dicho tiempo los músculos TA lesionados se extirparon y se analizaron para determinar el número y el tamaño de células regenerantes. Notablemente, el suplemento de rGDF11 en ratones viejos fue suficiente para restaurar los perfiles juveniles del calibre de miofibrilla en musculo regenerante (Figura 3A y Figura 3B, p < 0,05 por el método de Bonferroni descendente), indicando que la provisión sistémica de este factor solo podría recapitular los efectos de rejuvenecimiento de la parabiosis heterocrónica sobre la regeneración muscular. El suplemento de rGDF11 en ratones viejos también es suficiente para aumentar el tamaño medio de las miofibrillas regenerantes en estos animales hasta un 92 % del tamaño de las fibras regenerantes en ratones control jóvenes (Figura 13A); sin embargo, el suplemento de rGDF11 no alteró el calibre de miofibrilla de los músculos viejos o jóvenes ilesos (Figura 13B y Figura 13C). Coherente con la función regenerativa mejorada de ratones tratados con rGDF11, la frecuencia de células satélite (Figura 3C) y la función (Figura 3D) significativamente aumentó en músculos viejos con suplemento de rGDF11 sistémico (p < 0,05 por la prueba de la t de Student), mientras que las poblaciones celulares mononucleares asociadas a miofibrilla no estaban afectadas (Figura 14). Además, las células satélite aisladas de ratones viejos tratados con rGDF11 mostraron números significativamente aumentados de células con núcleos intactos (barras verdes, Figura 3E, p <0,05 mediante la prueba de la t de Student), en comparación con las células extraídas de ratones viejos que recibieron solo vehículo durante el mismo tiempo. Asimismo, el porcentaje de células satélite recién aisladas con ADN gravemente dañado (barras rojas, Figura 3E) se redujeron 4 veces tras el tratamiento con rGDF11 (p < 0,05 por la prueba de la t de Student). A diferencia de los resultados observados con ratones viejos, los ratones jóvenes tratados con un régimen idéntico de inyecciones de rGDF11 no mostraron cambios en la frecuencia de células satélite, la formación de colonia miogénica o el daño del ADN. Estas mejoras en la integridad del ADN de las células satélite viejas tras la administración sistémica de rGDF11 produjo un perfil comparable al de las células satélite aisladas de ratones jóvenes sin tratar (Figura 3E). Por tanto, GDF11, que se reduce en la circulación de ratones viejos y se restaura tras la parabiosis heterocrónica (Loffredo et al, Cell 153:828, 2013), es suficiente para restaurar la función miogénica y la integridad genómica de las células madre musculare viejas, fomentando de este modo la regeneración del músculo viejo después de la lesión.

El suplemento de rGDF11 en ratones viejos también aumentó la capacidad regenerativa de las células satélite en un modelo de trasplante, en el que números iguales de células satélite marcadas con GFP se inyectaron en los músculos lesionados de animales viejos tratados con rGDF11 o vehículo solo durante 4 semanas antes y 2 semanas tras el trasplante. Los receptores tratados con rGDF11 mostraron casi dos veces más de fibras injertadas (GFP+) como receptores tratados con vehículo (Figura 15). Las fibras recién regeneradas en receptores tratados con rGDF11 también eran más grandes en calibre (Figura 16), coherente con los efectos de rGDF11 sobre la reparación endógena de la lesión muscular en ratones viejos (Figura 3A y 3B).

Los presentes investigadores, a continuación, investigaron las base mecánica para los efectos de rGDF11 sobre el músculo viejo. Aunque no se observaron alteraciones en la anatomía total sobre el peso corporal, la masa grasa, o la masa muscular (Figura 17), el análisis de inmunofluorescencia demostró aumentos en el tamaño de las uniones neuromusculares (NMJ) tras el tratamiento de rGDF11 (Figura 18). Además, la microscopia electrónica del músculo ileso reveló mejoras notables de la morfología miofibrilar y mitocondrial en ratones viejos tratados con rGDF11 (Figura 19A). Los músculos tratados mostraron reducción de mitocondria atípica e hinchada, reducción de acumulación de vacuolas, y restauración del patrón mitocondrial sarcomérico e interfibrilar regular (Figura 19A). De manera coherente con estas mejoras ultraestructurales, los niveles del coactivador gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisoma 1a (PGC-1a), un regulador maestro de la biogénesis mitocondrial, se aumentaron en el músculo de ratones tratados con rGDF11 viejos (Figura 19B), sugiriendo que GDF11 puede afectar a las dinámicas mitocondriales de la fisión y la fusión para generar nuevas mitocondrias. De manera coherente con esta idea, el tratamiento in vitro de cultivos de diferenciación de células satélite viejas con rGDF11 produjeron aumentos de los números de miotubos multinucleados que presentan mayor contenido mitocondrial y mayor función mitocondrial (Figura 20). Por último, se observaron niveles basales aumentados de marcadores de autofagosoma (macroautofagia) (evaluados como el porcentaje de intermediarios autofágicos LC3-II sobre LC3-I), el músculo esquelético ileso de animales viejos tratados con rGDF11 (Figura 19C). Colectivamente, estos datos sugieren aumento de autofagia/mitofagia y biogénesis mitocondrial como explicaciones probables de la remodelación celular de las fibras musculares en ratones viejos tratados con rGDF11.

Los presentes investigadores, a continuación, investigaron si las mejoras en la ultraestructura muscular y la renovación mitocondrial en ratones viejos tratados con rGDF11 podrían traducirse en mejoras de la función física en los análisis de la resistencia al ejercicio y la fuerza de presión. Los ratones viejos tratados con rGDF11 mostraron aumento de la resistencia al ejercicio media (35 min frente a 57 min), a pesar de la variación en las respuestas de los animales individuales (Figura 19D). Los animales tratados con rGDF11 también mostraron aclaramiento del lactato sistémico (Figura 21A) y niveles inferiores de glucosa (Figura 21B) después de 40 minutos de carrera vigorosa, lo que proporciona evidencia adicional que soporta indirectamente el aumento de la función mitocondrial en animales tratados con rGDF11 viejos. Por último, de acuerdo con la remodelación estimulada por rGDF11 de la ultraestructura de miofibrilla, los animales tratados con rGDF11 presentaron fuerza de presión media (Figura 22) en una plataforma de prueba estandarizada (Hakim, et al., Methods Mol Biol 709: 75, 2011).

Los estudios informados en este caso establecen GDF11 como un regulador hormonal novedoso de la juventud y el potencial regenerativo y demuestra que la restauración de la función de las células satélite viejas por este factor coincide con la inversión del daño del ADN acumulado. La restauración de este factor a los niveles juveniles en la sangre, o bien a través de parabiosis heterocrónica o por inyección directa in vivo, invierte la disfunción dependiente de la edad de las células satélite y restaura la reparación muscular robusta en ratones viejos. Notablemente, la restauración de la función de las células satélite viejas está acompañada por la inversión del daño del ADN acumulado, lo que sugiere que la toxicidad genómica puede contrarrestar la función de la células madre en músculo esquelético viejos.

Cabe destacar que, estudios recientes también indican que la roturas de la hebra del ADN de amplio genoma dirigidas son un evento conservado y necesario para la reprogramación del genoma asociada a la diferenciación celular (Larsen et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107, 4230). La perfilación del transcriptoma de células madre musculares jóvenes y viejas indica que algunos genes de diferenciación muscular se regulan al alza en las células satélite viejas (Figura 23), a pesar del hecho de que las células viejas muestran capacidad regenerativa comprometida. Además, los presentes inventores fallaron en detectar las alteraciones relacionadas con la edad en la expresión de enzimas de reconocimiento y reparación del daño del ADN mediante análisis de inmunofluorescencia (Figura 24). Estos datos plantean la posibilidad interesante de que las células satélite viejas muestren un aumento aparente en el daño del ADN debido a que se detienen en un fase temprana de la miogénesis, en la que las roturas de hebra del ADN asociadas a la diferenciación se han inducido, pero no se han resuelto. Ampliando esta lógica, el "rejuvenecimiento" sistémico por parabiosis o tratamiento con rGDF11 puede liberar estas células de este bloqueo de diferenciación inducido por la edad. Esta idea es coherente con nuestros datos que demuestran (i) un aumento de la detección del daño del ADN y un aumento en la caspasa-3 escindida activada en células satélite viejas (Figura 25), (ii) la resolución de estos cambios tras la restauración de la actividad miogénica en el músculo "rejuvenecido", y (iii) la capacidad de tratamiento in vitro con rGDF11 para aumentar el número celular miogénico y fomentar la formación de miotubo en cultivos de células satélite viejas (Figura 26). Debido al rejuvenecimiento estimulado por rGDF11 de las células satélite viejas con remodelación de nichos celulares satélite viejos, los presentes investigadores especulan que aumentar los niveles de GDF11 en ratones viejos puede actuar tanto indirecta como directamente para restaurar la función regenerativa de la célula satélite, estimulando los cambios intrínsecos en la capacidad de diferenciación de células satélite y produciendo un nicho más promiogénico que soporte extrínsecamente la regeneración endógena y el injerto miogénico asociado al trasplante.

Como se ha indicado anteriormente, los músculos viejos y las células madre residentes musculares en animales viejos de 24 meses tampoco son senescentes (Figura 6) en nuestras manos. Por tanto, es posible que las células madre musculares viejas se detengan en una fase temprana de la miogénesis, en la que las roturas de la hebra del ADN asociada a diferenciación ya se han inducido, dando como resultado el aumento de las estructuras cometa tras la electroforesis en gel de células única. Debido a las deficiencias relacionadas con la edad en la señalización, se postuló que estas células son incapaces de proceder a la diferenciación completa y, por lo tanto, tienen carencias en su capacidad de regeneración. Basándose en estas observaciones, se especuló que el GDF11 sistémico, que desciende con la edad, puede ser requerido para progresión miogénica apropiada de células satélite activadas.

GDF11 pertenece a una familia conservada de factores de crecimiento que regulan los diversos procesos celulares. La deficiencia genética de GDF11 en ratones provoca profundas anomalías en el desarrollo, incluyendo la agénesis de los riñones, y la letalidad perinatal. La forma madura de GDF11 comparte aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con miostatina (MSTN), conocida por su potente influencia negativa sobre la masa del músculo esquelético, y se une a los mismos receptores (ACVR1B/ALK4, ACVR1A/ALK5 and ACVR1 C/ALK7). Un estudio anterior informó de niveles relativamente bajos de la expresión de ALK4/5 por células satélite postnatales (P12) y fallaron en detectar una diferencia en la proliferación de estas células tras la exposición a MSTN (Kim, et al., Science, 308:1927, 2005). Los presentes inventores han encontrado que la exposición in vitro de células satélite viejas a rGDF11, pero no MSTN o TGF-p1 recombinante, produjo aumentos de respuesta a la dosis en la proliferación celular (Figura 26) y diferenciación (Figura 20A), lo que sugiere que GDF11, a diferencia de MSTN, puede actuar directamente sobre las células satélite para alterar su función. Cabe destacar que, la promoción del crecimiento puede ser un papel primordial de MSTN/GDF11, ya que los invertebrados solo poseen un único ortólogo de la familia MSTN/GDF11, y la regulación a la baja de este gen da como resultado crecimiento retardado (De Santis, et al., J Exp Biol 214: 2671, 2011). En cualquier caso, la combinación única de los efectos promiogénicos de rGDF11 en el músculo esquelético, los efectos antihipertróficos en el corazón (Loffredo, et al., Cell 153: 828, 2013), y los efectos beneficiosos sobre la neurogénesis y la función neuronal en ratones viejos, debe animar a más investigación de su potencial terapéutico para diversas enfermedades relacionadas con la edad y sugiere que GDF11 debe considerarse como nuevo regulador molecular del envejecimiento de mamíferos con aplicaciones de investigación potencialmente amplia.

En resumen, considerando el aspecto terapéutico de los estudios informados en el presente documento, la capacidad del factor GDF11 en circulación regulado por la edad para modular reversiblemente la actividad de las células madre y la regeneración mediada por las células madre nos lleva un paso adelante hacia el desarrollo de nuevas estrategias para conservar la función juvenil de las células madre y la homeostasis de tejido.

Bibliografía

1. L. Liu, T. A. Rando, "Manifestations and mechanisms of stem cell aging". The Journal of cell biology 193, 257 (18 de abril, 2011).

2. A. J. Wagers, I. M. Conboy, "Cellular and molecular signatures of muscle regeneration: current concepts and controversies in adult myogenesis". Cell 122, 659 (9 de septiembre, 2005).

3. J. M. Ruckh et al., "Rejuvenation of regeneration in the aging central nervous system". Cell Stem Cell 10, 96 (6 de enero, 2012).

4. Y. C. Jang, M. Sinha, M. Cerletti, C. Dall'Osso, A. J. Wagers, "Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function". Cold Spring Harb Symp Quant Biol 76, 101 (2011).

5. R. I. Sherwood et al., "Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle". Cell 119, 543 (12 de noviembre, 2004).

6. M. Cerletti, Y. C. Jang, L. W. Finley, M. C. Haigis, A. J. Wagers, "Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function". Cell Stem Cell 10, 515 (4 de mayo, 2012).

7. I. M. Conboy et al., "Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment". Nature 433, 760 (17 de febrero, 2005).

8. J. V. Chakkalakal, K. M. Jones, M. A. Basson, A. S. Brack, "The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence". Nature 490, 355 (18 de octubre, 2012).

9. A. C. McPherron, "Metabolic Functions of Myostatin and Gdf11". Immunol Endocr Metab Agents Med Chem 10, 217 (diciembre, 2010).

10. B. D. Larsen et al., "Caspase 3/caspase-activated DNase promote cell differentiation by inducing DNA strand breaks". Proc Natl Acad Sci U S A 107, 4230 (Mar 2, 2010).

11. A. C. McPherron, T. V. Huynh, S. J. Lee, "Redundancy of myostatin and growth/differentiation factor 11 function". BMC Dev Biol 9, 24 (2009).

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende el polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11 para su uso en el tratamiento de una afección muscular esquelética en un sujeto que lo necesita, en donde la afección muscular esquelética se selecciona de entre caquexia, miositis inflamatoria, enfermedad neuromuscular, debilidad muscular después de la cirugía, debilidad muscular postraumática y exposición a toxinas, o para su uso para aumentar la frecuencia o número de las células madre del músculo esquelético, aumentar la eficacia de la formación de colonia miogénica, aumentar el porcentaje de núcleos intactos y disminuir el porcentaje de ADN gravemente dañado en un sujeto que lo necesita que tiene denervación o distrofia.

2. Un método no terapéutico para tratar o prevenir la fatiga del músculo esquelético inducida por el ejercicio en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que aumente el nivel del polipéptido de GDF11 en el sujeto, en donde la composición comprende el polipéptido de GDF11 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11.

3. El método de la reivindicación 2 para rejuvenecer las células madre del músculo esquelético en un sujeto que lo necesita, en donde la composición provoca el aumento de las células madre del músculo esquelético del sujeto en cuanto a frecuencia o número, el aumento de los tamaños de las miofibrillas regenerantes, el aumento de la eficacia de formación de colonia miogénica, el aumento del porcentaje de núcleos intactos y la disminución del porcentaje de ADN gravemente dañado.

4. La composición para su uso de la reivindicación 1 o el método no terapéutico de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en donde se aumenta el nivel de polipéptido de GDF11 en el tejido muscular esquelético del sujeto.

5. La composición para su uso de la reivindicación 1 o el método no terapéutico de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en donde la composición comprende un polipéptido de GDF11.

6. La composición para su uso de la reivindicación 1 o el método no terapéutico de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en donde la composición comprende un polipéptido de GDF11 que comprende la secuencia de aminoácidos de un GDF11 maduro humano, la secuencia de aminoácidos de un propéptido de GDF11 humano, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido precursor de GDF11 humano o la secuencia de aminoácidos de un polipéptido N-terminal de GDF11 humano.

7. La composición para su uso de la reivindicación 1 o el método no terapéutico de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en donde la composición comprende homodímeros de polipéptidos de GDF11 que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido precursor de GDF11 humano, un propéptido de GDF11 humano, un GDF11 maduro humano o un polipéptido N-terminal de GDF11 humano.

8. La composición para su uso de la reivindicación 1 o el método no terapéutico de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en donde la composición comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDF11.