ES2952367T3

ES2952367T3 - Conjugados terapéuticos basados en PAR-1 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2952367T3
Application number: ES15793541T
Authority: ES
Inventors: Joab Chapman; Efrat Shavit-Stein
Original assignee: Tel HaShomer Medical Research Infrastructure and Services Ltd
Current assignee: Tel HaShomer Medical Research Infrastructure and Services Ltd
Priority date: 2014-05-11
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2023-10-31
Anticipated expiration: 2035-05-11
Also published as: WO2015173802A1; US20170072014A1; EP3143036A1; EP3143036C0; US10028999B2; EP3143036A4; EP3143036B1

Abstract

La presente invención está dirigida a un conjugado peptídico que comprende un resto protector alfa-amino, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos de longitud derivada del extremo C' de PAR-1, o una variante activa del mismo y un fracción incapacitante de proteasas. La presente invención se dirige además a composiciones farmacéuticas que comprenden el conjugado peptídico y su uso para tratar enfermedades y trastornos asociados con una actividad excesiva de PAR-1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados terapéuticos basados en PAR-1 y usos de los mismos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención está dirigida a un conjugado peptídico que comprende un resto protector alfa-amino, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos de largo derivada del extremo C'-terminal de PAR-1, o una variante activa del mismo y un resto inhabilitador de proteasas. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden el conjugado peptídico y su uso para tratar enfermedades y trastornos asociados con una actividad excesiva de PAR-1.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los receptores activados por proteasa (PAR) son una familia de cuatro receptores acoplados a proteína G numerados PAR-1 a PAR-4. Desde su descubrimiento a principios de los años 90, PAR-1 se ha encontrado en muchos tejidos, incluido el cerebro, donde se encuentra en varios tipos de células que incluyen neuronas, astrocitos y microglia. Las primeras funciones de PAR-1 descritas en neuronas y glía involucraban la supervivencia celular y la muerte celular. Este doble efecto depende de la concentración, donde a niveles altos de activación de PAR-1 se observan efectos nocivos y a niveles más bajos se observan efectos protectores. PAR-1 lleva todos los determinantes necesarios para el reconocimiento de trombina.

[0003] Se sabe que muchas enfermedades neurológicas están asociadas con un aumento de la inflamación y una sobreactivación de los receptores activados por proteasa (PAR) por factores proteicos de la cascada de la coagulación. Esto incluye, la neuropatía que comúnmente es causada por la diabetes mellitus, que ocurre en el 60% de todos los pacientes diabéticos.

[0004] Muchos estudios han sugerido que la trombina juega un papel en la angiogénesis y su inhibición reduce el edema. El glioblastoma multiforme (GBM) es un tumor cerebral de rápido crecimiento que provoca una alta mortalidad en un mes. Varios procesos caracterizan a GBM, incluido el aumento de la angiogénesis, la formación de edema y la proliferación de células tumorales mejorada.

[0005] Los documentos US 2009/0281100 y US 2004/0092535 describen un método para inhibir una serina/treonina quinasa utilizando quinolinonas de bencimidazol, en el que la serina/treonina quinasa es PAR-1, para tratar diabetes, diabetes mellitus no insulinodependiente, enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, cáncer, enfermedades autoinmunes y rechazo de trasplantes de órganos.

[0006] Los documentos US 2012/0232097 y US 2009/0176803 describen derivados de cinamoil-piperazina como antagonistas de PAR-1 y usos de los mismos para tratar y/o prevenir trombosis arterial/venosa, síndromes coronarios agudos, reestenosis, angina estable, trastornos del ritmo cardíaco, infarto de miocardio, hipertensión, insuficiencia cardíaca, accidente cerebrovascular, trastornos inflamatorios, enfermedades pulmonares, enfermedades gastrointestinales, desarrollo de fibrosis en pacientes con enfermedad hepática crónica, cáncer y enfermedades de la piel.

[0007] Los documentos US 8.232.295 y 7.842.716 describen métodos para tratar y/o prevenir eventos vasculares mediante la inhibición de PAR-1 y/o PAR-4 usando estatinas.

[0008] El documento US 2007/0142272 describe el uso de una proteína C activada (APC), profármaco y/o una variante de la misma como agonista de PAR-1 y/o PAR-3 y/o receptor de proteína C endotelial (EPCR) para proporcionar neuroprotección, tratar enfermedades neurodegenerativas y mejorar el estrés o las lesiones.

[0009] A pesar de los esfuerzos realizados en el campo, sigue existiendo una necesidad insatisfecha en la técnica de inhibidores potentes que inhiban o prevengan la activación excesiva de PAR, especialmente PAR-1.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0010] La presente invención proporciona conjugados de péptidos novedosos capaces de dirigirse a una mayor actividad de proteasa asociada con enfermedades y trastornos. Los conjugados peptídicos de la invención están adaptados para proteger específicamente a los receptores PAR de la sobreactivación. Sorprendentemente, se demostró que los conjugados peptídicos de la invención inhiben la actividad de la trombina, reducen la actividad similar a la trombina generada por las células de glioma, inhiben la proliferación de células de glioma, inducen la reducción de tumores de glioblastoma multiforme (GBM) in vivo y reducen la formación de edema asociado con GBM. Ventajosamente, los conjugados de péptidos ejercen las actividades terapéuticas antes mencionadas a concentraciones significativamente bajas, dentro del rango de nanomolares in vitro y micromolares in vivo, mientras que los inhibidores de PAR1 conocidos requieren concentraciones mucho más altas para ejercer una actividad inhibidora. Además, la actividad del conjugado peptídico se realiza sin efectuar la coagulación. La notable eficacia en concentraciones nanomolares sugiere que los conjugados proporcionan una toxicidad reducida y una menor aparición de efectos secundarios, en particular, hemorragias internas no deseadas.

[0011] Se proporciona un conjugado peptídico que comprende un resto protector de alfa-amino, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Asp-Pro-Arg y SEQ ID NO: 1-17, y un resto incapacitante de proteasa, en el que el péptido se une al resto protector alfa-amino y al resto inhabilitador de proteasas,

[0012] en el que el resto que inhabilita la proteasa se selecciona del grupo que consiste en clorometilcetona, sulfonilfluoruros (-SO₂F), clorometilcetonas (-COCH₂Cl), aldehídos (-CHO), arilcetonas (-CO-arilo), trifluorometilcetonas (-COCF3) y ácidos cetocarboxílicos (-COCo Oh ), y

en el que el resto protector de alfa-amino es tosilo o derivados del mismo.

[0013] En algunas formas de realización, el resto protector de alfa-amino puede unirse a la secuencia de aminoácidos del extremo N' del péptido directamente o a través de un enlazador.

[0014] En algunas formas de realización, el resto que desactiva la proteasa puede unirse a la secuencia de aminoácidos del extremo C' del péptido directamente o a través de un enlazador.

[0015] En algunas formas de realización, el péptido comprende el aminoácido expuesto en SEQ ID NO:3, o una variante activa del mismo.

[0016] En algunas formas de realización, el péptido comprende el aminoácido establecido en SEQ ID NO: 4, o una variante activa del mismo.

[0017] En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Asp-Pro-Arg y SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 17.

[0018] En algunas formas de realización, el conector puede ser un conector peptídico o un conector oligonucleotídico.

[0019] Como se describe en el presente documento, el resto que desactiva la proteasa se puede seleccionar del grupo que consiste en sulfonilfluoruros, clorometilcetonas, ésteres, ácidos borónicos, aldehídos, arilcetonas, trifluorometilcetonas, ácidos cetocarboxílicos y combinaciones de los mismos.

[0020] En algunas formas de realización, el resto que desactiva la proteasa puede ser clorometilcetona y derivados de la misma.

[0021] En algunas formas de realización, el resto protector de alfa-amino puede ser tosilo o un derivado del mismo, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Pro-Arg o una variante activa del mismo y el resto que desactiva la proteasa puede ser un haloacetilo, en el que el haloacetilo es clorometilcetona.

[0022] Se proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado de péptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo dicho conjugado de péptido un resto protector alfa-amino, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Asp-Pro-Arg y SEQ ID NO: 1-17, y un resto que inhabilita la proteasa,. en el que el péptido se une a la fracción protectora de alfa-amino y a la fracción inhabilitadora de proteasa,

[0023] en el que el resto que inhabilita la proteasa se selecciona del grupo que consiste en clorometilcetona, sulfonilfluoruros (-SO₂F), clorometilcetonas (-COCH₂Cl), aldehídos (-CHO), arilcetonas (-CO-arilo), trifluorometilcetonas (-COCF3) y ácidos cetocarboxílicos (-COCOOH), y en donde el resto protector alfa-amino es tosilo o derivados del mismo.

[0024] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica puede incluir además tricloroacetato.

[0025] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica puede incluir además un antagonista de PAR-1.

[0026] En algunas formas de realización, el antagonista de PAR-1 puede ser SCH79797 (N3-ciclopropil-7-[[4-(1-metiletil)fenil]metil]-7H-pirrolo[3,2-f]quinazolina-1,3-diamina dihidrocloruro).

[0027] Se proporciona el uso de una composición farmacéutica que comprende un conjugado de péptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo dicho conjugado de péptido un resto protector alfa-amino, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Asp-Pro-Arg y SEQ ID NO: 1-17, y un resto inhibidor de proteasa, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una actividad excesiva del receptor de proteasa, en el que el péptido se une al resto protector de alfa-amino y al resto inhibidor de proteasa, en el que el el resto que inhabilita la proteasa se selecciona del grupo que consiste en clorometilcetona, sulfonilfluoruros (-SO₂F), clorometilcetonas (-COCH₂Cl), aldehidos (-CHO), arilcetonas (-CO-arilo), trifluorometilcetonas (-COCF3) y ácidos cetocarboxílicos (-COCOOH), y

donde el resto protector de alfa-amino es tosilo o derivados del mismo.

[0028] En algunas formas de realización, el receptor de proteasa puede ser PAR-1.

[0029] En algunas formas de realización, la enfermedad o trastorno puede seleccionarse del grupo que consiste en neuroinflamación, enfermedades o trastornos neuroinflamatorios, enfermedad o trastorno neurodegenerativo, neuropatía y neuropatía relacionada con la diabetes.

[0030] En algunas formas de realización, el uso puede ser para el tratamiento de un tumor asociado con dicha enfermedad o trastorno.

[0031] En algunas formas de realización, las enfermedades o trastornos pueden seleccionarse del grupo que consiste en glioma, astrocitomas, cáncer, tumor sólido, tumor cerebral, glioblastoma, oligodendroglioma, ependimoma, gliomas mixtos, glioblastoma multiforme, neuropatía, neuropatía periférica diabética, síndrome de Guillain-Barré, esclerosis lateral amiotrófica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, encefalomielitis diseminada aguda, neuritis óptica, mielitis transversa, neuromielitis óptica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, esclerosis múltiple y enfermedad de Parkinson.

[0032] En algunas formas de realización, el tratamiento puede incluir cualquiera o más de la inhibición de la progresión de dicha enfermedad o trastorno, la atenuación de la progresión de dicha enfermedad o trastorno o la prevención del deterioro de dicha enfermedad o trastorno.

[0033] Como se describe en este documento, se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con un exceso de actividad del receptor de proteasa en un paciente que necesita dicho tratamiento, comprendiendo el método el paso de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un conjugado peptídico y un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo dicho conjugado peptídico un resto protector alfa-amino, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos de longitud derivada del extremo C'-terminal de PAR-1 como se establece en SEQ ID NO: 17, o una variante activa del mismo y un resto inhabilitador de proteasas.

[0034] Como se describe en el presente documento, la composición farmacéutica puede administrarse por vía tópica, intraperitoneal, sistémica o intracraneal.

[0035] Como se describe en el presente documento, el tratamiento puede incluir uno o más de inhibir la progresión de dicha enfermedad o trastorno, atenuar la progresión de dicha enfermedad o trastorno o prevenir el deterioro de dicha enfermedad o trastorno.

[0036] Como se describe en el presente documento, el sujeto que lo necesite puede ser un sujeto afectado por dicha enfermedad o trastorno o un sujeto susceptible a dicha enfermedad o trastorno.

[0037] Como se describe en el presente documento, el método puede comprender además la administración de un segundo agente terapéutico en combinación con dicho conjugado peptídico.

[0038] En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico puede ser un antagonista de PAR-1.

[0039] Se proporciona el uso de una composición farmacéutica que comprende un conjugado peptídico y un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo dicho conjugado peptídico un resto protector alfa-amino, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos de longitud como se describe en el presente documento, para su uso en inducir una reducción en la actividad de la trombina.

[0040] Se proporciona un kit para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad excesiva del receptor de proteasa en un paciente que necesita dicho tratamiento, comprendiendo el kit al menos un recipiente que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un conjugado peptídico y un portador farmacéuticamente aceptable, comprendiendo dicho conjugado peptídico un resto protector alfa-amino, un péptido que comprenda la secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos de largo derivada del extremo C'-terminal de PAR-1 como se establece en SEQ ID NO: 17, o una variante activa del mismo y un resto inhabilitador de proteasas.

[0041] Como se describe en este documento, el kit puede comprender además al menos un segundo contenedor que incluye un segundo agente terapéutico. En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico puede ser un antagonista de PAR-1.

[0042] Como se describe en el presente documento, el kit puede incluir además instrucciones para el uso de la composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad o trastorno. En algunas formas de realización, las instrucciones de uso pueden incluir instrucciones para usar la composición farmacéutica en al menos un primer recipiente en combinación con la composición farmacéutica en al menos un segundo recipiente. En algunas formas de realización, las instrucciones pueden recitar además una dirección de sitio web que proporciona más información y resolución de problemas, entre otros servicios. En algunas formas de realización, las instrucciones pueden estar en papel, como un prospecto o una etiqueta.

[0043] Otras formas de realización y el alcance completo de la aplicabilidad de la presente invención se harán evidentes a partir de la descripción detallada que se proporciona a continuación. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican formas de realización preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, dado que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0044]

La Figura 1 muestra la actividad similar a la trombina media (U/ml ± SEM) en los nervios ciáticos de (A) ratas EAN el día de la inducción y a los 10, 14 y 19 días después de la inducción (EAN 10, n=10; EAN14, n= 10; EAN19, n=10, respectivamente) frente a ratas de control (n=10) y ratones CFA (adyuvante completo de Freund); y en (B) ratas STZ (n=15) frente a ratas control (n=12) (** = p<0,01; * = p<0,005).

La Figura 2 muestra transferencias de Western (A, C) y los análisis estadísticos correspondientes (B, D) de 3 experimentos independientes de inmunorreactividad de PAR-1 (A, B) e inmunorreactividad de PN-1 (C, D) en nervio ciático desvainado de STZ inducida. ratas diabéticas (n=3) y ratas control no diabéticas (n=3; *=p<0,05; **= p<0,01).

La Figura 3 presenta el efecto de (i) N alfa-tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK, 4,4 mg/kg, n=5) y (ii) Na-(2-naftil-sulfonil-glicil)-DL-p-amidinofenilalanil-piperidina (NAPAP, NAPAP-120 μM/kg de peso corporal, n=5), tratamientos (barras negras) en relación con el control/CFA (barras grises, n=3) y en relación con las ratas no tratadas con EAN (EAN, n=5) mediante pruebas electrofisiológicas: latencia (A), velocidad de conducción (B) y amplitud (C). Las estadísticas se indican como sigue: *= p<0,05, **= p<0,01.

La Figura 4 muestra el efecto de la clorometilcetona N alfa-tosil-L-lisina (TLCK, 4,4 mg/kg de peso corporal, n=8) y (ii) Na-(2-naftil-sulfonil-glicil)-DL-p-amidinofenilalanil-piperidina (NAPAP, 120 μM/kg de peso corporal, n=5), tratamientos (barras negras) respecto al control (barras grises, n=4) y ratas diabéticas no tratadas inducidas por STZ (n=5) mediante pruebas electrofisiológicas: latencia (A), velocidad de conducción (B) y amplitud (C) *= p<0,05, * *= p<0,01.

La figura 5 muestra transferencias de Western de PAR-1 y actina (A) y un análisis estadístico correspondiente (B) en homogeneizados de cerebro derivados de SOD-1 y ratones de control de tipo salvaje (p<0,001).

La Figura 6 muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier de (rombo completo) ratones SOD-1 no tratados (control), (círculo vacío) ratones SOD-1 tratados con TLCK (4,4 mg/kg) y (triángulo vacío) ratones tratados con P^aR -1 antagonista (SCH79797; 25 μg/kg).

La Figura 7 muestra la actividad similar a la trombina antes (barras negras) y después del tratamiento con NAPAP (barras grises) en células de glioma C6 (A) y CNS-1 (B) y su medio circundante.

La Figura 8A muestra la proliferación de células de control C6 (barra negra) y células tratadas con varias dosis de antagonista de PAR-1 SCH79797 (barras grises).

La Figura 8B muestra la proliferación de células de control CNS-1 (barra negra) y células tratadas con cada uno de los antagonistas de pAR-1: SCH79797, NAPAP y TLCK, y combinaciones de los mismos (barras grises).

La Figura 9 muestra la proliferación de la línea celular de glioma CNS-1 tras el tratamiento dependiente de la dosis con TLCK (barras grises) en comparación con las células no tratadas (barra negra).

La Figura 10 presenta el efecto de las diversas dosis de los conjugados peptídicos que abarcan el péptido Asp-ProArg (péptido corto; 3AA) y el péptido expuesto en SEQ ID NO: 4 (péptido largo; 7Aa ) sobre la proliferación de células de glioma CNS-1. -línea (barras grises) en relación con el control (barra negra de células no tratadas).

La Figura 11 presenta la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de gliomas por diferentes concentraciones de los conjugados peptídicos que abarcan el péptido Asp-Pro-Arg y los péptidos de SEQ ID NO: 2-4 (11A-11D, respectivamente) después de 48 h.

La Figura 12 presenta la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de gliomas por diferentes concentraciones de los conjugados peptídicos que abarcan el péptido Asp-Pro-Arg y los péptidos de SEQ ID NO: 2-4 (12A-12D, respectivamente) después de 72 h.

La Figura 13 presenta el efecto de los conjugados peptídicos que abarcan el péptido expuesto en SEQ ID NO: 4 (7AA) con o sin antagonista de PAR-1 (1 μM) sobre la proliferación (XTT) de la línea celular de glioma CNS-1 (gris barras) en comparación con las células no tratadas (control; barra negra).

La Figura 14 presenta la actividad similar a la trombina en el ensayo de inhibición de la trombina bajo varias dosis de los conjugados peptídicos (desde 156 nanomolar hasta 1 mM to) que abarcan el péptido Asp-Pro-Arg (3AA; A) y el péptido expuesto en SEQ ID NO: 4 (7AA; B) en relación con el control (es decir, sin la presencia de uno de los conjugados peptídicos (rombos).

La Figura 15 presenta la actividad de trombina (proporción) realizada en un ensayo de actividad de trombina (no celular) bajo diferentes concentraciones de los conjugados peptídicos que abarcan el péptido Asp-Pro-Arg (3AA; x, línea gris) o los péptidos establecidos en SEQ ⁱD NO: 1 (4A^a; x, línea oscura); S^eQ ID NO: 2 (5AA, triángulo, línea oscura); Se Q iD NO: 2 (5AA, triángulo, línea oscura); ID NO: 3 (6AA; cuadrado, línea gris) y SEQ ID NO: 4 (7AA; rombo, línea oscura).

La Figura 16 presenta el efecto de las diversas dosis de los conjugados peptídicos que abarcan el péptido Asp-ProArg (3AA) y el péptido establecido SEQ ID NO: 4 (7AA) sobre la actividad similar a la trombina en la línea celular de glioma CNS-1 (barras grises) en comparación con las células no tratadas (control; barra negra).

La Figura 17 presenta la actividad de trombina (proporción) generada por células de glioma de rata inhibidas por diferentes concentraciones de conjugados peptídicos que abarcan el péptido Asp-Pro-Arg (3AA; asterisco) o los péptidos establecidos en SEQ ID N^o: 1 (4A^a; x); SEQ ID NO: 2 (5AA; triángulo); SEQ ID NO: 3 (6AA; cuadrado) y SEQ ID NO: 4 (7AA; diamante).

La Figura 18 presenta la actividad de trombina en muestras de plasma después de la adición de los conjugados peptídicos que abarcan el péptido Asp-Pro-Arg (A) o los péptidos expuestos en SEQ ID NO: 2 (B); SEQ ID NO: 3 (C); y SEQ ID NO: 4 (D).

La Figura 19 presenta la velocidad de conducción del nervio ciático (m/s) en un modelo de ratones con diabetes mellitus (inducida por inyección de estreptozotocina (STZ)) no tratados (STZ) o tratados con T5AACK (un péptido conjugado que abarca el péptido 6AA (SEQ ID NO: 2) anidado entre tosyl y CK) a diferentes concentraciones y comparado con ratones normales sin diabetes (Control).

La Figura 20 presenta cambios en el tamaño del tumor (A) y en el tamaño del edema que rodea el tumor (B) en 3 grupos de ratas: (1) control; (2) tratamiento con 2 mM de un conjugado peptídico que comprende el péptido denominado 6AA (SEQ ID NO: 3); y (3) tratamiento con 20 μM de un conjugado peptídico que comprende el péptido denominado 6AA (SEQ ID NO: 3).

La Figura 21 presenta el porcentaje de supervivencia de ratas en los siguientes grupos de tratamiento: control (solución salina; círculo), 2 μM de un conjugado peptídico que comprende el péptido denominado 6AA (SEQ ID NO: 3; cuadrado) y 20 μM de un péptido conjugado que comprende el péptido denominado 6AA (SEQ ID NO: 3; diamante).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0045] La presente invención proporciona conjugados peptídicos novedosos que se dirigen a una mayor actividad de la proteasa asociada con enfermedades y trastornos al proteger específicamente a los receptores PAR de la sobreactivación.

[0046] Durante mucho tiempo se ha reconocido que en PAR-1 (NP_001983.2) el fragmento extracelular (exodominio amino-terminal) lleva todos los determinantes para el reconocimiento de trombina. En algunas formas de realización, la secuencia de dicho exodominio amino-terminal es la siguiente: 38LDPRSFLLRNPNDKYEPF55 (SEQ ID NO: 18). Esta secuencia peptídica está uniendo el sitio activo de la trombina y el exositio I. Además, la secuencia 38LDPR41 (también denominada LDPR; SEQ ID NO: 1), está en contacto con el sitio activo de la trombina y el motivo similar a la hirudina ácida, 51KYEPF55 (SEQ ID NO: 19), involucrando así el exositio I de trombina. Aunque la mayor afinidad de unión y la máxima proximidad se encontraron entre 38LDPR41 (P1 a P4; (SEQ ID NO: 1) y el sitio activo de la trombina, un modelo 3D de péptido N-terminal PAR-1 y la trombina revelan contactos (con menor fuerza) hasta el aminoácido en la posición 20 (P20). La activación de PAR-1 requiere la unión específica de la trombina y proteasas similares a un sitio de unión en el receptor, que está justo antes. El sitio de unión en el receptor PAR-1 comprende la secuencia de aminoácidos PESKATNATLDPR (s Eq ID NO: 10) que es significativamente diferente de las secuencias equivalentes en PAR-2, 3 y 4. Como se ejemplifica en la Tabla 2, a continuación, existe un alto grado de homología entre el PAR-1 humano, de ratón, de rata y bovino en las posiciones P1 a P7, donde la mayor homología está en P1-P2 y P5-P7.

[0047] En el sistema nervioso, la activación de PAR en las células gliales juega un papel importante. En el sistema nervioso periférico (SNP), PAR-1 se localiza en la mielina no compactada de las células de Schwann en el nódulo de Ranvier, y en la unión neuromuscular se localiza en la glía perisináptica y el músculo postsináptico. Los inventores de la presente invención fueron los primeros en mostrar un papel funcional para la activación de pAR-1 en el componente de la glía del nódulo de Ranvier en el SNP, donde la activación del receptor provocó el bloqueo de la conducción nerviosa (Shavit et al., Brain, 2008, Vol. 131 (Pt 4): Pág. 1113-1122). En el sistema nervioso central (SNC), se encontró PAR-1 en las neuronas y la glía. Se sugirió que PAR-1 se localiza en una estructura de astrocito específica en la sinapsis, y los inventores de la presente invención han confirmado esta ubicación mediante métodos de alta resolución como microscopía confocal y electrónica (Shavit et al., J Neurochem. 119(3): págs. 460-473). Se demostró que la activación de PAR-1 desempeña un papel fisiológico en la sinapsis del SNC, donde su activación modula la transmisión sináptica al provocar una potenciación a largo plazo (LTP) y una actividad similar a las convulsiones y potencia el receptor sináptico de Nmetil-D-aspartato (NMDA). Es interesante señalar, por tanto, que PAR-1 es un marcador de estructuras gliales adyacentes a las partes fisiológicamente más activas del sistema nervioso, la sinapsis y el nódulo de Ranvier.

[0048] Por lo tanto, se proporciona un conjugado peptídico que comprende un resto protector, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos DPR (también denominada Asp-Pro-Arg) o una variante activa del mismo y un resto inhabilitador de trombina.

[0049] En algunas formas de realización, el conjugado peptídico puede comprender la siguiente estructura: PRO-PEP-DIS, en el que PRO es un resto protector, tal como un resto protector de alfa-amino; PEP es un resto peptídico que comprende las secuencias de aminoácidos DPR o las secuencias de aminoácidos que comprenden las mismas, como se establece en SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 17, o una variante activa de las mismas; y DIS puede ser un resto que inhabilita la proteasa, en el que PRO puede unirse al aminoácido terminal N' de PEP directamente o a través de un enlazador, y en el que DIS puede unirse al aminoácido terminal C' de PEP directamente o a través de un enlazador. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0050] Los términos "resto peptídico" y "PEP" son intercambiables y se refieren a un resto peptídico derivado de PAR-1, que incluye, entre otros, el extremo C' de PAR-1 (SEQ ID NO: 17).

[0051] En algunas formas de realización, el resto peptídico puede tener una secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos de largo derivada del extremo C'-terminal de PAR-1.

[0052] En algunas formas de realización, el resto peptídico puede tener una secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos de largo y como máximo 7 aminoácidos de largo, derivada del extremo C' de PAR-1.

[0053] En algunas formas de realización, el resto peptídico puede tener una secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos de largo y como máximo 7 aminoácidos de largo derivados del extremo C'-terminal de PAR-1 comenzando desde Arginina en la posición 20 y continuando hacia el extremo N'.

[0054] En algunas formas de realización, las secuencias de aminoácidos de DPR y SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 17 son fragmentos del receptor PAR-1, al que se une la trombina y los conjugados peptídicos de la presente invención comprenden tal secuencia como señuelo para trombina, es decir, para permitir su unión específica a la trombina.

[0055] En algunas formas de realización, el resto peptídico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en DPR, LDPR (SEQ ID NO: 1), TLDPR (SEQ ID NO: 2), ATLDPR (SEQ ID NO: 3), NATLDPR (SEQ ID NO: 4), TNATLDPR (SEQ ID NO: 5), ATNATLDPR (SEQ ID NO: 6), KATNATLDPR (SEQ ID NO: 7), SKATNATLDPR (SEQ ID NO: 8), ESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 9), PESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 10), RPESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 11), RRPESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 12), ARRPESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 13), RARRPESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 14), TRARRPESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 15), RTRARRPESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 16) y ARTRARRPESKATNATLDPR (SEQ ID NO: 17). Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0056] En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en Asp-Pro-Arg (DPR). En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en s Eq ID NO: 1. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 2. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 3. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 3. formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 4. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 5. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 6. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 7. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 8. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 9. En algunas formas de realización, el péptido el resto puede consistir en SEQ ID NO: 10. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 11. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede constar en SEQ ID NO: 12. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consta de SEQ ID NO: 13. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 14. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ Id NO: 15. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 16. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede consistir en SEQ ID NO: 17.

[0057] En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos Asp-Pro-Arg o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 9 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16 o una variante activa de la misma. En algunas formas de realización, el resto peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 17 o una variante activa de la misma.

[0058] Los términos "variante activa", "análogo" y "variante" como se usan en el presente documento son intercambiables y se refieren a cualquier resto peptídico derivado de una secuencia peptídica como se establece en DPR y cualquiera de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 17 por al menos una sustitución de aminoácido, que conserva al menos el 70%, opcionalmente, al menos el 80% o al menos el 90% o al menos el 95%, de la actividad biológica de la secuencia de la que se deriva, o a la que es más similar. Estos términos también abarcan péptidos que comprenden regiones que tienen una similitud sustancial con el resto peptídico, como variantes estructurales.

[0059] El término "similitud sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de manera óptima, comparten al menos un 50 por ciento de identidad de secuencia, al menos un 60 por ciento de identidad de secuencia, al menos un 70 por ciento de identidad de secuencia, al menos un 80 por ciento de identidad de secuencia, al menos un 90 por ciento de identidad de secuencia, o al menos 95 por ciento de identidad de secuencia o más (por ejemplo, 99 por ciento de identidad de secuencia). Típicamente, las posiciones de los residuos, que no son idénticas, difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos.

[0060] En algunas formas de realización, uno o más de los restos peptídicos pueden corresponder a variantes de la secuencia de aminoácidos DPR o las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 17. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0061] En algunas formas de realización, dichas variantes pueden comprender sustituciones conservativas con respecto a la secuencia de aminoácidos del resto peptídico correspondiente.

[0062] Ejemplos de sustituciones conservadoras como se considera en la presente invención son la sustitución de cualquier aminoácido de carga positiva (Arg, His, Lys) con cualquier otro aminoácido de carga positiva; la sustitución de cualquier aminoácido de carga negativa (Asp, Glu) por cualquier otro aminoácido de carga negativa; la sustitución de cualquier aminoácido sin carga polar (Ser, Thr, Asn, Gln) por cualquier otro aminoácido sin carga polar; o la sustitución de cualquier aminoácido hidrofóbico (Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val) con cualquier otro aminoácido hidrofóbico.

[0063] Por tanto, en algunas formas de realización, la variante activa puede comprender la sustitución Arg/His/Lys; sustitución de Asp/Glu; sustitución Ser/Thr/Asn/Gln; sustitución Ala/Ile/Leu/Met/Phe/Trp/TyrNal; o cualquier combinación de los anteriores. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0064] En algunas formas de realización, el péptido puede seleccionarse de las secuencias de aminoácidos DPR y las establecidas en SEQ ID NO: 1 a 17, en las que al menos una prolina está sustituida con un aminoácido de carga positiva. En otras formas de realización, el péptido se selecciona de DPR y SEQ ID NO: 1 a 17, en el que al menos una prolina está sustituida con lisina. Sin estar ligado a ninguna teoría del mecanismo, el péptido se sustituye con el fin de obtener una especificidad mejorada para la trombina y potencialmente otros factores de coagulación, una penetración mejorada en el cerebro y una vida media prolongada del conjugado.

[0065] Las posiciones residuales, que no son idénticas, también pueden estar compuestas por análogos peptídicos, incluidos aminoácidos no naturales o derivados de los mismos. Los análogos difieren típicamente de los péptidos naturales en una, dos o unas pocas posiciones, a menudo en virtud de sustituciones conservadoras.

[0066] Algunos análogos también pueden incluir aminoácidos no naturales o modificaciones de aminoácidos N o C terminales en una, dos o unas pocas posiciones. Ejemplos de aminoácidos no naturales, sin limitarse a son D-aminoácidos, alfa, alfa-aminoácidos disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico, 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-tri metillisina, épsilon-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, omega-N-metilarginina y ácido isoaspártico.

[0067] Los términos "resto protector" y "PRO" son intercambiables y se refieren a cualquier resto capaz de proteger el conjugado peptídico de la presente invención de efectos adversos tales como proteolisis, degradación o aclaramiento, o aliviar dichos efectos adversos.

[0068] En algunas formas de realización, el resto protector puede ser un resto protector alfa-amino. En algunas formas de realización, el resto protector puede ser tosilo (un grupo tosilo) o derivados del mismo.

[0069] En algunas formas de realización, el resto protector de alfa-amino puede ser tosilo.

[0070] El resto protector se puede seleccionar del grupo que consiste en t-butiloxicarbonilo (BOC, (CH₃)₃COCO-, t-BOC), t-amiloxicarbonilo, adamantilo-oxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC), 2-clorobenciloxicarbonilo y similares, nitro, tosilo (CH₃C6H4SO₂-), benciloxicarbonilo (CBZ), adamantiloxicarbonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo, 2,3,6-trimetil-4-metoxifenilsulfonilo, t-butilbencilo (BZL) o BZL sustituido, tal como pmetoxibencilo, p-nitrobencilo, p-clorobencilo, o-clorobencilo y 2,6-diclorobencilo.

[0071] PRO puede seleccionarse de t-butilo, ciclohexilo, ciclopentilo, benciloximetilo (BOM), tetrahidropiranilo, tritilo, clorobencilo, 4-bromobencilo y 2,6-diclorobencilo.

[0072] Otros grupos protectores que pueden emplearse adecuadamente son bromobenciloxicarbonilo, xantilo (Xan) y pmetoxibencilo.

[0073] En algunas formas de realización, PRO puede ser tosilo.

[0074] Los términos "resto que inhabilita proteasas" y "DIS" tal como se usan en este documento son intercambiables y se refieren a cualquier resto capaz de unirse a una proteasa e inhabilitar transitoria o permanentemente su actividad proteolítica. En algunas formas de realización, el resto que inhabilita la proteasa puede ser un resto que inhabilita la trombina. En algunas formas de realización, el resto que inhabilita proteasas puede ser un inhibidor de trombina.

[0075] El resto desactivador de proteasas puede ser un compuesto desactivador de proteasas seleccionado entre inhibidores irreversibles e inhibidores reversibles.

[0076] El resto que desactiva la proteasa puede ser un inhibidor irreversible seleccionado del grupo que consiste en acetilo sustituido (1-x-actilo), fluoruros de sulfonilo (-SO₂F), clorometilcetonas (-COCH₂Cl), ésteres (-COOR), ácidos borónicos (-B(OR)₂) y combinaciones de los mismos.

[0077] El resto desactivador de proteasas puede ser un inhibidor reversible seleccionado del grupo que consiste en aldehídos (-CHO), arilcetonas (-CO-Arilo), trifluorometilcetonas (-COCF3), ácidos cetocarboxílicos (-COCOOH) y combinaciones de los mismos.

[0078] El resto desactivador de proteasas puede ser un compuesto desactivador de proteasas seleccionado del grupo que consiste en clorometilcetona (CK) y sus derivados, sulfonilfluoruros (-SO₂F), clorometilcetonas (-COCH₂Cl|), ésteres (-COOR), borónicos ácidos (-B(OR)₂), aldehídos (-CHO), arilcetonas (-CO-Arilo), trifluorometilcetonas (-COCF3) y ácidos cetocarboxílicos (-COCOOH).

[0079] El resto que desactiva la proteasa puede ser un acetilo sustituido. El acetilo sustituido puede ser haloacetilo. El haloacetilo puede ser cloroacetilo. En algunas formas de realización, el resto que desactiva la proteasa puede ser clorometilcetona (CK).

[0080] En algunas formas de realización, el conjugado peptídico puede ser tosil-DPR-CK. En algunas formas de realización, el conjugado de péptido puede ser tosil-LDPR-CK. En algunas formas de realización, el conjugado peptídico puede ser tosil-TLDPR-CK. En algunas formas de realización, el conjugado peptídico puede ser tosil-ATLDPR-CK. En algunas formas de realización, el conjugado peptídico puede ser tosil-NATLDPR-CK.

[0081] En algunas formas de realización, el conjugado peptídico puede ser tosil-PEP-CK, donde PEP es ácido aspárticoprolinaarginina o cualquiera de los péptidos establecidos en SEQ ID NO: 1-17, o una variante activa del mismo, donde CK puede estar unido al aminoácido C'-terminal de Arginina y tosilo puede unirse al aminoácido N'-terminal de PEP.

[0082] Se conocen en la técnica varios inhibidores de trombina, incluidos TLCK (también conocido como N alfa-tosil-L-lisina clorometilcetona o TLCK), NAPAP (también conocido como Na-(2-naftilsulfonil-glicil)-DL-p-amidinofenilalanilpiperidina), PN-1 (también conocido como Proteasa nexin-1), PN-2 (también conocido como Proteasa nexin-2, APP) y SCH79797 (también conocido como N3-Ciclopropil-7-[[4-(1-metiletil)fenil]metil]-7H-pirrolo[3,2-f]quinazolina-1,3-diamina diclorhidrato). TLCK es un inhibidor irreversible de la serina proteasa tripsina (inactiva la tripsina más rápidamente a pH 7,5) y de muchas serina proteasas similares a la tripsina. El residuo de histidina-46 ubicado en el sitio activo de la tripsina es alquilado por TLCK. NAPAP se une trombina en los bolsillos S1, S2 y S4. El grupo amidina en NAPAP forma un puente salino bidentado con Asp profundamente en el bolsillo S 1, el grupo piperidina toma el papel de residuo de prolina y se une en el bolsillo S2, y los anillos de naftilo de la molécula forma una interacción hidrofóbica con Trp en el bolsillo S4. PN-1 es un inhibidor de trombina de 43 kDa, miembro de la superfamilia de inhibidores de la serina proteasa (serpinas), que regula la acumulación de matriz y la coagulación en condiciones fisiopatológicas mediante la inhibición de la trombina, la plasmina y los activadores del plasminógeno tisular. PN-2 es un inhibidor de la proteasa, que es la forma secretada del precursor de la proteína beta amiloide (APP) que contiene un dominio inhibidor de la proteasa de Kunitz. SCH79797 es un antagonista no peptídico potente y selectivo del receptor 1 activado por proteasa (PAR-1).

[0083] Sin embargo, el supuesto efecto terapéutico de los inhibidores conocidos va acompañado de efectos adversos graves. Por ejemplo, como se detalla a continuación, el péptido muy corto TLCK indujo la inhibición de la proliferación de células de glioma a concentraciones relativamente altas (mM) pero provocó una hemorragia interna grave.

[0084] Sorprendentemente, los conjugados peptídicos de la invención, que se basan en el sitio de unión de trombina en PAR-1, proporcionan el efecto terapéutico requerido sin causar efectos secundarios mortales. Como se ejemplifica a continuación, se demostró que los conjugados peptídicos inhibían eficazmente el crecimiento del glioma y la actividad de la trombina.

[0085] En algunas formas de realización, el aminoácido N' terminal de PEP puede unirse covalentemente a PRO, directamente o a través de un enlazador, a través de su grupo amino N' o a través de su cadena lateral. En algunas formas de realización, el aminoácido C' terminal de PEP puede unirse covalentemente a DIS, directamente o a través de un enlazador, a través de su grupo carboxilo C' o a través de su cadena lateral.

[0086] En algunas formas de realización, PRO puede unirse a PEP a través de un enlazador.

[0087] El término "enlazador" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier molécula unida tanto a PRO como a PEP y/o tanto a PEP como a DIS. En su forma más simple, un enlazador puede ser un enlace covalente. Los enlazadores más elaborados pueden ser fracciones de aminoácidos, fracciones de péptidos, fracciones de nucleótidos, fracciones de oligonucleótidos, etc. puede ser un resto de polietilenglicol (PEG), protegiendo aún más a los conjugados peptídicos que los portan de la degradación. Por lo tanto, en algunas formas de realización, dicho conector puede seleccionarse del grupo que consiste en un conector peptídico y un conector oligonucleotídico. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0088]

[0089] En algunas formas de realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el conjugado peptídico descrito anteriormente, como un ingrediente farmacéuticamente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización, la composición farmacéutica puede comprender además sal de tricloroacetato (TCA).

[0090] El término "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar conocidos en el campo, tales como soluciones estériles, tabletas, tabletas recubiertas y cápsulas. Típicamente, dichos vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácidos esteáricos o sales de los mismos, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos vehículos también pueden incluir aditivos de sabor y color u otros ingredientes.

[0091] Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, los siguientes: agua, solución salina, tampones, sólidos inertes no tóxicos (p. ej., manitol, talco).

[0092] Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos. Dependiendo del modo de administración previsto y el uso previsto, las composiciones pueden estar en forma de formas de dosificación sólidas, semisólidas o líquidas, tales como, por ejemplo, polvos, gránulos, cristales, líquidos, suspensiones, liposomas, nano -partículas, nanoemulsiones, pastas, cremas, ungüentos, etc., y pueden presentarse en formas monodosis adecuadas para la administración de dosificaciones relativamente precisas.

[0093] La composición farmacéutica de la invención se puede formular para administración oral, nasal, en aerosol, por inhalación, abdominal, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0094] La composición farmacéutica de la invención puede ser para administración intravenosa.

[0095] En algunas formas de realización, se proporciona el uso de un conjugado de péptido como se describe anteriormente, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una actividad de proteasa excesiva.

[0096] En algunas formas de realización, el uso del conjugado peptídico puede incluir además el uso de un segundo agente terapéutico. En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico puede ser un antagonista de PAR-1.

[0097] Como se usa en el presente documento, el término "actividad de proteasa excesiva" se refiere a una actividad que es al menos el doble de la actividad normal de la proteasa. En algunas formas de realización, la actividad de proteasa excesiva se refiere a una actividad que es al menos tres veces mayor que la actividad normal de la proteasa. Por ejemplo, el exceso típico de actividad de proteasa en accidentes cerebrovasculares, diabetes, ELA, EAE, traumatismos y gliomas es de dos a tres veces mayor que la actividad de proteasa en sujetos de control. En otro ejemplo, el exceso de actividad en el accidente cerebrovascular es hasta 100 veces mayor que la actividad de la proteasa en los sujetos de control.

[0098] El término "enfermedad o trastorno asociado con actividad de proteasa excesiva" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que se sabe que está causado y/o se manifiesta por una actividad de proteasa superior a la normal, determinada por métodos estándar bien conocidos en la técnica.

[0099] Se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad excesiva del receptor de proteasa que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición farmacéutica que comprende un conjugado peptídico según la presente invención y un vehículo,

[0100] En algunas formas de realización, dicha enfermedad o trastorno puede seleccionarse del grupo que consiste en neuroinflamación, enfermedades o trastornos neuroinflamatorios, enfermedad o trastorno neurodegenerativo, neuropatía y neuropatía relacionada con la diabetes. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0101] La neuropatía diabética periférica (DPN), una de las formas más prevalentes de neuropatía relacionada con la diabetes, se manifiesta principalmente como pérdida sensorial y debilidad de las extremidades inferiores y, en última instancia, representa una morbilidad significativa que contribuye a la amputación. En el SNP, la enfermedad inflamatoria prototípica que afecta a las células nerviosas es el síndrome de Guillain-Barré (GBS). GBS es un grupo de neuropatías inflamatorias agudas y su modelo animal es la neuritis autoinmune experimental (EAN). La polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda (AIDP) es la forma más común de GBS y se caracteriza por la desmielinización de los axones periféricos y la degeneración axonal en casos graves. El mecanismo que conduce al GBS aún se está dilucidando y la mayoría de las pruebas apuntan a un ataque inmunitario en el nódulo de Ranivier, incluidos los componentes gliales. La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) también afecta los nervios periféricos al causar una degeneración selectiva de los nervios motores inferiores junto con la degeneración de las neuronas motoras superiores en el cerebro. Se desconoce la causa de esta enfermedad y el tratamiento se limita al uso de riluzol, un antagonista del receptor de glutamato, que es solo parcialmente efectivo y los pacientes con esta enfermedad morirán dentro de los 2 años posteriores al diagnóstico.

[0102] En algunas formas de realización, dichas enfermedades o trastornos pueden seleccionarse del grupo que consiste en: glioma, astrocitomas, glioblastoma, oligodendroglioma, ependimoma, gliomas mixtos, glioblastoma multiforme, neuropatía, neuropatía periférica diabética, síndrome de Guillain-Barré, esclerosis lateral amiotrófica, desmielinizante inflamatorio agudo polineuropatía, encefalomielitis diseminada aguda, neuritis óptica, mielitis transversa, neuromielitis óptica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, esclerosis múltiple y enfermedad de Parkinson. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0103] El tratamiento puede incluir cualquiera o más de inhibir la progresión de dicha enfermedad o trastorno, atenuar la progresión de dicha enfermedad o trastorno o prevenir el deterioro de dicha enfermedad o trastorno.

[0104] En algunas formas de realización, se proporciona el uso de un conjugado peptídico descrito anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una actividad excesiva del receptor de proteasa. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.

[0105] Se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad excesiva del receptor de proteasa en un paciente que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica descrita anteriormente a dicho paciente, tratando así dicha enfermedad o trastorno.

[0106] El método de tratamiento de la enfermedad o trastorno puede incluir además la administración de un segundo agente terapéutico. En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico puede ser un antagonista de PAR-1.

[0107] Se proporciona un kit que comprende un conjugado peptídico para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una actividad excesiva del receptor de proteasa, en el que el conjugado peptídico puede ser como se establece en la fórmula I:

(I) PRO-PEP-DIS

en la que PRO es un fracción protectora; PEP es un resto peptídico que comprende ácido aspártico-prolina-arginina, o una variante activa del mismo; y DIS es un resto que inhabilita la proteasa, y en el que PRO se une al aminoácido terminal N' de PEP directamente o a través de un enlazador, y en el que DIS se une al aminoácido terminal C' de PEP directamente o a través de un enlazador.

[0108] El kit puede incluir además instrucciones para el uso de la composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad o trastorno. En algunas formas de realización, las instrucciones pueden recitar además una dirección de sitio web que proporciona más información y resolución de problemas, entre otros servicios. En algunas formas de realización, las instrucciones pueden estar en papel, como un prospecto o una etiqueta.

[0109] Los métodos de la invención están dirigidos a prevenir la actividad excesiva del receptor de proteasa, incluida la prevención del inicio de la actividad excesiva del receptor de proteasa. La determinación de la dosis del conjugado peptídico necesaria para prevenir la actividad del receptor de proteasa se puede realizar evaluando la reducción de los niveles de PAR-1 tras la administración del conjugado peptídico de la invención. La reducción en la actividad excesiva del receptor de proteasa se refiere a una disminución o una ausencia de actividad del receptor en relación con los niveles de actividad antes de la administración o en relación con un valor de control. Actividad reducida de PAR-1, incluye una reducción de la actividad de al menos un 10 % (p. ej., 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %), en comparación con el nivel de actividad justo antes de la administración. Por lo tanto, el nivel de actividad obtenido de una muestra de un paciente que lo necesite puede compararse con el nivel de actividad de PAR-1 en una muestra obtenida de dicho paciente en puntos de tiempo anteriores (p. ej., antes de la administración del conjugado peptídico o durante la aparición de una enfermedad o trastorno neuropático). Es además opcional medir la actividad de PAR-1 en un individuo antes de la aparición de una enfermedad o trastorno (p. ej., durante un chequeo regular), para determinar la línea de base del individuo.

[0110] La actividad de PAR-1 en un paciente que lo necesite puede compararse con un estándar o control obtenido de individuos normales. En un ejemplo, la actividad de PAR-1 puede evaluarse en una población de individuos sanos o individuos que no han tenido una enfermedad o trastorno neuropático. Tal actividad se denomina "control negativo". Por el contrario, PAR-1 también se puede obtener de un grupo de individuos que están experimentando una neuroinflamación, enfermedades o trastornos neuroinflamatorios, enfermedades o trastornos neurodegenerativos, neuropatía o neuropatía relacionada con la diabetes, para obtener un "control positivo". Por tanto, en algunas formas de realización, tras la administración del conjugado peptídico de la invención, el nivel de actividad de PAR-1 puede disminuir; los niveles pueden acercarse al nivel del control negativo y alejarse del control positivo. Alternativamente, los niveles de actividad de PAR-1 disminuyen en comparación con los niveles durante el inicio de la enfermedad o trastorno antes mencionado.

[0111] Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "incluyendo", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a". Este término abarca los términos "que consiste en" y "que consiste esencialmente en". Como se usa aquí, la forma singular "un", "una", "el" y "ella" incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluidas sus mezclas.

[0112] Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más completamente algunas formas de realización de la invención. Sin embargo, de ninguna manera deben interpretarse como limitantes del amplio alcance de la invención. Un experto en la técnica puede idear fácilmente muchas variaciones y modificaciones de los principios descritos en este documento sin apartarse del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Actividad sim ilar a la trom bina en nervios ciáticos de ratas diabéticas

[0113] La actividad similar a la trombina se midió en nervios ciáticos derivados de modelos animales del síndrome de GuiNain-Barré (denominado EAN, por neuritis autoinmune experimental; Fig. 1A) y diabetes (diabetes inducida por estreptozotocina (STZ); Fig. 1B).

[0114] Como se presenta en la Figura 1, la actividad similar a la trombina soluble generada y liberada por los nervios ciáticos de ratas EAN o diabéticas (STZ), en el medio circundante, se comparó con la actividad similar a la trombina en ratas de control sanas (n = 12) y en ratas CFA (adyuvante completo de Freund). El último grupo de control se refiere a ratas tratadas con un inóculo que contiene el mycobacterium tuberculosis emulsionado en solución salina y CFA solamente. Los resultados indican que las actividades similares a la trombina se elevaron significativamente en las tasas de EAN 10 días después de la inducción (los datos se presentan como una actividad similar a la trombina media U/ml ± SEM, **= p<0,01; *= p<0,005).

[0115] Los resultados indican además que las actividades similares a la trombina estaban significativamente elevadas en ratas diabéticas (Figura 1B, **=p=0,00071).

[0116] La velocidad de conducción de los nervios ciáticos derivados de un modelo animal de diabetes (diabetes inducida por estreptozotocina (STZ); Fig. 20) se midió en ratones tratados diariamente con tratamiento simulado (STZ) o con el fármaco activo TLDPR (péptido 5AA; SEQ ID NO: 2) anidado entre N alfa-tosil y clorometilcetona, concretamente TTN-ATLDPR-CK (denominado en adelante T5AACK) inyectado en 100 microlitros de 10 nM, 100 nM y 1 micromolar.

[0117] Las velocidades de conducción en los nervios ciáticos de los ratones se evaluaron mediante métodos de conducción nerviosa de electrofisiología estándar por un evaluador ciego. Los estudios de conducción nerviosa se realizaron un mes después de la inducción de la diabetes. Un grupo de ratones normales sin diabetes sirvió como control. Todos los ratones tratados con STZ desarrollaron diabetes grave.

[0118] La comparación de ratones tratados con simulación y tratados con T5AACK 1 micromolar fue altamente significativa, dando como resultado una p = 0,00046 (prueba T) y el efecto de la dosis de 10 nM siguió una tendencia similar, dando como resultado una p = 0,016 (Fig. 20).

[0119] Por lo tanto, la actividad similar a la trombina elevada en ratas y ratones diabéticos representa un objetivo potencial para la intervención de los nuevos conjugados de la presente invención.

Ejemplo 2. Nivel de expresión de PAR-1 en nervios ciáticos de ratas diabéticas

[0120] El nivel de expresión de PAR-1 se midió en nervios ciáticos desenvainados de ratas diabéticas inducidas con STZ y ratas no diabéticas de control (Fig. 2A-2B).

[0121] Análisis de transferencia Western del nivel de PAR-1 de los nervios ciáticos de dos ratas inducidas con STZ, en comparación con dos controles sanos indica una disminución significativa en el nivel de PAR-1 en los nervios ciáticos de ratas inducidas por STZ (n = 3; p = 0,012) en comparación con las ratas de control no diabéticas (Fig. 2B; datos presentados como un múltiplo medio de ± SEM, * = p<0,05).

[0122] Según la Figura 2 y otros datos (no divulgados), se encuentran niveles significativamente bajos de PAR-1 en los modelos animales del Síndrome de Guillain-Barré (EAN) y diabetes (ratas diabéticas inducidas por ^sT^z). Sin estar ligado a ninguna teoría o mecanismo, tales hallazgos pueden indicar un mecanismo de protección intrínseco empleado por los nervios para evitar la sobreactivación de PAR-1 por las actividades elevadas similares a la trombina (como se presenta en la Figura 1B). Por lo tanto, la sensibilidad a PAR-1 puede reforzar la necesidad de interferir con la vía de PAR-1 y proteger al receptor de una sobreactivación.

Ejemplo 3. Nivel de expresión de PN-1 en nervios ciáticos de ratas diabéticas

[0123] El nivel de expresión de PN-1 (inhibidor de trombina, 143 kDa) se midió en nervios ciáticos desvainados de ratas diabéticas inducidas con STZ y ratas no diabéticas de control, mediante análisis de transferencia Western (Figs. 3A-3B).

[0124] El resultado muestra un aumento significativo en el nivel de PN-1 en los nervios ciáticos de ratas inducidas con STZ (p = 0,003) en comparación con las ratas control no diabéticas (Fig. 3B; datos presentados como una media veces ± SEM, **= p< 0,01).

[0125] Sin estar ligado a ninguna teoría o mecanismo, el aumento de los niveles de inhibidores de la trombina, como PN-1, en ratas diabéticas inducidas por STZ es potencialmente un mecanismo de protección intrínseco empleado por los nervios para evitar la sobreactivación de PAR-1 por las actividades similares a la trombina elevadas presentadas en la Figura 1. Además, los niveles aumentados de inhibidor de trombina en ratas diabéticas pueden indicar la necesidad de regular las proteasas activadoras de PAR-1.

Ejemplo 4. Efecto terapéutico de inhibidores de trom bina sobre parámetros electrofisiológicos in vivo

[0126] Las pruebas electrofisiológicas de los nervios ciáticos se realizaron el día 32 PI (postinmunización/inducción) en el modelo eAn (Figs. 3A-C) y 8 semanas después de la inducción STZ (Fig. 4A-C). Las ratas se anestesiaron con fenobarbital (IP, 24 mg/kg). Se utilizaron dos pares de electrodos de aguja monopolar para estimular los nervios de la cola. Se insertaron cátodos estimulantes a una profundidad de 4-5 mm en la base de la cola y 4 cm distalmente. Se insertó un ánodo en cada ubicación en la piel (4-5 mm de profundidad) 1 cm proximal al cátodo. Se colocó un electrodo de tierra entre el electrodo de estimulación distal y el electrodo de registro activo. Se recolectaron registros de electromiografía (EMG) de las respuestas de los músculos de la cola a estímulos proximales y distales, realizados por un par de electrodos anulares recubiertos con gelatina de electrodos y colocados 1 cm distalmente al electrodo estimulador distal. La piel de la cola se limpió con alcohol antes de colocar los electrodos. La salida de EMG se mostró en un aparato Keypoint de grabación completamente digital (Dantec, Skovlunde, Dinamarca). Tanto las latencias proximales como las distales se midieron utilizando intervalos de tiempo desde el artefacto del estímulo hasta la primera desviación desde la línea de base. Para calcular la velocidad de conducción nerviosa motora (MNCV), la distancia entre los cátodos estimulantes se dividió por la diferencia de latencia. Las amplitudes del potencial de acción muscular compuesto (CMAP) de las estimulaciones proximal y distal se midieron desde los picos negativos a los positivos. La reducción del CMAP proximal en comparación con el CMAP distal se calculó mediante la ecuación: [(CMAP distal-CMAP proximal)/CMAP distal x 100] y se definió como el relación R. Las diferencias de temperatura se minimizaron realizando el estudio tan pronto como la anestesia hizo efecto y calentando la cola con una lámpara de calefacción.

[0127] Los datos se recolectaron de ratas EAN (Fig. 3) y ratas STZ (Fig. 4) tratadas diariamente con los siguientes inhibidores de trombina: (i) N alfa-tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK) y (ii) Na-(2-naftil-sulfonil-glicil)-DL-pamidinofenilalanil-piperidina (NAPAP), durante 2 semanas.

[0128] Las Figuras 3 y 4 incluyen cada una 3 gráficos que resumen los resultados de las pruebas electrofisiológicas de las ratas tratadas, como sigue: latencia distal (3A, 4A) que se refiere al tiempo, en milisegundos, entre la estimulación distal y el registro; velocidad de conducción (3B, 4B) referida a la distancia en el tiempo, en metros/segundos; y amplitud (3C, 4C) en referencia al tamaño de la respuesta medida en milivoltios.

[0129] Las ratas EAN y STZ que no fueron tratadas con TLCK o NAPAP (Fig. 3B, barra 'EAN' y Fig. 4B, barra 'STZ') exhibieron una velocidad de conducción significativamente reducida en relación con el control (Figs. 3B y 4B, barras negras; *= p<0.05, **= p<0.01, ***= p<0.001). La velocidad de conducción en ratas tratadas con TLCK fue significativamente alta en comparación con los grupos de control EAN y STZ tratados con solución salina (*= p<0,05, **= p<0,01, ***= p<0,001; STZ+TLCK: 41,95 ± 3,9 m/seg n=8 y STZ: 28,5 ± 2,8 m/seg n=4, p=0,001 Fig. 3B, EAN+TLCK: 40,55 ± 6,7 m/seg n=6 EAN: 23,6 ± 1,2 m/seg n=5, p=0,05). El grupo de tratamiento con NAPAP mostró alguna mejora en las velocidades de conducción en comparación con el grupo de control no afectado (EAN+NAPAP: 36,05 ± 3,57 m/seg, n=5 y EAN: 23,6 ± 1,2 m/seg, n=5, p=0,003, Figura 3B;STZ+NAPAP: 40,1 ± 2,7 m/seg n=5 y STZ: 28,5 ± 2,8 m/seg n=5, p=0,01, Figura 4B). El tratamiento con TLCK aumentó la amplitud proximal (EAN 0,76 ± 0,33, EAN+NAPAP 0,83 ± 0,4, EAN+TLCK 1,36 ± 0,49), de forma no significativa (Fig. 3B). El efecto beneficioso sobre la amplitud proximal observado en el modelo STZ (Fig. 4C) también fue insignificante: St Z+TLCK 1,81 ± 0,8 (n=8), STZ+NAPAP 1,68 ± 0,64 (n=5) en comparación con STZ: 0,48 ± 0,13 (n=5).

[0130] También se midió la latencia, el tiempo entre la inducción y la conducción nerviosa. Los resultados indican que en el grupo STZ la latencia aumentada fue de 1,93 ± 0,139 mseg (n=5) en comparación con el control (1,29 ± 0,057 mseg, n=4). Los tratamientos NAPAP y TLCK causaron latencias disminuidas de 1,676 ±0,132 mseg (n=5, p=0,11) y 1,44 ± 0,04 mseg (n=5, p=0,0019), respectivamente. En el grupo EAN se detectó una mayor latencia (1,43 ± 0,023 mseg, n=5) en comparación con el control (0,54 ± 0,03 mseg, n=3). Los tratamientos NAPAP y TLCK no causaron latencias disminuidas (1,32 ± 0,33 mseg, n=5, p=0,39, 1,28 ± 0,18 mseg, n=5, p=0,27, respectivamente).

[0131] Los resultados indican que el tratamiento con inhibidores de trombina mejora la conducción nerviosa en un modelo animal de diabetes. Sin embargo, este resultado se acompañó de hemorragia interna.

Ejemplo 5. Nivel de expresión de PAR-1 ex-vivo en homogeneizados de cerebro de un modelo animal para ELA (ratones SOD-1)

[0132] El nivel de expresión de PAR-1 se midió en homogeneizados de cerebro derivados de SOD-1 y ratones de control de tipo salvaje.

[0133] La Figura 5 muestra un Western blot (A) y el análisis correspondiente, realizado con el software ImageJ, de varios experimentos independientes (B), de los niveles de expresión de PAR-1 en homogeneizados de cerebro de cuatro ratones SOD-1, en comparación con cinco controles sanos. Los resultados demuestran una disminución significativa (disminución de 2,8 veces) en la expresión de PAR-1 en ratones SOD-1 en comparación con los controles de tipo salvaje (p<0,001). Los resultados pueden indicar que la interferencia con la ruta de ^pAR-1 y la protección de PAR -1 de la sobreactivación sería beneficioso en el tratamiento de enfermedades y trastornos neuropáticos.

Ejemplo 6. Experimento de supervivencia de ratones ALS (SOD-1) tratados con inhibidores generales de trombina

[0134] Los ratones ALS (SOD-1) se dividieron aleatoriamente en tres grupos y no recibieron tratamiento (diamante), se trataron con un inhibidor de trombina relativamente general, N alfa-tosil-L-lisina clorometilcetona (4,4 mg/kg TLCK; círculo ), o tratados con un antagonista de PAR-1 (25 μg/kg SCH79797; triángulos).

[0135] Los resultados indican que la supervivencia sin tratamiento no duró más de 145 días. Sin embargo, el tratamiento con un antagonista de PAR-1 o con un inhibidor de trombina mejoró la supervivencia en al menos 15 días (Figura 6). Dado que PAR-1 disminuye a medida que avanza la enfermedad, parece más razonable utilizar un inhibidor de trombina basado en PAR-1 específico en etapas avanzadas de la enfermedad que utilizar un antagonista de PAR-1.

Ejemplo 7. Actividad sim ilar a la trom bina en líneas celulares de glioma

[0136] La actividad similar a la trombina se midió en líneas celulares de glioma C6 y CNS-1 y su medio circundante (Figuras 7A y 7B, respectivamente), cuatro horas después de que las células fueran tratadas con el inhibidor de trombina altamente selectivo Na-(2-naftilsulfonil-glicil)-DL-p-amidinofenilalanil-piperidina, NAPAP (Figs. 7A-7B, barras grises). Los resultados se demuestran en relación con las células de control, no tratadas (Figs. 7A-7B, barras negras).

[0137] Es evidente a partir de la Figura 7 que (a) la actividad similar a la trombina estaba restringida a las propias células, sin actividad aparente en el medio circundante, y (b) la actividad similar a la trombina fue inhibida por NAPAP en ambas líneas celulares. Dado que se sabe que la trombina aumenta la proliferación de células de glioma, la generación endógena de actividad similar a la trombina de las líneas celulares de glioma indica el efecto beneficioso potencial del inhibidor específico de trombina como reguladores de la proliferación en gliomas como el glioblastoma multiforme (GBM).

Ejemplo 8. Proliferación-inhibición de líneas celulares de glioma por un antagonista de PAR-1

[0138] Se sintetizaron varios restos peptídicos (Tabla 1) según la presente invención. Se midió la proliferación, por medio de XTT, en líneas celulares de glioma C6 y CNS-1 (Figuras 8A y 8B, respectivamente). En las células C6, la proliferación se midió antes (barra negra) y después de que las células se trataran con el antagonista de PAR-1 SCH79797 a varias dosis que oscilaban entre 10 nM y 10 μM (barras grises; Fig. 8A). En las células CNS-1, la proliferación se midió antes (barra negra) y después de tratar las células con el antagonista de PAR-1 SCH79797 (1 μM), el inhibidor de trombina NAPAP, el inhibidor de trombina TLCK o combinaciones de los mismos (barras grises; Fig..8B).

[0139] Es evidente a partir de la Figura 8A que el antagonista de PAR-1 inhibió la proliferación de una manera dependiente de la dosis en células C6. Además, según los resultados presentados en la Figura 8B, NAPAP (1 μM) o TLCK (1 μM) no inhibieron la proliferación de células CNS-1 cuando se administraron solos. Sin embargo, la combinación de NAPAP o TLCK con un antagonista de PAR-1 parece mejorar el efecto inhibidor del antagonista de PAR-1.

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de restos peptídicos.

[0140] Los restos peptídicos se derivaron del extremo C'-terminal de PAR-1. Una comparación entre la secuencia de aminoácidos (AA) aguas arriba y aguas abajo del sitio de escisión de la trombina en seres humanos, ratones, ratas y bovinos indica que estas secuencias se conservan en general (Tabla 2). La posición de los aminoácidos correspondientes al sitio de corte de la trombina se indica para cada secuencia en la segunda columna de la Tabla 2 y la longitud del péptido diseñado se indica en la tercera columna de esta Tabla. Las posiciones 35-47 representan parte del N-terminal de PAR-1, también denominado P1-P7, que designa la posición aguas arriba del sitio de escisión.

Tabla 2. Secuencia de aminoácidos de PAR-1 aguas arriba y aguas abajo del sitio de escisión de la trombina en seres humanos, ratones, ratas y bovinos.

[0141] Además, el antagonista de PAR-1 (1 j M) solo provocó una inhibición significativa de la proliferación del 25% en células CNS-1, en el que un tratamiento combinado del antagonista de PAR-1 con NAPAP o TLCK aumentó significativamente dicho efecto inhibidor. La disminución de la proliferación de células de glioma en respuesta a la modulación de la vía PAR-1 es un descubrimiento importante, que sugiere el potencial de los compuestos basados en PAR-1 como inhibidores de la trombina para tratar la neuropatía y el glioma, como GBM.

[0142] En otro conjunto de experimentos, la línea celular de glioma CNS-1 se trató con dosis aumentadas de TLCK (125 nM a 14 mM), durante 48 horas (Fig. 9; barras grises). La proliferación se midió por medio de XTT en comparación con las células no tratadas (control; barra negra). Altas concentraciones de TLCK (6,7 mM, 14 mM) provocaron la muerte celular, y en el intervalo micromolar (8-33 j M) se produjo una inhibición significativa de la proliferación. No se observó una inhibición significativa de la proliferación entre 1 j M y 125 nM

[0143] Por lo tanto, es evidente que el inhibidor de trombina altamente eficaz TLCK disminuyó la proliferación de células de glioma a concentraciones relativamente altas (es decir, superiores a 1 j M), con la desventaja de un mayor riesgo de hemorragia. Los nuevos conjugados basados en PAR-1 proporcionados por la presente invención proporcionan la actividad requerida a concentraciones significativamente más bajas y carecen de efectos secundarios dañinos, como se demuestra en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 9. Inhibición de la proliferación celular

[0144] Inicialmente, las células de glioma del SNC-1 se trataron con concentraciones aumentadas de dos conjugados peptídicos: un conjugado corto de fórmula tosyl-DPR-CK (que consta de 3 aminoácidos, 3AA) o un conjugado largo de fórmula tosil-NATLDPR-CK (que consta de 7 amino ácidos, 7AA, SEQ ID NO: 4) en concentraciones de 100 μM, 1 nM y 10 nM, durante 48 horas (Fig. 10). La figura 10 proporciona los resultados de un ensayo XTT utilizado para evaluar la proliferación celular. Los resultados indican que el conjugado corto (3AA) provocó una inhibición significativa de la proliferación celular a 1 nM y una mayor inhibición a 10 nM, mientras que el conjugado largo (7AA) provocó una inhibición significativa a 10 nM, en relación con el control no tratado (Fig. 10).

[0145] Se trataron células de glioma CNS-1 con concentraciones aumentadas de los conjugados peptídicos que contenían el péptido DPR o los péptidos de SEQ ID NO: 2-4 durante 48 horas y durante 72 horas (Figs. 11 y 12, respectivamente). Como se ve en la Figura 11, se observó una tendencia a la proliferación reducida en las muestras tratadas con los conjugados peptídicos en comparación con los controles a las 48 horas. Se observó una inhibición significativa, en relación con los controles no tratados, para el conjugado peptídico 10 ^jM que abarcaba los péptidos 6AA y 7AA (p<0,05). En el experimento de 72 horas (Fig. 12), se encontró una proliferación significativamente menor para todas las concentraciones del péptido conjugado que contenía el péptido 6AA en comparación con los controles (p<0,05). Esta observación fue más significativa a concentraciones de 1 y 10 micromolar (p=0,002 y 0,003, respectivamente). Se observó un efecto inhibitorio similar bajo el tratamiento con el conjugado peptídico que incluye el péptido 3AA, en todas las concentraciones probadas, en comparación con los controles (p<0,05). Los resultados indican que la inhibición de la proliferación celular mostrada por los conjugados peptídicos es significativamente mayor que la proliferación celular de las células de control, es decir, las células no incubadas con ninguno de los conjugados peptídicos. Además, el efecto inhibidor ejercido por el conjugado peptídico fue destacado incluso en concentraciones tan bajas como el rango de micromolares y nanomolares.

Ejemplo 10. Inhibición de la proliferación relativa a la actividad inhibidora de PAR-1

[0146] El efecto del conjugado peptídico solo, o en combinación con el antagonista de PAR-1, SCH79797, sobre la proliferación celular se determinó en comparación con las células no tratadas o las células tratadas con el antagonista de PAR-1 (Fig. 13). Los resultados indican que el conjugado de péptido, como se ejemplifica mediante un conjugado que comprende el péptido establecido en SEQ ID NO: 4, induce una mayor inhibición de la proliferación celular cuando se aplica solo o en combinación con el antagonista de PAR-1, en comparación con el control (células no tratadas) e incluso en comparación con el antagonista de PAR-1 solo.

Ejemplo 11. Actividad antitrombina ex vivo

[0147] La actividad de altas concentraciones (0,05U/ml) de trombina (Figs. 14-14B; diamante) se midió después del tratamiento con un amplio rango de dosis del conjugado corto (Figura 14A, tosil-DPR-CK, 3AA) o el conjugado largo (Figura 14B, tosil-NATLDPR-CK, 7AA). Las medidas se llevaron a cabo en un ensayo no celular de inhibición de trombina, que incluía un tampón, trombina y un sustrato de trombina específico cuya escisión indica actividad o inhibición de trombina. Las concentraciones de conjugados aplicadas fueron las siguientes: control (sin tratamiento - 0 nM; diamante completo), 1 mM (línea vertical), 50 ^jM (círculo), 10 ^jM (cruz), 1,25 ^jM (cuadrado) y 156 nM (triángulo).

[0148] Los datos presentados en las Figuras 14A-14B demuestran que ambos conjugados peptídicos tienen la capacidad de ejercer una inhibición completa de la actividad de la trombina en una amplia gama de concentraciones, que van desde un máximo de 1 mM hasta un mínimo de 156 nM.

[0149] La Figura 15 presenta la actividad de la trombina en presencia de conjugados peptídicos que contienen el péptido DPR (también denominado 3AA; Fig. 15: símbolos x en la línea gris) o los péptidos establecidos en SEQ ID NO: 1-4 (también denominados 4AA-7AA, respectivamente Fig. 15: 4AA - símbolos x en línea oscura, 5AA - triángulos, 6AA -cuadrados, 7AA - rombos) determinados en un sistema no celular como se describe anteriormente. La CI50 correspondiente de los conjugados peptídicos se enumeran en la Tabla 3 a continuación. Estos resultados demuestran la eficacia de los conjugados peptídicos en la inhibición de la trombina sérica bovina.

Tabla 3. CI50 de los conjugados peptídicos

Ejemplo 12. Actividad antitrombina en células CNS-1

[0150] La actividad similar a la trombina de las células CNS-1 se midió inicialmente en células de control y en células tratadas con (i) el conjugado de péptido corto (tosil-DPR-CK, correspondiente a un conjugado que incluye el péptido denominado 3AA) o (ii) el conjugado largo (tosil-NATLDPR-CK, correspondiente a un conjugado que incluye el péptido denominado 7AA (SEQ ID No. 4)) a concentraciones altas (10 mM) y bajas (100 nM) (Fig. 16).

[0151] En todo el rango de concentraciones, los conjugados de péptidos indujeron una inhibición significativa de la actividad similar a la trombina generada por las células de glioma SNC-1.

[0152] La Figura 17 presenta la actividad de trombina en presencia de conjugados peptídicos que contienen el péptido DPR (también denominado 3AA; Fig. 17: asterisco) o los péptidos establecidos en SEQ ID NO: 1-4 (también denominados 4AA-7AA, respectivamente; Fig. 17: 4AA-x, 5AA-triángulo, 6AA-cuadrado, 7AA-rombo) determinado en células de glioma de rata como se describe anteriormente. La CI50 correspondiente de los conjugados peptídicos se enumeran en la Tabla 4 a continuación:

Tabla 4. CI50 de los conjugados peptídicos en células de glioma de rata

Ejemplo 13. Concentraciones plasmáticas de los conjugados in v ivo

[0153] Las concentraciones de los conjugados peptídicos en el plasma de los animales tratados con ellos se evaluaron mediante el método único que se basaba en la capacidad de los conjugados peptídicos para inhibir la actividad de la trombina. Se obtuvieron datos para péptidos conjugados que comprenden el péptido DPR y los péptidos expuestos en SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; y S^eQ ID NO: 4 (Figuras 18A-18D, respectivamente). El ensayo se inició obteniendo muestras de sangre de animales que recibieron los conjugados peptídicos (100 microlitros que contenían 2 micromolar, i.p.). Las muestras de sangre, después de mantenerse en tubos de muestra tamponados con citrato, se sometieron a centrifugación para la separación del plasma. A continuación, las muestras se filtraron a través de una membrana con un límite de peso molecular de 10 kD que excluía todos los factores de coagulación de la sangre (mediante la adición de calcio para neutralizar el efecto anticoagulante del tampón de citrato). A continuación, se aplicaron muestras de plasma sin factor de coagulación al ensayo de actividad de trombina.

[0154] Las actividades de trombina resultantes en cada muestra de plasma ya sea diluida (x10) o tal cual se dieron en unidades arbitrarias (Figs. 18-18D, sombreado diagonal y barras punteadas, respectivamente). Sin embargo, la concentración real se dedujo comparando las actividades con actividades calibradas generadas con concentraciones conocidas de los péptidos conjugados. Los datos de calibración incluían las siguientes actividades de trombina: actividad en una muestra de trombina en ausencia de plasma y conjugados (barras negras, Figs. 18A-18D); y actividad en cuatro muestras de trombina y concentraciones conocidas de los conjugados peptídicos (10 nM, 100 nM, 1 micromolar y 10 micromolar; barras 2 a 5 desde la derecha en las Figs. 18A-18D). La comparación con los datos de calibración indica que una inyección ip de 100 μl que contenía 2 micromolar de cada conjugado peptídico resultó en una concentración sérica de aproximadamente 1 μM para el conjugado peptídico que contenía el péptido 3AA, menos de 10 nM para los conjugados peptídicos que contenían el péptidos 5AA y 6AA, y aproximadamente 10 nM para los conjugados peptídicos que contienen el péptido 7AA. Los resultados también sugieren que el ensayo utilizado aquí es adecuado para medir los niveles del conjugado peptídico y para identificar diferencias significativas en su distribución y estabilidad in vivo.

Ejemplo 14. El efecto de los conjugados peptídicos sobre la coagulación sanguínea

[0155] Las Tablas 5-9 a continuación representan el efecto de los conjugados peptídicos que comprenden el péptido DPR y los péptidos establecidos en SEQ ID NO: 1-4 en las siguientes pruebas estándar de coagulación sanguínea: Tiempo de protrombina (PT, Tabla 5), tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT, Tabla 6), tiempo de trombina (TT, Tabla 7), actividad del Factor Xa (Fxa; Tabla 8) y actividad de la Proteína C (Tabla 9) utilizando pruebas de laboratorio de hematología estándar. Para cada prueba, se puntuó del conjugado peptídico más potente al menos potente de (1) a (5). En las pruebas de PT y PTT sólo concentraciones muy altas (100 μM) del conjugado peptídico afectaron significativamente a la coagulación. Dado que se aplicó una selección hacia los conjugados con menos probabilidad de afectar sistémicamente a la coagulación, el conjugado peptídico que tenía el péptido 3AA se destacó por tener efectos significativamente más nocivos sobre la coagulación. La prueba más sensible para verificar el efecto de los conjugados peptídicos en general fue la TT. Sin estar ligado a ninguna teoría o mecanismo, se supone que la prueba TT fue la más sensible porque apoya el mecanismo de acción de los conjugados peptídicos como inhibidores directos de la trombina. Por lo tanto, la prueba TT indica que los conjugados son inhibidores útiles. Además, los resultados sugieren que el conjugado peptídico ejerce su actividad terapéutica sin interferir con la coagulación. Este es un beneficio extraordinario, ya que los inhibidores de trombina actuales provocan hemorragias internas.

Tabla 5. Prueba de tiempo de protrombina

Tabla 6. Prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada

Tabla 7. Prueba de tiempo de trombina

Tabla 8. Prueba de actividad del factor Xa

Tabla 9. Prueba de actividad de proteína C

Ejemplo 15. Velocidades de conducción en el nervio ciático de un modelo animal de neuropatía diabética

[0156] Se disolvió estreptozotocina (STZ) en tampón de citrato pH 4,5 y se administró una dosis única de STZ IP (140 mg/kg) a ratones BALB/c de 12 semanas. Se observó hiperglucemia (más de 300 mg/dl de glucosa en sangre) en el 90 % de los ratones en 3 mediciones repetidas dentro de una semana desde la inyección de STZ. Los ratones desarrollaron neuropatía diabética dentro de las 4 semanas posteriores a la inducción de la diabetes. Los ratones se trataron diariamente con simulado (STZ), o con el conjugado peptídico como fármaco activo, ejemplificado por el conjugado T5AACK (es decir, un conjugado que comprende el péptido establecido en SEQ ID NO: 2) inyectado en un volumen de 100 microlitros que contenía las siguientes dosis: 10 nM, 100 nM y 1 micromolar. Un grupo de ratones normales sin diabetes sirvió como control.

[0157] Las velocidades de conducción en los nervios ciáticos de los ratones se evaluaron mediante métodos de conducción nerviosa de electrofisiología estándar por un evaluador ciego (Fig. 19). El análisis de la prueba T indicó que el efecto del conjugado peptídico T5AACK en relación con los ratones tratados con simulación fue muy significativo: 1 micromolar, p=0,00046 y 10 nM, p=0,016.

[0158] Por lo tanto, la velocidad de conducción del nervio ciático en ratones diabéticos tratados con el conjugado peptídico se parecía a la de los ratones sanos normales.

Ejemplo 16. Tamaño tumoral y edema en modelo animal GBM

[0159] El efecto terapéutico del conjugado peptídico se determinó in vivo en un modelo animal (rata) de GBM usando un conjugado peptídico que incluye el péptido 6AA (SEQ ID NO: 3).

[0160] células (0,5 x 106 células) de una línea celular altamente maligna de glioblastoma multiforme (GBM) de rata mediante métodos estereotácticos en la corteza parietal de ratas. Cinco (5) días después, se examinó el cerebro de estas ratas mediante IRM y los tumores se puntuaron en una escala de 1-3 (1-tumor de tamaño pequeño, 2-tumor de tamaño medio, 3-tumor de gran tamaño) y para la localización ventricular del tumor. Se colocó un catéter en el tumor cerebral y se conectó a una bomba osmótica (Alzet) liberando 1 μl/h durante 7 días de uno de los siguientes tres (3) tratamientos: solución salina (n=13), 6AA 2 μM (n =14) y 6AA 20 μM (n=14). Después de siete (7) días de tratamientos, se realizó una resonancia magnética y se analizó el tamaño del tumor y el edema que rodeaba el tumor mediante técnicas manuales estándar de ROI para cada rata y se resumió para los tres grupos de tratamiento (1) control; (2) tratamiento con 2 μM de un conjugado peptídico que comprende el péptido denominado 6AA (SEQ ID NO: 3); y (3) tratamiento con 20 μM de un conjugado peptídico que comprende el péptido denominado 6AA (SEQ ID NO: 3).

[0161] Para tener en cuenta la distribución desigual del tamaño inicial del tumor, se realizaron análisis de tumor y edema en ratas con tumores de grado 1 y 2 en la resonancia magnética inicial (n = 7, 6 y 5 para los grupos de tratamiento salino, bajo y alto, respectivamente).). Los resultados de los cambios en el tamaño del tumor (es decir, el tamaño obtenido en la segunda IRM (posterior al tratamiento) menos el tamaño en la IRM inicial (línea base, t=0)) y cambios similares en el edema se presentan en las Figuras 20 y 21, respectivamente. Como se muestra en las Figs. 20 y 21, el tratamiento con dosis altas redujo el tamaño del tumor a la mitad del tamaño original (p=0,030, prueba t). Se observó una tendencia similar para el grupo de dosis baja. Además, ambas dosis provocaron una reducción del edema que rodeaba los tumores.

[0162] La supervivencia se registró diariamente (Fig. 21). Ninguna de las 3 ratas con tumores iniciales graves (grado 3 o ventriculares) sobrevivió para realizar la segunda resonancia magnética, en comparación con las 3 ratas con tumores graves en el grupo de tratamiento de dosis alta (6AA 20 μM) y 1 de 3 en el grupo de dosis baja (p=0,05 para el grupo de dosis alta en comparación con los controles y p=0,024 para el grupo de dosis alta en comparación con los otros 2). Como se muestra en la Figura 21, hubo una clara tendencia a una mayor supervivencia en el grupo de dosis alta de 20 μM y este grupo incluía 2 ratones con una supervivencia excepcionalmente larga que está en el límite de la no supervivencia en los otros grupos (p = 0,055 por Fisher's prueba exacta).

[0163] La descripción anterior de las formas de realización específicas revelará tan completamente la naturaleza general de la invención que otros pueden, mediante la aplicación de los conocimientos actuales, modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones tales formas de realización específicas sin experimentación indebida y sin apartarse del concepto genérico, y, por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones deberían y están destinadas a ser comprendidas dentro del significado y rango de equivalentes de las formas de realización descritas. Debe entenderse que la fraseología o terminología empleada en el presente documento tiene fines de descripción y no de limitación. Los medios, materiales y pasos para llevar a cabo varias funciones descritas pueden tomar una variedad de formas alternativas sin apartarse de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado peptídico que comprende un resto protector de alfa-amino, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Asp-Pro-Arg y SEQ ID NO: 1-17, y un resto inhabilitador de proteasa, en el que el péptido se une al resto protector alfa-amino y al resto inhabilitador de proteasas, donde el resto inhabilitador de proteasas se selecciona del grupo que consiste en clorometilcetona, sulfonilfluoruros (-SO₂F), clorometilcetonas (-COCH₂Cl), aldehídos (-CHO), arilcetonas (-CO-arilo), trifluorometilcetonas (-COCF3) y ácidos cetocarboxílicos (-COCOOH), y donde el resto protector alfa-amino es tosilo o derivados del mismo.

2. El conjugado peptídico de la reivindicación 1, en el que el resto protector de alfa-amino está unido a la secuencia de aminoácidos del extremo N' del péptido directamente o a través de un enlazador.

3. El conjugado peptídico de la reivindicación 1, en el que el resto inhabilitador de proteasas está unido a la secuencia de aminoácidos del extremo C' del péptido directamente o a través de un enlazador.

4. El conjugado peptídico de la reivindicación 1, en el que el resto que desactiva la proteasa es clorometilcetona.

5. El conjugado peptídico de la reivindicación 1, en el que el resto protector de alfa-amino es tosilo o un derivado del mismo, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Pro-Arg o una variante activa del mismo y el resto inhabilitador de proteasa es clorometilcetona.

6. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado peptídico y un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo dicho conjugado peptídico un resto protector alfa-amino, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Asp-Pro-Arg y SEQ ID NO: 1-17 y un resto inhabilitador de proteasas, en el que el péptido se une al resto protector de alfa-amino y al resto inhabilitador de proteasas, en el que el resto inhabilitador de proteasas se selecciona del grupo que consiste en clorometilcetona, sulfonilfluoruros (-SO₂F), clorometilcetonas (-COCH₂Cl), aldehídos (-CHO), arilcetonas (-CO-arilo), trifluorometilo cetonas (-COCF3) y ácidos cetocarboxílicos (-COCOOH), y en donde el resto protector alfa-amino es tosilo o derivados del mismo.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que comprende además tricloroacetato.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que comprende además un antagonista de PAR-1.

9. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una actividad excesiva del receptor de proteasa.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en neuroinflamación, enfermedades o trastornos neuroinflamatorios, enfermedad o trastorno neurodegenerativo, neuropatía y neuropatía relacionada con la diabetes.

11. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para usar en la inducción de una reducción en la actividad de la trombina.