KR20210054542A

KR20210054542A - 신경 가소성을 유도하기 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20210054542A
Application number: KR1020217009271A
Authority: KR
Inventors: 제리 실버; 유 루오; 푸쳉 루오
Original assignee: 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2021-05-13
Also published as: US20210330757A1; CN113260373A; EP3846838A1; JP2021536461A; CA3111512A1; EP3846838A4; AU2019334965A1; WO2020051051A1

Abstract

신경 손상 후 남은 신경 세포의 보상성 가소성을 촉진하는 방법은 남은 신경 세포를 치료학적 펩타이드를 포함하는 치료제의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 32에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

Description

신경 가소성을 유도하기 위한 방법 및 조성물

관련 출원의 교차 참조(들)

본 출원은 2018년 9월 5일에 출원된 미국 임시출원 제62/727420호의 이익을 주장하고, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.

서열 목록에 관한 성명

본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되고, 본원에 인용되어 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 CWR026868WOORD.txt이다. 텍스트 파일은 24 KB이고; 2019년 8월 28일에 생성되고; 본 명세서의 출원에 의해 EFS-Web을 통해 제출되었다.

신경 손상은 신경 조직의 기능이상 또는 사멸을 발생시켜 매우 넓은 증상 및 효과를 나타낸다. 그 손상은 외부 사건, 예컨대 외상성 뇌 손상 또는 허혈성 병태에 의해, 내부 사건, 예컨대 뇌졸중, 동맥류, 뇌출혈, 혈전 또는 색전증으로부터, 또는 보다 만성인 신경퇴행성 질환, 예컨대 다발성 경화증으로부터 생길 수 있다.

예시적인 예로서, 뇌로의 혈류가 중단되어서, 신경 조직의 사멸 및 국소 신경학적 결핍을 야기할 때 뇌졸중이 생긴다. 징후 및 증상은 뇌졸중의 위치 및 정도에 따라 변할 수 있다. 미국에서 매년 거의 800,000건의 뇌졸중의 모든 유형이 있고, 허혈성 뇌졸중은 이들 뇌졸중의 대략 80%를 차지한다. 문헌[Roger et al. (2011) Circulation 123(4):e18-e209]. 유럽에서, 뇌졸중 연간 발생 추정치는 110만건 초과이고, 이들의 유사한 백분율로 대략 80%가 허혈성 뇌졸중이다. 문헌[Heuschmann et al. (2009) Stroke 40(5):1557-1563].

급성 뇌졸중 환자의 평가 및 치료에 대한 가이드라인은 뇌졸중을 악화시키거나 임상 과정을 복잡하게 할 수 있는 인자 및 재관류 치료에 집중한다. 급성 허혈성 뇌졸중의 진단은 국소 허혈 및 생성된 신경학적 결핍과 일치하는 신체 검사와 병력의 조합을 통해 이루어진다. 전산화 단층촬영(CT: computed tomography) 또는 자기 공명 영상화(MRI: magnetic resonance imaging) 중 어느 하나인 뇌 영상화는 출혈 및 다른 국소 병리학을 배제하고 허혈의 초기 신호를 뒷받침하도록 사용된다.

뇌졸중은 또한 만성 질환으로 여겨질 수 있다. 만성 뇌졸중 질환의 표시는 인지 결핍, 연하곤란 및 보행 장애를 포함하고, 급성 악화는 삼키기나 보행에서의 보상작용 상실, 또는 섬망의 형태를 취할 수 있다. 모든 만성 질환에 의한 것처럼, 추가의 급성 뇌졸중의 위험은 만성 뇌졸중 질환의 환자에서 더 높고; 위험 또는 재발성 뇌졸중은 동일한 연령 및 성별의 일반 집단에서의 제일 처음의 뇌졸중의 위험보다 약 6배 더 높다.

신경 손상에 대한 많은 치료학적 접근법은 손상된 뉴런의 기능을 재획득하려는 복원적 전략을 다룬다. 그러나, 기능 및/또는 신경 사멸의 전체 소실 전에 개입하는 시간의 윈도우는 짧다. 따라서, 많은 신경 손상을 다루는 데에서의 진전에도 불구하고 신경 손상 후 기능을 다시 재획득하고/하거나 부정적인 영향을 개선하도록 효과적이고 가요성인 치료에 대한 필요성이 남아 있다. 본 개시내용은 이들 수요 및 관련 수요를 해결한다.

이 요약은 상세한 설명에서 하기에 추가로 기재된 단순화된 형태로 개념의 선택을 도입하도록 제공된다. 이 요약은 청구된 대상의 중요한 특징을 확인하도록 의도되지 않고, 청구된 대상의 범위를 결정하는 것에 대한 도움으로서 사용되도록 의도되지 않는다.

본 개시내용은 일반적으로 이를 필요로 하는 대상체에서 신경 손상, 예컨대 외상성 뇌 손상 (TBI: traumatic brain injury), 허혈, 뇌졸중(예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 및/또는 만성 뇌졸중 질환), 동맥류, 뇌출혈, 혈전, 색전증, 다발성 경화증(MS: multiple sclerosis) 또는 알츠하이머병에 의해 생긴 신경 손상을 치료하는 제제, 화합물 및 방법, 및 대상체의 신경계에서 신경교 반흔 형성 및/또는 황산콘드로이틴 프로테오글리칸(CSPG)과 연관된 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 개시내용은 신경 손상 후 남은 신경 세포의 보상성 가소성(compensatory plasticity)을 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 남은 신경 세포를 남은 신경 세포에서 PTPσ의 촉매 활성, 신호전달 또는 기능 중 하나 이상을 억제하는 치료제의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 치료학적 펩타이드를 포함하고, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 32에 대해 적어도 70%의 동일성 또는 서열 번호 33에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 신경 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료학적 펩타이드를 포함하는 치료제의 유효량을 대상차에게 투여하여 신경 손상 후 남은 신경 세포의 보상성 가소성을 촉진하는 것을 포함하고, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 32에 대해 적어도 70%의 동일성 또는 서열 번호 33에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

이 양태의 다양한 실시형태에서, 남은 신경 세포는 신경 줄기 세포일 수 있고/있거나, 희소돌기 전구 세포(OPC: oligodendrocyte progenitor cell) 및/또는 신경교 전구체 세포(GPC: glial precursor cell)를 포함할 수 있거나, 뉴런일 수 있다. 일부 실시형태에서, 보상성 가소성은 남은 신경 세포의 신경돌기 증식, 예컨대 축삭돌기 발아 또는 가지돌기 발아 또는 분지로 나타날 수 있다. 일부 실시형태에서, 보상성 가소성은 신경 손상을 향한 남은 신경 세포의 보상성 이동으로 나타날 수 있다. 일부 실시형태에서, 신경 손상은 뇌와 같은 중추 신경계에 있다. 일부 실시형태에서, 신경 손상은 외상성 뇌 손상(TBI), 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병, 허혈, 뇌졸중, 동맥류, 뇌출혈, 혈전 또는 색전증에 의해 생긴다.

일부 실시형태에서, 치료제는 치료학적 펩타이드에 연결된 운반 모이어티를 추가로 포함하고, 세포에 의한 치료학적 펩타이드의 흡수를 수월하게 한다. 일부 실시형태에서, 운반 모이어티는 HIV Tat 운반 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 대상체에게 전신으로, 척추강내로 또는 유리체내로 투여된다.

본 발명의 하기 양태 및 많은 수반된 이점은 수반된 도면과 함께 취해질 때 이들이 하기 상세한 설명을 참조하여 더 양호하게 이해되면서 더 용이하게 이해될 것이고, 여기서
도 1은 동물 모델에서 PTPσ의 세포 특이적 결실을 실행하는 접근법의 예를 도식적으로 예시한다.
도 2a-2c: 도 2a는 T2 가중 MRI 스캔 영상을 예시하고, 도 2b는 비히클 및 ISP 치료 그룹이 치료가 뇌졸중-후 24시간에 시작하기 전에 일시적 근위 중대뇌동맥 폐색(tMCAO: transient proximal middle cerebral artery occlusion) 수술에 의해 유도된 뇌졸중-후 18시간에 동일한 경색 크기를 갖는다는 것을 보여주는 그래프를 예시한다. 도 2c는 연속 뇌졸중-후 ISP 치료가 시간에 따른 비히클 치료된 뇌졸중 동물(44.828%)에 대한 시간에 따른 뇌졸중 동물(67.742%)의 생존을 증가시켰다는 것을 그래프로 예시한다.
도 3a-3c는 뇌졸중-후 2주 내지 4주에 각각 총 거리, 수평 활성 및 수직 활성의 매개변수에 대해 연속 뇌졸중-후 ISP 치료된 마우스에서 향상된 운동능력 활성을 나타내는 컴퓨터 자동화 운동능력 오픈 필드 분석의 결과를 그래프로 예시한다. n=7-12, *<p<0.05, **, p<0.01, ANOVA.
도 4는 뇌졸중-후 ISP 치료가 접착제 제거 시험에 의해 측정된 바와 같은 뇌졸중 이환된 사지에서의 감각운동 기능을 개선한다는 것을 그래프로 예시한다.
도 5a-5b는 뇌졸중-후 ISP 치료가 반즈 미로에서 목표 홀을 발견하기 위해 오류 실험의 시간(도 5a) 및 수(도 5b)에 의해 측정된 바대로 뇌졸중 마우스에서 인지 기능을 개선한다는 것을 그래프로 예시한다.
도 6a-6c는 뇌졸중-후 4주에 각각 총 거리(도 6a), 수평 활성(도 6b) 및 수직 활성(도 6c)의 매개변수에서의 지연된(뇌졸중-후 7일) 뇌졸중-후 ISP 치료된 마우스에서 향상된 운동능력 활성을 나타내는 컴퓨터 자동화 운동능력 오픈 필드 분석을 그래프로 예시한다. n=7 각각의 그룹, *p<0.05 및 **, p<0.01, ANOVA.
도 7a-7f는 ISP 치료가 신경아세포 세포 형성 및 피질 척추로(cortical spinal tract) 축삭돌기 발아 둘 다를 향상시킨다는 것을 예시한다. 도 7a-7c는 뇌졸중-후 ISP 치료가 뇌졸중-후 마우스에서 측뇌실 및 인접한 선조체 조직 둘 다의 근처에서 DCX+ 신경아세포를 향상시켰다는 것을 나타내는 영상 및 그래프이다. * p<0.05, n=4. 기준자 = 100 μm. 도 7d-7f는 각각 카툰형 개략도, 영상 및 그래프이고, 이는 뇌졸중-후 ISP 치료가 대측성 피질 척추로로부터 축삭돌기 발아를 향상시킨다는 것을 나타낸다. 경부 척수에서의 교차된 CST 섬유(화살표)는 대측성 피질 BDA 트레이싱에 의해 표지됨. (p<0.01, 스튜던트 t-시험, 각각의 그룹에 대해 n=3).
도 8a-8f는 조건적(유도성) KO 마우스에서 PTPσ 유전자의 NSC 특이적 결실의 생성 및 규명 및 토마토(tomato) 리포터의 동시의 라벨링을 예시한다. 도 8a는 동시의 라벨링에 의한 PTPσ 유전자의 유도성/조건적 KO(cKO)를 생성하기 위한 절차를 도식적으로 예시한다. 도 8b 및 도 8c는 유도에 의한 또는 이것이 없는 조건적 대립유전자 및 재조합된 대립유전자를 확인시켜주는 전기영동 영상을 예시한다. PTPσ 유전자 재조합은 오직 성체 NSC+ niche(도 8b)에서 관찰되고 1차 성체 NSC 신경구(도 8c)에서 농후화되었다. 도 8d-8f는 선조체(도 8d) 및 DG(도 8e)에서의 SVZ 또는 SGZ 기원된 성체 유래 토마토+ 세포, 및 해마에서의 CA3 영역으로의 이의 돌출(도 8f)을 예시하는 영상이다. 기준자 = 100 μm.
도 9a-9h는 신경복구의 축삭돌기 발아 기전에 대한 PTPσ 결실을 평가하는 전략을 예시한다. 도 9a는 조건적 PTPσ 마우스에서 PTPσ 유전자의 AAV 매개된 성체 뉴런 특이적 결실 및 토마토 리포터의 동시의 라벨링을 생성하는 절차를 도식적으로 예시한다. 도 9b는 예시적인 전기영동 분석의 영상이고 대상체 마우스의 조직에서 조건적 대립유전자 및 재조합된 대립유전자를 확인시켜준다. 도 9c는 토마토 리포터에 의해 표지된 바와 같은 유도된 PTPσ 결실의 영상으로서, 피질 뉴런의 토마토 리포터 라벨링(d로 표지됨; 도 9d에서 확대됨) 및 선조체로의 이의 돌출(e로 표지됨; 도 9e에서의 확대됨), 교차하는 뇌들보(f로 표지됨; 도 9f에서 확대됨) 내지 대측성 피질(g로 표지됨; 도 9g에서 확대됨)을 보여준다. 도 9h는 피질척추로(CST) 및 토마토 리포터가 또한 피질척추로(CST)를 성공적으로 표지한다는 것을 나타내는 영상을 예시한다. 기준자 = 50 μm.
도 10a-10e는 성체 신경 줄기 세포 배양의 확립 및 규명을 예시한다. 도 10a는 wt 또는 cKO 마우스로부터 성체 신경 줄기 세포(NSC) 배양의 확립을 도식적으로 예시한다. 도 10b 및 도 10c는 성체 NSC가 CSPG를 생성하고(도 10b), 네스틴 양성(도 10c)이라는 것을 확인시키는 영상이다. 도 10d는 구배 스팟 검정으로부터의 영상으로서, 여기서 wt NSC(네스틴 양성; 화살표)는 CS56 면역염색(그린)에 의해 가시화된 외부 CSPG 가장자리를 침투할 수 없다. 이와 반대로, 도 10e는 cKO NSC가 이들에서 PTPσ 기능의 소실을 나타내는 CSPG 가장자리로 침투할 수 있다는 것을 보여주는 영상이다. 기준자 = 100 um.
도 11a-11e는 아그레칸 기질 코팅이 성체 NSC의 이동을 감소시키고, (wt와 비교된) cKO NSC 세포에서의 PTPσ 유전자의 결실이 기준 수준(아그레칸 코팅 무) 하에 그리고 아그레칸 코팅에 의해 둘 다로 이동을 향상시킨다는 것을 예시한다. 도 11a는 아그레칸 기질 코팅이 없는 야생형 NSC의 대표적인 영상이다. 도 11b는 아그레칸 기질 코팅이 없는 대표적인 cKO NSC의 영상이다. NSC가 CSPG 자체를 생성함을 고려하면, 이는 PTPσ의 결실 또는 억제가 왜 아그레칸 기질 코팅 없이 NSC 이동을 향상시키는지를 설명한다. 허혈성 뇌에서, 반응성 성상세포 신경교가 병변 주위의 기질 내에 추가의 CSPG를 생성하므로, 추가의 아그레칸 기질 코팅의 존재 하의 NSC의 이동이 또한 시험되었다. 도 11c는 아그레칸 기질 코팅에 의한 대표적인 야생형 NSC의 영상으로서, 추가의 아그레칸 코팅이 WT NSC의 이동을 억제하고, cKO 세포에서의 PTPσ의 결실이 추가의 아그레칸 코팅에 의해서도 cKO 세포의 이동을 향상시킬 수 있다는 것을 입증한다. 도 11d는 아그레칸 기질 코팅이 있는 대표적인 cKO NSC의 영상이다. 기준자 = 50 um. 이동의 정량화는 (E)에 도시되어 있다. ** 및 ***은 wt 세포와 비교된 p<0.01 및 p<0.001을 나타내고, # 및 ###은 아그레칸 코팅 무 조건과 비교된 p<0.05 및 p<0.001을 나타낸다(2방향 ANOVA, Tukey 사후 비교).
도 12a 및 도 12b는 ISP에 의한 CSPG- PTPσ 경로의 약물학적 억제가 유전적 PTPσ 결실과 유사한 결과를 나타낸다는 것을 예시한다. 도 12a는 아그레칸 코팅과 함께 또는 이것이 없는 대조군 및 배양된 ISP 치료된 세포의 이동을 보여주는 일련의 영상이다. 예시된 것처럼, 아그레칸 코팅은 성체 NSC의 이동을 감소시키고, ISP 치료는 NSC 이동에 대한 CSPG의 억제를 완화하였다. 도 12b는 도 12a에 예시된 다양한 조건 하에 세포의 정규화된 이동 지수를 그래프로 예시한다. 2방향 ANOVA, ** 및 ***는 대조군 치료된 NSC와 비교하여 p<0.01 및 p<0.001을 나타내고, #은 무 아그레칸 코팅된 조건과 비교하여 p<0.05를 나타낸다. 기준자 = 100 um.
도 13a-13c는 1차 PTPσ cKO 성체 NSC가 아그레칸 기질에서 야생형 NSC와 비교하여 증가된 신경돌기 증식을 갖는다는 것을 예시한다. 도 13a 및 도 13b는 5일 동안 시험관내 분화된 각각 야생형 및 cKO NSC에서의 MAP2 면역염색의 대표적인 영상이다. 기준자 = 50 um. 도 13c는 50개의 분화된 뉴런 세포의 비편향된 영상화 및 정량화에 의해 수행된 신경돌기 길이의 정량화를 그래프로 예시한다. **는 p<0.01, 스튜던트 t-시험을 나타낸다.
도 14a 및 도 14b는 ISP 치료가 WT 1차 NSC 세포에서 신경돌기 증식을 향상시킨다는 것을 예시하였다. 도14는 5일 동안 시험관내 분화된 야생형 NSC에서의 MAP2 면역염색의 일련의 대표적인 영상이다. 신경돌기 길이의 정량화는 각각의 조건에서 50개의 분화된 뉴런 세포의 비편향된 영상화 및 정량화에 의해 수행되었다. 도 14b는 대조군, 스크램블링된 펩타이드로 치료된 세포 및 ISP 펩타이드로 치료된 세포에 관찰된 신경돌기 길이를 그래프로 예시한다. 대조군과 스크램블링된 펩타이드 치료된 세포 사이에 유의차가 없고, **는 대조군 또는 스크램블링된 펩타이드 치료된 세포와 비교하여 ISP 치료된 세포에서 p<0.01을 나타낸다. 1방향 ANOVA.

본 개시내용은 일반적으로 이를 필요로 하는 대상체에서 신경 손상, 예컨대 외상성 뇌 손상 (TBI), 허혈, 뇌졸중(예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 및/또는 만성 뇌졸중 질환), 동맥류, 뇌출혈, 혈전, 색전증, 다발성 경화증(MS) 또는 알츠하이머병에 의해 생긴 신경 손상을 치료하는 제제, 화합물 및 방법, 및 대상체의 신경계에서 신경교 반흔 형성 및/또는 황산콘드로이틴 프로테오글리칸(CSPG)과 연관된 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 신경 손상 후 남은 신경 세포의 보상성 가소성을 촉진하는 것에 관한 것이다.

본 개시내용은 부부적으로 황산콘드로이틴 프로테오글리칸(CSPG)이 동물 및 인간 뇌졸중 환자 둘 다에서 만성 상태에 걸쳐 경색주위 영역에서의 신경교 반흔에서 축적하거나 조절할 수 있다는 본 발명자들의 발견에 기초한다. 뇌졸중의 만성 단계 동안 경색주위 영역에서의 CSPG의 이 축적은 새로운 국소 회로의 형성, 분구 사이 연결 및 피질척추로 축삭돌기 발아를 포함하는 뇌졸중-후 뉴런 가소성 재구성의 억제에 연루되었고, 이는 잠재적으로 뇌졸중 동물 및 인간 환자에서 회복을 제한시킨다. 하기 보다 자세히 기재된 바대로, 본 발명자들은 신경 세포에서 PTPσ 촉매 활성, 신호전달, 및/또는 기능을 억제하거나 조절한 전신 펩타이드 치료(예를 들어, 세포내 시그마 펩타이드(ISP) 치료)가 일반 로코모터 기능, 특정 상지 감각운동 기능 및 인지 기능을 포함하는 쥣과 뇌졸중 모델에서 기능 회복의 다수의 양태를 현저히 개선하기 위해 CSPG 장벽을 개선한다는 것을 발견하였다. 회복의 기전의 조사 동안에, 신경 세포에서의 PTPσ 신호전달의 ISP 조절이, 손상된 뉴런의 존재를 보상하기 위한 기능성을 허용한, 손상으로부터 남은 신경 세포(예를 들어, 비손상된 뉴런)의 이동 및 발아 활성을 유도함으로써 회복의 여러 양태에 기여한다고 결정되었다. 이것은 ISP 치료가 신경 손상 후 지연될 때에도 궁극적으로 완화 효과의 유도를 허용하였다. 더욱이, 전신 펩타이드 치료는 PTPσ 촉매 활성, 신호전달, 및/또는 기능을 억제하거나 조절하여서 뇌졸중 후 만성 뇌 위축을 감소시킨다. 따라서, 이것은 신경 손상에 근위 및 원위인 남은(예를 들어, 비손상된) 신경 세포의 가소성을 촉진하는 능력이 손상, 예컨대 악성 뇌졸중이 발생한 후 회복 및 생존을 촉진하기 위한 치료에 고도로 관련된다는 것을 나타냈다.

상기에 따라, 일 양태에서, 본 개시내용은 신경 손상 후 남은 신경 세포의 보상성 가소성을 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 남은 신경 세포를 남은 신경 세포에서 PTPσ의 촉매 활성, 신호전달 또는 기능 중 하나 이상을 억제하거나 조절하는 치료제의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 방법은 본 개시내용에 의해 또한 포함된 유효량의 개시된 치료제 또는 조성물을 대상체에게 투여하여 신경 손상 후 남은 신경 세포에서 보상성 가소성을 촉진하여 대상체에서 신경 손상을 위한 치료의 추가의 방법에 적용 가능하다. 일부 실시형태에서, 치료제는 치료학적 펩타이드를 포함한다. 치료학적 펩타이드는 서열 번호 32에 대해 적어도 70%의 동일성 또는 서열 번호 33에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다"는 대상체(예를 들어, 인간 또는 비인간 포유류, 예컨대 다른 영장류, 말, 개, 돼지, 마우스, 래트, 기니아 피그, 토끼 등)의 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 신경 손상)의 의학 관리를 지칭한다. 치료는 임의의 매개변수, 예컨대 증상의 폐지, 관해, 감소 또는 질환 또는 병태가 환자에게 더 관용성이 되게 하는 것, 퇴행 또는 감소의 속도의 느려짐, 또는 퇴행이 덜 쇠약하게 하는 것을 포함하여 질환 또는 병태(예를 들어, 신경 손상)의 치료 또는 경감의 성공의 임의의 표시를 포함할 수 있다. 증상의 치료 또는 경감은 의사에 의한 검사의 결과를 포함하여 객관적인 매개변수 또는 주관적인 매개변수에 기초할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 칭해지는 "NIHSS 척도"는 뇌졸중에 의해 생긴 손상의 수준을 측정하기 위해 흔히 사용되는 척도이다(문헌[Kasner S E. Lancet Neurol. 2006; 7:603-12]). 따라서, 용어 "치료하는"은 질환 또는 병태(예를 들어, 신경 손상)와 연관된 증상 또는 컨디션의 발생을 완화하거나 정지시키거나 억제하기 위한 본 개시내용의 조성물의 투여를 포함한다. 게다가, 이 용어는 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 치유보다는 증상의 경감에 설계된 치료인 완화적 치료; 연관된 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 발생을 최소화하는 것 또는 부분적으로 또는 완전히 억제하는 것에 관한 치료인 예방적 치료; 및 연관된 질환, 병리학적 병태 또는 장애의 개선에 관한 다른 특정 치료를 보충하도록 사용된 치료인 지지적 치료를 포함한다.

용어 "치료 효과"는 대상체에서의 질환 또는 병태, 질환 또는 병태의 증상, 또는 질환 또는 병태의 부효과의 일반적인 경감, 감소 또는 제거를 지칭한다.

용어 "치료학적으로 효과적인"은 용이하게 결정될 수 있는 치료 효과, 예컨대 남은 뉴런에서의 유도된 보상성 가소성 및/또는 증가된 로코모터 기능, 감각운동 기능, 또는 인식을 발생시키는 조성물의 양을 지칭한다. 본원에 정의된 바와 같은 제제의 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 대상체에서의 원하는 반응을 유발하는 제제의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 투여 요법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 유효량은 또한 치료학적으로 유리한 효과가 활성 화합물의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 것이다.

용어 "보상성 가소성"은 손상되는 신경 세포의 소실 또는 분해를 보상하는 신경 기능에 기여하는 건강한 신경 세포의 표현형 변화의 유도를 지칭한다. 건강한 신경 세포는 "남은" 신경 세포라 칭해지고, 이는 이것이 상기 방법이 다루는 신경 손상에서 직접적으로 손상되지 않는다는 것을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 남은 신경 세포는 신경 줄기 세포이다. 신경 줄기 세포는 신경계의 뉴런 및 교세포로 궁극적으로 분화할 수 있는 다능성 비분화된 신경 세포이다. 다른 실시형태에서, 남은 신경 세포는 희소돌기 전구 세포(OPC) 및/또는 신경교 전구체 세포(GPC)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 남은 신경 세포는 뉴런이다. 뉴런 또는 신경 세포는 세포를 분리하는 작은 시냅스 공간으로의 신경전달물질의 방출을 통해 다른 세포와의 통신에 영향을 미치도록 이의 세포체의 일부를 따라(예를 들어, 축삭돌기를 따라) 전기 임펄스를 전달하는 신경 조직 내의 세포이다. 뉴런은, 본 개시내용에 의해 포함되는 것처럼, 소정의 세포 마커의 발현에 의해 신경 줄기 세포와 구별 가능하다. 구체적으로, 뉴런은 전형적으로 네스틴- 및 DCX+(미성숙 뉴런에 대해) 또는 네스틴- 및 NeuN+ 또는 apt2+(성숙 뉴런에 대해)이다. 신경 줄기 세포는 이와 반대로 전형적으로 네스틴+ 및 DCX-이다.

하기 더 자세히 기재된 것처럼, PTPσ의 촉매 활성 신호전달 및/또는 기능의 억제가 신경 손상(예를 들어, 뇌졸중) 후 남은 신경 세포에서 신경돌기 증식을 유도한다는 것이 확립되었다. 따라서, 일부 실시형태에서, 치료제/펩타이드는 남은 신경 세포의 보상성 신경돌기 증식을 유도한다. 신경돌기 증식은 남은 신경 세포에서의 축삭돌기 발아로 나타날 수 있다. 축삭돌기 발아는 세포체로부터의 연장 발육, 또는 달리 축삭돌기, 즉 신경 섬유의 성장이다. 축삭돌기는 전형적으로 다른 세포를 향해 신경 세포체로부터 멀리 전기 펄스를 전도하도록 작용한다. 다른 실시형태에서, 신경돌기 증식은 남은 신경 세포에서의 가지돌기 발아로 나타날 수 있다. 가지돌기는 신경 세포의 분지된 원형질 연장이고, 이는 다른 신경 세포로부터 세포체로 받은 전기화학 자극을 전파시킨다. 어느 한 실시형태에서, 신경돌기 발아는, 축삭돌기 발아 또는 가지돌기 발아 또는 분지이든, 이웃하는, 둘러싼 또는 심지어 먼 신경 세포와의 시냅스 접촉을 증가시킨다. 특정 이론에 제한됨이 없이, 증가된 시냅스 접촉은 다른 세포의 손상으로 인해 소실된 시냅스 접촉을 보상한다. 신경돌기 발아를 통한 보상성 시냅스의 증가에 의해, 대안적인 또는 우회 연결은 확립될 수 있어서 손상된 신경 세포의 소실 또는 분해 후 기능을 회복하도록 작용할 수 있는 신호전달 경로를 재경로변경한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 신경돌기 증식은 신경 손상의 부위에 근위, 또는 손상의 부위에 원위인 남은 신경 세포에서 발생할 수 있다. 용어 "근위" 또는 "원위"는 상대 거리를 나타내고 문맥에 따라 상이한 거리를 나타낼 수 있는 용어이다. 일부 경우에, 신경 손상의 부위에 근위인 남은 신경 세포는 손상의 부위의 근처이거나 달리 이와 가까운, 예를 들어 손상된 신경 세포와 직접 접촉하는, 또는 손상된 세포로부터 세포 길이 또는 폭에서 측정 가능한 거리 내의 세포이다. 이와 반대로, 신경 손상의 부위에 원위인 남은 신경 세포는 예컨대 뇌의 상이한 조직 또는 영역에서, 또는 심지어 중추 신경계의 다른 영역, 예컨대 척수에서 멀리 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 치료제/펩타이드는 대측성 피질척추로에서의 위치와 같은 신경 손상의 부위에 원위인 남은 뉴런에서 신경돌기 증식을 유도한다.

다른 실시형태에서, 치료제/펩타이드는 신경 손상을 향한 남은 신경 세포의 보상성 이동을 유도한다. 일부 실시형태에서, 보상성 이동을 나타내는 남은 신경 세포는 신경 줄기 세포이다. 다른 실시형태에서, 보상성 이동을 나타내는 남은 신경 세포는 희소돌기 전구 세포(OPC) 및/또는 신경교 전구체 세포(GPC)이다. 일부 실시형태에서, 치료제/펩타이드는 신경 손상의 부위에 원위인 남은 신경 세포의 보상성 이동을 유도한다. 본 개시내용이 남은 신경 세포의 보상성 이동이 남은 신경 세포가 신경 손상의 부위에 진입하게 하는 실시형태를 포함하지만, 본 개시내용은 그렇게 제한되지 않는다. 본 개시내용은 또한 남은 신경 세포의 보상성 이동이 남은 신경 세포가 치료제/펩타이드의 투여 전보다 신경 손상의 부위에 더 가깝게 하는 실시형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 남은 신경 세포의 이동은 CSPG의 고리를 횡단한다.

개시된 방법은 중추 신경계에서 생기는 신경 손상을 다룬다. 일부 실시형태에서, 신경 손상은 뇌에 있다. 하기 더 자세히 기재된 것처럼, 뇌졸중 모델은 신경 손상 후 남은 신경 세포의 유도된 가소성을 확립하도록 사용되었다. 손상의 부위에 원위인 신경 세포를 포함하여 남은 신경 세포에서 발생한 향상된 가소성의 효과를 고려하여, 본 개시내용이 뇌졸중의 경우에 제한되지 않을 뿐만 아니라 신경 손상의 다른 형태를 포함한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 신경 손상은 외상성 뇌 손상(TBI), 예를 들어 뇌진탕; 신경퇴행성 질환, 예컨대 다발성 경화증(MS); 알츠하이머병, 허혈(예를 들어, 국소 허혈 또는 전체 허혈); 뇌졸중(예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 및/또는 만성 뇌졸중 질환); 동맥류, 뇌출혈, 혈전, 색전증; 및 신경 세포가 손상된 기타에 의해 야기될 수 있다.

본원에 "대뇌 허혈," "뇌 허혈," 또는 "뇌혈관 허혈"이라고도 칭하는 용어 "허혈"은 대사 요구량을 충족시키기 위해 뇌로의 불충분한 혈류가 있는 병태이다. 이는 불량한 산소 공급 또는 뇌저산소증, 이에 따라 "허혈성 뇌졸중"이라고도 칭하는 뇌 조직 또는 뇌 경색의 사멸을 야기한다. "허혈성 뇌졸중"은 뇌졸중의 하위유형이고, 전형적으로 대뇌 동맥의 폐색으로 인해 뇌로의 혈액 공급의 중단의 결과이다. 용어 "대뇌 허혈" 및 "허혈성 뇌졸중"은 본원에서 상호 교환되어 사용될 수 있다.

2가지 유형의 대뇌 허혈이 있다: 특정 뇌 영역으로 구속된 "국소 허혈"; 및 넓은 뇌 조직 영역을 포함하는 "전체 허혈". 전형적으로, 대뇌 허혈은 하기 증상 중 하나 이상을 제시하는 환자를 특징으로 한다: 말하기 및 이해의 곤란, 얼굴, 팔 또는 다리의 마비 또는 무감각, 일안 또는 양안으로 보는 것의 곤란, 두통 및 걷기의 곤란. 뇌졸중의 유형 및 가장 적절한 치료를 결정하기 위해, 응급팀은 뇌졸중의 유형 및 뇌졸중에 의해 영향을 받은 뇌의 영역을 평가할 필요가 있다. 이들은 또한 뇌종양 또는 약물 반응과 같은 증상의 다른 가능한 원인을 배제할 필요가 있다. 뇌졸중의 유형을 결정하기 위해 일반적으로 사용된 여러 시험이 있다: 신체 검사, 혈액 시험(혈당 수치, 혈액 세포, 혈청 전해질, 예컨대 나트륨, 칼륨 또는 칼슘, 콜레스테롤, 총 지질, HDL, LDL 또는 응고 인자, 예컨대 안티트롬빈 III, 단백질 C, 단백질 S의 계수; VIII 인자; 활성화 단백질 C 저항; 특별히 응고 인자 및 혈소판 결정이 관련됨), 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 자기 공명 영상화(MRI), 경동맥 초음파, 뇌혈관 조영상 및 심초음파검사. 허혈성 뇌졸중의 진단의 검토를 위해, 문헌[Am Fam Physician., 2015, 91(8):528-36]을 참조한다. 허혈성 뇌졸중의 급성 단계는 본원에서 "급성 허혈성 뇌졸중"이라 칭해지고, 발생 4시간 내로 한정된다. 뇌졸중 또는 허혈성 뇌졸중의 만성 단계는 본원에서 만성 뇌졸중 질환이라 칭해지고, 허혈성 뇌졸중의 급성 단계 후 생긴다.

남은 신경 세포에서의 PTPσ의 촉매 활성, 신호전달 또는 기능 중 하나 이상의 억제 및 이 목적을 위한 치료제가 이제 기재될 것이다.

PTPσ의 활성, 신호전달, 및/또는 기능은 PTPσ의 세포내 도메인의 활성의 직접 억제(예를 들어, 소분자, 펩티도미메틱, 항체, 인트라바디 또는 우성 음성 폴리펩타이드를 사용함으로써); PTPσ의 세포내 도메인의 활성, 신호전달, 및/또는 기능 중 하나 이상을 억제하는 유전자 및/또는 단백질의 활성화(예를 들어, 유전자 및/또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써); PTPσ의 하류 매개자인 유전자 및/또는 단백질의 억제(예를 들어, 매개자 유전자 및/또는 단백질의 발현 및/또는 활성을 차단함으로써); PTPσ의 활성, 신호전달, 및/또는 기능 중 하나 이상을 부정적으로 조절하는 유전자 및/또는 단백질의 도입(예를 들어, 재조합 유전자 발현 벡터, 재조합 바이러스 벡터 또는 재조합 폴리펩타이드를 사용함으로써); 또는 예를 들어 PTPσ의 하이포모르프 돌연변이체(hypomorphic mutant)에 의한 유전자 대체(예를 들어, 상동성 재조합, 재조합 유전자 발현 또는 바이러스 벡터를 사용한 과발현, 또는 돌연변이유발에 의해)를 포함하는 여러 방식으로 억제되고/되거나 저해되고/되거나 차단될 수 있다.

PTPσ의 활성, 신호전달, 및/또는 기능 중 하나 이상을 억제하거나 감소시키는 치료제는 PTPσ의 활성, 신호전달, 및/또는 기능을 감소시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 세포내로 전달되고 세포내로 전달되면 대상체에서 로코모터 기능, 감각운동 기능 또는 인식 중 적어도 하나를 향상시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, PTPσ의 활성, 신호전달, 및/또는 기능 중 하나 이상을 억제하거나 감소시키는 치료제는 PTPσ의 활성, 신호전달, 및/또는 기능을 억제하도록 PTPσ의 세포내 도메인, 특히 세포내 쐐기 형상의 도메인에 결합하고/하거나 이것과 복합체화하는 치료학적 펩타이드 또는 소분자를 포함한다. 따라서, 남은 신경 세포(예를 들어 신경 줄기 세포, OPC, GPC, 뉴런, 및/또는 신경교 세포)의 PTPσ의 세포내 도메인에 결합하고/하거나 이것과 복합체화하는 치료학적 펩타이드 또는 소분자는 보상성 세포 성장, 운동성(예를 들어, 이동), 신경돌기 증식, 생존 또는 다른 특징을 촉진하여 이들 세포의 보상성 가소성을 촉진하도록 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 치료제는 예를 들어 국제공개 WO 2013/155103A1호(본원에 그 전체가 인용되어 포함됨)에 기재된 것과 같은 PTPσ의 세포내 촉매 도메인의 쐐기 형상의 도메인(즉, 쐐기 도메인)의 펩타이드 모방체일 수 있다. PTPσ의 쐐기 도메인의 펩타이드 모방체는 세포(예를 들어, 뉴런 및/또는 신경교 세포)에서 발현되거나 세포내 운반 모이어티에 접합될 때 남은 신경 세포에서 발현된 쐐기 도메인에 결합하고/하거나 이것과 키메라화하여, 세포 성장, 이동 및 생존을 촉진하도록 남은 신경 세포에서 PTPσ 신호전달의 무효화를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, PTPσ 온전한 쐐기 도메인에 대한 이들 치료학적 펩타이드의 결합은 (i) PTPσ가 포스파타아제 표적과 같은 표적 단백질과 상호작용하는 능력을 방해하고/하거나; (ii) PTPσ와 PTPσ에 함유된 다른 도메인, 예컨대 촉매적으로 불활성인 제2 포스파타아제 도메인 D2 사이에 분자간 상호작용을 촉진하는 활성을 방해하고/하거나; (iii) 활성 포스파타아제 부위에 대한 단백질의 접근을 방지하고/하거나; (iv) 쐐기 도메인의 정상 상호작용을 능가하고/하거나; (v) 포스파타아제 활성을 입체적으로 억제할 수 있다.

상기 표시된 것처럼, 일부 실시형태에서 치료제는 PTPσ의 쐐기 도메인의 아미노산 서열의 약 10개 내지 약 20개의 연속 아미노산 부분과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 100% 동일한 약 10개 내지 약 20개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 치료학적 펩타이드를 포함하고/하거나 이들로 본질적으로 이루어지고/지거나 이들로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 10개 내지 약 20개의 연속 아미노산 부분은 쐐기 도메인의 N 말단 알파 헬릭스 및 4개 아미노산 턴의 연속 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, PTPσ의 기준 쐐기 도메인은 인간 PTPσ 서열이다. 일부 실시형태에서, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 32에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 78%, 적어도 약 85%, 적어도 약 92%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 33에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 78%, 적어도 약 85%, 적어도 약 92%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

하기 개시된 것처럼, 사이토솔-캐리어를 갖는 PTPσ의 쐐기 도메인에 상응하거나 이것과 실질적으로 동일한 펩타이드(예를 들어, 치료학적 펩타이드)는 뇌졸중-후 뉴런 가소성 재편성의 CSPG 매개된 억제를 줄일 수 있어서 로코모터 기능, 감각운동 기능 또는 인식 중 적어도 하나를 향상시킨다. 유리하게는, 치료학적 펩타이드는 전신으로 투여될 수 있다.

표 1에 기재된 것처럼, PTPσ의 쐐기 도메인 서열은 인간에서 마우스 및 래트로 오직 단일 아미노산 변화(6 위치에서 트레오닌에서 메티오닌으로)로 더 고등한 포유류에서 고도로 보존되어서 100% 상동성을 방지한다.

표 1에 기재된 것처럼, PTPσ의 쐐기 도메인의 제1 알파 헬릭스는 1번 내지 10번 아미노산을 포함하고, 턴 영역은 11번 내지 14번 아미노산을 포함하고, 제2 알파 헬릭스는 15번 내지 24번 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 인간 PTPσ(서열 번호 25)의 쐐기 도메인의 제1 알파 헬릭스는 DMAEHTERLK(서열 번호 29)의 아미노산 서열을 갖고, 턴은 ANDS(서열 번호 30)의 아미노산 서열을 갖고, 제2 알파 헬릭스는 LKLSQEYESI(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 갖는다.

쐐기 도메인은 또한 LAR 패밀리의 다른 구성원, LAR 및 PTPδ와 서열 상동성을 공유한다. 이 아미노산이 쐐기 도메인의 전체 구조에 필요할 것이다. 보존된 아미노산은 제1 알파 헬릭스의 종료 및 턴의 시작을 마킹하는 13번 위치에 알라닌을 포함하여서, 이것이 일반 쐐기 크기 및 구조에 필요하게 할 것이다.

쐐기 도메인의 일반 2차 구조 및 3차 구조가 대부분의 수용체 PTP에 걸쳐 일정하게 있으므로, 여러 보존적 치환은 유사한 결과를 얻기 위해 PTPσ 쐐기 도메인을 표적화하는 치료학적 펩타이드에 이루어질 수 있다. 보존적 치환의 예는 다른 것에 대한 하나의 비극성(소수성) 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 치환, 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 글리신과 세린 사이와 같은 다른 것에 대한 하나의 극성(친수성) 잔기의 치환, 다른 것에 대한 하나의 염기성 잔기, 예컨대 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 치환, 및/또는 다른 것에 대한 하나의 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산의 치환을 포함한다.

이 보존적 치환은 비고유한 도메인에서 알파 헬릭스 또는 턴에서, 구체적으로 제1 알파 헬릭스의 1번 내지 3번 위치 및 7번 내지 10번 위치; 턴에서 12번 및 13번 위치; 및 제2 알파 헬릭스의 15번, 16번, 18번 내지 24번 위치에서 발생할 수 있다. 이 아미노산은 쐐기 도메인의 전체 구조에 필요할 수 있지만, PTPσ에 대한 쐐기의 결합의 특이성에 필요하지 않다.

PTPσ에 대한 고유한 아미노산, 특히 LAR에 대해 PTPσ에서 차등적으로 발현된 아미노산은 쐐기 도메인 결합의 특이성에 필요한 것으로 발견되었다. 이들은, 제1 알파 헬릭스의 4번 및 5번 위치의 EH 도메인과, 이것에 이어서 6번 위치의 트레오닌 또는 메티오닌(래트 및 마우스 치환)을 포함한다. 결국, 더 고등한 포유류 모두에 있어서 14번 위치에 고유한 세린이 있다. 마지막으로, 제2 알파 헬릭스의 17번 위치에 고유한 류신이 있다. 이 고유한 아미노산의 잠재적인 역할은 하기 기재될 것이다.

턴에서 14번 위치의 세린 잔기는 쐐기 도메인에서의 이의 위치로 인해, 특히 흥미로운 것이다. 알파 헬릭스들 사이의 턴에 위치한 이 아미노산은 PTPσ의 일반 2차 구조 및 3차 구조로부터 약간 연장하여서, 이것이 결합 상호작용에 이용 가능하게 한다. 또한, 세린은, 이것이 함유하는 이의 하이드록실기 및 극성으로 인해, 여러 특이항체성 및 이호성 결합 사건, 예컨대 인접한 세린 사이의 수소 결합을 수월하게 하는 것으로 알려져 있다. 세린은 또한 인산화와 같은 다양한 변형을 겪는 것으로 공지되어 있고, 이 변형은 특이성에 대한 이의 필요성의 가능성을 높게 만든다. 쐐기 도메인에서 턴에 집중하고 보존된 세린을 포함하는 더 작은 펩타이드가 유사한 기능으로 더 큰 안정성을 제공할 수 있다. 이러한 펩타이드는 생성된 디설파이드 결합에 대한 어느 한 말단 상의 시스테인에 의해 루프로서 합성될 수 있다.

제1 알파 헬릭스에서의 고유한 아미노산은 4번 위치에서의 글루탐산, 5번 위치에서의 히스티딘 및 6번 위치의 트레오닌 또는 메티오닌을 포함한다. 히스티딘이 공통 쐐기 도메인에 연루되지만, 이것이 LAR, PTPδ, PTPμ 또는 CD45에서 발견되지 않는다. 이들 아미노산의 모든 3개가 충전되거나 극성이므로, 이 서열 또는 이들 성분들 중 하나가 PTPσ 쐐기 특이성에 필요할 것이다.

추가적으로, 제2 알파 헬릭스는 17번 위치에 고유한 류신을 함유한다. 류신은 류신 지퍼의 3차원 구조에 대한 중요한 접착 분자로서 연루된다. 쐐기 도메인과 구조적으로 유사한 이 분자에서, 대략 7개 간격에 위치한 반대의 알파 헬릭스의 류신은 반대의 알파 헬릭스의 소수성 영역과 상호작용한다. 9번 위치에 위치한 제1 알파 헬릭스에 류신이 또한 있으므로, 이 고유한 류신이 PTPσ 쐐기의 전체 3차원 구조 통합성에 필요하다고 믿어진다.

따라서, 일부 실시형태에서 치료학적 펩타이드는 약 14개 내지 약 20개의 아미노산을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어질 수 있고, 아미노산 서열 EHX1ERLKANDSLKL(서열 번호 32)(여기서, X₁은 T 또는 M임)을 포함한다. 치료학적 펩타이드가 서열 번호 32와 적어도 약 70%, 적어도 약 78%, 적어도 약 85%, 적어도 약 92%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖도록 서열 번호 32를 포함하는 치료학적 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 보존적 치환은 서열 번호 32의 아미노산 잔기 4E, 5R, 6L, 7K, 9N, 10D, 12L 또는 13K일 수 있다. 비제한적인 예로서, 아미노산 잔기 4E는 D 또는 Q로 치환될 수 있고/있거나, 아미노산 잔기 5R은 H, L 또는 K로 치환될 수 있고/있거나, 아미노산 잔기 6L은 I, V 또는 M으로 치환될 수 있고/있거나, 아미노산 잔기 7K는 R 또는 H로 치환될 수 있고/있거나, 아미노산 잔기 9N은 E 또는 D로 치환될 수 있고/있거나, 아미노산 잔기 10 D는 E 또는 N으로 치환될 수 있고/있거나, 아미노산 잔기 12L은 I, V 또는 M으로 치환될 수 있고/있거나, 아미노산 잔기 13K는 R 또는 H로 치환될 수 있다. 표시된 치환 중 임의의 하나 이상은 생성된 서열이 상기 기재된 동일성 매개변수를 달성하는 한 임의의 조합으로 실행될 수 있다.

치료학적 펩타이드의 설명의 많은 양태는 서열 번호 32의 맥락에서 일반적으로 본원에 제시되어 있고, 본 개시내용은 또한 치료학적 펩타이드가 서열 번호 33에 기재된 바와 같은 쐐기 도메인에서 변이체를 포함하는 실시형태를 포함한다. 본원에 기재된 치료학적 펩타이드의 모든 다른 측면 및 특징이 달리 구체적으로 기술되지 않는 한 이 변형 실시형태에 또한 적용된다고 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시형태에서 치료학적 펩타이드는 약 14개 내지 약 20개의 아미노산을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어질 수 있고, 아미노산 서열 DMAEHX₁ERLKANDS(서열 번호 33)(여기서, X₁은 T 또는 M임)을 포함한다. 치료학적 펩타이드가 서열 번호 33과 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 갖도록, 서열 번호 33을 포함하는 치료학적 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 보존적 치환은 서열 번호 33의 아미노산 잔기 7E, 8R, 9L, 10K, 12N 또는 13D일 수 있다. 예로서, 아미노산 잔기 7E는 D 또는 Q로 치환될 수 있고, 아미노산 잔기 8R은 H, L 또는 K로 치환될 수 있고, 아미노산 잔기 9L은 I, V 또는 M으로 치환될 수 있고, 아미노산 잔기 10K는 R 또는 H로 치환될 수 있고, 아미노산 잔기 12N은 E 또는 D로 치환될 수 있고, 아미노산 잔기 13D는 E 또는 N으로 치환될 수 있다.

일부 실시형태에서, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 1-25, 32 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

본원에 기재된 치료학적 펩타이드는 다른 다양한 변화, 치환, 삽입 및 결실의 대상일 수 있고, 여기서 이러한 변화는 이의 사용에서 소정의 이점을 제공한다. 이와 관련하여, PTPσ의 쐐기 도메인에 결합하고/하거나 이와 복합체화하는 치료학적 펩타이드는 언급된 폴리펩타이드의 서열에 상응하거나 이와 실질적이지만 불완전한 동일성을 가질 수 있고, 여기서 하나 이상의 변화가 이루어지고, 이것은 PTPσ 기능의 활성, 신호전달, 및/또는 기능 중 하나 이상을 억제하거나 감소시키는 능력을 보유한다.

치료학적 펩타이드는 아미드, 단백질과의 접합체, 고리화된 폴리펩타이드, 중합된 폴리펩타이드, 유사체, 단편, 화학적으로 변형된 폴리펩타이드 및 유사한 유도체를 포함하는 임의의 다양한 형태의 폴리펩타이드 유도체일 수 있다.

보존적 치환이 또한 비유도체화된 잔기 대신에 화학적으로 유도체화된 잔기의 사용을 포함할 수 있다고 이해될 것이고, 단 이러한 펩타이드는 필요한 결합 활성을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "화학 유도체" 또는 이의 문법적 변형어는 작용성 측쇄 기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 해당 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 유도체화된 분자는 예를 들어 유리 아미노기가 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐기, 카보벤족시기, t-부틸옥시카보닐기, 클로로아세틸기 또는 포밀기를 형성하도록 유도체화된 분자를 포함한다. 유리 카복실기는 염, 메틸 및 에틸 에테르 또는 다른 유형의 에스테르 또는 하이드라지드를 형성하도록 유도체화될 수 있다. 유리 하이드록실기는 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성하도록 유도체화될 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 N-im-벤질히스티딘을 형성하도록 유도체화될 수 있다. 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 폴리펩타이드가 화학 유도체로서 또한 포함된다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 프롤린에 대해 치환될 수 있고; 5-하이드록시리신은 리신에 대해 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘에 대해 치환될 수 있고; 호모세린은 세린에 대해 치환될 수 있고; 오르니틴은 리신에 대해 치환될 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩타이드는 필요한 활성이 유지되는 한 서열이 본원에 기재된 폴리펩타이드의 서열에 비해 하나 이상의 부가 및/또는 결실 또는 잔기를 갖는 임의의 폴리펩타이드를 또한 포함할 수 있다.

본원에 기재된 치료학적 펩타이드의 펩타이드 중 하나 이상은 자연 과정, 예컨대 번역후 가공에 의해, 및/또는 당해 분야에 공지된 화학 변형 기법에 의해 또한 변형될 수 있다. 변형은 펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복시 말단을 포함하는 펩타이드에서 발생할 수 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 펩타이드에서 몇몇 부위에서 동일한 또는 다양한 정도로 존재할 수 있다고 이해될 것이다. 변형은 예를 들어 제한 없이 아세틸화, 아실화, 아세토미도메틸(Acm)기의 첨가, ADP-리보실화, 아미드화, 피아빈에 대한 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화 및 유비퀴틴화와 같은 단백질에 대한 아미노산의 운반-RNA 매개 첨가(참고로 문헌[Protein-structure and molecular properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New-York, 1993] 참조)를 포함한다.

본원에 기재된 펩타이드 및/또는 단백질은 또한 예를 들어 생물학적 활성 돌연변이체, 변이체, 단편, 키메라 및 유사체를 포함할 수 있고; 단편은 하나 이상의 아미노산의 절두를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 절두는 아미노 말단(N 말단), 카복시 말단(C 말단)으로부터, 또는 단백질의 내부로부터 기원할 수 있다. 본 발명의 유사체는 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 치환을 수반한다. 돌연변이체, 변이체, 단편, 키메라 및 유사체는 (본 실시예로 제한됨이 없이) LAR 패밀리 포스파타제의 억제제로서 기능할 수 있다.

본원에 기재된 치료학적 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 펩타이드 및/또는 단백질은 재조합 DNA를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 하나의 제법은 세포 내에 펩타이드 및/또는 단백질의 발현을 제공하는 조건 하에 숙주 세포(박테리아 또는 진핵생물)를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

폴리펩타이드의 정제는 친화도 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수화도 또는 단백질 정제에 전형적으로 사용된 다른 정제 기법에 의해 수행될 수 있다. 정제 단계는 비변성 조건 하에 수행될 수 있다. 다른 한편, 변성 단계가 필요하면, 단백질은 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여 재생될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료학적 펩타이드는 폴리펩타이드가 다른 폴리펩타이드, 단백질, 검출 가능한 모이어티, 라벨, 고체 매트릭스 또는 캐리어에 편리하게 연결되고/되거나 고정될 수 있는 "링커"를 제공할 목적을 위해 폴리펩타이드의 어느 한 말단에서 부가될 수 있는 추가의 잔기를 포함할 수 있다.

아미노산 잔기 링커는 보통 적어도 1개의 잔기이고, 40개 이상의 잔기, 보다 대개 1개 내지 10개의 잔기일 수 있다. 연결에 사용된 전형적인 아미노산 잔기는 글리신, 티로신, 시스테인, 리신, 글루탐산 및 아스파르트산 등이다. 또한, 해당 폴리펩타이드는 말단-NH₂ 아실화, 예를 들어 아세틸화 또는 티오글리콜산 아미드화에 의해, 예를 들어 암모니아, 메틸아민에 의한 말단-카복실아미드화에 의해, 그리고 유사한 말단 변형에 의해 변형되는 서열이 다르다. 말단 변형은 프로테이나제 소화에 의한 감수성을 감소시키고, 따라서 용액, 특히 프로테아제가 존재할 수 있는 생물학적 유체 중에 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키도록 작용하는 것으로 잘 알려진 것처럼 유용하다. 이와 관련하여, 폴리펩타이드 고리화는 또한 유용한 말단 변형이고, 고리화에 의해 형성된 안정한 구조 때문에 그리고 본원에 기재된 바와 같은 이러한 환식 펩타이드에 관찰된 생물학적 활성의 관점에서 또한 특히 바람직하다.

일부 실시형태에서, 링커는 치료학적 펩타이드를 다른 폴리펩타이드, 단백질, 및/또는 분자, 예컨대 검출 가능한 모이어티, 라벨, 고체 매트릭스 또는 캐리어에 연결하는 가용성 펩타이드 링커일 수 있다. 가요성 펩타이드 링커는 약 20개 이하의 아미노산 길이일 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 링커는 약 12개 또는 더 적은, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 및 12개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 펩타이드 링커는 임의의 조합으로 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌의 아미노산의 2개 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료학적 펩타이드를 포함하는 치료제는 접합체 단백질의 형태로 제공될 수 있거나, 약물 전달 작제물은 치료학적 펩타이드에 연결된 적어도 운반 하위도메인(들) 또는 모이어티(들)(즉, 운반 모이어티)를 포함한다. 운반 모이어티는 포유류(즉, 인간 또는 동물) 조직 또는 세포(예를 들어, 신경 세포)로의 치료학적 폴리펩타이드의 흡수를 촉진할 수 있다. 운반 모이어티는 치료학적 펩타이드에 공유 연결될 수 있다. 공유 연결은 펩타이드 결합 또는 불안정한 결합(예를 들어, 용이하게 절단 가능하거나 내부 표적 세포 환경에서 화학 변경이 되는 결합)을 포함할 수 있다. 추가적으로, 운반 모이어티는 치료학적 폴리펩타이드에 가교결합(예를 들어, 화학적으로 가교결합, UV 가교결합)될 수 있다. 운반 모이어티는 본원에 기재된 연결 폴리펩타이드에 의해 치료학적 폴리펩타이드에 또한 연결될 수 있다.

운반 모이어티는 치료제에서 1회 초과 반복될 수 있다. 운반 모이어티의 반복은 원하는 세포에 의해 펩타이드 및/또는 단백질의 흡수에 영향을 미칠 수 있다(예를 들어, 흡수를 증가시킬 수 있다). 운반 모이어티는 또한 치료학적 펩타이드의 아미노-말단 영역에 또는 이의 카복시-말단 영역에 또는 영역 둘 다에 위치할 수 있다.

일부 실시형태에서, 운반 모이어티는 운반 모이어티에 일단 연결된 치료학적 폴리펩타이드가 수용체 독립적 기전에 의해 세포로 침투하게 하는 적어도 하나의 운반 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 의해 포함된 Tat 서열의 예는 서열 번호 34에 기재되어 있다. 예를 들어, 예시적인 비제한적인 실시형태에서 운반 펩타이드는 적어도 Tat 매개된 단백질 전달 서열 및 서열 번호 1-25, 32 및 33 중 하나와 적어도 70% 동일한 서열을 함유하는 합성 융합 펩타이드이다. 구체적인 예시적인 실시형태에서, Tat 매개된 단백질 전달 서열이 하나의 잔기의 펩타이드 링커에 의해 서열 번호 1-25, 32 및 33 중 하나의 쐐기 도메인 서열에 연결된 경우, 융합 펩타이드는 각각 서열 번호 35-61의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 서열 번호 35-59의 각각에 표시된 Xaa(및 서열 번호 60 및 61의 각각에 표시된 제1 Xaa)는 임의의 아미노산 잔기, 예컨대 글리신, 티로신, 시스테인, 리신, 글루탐산 및 아스파르트산 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표시된 링커 아미노산(Xaa로 표시됨)은 글리신, 세린, 알라닌 또는 트레오닌이다. 일부 실시형태에서, 표시된 링커 아미노산(Xaa로 표시됨)은 시스테인이 아니다. 서열 번호 35-61이 각각 단일 링커 아미노산 잔기를 갖는 서열을 개시하지만, 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 더 긴 펩타이드 링커를 갖는 다른 실시형태가 본 개시내용에 의해 또한 포함된다고 이해될 것이다. 더 긴 펩타이드 링커가 상기 기재되어 있다.

본 개시내용에 의해 포함된 공지된 운반 모이어티, 하위도메인 등의 다른 예는 예를 들어 캐나다 특허 제2,301,157호(안테나페디아의 호메오도메인을 함유하는 접합체), 및 미국 특허 제5,652,122호, 미국 특허 제5,670,617호, 미국 특허 제5,674,980호, 미국 특허 제5,747,641호 및 미국 특허 제5,804,604호(이들은 모두 그 전체가 본원에 인용되어 포함됨)에 기재되어 있다. 이러한 예는 Tat HIV 단백질의 아미노산을 함유하는 접합체; 단순 포진 바이러스-1 DNA 결합 단백질 VP22, 4개 내지 30개의 히스티딘 반복부의 범위의 히스티딘 태그, 또는 수용체 독립적 공정에 의한 활성 카고 모이어티의 흡수를 수월하게 할 수 있는 이의 변이 유도체 또는 동족체를 포함한다.

안테나피디아 호메오도메인의 제3 알파-헬릭스의 16개의 아미노산 영역은 또한 단백질(융합 단백질로서 제조됨)이 세포막을 횡단하게 한다고 나타났다(PCT 국제공개 WO 99/11809호 및 캐나다 출원 제2,301,157호). 유사하게, HIV Tat 단백질은 세포막을 횡단할 수 있는 것으로 나타났다.

또한, 운반 모이어티(들)는 활성제 모이어티에 공유 연결된 염기성 아미노산 농후 영역을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, 세포내 도메인 함유 단편 억제제 펩타이드)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염기성 아미노산 농후 영역"은 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴, 글루타민, 리신과 같은 염기성 아미노산의 높은 함량을 갖는 단백질의 영역에 관한 것이다. "염기성 아미노산 농후 영역"은 예를 들어 15% 이상의 염기성 아미노산을 가질 수 있다. 일부 경우에, "염기성 아미노산 농후 영역"은 15% 미만의 염기성 아미노산을 가질 수 있고, 운반제 영역으로서 여전히 작용한다. 다른 경우에, 염기성 아미노산 영역은 30% 이상의 염기성 아미노산을 가질 것이다.

운반 모이어티(들)은 프롤린 농후 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 프롤린 농후 영역은 이의 서열에서 5% 이상(최대 100%)의 프롤린을 갖는 폴리펩타이드의 영역을 지칭한다. 일부 경우에, 프롤린 농후 영역은 5% 내지 15%의 프롤린을 가질 수 있다. 추가적으로, 프롤린 농후 영역은 천연 발생 단백질(예를 들어, 인간 게놈에 의해 암호화된 단백질)에서 일반적으로 관찰되는 것보다 더 많은 프롤린을 함유하는 폴리펩타이드의 영역을 지칭한다. 이 적용의 프롤린 농후 영역은 운반제 영역으로서 작용할 수 있다.

일 실시형태에서, 본원에 기재된 치료학적 펩타이드는 형질도입 제제에 비공유 연결될 수 있다. 비공유로 연결된 폴리펩타이드 형질도입 제제의 예는 Chariot 단백질 전달 시스템이다(모두 본원에 그 전체가 인용되어 포함된 미국 특허 제6,841,535호; 문헌[J Biol Chem 274(35):24941-24946]; 및 문헌[Nature Biotec. 19:1173-1176] 참조).

본원에 기재된 치료제는 변형(예를 들어, 화학 변형)될 수 있다. 이러한 변형은 분자의 조작 또는 정제를 수월하게 하도록, 분자의 용해도를 증가시키도록, 원하는 위치에 표적화하는 투여를 수월하게 하도록, 반감기를 증가시키거나 감소시키도록 설계될 수 있다. 다수의 이러한 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, 숙련자에 의해 적용될 수 있다.

일 실시형태에서, 본원에 개시된 치료 방법, 치료학적 유효량의 치료제는 만성 뇌졸중 질환과 연관된 만성 기능을 갖는 대상체에게 투여된다. 치료제를 포함하는 제형은 예를 들어 뇌졸중의 검출 또는 발생의 시간으로부터 뇌졸중의 검출 또는 발생 후 일, 주, 개월, 및/또는 년까지의 기간에 대상체에게 1회 이상 투여될 수 있다.

치료제는 예를 들어 국소 투여 및/또는 전신 투여를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 전신 투여는 예를 들어 비경구 투여를 포함할 수 있다. 구절 "비경구 투여"는 주사에 의해 대표되는 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하고, 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 뇌실내, 낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척주내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전신 투여는 근육내, 정맥내, 관절내, 동맥내, 척추강내, 유리체내, 피하 또는 복강내 투여를 포함한다. 제제는 경구로, 경피로, 국소로, 흡입(예를 들어, 기관지내, 비강내, 경구 흡입 또는 비강내 점비액)에 의해 또는 직장으로 또한 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 매일 또는 주마다 치료제의 용량을 전달하도록 주입 펌프를 사용하여 정맥내 투여를 통해 대상체에게 투여될 수 있다.

국소 투여의 원하는 특징은 치료제의 효과적인 국소 농도의 달성, 및 치료제의 전신 투여로부터의 잠재적인 불리한 부효과의 회피를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 치료제는 대상체의 뇌로 직접 도입될 수 있다.

치료제의 약제학적으로 허용 가능한 제형은 수성 비히클에 현탁되고 종래의 피하 니들을 통해 또는 주입 펌프를 사용하여 도입될 수 있다.

주사를 위해, 치료제는 액체 용액, 전형적으로 생리학적 상용성 완충액, 예컨대 행크액(Hank's solution) 또는 링거액(Ringer's solution) 중에 제형화될 수 있다. 또한, 치료제는 고체 형태로 제형화될 수 있고, 사용 바로 전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태가 또한 제공된다. 주사는 예를 들어 치료제의 볼루스 주사 또는 연속 주입(예컨대, 주입 펌프 사용)의 형태일 수 있다.

임의의 동물 또는 인간 대상체에게 투여되는 치료제의 양, 부피, 농도, 및/또는 투여량이 대상체의 몸집, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 조성물, 성별, 투여의 시간 및 경로, 일반 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물과 같은 많은 인자에 따라 투여된다고 이해될 것이다. 치료제의 상기 기재된 양, 부피, 농도, 및/또는 투여량의 특정 변경은 하기 기재된 실험 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료제, 예컨대 치료학적 펩타이드는 치료되는 대상체의 약 0.1 μmol, 약 1 μmol, 약 5 μmol, 약 10 μmol, 또는 초과; 또는 약 0.0001 mg/kg, 약 0.001 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 또는 10 mg/kg의 용량 또는 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 국소로 및/또는 전신으로 투여될 수 있다. 치료제는 로코모터, 감각운동, 및/또는 인지 결핍의 최대 회복이 있을 때까지 매일, 주마다, 2주마다, 달마다 또는 덜 빈번히 투여될 수 있다.

치료제는 1-1000 mg IV, 예를 들어 100-600 mg IV, 예를 들어 200 및 400 mg IV, 예를 들어 약 300 mg IV의 고정된 단위 용량으로 투여될 수 있다. 치료제는 피하로 투여될 때 전형적으로 용량 1 mg 내지 100 mg의 SC(예를 들어, 75 mg)로 투여된다. 이것은 또한 1 내지 10 mg/kg, 예를 들어 약 6.0, 4.0, 3.0, 2.0, 1.0 mg/kg의 용량으로 볼루스로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 연속 투여는 예를 들어 피하 펌프를 통해 표시될 수 있다.

일부 실시형태에서, 남은 신경 세포는 손상 후 7일 내에, 예를 들어 신경 손상이 발생한 후 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 및 약 7일 내에 치료제와 접촉한다.

대상체의 치료의 실시형태에서, 대상체는 손상 후 7일 내에, 예를 들어 신경 손상이 발생한 후 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 및 약 7일 내에 치료제가 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 치료제, 예를 들어 치료학적 펩타이드는 신경 손상, 예컨대 뇌졸중의 발생 후 12시간 이상, 예를 들어 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 10시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 이상 후 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 치료제는 급성 뇌졸중 후 또는 뇌졸중의 발생으로부터 약 12시간 이상 후 투여될 수 있다.

다른 실시형태에서, 치료제는 신경 손상, 예를 들어 뇌졸중이 발생할 때의 보통 약 24시간, 약 48시간, 약 100시간 또는 약 200시간 이상 후 정맥내 주사에 의해 전신으로 또는 손상의 부위에 국소로 대상체에게 투여될 수 있다.

다른 실시형태에서, 치료제(들)를 투여하도록 사용된 약제학적으로 허용 가능한 제형은 또한 대상체에 대한 활성 화합물의 지속적인 전달을 제공하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 제형은 대상체에 대한 초기 투여 후를 포함하여 적어도 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 활성 화합물을 전달할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 적어도 30일 동안 치료제로 치료될 수 있다(반복 투여 또는 지속 전달 시스템의 사용, 또는 둘 다에 의해).

지속된 전달을 위한 접근법은 중합체성 캡슐, 제형을 전달하는 미니펌프, 생체분해성 임플란트 또는 이식된 형질전환 자가유래 세포의 사용을 포함한다(미국 특허 제6,214,622호 참조). 이식형 주입 펌프 시스템(예를 들어, INFUSAID 펌프(펜실베니아주 토완다)); 문헌[Zierski et al., 1988; Kanoff, 1994] 참조) 및 삼투성 펌프(Alza Corporation에 의해 판매된)가 상업적으로 이용 가능하고, 달리 당해 분야에 공지되어 있다. 다른 투여 방식은 이식 가능한, 외부 프로그래밍 가능한 주입 펌프를 통한다. 주입 펌프 시스템 및 저장소 시스템은 또한 예를 들어 미국 특허 제5,368,562호 및 미국 특허 제4,731,058호에 기재되어 있다.

약제학적 조성물은 보상성 신경 가소성의 유리한 효과, 예를 들어 향상된 로코모터 기능, 감각운동 기능, 및/또는 인식에서의 가소성 표시를 경험할 수 있는 임의의 대상체에게 투여될 수 있다. 인간이 이러한 동물 중에서 가장 중요하지만, 본원에 기재된 실시형태는 그렇게 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

기재된 치료제는 표시된 바대로 대상체에서 신경 손상을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 치료제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 치료학적 유효량은 남은 신경 세포의 보상성 가소성, 예를 들어 대상체에서 로코모터 기능, 감각운동 기능 또는 인식 중 적어도 하나에서 나타날 수 있는 가소성을 향상시키는 데 효과적인 양(용량)을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료제는 치료제의 투여가 없는 대상체에서의 신경 세포, 예를 들어 NSC, 뉴런, 및/또는 신경교 세포의 양과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 또는 1000%의 뉴런 및/또는 신경교 세포 생성의 양의 증가에 의해 대상체의 중추 신경계에서 신경 세포, 예를 들어 NSC, 뉴런, 및/또는 신경교 세포의 생성을 향상시키기에 효과적인 양으로 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료된 대상체는 급성 중대뇌동맥(MCA) 허혈성 사건 또는 뇌졸중, 예를 들어 허혈성 뇌졸중으로 고생한다. 허혈성 뇌졸중은 혈전증(예를 들어, 정맥 혈전증), 색전증 또는 전신 관류저하에 의해 생긴 허혈(포도당 및 산소 공급의 부족)로 인해 뇌로의 혈액 공급의 방해로 인한 뇌 기능(들)의 신속히 발생하는 소실이다. 그 결과, 뇌의 이환된 부위는 작용할 수 없어서, 신체의 한 측에서 하나 이상의 사지를 이동시키지 못하는 것, 언어능력을 이해하거나 진술하지 못하는 것, 또는 시야의 한 측을 보지 못하는 것으로 이어진다.

급성 중대뇌동맥(MCA) 허혈성 사건 또는 허혈성 뇌졸중의 증상은 예를 들어 편측마비, 얼굴의 감각 감소 및 근육 약화, 둔해짐, 감각 또는 진동 감각의 감소, 냄새, 맛, 청각 또는 시각(전부 또는 부분)의 변경, 눈꺼풀의 늘어짐(눈꺼풀 처짐) 및 눈 근육의 약화, 반사 감소, 균형 문제 및 안구진탕, 호흡 및 심박수의 변경, 흉쇄유돌근의 약화와 머리를 한 측으로 돌리지 못함, 혀의 약함(내밀고/내밀거나 한 측에서 다른 측으로 이동하지 못함), 실어증, 실행증, 시야 결손, 기억 결핍, 편측무시, 사고 와해, 혼란, 과잉성욕 표현, 실인증, 문제가 있는 걸음, 이동 조정력의 변경, 및 어지럼증 및/또는 불균형을 포함한다.

허혈성 사건 또는 뇌졸중, 예를 들어 허혈성 뇌졸중, 발병 시간은 임의의 이용 가능한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 뇌졸중 발병의 근사 시간을 확인하기 위해 예를 들어 본원에 기재된 바대로 뇌졸중의 다양한 증상과 관련하여 예를 들어 의사에 의해 질문을 받을 수 있다. 일부 경우에, 뇌졸중 발병 시간은 예컨대 대상체가 뇌졸중으로 깨어날 때, 또는 증상의 출발이 달리 검출 불가능한 경우 정확히 찾아내기 어렵다. 이러한 경우에, 뇌졸중 발병은 대상체가 건강한 것으로 마지막에 알려진 시간, 예를 들어 마지막 알려진 정상(LKN: last known normal)을 확인하여 결정될 수 있다. 일부 경우에, 뇌의 MRI는 대상체에서 발생 시간 및/또는 뇌졸중 기간을 결정하도록 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova et al.; Radiology (2010) MR imaging helps predict time from symptom onset in patients with acute stroke: implications for patients with unknown onset time, 257(3):782-92](본원에 그 전체가 인용되어 포함됨) 참조).

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이를 필요로 하는 대상체에서 신경 손상을 치료하는 방법은 신경 손상에 대한 추가의 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 달리 기술하면, 현재 개시된 치료 방법은 신경 손상을 해결하는 데 있어서 조합 치료의 일부일 수 있다. 예를 들어, 뇌졸중을 치료하기 위한 추가의 치료는 또한 예를 들어 혈전용해(예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성자(tPA)), 혈전절제술, 혈관성형술 및 스텐팅, 치료학적 저체온증 및 약제(예를 들어, 아스피린, 클로피도그렐 및 디피리다몰)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 치료는 예를 들어 혈전용해제, 신경보호제, 소염제, 스테로이드, 사이토카인 또는 성장 인자이다. 사용된 혈전용해제는 조직 플라스미노겐 활성자 또는 유로키나제일 수 있다. 사용된 신경보호제는 N-메틸-D 아스파르테이트 수용체(NMDA), a-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로프리온산 수용체(AMPA), 글리신 수용체, 칼슘 채널 수용체, 브래디키닌 B2 수용체 및 나트륨 채널 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된, 또는 브래디키닌 B1 수용체, α-아미노 부티르산(GABA) 수용체, 및 아데노신 A1 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체에 대한 작용제일 수 있다. 사용하기 위한 소염제는 인터류킨-1 및 종양 괴사 인자 패밀리 구성원일 수 있다.

신경학적 회복에 대한 표준 시험(예를 들어, 국립 보건원 뇌졸중 척도(NIHSS: National Institute of Health Stroke Scale), 바텔 지수(Barthel Index), 변형 랭킨 척도(Rankin Scale)(mRS), 글라스고 결과 척도(Glasgow Outcome Scale), 몬트리올 인지 평가(MoCA: Montreal Cognative Assessment), 뇌졸중 영향 척도(Stroke Impact Scale)(SIS-16))은 효능을 결정하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다. NIHSS는, 대상체가 질문에 대해 답변하는 능력, 그리고 의식 수준, 언어, 시야 손실, 안외 운동, 운동 강도, 운동실조, 조음장애, 감각 손실 및 소멸 및 부주의와 관련하여 활동을 수행하는 능력에 기초하여, 뇌졸중의 중증도를 분류한다. 15개의 항목이 있고, 각각의 항목에 대한 순위는 모든 항목에 대하여 정상으로서 0 및 42의 최대 중증도 점수로 3 내지 5 등급으로 점수 매겨진다. 1 내지 4의 NIHSS는 약간의 뇌졸중을 표시하고; 5 내지 15의 점수는 보통의 뇌졸중을 나타내고, 16 내지 20의 점수는 보통 내지 중증의 뇌졸중을 나타내고; 21 내지 42의 점수는 중증의 뇌졸중을 나타낸다.

일반 정의

본원에 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에 의해 흔히 이해되는 의미를 가져야 한다. 실행자는 특히 당해 분야의 정의 및 용어에 대해 문헌[Ausubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2010)]; 문헌[Coligan, J.E., et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York (2010)]; 문헌[Mirzaei, H. and Carrasco, M. (eds.), Modern Proteomics - Sample Preparation, Analysis and Practical Applications in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer International Publishing, (2016)]; 문헌[Comai, L, et al., (eds.), Proteomic: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology, Springer International Publishing, (2017)]; 문헌[Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell, W. W. Norton & Company; Sixth edition (2014)]; 및 문헌[Kandel, E.R., et al. Principles of Neural Science, McGraw-Hill Education/Medical; 5th edition (2012)]과 관련된다.

편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 청구항에서 본원에 사용된 소정의 용어가 여기에 제공된다. 본 발명의 범위가 오직 청구항에 의해 제한되므로 정의는 특정 실시형태를 기술하는 것을 돕도록 제공되고 청구된 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.

문맥에 의해 달리 필요하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 단수 형태 용어("a" 및 "an")는 청구항 또는 명세서에서 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때 달리 구체적으로 기재하지 않는 한 하나 이상을 나타낸다. 청구항에서 용어 "또는"의 사용은 오직 대안을 지칭하도록 명확히 표시되지 않는 한 "및/또는"을 의미하도록 사용되거나, 대안은 상호 배타적이지만, 본 개시내용은 오직 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다.

문맥이 명확히 달리 필요하지 않는 한, 명세서 및 청구항에 걸쳐, 용어 "포함한다", "포함하는" 등은 "비제한적인 예로서 포함하는"의 의미로 표시하는 것인 배타적인 또는 철저한 의미와 반대로 포함 의미로 해석되어야 한다. 단수 또는 복수 숫자를 사용한 단어가 또한 각각 복수 및 단수 숫자를 포함한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 기준 조성물이 추가의 요소, 변경, 및/또는 서열을 포함할 수 있지만, 추가의 요소, 변경, 및/또는 서열이 표시된 조성물의 기능성에 유의미하게 기여하지 않는다는 것을 나타낸다.

단어 "약"은 예를 들어 분량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 나타내는 언급된 기준 숫자보다 크거나 낮은 적은 변화의 범위 내의 숫자를 나타낸다. 예를 들어, "약"은 표시된 기준 숫자의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 초과 또는 미만의 범위 내의 숫자를 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 단량체가 아미드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산 잔기인 중합체를 지칭한다. 아미노산이 알파-아미노산일 때, L-광학 이성질체 또는 D-광학 이성질체가 사용될 수 있고, L-이성질체가 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 폴리펩타이드 또는 단백질은 또한 임의의 아미노산 서열을 포함하고, 당단백질과 같은 변형된 서열을 포함한다. 용어 폴리펩타이드는 천연 발생 단백질, 및 재조합으로 또는 합성으로 제조된 것을 다루도록 구체적으로 의도된다. 용어 "펩타이드"는 단순히 비교적 짧은 폴리펩타이드 중합체, 예를 들어 최대 약 20개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개 또는 약 90개의 아미노산 길이를 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드의 맥락에서 용어 "키메라" 또는 "융합"은 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 아미노산 서열과 제1 폴리펩타이드의 도메인에 외래이고 이와 실질적으로 상동성이 아닌 도메인(예를 들어, 폴리펩타이드 부분)을 한정하는 제2 아미노산 서열의 융합을 지칭한다. 키메라 단백질은 제1 단백질을 또한 발현하는 (상이한 단백질에 있을지라도) 유기체에서 발견된 외래 도메인을 제시할 수 있거나, 이것은 상이한 종류의 유기체에 의해 발현된 단백질 구조의 "종간", "유전자간" 등의 융합일 수 있다.

당업자는 단일 아미노산 또는 서열에서의 아미노산의 백분율을 변경하거나 부가하거나 결실시키는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이고, 여기서 변경은 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 발생시킨다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 아미노산 치환 표는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 하기 6개의 그룹은 서로에 대해 보존적 치환인 것으로 생각되는 아미노산의 예이다:

(1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T),

(2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E),

(3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q),

(4) 아르기닌(R), 리신(K),

(5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V), 및

(6) 페닐알라닌 (F), 티로신(Y), 트립토판(W).

서열 동일성에 대한 지칭은 2개의 중합체성 서열, 예컨대 단백질 서열의 유사성의 정도를 해결한다. 서열 동일성의 결정은 인정된 알고리즘 및/또는 기법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정되고, 여기서 비교 윈도우에서의 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부가 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 함유하지 않는) 기준 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 일치된 위치의 수를 생성하도록 서열 둘 다에서 발생하는 위치의 수를 결정하고, 비교의 윈도우에서 위치의 총 수에 의해 일치된 위치의 수를 나누고 그 결과에 100을 곱해 서열 동일성의 백분율을 생성하여서 계산된다. 이러한 비교를 수행하기 위해 BLAST N 또는 BLAST와 같은 다양한 소프트웨어 유도 알고리즘이 용이하게 이용 가능하다.

용어 "야생형"(또는 "wt")은 각각 보통 생체내 존재하면서 단백질, 또는 이의 일부를 암호화하는 천연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 단백질 서열, 또는 이의 일부를 지칭한다.

본원에 기재된 방법에 사용된 제제, 화합물, 조성물 등은 이의 사용 전에 정제되고/되거나 단리되는 것으로 여겨진다. 정제된 재료는 전형적으로 "실질적으로 순수"하고, 이는 핵산, 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 다른 분자가 이것을 천연으로 수반하는 성분으로부터 분리된다는 것을 의미한다. 전형적으로, 폴리펩타이드는 이것이 천연으로 연관된 단백질 및 다른 유기 분자로부터 적어도 60 중량%, 70 중량%, 80 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 또는 심지어 99 중량% 유리이면 실질적으로 순수하다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 자연 소스로부터의 추출에 의해, 그 단백질을 정상 발현하지 않는 세포에서의 재조합 핵산의 발현에 의해, 또는 화학 합성에 의해 얻어질 수 있다. "단리된 재료"는 이의 천연 위치 및 환경으로부터 제거되었다. 단리된 또는 정제된 도메인 또는 단백질 단편의 경우에, 도메인 또는 단편은, 천연 발생 서열에 있어서 단백질에 인접하는 아미노산 서열이 실질적으로 없다.

용어 "일부", "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 폴리펩타이드를 지칭할 때 본원에 언급된 적어도 일부 생물학적 활성(예를 들어, 상호작용, 예컨대 결합의 억제)을 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드는 제한 없이 폴리펩타이드가 여전히 이의 기능을 제공하는 한 부분, 단편, 변이체, 또는 유도체 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 일부는 단백분해 단편, 결실 단편 및 특히, 또는 동물에게 전달될 때 작용 부위에 더 용이하게 도달하는 단편을 포함할 수 있다.

사용될 수 있는, 함께 사용될 수 있는, 제조에 사용될 수 있는, 또는 개시된 방법 및 조성물의 생성물인 재료, 조성물 및 성분이 개시되어 있다. 이들 화합물의 각각의 및 모든 단일 조합 및 순열에 대한 특정 참고문헌이 명확히 개시될 수 없을지라도 이들 재료의 조합, 하위집단, 상호작용, 그룹 등이 개시될 때, 다양한 개별적 및 집단적 조합의 각각이 구체적으로 고려된다고 이해된다. 이 개념은 비제한적인 예로서 기재된 방법에서의 단계를 포함하는 본 개시내용의 모든 양태에 적용된다. 따라서, 임의의 상기 실시형태의 특정 요소가 다른 실시형태에서 요소에 대해 조합되거나 치환될 수 있다. 예를 들어, 수행될 수 있는 다양한 추가의 단계가 있으면, 이들 추가의 단계의 각각이 임의의 특정 방법 단계 또는 개시된 방법의 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 이러한 조합 또는 조합의 하위집단이 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 여겨져야 한다고 이해된다. 추가적으로, 본원에 기재된 실시형태가 임의의 적합한 재료, 예컨대 본원에 어딘가에 기재되거나 당해 분야에 공지된 바와 같은 것을 이용하여 실행될 수 있다고 이해된다.

본원에 인용된 공보 및 이들이 인용한 대상은 그 전체가 본원에 구체적으로 인용되어 포함된다.

하기는 구체적이고 예시적인 실시형태의 설명이고, 여기서 본 발명자들은 세포내 시그마 펩타이드(ISP) 치료가 신경 손상의 모델에서 회복을 촉진한다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 예를 들어 ISP 치료에 의한 PTPσ의 CSPG 유도된 신호전달의 억제가 일반 로코모터 기능, 특정 상지 감각운동 기능 및 인지 기능을 포함하는 쥣과 뇌졸중 모델에서 기능 회복의 다수의 양태를 현저히 개선하기 위해 CSPG 장벽을 개선하는 것으로 나타났다. 회복의 기전이 또한 조사된다. PTPσ 신호전달의 ISP 조절은 손상된 뉴런의 존재를 보상하기 위한 기능성을 허용한 손상으로부터 남은 신경 세포(즉, 비손상된 뉴런)에서 이동 및 발아 활성을 유도함으로써 회복의 여러 양태에 기여하였다. 이것은 ISP 치료가 신경 손상 후 지연될 때에도 궁극적으로 완화 효과의 유도를 허용하였다.

처음에, C57BL/6 마우스에서의 뇌졸중-후 ISP 치료의 효능은 근위 중대뇌동맥 폐색(pMCAO) 모델을 사용하여 시험되었다. 마우스의 3개의 코호트(n=59)는 선조체 및 피질 조직 둘 다에서 큰 뇌졸중을 유도하도록 MCAO 수술로 처리되어서, 인간에서 치명적인 경향이 있는 인간 "악성" 뇌졸중을 모방한다. 뇌졸중 마우스는 뇌졸중 손상의 크기를 결정하도록 T2 가중 MRI 스캐닝으로 처리되고, 6주 동안 뇌졸중 발생 후 24시간으로부터 출발하여 매일 비히클(5% DMSO) 또는 매일 ISP(20 μg/마우스/일 또는 30 μg/마우스/일 S.C. 주사) 치료를 받은 2개의 동등하게 분포된 그룹으로 맹검으로 그룹화되었다.

치료를 뇌졸중-후 24시간에 시작한 후, 마우스는 MRI에 의해 규명되었다. 데이터는 동물의 2개의 그룹이 MRI 스캐닝에 의해 허혈성 손상의 사건에서 차이를 갖지 않는다는 것을 나타냈다(예를 들어, 도 2a 및 도 2b). 뇌졸중 후 24시간에 개시된 ISP 치료(뇌졸중 발생으로부터 4.5시간의 뇌졸중 rtPA의 치료 윈도우에 대한 오직 FDA 승인된 치료와 비교하여)는 뇌졸중 동물의 생존율을 유의미하게 개선할 수 있었다(예를 들어, 도 2c 참조). 이것은 가능하게는 뇌졸중의 급성 단계 동안 뇌의 염증성 반응 및 종창 반응에 궁극적으로 대응하는 항-CSPG 효과의 효과로 인한다.

모든 생존한 마우스에서, 컴퓨터 모니터링된 자동화 오픈 필드 분석을 사용하여, 본 발명자들은 뇌졸중-후 ISP 치료가 다수의 매개변수에서 뇌졸중 후 2주 내지 4주에 뇌졸중 마우스에서 로코모터 기능을 유의미하게 증가시켰다는 것을 발견하였다(즉, 이동한 총 거리, 총 수평 활성 및 총 수직 활성; 각각 도 3a, 도 3b, 도 3c 참조).

뇌졸중 후 가장 흔한 기능 결핍이 대측성 상지의 운동 손상이고 인간 뇌졸중 생존자의 90% 초과가 감각 결핍을 경험함을 고려하면, 감각운동 행동 시험(즉, 접착제 테이프 제거 시험)에서 뇌졸중 마우스의 수행에 대한 뇌졸중-후 ISP 치료의 효과가 또한 조사되었다. 이 시험에서, 마우스는 이의 이환된 앞발 및 비이환된 앞발에 부착된 테이프의 조각을 제거할 필요가 있다. 데이터는 ISP 치료가 마우스가 이환된 사지에서 테이프를 제거할 수 있는(비이환된 사지에 대한 임의의 명확한 효과 없이) 속도를 유의미하게 개선하였다는 것을 보여주었다. 이것은 ISP 치료의 결과가 감각 기능 및 운동 기능에서 뇌졸중 유도된 결핍과 구체적으로 관련된다는 것을 나타냈다(도 4).

인지 감소는 또한 뇌졸중 생존자에서 장애의 주요 원인이다. 따라서, 뇌졸중 마우스에서의 인지 기능에 대한 ISP 치료의 효과가 또한 조사되었다. 반즈 미로 시험은 마우스에서 학습/기억 기능을 평가하도록 사용되었다. 데이터는 뇌졸중 후 4주에 ISP 치료된 마우스가 반즈 미로에서 탈출 홀을 발견하기 위한 상당히 더 적은 시간 및 더 적은 오류 실험을 사용한다는 것을 보여주었다(도 5a 참조).

이 데이터는 전신 ISP 치료가 일반 로코모터 기능, 특정 상지 감각운동 기능, 및 인지 기능을 포함하는 뇌졸중 마우스에서 기능 회복의 다수의 양태를 개선한다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 또한 ISP 치료가 뇌졸중 후 만성 뇌 위축을 감소시킨다는 것을 제안한다(도 5b 참조). 생존한 마우스에서의 급성 단계 생존율 및 만성 기능의 개선은 신경 손상 환자에 잠재적으로 이익일 수 있는 적어도 2의 가능한 기전을 제안하고, 이는 따라서 손상, 예컨대 악성 뇌졸중 후 생존율 둘 다를 촉진하고 손상 생존자에서 장기간 기능 회복을 향상시키는 매력적이고 표적화 가능한 경로를 제공한다.

손상의 시간에 대한 ISP 투여의 시기, 및 회복에 대한 상응하는 효과를 시험하기 위해, 성체 C57bl/6J 암컷 및 수컷 마우스는 상기 기재된 바대로 일시적 근위 MCAO 수술(35분)로 처리되었다. 동물은 치료의 개시 전 동물의 2개의 그룹에서 차이가 존재하지 않음을 보장하도록 뇌졸중-전 및 뇌졸중 후 7일에 기준치 행동 시험으로 처리되었다. 뇌졸중 후 7일에 개시된 ISP의 지연된 뇌졸중-후 치료의 효능은 SVZ 및 SGZ NSC가 활성화될 때인 시점에 시험되었다. 마우스는 연속 3주 동안 ISP(1 mg/kg/일) 또는 비히클을 매일 주사받는다. 오픈 필드 운동능력 시험 및 접착제 테이프 제거 시험은 뇌졸중 후 4주까지 주마다 수행되었다. 도 6a-6c는 지연된 ISP 치료 패러다임이 4주에 오픈 필드 운동능력 시험에서 다수의 매개변수(즉, 각각 총 거리, 수평 활성 및 수직 활성)에 대한 개선된 성능에서의 유의미한 효과를 제공한다는 것을 예시한다. 이것은 여기에 입증된 것처럼 뇌졸중-후 7일이 현재의 FDA-승인된 tPA 치료 윈도우보다 상당히 더 넓은 치료 윈도우를 제공하므로 상당한 임상 번역 영향을 갖는다.

마우스 뇌졸중 모델을 사용하여, ISP 치료는 손상에 원위인 위치에서 신경아세포 세포 형성 및 피질 척추로 축삭돌기 발아 둘 다를 향상시키는 것으로 또한 나타났다. 도 7a-7f 참조. 예시된 것처럼, 이 검정은 뇌졸중-후 ISP 치료가 뇌졸중-후 마우스에서 측뇌실 및 인접한 선조체 조직 둘 다의 근처에서 DCX+ 신경아세포를 향상시켰다는 것을 입증하였다. 뇌졸중 후 ISP 치료는 대측성 피질 척추로 부위로부터 축삭돌기 발아를 향상시켰다. 이는 대측성 피질로부터의 피질척추로 돌출을 증가시켜, 유도된 가소성 및 남은 신경 세포의 기전을 확립하는 뇌졸중-후 ISP 치료의 첫번째의 입증이다.

ISP 치료에 의해 유도된 신경 손상으로부터 상기 기재된, 이 현저한 기능 회복에 기초하는 기전을 추가로 조사하기 위해, 유도성 조건부 PTPσ 넉아웃 모델이 생성되었다. 도 1은 PTPσ의 세포 특이적 결실을 실행하기 위한 접근법을 도식적으로 예시한다. PTPσ 플록화된 마우스, 네스틴-CreERT2-PTPσ 조건부 넉아웃 마우스(신경 줄기 세포 특이적 cKO) 및 피질 뉴런 특이적 cKO(PTPσ 플록화된 마우스에서 AAV-hSyn-cre 바이러스 주사를 사용하여)가 생성되었다. 교배의 3세대 후, 네스틴-CreERT2-PTPσ 조건부 넉아웃 마우스(cKO)를 얻었다. cKO 마우스는 원하는 시간에 성체 NSC에서 PTPσ의 조건적 결실을 허용한다. 추가적으로, 이들 조건적 KO 마우스에서의 대측성 부위 또는 경색주변 부위로의 AAV-hSyn1-cre 주사는 본 발명자들이 대측성 부위 또는 경색주변 부위에서 성숙 발아 뉴런에서 PTPσ 유전자를 특이적으로 하게 한다.

조건적 KO 마우스는 예상된 멘델비로 태어났는데, 이는 플록화된 대립유전자가 유전자 재조합의 유도 없이 cKO 마우스의 정상 발생 및 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인시켜준다. 피질 뉴런 PTPσ 마우스는 PTPσ 플록화된 마우스에서 운동 및 체성감각 피질로 AAV-hSyn-cre 바이러스를 주사하여 생성되었다. 플록화된 대립유전자의 성공적인 표적화 및 대립유전자의 재조합은 AAV-hSyn-cre 주사된 마우스에서 NSC 특이적 cKO 및 피질 특이적 재조합에서 뇌 영역을 함유하는 성체 NSC에서 cKO 마우스에서 확인되었다(도 1, 도 8a-8f 및 도 9a-9h 참조).

도 8a-8f는 조건부 넉아웃 마우스가 신경생성에서의 CSPG-PTPσ 경로의 역할 및 뉴런 손상, 예컨대 뇌졸중 후 기능 회복에 대한 이의 기여의 연구를 허용한다는 것을 예시한다. 도 9a-9h는 조건부 넉아웃 마우스가 의도된 시간에 기존의 성숙 뉴런에서 유전자를 결실시키도록 경색주변 부위 및 대측성 피질 부위로 AAV-hSyn-cre를 주사하여 축삭돌기 발아 기전에 대한 PTPσ 조절의 효과의 연구를 허용한다는 것을 나타낸다. 이 모델에서 경색주위 주사 및 대측성 피질 주사는 근위 돌출(경색주위 뉴런 발아) 및 임의의 원위 돌출(대측성 피질 뉴런 발아)의 기여의 구별을 허용한다.

초기 결과가 ISP 치료가 경색 구역을 향해 이동하는 DCX+ 세포의 수를 향상시킨다는 것을 보여주므로(상기 기재된 도 7a-7f 참조), 야생형 또는 cKO PTPσ 마우스로부터의 SVZ NSC의 이동이 조사되었다. 성체 야생형 및 NSC-cKO 마우스 SVZ로부터, 성체 신경 줄기 세포(NSC) 신경구 배양이 확립되었다(도 10a). 이동 검정은 네스틴 (+) NSC가 CSPG를 생성한다는 것을 입증하였다(도 10b 및 도 10c). CSPG 스팟 검정에서, 야생형 NSC가 이전의 연구와 일치하여 CSPG 고리의 가장자리를 횡단하지 않는다는 것이 입증되었다(도 10d). 날카로운 비교에서, cKO NSC는 CSPG 고리의 외부 가장자리를 횡단할 수 있어서, cKO NSC에서 PTPσ 기능의 성공적인 폐지를 입증한다(도 10e).

또한, CSPG 유도된 PTPσ 신호전달은 성체 NSC에서 이동 및 신경돌기 성장을 조절하는 데 중요한 것으로 처음으로 입증되었다. 아그레칸 기질 코팅은 성체 NSC의 이동을 감소시키고, cKO NSC 세포에서의 PTPσ 유전자의 결실은 기준 수준(아그레칸 코팅 무) 하에 그리고 아그레칸 코팅에 의해 둘 다로 이동을 향상시켰다(도 11a-11e 참조). ISP에 의한 CSPG-PTPσ 경로의 약물학적 억제는 유전적 PTPσ 결실과 유사한 결과를 보여주었다(도 12a 및 도 12b 참조). 게다가, 성체 cKO NSC에서의 PTPσ의 유전적 결실 및 ISP 펩타이드에 의한 PTPσ의 약물학적 억제 둘 다는 분화된 NSC에서 지속적으로 증가된 신경돌기 증식으로 이어지는 반면, 스크램블링된 ISP 펩타이드는 효과를 갖지 않았다(도 13a-13c, 도 14a 및 도 14b 참조).

요약하면, PTPσ 조건부 넉아웃 마우스로부터 얻은 이 데이터는 성체 NSC를 포함하는 신경 손상 후 남은 신경 세포의 기본적인 생물학에서 PTPσ의 명확한 기능적 중요성을 입증하였다. 관찰된 기능은 뉴런 분화, 신경돌기 증식 및 이동을 포함하였고, 이는 기초 조건 하에 신경생성에, 및 손상, 예컨대 뇌졸중 후 가소성에 관여된 중요한 세포 기전이다. 중요하게는, 뇌졸중-후 심지어 7일에 개시된 ISP 치료가 기능 회복을 향상시키는 데 여전히 효과적이라는 것이 입증되었다. 이 결과는 뇌졸중 환자에서 급성 치료 윈도우(약물학적으로 6시간 및 수술로 24시간)를 지나 현재 이용 가능한 치료학적 치료가 없으므로 극도로 중요하다.

신경생성이 SCI에서 신경 복원에 대한 주요 기여자가 아니므로 CSPG-PTPσ 경로의 역할은 척수 손상(SCI) 모델에서 손상된 뉴런에서 이전에 보다 연구되었다. 그러나, 신경생성 및 DCX+ 신경아세포의 이동은 이제 뇌졸중 후 회복에 대한 기능적 기여를 하는 것으로 나타났다. 본 데이터는 성체 NSC에서의 PTPσ의 유전적 결실 및 ISP에 의한 PTPσ의 약물학적 억제가 새로 분화된 신경아세포에서의 신경돌기 증식 및 이들 세포의 이동 둘 다를 지속적으로 향상시킨다는 것을 나타낸다.

실시예

하기 실시예는 제한 없이 본 개시내용을 예시할 목적을 위해 제공된다.

실시예

본 개시내용의 다양한 실시형태의 실행을 위한 재료 및 방법

1. 동물

C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratory로부터 구입하고, Case Western Reserve University의 동물 시설에 수용하였다. 마우스는 12시간 광/암 주기로 유지되고 자유식으로 공급되었다. 모든 동물 프로토콜은 케이스 웨스턴 리저브 대학교(Case Western Reserve University)의 동물 윤리 통합 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 10-12주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 이 연구에 사용하였다.

2. 일시적 국소 허혈의 쥣과 모델

일시적 정중선 대뇌 동맥 폐색(tMCAO)은 실리콘 고무 코팅된 모노필라멘트(카탈로그 602212PK10Re 및 602312PK10Re, Doccol Corporation)로 45분 동안 왼쪽 MCA의 관내 폐색에 의해 수컷 C57BL/6 마우스(12주령, 25-30g)에서 유도되었다. 약술하자면, 마우스를 이소플루란으로 마취하였다. 체온을 모니터링하고 온혈동물 블랭킷 제어 유닛(Harvard apparatus)에 의해 37±0.5℃에서 유지시켰다. 동물의 통증을 최소화하기 위해, 마우스를 부프레노르핀으로 피하로 주사하였다. 두개관 위의 피부에서 정중선 절개를 하고, 마우스의 왼쪽 정수리 두개골(브레그마에 0.5 mm 후방 및 3.5 mm 측면)의 표면에서 가요성 마이크로팁을 고정하도록 피부를 측면으로 당겼다. 다음에, 마우스의 왼쪽 총경동맥(CCA), 외경동맥(ECA) 및 내경동맥(ICA)을 단리시키도록 정중선 목 절개가 이루어졌다. 실리콘 고무 코팅된 모노필라멘트는 ECA에서 동맥절개술을 통해 도입되고, Longa 방법에 따라 MCA의 기원을 향해 ICA를 통해 천천히 진행하였다. MCA의 일관되고 성공적인 봉쇄를 보장하도록, 구역상 뇌 혈류는 레이저 도플러(Laser Doppler) 유량계(PeriFlux system 5000, 스웨덴 페리메드)에 의해 모든 뇌졸중 동물에서 모니터링되었다. 절개 밀봉 후, 마우스에 1 ml의 따뜻한 식염수를 피하로 주고, 회복될 때까지 가열된 동물 집중 치료실에 두었다.

3. 자기 공명 영상화(MRI)

경색 부피는 뇌 허혈의 유도 후 23시간에 3-cm 버드케이지 코일(Bruker Inc., 매사추세츠주 빌레리카)로 수평 biospec 9.4T 스캐너를 사용하여 측정되었다. MRI 스캐닝 절차 동안, 마우스를 1.5% 이소플루란/산소 혼합물로 마취시키고, 복와위로 크레이들에 넣었다. 마우스의 체온은 피드백 제어 시스템(SA Instruments, 뉴욕주 스토니 브룩)을 통해 스캐너로 따뜻한 공기를 취입하여 33℃에서 유지되었다. 호흡수는 또한 실험 동안 모니터링되었다. 허혈성 부종 부피를 정량화하기 위해, 다중-슬라이스, T2 가중, 축 영상은 하기 매개변수로 완화 향상을 갖는 신속 획득(RARE: rapid acquisition with relaxation enhancement) 순서를 사용하여 획득되었다: TE/TR, 15/2000 ms; RARE 인자, 8; NAV, 4; 매트릭스 크기, 256x256; 슬라이스 두께, 1mm; 슬라이스의 수, 13; 관측 시야, 2.4x2.4 cm. 영상 재구성 및 분석은 인하우스 개발된 MATLAB 기반 소프트웨어(Natick, 미국 매사추세츠주)를 사용하여 수행되었다. 허혈성 부종 부피 및 뇌 조직의 ROI는 T2 가중 영상으로부터 그려진다. 결과적으로, 허혈성 경색 부피의 백분율은 하기 식으로 계산되었다: ∑ (대측성 면적 － 동측성 비경색 면적)/∑대측성 면적 X 100%.

4. 펩타이드 제조

펩타이드를 98% 초과의 순도로 CS-Bio(미국 캘리포니아주)로부터 구매하였다. 동결건조된 펩타이드를 무균 수에 용해시키고, 사용까지 -80℃에서 저장하였다. 펩타이드 서열은 하기와 같다:

ISP: GRKKRRQRRRCDMAEHMERLKANDSLKLSQEYESI(서열 번호 62)

스크램블링된 ISP(SISP): GRKKRRQRRRCIREDDSLMLYALAQEKKESNMHES(서열 번호 63)

5. 전신 펩타이드 치료

처음에, 10% DMSO의 비히클 용액(23.73 ml의 무균 식염수 중의 1.25 ml의 DMSO)은 각각의 마우스에 대해 제조되었다. 다음에, 적절한 ISP 펩타이드는 비히클 용액에 첨가되고, 1.5 ml의 Eppendorf 튜브(각각 단일 마우스의 매일의 용량에 상응함)에 분취되고, -80℃에서 동결되었다. 최종 ISP 펩타이드 농도는 0.3 μg/μl였다. MRI 스캐닝 후, 허혈성 마우스는 뇌졸중 손상의 크기에 따라 2개의 동등하게 분포된 그룹으로 무작위로 그룹화되었다. 허혈후 24시간에 그리고 이후 6주 동안 오후 마다, 마우스를 ISP(30 μg/일, 100 μl) 또는 비히클(식염수 중의 5% DMSO, 100 μl)로 피하로 주사하였다. 실험을 맹검 방식으로 수행하였다.

6. 뇌졸중 동물에서의 뇌 위축의 정량화

뇌졸중-후 6주 뇌 절편(25 μm)을 PLL-코팅된 슬라이드에 탑재하였다. 절편을 10분 동안 KH₂PO₄ 완충액(pH 4.5)에서 재수화하고, 이후 42℃에서 30분 동안 예열 10% Giemsa 용액에서 염색하였다. KH₂PO₄ 완충액에 의한 간단한 세정 후, 절편을 무수 에탄올 중에 탈수시키고, 자일렌에서 깨끗하게 하고, Histoseal로 탑재하였다. 연속 절편의 세트는 Path Scan Enabler IV 슬라이드 스캐너에 의해 영상화되었다. 대측성 및 동측성 뇌 면적은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다. 위축률의 계산식은 하기와 같다: ∑ (대측성 뇌 면적 － 동측성 뇌 면적) /∑대측성 뇌 면적 X 100%.

7. 축삭돌기 발아의 전방 트레이싱 및 정량화

tMCAO 후 4주에, 마우스를 1.5% 이소플루란/산소 혼합물로 마취시키고, 정위 프레임에서 안정화시켰다. 1.5 μl의 비오틴 덱스트란 아민(BDA, MW10,000; PBS 중의 10%, invitrogen)은 손상반대측 피질에서 3개의 부위에서 주사되었다(좌표: 1. A/P 0.0 mm, M/L -2mm, D/V -1 mm; 2.A/P 0.5 mm, M/L -1.5 mm, D/V -1 mm; 3. A/P 0.5 mm, M/L -2 mm, D/V -1 mm,). 2주 후, 뇌 및 경부 척수는 PBS, 이어서 4% 파라포름알데하이드에 의한 심장 관류 후 수확되었다. 밤새 4% 파라포름알데하이드에서의 후고정 및 20% 및 30% 수크로스에서의 한랭보호 후, 두정 뇌 절편 및 횡단 척수 절편을 30 μm 두께에서 절단하였다. BDA의 검출을 위해, 절편을 0.1M PB에 세정하고, 30분 동안 0.3% H2O2에서 항온처리하여 내인성 퍼옥시다아제를 불활성화한 후, Vectastain ® ABC 키트(Vector Laboratories, 미국 캘리포니아주 벌링게임)에 의해 2시간 동안 항온처리하였다. 염색은 2,3' 디아미노벤지인 테트라하이드로클로라이드(0.1 M PB 중의 0.5 mg/ml)로 전개되었다. 정중선-횡단 BDA+ 섬유의 수 및 길이는 맹검 방식으로 평가되었다. ImageJ 소프트웨어에 의해 절편을 분석하였다.

8. 신경행동 검정

모든 행동 시험은 맹검 방식으로 광 단계 동안 수행되었다. 스트레스를 감소시키기 위해, 마우스는 시험 시작 전 1시간에 행동 시험 룸에 적응되었다. 마우스 사이의 본능적인 냄새를 피하기 위해 모든 장치를 75% 에탄올로 세정하였다.

8.1 로코모터 기능

마우스 운동 활성은 이전에 기재된 바대로 tMCAO 전일에 및 이후 3일, 7일, 14일, 21일, 35일 및 42일에 Accuscan 활성 모니터(미국 오하이오주 콜롬버스)를 사용하여 평가되었다. 이 모니터에 16개의 수평 적외선 센서 및 8개의 수직 적외선 센서(간격 2.5 cm)가 있다. 각각의 마우스를 1시간 동안 음식 및 물을 공급하며 42x42x31 cm Plexiglas 오픈 박스에 넣었다. 관찰자 편향을 피하기 위해, 이 로코모터 시험은 컴퓨터 및 소프트웨어에 의해 자동 모니터링되었다. 로코모터 활성은 자동화 Versamax 소프트웨어(Accuscan, 미국 오하이오주 콜럼버스)에 의해 계산되었다. 하기 변수를 측정하였다: (A) 수평 활성(수평 센서에서 발생한 빔 중단의 전체 수); (B) 이동한 총 거리(cm, 동물이 이동한 거리); (C) 수직 활성(수직 센서에서 발생한 빔 중단의 전체 수).

8.2 반즈 미로 시험

허혈성 마우스의 공간 기억은 tMCAO 후 28일에 반즈 미로를 사용하여 검사되었다(Stoelting Company, 미국 일리노이주 우드데일). 미로는 주연부에 걸쳐 20개의 홀로 91.5 cm 직경 원형 플랫폼으로 이루어진다. 마우스는 취입 팬 및 플랫폼 위의 밝은 광에 의해 목적 없이 주위에 빈둥거리지 못하게 했다. 0일에, 마우스는 출발 챔버를 제거한 후 표적 홀에 들어가도록 온화하게 가이드되었다. 1일에, 마우스는 목표 홀 하에 위치한 탈출 터널을 발견하도록 2 세션에서 4개 실험에 대해 훈련되었다. 마우스가 목표 홀에 들어가면, 홀을 커버하고, 마우스는 2분 동안 이것에 머물도록 허용되었다. 마우스가 5분 내에 목표 홀에 위치하지 않을 수 있으면, 마우스는 관찰자에 의해 목표 홀에 들어가도록 가이드되었다. 2일에, 마우스가 목표 홀에 위치하지 않을 때 마우스가 목표 홀에 들어가거나 5분에 종료할 때까지 하나의 실험이 실행되고 비디오 테이프 녹화되었다. 탈출 홀을 배치하는 데 걸린 시간 및 마우스에 의해 이루어진 은폐 홀을 발견하는 것에서의 오차 수는 맹검 방식으로 관찰자에 의해 측정되었다.

8.3 접착제 제거 시험

이 시험은 감각운동 결핍을 조사하도록 뇌졸중-후 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일에 수행되었다. 각각의 마우스를 1분의 습관화 기간 동안 투명 실린더(15 cm 직경)에 넣었다. 이후, 2개의 상이한 유색 접착제 라벨(펀칭하여 제조된 2.5 mm 직경, Tough Spots)을 각각의 마우스의 앞발에 동일한 압력으로 도포하였다. 접착제 라벨을 제거하는 데 필요한 시간은 최대 2분으로 측정되었다. 성능의 최적 수준을 달성하기 위해, 마우스는 수술 전 4일 동안 훈련되어야 한다.

9. 신경 줄기 세포 배양

1차 줄기 세포는 5주령에 C57BL/6J 마우스로부터 수득되었다. 안락사 후, 전뇌를 즉시 수확하고, 뇌실하대(SVZ) 조직을 얻도록 현미경 하에 절개하였다. 스탭 나이프에 의한 기계적 해리 후, 조직 단편은 트립신을 사용하여 가공되고, 성장 인자(표피 성장 인자 및 염기성 섬유모세포 성장 인자)(NBM-GF)를 갖는 신경기준 배지에서 10⁴개의 세포/cm²의 밀도로 개별 세포로서 재현탁되었다. 세포의 후속하는 계대배양은 세포가 생존가능 라인을 확립할 때까지 7일마다 accutase®(innovative #AT-104, 미국 캘리포니아주)를 사용하여 수행되고, 세포 부스러기는 각각의 계대배양 후 자연히 감소하였다. 각각의 계대배양의 4일에, 증식하는 구는 NBM-GF와 공급되었다. 본 발명자들은 이 연구에서 계대배양 P3-P8에서 신경구를 사용하였다.

10. CSPG 구배 횡단 검정

CSPG 구배는 이전에 기재된 바대로 커버슬립에서 제조되었다. 간단히, 24웰 유리 커버슬립을 폴리-L-리신 및 니트로셀룰로스, 및 커버슬립에 스팟팅된 700 ug/ml의 아그레칸(A1960)과 10 ug/ml의 Laminin(11243217001, Sigma)의 혼합물로 코팅하였다. 건조 후, 코팅된 커버슬립을 이후 37℃에서 3시간 동안 라미닌과 항온처리하였다. 형질주입된 신경 줄기 세포를 10⁴개의 세포/커버슬립의 밀도로 플레이팅하고, NBM-GF 배지에서 배양하였다. 7일 후, 웰을 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 염색까지 4℃에서 인산염 완충 식염수에서 저장하였다.

11. CSPG에서의 신경 줄기 세포의 이동

시험관내 신경 줄기 세포의 이동에 대한 CSPG의 효과를 결정하기 위해, 평평-바닥 48웰 플레이트를 처음에 밤새 폴리-L-리신으로 코팅된 후, 물로 세정하였다. 아그레칸(A1960, sigma)을 밤새 무균수에서 희석된 1 ug/ml 및 10 ug/ml의 농도로 48웰 플레이트에 코팅한 후, 물로 세정하였다. 대조군 웰은 폴리-L-리신 단독을 함유하였다. 동일한 크기의 신경구는 각각의 웰에서 2.5 μM ISP 펩타이드 또는 스크램블 펩타이드(조건당 7웰에서 n=7 신경구)를 갖는 NBM-GF 배지에서 시딩되고, 플레이트를 37℃에서 21시간 동안 항온처리하였다. 이후, Leica DMi8 광시야 현미경을 사용하여 각각의 웰의 영상을 취했다. 이동 활성은 신경구의 총 면적을 신경구의 내부 면적으로 나눈 것으로 정의된다. 신경구의 내부 부위 및 전체 부위는 ImageJ 소프트웨어에 의해 측정되었다. 거리 측정은 맹검 방식으로 관찰자에 의해 수행되었다.

12. 신경 줄기 세포 분화 검정

간단히, 비처리된 24웰 플레이트에서 유리 커버슬립을 폴리-오르니틴 및 라미닌으로 코팅하였다. 계대배양 동안 신경구를 분할한 후, 개별 세포를 500 μl의 NBM-GF에서 10⁴개의 세포/cm²의 밀도로 플레이팅하였다. 격일로, 250 μl의 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 300 μl의 새로운 NBM-GF를 첨가하였다. 부착된 세포가 대략 70% 포화상태에 도달할 때(대략 5일), 각각의 웰 내의 모든 NBM-GF는 온화하게 제거되고, ISP 펩타이드(2.5 μM) 또는 스크램블 펩타이드(2.5 μM)를 갖고 성장 인자(NBM)가 없는 신경기본 배지로 즉시 대체되었다. 각각의 웰은 250 μl의 배지를 제거하고 ISP 또는 스크램블 펩타이드를 함유하는 300 μl의 배지를 첨가하여 매일 공급되었다. NBM-GF의 완전한 대체 후 5일에, 웰을 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 염색까지 4℃에서 인산염 완충 식염수에서 저장하였다.

13. 면역조직화학

마우스는 아베르틴으로 마취되고, PBS 및 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 관류되었다. 뇌를 절개하고, 4℃에서 밤새 4% PFA에서 후고정하고, 20% 수크로스 및 30% 수크로스에서 평형화시켰다. 25 μm 두께의 절편을 1시간 동안 4% BSA/0.3% Triton-x100에서 항온처리하였다. 절편을 차단 후 4℃에서 밤새 1차 항체, 이어서 Alexa fluorescence 488 또는 594와 접합된 적절한 2차 항체와 항온처리하였다. 하기 1차 항체를 사용하였다: 5-HT(1:500, Immunostar, 위스콘신주 허드슨) 및 CS56(1:500, C8035, Sigma). 각각의 염색에 대해, 적어도 3마리의 개별 동물/그룹을 조사하고, 형광 현미경에 의해 영상을 포착하였다. 염색은 Image J 소프트웨어(미국 국립 보건원, 미국)를 사용하여 정량화되었다.

14. 면역세포화학

커버슬립에서 배양된 세포를 15분 동안 4% PFA에 고정하고, 10분 동안 0.1% Triton-X100으로 투과시키고, 이후 1시간 동안 10% 정상 염소 혈청에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 4℃에서 밤새 희석된 1차 항체, 이어서 Alexa Fluor 488 또는 594와 접합된 적절한 2차 항체 염소 항-마우스 또는 항-토끼 IgM 또는 IgG(1:1000, Invitrogen)에서 항온처리되었다. 유리 커버슬립을 Mowiol 함유 DAPI(Sigma, 미국 세인트 루이스)에서 현미경 슬라이드에 탑재하였다. 하기 1차 항체를 사용하였다: MAP2(1:500, AB5622, Millipore), 네스틴(1:500, NB100-1604, Novus) 및 CS56(1:500, C8035, Sigma). 3개의 커버슬립을 조건마다 분석하였다. 각각의 커버슬립에서의 필드의 랜덤 선택은 Stereo Investigator 소프트웨어(MBF Bioscience, 미국 버몬트주 윌리스톤)에 의해 선택되고 영상화되고, 정량적 데이터는 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다.

15. 통계 분석

모든 연구는 맹검 방식으로 GraphPad Prism 6.00 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 기재된다. 통계 유의성은 p < 0.05에서 설정되었다. 통계 분석은 2-꼬리 비결합 스튜던트 t 시험, 1방향 또는 1방향 ANOVA와 Tukey 다중 비교 시험에 의한 사후 분석, Dunnett 다중 비교 시험, 또는 Sidak 다중 비교 시험에 의해 수행되었다. 통계 시험은 샘플 크기를 미리 결정하도록 사용되지 않았지만, 본 발명자들의 샘플 크기는 필드에서 일반적으로 사용되는 것과 유사하다.

예시적인 실시형태가 예시되고 기재되어 있지만, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 여기에 다양한 변화가 이루어질 수 있다고 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR INDUCING NEURAL PLASTICITY <130> CWR-026868WO ORD <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Xenopus borealis <400> 1 Asp Leu Ala Glu His Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 Ser Gln Glu Tyr Glu Ser 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Anolis carolinensis <400> 2 Asp His Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 3 Glu Leu Ala Glu His Thr Glu Leu Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Oreochromis aureus <400> 4 Glu Leu Ala Glu His Thr Glu Leu Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 5 Glu Leu Ala Glu His Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Fringilla coelebs <400> 6 Glu Leu Ala Glu His Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Ornithorhynchus anatinus <400> 7 Glu Leu Ala Glu His Thr Asp His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Sarcophilus harrisii <400> 8 Glu Met Ala Glu His Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Mustela putorius <400> 9 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Galago alleni <400> 10 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <213> Callithrix aurita <400> 11 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 12 <211> 24 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 12 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Asp Met Ala Glu His Met Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 14 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Sus barbatus <400> 15 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Bos primigenius <400> 16 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 17 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Orcinus orca <400> 18 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Saimiri sciureus <400> 19 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Papio hamadryas <400> 20 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 21 <211> 24 <212> PRT <213> Gorilla gorilla <400> 21 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 22 <211> 24 <212> PRT <213> Hylobates lar <400> 22 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 23 <211> 24 <212> PRT <213> Macaca radiata <400> 23 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 24 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 26 <211> 24 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 26 Asp Leu Ala Asp Asn Ile Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Gly Leu Lys 1 5 10 15 Phe Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 27 Glu Leu Ala Asp His Ile Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys 1 5 10 15 Phe Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 <210> 28 <211> 24 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 28 Lys Leu Glu Glu Glu Ile Asn Arg Arg Met Ala Asp Asp Asn Lys Ile 1 5 10 15 Phe Arg Glu Glu Phe Asn Ala Leu 20 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Asp Met Ala Glu His Thr Glu Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Asn Asp Ser 1 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 1 5 10 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa is T or M <400> 32 Glu His Xaa Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 33 Asp Met Ala Glu His Xaa Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 35 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa isany amino acid residue <400> 35 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Ser Gln Glu Tyr Glu 20 25 30 Ser <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 36 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp His Thr Glu His 1 5 10 15 Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr Glu Ser Ile 20 25 30 <210> 37 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 37 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Glu Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Leu Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 38 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 38 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Glu Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Leu Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 39 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 39 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Glu Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 40 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 40 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Glu Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 41 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 41 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Glu Leu Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Asp His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 42 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 42 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Glu Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu His Leu Lys Ala Asn Asp Asn Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 43 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 43 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 44 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 44 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 45 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 45 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 46 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 46 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 47 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 47 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Met Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 48 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 48 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 49 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid <400> 49 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 50 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 50 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 51 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 51 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 52 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 52 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 53 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 53 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 54 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 54 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 55 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 55 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 56 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 56 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 57 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 57 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 58 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 58 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 59 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 59 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 60 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 60 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Glu His Xaa Glu Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu 20 25 <210> 61 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Xaa is any amino acid residue <400> 61 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Xaa Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser 20 25 <210> 62 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Cys Asp Met Ala Glu His 1 5 10 15 Met Glu Arg Leu Lys Ala Asn Asp Ser Leu Lys Leu Ser Gln Glu Tyr 20 25 30 Glu Ser Ile 35 <210> 63 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Cys Ile Arg Glu Asp Asp 1 5 10 15 Ser Leu Met Leu Tyr Ala Leu Ala Gln Glu Lys Lys Glu Ser Asn Met 20 25 30 His Glu Ser 35

Claims

신경 손상 후 남은 신경 세포의 보상성 가소성(compensatory plasticity)을 촉진하는 방법으로서,
남은 신경 세포를 치료학적 펩타이드를 포함하는 치료제의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 32에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 남은 신경 세포는 신경 줄기 세포인, 방법.
제1항에 있어서, 남은 신경 세포는 희소돌기 전구 세포(OPC: oligodendrocyte progenitor cell) 및/또는 신경교 전구체 세포(GPC: glial precursor cell)를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 남은 신경 세포는 뉴런인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드는 남은 신경 세포의 보상성 신경돌기 증식을 유도하는, 방법.
제5항에 있어서, 신경돌기 증식은 남은 신경 세포의 축삭돌기 발아를 포함하는, 방법.
제5항에 있어서, 신경돌기 증식은 남은 신경 세포의 가지돌기 발아 또는 분지를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드는 신경 손상을 향한 남은 신경 세포의 보상성 이동을 유도하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 손상은 중추 신경계에 있는, 방법.
제9항에 있어서, 신경 손상은 뇌에 있는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 손상은 외상성 뇌 손상(TBI: traumatic brain injury), 다발성 경화증(MS: multiple sclerosis), 알츠하이머병, 허혈, 뇌졸중, 동맥류, 뇌출혈, 혈전 또는 색전증에 의해 생기는, 방법.
제11항에 있어서, TBI는 뇌진탕인, 방법.
제11항에 있어서, 허혈은 국소 허혈 또는 전체 허혈인, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열은 서열 번호 32에 대해 적어도 78%, 적어도 85%, 또는 적어도 92%의 동일성을 갖는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 펩타이드는 다른 아미노산에 대해 서열 번호 32의 4번, 5번, 6번, 7번, 9번, 10번, 12번 또는 13번 잔기 중 적어도 하나의 아미노산의 치환을 포함하고, 아미노산 잔기 4E는 D 또는 Q로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 5R은 H, L 또는 K로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 6L은 I, V 또는 M으로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 7K는 R 또는 H로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 9N은 E 또는 D로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 10D는 E 또는 N으로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 12L은 I, V 또는 M으로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 13K는 R 또는 H로 치환되는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 1-25 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 치료학적 펩타이드에 연결된 운반 모이어티를 추가로 포함하고, 세포에 의한 치료학적 펩타이드의 흡수를 수월하게 하는, 방법.
제17항에 있어서, 운반 모이어티는 HIV Tat 운반 모이어티인, 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 운반 모이어티는 펩타이드 링커에 의해 치료학적 펩타이드에 연결된, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 서열 번호 35-61로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 남은 신경 세포는 손상 후 7일 내에 치료제와 접촉하는, 방법.
치료를 필요로 하는 대상체에서 신경 손상을 치료하는 방법으로서,
치료학적 펩타이드를 포함하는 치료제의 유효량을 대상체에게 투여하여 신경 손상 후 남은 신경 세포의 보상성 가소성을 촉진하는 단계를 포함하고, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 32에 대해 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 남은 신경 세포는 신경 줄기 세포인, 방법.
제22항에 있어서, 남은 신경 줄기 세포는 희소돌기 전구 세포(OPC) 및/또는 신경교 전구체 세포(GPC)를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 남은 신경 세포는 뉴런인, 방법.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드는 남은 신경 세포에서의 보상성 신경돌기 증식을 유도하는, 방법.
제26항에 있어서, 신경돌기 증식은 남은 신경 세포에서의 축삭돌기 발아를 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 신경돌기 증식은 남은 신경 세포에서의 가지돌기 발아 또는 분지를 포함하는, 방법.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드는 신경 손상을 향한 남은 신경 세포의 보상성 이동을 유도하는, 방법.
제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 손상은 중추 신경계에 있는, 방법.
제30항에 있어서, 신경 손상은 뇌에 있는, 방법.
제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 손상은 외상성 뇌 손상(TBI), 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병, 허혈, 뇌졸중, 동맥류, 뇌출혈, 혈전 또는 색전증에 의해 생기는, 방법.
제34항에 있어서, TBI는 뇌진탕인, 방법.
제34항에 있어서, 허혈은 국소 허혈 또는 전체 허혈인, 방법.
제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열은 서열 번호 32에 대해 적어도 78%, 적어도 85%, 또는 적어도 92%의 동일성을 갖는, 방법.
제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 펩타이드는 다른 아미노산에 대해 서열 번호 32의 4번, 5번, 6번, 7번, 9번, 10번, 12번 또는 13번 잔기 중 적어도 하나의 아미노산의 치환을 포함하고, 아미노산 잔기 4E는 D 또는 Q로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 5R은 H, L 또는 K로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 6L은 I, V 또는 M으로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 7K는 R 또는 H로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 9N은 E 또는 D로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 10D는 E 또는 N으로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 12L은 I, V 또는 M으로 치환되고/되거나, 아미노산 잔기 13K는 R 또는 H로 치환되는, 방법.
제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 펩타이드는 서열 번호 1-25 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 치료학적 펩타이드에 연결된 운반 모이어티를 추가로 포함하고, 세포에 의한 치료학적 펩타이드의 흡수를 수월하게 하는, 방법.
제38항에 있어서, 운반 모이어티는 HIV Tat 운반 모이어티인, 방법.
제38항 또는 제39항에 있어서, 운반 모이어티는 펩타이드 링커에 의해 치료학적 펩타이드에 연결된, 방법.
제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 서열 번호 35-61로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제22항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 남은 신경 세포는 손상 후 7일 내에 치료제와 접촉하는, 방법.
제22항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 또는 다른 비인간 포유류인, 방법.
제22항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 대상체에게 전신으로, 척추강내로 또는 유리체내로 투여되는, 방법.