PT2017095250B

PT2017095250B - Peptídeos inibidores da bace1 para o tratamento de doenças neurológicas

Info

Publication number: PT2017095250B
Application number: PT201050011A
Authority: PT
Inventors: Emanuela Castro E Santos Armanda; Maria Branco De Matos Costa Resende Rosa; Maria Fragão Pereira Cláudia; Ferreira Marques Marisa; Carmo Pimenta Dinis Silva Teresa
Original assignee: Univ De Coimbra
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2021-08-06
Also published as: WO2017095250A1

Abstract

0 presente pedido diz respeito a peptideos desenhados para inibir a enzima que cataliza a clivagem da proteína beta amilóide, capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica e sem efeitos tóxicos. Adicionalmente, refere-se uma nova metodologia para inibir a enzima BACE1 com compostos peptidérgicos. Os peptideos serão incorporados em formas farmacêuticas e utilizados no tratamento da doença de Alzheimer e noutros distúrbios neurológicos, tais como a doença de Parkinson, demência vascular, demência com corpos de Lewy, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down, traumatismo craniano e acidente vascular cerebral.

Description

DESCRIÇÃO

PEPTÍDEOS INIBIDORES DA BACE1 PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEUROLÓGICAS

Campo técnico presente pedido refere-se a novos inibidores da enzima que cataliza a clivagem do peptideo beta amilóide (BACE, protease aspártica beta-secretase transmembranar, enzima que cataliza a clivagem da APP no local beta, memapsina2, BACE-1, EC 3.4.23.46), a formas farmacêuticas para os incorporar, a uma nova metodologia para inibir a BACE1, e à sua utilização no tratamento da doença de Alzheimer (DA) e em outros distúrbios neurológicos, como doença de Parkinson, Demência Vascular, Demência com corpos de Lewy, Esclerose Lateral Amiotrófica, Síndrome de Down, Traumatismo Craniano e Acidente Vascular Cerebral. Estas situações patológicas apresentam depósitos amilóides ou atuam como fator de risco para a doença de Alzheimer.

Estado da arte

A demência afeta um número crescente de indivíduos, principalmente com idades superiores a 60 anos. Prevê-se que, em 2050, o número de indivíduos afetados seja superior a 100 milhões. A doença de Alzheimer (DA) é a demência mais comum em todo o mundo. É uma doença neurodegenerativa, crónica, do sistema nervoso central (especificamente do cérebro) que impede uma vivência normal, uma vez que afeta funções cognitivas como a memória de curto prazo, a atenção e a linguagem. Os pacientes frequentemente apresentam também problemas de comportamento. As lesões neuropatológicas são as placas amilóides, constituídas por agregados de peptideo betaamilóide fibrilar (Αβ) , e as tranças neurofibrilares compostas essencialmente de proteína tau anormal que estão associadas a muitos distúrbios neurológicos comumente chamados de tauopatias (Karren et al. , 2011; Selkoe 2011) . As placas amilóides são exclusivas da DA, no entanto, foi já descrita a presença de Αβ no cérebro de pacientes afetados por outras condições neurológicas, nomeadamente, doença de Parkinson, Demência Vascular, Demência com corpos de Lewy, Esclerose Lateral Amiotrófica e síndrome de Down.

É geralmente aceite, que a acumulação de Αβ no parênquima cerebral representa um acontecimento precoce numa cascata de eventos que termina em neurodegenerescência e demência, pelo que, o peptideo Αβ é considerado o agente etiológico da doença (Karren et al., 2011; Selkoe 2011; Yan & Vassar 2014) . O peptideo Αβ tem sido referido como o responsável pela hiperfosforilação da tau, que está na base da formação das tranças neurofibrilares. A formação de Αβ requer a clivagem sequencial da proteína precursora βamilóide (APP) pelas enzimas β-secretase (BACE-1) e γ-secretase. Normalmente, dependendo do local de clivagem catalizada pela γsecretase, a partir do C-terminal, o peptideo Αβ pode ter entre 39-43 aminoácidos de comprimento (Karren et al., 2011) . Estes peptídeos têm uma forte propensão para adotar estruturas em folha beta e para oligomerizar e formar agregados insolúveis de proteína. Ο Αβ40 é o produto predominante do processamento da APP pela via amiloidogénica, mas ο Αβ42 tende a oligomerizar e agregar mais rapidamente e é a principal forma de Αβ ligada à patogénese da DA, levando à perda sináptica e neuronal. A APP também é clivada pela α-secretase, no entanto, não se forma Αβ uma vez que a clivagem ocorre entre os resíduos 16-17 resultando em peptídeos não amiloidogénicos.

A BACE1 é a única β-secretase no cérebro e atua na etapa limitante da formação de Αβ (Ohno et al., 2004; Vassar et al., 2009; Luo e Yan, 2010; De Strooper et al., 2010; Yan & Vassar, 2014) . Do ponto de vista do desenvolvimento de fármacos, a BACE1 tem a vantagem de ser uma entidade molecular única enquanto a γ-secretase é constituída por múltiplas subunidades com um alto grau de heterogeneidade (De Strooper et al., 2010) . A BACE1 é uma protease aspártica transmembranar tipo 1, que se localiza preferencialmente em compartimentos intracelulares ácidos, como na rede trans do complexo de Golgi e nos endossomas, onde cliva a APP, também ela uma proteína transmembranar tipo 1 (Karren et al. , 2011; Selkoe 2011; Yan e Vassar 2014) . A BACE2, é uma proteína homóloga que partilha 59% de homologia com a BACE1 mas tem uma especificidade de clivagem diferente, clivando a APP preferencialmente dentro da região Αβ e originando peptideos não amiloidogénicos. É interessante realçar que uma redução de 50% da expressão do gene que codifica a BACE1 mostrou diminuir a deposição de Αβ no cérebro de camundongos PDAPP. Bacel + /-, bem como proteger contra défices sinápticos, sem comprometer a função cerebral normal (McColongue et al. 2007) . Também, a recentemente identificada variante Ala673Thr APP, que é clivada menos eficientemente pela BACE1, confere proteção contra a DA e o declínio cognitivo em idosos. Verificou-se que indivíduos que têm uma cópia da mutação Ala673Thr apresentam uma diminuição de cerca de 20% na produção de Αβ (Jonsson et al. , 2012; Yan & Vassar 2014), evidenciando que não é necessário uma forte inibição da BACE1 para prevenir a DA. Assim, uma estimativa cuidadosa da dose de um potencial inibidor da BACE1 permite a diminuição na produção de Αβ e minimiza os efeitos adversos.

Apesar dos esforços da comunidade científica para a compreensão da DA, não existe ainda uma terapia eficaz para a combater (Karran et al. , 2011; Selkoe 2011) . Embora vários fármacos estejam comercialmente disponíveis, eles só oferecem melhorias sintomáticas sem impedir a progressão da doença. Assim, uma terapia bem-sucedida terá um impacto enorme no ónus pessoal, económico e social desta doença.

A enzima BACE1 é um alvo crucial na DA (Li et al. , 2004; Zetterberg et al., 2008; De Strooper et al. , 2010; Luo e Yan, 2010; Karran et al. , 2011; Selkoe, 2011; Yan e Vassar, 2014) . Neste pedido de patente, divulgamos novos inibidores peptídicos da BACE1 que compreendem um peptídeo ativo e um peptídeo de penetração celular (CPP) . Os peptideos de penetração celular são sequências de aminoácidos utilizadas como transportadores de outras moléculas ou compostos farmacologicamente ativos denominados cargoes . A sequência TAT (48-57) (TAT de transativador de transcrição) é um CPP enriquecido em resíduos carregados positivamente que corresponde ao domínio responsável pelas propriedades de penetração celular da proteína TAT. A carga positiva do peptídeo

TAT é crucial para promover a internalização celular independente de recetor, principalmente pela via endocitica (Chauhan et al., 2007; Jarver et al., 2010) . A captação de um fármaco por endocitose assume uma relevância particular dentro do contexto de uma terapia para a DA que visa a BACE1, uma vez que esta protease se localiza preferencialmente em compartimentos acidicos tais como os endossomas. Além disso, a ativação da endocitose é um evento especifico e precoce na forma esporádica da DA, portanto, o uso da TAT permite um aumento da captação e da eficácia celular do composto na forma mais comum da DA (Cataldo et al. , 2000) . A capacidade da TAT de translocar a membrana plasmática permite a passagem através da barreira hematoencefálica (BHE) e a entrega da carga ao citoplasma das células (Aarts et al., 2002; Borsello et al. , 2003; Chauhan et al. , 2007; Taghibiglou et al. , 2009; Ittner et al., 2010; Jarver et al., 2010; Tu et al., 2010; Cook et al., 2012; Bach et al., 2012; Plattner et al., 2014) .

A estabilidade dos sistemas peptideo ativo e peptideo de penetração celular, ín vivo, pode ser comprometida pela ação de enzimas proteoliticas. Para ultrapassar a degradação proteolitica, as sequências peptidicas apresentadas neste pedido podem incluir Daminoácidos na sua composição. Frequentemente, é usada a sequência retroinversa (RI) com D-aminoácidos do peptideo nativo (Borsello et al. , 2003; Snyder et al., 2004; Michod et al., 2009; Vaslin et al., 2011) . Esta estratégia de dupla inversão da estrutura peptidica aumenta a estabilidade e, consequentemente, a meia-vida dos peptideos biologicamente ativos, o que permite uma diminuição da frequência de administração do fármaco (Michod et al., 2009).

Vários inibidores da BACE1 foram desenvolvidos durante a última década (Chang et al. , 2004; Hussain et al. , 2007; Gosh et al. , 2008; Fukomoto et al., 2010; Chang et al., 2011; May et al., 2015; Thakker et al. , 2015) e US 2011/0275619 Al, US 2006/0063717 Al, WO2011 / 119465, EP 0692490 Bl, EP 2172208 Al, WO2009 / 131974 Al) , principalmente moléculas pequenas ou peptideos estruturalmente distintos dos do presente pedido. Além disso, ao contrário das moléculas do presente pedido, estes inibidores de BACE1 não estão acoplados a um peptideo de penetração celular. De um modo geral, essas moléculas apresentam uma fraca biodisponibilidade oral, potência, seletividade e dificuldade em atravessar a barreira hemato-encef álica, o que faz com que rapidamente se considerem inadequados. Atualmente, não há nenhum inibidor da BACE1 em uso clínico, embora recentemente um inibidor de BACE1, a molécula MK-8931, tenha alcançado os ensaios clínicos de fase II / III (Yan e Vassar, 2014). Esta molécula é diferente das moléculas mencionadas neste pedido, uma vez que não é, nem um composto peptídico nem está ligada a transportadores peptídicos de penetração celular.

Por outro lado, existem alguns ensaios clínicos em curso com candidatos promissores que degradam ou imunobloqueiam as placas amilóides formadas durante a progressão da doença. No entanto, contrariamente a uma inibição eficiente de BACE1, estas estratégias visam as placas amilóides pré-formadas e não impedem a sua formação, não sendo, portanto, as mais adequadas para prevenir o aparecimento nem a progressão da doença.

Atualmente, a terapêutica sintomática em uso para a DA inclui inibidores da acetilcolinesterase e um antagonista do recetor de NMDA (memantina), que permitem uma melhor função da neurotransmissão colinérgica e glutamatérgica em pacientes com DA. No entanto, estes compostos não são fármacos modificadores da doença e, portanto, não impedem ou retardam a progressão da doença.

Sumário

O presente pedido de patente revela peptideos inibidores da BACE1 que incluem uma sequência de aminoácidos da APP ou uma sequência de aminoácidos derivada, associada à sequência de um peptídeo de penetração celular.

Numa forma de realização, a sequência de aminoácidos da APP inclui SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

Noutra forma de realização, os inibidores peptídicos têm homologia igual ou superior a 70% relativamente à sequência de aminoácidos da APP.

Noutra forma de realização, a sequência derivada da sequência de aminoácidos da APP inclui a sequência SEQ ID NO: 3.

Numa outra forma de realização, a sequência do peptideo de penetração celular inclui a sequência do peptideo TAT SEQ ID NO:4 ou uma sequência derivada do peptideo TAT.

Noutra forma de realização, os aminoácidos das sequências da APP, da sequência derivada da APP e do peptideo TAT incluem aminoácidos D.

Ainda noutra forma de realização, os aminoácidos D estão na forma retro inversa.

Noutra forma de realização, o peptideo inibidor da BACE-1 inclui uma das seguintes sequências:

SEQ ID NO: 5;

SEQ ID NO:6;

SEQ ID NO: 7;

SEQ ID NO:8;

SEQ ID NO:9; ou

SEQ ID NO:10.

O presente pedido de patente também se refere a um método para inibir a BACE-1 que inclui o uso dos inibidores peptidicos descritos acima.

É ainda divulgada, no presente pedido de patente, uma composição farmacológica que inclui o inibidor peptidico da BACE-1 conforme o disposto neste documento, de forma opcional em conjunto com um ou mais transportadores farmacologicamente aceites, excipientes ou diluentes.

O presente pedido refere-se ainda ao uso de peptideos num método para tratamento ou prevenção de uma doença associada a depósitos de amilóide ou a uma doença que constitua um fator de risco para a demência.

Além disso, o presente pedido revela o uso de peptideos num método para tratamento ou prevenção da doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson, Demência Vascular, Demência de corpos de Lewy, Esclerose Lateral Amiotrófica, Sindrome de Down, traumatismo craniano e acidente vascular cerebral.

DESCRIÇÃO GERAL presente pedido de patente revela novos fármacos que incluem peptideos desenhados para inibir a BACE-1. Os peptideos incluem um peptideo ativo baseado na sequência de aminoácidos que flanqueiam o Asp⁶⁷² , bem como em variantes inovadoras da sequência da APP que nunca foram usadas, e um peptideo com capacidade de penetrar as células, que, numa forma de realização preferida, é o peptideo de internalização TAT ou uma sequência variante do peptideo TAT que promove a entrada do peptideo nas células. Os fármacos são compostos por aminoácidos L ou compostos em parte ou exclusivamente, por aminoácidos D na sequência retro inversa (DRI) . Os peptideos são concebidos para serem usados na DA, mas também podem ser usados dentro do contexto de outras doenças neurológicas caracterizadas pela deposição de amilóide ou que constituam um fator de risco. 0 presente pedido de patente proporciona também uma nova metodologia para inibir a BACE-1 baseada no uso de peptideos com capacidade de penetrar as células associados a um peptideo inibidor da BACE-1. Esta abordagem para desenhar inibidores da BACE-1 nunca foi usada.

A abordagem com os peptideos divulgados neste pedido de patente ultrapassa algumas das limitações dos inibidores da BACE-1 previamente desenvolvidos, uma vez que apresenta as seguintes caracteristicas inovadoras:

i) Passagem facilitada através da BHE e entrada nas células, favorecendo a biodisponibilidade do composto nas células do cérebro onde este deve atuar. De facto, imagiologia de fluorescência ín vivo permitiu determinar a presença do peptideo aqui divulgado (peptideo 6) no cérebro de murganho após administração intraperitoneal (i.p).

ii) Favorece a localização do inibidor da BACE-1 em endossomas onde se co-localiza com a BACE-1 aumentando a probabilidade de a inibir.

iii) A ativação da endocitose é um evento precoce e específico na forma esporádica da doença de Alzheimer, portanto consegue-se um aumento da entrada do inibidor nas células e aumento da sua eficácia. Possivelmente, também contribui para o direcionamento seletivo para os neurónios doentes, diminuindo possíveis efeitos secundários.

iv) o uso de um peptídeo na forma D-RI aumenta o tempo de meiavida do inibidor, permitindo uma possível redução na frequência de administração. De facto, estudos de imagiologia de fluorescência ín vivo permitiram determinar a presença de um dos peptídeos aqui divulgados (peptídeo 6) no cérebro de murganhos 24 h após a administração intraperitoneal do composto.

v) Uma titulação cuidadosa da dose dos inibidores da BACE-1 permite a diminuição da produção de beta amilóide, minimizando os efeitos adversos uma vez que evitam a inibição total da BACE-1 permitindo que esta atue sobre outros substratos endógenos.

As características mencionadas acima são particularmente relevantes quando se considera um tratamento crónico como no caso da doença de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas.

Os inibidores da BACE-1 incluídos no presente pedido visam superar as limitações dos compostos existentes em uso clínico que não atuando como terapias modificadoras da doença apenas melhoram com eficácia moderada alguns dos sintomas da doença de Alzheimer. De facto, os compostos incluídos no presente pedido irão permitir atrasar o início e a progressão da doença uma vez que a inibição da BACE-1 irá diminuir a produção do peptídeo beta amilóide abolindo a patologia amilóide que resulta da acumulação deste peptídeo no parênquima cerebral.

Foram desenvolvidos novos peptideos inibidores da BACE-1 que ultrapassam algumas das limitações de inibidores da BACE-1 previamente desenvolvidos que impediram o seu uso clínico. Os novos peptideos inibidores da BACE-1 aqui revelados incluem peptideos ativos (baseados na estrutura molecular do substrato (APP), bem como em novas variantes artificiais da sequência da APP que nunca foram usadas) e um peptídeo com capacidade de penetrar as células, que numa forma de realização preferida é a sequência TAT₍₄₈_₅₇₎ (SEQ ID NO:4) ou uma sequência variante do peptídeo TAT, que favorece a passagem da membrana celular e permite que o inibidor atinja concentrações eficazes no sistema nervoso central, onde deve atuar. Estes novos peptideos constituem uma estratégia inovadora para desenhar um inibidor da BACE-1.

peptídeo ativo inclui a sequência da APP humana (SEQ ID NO:1) que flanqueia o local de clivagem Met-Asp⁶⁷² . Este pedido inclui também a sequência da APP humana (SEQ ID NO:2) que flanqueia o local de clivagem Asp⁶⁷² presente na APP portadora da mutação Sueca (APPswe) que tem grande afinidade para a BACE-1. É ainda revelada a sequência SEQ ID NO: 3 que é uma nova variante artificial da sequência da APPswe. As sequências do peptídeo ativo podem incluir a sequência variante com mais ou menos aminoácidos. Os terminais COOH de todos os peptideos são modificados por amidação para aumentar a resistência à proteólise.

número de aminoácidos nos peptideos ativos foram escolhidos tendo em conta que a bolsa do local ativo da BACE-1 acomoda oito cadeias laterais e considerando três ou quatro resíduos para funcionar como espaçador entre o local ativo e a sequência do peptídeo transportador. Os peptideos ativos devem ser reconhecidos seletivamente pela BACE-1 sem interferir com a clivagem da APP mediada pela α-secretase e pela BACE-2. De facto, foi escolhida a sequência da APP que flanqueia Asp⁶⁷² em vez da sequência que flanqueia o local de clivagem Tyr-Glu⁶⁸² , também reconhecida pela BACE-1, de modo a utilizar uma sequência da APP distante do local de clivagem reconhecida pela α-secretase e dos locais de clivagem preferenciais da BACE-2 ín vivo. A sequência preferencial do peptídeo transportador é a sequência TAT.

Para contornar a degradação proteolitica, os peptideos TAT-APP foram desenhados usando aminoácidos D, resistentes a protéases, e de forma a melhor mimetizar a estrutura natural do peptideo, considerou-se o uso da forma retro inversa (RI) dos peptideos na forma D.

As sequências preferenciais dos peptideos deste pedido de patente (em ambas as formas L nativa ou D-RI) são:

• Peptideo 1- TAT-APP: SEQ ID NO: 5;

• Peptideo 2- D-RI-TAT-APP: SEQ ID NO: 6;

• Peptideo 3- TAT-APPsw: SEQ ID NO: 7;

• Peptideo 4- D-RI-TAT-APPsw: SEQ ID NO: 8;

• Peptideo 5- TAT-varianteartificialAPPsw: SEQ ID NO: 9;

• Peptideo 6- D-RI-TAT-varianteartificialAPPsw: SEQ ID NO:10.

Estas sequências dos peptideos podem incluir sequências variantes relacionadas, com mais ou menos aminoácidos, de modo a que os peptideos tenham homologia igual ou superior a 70 % com as sequências dos peptideos incluídos no presente pedido.

Breve descrição dos resultados

Sem a intenção de limitar a descrição aqui presente, esta aplicação apresenta em anexo figuras ilustradoras de realizações com os peptideos inibidores da BACE1 revelados neste pedido, para uma compreensão mais fácil.

Figura 1 ilustra a atividade da BACE1 na presença de novos putativos peptideos inibidores da BACE1: PEP#1 (A), PEP#2 (B) , PEP#3 (C), PEP#4 (D), PEP#5 (E) e PEP#6 (F). A atividade da BACE1 foi determinada utilizando um Ensaio de Atividade da BACE1 (Sigma), com base num ensaio de FRET, em que o sinal de fluorescência é observado após a clivagem do substrato. Brevemente, a enzima BACE1 recombinante foi incubada durante 2 horas a 37 °C com concentrações diferentes dos inibidores, e na presença do substrato, de acordo com o protocolo do fabricante (n= 3-5 experiências independentes) .

A fluorescência foi registada num fluorimetro de placas a 320 nm (excitação) e 405 nm (emissão).

Figura 2 ilustra o efeito do novo inibidor da BACE1, peptideo 5 (PEP#5), nos níveis de Αβ40 e Αβ42 no meio condicionado de células de Neuroblastoma-2A que expressam APPswe. (A e B) Efeito do PEP#5 nos níveis de Αβ40/42 secretados. Vinte e quatro horas após o plaqueamento, as células de Neuroblastoma-2A que expressam constitutivamente APPswe (células N2A-APPswe) foram incubadas em meio sem FBS com 12,5 a 300 μΜ do peptideo por 24 h, a 37 °C, numa incubadora com 5 % de CO₂. No final do período de incubação, o meio condicionado foi recolhido e armazenado a -80 °C até a análise dos níveis de Αβ40 e Αβ42 por ELISA (Invitrogen) , de acordo com o protocolo do fabricante. As células controlo foram submetidas aos mesmos procedimentos experimentais na ausência de tratamento com peptideo. Os resultados (pg de Αβ por mL) representam a média ± SEM de n= 2-5 experiências independentes realizadas em duplicado, e são expressos como percentagem do controlo. *p<0,05, ****p<0,0001, significativamente diferente em relação ao grupo controlo, conforme determinado pela ANOVA, seguido pelo teste póshoc de Dunnet.

Figura 3 ilustra o efeito do novo inibidor da BACE1, peptideo 6 (PEP#6), nos níveis de Αβ40 e Αβ42 no meio condicionado de células de Neuroblastoma-2A que expressam APPswe. (A e B) Efeito do PEP#6 nos níveis de Αβ40/42. Vinte e quatro horas após o plaqueamento, as células Neuroblastoma-2A que expressam constitutivamente APPswe (células N2A-APPswe) foram incubadas em meio sem FBS com 12,5 a 300 μΜ do peptideo por 24 h, a 37 °C, numa incubadora com 5 % de CO₂. No final do período de incubação, o meio condicionado foi recolhido e armazenado a -80 °C até a análise dos níveis de Αβ40 e Αβ42 por ELISA (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. As células controlo foram submetidas aos mesmos procedimentos experimentais na ausência de tratamento com peptideo. Os resultados (pg de Αβ por mL) representam a média ± SEM de n= 2-5 experiências independentes realizadas em duplicado, e são expressos como percentagem do controlo. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 e ****p<0,0001 significativamente diferentes em comparação ao grupo controlo, conforme determinado pela ANOVA, seguido pelo teste pós-hoc de Dunnet.

Figura 4 ilustra o efeito dos novos inibidores de BACE1 nos níveis de Αβ40 e Αβ42 no meio condicionado de células Neuroblastoma-2A que expressam APPswe. (A a D) Efeito da PEP#5 e do seu Dretroinverso (PEP#6) nos níveis de Αβ40/42 secretados. Vinte e quatro horas após o plaqueamento, as células de Neuroblastoma-2A, que expressam constitutivamente APPswe (células N2A-APPswe), foram incubadas em meio sem FBS com 12,5 a 300 μΜ dos inibidores por 24 h, a 37°C, numa incubadora com 5 % de CO₂. No final do período de incubação, o meio condicionado foi recolhido e armazenado a -80°C até a análise dos níveis de Αβ40 e Αβ42 por ELISA (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. As células controlo foram submetidas aos mesmos procedimentos experimentais na ausência de tratamento com o peptídeo. Os resultados (pg de Αβ por mL) representam a média ± SEM de n= 2-5 experiências independentes realizadas em duplicado, e são expressos como percentagem de controlo.

Figura 5 ilustra que os novos peptídeos PEP#5 e PEP#6, inibidores da BACE1, na concentração do IC50 não alteram a viabilidade das células Neuro2A-APPswe. As células foram incubadas com os inibidores de BACE1, 50 μΜ (PEP#5) ou 75 μΜ (PEP#6), em meio de cultura sem FBS e por 24 h, a 37°C, numa incubadora com 5 % de CO₂. Células não tratadas foram usadas como controlo. Avaliou-se a viabilidade celular determinando a atividade quer de LDH (Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega) quer de Caspases 3/7 (Caspase 3/7- Glo assay, Promega) após o período de incubação. Os resultados da atividade de Caspase 3/7 representam a média ± SEM de 2-4 experiências independentes (n= 2 por 15 min e n= 4 para os 30-180 min) e foram normalizados para a atividade de Caspases 3/7 das células controlo (A, B). Os resultados de LDH são expressos em percentagem de LDH total (C, D) e representam a média ± SEM de 4-5 experiências independentes. Os novos inibidores da BACE1, numa concentração próxima ao IC50, não induziram toxicidade nas células N2A-APPswe, uma vez que não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as condições experimentais, grupo controlo e grupo tratado, (p> 0,05), conforme determinado pela ANOVA, seguido pelo teste pós-hoc de Dunnet.

Figura 6 ilustra que o novo inibidor da BACE1, PEP#6, alcança o cérebro de murganhos e os seus níveis permanecem elevados até 24 h após a administração em murganhos 3xTg-AD. Murganhos 3xTg-AD com quatro meses de idade foram tratados com uma única injeção i.p. de 10 mg/kg de PEP#6, marcada com uma sonda fluorescente, Cy5.5. A imagiologia de fluorescência ín vivo foi realizada imediatamente antes do tratamento e entre 1-48 horas após a administração do fármaco, utilizando o equipamento Perkin Elmer IVIS Lumina XR (A). Para isso, os murganhos foram anestesiados e submetidos a imagiologia de fluorescência não invasiva, tendo-se procedido à depilação dos animais na zona do cérebro. A quantificação do sinal na área do cérebro foi determinada pela medição da eficiência radiante numa região de interesse especificada (ROI). Para cada murganho, a ROI foi delimitada na área do cérebro e a densidade integrada do sinal [ (p/seg/cm²/sr) / (pW/cm²)] foi determinada usando o software Living Image versão 4.5 (Perkin Elmer) . O gráfico representa a média ± SEM de n= 3 murganhos por grupo (B). A análise estatística foi realizada pelo teste t, ****p<0,0001 significativamente diferente em relação ao tempo zero.

Figura 7 ilustra que os novos inibidores da BACE1, PEP#5 e PEP#6, diminuem os níveis plasmáticos de Αβ40/42 em murganhos 3xTg-AD. Um único tratamento i.p. com os novos inibidores da BACE1, PEP#5 e PEP#6, reduziu os níveis plasmáticos de Αβ40 (A) e Αβ42 (B) em murganhos 3xTg-AD com 4 meses de idade. Vinte e quatro horas após a administração, os murganhos foram sacrificados com anestesia seguida de deslocamento cervical e o sangue foi recolhido em tubos tratados com EDTA. Após a centrifugação, o plasma foi isolado e armazenado a -80 °C até a análise dos níveis de Αβ40 e Αβ42 por teste ELISA em sanduíche (Invitrogen), conforme protocolo do fabricante. Os murganhos do grupo controlo foram injetados com o veiculo (solução salina) na ausência de peptideos. Os resultados (pg de Αβ por mL) representam a média ± SEM de n= 3 murganhos por grupo. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 e ****p<0,0001 significativamente diferentes em comparação ao grupo controlo, conforme determinado pela ANOVA, seguido pelo teste pós-hoc de Dunnet.

Figura 8 ilustra que os novos inibidores de BACE1, PEP#5 e PEP#6, diminuem os níveis de Αβ40/42 solúveis no cérebro, em murganhos 3xTg-AD. Um único tratamento i.p. com os novos inibidores de BACE1 PEP#5 e PEP#6 reduziram os níveis solúveis de Αβ40 e Αβ42 no cérebro de murganhos 3xTg-AD com 4 meses de idade. Vinte e quatro horas após a administração, os murganhos foram sacrificados com anestesia seguida de deslocamento cervical e o cérebro foi isolado e armazenado a -80°C. Os extratos de cérebro em tampão RIPA foram utilizados para analisar os níveis de Αβ40 e Αβ42 por ELISA (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. Os murganhos do grupo controlo foram injetados com o veiculo (solução salina) na ausência de peptideos. Os níveis de proteína foram avaliados pelo método do BOA. Os resultados (pg de Αβ por mg de proteína) representam a média ± SEM de n= 3 murganhos por grupo. ***p<0,001 significativamente diferente em comparação ao grupo controlo, conforme determinado pela ANOVA, seguido pelo teste pós-hoc de Dunnet.

Figura 9 ilustra que o novo inibidor de BACE1, PEP#5, diminui os níveis de εΑΡΡβ no cérebro, enquanto que os níveis de sAPPa permanecem inalterados, em murganhos 3xTg-AD. Um único tratamento i.p. com o novo inibidor da BACE1 PEP#5 diminuiu os níveis cerebrais de εΑΡΡβ sem alterar os níveis de sAPPa, em murganhos 3xTg-AD com 4 meses de idade. Vinte e quatro horas após a administração, os murganhos foram sacrificados com anestesia seguida de deslocamento cervical e o cérebro foi isolado e armazenado a -80°C. Os extratos de cérebro em tampão RIPA foram utilizados para determinar os níveis de εΑΡΡβ (A) , sAPPa (B) e Actina, através de análise de Western blotting. A proteína foi avaliada pelo método do BCA. Os murganhos do grupo controlo foram injetados com o veiculo (solução salina) na ausência de peptideos. Bandas de Western blotting representativas para cada proteína são apresentadas acima do gráfico. Os resultados representam a média ± SEM de, pelo menos, n= 5-9 murganhos por grupo e são expressos como percentagem do grupo controlo. A análise estatística foi realizada segundo o teste t. *p<0,05 e ***p<0,001 significativamente diferentes em relação ao grupo controlo.

Figura 10 ilustra que o novo inibidor BACE1, PEP#6, diminui os níveis cerebrais de εΑΡΡβ, ao passo que os níveis de sAPPa permanecem inalterados em murganhos 3xTg-AD. Um único tratamento i.p. com o novo inibidor da BACE1 PEP#6 diminuiu os níveis cerebrais de εΑΡΡβ sem alterar os níveis de sAPPa, em murganhos 3xTg-AD com 4 meses de idade. Vinte e quatro horas após a administração, os murganhos foram sacrificados com anestesia seguida de deslocamento cervical e o cérebro foi isolado e armazenado a -80°C. Os extratos de cérebro em tampão RIPA foram utilizados para determinar os níveis de εΑΡΡβ (A) , sAPPa (B) e Actina, através de análise de Western blotting. A proteína foi avaliada pelo método do BCA. Os murganhos controlo foram injetados com o veiculo (solução salina) na ausência de peptideos. Bandas de Western blotting representativas para cada proteína são apresentadas acima do gráfico. Os resultados representam a média ± SEM de, pelo menos, n= 3-5 murganhos por grupo e são expressos como percentagem do grupo controlo. A análise estatística foi realizada segundo o teste t. *p<0,05 e ***p<0,001 significativamente diferentes em relação ao grupo controlo.

Figura 11 ilustra que o novo inibidor de BACE1, PEP#5, não diminui os níveis de APP nem de BACE1 no cérebro de murganhos 3xTg-AD. Um único tratamento i.p. com o novo inibidor da BACE1, PEP#5, não altera os níveis de APP nem de BACE1 no cérebro de murganhos 3xTgAD com 4 meses de idade. Vinte e quatro horas após a administração, os murganhos foram sacrificados com anestesia seguida de deslocamento cervical e o cérebro foi isolado e armazenado a -80°C. Os extratos de cérebro em tampão RIPA foram utilizados para determinar os níveis de APP (A) , BACE1 (B) e Actina, através de análise de Western blotting. A proteína foi avaliada pelo método do BCA. Os murganhos do grupo controlo foram injetados com o veiculo (solução salina) na ausência de peptideos. Bandas de Western blotting representativas para cada proteína são apresentadas acima do gráfico. Os resultados representam a média ± SEM de, pelo menos, n= 6-10 murganhos por grupo e são expressos como percentagem do grupo controlo. A análise estatística realizada segundo o teste t não determinou diferenças significativas.

Figura 12 ilustra que o novo inibidor de BACE1, PEP#6, não diminui os níveis de APP nem de BACE1 no cérebro de murganhos 3xTg-AD. Um único tratamento i.p. com o novo inibidor da BACE1, PEP#6, não altera os níveis de APP nem de BACE1 no cérebro de murganhos 3xTgAD com 4 meses de idade. Vinte e quatro horas após a administração, os murganhos foram sacrificados com anestesia seguida de deslocamento cervical e o cérebro foi isolado e armazenado a -80 °C. Os extratos de cérebro em tampão RIPA foram utilizados para determinar os níveis de APP (A) , BACE1 (B) e Actina, através de análise de Western blotting. A proteína foi avaliada pelo método do BCA. Os murganhos do grupo controlo foram injetados com o veiculo (solução salina) na ausência de peptideos. Bandas de Western blotting representativas para cada proteína são apresentadas acima do gráfico. Os resultados representam a média ± SEM de, pelo menos, n= 4 murganhos por grupo e são expressos como percentagem do grupo controlo. A análise estatística realizada segundo o teste t não determinou diferenças significativas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Na presente divulgação são descritos novos peptideos inibidores da BACE1 que ultrapassam algumas das limitações dos inibidores anteriores que impediram a sua utilização clinica.

Os novos inibidores peptidicos da BACE1 compreendem um peptideo ativo baseado na estrutura molecular do substrato (APP), bem como novas variações artificiais da sequência da APP que nunca foram utilizadas, e um peptideo de penetração celular, preferencialmente a sequência TAT₍₄₈_₅₇₎ (SEQ ID NO: 4), ou uma variante relacionada do peptideo TAT, que facilita a penetração da membrana celular e permite que o inibidor atinja concentrações efetivas no sistema nervoso central, onde deve atuar. Esses novos peptídeos constituem uma estratégia inovadora para projetar um inibidor da BACE1 que nunca foi abordada antes. Os terminais COOH de todos os peptídeos estão modificados por amidação para aumentar a resistência proteolítica.

Os peptídeos ativos incluem a sequência SEQ ID NO: 3, que é uma nova variação artificial da sequência APPswe que nunca foi utilizada antes.

Os peptídeos ativos incluem a sequência APP humana (SEQ ID NO: 1) flanqueando o sítio de clivagem Met-Asp⁶⁷² . 0 presente pedido inclui também a sequência APP humana (SEQ ID NO: 2) flanqueando o sítio de clivagem de Leu-Asp⁶⁷² , presente na versão da APP com a mutação Sueca (APPsw), que tem uma afinidade aumentada para a BACE1.

Para ultrapassar a degradação proteolítica, concebemos peptídeos TAT-APP utilizando D-aminoácidos, resistentes a proteases e, para melhor imitar a estrutura do peptideo natural, considerámos a utilização da forma retroinversa (RI) dos peptídeos D.

número de aminoácidos no peptideo ativo foi escolhido tendo em mente que a bolsa do local ativo da BACE1 acomoda oito cadeias laterais, e considerando três ou mais resíduos para trabalhar como um espaçador entre as sequências de APP e TAT.

Os peptídeos ativos devem ser seletivamente reconhecidos pela BACE1 sem interferir na clivagem da APP mediada pela a-secretase e pela BACE2. Foi selecionada a sequência de APP flanqueando o Asp⁶⁷² em vez da sequência que flanqueia o local de clivagem TyrGlu⁶⁸² também reconhecido pela BACE1, a fim de usar uma sequência da APP distante do local de clivagem reconhecido pela a-secretase e dos locais de clivagem preferencial pela BACE2 ín vivo.

Portanto, os peptideos divulgados apresentam as seguintes caracteristicas funcionais inovadoras relativamente a inibidores anteriores da BACE1:

- Facilitação da passagem através da BHE e a internalização celular, favorecendo a biodisponibilidade do composto nas células do cérebro onde deve atuar. De facto, a imagiologia de fluorescência ín vivo permitiu determinar a presença de um peptideo aqui descrito (peptideo 6) no cérebro de murganho após administração intraperitoneal (i.p.).

- Favorecimento da localização do inibidor da BACE1 no compartimento endossomal, onde se co-localiza com a BACE1, aumentando assim a probabilidade de inibir a BACE1.

- A ativação da endocitose é um evento específico e precoce na DA esporádica, permitindo um aumento da captação celular e eficácia dos peptideos. Possivelmente, também contribui para o direcionamento seletivo para os neurónios doentes, diminuindo possíveis efeitos secundários.

- 0 uso de um peptideo D-RI aumenta o tempo de meia-vida do inibidor, permitindo uma redução na frequência de administração. De facto, a imagiologia de fluorescência in vivo permitiu determinar a presença de um peptideo aqui divulgado (peptideo 6) no cérebro de ratos, 24 h após a administração do fármaco (i.p.). Uma caracteristica importante do peptideo TAT é que apresenta baixa toxicidade. 0 uso do peptideo TAT acoplado a um inibidor da BACE1 com base na sequência de aminoácidos da APP, ou em uma variação dessa sequência, nunca foi abordado na DA.

- Por outro lado, uma titulação cuidadosa da dosagem de um potencial inibidor da BACE1 permite diminuir a produção de Αβ enquanto minimiza os efeitos adversos, uma vez que evitará uma inibição total de BACE1, permitindo que a enzima atue sobre outros substratos celulares.

As caracteristicas mencionadas acima são particularmente relevantes quando se considera um tratamento crónico, como no caso da DA e de outras doenças neurodegenerativas.

Os dados experimentais que suportam os peptideos divulgados como novos inibidores de BACE1 são descritos abaixo.

Em primeiro lugar, determinou-se a eficácia dos peptideos em inibir a atividade de BACE1 utilizando um ensaio ín vítro efetuado sem células (BACE1 Activity Assay Kit, Sigma) seguindo as instruções do fabricante. Os ensaios in vitro permitiram determinar os 1050 dos peptideos (Tabela 1, Figura 1).

Tabela 1. 1050 dos peptideos determinado usando um sistema de ensaio sem células. 0 1050 refere-se à concentração do peptídeo

que inibe 50% da atividade da BACE1.
Peptídeo	IC50 (M)
Peptídeo 1	8.316 x 10-⁷
Peptídeo 2	7.64 x 10~⁶
Peptídeo 3	1.485 x 10~⁶
Peptídeo 4	3.713 x 10~⁶
Peptídeo 5	9.803 x 10~⁶
Peptídeo 6	6.490 x 10~⁷

Posteriormente, os peptideos 5 e 6 foram selecionados para iniciar os estudos num modelo celular da DA, a linhagem de células de neuroblastoma Neuro-2A sobreexpressando APPswe (N2A-APPswe) e a capacidade dos novos inibidores da BACE1 para reduzir a produção endógena de Αβ40 e Αβ42, avaliado por teste ELISA em sandwich, foi determinado. Observou-se que, após um período de incubação de 24 h, 100 μΜ do peptídeo 5 (Figura 2) inibiram maximamente a formação de Αβ40 e Αβ42 em 74,0 ± 4,51% e 84,2 ± 6,6% enquanto que 100 μΜ do peptídeo 6 (Figura 3) inibiram maximamente a produção de Αβ40 e Αβ42 em 73,8 ± 7,7% e 74,1 ± 5,5%, respetivamente. As curvas dose-resposta (Figura 4) permitiram a determinação do IC50 para o peptídeo 5 e o peptídeo 6 em células N2A-APPswe (Tabela 2).

Tabela 2. IC50 dos peptideos determinados num ensaio celular. A IC50 refere-se à concentração de peptídeo que inibe a produção endógena de Αβ40 e Αβ42 em células N2A-APPswe em 50%.

Peptídeo

Αβ40

IC50 (Μ)

Peptídeo 5 Peptídeo 6	6.408 x 10~⁵
7.562	X	10~⁵
Peptídeo		Αβ42		IC50 (M)
Peptídeo	5	4.560	X	10~⁵
Peptídeo	6	7.823	X	10~⁵

De realçar, a incubação durante 24 h com os novos inibidores da BACE1 (peptídeo 5 e 6) , em concentrações próximas à IC50, não induziu a ativação de caspase-3 e de caspase-7 (Figura 5 A e B), nem aumentou a libertação de LDH (Figura 5 C e D) . Estes resultados indicam que, na concentração próxima da IC50, os peptideos 5 e 6 não causaram apoptose nem necrose de células N2A-APPswe. Assim, os novos inibidores da BACE1 reduziram a produção endógena de Αβ em células N2A-APPswe na ausência de um efeito citotóxico.

Realizaram-se estudos in vivo, usando o modelo de murganho triplo transgénico da DA (3xTg-AD) que inclui os transgenes PS1M146V, APPswe e TauP301L (Oddo et al. , 2003), para avaliar se os novos inibidores da BACE1, o peptídeo 5 e o peptídeo 6, melhoram a patologia amiloide.

Para demonstrar que os peptideos aqui divulgados têm potencial para alcançar o cérebro, marcámos o peptídeo 6 com o corante fluorescente Cy 5.5 e realizámos um estudo de imagiologia de fluorescência in vivo em murganhos 3xTg-AD injetados (i.p.) com 10 mg/kg do composto. Como mostrado na Figura 6, o peptídeo 6 tem a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica e penetrar no cérebro do murganho. Os seus níveis cerebrais permaneceram altos até 24 h após a administração do peptídeo e após 48 h os níveis cerebrais do composto eram idênticos aos basais. Posteriormente, os níveis cerebrais e plasmáticos de Αβ40 e Αβ42 foram avaliados 24 h após uma única administração (injeção i.p.) dos compostos em ratinhos 3xTg-AD com 4 meses de idade. Os resultados indicaram que ambos os peptideos na dose 1.25 mg/kg reduziram Αβ40 no plasma em 30% e, na dose de 5.0 mg/kg, reduziram Αβ42 no plasma em pelo menos

30%, como avaliado por ELISA em relação aos níveis de Αβ solúveis a 1,25 mg/kg reduziram Αβ40 em 50% ambos os peptídeos reduziram Αβ42 B) .

sanduíche (Figura 7 A, B) . Em no cérebro, os peptídeos 5 e 6 e 28%, respetivamente, enquanto em cerca de 28% (Figura 8 A e

De acordo com isto, o peptídeo 5 diminuiu o fragmento de clivagem de APP solúvel εΑΡΡβ, que resulta da clivagem da APP pela BACE1, em cerca de 11% (Figura 9A), sem alterar os níveis do fragmento de sAPPa, que surge da clivagem de APP por α-secretase (Figura 9 B), conforme avaliado por western blotting. Do mesmo modo, o peptídeo 6 diminuiu os níveis de εΑΡΡβ em cerca de 24% enquanto a quantidade do fragmento sAPPa não foi significativamente alterada (Figura 10 A e B) . Estes resultados indicam que os peptídeos 5 e 6 inibem seletivamente a atividade da BACE1 em ratinhos 3xTg-AD sem inibir a atividade da a-secretase.

Além disso, observou-se que a administração dos peptídeos 5 e 6 não reduziu os níveis de APP (Figura 11 A e Figura 12 A) nem de BACE1 (Figura 11 B e Figura 12 B), o que demonstra que a redução nos níveis de Αβ e εΑΡΡβ é devida à inibição da atividade de BACE1 e não por causa de uma diminuição na quantidade de enzima ou na quantidade do seu substrato.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Universidade de Coimbra <12 0> PEPTÍDEOS INIBIDORES DA BACE1 PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEUROLÓGICAS <130> PPI 51891/15 <160> 10 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 11

<212	> PRT
<213	> Home	sapiens
<400	> 1
Glu	Ile Ser	Glu Vai	Asn	Leu	Asp	Ala	Glu	Phe
1		5					10
<210	> 2
<211	> 11
<212	> PRT
<213	> Home	sapiens
<400	> 2
Glu	Ile Ser	Glu Vai	Lys	Met	Asp	Ala	Glu	Phe
1		5					10
<210	> 3
<211	> 11
<212	> PRT
<213	> Sequência Artificial
<220	>
<223	> Sequência Artificial
<400	> 3
Leu	Glu Ile	Ala Vai	Ser	Asn	Glu	Phe	Glu	Asp
1		5					10

<210>4 <211>10 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência Humana <400>4

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1510 <210>5 <211>21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência Artificial <400> 5

Gly Arg	Lys Lys Arg Arg Gin	Arg	Arg	Arg	Glu	Ile	Ser	Glu	Vai	Lys
1 Met Asp <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>	5 Ala Glu Phe 20 6 21 PRT Sequência Artificial Sequência Artificial 6			10					15
Phe Glu 1 Arg Lys <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>	Ala Asp Met Lys Vai 5 Lys Arg Gly 20 7 21 PRT Sequência Artificial Sequência Artificial 7	Glu	Ser	Ile 10	Glu	Arg	Arg	Arg	Gin 15	Arg
Gly Arg 1 Leu Asp	Lys Lys Arg Arg Gin 5 Ala Glu Phe 20	Arg	Arg	Arg 10	Glu	Ile	Ser	Glu	Vai 15	Asn

<210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência Artificial <400> 8

Phe Glu Ala Asp Leu Asn Vai Glu Ser Ile Glu Arg Arg Arg Gin Arg

10 15

Arg Lys Lys Arg Gly <210> 9 <211> 21 < 212> PRT < 213> Sequência Artificial <220>

< 223> Sequência Artificial < 400>9

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Leu Glu Ile Ala Vai Ser 15 1015

Asn Glu Phe Glu Asp 20 <210>10 <211>21 < 212> PRT < 213> Sequência Artificial <220>

< 223> Sequência Artificial < 400> 10

Asp Glu Phe Glu Asn Ser Vai Ala Ile Glu Leu Arg Arg Arg Gin Arg 15 10 15

Arg Lys Lys Arg Gly

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de maio de 2018

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um inibidor peptidico da BACE1 compreendendo:

- uma sequência de aminoácidos da APP, ou uma sequência de aminoácidos da APP acoplada a uma sequência peptidica de penetração celular, em que os aminoácidos das duas sequências de APP, isolados e acoplados, compreendem D-aminoácidos e a sequência está na forma retroinversa, ou

- uma sequência artificial derivada de aminoácidos da APP, ou

- uma sequência artificial derivada de aminoácidos da APP, acoplada a uma sequência peptidica de penetração celular;

em que os aminoácidos compreendem L-aminoácidos ou Daminoácidos e a sequência compreende uma percentagem de homologia igual ou superior a 70% relativamente às sequências SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10;

e em que os terminais COOH de todas as sequências são opcionalmente modificados por amidação.
2. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com a reivindicação anterior, em que os aminoácidos das sequências artificiais derivadas de aminoácidos da APP, isolados ou acoplados, compreendem D-aminoácidos na forma retroinversa.
3. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos da APP compreende adicionalmente a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2.
4. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com a reivindicação n° 1, em que a sequência derivada de aminoácidos da APP compreende a sequência artificial SEQ ID NO: 3.
5. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com a reivindicação n° 1, em que a sequência do peptideo de penetração celular compreende adicionalmente uma sequência do peptideo TAT SEQ ID N°:4 ou uma sequência variante da TAT ou outro peptideo de penetração celular adequado.
6. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com as reivindicações precedentes n°s 1 e 5, em que os aminoácidos das sequências TAT compreendem D-aminoácidos.
7. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com a reivindicação anterior, em que a sequência de D-aminoácidos está na forma retroinversa.
8. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com as reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente uma das seguintes sequências com uma homologia igual ou superior a 70% com:

SEQ ID NO:5;

SEQ ID NO:6;

SEQ ID NO:7;

SEQ ID NO:8.
9. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com a reivindicação anterior, , em que os aminoácidos compreendem L-aminoácidos ou D-aminoácidos.
10. Os inibidores peptidicos da BACE1 de acordo com a reivindicação anterior, em que as sequências de Daminoácidos estão na forma retroinversa.
11. Os inibidores peptidicos de qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização num método para a inibição da BACE1.
12. Uma composição farmacêutica compreendendo um péptido descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, opcionalmente em conjunto com um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
13. Uma composição farmacêutica descrita na reivindicação anterior para utilização num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio associado a depósitos amilóides ou de um distúrbio que constitua um fator de risco para demência.
14. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação anterior para utilização num método para o tratamento ou prevenção da doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência vascular, demência com corpos de Lewy, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down, traumatismo craniano e acidente vascular cerebral.
15. Um peptídeo descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para utilização num método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio associado a depósitos amilóides ou com um distúrbio que constitua um fator de risco para demência.
16. Um peptídeo descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para utilização num método para o tratamento ou prevenção da doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência vascular, demência com corpos de Lewy, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down, traumatismo craniano e acidente vascular cerebral.