KR101603232B1 - 타우 과인산화를 저해하는 펩타이드를 포함하는 치매 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 타우 과인산화를 저해하는 신규 펩타이드를 유효성분으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia) 및 파킨슨 질환(Parkinson's disease) 중에서 선택된 어느 하나의 질환에 유용하고, 특히 유전되는 타우 기인성 치매(tau only dementia)인 전두측두엽 치매의 예방이나 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 타우 과인산화를 저해하는 펩타이드를 포함하는 치매 예방 또는 치료용 조성물, Akt 단백질에 의해 활성화되고 GSK3β를 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 하고, 타우 과인산화를 저해하는 메카니즘을 통해 치매를 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.
타우 질환(tauopathy)은 과인산화된 타우 단백질의 섬유성 응집이 내부신경세포에 비정상적으로 축적되어 발생하는 퇴행성 신경질환으로, 대표적인 예가 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia)와 몇몇 파킨슨 질환(Parkinson's disease)이 있다.
퇴행성 신경질환, 예를 들어 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia; AD)은 퇴행성 신경질환에서 발병률이 가장 높은 질환으로 신경세포 손실, 인식력 장애, 기억력과 학습능력 저하를 일으킨다. 알츠하이머성 치매는 단계별로 진행되어 점차 기억력, 추리, 판단력, 언어, 나아가 아주 단순한 업무능력까지도 점차적으로 파괴하고 결국 감정조차 조절할 수 없어 인간의 삶에서 동물의 삶으로 전락시키는 과정을 거친다. 아직 알츠하이머성 치매를 근본적으로 치료하는 방법은 없으며 관련 증상을 완화하는데 도움을 주는 약물들만 임상에 쓰이고 있다. 그러나 실제 환자들에게 이들 약물의 효과는 제한적이다. 환자의 절반 정도가 초기 약물 치료에 실패하고 있으며, 설사 치료가 성공적이라 하더라도 증상의 완만한 완화만을 보여줄 뿐이다. 알츠하이머성 치매는 병이 진행되면서 뇌의 피질(cortex)과 해마(hippocampus)가 소실되면 재생이 불가능하여 치료방법이 거의 없는 것으로 알려져 있다.
한편 타우 단백질은 미세소관을 지지하는 단백질(microtubule-associated protein)으로서 세포골격 단백질(cytoskeleton protein)로서, 다른 세포에 비하여 중추신경계통(central nervous system)의 신경세포 안에 풍부 하게 존재하는 단백질로서, 과인산화된 타우 단백질의 섬유성 응집이 내부신경세포에 비정상적으로 축적되어 타우 질환(tauopathy)이 발생한다.
타우 질환은 알츠하이머성 치매의 주요 병인으로 거론되는 아밀로이드 베타(Aβ, β-amyloid)의 축적이 외부신경세포에서 이루어지는 점에서 구별되고, 특히 유전되는 타우 기인성 치매(tau only dementia)인 전두측두엽 치매 환자에서 외부신경세포에서 아밀로이드 베타의 축적 없이 내부신경세포에서 타우 과인산화와 응집만으로도 치매가 유도되는 점이 확인된 바 있다(van Swieten and Spillantini, 2007).
또한 알츠하이머성 치매에서도 해마나 전두 피질과 같은 취약한 뇌 부분에서 타우 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangle; NFT)을 보유한 뉴론의 수와 인지 장애와 상관관계가 높다고 알려지고 있다.
타우 질환의 원인은 아직까지도 완전히 이해되고 있지 않지만, 과다한 산화적 스트레스, 세포내 칼슘 항상성의 변화와 에너지 결핍 등으로 인한 것으로 믿어지고 있다.
지금까지 아밀로이드 베타를 타깃으로 하여 알츠하이머 병변을 완화시키고자 하는 연구는 많이 이루어져 있으며 아밀로이드 베타에 대한 저해제 연구도 많이 알려져 있으나, 임상실험에서 성공한 적이 없었으며 아밀로이드 베타에 의한 노인반이 형성된 시점에서의 치료는 치매가 상당히 진행되어 그 치료가 어려운 점이 있었다.
따라서 본 발명자들은 내부신경세포에서 타우 과인산화를 저해할 수 있는 후보물질이, 외부신경세포에서 아밀로이드 베타의 축적을 저해하거나 분해하는 약물과 별도로 퇴행성 신경질환인 치매, 예를 들어 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 파킨슨 질환(Parkinson's disease) 등의 효과적인 치료 및 예방을 위한 약물을 제시할 수 있다고 판단하였고, 타우 과인산화 저해제를 검색하기 위한 효율적인 검색방법을 개발하여 한국특허 제10-1231777호로 등록받았고, 천연식물에서 분리한 폴리페놀에서 항산화 활성을 나타내지 않는 아주 낮은 농도에서 구조가 유사한 다른 폴리페놀에서 전혀 나타나지 않았던 타우 과인산화 억제활성이 유독 특정 플라보놀에서만 나타남을 확인하여, 한국특허출원 제10-2011-0018516호로 출원하였다.
한편 Wnt 보조 수용체인 LRP6의 세포질 도메인에 위치하는 다섯 반복되는 PPPSPxS 모티프가 세포막에 위치하는 GSK3β 및 CK1을 통해 인산화되면 GSK3β의 저해제로 작용할 수 있다고 알려져 있으나, PPPSPxS 모티프 단독으로는 세포 내 및 세포 외 어디에서나 GSK3β에 의해 인산화되기 어렵기 때문에, Akt 단백질에 의해 활성화되고 GSK3β를 억제하는 신규 펩타이드를 합성하였고, 이 신규 펩타이드의 타우 과인산화 억제활성을 신경아세포종과 치매 동물실험에서 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 타우 과인산화를 저해하는 메카니즘을 통해 치매를 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 다음 식(1)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
식 (1)
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14
상기 식 (1)에서,
상기 Z1, Z2, Z3 및 Z5는 프롤린이고,
상기 Z4, Z7, Z8 및 Z14는 세린 또는 트레오닌이며,
상기 Z6, Z10, Z12 및 Z13은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린이며,
상기 Z9 및 Z11은 아르기닌이다.
또한 본 발명의 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하여 이루이지는 펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 신규 펩타이드는 타우 과인산화를 저해하는 메카니즘을 통해 치매 예방 또는 치료에 유용한 약학 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia) 및 파킨슨 질환(Parkinson's disease) 중에서 선택된 어느 하나의 질환에 유용하고, 특히 유전되는 타우 기인성 치매(tau only dementia)인 전두측두엽 치매에 유용하다.
도 1은 실험예 1에서 마우스의 해마에서 GSK3β에 의해 타우 과인산화가 유도됨을 확인할 수 있는 웨스턴 블랏 사진이다.
도 2a는 실험예 1에서 사용한 LRP-GSK 및 LRP-GSKmt의 구조를 도식화한 그림이고, pLRP-GSK는 LRP-GSK에서 Z4 위치의 T(트레오닌)이 인산화된 것이다.
도 2b는 상기 도 2a 펩타이드중 LRP-GSK의 세포 투과성을 높이기 위하여, 세포 투과성 펩타이드(CPS)를 N-말단에 부가하고, C-말단을 아미드화 하고, FITC 표지를 부가한 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에서 도 2a의 펩타이드들을 각각 첨가하여 타우 과인산화 저해 여부를 확인한 웨스턴 블랏 사진이다.
도 4는 실험예 2에서 도 2b의 펩타이드가 세포 내로 투과하여 형광을 나타냄을 확인하기 위한 공초점 현미경 사진이다.
도 5는 실험예 3에서 신경아세포종에서 Aβ를 처리한 후 LG peptide를 첨가했을 때의 세포 생존율을 확인한 MTT 분석 결과 그래프이다.
도 6은 실험예 3에서 신경아세포종에서 인산화된 타우 단백질의 양을 측정하여 나타낸 웨스턴 블랏 사진이다.
도 7a는 실험예 4에서 마우스의 뇌 단면에서 CA1 뉴론을 염색하여 인산화된 타우를 확인한 사진이다.
도 7b는 실험예 4에서 마우스의 뇌 단면에서 인산화된 타우 양성 세포의 수를 측정하여 그래프이다.
도 7c는 실험예 4에서 마우스의 뇌 단면에서 subiculum, 피질(cortex), CA3, 편도체(amygdala) 뉴론을 염색하여 인산화된 타우를 확인한 사진이다.
도 8a는 3xTg-AD 마우스의 해마에서 GFAP, Iba-1 이중 라벨 면역조직화학 분석한 사진이다.
도 8b는 도 8a의 이중 라벨된 GFAP와 Iba-1을 정량화한 그래프이다.
도 8c는 3xTg-AD 마우스의 해마와 피질에서 니슬 염색한 사진이다.
도 2a는 실험예 1에서 사용한 LRP-GSK 및 LRP-GSKmt의 구조를 도식화한 그림이고, pLRP-GSK는 LRP-GSK에서 Z4 위치의 T(트레오닌)이 인산화된 것이다.
도 2b는 상기 도 2a 펩타이드중 LRP-GSK의 세포 투과성을 높이기 위하여, 세포 투과성 펩타이드(CPS)를 N-말단에 부가하고, C-말단을 아미드화 하고, FITC 표지를 부가한 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에서 도 2a의 펩타이드들을 각각 첨가하여 타우 과인산화 저해 여부를 확인한 웨스턴 블랏 사진이다.
도 4는 실험예 2에서 도 2b의 펩타이드가 세포 내로 투과하여 형광을 나타냄을 확인하기 위한 공초점 현미경 사진이다.
도 5는 실험예 3에서 신경아세포종에서 Aβ를 처리한 후 LG peptide를 첨가했을 때의 세포 생존율을 확인한 MTT 분석 결과 그래프이다.
도 6은 실험예 3에서 신경아세포종에서 인산화된 타우 단백질의 양을 측정하여 나타낸 웨스턴 블랏 사진이다.
도 7a는 실험예 4에서 마우스의 뇌 단면에서 CA1 뉴론을 염색하여 인산화된 타우를 확인한 사진이다.
도 7b는 실험예 4에서 마우스의 뇌 단면에서 인산화된 타우 양성 세포의 수를 측정하여 그래프이다.
도 7c는 실험예 4에서 마우스의 뇌 단면에서 subiculum, 피질(cortex), CA3, 편도체(amygdala) 뉴론을 염색하여 인산화된 타우를 확인한 사진이다.
도 8a는 3xTg-AD 마우스의 해마에서 GFAP, Iba-1 이중 라벨 면역조직화학 분석한 사진이다.
도 8b는 도 8a의 이중 라벨된 GFAP와 Iba-1을 정량화한 그래프이다.
도 8c는 3xTg-AD 마우스의 해마와 피질에서 니슬 염색한 사진이다.
본 발명은 다음 식(1)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
식 (1)
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14
상기 식 (1)에서,
상기 Z1, Z2, Z3 및 Z5는 프롤린이고,
상기 Z4, Z7, Z8 및 Z14는 세린 또는 트레오닌이며,
상기 Z6, Z10, Z12 및 Z13은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린이며,
상기 Z9 및 Z11은 아르기닌이다.
상기 Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 펩타이드는 GSK3β의 억제를 위해 인간 LRP6 모티프 C에서 선택된 서열이고, Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14 펩타이드는 Z4가 인산화될 수 있도록 서로 다른 인산화효소들에 의해 인산화될 수 있도록 GSK3β의 N-말단 영역에서 선택된 서열이다. 상기 Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 펩타이드와 Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14 펩타이드는 Z8, 즉 세린 또는 트레오닌에 의해 결합됨으로써 서로 다른 인산화효소들, 예를 들어 Akt, GSK3β, CK1ε에 의해 세린 또는 트레오닌의 히드록시 잔기가 인산화되면서 Z4 까지 인산화가 될 수 있도록 연결한다.
상기 Z8은 세린인 것이 바람직하고, 상기 Z10, Z12 및 Z13은 세린 또는 트레오닌인 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 식 (1)의 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하여 이루이지는 펩타이드일 수 있고, 또한 상기 식 (1)의 펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩타이드일 수 있다.
또한 본 발명의 상기 식 (1)의 펩타이드의 N-말단에 세포 투과성 펩타이드가 융합됨으로써, 세포 투과성을 높일 수 있다. 상기 세포 투과성 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 펩타이드의 세포 투과성을 높일 수 있는 것이면 특별히 한정하지 않고, 예를 들어 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한 본 발명의 상기 식 (1)의 펩타이드의 C-말단은 아미드화된 것일 수 있다.
또한 본 발명의 상기 식 (1)의 펩타이드는 타우 과인산화를 저해함으로써, 치매, 예를 들어 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia) 및 파킨슨 질환(Parkinson's disease) 중에서 선택된 어느 하나의 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명의 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 식 (1)의 펩타이드 이외에 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 서열번호 1의 화합물을 기준으로 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 뇌 조직에서 GSK3β에 의해 유도된 타우 과인산화 저해 효과
C57BL/6 mice 뇌를 적출하여 해마(hippocampus)를 해부하여 균질화 한 후, GSK3β 인산화와 pH 조절을 위해서 ATP와 5 X 완충용액(50 mM β-mercaptoethanol, 250 mM Tris-HCL, 50 mM MgCl2)을 넣고, 1 mg/ml의 GSK3β를 웰 당 0.5 μL씩 첨가한 후, 37℃ 수조에서 30분간 반응 시킨 후 웨스턴 블랏에 의해 GSK3β에 의해 타우 인산화를 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 결과로부터 GSK3β가 타우의 인산화를 유도함을 확인하였다.
GSK3β에 의한 베타-카테닌의 인산화 저해 활성을 바탕으로 효소면역학적 방법으로 본 발명의 합성 펩타이드가 GSK3β에 의해 유도된 타우 과인산화를 억제하는지를 뇌 조직에서 확인하였다.
아미노산 서열 EPVPPPP T PRSSRSRTTSFSES인 펩타이드(이하 'LRP-GSK'라 함, 서열번호 3) 및 EPVPPPP A PRSSRSRTTSFSES인 펩타이드(이하 'LRP-GSKmt'라 함, 서열번호 5)는 고정상 합성을 통해 준비하였고, 상기 LRP-GSK에서 굵은 글씨로 표시한 Z4 위치의 T(트레오닌)이 인산화된 것을 별도로 pLRP-GSK로 명명하였다. 상기 LRP-GSKmt는 LRP-GSK에서 Z4 위치가 인산화될 수 없도록 T(트레오닌)이 A(알라닌)으로 변형된 것이다. 도 2a에 상기 펩타이드들의 구조를 도식화하여 나타내었다.
본 발명의 pLRP-GSK, 음성대조군인 LRP-GSK와 LRP-GSKmt을 각각 첨가하여 타우 과인산화를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3의 웨스턴 블랏 사진에 따르면, pLRP-GSK는 GSK3β에 의해 유도된 타우 과인산화를 현저히 감소시킴을 확인할 수 있었고, 이에 비해 LRP-GSK는 타우 과인산화를 일부분 조절하고, LRP-GSKmt는 전혀 타우 과인산화를 조절하지 못함을 타우 과인산화 저해 효과를 과인산화 항체인 pSpS(ser199/202)와 pTau(ser396)을 이용하여 웨스턴 블랏에 의해 확인하였다.
실험예 2: 신경아세포종에서의 LG peptide 투과성 확인
상기 실험예 1의 펩타이드 중에서 LRP-GSK의 세포 내 투과를 돕기 위하여, 상기 펩타이드의 N-말단에는 서열번호 6의 아미노산 서열 YGRRARRRARR인 세포 투과성 펩타이드를 융합시켰으며, 상기 융합시킨 펩타이드의 C-말단은 아미드화 하였고, N-말단에는 형광물질로 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 표지시킨 서열번호 7의 펩타이드(이하, 'LG peptide' 또는 'LG'라 함)를 이후 실험에 사용하였다. 도 2b는 LRP-GSK에 대해서 세포 투과성 펩타이드(Cell Permeable sequence, CPS)를 N-말단에 부가하고, C-말단을 아미드화 하고, FITC 표지를 부가한 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
신경아세포종(ATCC로부터 구입, Human neuroblastoma cell:SH-SY5Y cell)를 커버 글라스를 구비한 6웰 플레이트에 두고, 10 μM의 LG peptide 및 대조군(control) DMSO로 30 분 동안 처리하였다. 상기 세포는 DAPI로 고정 및 염색하고 공초점 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과 LG peptide가 세포 내로 투과하였음을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 신경아세포종에서의 신경보호 효과
신경아세포종(SH-SY5Y cell)을 RPMI배지(RPMI 1640 medium containing 1% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 LG peptide를 2μM로 2시간 동안 전처리하고 1% FBS에 용해된 10 μM의 Aβ1-42와 함께 48시간 동안 배양하였다.
MTT 분석 결과 Aβ를 처리 하였을 때 세포 생존률이 현저히 감소하였으며 LG peptide를 처리한 경우 Aβ에 의한 세포의 사멸을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
한편 타우 과인산화와 관련된 LG peptide의 신경보호 효과를 평가하기 위해서 Aβ 처리된 신경아세포종에서의 인산화된 타우 단백질의 양을 측정하기 위한 웨스턴 블랏 결과를 도 6에 나타내었다. Aβ 는 타우 인산화 수준을 현저히 증가시켰고, LG peptide는 이렇게 증대된 타우 과인산화를 효과적으로 억제하여, LG peptide가 신경보호 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 마우스에서의 타우 과인산화 저해 효과
3xTg-AD 마우스는 나이가 들면서 플라그와 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangle; NFT)이 발생함이 알려져 있다. 따라서 LG peptide의 생체 내 효과를 확인하기 위하여 15월령의 3xTg-AD 마우스에 3일 동안 정맥으로 LG peptide를 1μM/kg으로 투여하였다(Tg-LG). 3xTg-AD 마우스와 비교를 위해 일반 마우스(WT-con)로는 동일 월령의 C57BL/6 마우스를 이용하였다.
3xTg-AD 마우스와 일반 마우스의 뇌 단면을 타우 인산화를 확인하기 위하여, 항PHF-tau (AT180, Thr231/Ser235) 항체로 면역염색한 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. CA1에서 AT180 염색된 뉴론의 수가 일반 마우스(WT-con)에 비해 3xTg-AD 마우스(Tg-con)에서 증가하였고, LG peptide 투여군(Tg-LG)에서는 3xTg-AD 마우스(Tg-con)에 비해 유의적으로 감소하였다.
또한 LG peptide를 투여하지 않은 대조군(Tg-con)의 3xTg-AD 마우스의 뇌 단면의 면역염색 결과 CA3, subiculum, 편도체(amygdala) 뉴론에서는 염색된 다량의 인산화된 타우(AT180, thr231/ser235)를 확인할 수 있었고, LG peptide를 투여한 경우(Tg-LG)에는 CA3, 편도체(amygdala) 뉴론에서 인산화된 타우의 검출이 현저히 저하된 것을 확인할 수 있었다(도 7c 참조).
실험예 5: 마우스에서의 신경 손상과 신경아교세포 활성화 확인
3xTg-AD 마우스에서 신경 손상과 신경아교세포 활성화 효과를 확인하기 위하여, 성상교세포(astocyte)의 마커인 GFAP와 미세아교세포(microglia)의 마커인 Iba-1에 대한 항체를 사용하여 이중 라벨 면역조직화학 분석을 실시하였다.
3xTg-AD 마우스의 해마에서 GFAP 및 Iba-1 염색 결과와 일반 마우스(WT-Control)에서의 염색 결과, 일반 마우스에 비하여 3xTg-AD 마우스의 subiculum에서 GFAP가 활성화되는 것을 확인하였으나 LG peptide 투약군과는 큰 차이를 나타내지 않았다(도 8a 및 8b).
또한 도 8c의 니슬 염색 결과는 3xTg-AD 마우스의 해마와 피질에서의 신경세포의 밀도나 형태가 일반 마우스와 크게 차이가 나지 않음을 보여 주었다.
이러한 결과들은 15월령의 3xTg-AD 마우스에서 타우 과인산화와 신경아교세포의 과활성화는 존재하지만, 신경 손상은 존재하지 않았다는 것을 의미하고, 따라서 타우 과인산화는 신경 손상이 발생하기 전 단계에서 나타남을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명에서 탐색한 LG peptide는 치매로 인한 신경 손상이 발생하기 전에 치매의 발병을 예방하거나 지연하도록 하는 예방약으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
하기에 본 발명의 신규 펩타이드 화합물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실험예 2의 LG peptide 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실험예 2의 LG peptide 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실험예 2의 LG peptide 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실험예 2의 LG peptide 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실험예 2의 LG peptide 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation
<120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment of
Alzheimer's dementia comprising peptide with attenuating activity
of tau hyperphosphorylation
<130> HPC-4290
<160> 7
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human LRP6 motif C
<400> 1
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human LRP6 motif C
<400> 2
Pro Pro Pro Ser Pro Arg Ser
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chimeric peptide: human LRP6 motif C and Akt target sequence
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Glu Pro Val Pro Pro Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Arg Ser Arg Thr
1 5 10 15
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20
<210> 4
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chimeric peptide: human LRP6 motif C and Akt target sequence
<400> 4
Glu Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Pro Arg Ser Ser Arg Ser Arg Thr
1 5 10 15
Thr Ser Phe Ser Glu Ser
20
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<213> Artificial Sequence
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<223> chimeric peptide: human LRP6 motif C with alanine substitution
and Akt target sequence
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Thr Ser Phe Ser Glu Ser
20
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<223> chimeric peptide: cell permeable sequence, human LRP6 motif C and
Akt target sequence
<400> 7
Tyr Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ala Arg Arg Glu Pro Val Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Arg Ser Arg Thr Thr Ser Phe Ser Glu
20 25 30
Ser
Claims (16)
- 삭제
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- 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N-말단에 세포 투과성 펩타이드가 융합된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 제 11 항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 상기 융합된 펩타이드의 C-말단이 아미드화된 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 타우 과인산화를 저해하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 15 항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia) 및 파킨슨 질환(Parkinson's disease) 중에서 선택된 어느 하나의 질환인 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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