KR20220127877A - 퇴행성 뇌질환 치료용 개선된 세포-투과성 변형 Ｐａｒｋｉｎ 재조합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 iCP-mParkin에 관한 것이다. 상기 iCP-mParkin은 신경세포의 손상과 관련된 질병을 치료하기에 적합한 생물학적 특성을 가진다. 이에 따라, 본 발명에서 제공하는 iCP-mParkin은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 헝팅턴병을 포함하는 퇴행성 뇌질환을 치료, 예방, 또는 개선하기 위한 조성물 또는 방법에 이용될 수 있다. 더 나아가, 상기 iCP-mParkin은 기존의 iCP-Parkin 보다 높은 안정성을 가지므로, 단백질 의약품으로 사용되기에 적합한 특성을 가진다. 또한, 본 발명에서 제공하는 제조 방법에 의해 수득된 iCP-mParkin은 높은 순도(Purity)를 가지며, 상기 제조 방법은 대량 생산에 적합한 특성을 가진다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 4일에 출원된 미국 가특허출원 일련번호 63/074,697의 혜택과 우선권을 주장하며, 그 전체가 여기에 참조로 포함된다.
본 발명은 iCP-mParkin에 관한 것이다. 상기 iCP-mParkin은 신경세포의 손상과 관련된 질병을 치료하기에 적합한 생물학적 특성을 가진다. 이에 따라, 본 발명에서 제공하는 iCP-mParkin은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 헝팅턴병을 포함하는 퇴행성 뇌질환을 치료, 예방, 또는 개선하기 위한 조성물 또는 방법에 이용될 수 있다. 더 나아가, 상기 iCP-mParkin은 기존의 iCP-Parkin 보다 높은 안정성을 가지므로, 단백질 의약품으로 사용되기에 적합한 특성을 가진다. 또한, 본 발명에서 제공하는 제조 방법에 의해 수득된 iCP-mParkin은 높은 순도(Purity)를 가지며, 상기 제조 방법은 대량 생산에 적합한 특성을 가진다.
퇴행성 뇌질환 및 이의 미충족 의료 수요
퇴행성 뇌질환(Neurodegenerative disease; NDD)은 신체의 구조와 기능이 점진적으로 퇴화될수록 발생하는 질환 중 특히 뇌와 척수에 발명하며, 신경세포전달물질의 불균형을 통해 학습, 기억 등의 이상 장애를 야기한다. 퇴행성 뇌질환은 나타나는 주요 증상과 침범되는 뇌 부위를 고려하여 분류할 수 있으며, 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 헌팅턴병(Huntington's disease: HD)이 포함된다. 아직까지 신경발생에 적용할 수 있고 신경 세포의 세포자멸사(apoptosis)를 억제할 수 있는 적절한 치료법이 존재하지 않는다.
피킨슨병
파킨슨병은 뇌의 흑질(substantia nigra pars compacta)과 선조체(striatum) 사이의 흑질선조체 시스템(도파민 시스템)의 도파민성 신경세포가 선택적으로 소실되면서 발생하는 퇴행성 질병이다. 전 세계 환자의 수는 약 1000만명이며, 그 수는 계속 증가하고 있다. 피킨슨병은 흑질(substantia nigra; SN)의 불완전한 도파민의 생성 및 작용으로 운동신경 피질의 자극이 감소되어 발생한다. 파킨슨병은 떨림(tremor), 서동(bradykinesia), 경직(rigidity) 등의 운동성 장애 및 우울증(depression), 불면증(insomnia), 인지장애 등의 비운동성 장애와 같은 임상적 증상을 동반하는 PD 관련 인자에 의해 야기되는 가족성 PD로 분류된다. 이것은 PD의 병인이 광범위한 신경계에서 신경 세포의 사멸을 유발하는 다계통 질환임을 암시한다.
유전적 결함에 의한 가족성 파킨슨병의 경우, α-Synuclein(PARK1/4), LRRK2(PARK8), PINK1(PARK6), Parkin(PARK2), DJ-1(PARK7) 등이 잘 알려져 있다. 또한, 가족성 파킨슨병의 유전적 요인은 산발성 파킨슨병 및 발병의 중요한 단계에 위치하는 Parkin과 같은 파킨슨병 원인 유전자에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. Parkin 돌연변이로 인한 E3 유비퀴틴 리가제 기능의 상실은 도파민 방출을 억제하여 특정 기질의 축적을 초래하거나 도파민성 뉴런의 퇴화를 유도하여 세포 사멸을 초래한다. 또한 Parkin은 미토콘드리아에서 보호 기능을 가지며, 스트레스로 인한 미토콘드리아 팽윤 및 세포자멸사를 감소시키는 세포보호 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다. 비정상적인 병리학적 단백질 응집체 축적은 해당 기전에 의해 뇌 뉴런의 죽음을 유도하고 파킨슨병: 미토콘드리아 기능 장애 및 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 기능 장애를 야기한다.
최근 파킨슨병의 병리학적 분석에 따르면, α-Synuclein은 후신경구(olfactory bulb)와 장신경총(enteric plexus)에서 유도되며, 연수(medulla oblongata) 및 뇌교(pons)로 이동 및 전파되어 파킨슨병으로 전달된다. α-Synuclein는 중뇌, 그 다음 피변연 피질(limbic cortex)을 포함한 대뇌영역으로 전파되어 치매 관련 다양한 퇴행성 증상들이 나타나게된다. 증상이 심해지면, 증상-관련 약물 만으로는 파킨슨병의 진행을 막을 수 없다.
현재 파킨슨병에 대한 치료법은 일시적으로 증상을 억제할 뿐이며, 환자의 안전성과 유효성을 만족시키지 못하고 심각한 부작용을 유발하는 근본적인 상태를 개선하는 것은 불가능하다. 미충족 수요 규모는 약 10억8000만 달러로 추산되며, 질병을 근본적으로 치료할 수 있는 새로운 기전-특이적 질병 조절 약물의 개발이 필요하다. 현재 항체 치료제와 같은 바이오의약품은 혈액뇌장벽(blood-brain barrier; BBB)을 통과하거나 병리학적 물질이 생성되는 뇌 신경세포 내부로 전달하기가 어렵다. 파킨슨병 진단 기술이 발전하면서 파킨슨병 치료 가능성은 높아지고 있다. 이를 통해 관련 치료제 시장은 점차 확대될 전망이다. 새로운 약리학적 전달 기술을 기반으로 한 치료제의 개발은 경쟁력이 있으므로 근본적인 치료를 제공할 수 있는 기전-특이적 질병 조절 치료제의 개발이 필요하다.
알츠하이머병
알츠하이머병은 치매에서 가장 흔한 유형으로 중년과 노년기(65세 이상)에 발생하며 전체 치매 중 약 60~70%를 차지한다. 오랫동안 알츠하이머병의 원인을 찾기 위한 노력이 지속되어 왔지만 아직도 밝혀지지 않은 부분이 많다. 알츠하이머병 환자에서 발견되는 주요 증상은 기억과 인지 능력의 감소이다. 초기에는, 최근 기억이 손상되다가 과거 기억까지 저하되며 의사소통 장애가 나타난다. 병이 진행되는 동안 불안, 초조, 우울, 망상 등의 정신행동증상들이 흔히 동반되며, 인지적, 신경학적 증상들은 매우 천천히 진행된다.
신경세포안에서 비정상적으로 꼬여 있는 신경섬유덩어리(neurofibrillary tangles) 역시 알츠하이머병의 특징이다. 타우(tau) 단백질의 인산화가 생화학적 반응을 거쳐 신경 세포 파괴를 촉진한다. 다만, 신경섬유덩어리가 알츠하이머 치매 환자의 뇌에서만 발견되는 것은 아니며, 정상인에서도 발견되지만 알츠하이머 치매 환자의 뇌에 그 양이 많다. 올리고머 Aβ나 신경섬유덩어리와 같은 신경독성 물질로 인한 세포내 손상된 미토콘드리아의 축적과 UPS의 과활성화는 뇌신경세포사를 유도하는 것으로 보고되었 있다. UPS 기능장애가 발생하면 비정상적인 Aβ와 p-Tau 단백질이 뉴런의 세포질에 응집되어 뉴런의 세포사에 의해 알츠하이머병이 유발된다. 그러나 자세한 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다.
2010년 기준 전 세계 치매 관련 시장 규모는 6,040억 달러(전 세계 GDP의 약 1%)로 추산되며, 선진국 뿐만 아니라 개발도상국에서도 환자 수가 증가하고 있어 치매-관련 치료제를 확보하는 것이 시급한 과제이다. 특히, 미국의 베이비붐 세대는 2011년 1월 1일에 65세가 되고, 2022년 12월 31일까지 매일 1만 명이 65세가 되어 고령인구에 진입한다. 미국의 치매-관련 의료 및 간호 비용은 연간 약 2,260억 달러로 추산되며, 이러한 추세가 지속된다면 2050년까지 치매-관련 의료비는 1조 1,000억 달러에 이를 것으로 예상된다.
치매의 원인 중 60% 이상을 차지하는 알츠하이머병은 기억, 언어능력, 실행기능, 운동능력 등 인지기능이 점차 저하된다. Amyloid-β(Aβ) 및 Tau 단백질의 병리학적 마커는 축적되어도 생체 내에서 분해되지 않는다. 알츠하이머병 치매의 주요 원인은 피질/해마 뉴런이 죽는 퇴행성 뇌 질환이다. 아직까지 밝혀지지 않은 다른 병리, 유전적 이상, 연령, 원인 등 다양한 위험인자가 존재한다. 알츠하이머병의 병리학적 특징으로 대표적으로 노인반점(senile plaque; SP)이 있으며, 이는 비정상적인 대사를 통해 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP)로부터 생성된 Aβ가 물에 대한 용해도가 낮아 뇌에 응집 및 축적되어 형성된다. 형성된 노인반점은 세포독성을 가지고 있어 뇌 부위에 있던 신경 세포들의 파괴를 촉진하고 신경전달물질에 영향을 미쳐 임상적으로 치매 상태를 초래한다.
Tau 단백질은 또한 인산화 과정에서 생화학 반응을 거쳐 비정상적으로 꼬인 형태인 신경섬유덩어리를 형성하고, 동시에 신경 독성(세포 독성)을 가지므로 뇌에서 신경세포의 파괴를 촉진한다. 그러나, 신경섬유덩어리가 정상 상태에서도 발견되지만, 특히 알츠하이머병 환자의 뇌에 그 양이 많다. 올리고 Aβ 또는 신경섬유덩어리와 같은 신경독성 물질로 인한 세포내 손상된 마토콘트리아의 축적 및 UPS의 과활성화가 뇌상경 세포사를 유도하는 것으로 보고되어 있다. UPS 기능장애가 발생하면 비정상적인 Aβ와 p-Tau 단백질이 뉴런의 세포질에 응집되어 뉴런의 세포사에 의해 알츠하이머병이 유발된다. 그러나 자세한 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 따라서 시장 수요에 따른 새로운 치매 치료 메카니즘의 개발이 필요하다.
개선된 세포-투과성 변형 Parkin의 개발(iCP-Parkin)
Parkin은 신경세포 사멸에 대한 항-세포자멸사 효과가 입증되되어 있고 기초 연구로 증명된 단백질이다. 파킨슨병 동물모델에서, Parkin을 공급(보충)한 경우 신경세포가 재활성화되어 파킨슨병의 증상이 치료된다는 보고가 있다. Parkin이 비활성화된 도파민성 신경 세포를 활성화함으로써 파킨슨병의 근본적인 치료제로 작용할 수 있다는 증거를 입증한다. Parkin의 기능 상실이 파킨슨병의 병리학적 인자임이 밝혀지면서 Parkin에 의한 미토파지가 중요한 기전으로 작용함이 알려졌다(J. Cell Biol. 2008). Parkin은 손상된 미토콘드리아를 제거하고 및/또는 미토파지를 유도하는 E3 유비퀴틴 리가제이다(Nat Commun, 2012).
C. elegans 파킨슨병 모델에서 Parkin 또는 PINK1 유전자를 제거한 경우, 미토콘드리아 기능장애 및 운동 기능이 상실되고 Parkin-발현 PINK1 결핍 초파리에서 PINK1 돌연변이로 인한 결함 표현형은 Parkin의 보충에 의해 회복되는 것으로 보고되었다(Nature , 2006). 또한 파킨슨병 환자의 뇌에서 Parkin 발현에 문제가 있는 것으로 보고되어 있다(Nat Med, 2005). 또한, 파킨슨병의 주요 병인은 뇌에 존재하는 α-Synuclein이 기능이상으로 인해 축적이 일어나며, 추가적인 미토콘드리아 복합체 I 분해, 산화 스트레스 및 유비퀴틴 프로테아좀 억제와 함께 도파민성 신경 세포의 점진적인 세포자멸사를 초래하게 된다. Parkin 돌연변이는 E3 유비퀴틴 리가제 활성의 상실에 의해 발생하는 비정상적인 단백질의 축적을 유발하고, 도파민 방출 저해와 도파민성 신경 세포의 퇴화를 유발시켜 결국 신경 세포 사멸을 일으킨다. 즉, Parkin의 기능 이상은 α-Synuclein의 축적을 야기시킨다.
TSDT 플랫폼을 이용하여 최적의 파킨슨병 표적 후보를 도출하기 위해 다음과 같은 구조적 스크리닝 과정을 거쳐 iCP-Parkin을 개발하였다.
(1) aMTD321 서열을 무작위로 선별하고 가용화 도메인 [Myxococcus xanthus의 Protein S 유래 SDA(184A/a) 또는 Rattus norvegicus의 cytochrome b 유래 SDB(99A/a)]에 융합하여 His-aMTD321-Parkin-SDA(HM321PSA) 및 His-aMTD321-Parkin-SDB(HM321PSB)을 유도하였다. (2) aMTD321과 SDB 조합의 융합을 기본 골격 구조로 결정하였다. (3) Optimal aMTD Screening Process: aMTD sequence의 치환을 통해, 재조합 단백질의 용해도, 수율, 세포-투과도, 생물학적 활성을 비교 분석하여 최적의 aMTD(aMTD524)를 결정하였다. 10가지 유형의 aMTD이 Parkin과 가용화 도메인 B(SDB)를 결합한 기본 구조로 스크리닝되었다. 10종의 aMTD 중 aMTD524가 가장 우수한 용해도와 수율을 나타내었다.
또한, 10개의 aMTD-융합 Parkin 재조합 단백질의 세포-투과도를 확인한 결과, 모든 단백질이 세포투과성을 가지며 aMTD524가 4번째로 우수하였다. 게다가, 신경독소인 6-OHDA에 의해 유도된 세포독성 환경에서 aMTD524가 가장 우수한 세포보호 효과가 있음이 확인되었다. (4) 다른 CPP(TAT, PolyR, DPV03)와의 비교를 통해 aMTD가 융합된 Parkin의 우수성을 입증하였다. (5) His-Tag를 제거하고 동등성을 입증하였다. (6) aMTD524-Parkin-SDB(M524PSB)를 iCP-Parkin의 리드로 결정하였다
또 다른 신경독소인 MPP+에 의해 유도된 세포독성 환경에서 aMTD524가 세번째로 세포보호 효과가 있었으며, 6-OHDA에 의해 유도된 세포독성 환경에서 세포자멸사 세포를 염색할 수 있는 annexin V 실험에서 aMTD524가 최고의 세포보호 효과를 가지는 것으로 나타났다. 이를 바탕으로 최적화된 리드 구조에 의해 aMTD524/SDB-융합 인간 Parkin 재조합 단백질을 선별하였다. 이 구조는 메커니즘-특이적 파킨슨병 표적 치료제로서, 개선된 세포-투과성 파킨(iCP-Parkin)으로 처음 확인되었다. 즉, iCP-Parkin은 세포보호 효과가 있는 Parkin 단백질의 기능적 도메인에 aMTD524(AVALIVVPALAP(SEQ ID No.123))를 결합시켜 만든 세포투과도가 높은 재조합 단백질이다.
[참조]
1.
PCT/KR2016/008174
상기 기술한 바와 같이, 선행기술인 iCP-Parkin 신경보호 활성 및 항-파킨슨병 효과를 나타내는 큰 잠재력을 갖는다. 그러나, 새로운 치료제 개발을 위한 의약품으로 iCP-Parkin을 생산하기 위해서는 생산 수율을 높이고 대량-생산이 가능한 효과적인 공정 개발이 필요하다. 이를 위해 본 발명은 선행기술의 진보된 시스템으로서 1) iCP-Parkin의 구조를 변형(즉, iCP-mParkin)시켜 단백질의 안정성을 향상시키고, 2) 선행 기술의 치료 활성 및 작용 방식을 유지하면서 대규모로 제조할 수 있는 단백질의 적절한 정제 공정을 개발하는 것을 포함한다.
본 발명은 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 재조합 단백질은:
i)
변형 Parkin 단백질(modified Parkin protein); 및
ii)
aMTD(advanced macromolecule transduction domain)을 포함하고,
상기 변형 Parkin 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고,
상기 aMTD는 서열번호 2 내지 241로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 상기 재조합 단백질은 하나 또는 그 이상의 가용화 도메인(solubilization domain; SD)(들)을 추가로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 재조합 단백질은 하기의 구조식 중 어느 하나로 표현될 수 있으며:
A-B, B-A, A-B-C, A-C-B, B-A-C, B-C-A, C-A-B, C-B-A and A-C-B-C
상기 A는 aMTD(advanced macromolecule transduction domain)이고,
B는 변형 Parkin 단백질이고, 그리고
C는 가용화 도메인(solubilization domain; SD)이다.
일 구현예에 따르면, 상기 재조합 단백질은 서열번호 243의 아미노산을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 상기 가용화 도메인(들)은 서열번호 242의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에 따르면 상기 재조합 단백질은 퇴행성 뇌질환의 치료에 사용된다.
일 구현예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병 및 헌팅턴병을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 iCP-mParkin 재조합 단백질을 코팅하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 활성 성분으로서 상기 iCP-mParkin 재조합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 활성 성분으로서 상기 iCP-mParkin 재조합 단백질; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료용 약제학적 조성물이 제공된다.
이와 관련하여, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 헝틴턴병을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 퇴행성 퇴질환의 치료용 약제로서 상기 iCP-mParkin 재조합 단백질의 용도가 제공된다.
이와 관련하여, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 헝틴턴병을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 iCP-mParkin 재조합 단백질을 포함하는 약제가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 퇴행성 뇌질환의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 iCP-mParkin 재조합 단백질의 용도가 제공된다.
이와 관련하여, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 헝틴턴병을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 퇴행성 뇌질환 환자의 치료 방법이 제공된다.
이와 관련하여, 상기 방법은 iCP-mParkin 재조합 단백질의 치료적으로 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 iCP-mParkin 재조합 단백질의 제조 방법이 제공된다.
이와 관련하여, 상기 방법은:
상기 iCP-mParkin 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오테드 서열을 포함하는 재조합 발현 백터를 제조하는 단계;
상기 재조합 발현 벡터를 사용하여 형질전환체를 제조하는 단계;
상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
상기 배양에 의해 발현된 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 재조합 단백질을 수득하는 단계는:
봉입체(inclusion body)를 세척하는 단계;
제1차 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
제2차 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 세척하는 단계는 pH 8 세척 완충액을 이용한 1 단계 세척을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1차 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이고, 그리고
상기 제2차 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2차 이온 교환 크로마토그래피는:
8.0mS/Cm 전도도 조건에서 세척하는 단계; 및
9.0mS/Cm 전도도 조건에서 용출하는 단계를 포함한다. .
일 구현예에 따르면, 상기 배양하는 단계는 유가식 발효를 포함한다.
iCP-mParkin은 공정 개발 및 구조 변형을 통해, 종래 iCP-Parkin의 여러가지 한계 및 문제점(예를 들면: 낮은 안정성 및 불균일한 단량체 수율, 고비용 SEC 사용)을 해결할 수 있으므로, 이미 피어 리뷰 저널 출판물에서 입증된 iCP-Parkin의 강력한 치료 잠재력을 가진 첨단 약물 소재로 개발될 수 있다. iCP-Parkin의 Ubl 도메인이 삭제된 변형 구조인 iCP-mParkin은 우수한 순도, 균질성, 안정성 및 생물학적 활성을 기반으로 iCP-Parkin의 최종 구조로 선택되었다.
도 1은 Parkin 단백질의 구조 및 소수성 영역을 나타낸다.
도 2는 iCP-Parkin 변이체의 구조 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 3은 HPLC analysis을 이용한 iCP-Parkin 변이체의 단백질 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 시스테인에서 세린으로 변경된 iCP-Parkin 변이체의 구조들을 나타낸다.
도 5는 iCP-Parkin(종래기술) 및 iCP-mParkin의 구조도를 나타낸다.
도 6은 더 높은 균질성과 순도를 갖는 재조합 단백질을 정제하기 위한 Improved Process(IP)의 개발을 예시한다.
도 7은 IB 세척에 의해 생성된 단백질의 불순물이 감소됨을 나타내는 다이어그램이다.
도 8은 재조합 단백질의 불순물을 제거하기 위해 변형된 용출 방법을 나타낸다
도 9는 더 높은 부분의 단량체 iCP-mParkin을 얻기 위한 최적화된 용출 방법을 사용한 1-단계 IB 세척 및 2-단계 컬럼 정제 공정의 개발을 나타낸다.
도 10은 2-단계 컬럼 정제 공정이 불순물을 효과적으로 제거함을 설명하는 도면이다.
도 11은 단량체 iCP-mParkin의 대규모 생산을 위한 단계-용출의 통합을 나타낸다.
도 12는 iCP-mParkin의 전임상 및 임상 개발을 위한 단백질 제조의 최종 공정(FP)을 나타낸다.
도 13은 동일한 조건에서 정제된 iCP-Parkin과 iCP-mParkin의 크로마토그램 비교를 나타낸다.
도 14는 iCP-mParkin의 개선된 안정성을 나타낸다.
도 15는 37℃에서 48시간 동안 및 25℃에서 4일 동안 iCP-mParkin의 안정성을 나타낸다.
도 16은 농도에 따른 iCP-mParkin의 안정성을 나타낸다
도 17은 iCP-mParkin의 특성 요약을 나타내며, iCP-mParkin는 임상 개발 수준에서 적용 가능한 구조적 안정성을 갖는다.
도 18은 유가식 발효의 결과를 나타낸다.
도 19는 세포 질량 수확량에 따른 iCP-mParkin의 IB 수율을 비교한 것이다.
도 20은 유가식 발효로부터 생산된 iCP-mParkin 세포 지량 이용한 정제 결과를 나타낸다.
도 21은 iCP-mParkin 발현을 위한 세포주 개발을 나타낸다.
도 22는 CMO에서 세포주 개발의 최종 결과 세트를 나타낸다.
도 23은 CMO에서 최종 공정(FP) 방법으로 생산된 iCP-mParkin을 나타낸다.
도 24는 CMO 및 셀리버리(Cellivery)에서 생산된 iCP-mParkin의 순도를 나타낸 것이다.
도 25는 CMO에서 생산된 iCP-mParkin의 동결/해동 및 열 안정성을 나타낸다.
도 26은 CMO 및 셀리버리(Cellivery)에서 생산된 iCP-mParkin의 뛰어난 생물학적 활성에 대한 입증을 나타낸다.
도 27은 iCP-mParkin이 세포 투과성임을 나타낸다.
도 27은 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin 재조합 단백질의 가시화된-세포 투과도를 나타낸다. C2C12 세포는 37℃에서 2시간 동안 aMTD에 융합된 FITC-표지된 단백질(10μM)로 처리하였다. (A) 단백질의 세포-투과도는 laser scanning confocal microscopy 으로 가시화하였다. flow cytometry에 의한 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin 재조합 단백질의 세포 투과도를 측정하였다. 두 Parkin 재조합 단백질의 세포-투과도는 각각 C2C12(B)와 A549(C)에서 시각적으로 비교하였다. 흰색 bar는 미처리 세포(비히클)를 나타내고; 검은색 bar 선은 동일한 몰 농도의 FITC(FITC만)로 처리된 세포를 나타내고; 파란색 bar는 FITC-표지된 iCP-Parkin으로 처리된 세포를 나타내고; 빨간색 bar는 FITC-표지된 iCP-mParkin으로 처리된 세포를 나타낸다. 세포-투과도는 flow cytometry analysis에 의해 측정하였다.
도 28은 iCP-mParkin이 손상된 세포에서 세포-투과성임을 나타낸다.
도 28은 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin 재조합 단백질의 세포 투과도 측정 결과를 나타낸다. 두 Parkin 재조합 단백질의 세포 투과도는 6-OHDA 처리 후 C2C12에서 서로 시각적으로 비교하였다. 2시간 인큐베이션 후, 세포를 용해시키고 western blot analysis으로 분석하였다.
도 29는 Parkin 재조합 단백질의 auto-ubiquitination assay 결과를 나타낸다.
도 29는 ATP 유무에 따른 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin의 in vitro 자동-유비퀴틴화 활성의 결과를 나타낸다. 자동-유비퀴틴화는 항-유비퀴틴(FK2)을 사용하여 western blot analyze에 의해 평가하였다.
도 30은 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin에 의한 세포생존율 분석 결과를 나타낸다.
SH-SY5Y 세포를 30μM 6-OHDA 및 10μM의 iCP-Parkin 또는 iCP-mParkin으로 처리하였다. (A) 24시간 인큐베이션 후, 세포를 ATP Glo assay에 적용하였다. 두 개의 재조합 단백질에 의한 세포 생존율은 거의 동일하다는 것이 주목된다. (B) 처리로부터 세포 형태의 변화를 light microscopy으로 모니터링하였다
도 31은 iCP-mParkin이 미토콘드리아 손상 상태에서 미토파지를 촉진함을 나타낸다. (A) SH-SY5Y 세포를 CCCP 및 iCP-Parkin/iCP-mParkin과 함께 4시간 동안 배양하였다. autophagy inhibitor로서 클로로퀸을 처리한 CCCP 또는 CCCP + iCP-mParkin 처리 SH-SY5Y 세포의 용해물에서 autophagy marker인 LC3B-II를 western blot analysis을 통해 검출하였다 (B) 미토파지를 검출하기 위한 confocal microscope images 를 나타낸다.
도 32는 iCP-mParkin이 미토콘드리아 손상 상태에서 미토콘드리아 생합성을 촉진하고 ROS 생성을 억제함을 나타낸다.
도 33은 iCP-mParkin 및 iCP-Parkin의 comparable MoA1에 대한 입증 결과를 나타낸다.
도 34는 iCP-mParkin이 sodium arsenide으로 유도된 세포 사멸 및 α-Synuclein 의 응집된 형태를 억제함을 나타낸다.
sodium arsenide은 TagGFP2-α-Synuclein SH-SY5Y 세포에 독성이 있으며 응집된 α-Synuclein의 축적을 유도한다(A,B). ELISA 분석은 8시간에 가용성 fraction에서 iCP-mParkin에 의한 올리고머화 및 섬유화 α-Synuclein과 같은 병리학적 α-Synuclein 형태의 상당한 감소를 나타낸다.
도 35는 iCP-mParkin 및 iCP-Parkin의 comparable MoA2에 대한 입증을 나타낸다.
도 36은 iCP-mParkin이 iCP-Parkin과 비교하여 생체내 독성을 나타내지 않음을 나타낸다.
iCP-Parkin과 iCP-mParkin(60 mg/kg)을 2주 동안 주 3회 정맥주사하였다. 마우스의 체중, 털 상태 및 행동을 분석하였다
도 37은 iCP-mParkin이 iCP-Parkin과 비교하여in vivo 독성을 나타내지 않음을 보여준다.
iCP-Parkin과 iCP-mParkin(60 mg/kg)을 2주 동안 주 3회 정맥주사하였다. 처리된 마우스로부터의 비장 중량 대 체중의 비율을 분석하였다.
도 38은 iCP-mParkin이 iCP-Parkin과 유사한 6-OHDA-유도 파킨슨병 동물 모델에서 행동 및 분자 결함을 개선함을 나타낸다.
도 38은 6-OHDA-유도 파킨슨병(PD) 마우스 모델에서 iCP-Parkin의 효능을 나타낸다. 6-OHDA(4μg/head)를 선조체의 오른쪽에 주입하였다. Rota-rod test. 상대 행동 활동은 100%로 희석제 대조군의 값을 기준으로 하였다.
도 39는 iCP-mParkin이 6-OHDA-유도 파킨슨병 동물 모델에서 행동 및 분자 결함을 개선함을 나타낸다.
A는 실험 프로토콜의 개략도를 나타낸다. 6-OHDA(4μg/head)를 선조체의 오른쪽에 주입하였다. iCP-mParkin를 우뇌의 ST에 6-OHDA를 주입한 후 2주부터 4주간 주 3회 정맥 주입하였다. B는 Rota-rod test를 나타낸다. 상대 행동 활동은 100%로 희석제 대조군의 값을 기준으로 하였다.
도 40은 iCP-mParkin이 6-OHDA-유도 파킨슨병 동물 모델에서 행동 및 분자 결함을 개선함을 나타낸다.
도 40은 tyrosine hydroxylase(TH) 발현의 western blot analysis 및 ImageJ를 사용하여 정량화된 상대 TH 발현의 그래프를 나타낸다. L과 R은 각각 뇌의 왼쪽과 오른쪽을 나타낸다.
도 41은 투여 2주 후 알츠하이머병 마우스 모델에서 iCP-mParkin의 인지 기능 개선을 나타낸다.
A는 2주 동안 알츠하이머병 모델에서 iCP-mParkin의 용량 의존적 실험 설계를 나타낸다. B는 iCP-mParkin의 투여가 알츠하이머병 모델에서 용량 의존적 방식으로 인지 기능을 유의하게 개선함을 나타낸다.
도 42는 투여 4주 후 알츠하이머병 마우스 모델에서 iCP-mParkin의 인지 기능 개선을 나타낸다.
A는 4주 동안 알츠하이머병 모델에서 iCP-mParkin의 용량 의존적 실험 설계를 나타낸다. B는 iCP-mParkin의 투여가 알츠하이머병 모델에서 저용량 의존 방식으로 인지 기능을 유의하게 개선함을 나타낸다.
도 43은 알츠하이므병 모델의 뇌에서 iCP-mParkin이 병리학적 단백질을 제거함을 나타낸다.
(A) 대표적인 immunohistochemistry 이미지는 iCP-mParkin에 의한 아밀로이드-베타(Aβ) 플라크 제거 및 및 신경보호 효과를 나타낸다.(B) 대표적인 dot-blot 이미지는 가용성 분획에서 iCP-mParkin에 의한 병리학적 Aβ 플라크 형태의 상당한 감소를 나타낸다.(C) dot-blot 이미지의 정량화는 iCP-mParkin에 의한 Aβ 플라크 비율의 현저한 감소를 나타낸다.
도 44는 iCP-mParkin이 Aβ 처리된 HT22 세포에서 3 및 6시간에 반응성 산화 스트레스(ROS) 축적을 차단함을 나타낸다.
도 45는 iCP-mParkin이 LC-MS/MS analysis에 의해 알츠하이므병 모델에서 높은 뇌 전달력을 가졌음을 나타낸다.
(A) AD 모델의 뇌에서 iCP-mParkin의 정량적 양은 Non-CP-mParkin보다 더 풍부하였다. (B) AD 모델에서 iCP-mParkin의 최대 뇌 전달은 2.9%이었다. 시점: 0.5 및 1시간. **p <0.01, 데이터는 각각 Student's t-test을 사용한 평균 ± S.E.M이다.
도 2는 iCP-Parkin 변이체의 구조 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 3은 HPLC analysis을 이용한 iCP-Parkin 변이체의 단백질 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 시스테인에서 세린으로 변경된 iCP-Parkin 변이체의 구조들을 나타낸다.
도 5는 iCP-Parkin(종래기술) 및 iCP-mParkin의 구조도를 나타낸다.
도 6은 더 높은 균질성과 순도를 갖는 재조합 단백질을 정제하기 위한 Improved Process(IP)의 개발을 예시한다.
도 7은 IB 세척에 의해 생성된 단백질의 불순물이 감소됨을 나타내는 다이어그램이다.
도 8은 재조합 단백질의 불순물을 제거하기 위해 변형된 용출 방법을 나타낸다
도 9는 더 높은 부분의 단량체 iCP-mParkin을 얻기 위한 최적화된 용출 방법을 사용한 1-단계 IB 세척 및 2-단계 컬럼 정제 공정의 개발을 나타낸다.
도 10은 2-단계 컬럼 정제 공정이 불순물을 효과적으로 제거함을 설명하는 도면이다.
도 11은 단량체 iCP-mParkin의 대규모 생산을 위한 단계-용출의 통합을 나타낸다.
도 12는 iCP-mParkin의 전임상 및 임상 개발을 위한 단백질 제조의 최종 공정(FP)을 나타낸다.
도 13은 동일한 조건에서 정제된 iCP-Parkin과 iCP-mParkin의 크로마토그램 비교를 나타낸다.
도 14는 iCP-mParkin의 개선된 안정성을 나타낸다.
도 15는 37℃에서 48시간 동안 및 25℃에서 4일 동안 iCP-mParkin의 안정성을 나타낸다.
도 16은 농도에 따른 iCP-mParkin의 안정성을 나타낸다
도 17은 iCP-mParkin의 특성 요약을 나타내며, iCP-mParkin는 임상 개발 수준에서 적용 가능한 구조적 안정성을 갖는다.
도 18은 유가식 발효의 결과를 나타낸다.
도 19는 세포 질량 수확량에 따른 iCP-mParkin의 IB 수율을 비교한 것이다.
도 20은 유가식 발효로부터 생산된 iCP-mParkin 세포 지량 이용한 정제 결과를 나타낸다.
도 21은 iCP-mParkin 발현을 위한 세포주 개발을 나타낸다.
도 22는 CMO에서 세포주 개발의 최종 결과 세트를 나타낸다.
도 23은 CMO에서 최종 공정(FP) 방법으로 생산된 iCP-mParkin을 나타낸다.
도 24는 CMO 및 셀리버리(Cellivery)에서 생산된 iCP-mParkin의 순도를 나타낸 것이다.
도 25는 CMO에서 생산된 iCP-mParkin의 동결/해동 및 열 안정성을 나타낸다.
도 26은 CMO 및 셀리버리(Cellivery)에서 생산된 iCP-mParkin의 뛰어난 생물학적 활성에 대한 입증을 나타낸다.
도 27은 iCP-mParkin이 세포 투과성임을 나타낸다.
도 27은 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin 재조합 단백질의 가시화된-세포 투과도를 나타낸다. C2C12 세포는 37℃에서 2시간 동안 aMTD에 융합된 FITC-표지된 단백질(10μM)로 처리하였다. (A) 단백질의 세포-투과도는 laser scanning confocal microscopy 으로 가시화하였다. flow cytometry에 의한 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin 재조합 단백질의 세포 투과도를 측정하였다. 두 Parkin 재조합 단백질의 세포-투과도는 각각 C2C12(B)와 A549(C)에서 시각적으로 비교하였다. 흰색 bar는 미처리 세포(비히클)를 나타내고; 검은색 bar 선은 동일한 몰 농도의 FITC(FITC만)로 처리된 세포를 나타내고; 파란색 bar는 FITC-표지된 iCP-Parkin으로 처리된 세포를 나타내고; 빨간색 bar는 FITC-표지된 iCP-mParkin으로 처리된 세포를 나타낸다. 세포-투과도는 flow cytometry analysis에 의해 측정하였다.
도 28은 iCP-mParkin이 손상된 세포에서 세포-투과성임을 나타낸다.
도 28은 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin 재조합 단백질의 세포 투과도 측정 결과를 나타낸다. 두 Parkin 재조합 단백질의 세포 투과도는 6-OHDA 처리 후 C2C12에서 서로 시각적으로 비교하였다. 2시간 인큐베이션 후, 세포를 용해시키고 western blot analysis으로 분석하였다.
도 29는 Parkin 재조합 단백질의 auto-ubiquitination assay 결과를 나타낸다.
도 29는 ATP 유무에 따른 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin의 in vitro 자동-유비퀴틴화 활성의 결과를 나타낸다. 자동-유비퀴틴화는 항-유비퀴틴(FK2)을 사용하여 western blot analyze에 의해 평가하였다.
도 30은 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin에 의한 세포생존율 분석 결과를 나타낸다.
SH-SY5Y 세포를 30μM 6-OHDA 및 10μM의 iCP-Parkin 또는 iCP-mParkin으로 처리하였다. (A) 24시간 인큐베이션 후, 세포를 ATP Glo assay에 적용하였다. 두 개의 재조합 단백질에 의한 세포 생존율은 거의 동일하다는 것이 주목된다. (B) 처리로부터 세포 형태의 변화를 light microscopy으로 모니터링하였다
도 31은 iCP-mParkin이 미토콘드리아 손상 상태에서 미토파지를 촉진함을 나타낸다. (A) SH-SY5Y 세포를 CCCP 및 iCP-Parkin/iCP-mParkin과 함께 4시간 동안 배양하였다. autophagy inhibitor로서 클로로퀸을 처리한 CCCP 또는 CCCP + iCP-mParkin 처리 SH-SY5Y 세포의 용해물에서 autophagy marker인 LC3B-II를 western blot analysis을 통해 검출하였다 (B) 미토파지를 검출하기 위한 confocal microscope images 를 나타낸다.
도 32는 iCP-mParkin이 미토콘드리아 손상 상태에서 미토콘드리아 생합성을 촉진하고 ROS 생성을 억제함을 나타낸다.
도 33은 iCP-mParkin 및 iCP-Parkin의 comparable MoA1에 대한 입증 결과를 나타낸다.
도 34는 iCP-mParkin이 sodium arsenide으로 유도된 세포 사멸 및 α-Synuclein 의 응집된 형태를 억제함을 나타낸다.
sodium arsenide은 TagGFP2-α-Synuclein SH-SY5Y 세포에 독성이 있으며 응집된 α-Synuclein의 축적을 유도한다(A,B). ELISA 분석은 8시간에 가용성 fraction에서 iCP-mParkin에 의한 올리고머화 및 섬유화 α-Synuclein과 같은 병리학적 α-Synuclein 형태의 상당한 감소를 나타낸다.
도 35는 iCP-mParkin 및 iCP-Parkin의 comparable MoA2에 대한 입증을 나타낸다.
도 36은 iCP-mParkin이 iCP-Parkin과 비교하여 생체내 독성을 나타내지 않음을 나타낸다.
iCP-Parkin과 iCP-mParkin(60 mg/kg)을 2주 동안 주 3회 정맥주사하였다. 마우스의 체중, 털 상태 및 행동을 분석하였다
도 37은 iCP-mParkin이 iCP-Parkin과 비교하여in vivo 독성을 나타내지 않음을 보여준다.
iCP-Parkin과 iCP-mParkin(60 mg/kg)을 2주 동안 주 3회 정맥주사하였다. 처리된 마우스로부터의 비장 중량 대 체중의 비율을 분석하였다.
도 38은 iCP-mParkin이 iCP-Parkin과 유사한 6-OHDA-유도 파킨슨병 동물 모델에서 행동 및 분자 결함을 개선함을 나타낸다.
도 38은 6-OHDA-유도 파킨슨병(PD) 마우스 모델에서 iCP-Parkin의 효능을 나타낸다. 6-OHDA(4μg/head)를 선조체의 오른쪽에 주입하였다. Rota-rod test. 상대 행동 활동은 100%로 희석제 대조군의 값을 기준으로 하였다.
도 39는 iCP-mParkin이 6-OHDA-유도 파킨슨병 동물 모델에서 행동 및 분자 결함을 개선함을 나타낸다.
A는 실험 프로토콜의 개략도를 나타낸다. 6-OHDA(4μg/head)를 선조체의 오른쪽에 주입하였다. iCP-mParkin를 우뇌의 ST에 6-OHDA를 주입한 후 2주부터 4주간 주 3회 정맥 주입하였다. B는 Rota-rod test를 나타낸다. 상대 행동 활동은 100%로 희석제 대조군의 값을 기준으로 하였다.
도 40은 iCP-mParkin이 6-OHDA-유도 파킨슨병 동물 모델에서 행동 및 분자 결함을 개선함을 나타낸다.
도 40은 tyrosine hydroxylase(TH) 발현의 western blot analysis 및 ImageJ를 사용하여 정량화된 상대 TH 발현의 그래프를 나타낸다. L과 R은 각각 뇌의 왼쪽과 오른쪽을 나타낸다.
도 41은 투여 2주 후 알츠하이머병 마우스 모델에서 iCP-mParkin의 인지 기능 개선을 나타낸다.
A는 2주 동안 알츠하이머병 모델에서 iCP-mParkin의 용량 의존적 실험 설계를 나타낸다. B는 iCP-mParkin의 투여가 알츠하이머병 모델에서 용량 의존적 방식으로 인지 기능을 유의하게 개선함을 나타낸다.
도 42는 투여 4주 후 알츠하이머병 마우스 모델에서 iCP-mParkin의 인지 기능 개선을 나타낸다.
A는 4주 동안 알츠하이머병 모델에서 iCP-mParkin의 용량 의존적 실험 설계를 나타낸다. B는 iCP-mParkin의 투여가 알츠하이머병 모델에서 저용량 의존 방식으로 인지 기능을 유의하게 개선함을 나타낸다.
도 43은 알츠하이므병 모델의 뇌에서 iCP-mParkin이 병리학적 단백질을 제거함을 나타낸다.
(A) 대표적인 immunohistochemistry 이미지는 iCP-mParkin에 의한 아밀로이드-베타(Aβ) 플라크 제거 및 및 신경보호 효과를 나타낸다.(B) 대표적인 dot-blot 이미지는 가용성 분획에서 iCP-mParkin에 의한 병리학적 Aβ 플라크 형태의 상당한 감소를 나타낸다.(C) dot-blot 이미지의 정량화는 iCP-mParkin에 의한 Aβ 플라크 비율의 현저한 감소를 나타낸다.
도 44는 iCP-mParkin이 Aβ 처리된 HT22 세포에서 3 및 6시간에 반응성 산화 스트레스(ROS) 축적을 차단함을 나타낸다.
도 45는 iCP-mParkin이 LC-MS/MS analysis에 의해 알츠하이므병 모델에서 높은 뇌 전달력을 가졌음을 나타낸다.
(A) AD 모델의 뇌에서 iCP-mParkin의 정량적 양은 Non-CP-mParkin보다 더 풍부하였다. (B) AD 모델에서 iCP-mParkin의 최대 뇌 전달은 2.9%이었다. 시점: 0.5 및 1시간. **p <0.01, 데이터는 각각 Student's t-test을 사용한 평균 ± S.E.M이다.
본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다.
본 명세서 전체에서 특별한 언급이 없는 한 "포함" 또는 "함유"라 함은 어떤 구성 요소(또는 구성 성분)를 별다른 제한 없이 포함함을 지칭하며, 다른 구성 요소(또는 구성 성분)의 부가를 제외하는 것으로 해석될 수 없다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산"은 광의적인 개념에서 자연적으로 발생하는 L α-아미노산 또는 그것의 잔기(residue)뿐만 아니라, 더불어 D-아미노산 및 화학적으로 변형된(chemically modified) 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 상기한 아미노산 모방체 및 유사물을 포함하며, 본 발명에서 상기 모방체 및 유사물은 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 본 발명에 따른 iCP-mParkin recombinant protein의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환이 억제되거나 발병이 지연되는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 iCP-mParkin 재조합 단백질의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 대상체에게 소정의 본 발명의 약제학적 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "대상체"는 렙틴 저항성 고도 비만 또는 비만 연관 질환이 발병하였거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 또는 고양이를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Ⅰ. iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질
1.
변형 Parkin(modified Parkin)
본 발명의 일 예는 변형 Parkin을 포함하는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 제공한다. 상기 변형 Parkin은 선행 기술의 iCP-Parkin과 비교하여 단백질의 안정성이 증가되는 효과를 가질 수 있다.
상기 변형 Parkin은 Parkin 단백질에서 일부 도메인이 제거된 형태일 수 있다. 일 실시예로, Parkin 단백질의 Ubl, RING0, RING1, IBR, 및 RING2로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 도메인이 제거된 형태일 수 있다. 구체적인 일 실시예로, 상기 modified parkin은 Ubl 도메인이 제거된 형태일 수 있다. 보다 더 구체적인 일 실시예로, 상기 변형 Parkin은 QEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYNSFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQGPSCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGFAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV(SEQ ID No:1)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다만, 상기 변형 Parkin은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것에 한정되지 않고, 상기 서열과 동일 또는 유사한 효과를 가지는 변형체를 모두 포함할 수 있다.
2.
생물학적 활성 분자를 세포의 원형질 막 내로 전달하는 것을 용이하게 하는 도메인
본 발명의 일 예는 생물학적 활성 분자를 세포의 원형질 막 내로 전달하는 것을 용이하게 하는 도메인을 포함하는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 제공한다. 상기 생물학적 활성 분자를 세포의 원형질 막 내로 전달하는 것을 용이하게 하는 도메인은 일 실시예로 aMTD 도메인을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 세포 투과성을 가지는 양이온, 키메릭, 소수성 CPP(cell penetrating peptide)를 포함할 수 있다.
이때, 상기 생물학적 활성 분자는 단백질, 펩타이드, 핵산, 화합물 등을 포함한다. 본 발명에서 aMTD 도메인은 위에 기재한 SOCS3 단백질의 SH2 도메인을 원형질 막 내로 전달하는 것을 용이하게 하는 펩티드를 의미할 수 있다. 이때, 상기 aMTD 도메인에 관한 것은 한국등록특허 10-1971021에 기재된 내용의 전문이 참고로 포함된다.
일 실시예로, 상기 aMTD 도메인은 서열번호 2 내지 241로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 구체적인 일 실시예로, 상기 aMTD 도메인은 서열번호 123의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
| 서열번호 | 염기서열 |
| 2 | Ala Ala Ala Leu Ala Pro Val Val Leu Ala Leu Pro |
| 3 | Ala Ala Ala Val Pro Leu Leu Ala Val Val Val Pro |
| 4 | Ala Ala Leu Leu Val Pro Ala Ala Val Leu Ala Pro |
| 5 | Ala Leu Ala Leu Leu Pro Val Ala Ala Leu Ala Pro |
| 6 | Ala Ala Ala Leu Leu Pro Val Ala Leu Val Ala Pro |
| 7 | Val Val Ala Leu Ala Pro Ala Leu Ala Ala Leu Pro |
| 8 | Leu Leu Ala Ala Val Pro Ala Val Leu Leu Ala Pro |
| 9 | Ala Ala Ala Leu Val Pro Val Val Ala Leu Leu Pro |
| 10 | Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Leu Leu Ala Val Pro |
| 11 | Ala Val Val Leu Val Pro Val Leu Ala Ala Ala Pro |
| 12 | Val Val Leu Val Leu Pro Ala Ala Ala Ala Val Pro |
| 13 | Ile Ala Leu Ala Ala Pro Ala Leu Ile Val Ala Pro |
| 14 | Ile Val Ala Val Ala Pro Ala Leu Val Ala Leu Pro |
| 15 | Val Ala Ala Leu Pro Val Val Ala Val Val Ala Pro |
| 16 | Leu Leu Ala Ala Pro Leu Val Val Ala Ala Val Pro |
| 17 | Ala Leu Ala Val Pro Val Ala Leu Leu Val Ala Pro |
| 18 | Val Ala Ala Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Leu Pro |
| 19 | Val Ala Leu Leu Ala Pro Val Ala Leu Ala Val Pro |
| 20 | Ala Ala Leu Leu Val Pro Ala Leu Val Ala Val Pro |
| 21 | Ala Ile Val Ala Leu Pro Val Ala Val Leu Ala Pro |
| 22 | Ile Ala Ile Val Ala Pro Val Val Ala Leu Ala Pro |
| 23 | Ala Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Pro |
| 24 | Ala Val Val Leu Ala Pro Val Ala Ala Val Leu Pro |
| 25 | Leu Ala Val Ala Ala Pro Leu Ala Leu Ala Leu Pro |
| 26 | Ala Ala Val Ala Ala Pro Leu Leu Leu Ala Leu Pro |
| 27 | Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro |
| 28 | Leu Val Ala Leu Ala Pro Val Ala Ala Val Leu Pro |
| 29 | Leu Ala Leu Ala Pro Ala Ala Leu Ala Leu Leu Pro |
| 30 | Ala Leu Ile Ala Ala Pro Ile Leu Ala Leu Ala Pro |
| 31 | Ala Val Val Ala Ala Pro Leu Val Leu Ala Leu Pro |
| 32 | Leu Leu Ala Leu Ala Pro Ala Ala Leu Leu Ala Pro |
| 33 | Ala Ile Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Leu Ala Pro |
| 34 | Ala Ala Ile Ile Val Pro Ala Ala Leu Leu Ala Pro |
| 35 | Ile Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ile Ala Ala Pro |
| 36 | Ala Val Ile Val Leu Pro Ala Leu Ala Val Ala Pro |
| 37 | Ala Val Leu Ala Val Pro Ala Val Leu Val Ala Pro |
| 38 | Val Leu Ala Ile Val Pro Ala Val Ala Leu Ala Pro |
| 39 | Leu Leu Ala Val Val Pro Ala Val Ala Leu Ala Pro |
| 40 | Ala Val Ile Ala Leu Pro Ala Leu Ile Ala Ala Pro |
| 41 | Ala Val Val Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ile Val Pro |
| 42 | Leu Ala Leu Val Leu Pro Ala Ala Leu Ala Ala Pro |
| 43 | Leu Ala Ala Val Leu Pro Ala Leu Leu Ala Ala Pro |
| 44 | Ala Leu Ala Val Pro Val Ala Leu Ala Ile Val Pro |
| 45 | Ala Leu Ile Ala Pro Val Val Ala Leu Val Ala Pro |
| 46 | Leu Leu Ala Ala Pro Val Val Ile Ala Leu Ala Pro |
| 47 | Leu Ala Ala Ile Val Pro Ala Ile Ile Ala Val Pro |
| 48 | Ala Ala Leu Val Leu Pro Leu Ile Ile Ala Ala Pro |
| 49 | Leu Ala Leu Ala Val Pro Ala Leu Ala Ala Leu Pro |
| 50 | Leu Ile Ala Ala Leu Pro Ala Val Ala Ala Leu Pro |
| 51 | Ala Leu Ala Leu Val Pro Ala Ile Ala Ala Leu Pro |
| 52 | Ala Ala Ile Leu Ala Pro Ile Val Ala Leu Ala Pro |
| 53 | Ala Leu Leu Ile Ala Pro Ala Ala Val Ile Ala Pro |
| 54 | Ala Ile Leu Ala Val Pro Ile Ala Val Val Ala Pro |
| 55 | Ile Leu Ala Ala Val Pro Ile Ala Leu Ala Ala Pro |
| 56 | Val Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro |
| 57 | Ala Ala Ala Val Val Pro Val Leu Leu Val Ala Pro |
| 58 | Ala Ala Leu Leu Val Pro Ala Leu Val Ala Ala Pro |
| 59 | Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Ala Leu Ala Ala Pro |
| 60 | Ala Ala Ala Leu Ala Pro Val Leu Ala Leu Val Pro |
| 61 | Leu Val Leu Val Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ala Pro |
| 62 | Ala Leu Ile Ala Val Pro Ala Ile Ile Val Ala Pro |
| 63 | Ala Leu Ala Val Ile Pro Ala Ala Ala Ile Leu Pro |
| 64 | Leu Ala Ala Ala Pro Val Val Ile Val Ile Ala Pro |
| 65 | Val Leu Ala Ile Ala Pro Leu Leu Ala Ala Val Pro |
| 66 | Ala Leu Ile Val Leu Pro Ala Ala Val Ala Val Pro |
| 67 | Val Leu Ala Val Ala Pro Ala Leu Ile Val Ala Pro |
| 68 | Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Leu Ile Val Ala Pro |
| 69 | Ala Leu Ile Ala Pro Ala Val Ala Leu Ile Val Pro |
| 70 | Ala Ile Val Leu Leu Pro Ala Ala Val Val Ala Pro |
| 71 | Val Ile Ala Ala Pro Val Leu Ala Val Leu Ala Pro |
| 72 | Leu Ala Leu Ala Pro Ala Leu Ala Leu Leu Ala Pro |
| 73 | Ala Ile Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ala Ile Ala Pro |
| 74 | Ile Ala Leu Ala Ala Pro Ile Leu Leu Ala Ala Pro |
| 75 | Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Val Pro |
| 76 | Val Val Ala Ile Val Leu Pro Ala Leu Ala Ala Pro |
| 77 | Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Val Ala Leu Ala Pro |
| 78 | Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Ala Leu Val Pro |
| 79 | Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Val Ala Leu Pro |
| 80 | Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Val Leu Ala Pro |
| 81 | Val Ile Val Ala Leu Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro |
| 82 | Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Val Ala Pro |
| 83 | Ala Leu Leu Ile Val Ala Pro Val Ala Val Ala Pro |
| 84 | Ala Val Val Ile Val Ala Pro Ala Val Ile Ala Pro |
| 85 | Ala Val Leu Ala Val Ala Pro Ala Leu Ile Val Pro |
| 86 | Leu Val Ala Ala Val Ala Pro Ala Leu Ile Val Pro |
| 87 | Ala Val Ile Val Val Ala Pro Ala Leu Leu Ala Pro |
| 88 | Val Val Ala Ile Val Leu Pro Ala Val Ala Ala Pro |
| 89 | Ala Ala Ala Leu Val Ile Pro Ala Ile Leu Ala Pro |
| 90 | Val Ile Val Ala Leu Ala Pro Ala Leu Leu Ala Pro |
| 91 | Val Ile Val Ala Ile Ala Pro Ala Leu Leu Ala Pro |
| 92 | Ile Val Ala Ile Ala Val Pro Ala Leu Val Ala Pro |
| 93 | Ala Ala Leu Ala Val Ile Pro Ala Ala Ile Leu Pro |
| 94 | Ala Leu Ala Ala Val Ile Pro Ala Ala Ile Leu Pro |
| 95 | Ala Ala Ala Leu Val Ile Pro Ala Ala Ile Leu Pro |
| 96 | Leu Ala Ala Ala Val Ile Pro Ala Ala Ile Leu Pro |
| 97 | Leu Ala Ala Ala Val Ile Pro Val Ala Ile Leu Pro |
| 98 | Ala Ala Ile Leu Ala Ala Pro Leu Ile Ala Val Pro |
| 99 | Val Val Ala Ile Leu Ala Pro Leu Leu Ala Ala Pro |
| 100 | Ala Val Val Val Ala Ala Pro Val Leu Ala Leu Pro |
| 101 | Ala Val Val Ala Ile Ala Pro Val Leu Ala Leu Pro |
| 102 | Ala Leu Ala Ala Leu Val Pro Ala Val Leu Val Pro |
| 103 | Ala Leu Ala Ala Leu Val Pro Val Ala Leu Val Pro |
| 104 | Leu Ala Ala Ala Leu Val Pro Val Ala Leu Val Pro |
| 105 | Ala Leu Ala Ala Leu Val Pro Ala Leu Val Val Pro |
| 106 | Ile Ala Ala Val Ile Val Pro Ala Val Ala Leu Pro |
| 107 | Ile Ala Ala Val Leu Val Pro Ala Val Ala Leu Pro |
| 108 | Ala Val Ala Ile Leu Val Pro Leu Leu Ala Ala Pro |
| 109 | Ala Val Val Ile Leu Val Pro Leu Ala Ala Ala Pro |
| 110 | Ile Ala Ala Val Ile Val Pro Val Ala Ala Leu Pro |
| 111 | Ala Ile Ala Ile Ala Ile Val Pro Val Ala Leu Pro |
| 112 | Ile Leu Ala Val Ala Ala Ile Pro Val Ala Val Pro |
| 113 | Ile Leu Ala Ala Ala Ile Ile Pro Ala Ala Leu Pro |
| 114 | Leu Ala Val Val Leu Ala Ala Pro Ala Ile Val Pro |
| 115 | Ala Ile Leu Ala Ala Ile Val Pro Leu Ala Val Pro |
| 116 | Val Ile Val Ala Leu Ala Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 117 | Ala Ile Val Ala Leu Ala Val Pro Val Leu Ala Pro |
| 118 | Ala Ala Ile Ile Ile Val Leu Pro Ala Ala Leu Pro |
| 119 | Leu Ile Val Ala Leu Ala Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 120 | Ala Ile Ile Ile Val Ile Ala Pro Ala Ala Ala Pro |
| 121 | Leu Ala Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Val Ala Pro |
| 122 | Ala Leu Leu Val Ile Ala Val Pro Ala Val Ala Pro |
| 123 | Ala Val Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 124 | Ala Leu Ala Ile Val Val Ala Pro Val Ala Val Pro |
| 125 | Leu Leu Ala Leu Ile Ile Ala Pro Ala Ala Ala Pro |
| 126 | Ala Leu Ala Leu Ile Ile Val Pro Ala Val Ala Pro |
| 127 | Leu Leu Ala Ala Leu Ile Ala Pro Ala Ala Leu Pro |
| 128 | Ile Val Ala Leu Ile Val Ala Pro Ala Ala Val Pro |
| 129 | Val Val Leu Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Val Pro |
| 130 | Ala Ala Val Ala Ile Val Leu Pro Ala Val Val Pro |
| 131 | Ala Leu Ile Ala Ala Ile Val Pro Ala Leu Val Pro |
| 132 | Ala Leu Ala Val Ile Val Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 133 | Val Ala Ile Ala Leu Ile Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 134 | Val Ala Ile Val Leu Val Ala Pro Ala Val Ala Pro |
| 135 | Val Ala Val Ala Leu Ile Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 136 | Ala Val Ile Leu Ala Leu Ala Pro Ile Val Ala Pro |
| 137 | Ala Leu Ile Val Ala Ile Ala Pro Ala Leu Val Pro |
| 138 | Ala Ala Ile Leu Ile Ala Val Pro Ile Ala Ala Pro |
| 139 | Val Ile Val Ala Leu Ala Ala Pro Val Leu Ala Pro |
| 140 | Val Leu Val Ala Leu Ala Ala Pro Val Ile Ala Pro |
| 141 | Val Ala Leu Ile Ala Val Ala Pro Ala Val Val Pro |
| 142 | Val Ile Ala Ala Val Leu Ala Pro Val Ala Val Pro |
| 143 | Ala Leu Ile Val Leu Ala Ala Pro Val Ala Val Pro |
| 144 | Val Ala Ala Ala Ile Ala Leu Pro Ala Ile Val Pro |
| 145 | Ile Leu Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ile Val Pro |
| 146 | Leu Ala Leu Val Leu Ala Ala Pro Ala Ile Val Pro |
| 147 | Ala Leu Ala Val Val Ala Leu Pro Ala Ile Val Pro |
| 148 | Ala Ala Ile Leu Ala Pro Ile Val Ala Ala Leu Pro |
| 149 | Ile Leu Ile Ala Ile Ala Ile Pro Ala Ala Ala Pro |
| 150 | Leu Ala Ile Val Leu Ala Ala Pro Val Ala Val Pro |
| 151 | Ala Ala Ile Ala Ile Ile Ala Pro Ala Ile Val Pro |
| 152 | Leu Ala Val Ala Ile Val Ala Pro Ala Leu Val Pro |
| 153 | Leu Ala Ile Val Leu Ala Ala Pro Ala Val Leu Pro |
| 154 | Ala Ala Ile Val Leu Ala Leu Pro Ala Val Leu Pro |
| 155 | Ala Leu Leu Val Ala Val Leu Pro Ala Ala Leu Pro |
| 156 | Ala Ala Leu Val Ala Val Leu Pro Val Ala Leu Pro |
| 157 | Ala Ile Leu Ala Val Ala Leu Pro Leu Leu Ala Pro |
| 158 | Ile Val Ala Val Ala Leu Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 159 | Ile Val Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ala Pro |
| 160 | Ile Val Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Ala Pro |
| 161 | Ile Val Ala Leu Ala Val Leu Pro Ala Val Ala Pro |
| 162 | Val Ala Val Leu Ala Val Leu Pro Ala Leu Ala Pro |
| 163 | Ile Ala Val Leu Ala Val Ala Pro Ala Val Leu Pro |
| 164 | Leu Ala Val Ala Ile Ile Ala Pro Ala Val Ala Pro |
| 165 | Val Ala Leu Ala Ile Ala Leu Pro Ala Val Leu Pro |
| 166 | Ala Ile Ala Ile Ala Leu Val Pro Val Ala Leu Pro |
| 167 | Ala Ala Val Val Ile Val Ala Pro Val Ala Leu Pro |
| 168 | Val Ala Ile Ile Val Val Ala Pro Ala Leu Ala Pro |
| 169 | Val Ala Leu Leu Ala Ile Ala Pro Ala Leu Ala Pro |
| 170 | Val Ala Val Leu Ile Ala Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 171 | Ala Val Ala Leu Ala Val Leu Pro Ala Val Val Pro |
| 172 | Ala Val Ala Leu Ala Val Val Pro Ala Val Leu Pro |
| 173 | Ile Val Val Ile Ala Val Ala Pro Ala Val Ala Pro |
| 174 | Ile Val Val Ala Ala Val Val Pro Ala Leu Ala Pro |
| 175 | Ile Val Ala Leu Val Pro Ala Val Ala Ile Ala Pro |
| 176 | Val Ala Ala Leu Pro Ala Val Ala Leu Val Val Pro |
| 177 | Leu Val Ala Ile Ala Pro Leu Ala Val Leu Ala Pro |
| 178 | Ala Val Ala Leu Val Pro Val Ile Val Ala Ala Pro |
| 179 | Ala Ile Ala Val Ala Ile Ala Pro Val Ala Leu Pro |
| 180 | Ala Ile Ala Leu Ala Val Pro Val Leu Ala Leu Pro |
| 181 | Leu Val Leu Ile Ala Ala Ala Pro Ile Ala Leu Pro |
| 182 | Leu Val Ala Leu Ala Val Pro Ala Ala Val Leu Pro |
| 183 | Ala Val Ala Leu Ala Val Pro Ala Leu Val Leu Pro |
| 184 | Leu Val Val Leu Ala Ala Ala Pro Leu Ala Val Pro |
| 185 | Leu Ile Val Leu Ala Ala Pro Ala Leu Ala Ala Pro |
| 186 | Val Ile Val Leu Ala Ala Pro Ala Leu Ala Ala Pro |
| 187 | Ala Val Val Leu Ala Val Pro Ala Leu Ala Val Pro |
| 188 | Leu Ile Ile Val Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Pro |
| 189 | Ile Val Ala Val Ile Val Ala Pro Ala Val Ala Pro |
| 190 | Leu Val Ala Leu Ala Ala Pro Ile Ile Ala Val Pro |
| 191 | Ile Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Leu Val Pro |
| 192 | Ile Ala Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Ala Val Pro |
| 193 | Ala Ala Leu Ala Leu Val Ala Pro Val Ile Val Pro |
| 194 | Ile Ala Leu Val Ala Ala Pro Val Ala Leu Val Pro |
| 195 | Ile Ile Val Ala Val Ala Pro Ala Ala Ile Val Pro |
| 196 | Ala Val Ala Ala Ile Val Pro Val Ile Val Ala Pro |
| 197 | Ala Val Leu Val Leu Val Ala Pro Ala Ala Ala Pro |
| 198 | Val Val Ala Leu Leu Ala Pro Leu Ile Ala Ala Pro |
| 199 | Ala Ala Val Val Ile Ala Pro Leu Leu Ala Val Pro |
| 200 | Ile Ala Val Ala Val Ala Ala Pro Leu Leu Val Pro |
| 201 | Leu Val Ala Ile Val Val Leu Pro Ala Val Ala Pro |
| 202 | Ala Val Ala Ile Val Val Leu Pro Ala Val Ala Pro |
| 203 | Ala Val Ile Leu Leu Ala Pro Leu Ile Ala Ala Pro |
| 204 | Leu Val Ile Ala Leu Ala Ala Pro Val Ala Leu Pro |
| 205 | Val Leu Ala Val Val Leu Pro Ala Val Ala Leu Pro |
| 206 | Val Leu Ala Val Ala Ala Pro Ala Val Leu Leu Pro |
| 207 | Ala Ala Val Val Leu Leu Pro Ile Ile Ala Ala Pro |
| 208 | Ala Leu Leu Val Ile Ala Pro Ala Ile Ala Val Pro |
| 209 | Ala Val Leu Val Ile Ala Val Pro Ala Ile Ala Pro |
| 210 | Ala Leu Leu Val Val Ile Ala Pro Leu Ala Ala Pro |
| 211 | Val Leu Val Ala Ala Ile Leu Pro Ala Ala Ile Pro |
| 212 | Val Leu Val Ala Ala Val Leu Pro Ile Ala Ala Pro |
| 213 | Val Leu Ala Ala Ala Val Leu Pro Leu Val Val Pro |
| 214 | Ala Ile Ala Ile Val Val Pro Ala Val Ala Val Pro |
| 215 | Val Ala Ile Ile Ala Val Pro Ala Val Val Ala Pro |
| 216 | Ile Val Ala Leu Val Ala Pro Ala Ala Val Val Pro |
| 217 | Ala Ala Ile Val Leu Leu Pro Ala Val Val Val Pro |
| 218 | Ala Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Val Ala Val Pro |
| 219 | Ala Ile Ala Leu Val Val Pro Ala Val Ala Val Pro |
| 220 | Leu Ala Ile Val Pro Ala Ala Ile Ala Ala Leu Pro |
| 221 | Leu Val Ala Ile Ala Pro Ala Val Ala Val Leu Pro |
| 222 | Val Leu Ala Val Ala Pro Ala Val Ala Val Leu Pro |
| 223 | Ile Leu Ala Val Val Ala Ile Pro Ala Ala Ala Pro |
| 224 | Ile Leu Val Ala Ala Ala Pro Ile Ala Ala Leu Pro |
| 225 | Ile Leu Ala Val Ala Ala Ile Pro Ala Ala Leu Pro |
| 226 | Val Ile Ala Ile Pro Ala Ile Leu Ala Ala Ala Pro |
| 227 | Ala Ile Ile Ile Val Val Pro Ala Ile Ala Ala Pro |
| 228 | Ala Ile Leu Ile Val Val Ala Pro Ile Ala Ala Pro |
| 229 | Ala Val Ile Val Pro Val Ala Ile Ile Ala Ala Pro |
| 230 | Ala Val Val Ile Ala Leu Pro Ala Val Val Ala Pro |
| 231 | Ala Leu Val Ala Val Ile Ala Pro Val Val Ala Pro |
| 232 | Ala Leu Val Ala Val Leu Pro Ala Val Ala Val Pro |
| 233 | Ala Leu Val Ala Pro Leu Leu Ala Val Ala Val Pro |
| 234 | Ala Val Leu Ala Val Val Ala Pro Val Val Ala Pro |
| 235 | Ala Val Ile Ala Val Ala Pro Leu Val Val Ala Pro |
| 236 | Ala Val Ile Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro |
| 237 | Val Ala Ile Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro |
| 238 | Val Ala Leu Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro |
| 239 | Val Ala Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Val Ala Pro |
| 240 | Val Ala Leu Ala Leu Pro Ala Val Val Val Ala Pro |
| 241 | Val Ala Leu Leu Ala Pro Ala Val Val Val Ala Pro |
1.
가용화 도메인
본 발명의 일 예에서 제공하는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 변형 Parkin 및 aMTD 도메인 외에 추가적으로 하나 이상의 가용화 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 변형 Parkin, aMTD 도메인, 및 가용화 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에서 가용화 도메인을 포함하는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 생체 내에서 가용성이 증가된 효과를 가질 수 있다. 상기 가용화 도메인은 일 실시예로, 생물학적 활성 분자의 용해도를 증가시키는 역할을 하는 펩티드를 포함한다. 상기 가용화 도메인은 구체적인 일 실시예로, MAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWLILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL(SEQ ID No : 242)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않고 생물학적 활성 분자의 가용성을 높이는 것으로 공지된 물질을 모두 포함할 수 있다.
Ⅱ.
iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질 구체적 예시
본 발명의 일 예에서 제공하는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 A-B, B-A, A-B-C, A-C-B, B-A-C, B-C-A, C-A-B, C-B-A, 및 A-C-B-C로 이루어진 군으로부터 선택된 구조식으로 표현될 수 있다. 이때, 상기 A는 aMTD 도메인이며, B는 변형 Parkin이고, C는 가용화 도메인이다.
본 발명의 일 예에서 제공하는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 구체적인 일 예시로 아래와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않고, 상기 I. iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질에 기재된 내용을 조합하여 제조할 수 있는 아미노산 서열을 가지는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 모두 포함할 수 있다.(표 2. 구체적인 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 조조합 단백질 예시)
| No. | 염기서열 | 서열번호 |
| iCP-mParkin | AVALIVVPALAPQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYNSFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQGPSCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGFAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDVMAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWLILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL | 243 |
또한, 본 발명의 일 예에서는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 아미노산 서열의 형태 뿐만 아니라, 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 형태, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 또는 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 형질전환체의 형태로 제공할 수 있다.
Ⅲ. iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질의 용도
1.
약학적 조성물
본 발명의 일 예는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 일 예는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시예로, 상기 조성물은 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 예에서 제공하는 약학 조성물은 담체를 더 포함할 수 있으며, 상기 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 예에 따른 상기 약학 조성물을 제제화할 경우, 당해 분야에서 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 하나 이상 혼합하여 제조할 수 있다.
일 실시예로, 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 다른 일 실시예로, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 세포 투과성을 가지며, 신경독소로부터 신경 세포를 보호하는 역할을 할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 미토콘드리아 손상된 조건에서 미토파지를 촉진하는 역할을 할 수 있다. 또한, 병리학적 ㅇ아알파-synuclein의 축적을 억제하는 역할을 한다. 즉, 상기 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 상기 기전에 따라, 신경 세포를 보호하는 역할을 수행할 수 있다.
이에 따라, 상기 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 신경 세포의 손상과 관련된 질병의 예방, 치료, 개선을 위한 약학적 조성물에 포함되거나, 약으로의 용도, 또는 약을 제조하는 용도로 이용될 수 있다. 신경 세포의 손상과 관련된 질병은 일 실시예로, 퇴행성 뇌질환를 포함할 수 있다. 이때, 퇴행성 뇌질환는 파킨슨병, 알츠하이머병, 헝틴턴병, 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 및 운동 뉴런 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 신경 세포의 손상과 관련된 질병으로 공지된 모든 질병을 포함한다.
2.
치료 방법
본 발명의 일 예에서 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질은 질병의 치료 용도로 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 예는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 질환 치료방법을 제공한다. 이때, 상기 개체는 인간을 포함하는 포유동물을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 예에서 제공하는 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 예에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이때, 상기 질환 치료 방법에서 질환은 2. 약학적 조성물에 기재한 질환에 관한 내용을 모두 포함한다. 즉, 본 발명의 일 예는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병, 알츠하이머병, ㅎ헝틴턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 운동 뉴런 질환을 포함하는 신경 세포의 손상과 관련된 질병 치료 방법을 제공한다.
Ⅳ. iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질의 제조 방법
본 발명의 일 예는 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 아래에 기재된 단계들을 포함할 수 있다:
1.
iCP-mParkin 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계
상기 제조 방법은 iCP-mParkin 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, iCP-mParkin 재조합 단백질에 관한 내용은 I. iCP(improved cell-permeable) - mParkin recombinant protein에 기재된 내용을 모두 포함한다.
본 발명의 "재조합 발현 벡터"는 재조합 펩타이드 또는 단백질을 발현시키기 위한 벡터를 의미할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 제작될 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 예컨대, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터, 플라스미드 벡터 등일 수 있다. 본 발명에 이용되는 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 제작될 수 있다.
2.
재조합 발현 벡터를 에용하여 형질전환체는 제조하는 단계
상기 제조 방법은 재조합 발현 벡터를 에용하여 형질전환체는 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환시키는 숙주세포는 재조합 단백질을 생산하는 숙주세포로서 공지된 것이라면 어떠한 것이든 이용될 수 있다. 숙주세포로는 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예로, E.coli 균주가 사용될 수 있다. 구체적인 일 예시로, E. coli BL21star(DE3), NEB express 균주가 사용될 수 있다. 보다 더 구체적인 일 실시예로, E. coli NEB express 균주가 사용될 수 있다. E. coli NEB express 균주의 경우, 보다 높은 IB(inclusion body) 수율이 얻어질 수 있다. 다만 이에 제한되지 않고, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 와 같은 바실러스 속(bacillus sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 락토바실러스 속(lactobacillus sp.) 균주를 숙주세포로서 이용할 수 있으며, 본 발명은 상기 예시에 제한되지 않는다.
3.
형질전환체를 배양하는 단계
상기 제조 방법은 형질전환체를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 배양은 일 실시예로, 회분식 발효(batch fermentation) 또는 유가식 발효(fed-batch fermentation)을 포함할 수 있다. 구체적인 일 실시예로, 상기 배양은 유가실 발효를 포함할 수 있으며, 이 경우 회분식 발효와 비교하여 재조합 단백질의 수율이 증가되는 효과를 가질 수 있다.
4.
상기 배양에 의해 발현된 재조합 단백질을 수득하는 단계
상기 제조 방법은 상기 배양에 의해 발현된 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 재조합 단백질을 수득하는 단계는 아래에 기재된 내용을 포함할 수 있다:
1)
봉입체를 세척하는 단계
상기 수득하는 단계는 봉입체를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 세척하는 단계는 1회 이상의 세척을 포함할 수 있다. 일 실시예로, 2회 이상의 세척이 포함될 수 있다. 다만, 단백질의 loss를 고려하여, 1회 세척으로 세척하는 단계를 간소화(simplify)할 수 있다. 구체적인 일 실시예로, 상기 세척하는 단계는 5M urea 및 50mM Tris을 포함하는 washing buffer(pH 8)를 이용한 one step washing을 포함할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
2)
이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계
상기 수득하는 단계는 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 일 실시예로, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 2회 수행될 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예로, 2회의 이온 교환 크로마토그래피에서, 제1차 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이고, 제2차 이온 교환 크로마토그래피는 ㅇ음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 상기 수득하는 단계에서 2회의 이온 교환 크로마토그래피가 수행되는 경우, 상기 iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질의 제조 방법은 SEC(Size exclusion chromatography)을 수행하지 않을 수 있다.
상기 제2차 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계는 일 실시예로, step-elution을 포함할 수 있다. 상기 step-elution은 8.0mS/Cm 전도도 조건에서 세척하는 단계 및 9.0mS/Cm 전도도 조건에서 용출하는 단계를 포함한다. 상기 step-elution은 단량체 iCP-mParkin을 높은 비율로 수득(obtain)할 수 있도록 한다.
3)
추가적인 단계
상기 수득하는 단계는 상기 봉입체를 세척하는 단계 단계 및 상기 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계 이외에 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예로, denaturion 단계, Refolding 단계, 및 Dissolving 단계를 포함할 수 있다. 구체적인 일 실시예로, 상기 수득하는 단계는 봉입체를 세척하는 단계, 변성(denaturation), 제1차 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계, 제2차 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계, 재접힘(refolding) 단계, 및 옹해(dissolving)단계를 순서대로 포함할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않고, 재조합 단백질의 효율적인 수득을 위해 각 단계가 변형될 수 있다.
iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질의 효율적인 수득(obtaining)을 위해 바람직한 제조 방법이 도 12에 나타나있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
이때 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명하다.
실시예
1. 개선된 세포 투과성 변형 파킨(iCP-mParkin)의 개발 및 기술적 의미
(1) 균질성 및 안정성 향상을 위한 iCP-mParkin의 구조적 변형 및 스크리닝 및 개발
Parkin 단백질은 N-말단 유비퀴틴 유사(N-terminal ubiquitin-like: Ubl), RING(really interesting new gene) 0, 1, 2, IBR(in between ring), 및 억제 요소(repressor element: REP) 도메인을 포함한 여러 도메인으로 구성된다. RING 도메인은 Parkin 구조 형성에 중요한 아연 결합 부위를 포함한다. RING1 도메인은 E2-Ub 결합 부위이고 RING2 도메인은 E3 유비퀴틴 리가아제(E3 ubiquitin ligase)로서 주요 활성 부위로, Parkin 도메인의 효소 활성에 대한 임계점을 포함한다(도 1). 또한, 소수성 밀집 영역은 소수성 상호 작용으로 인해 Parkin 단백질의 응집 및 불안정성을 유발할 수 있다(도 1). 이러한 구조활성 상관관계(Structure-Activity-Relationship: SAR) 및 소수성 밀도 등의 이론적 근거를 바탕으로, 보다 안정적인 파킨의 구조를 생성하기 위해, 변형된 iCP-Parkin 단백질의 다양한 구조를 발현하는 클론을 개발하고 해당 단백질의 유도 및 정제를 조사하였다(도 2).
대부분의 iCP-Parkin 변이체는 재접힘(refolding) 단계에서 응집되어 분석할 수 없었으며(도 2), 일부 변이체(No. 13-15)는 HPLC 분석으로 정제한 후 분석한 바와 같이 이질적인 종을 나타내었다(도 3).
기존 Parkin 서열에 존재하는 시스테인 잔기(Cysteine residues)는 분자내 및 분자간 이황화 결합의 형성을 방지하기 위하여 세린(serine)으로 변경하여 구조적 안정성을 증가시켰다(도 4).
총 25개의 변형 구조가 설계 및 스크리닝 되었으며 1개의 구조만이 우수한 안정성을 보였다. 나머지 24개는 심각한 응집을 나타내어 컬럼 정제 작업 전에 정제 과정을 중단해야 했다. 기존 파킨에서 UBL 도메인이 삭제된 구조 [aMTD524- Parkin(ΔUBL)-SDB]는 응집을 나타내지 않았다(도 5). 이 변형된 구조를 개선된 세포 투과성 변형 파킨(iCP-mParkin)으로 명명하고 다음 실험에서 사용하였다. 요약하면, 변이체 결실 Ubl 도메인만이 진보된 iCP-Parkin으로서 매우 안정적으로 정제될 수 있었는데, 이는 PD 세포 및 동물 모델을 사용한 이전 연구에서 치료 가능성이 이미 입증된 것이었다.
iCP-mParkin의 서열은 다음과 같다:
MAVALIVVPALAPQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYNSFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQGPSCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGFAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDVMAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWLILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL(SEQ ID No:243)
(2) 대량생산을 위한 정제 단계의 최적화
이 문제를 해결하기 위해 E.coli 시스템에서 변성 및 재접힘 중 물리화학적 조건을 달리함으로써 재최적화한 후 개선된 공정(IP)을 개발하였다. 이는 고순도의 단량체 재조합 단백질의 제조를 가능케 하였다(도 6).
공정 조건 스크리닝은 봉입체(IB) 세척, 컬럼 스크리닝 및 용리방법 스크리닝을 포함한 광범위한 절차에 중점을 두었다. pH 조건 및 완충제는 변성 및 재접힘 과정을 위해 변경되었다. HIC 정제 후 재접힘이 수행되는 이전 공정과 달리, HIC는 AIEX로 대체되었고 재접힘 공정 후에 수행되었다. 재접힘 단백질 농도는 0.1 mg/ml로 보정되었다. AIEX에 이어 SEC 정제를 추가하였다. 변성 전에 추가로 수행된 IB 세척은 재조합 단백질의 순도를 증가시킬 수 있었다(도 7). IB 세척 과정은 1) 더 낮은 pH 버퍼로 1차 세척, 2) 더 낮은 요소 농도 및 더 높은 pH 버퍼로 2차 세척의 두 단계로 구성된다. 이 과정을 통해 불순물을 줄일 수 있었다(도 8).
대규모 생산 이전에는 개선된 공정(IP)에서 추가적인 공정 개발이 요구되었다. 개선된 공정(IP)에서 AIEX와 SEC의 2단계 컬럼 정제는 CIEX와 AIEX로 대체되었고, 대용량의 더 많은 작업량을 고려하여 용출 공정을 단순화하기 위해 구배 용출을 단계 용출(step-elution)로 대체하였다. 2단계 IB 세척 또한 pH 8 세척 완충액을 사용한 1단계 세척 공정으로 단순화되어, 불순물을 효과적으로 제거하면서 표적 단
백질의 손실을 줄이게 되었다(도 9 및 10). 단량체 iCP-mParkin은 다음과 같이 다양한 용출 방법으로 정제되었다: CIEX에서 낮은 pH에서 높은 pH까지 직접 용출, 및 AIEX에서 높은 pH에서 낮은 pH로의 구배 용출(gradient elution)(도 9 및 10).
또한, 용출 방법의 추가 변형으로 구배 용출 방식이 단계 용출(step-elution)로 대체되었다. 구체적으로, 2차 LC의 용출 단계 이전에 8.0 mS/Cm 전도도 조건을 사용하여 세척 단계를 추가하여 불순물을 세척하였다. 9.0 mS/Cm의 전도도를 표적 용출에 사용하여 단량체 iCP-mParkin의 수율을 더 높였다(도 11).
따라서 이러한 대규모 생산에 적합한 변형 공정을 최종 공정(Final Process, FP)이라는 이름으로 개발하였다. 상기 설명한 최적화를 기반으로 개발된 FP를 사용하면 SEC 컬럼 정제 없이도 90%(~92%) 이상의 균질성/순도를 갖는 iCP-mParkin을 제조할 수 있었다(도 12).
이에 비해 iCP-mParkin은 훨씬 더 높은 단량체 부분을 나타내었다(도 13).
37℃에서 iCP-mParkin의 개선된 구조적 안정성을 확인하기 위하여 원형 동적(Circular Dynamic, CD) 분석을 수행하였다. iCP-Parkin(~600초)에 비해 iCP-mParkin은 열적 안정성을 나타내어 1,000초간 측정하는 동안 구조가 유지되었음을 확인하였다(도 14A). 이는 37℃에서 iCP-mParkin의 안정성보다 67% 증가한 수치이다. 1000초 이후의 안정성은 측정되지 않았기 때문에 더 많은 안정성이 있을 것으로 생각되며 추후 업데이트 될 예정이다. iCP-mParkin의 Tm은 iCP-Parkin보다 6℃높게 측정되었다(도 14B). iCP-mParkin의 우수한 안정성을 추가로 입증하기 위하여 확장된 실험을 수행하였다.
iCP-mParkin은 iCP-Parkin에 비해 37℃에서 더 안정적인 것으로 나타났다(도 15). iCP-mParkin은 37℃에서 24시간 후 단량체 부분 손실의 5% 미만을 나타내는 반면 iCP-Parkin은 15% 이상의 손실을 보였다. 이는 임상적 효과가 나타날 때까지 체내에서 안정적으로 유지되어야 하는 치료제의 필요성을 고려할 때 iCP-mParkin이 임상 치료제로서 더 적합함을 시사한다.
FP를 사용하여 정제할 때 iCP-mParkin은 HPLC 분석을 통해 92%의 균질성/순도를 나타냈다. 또한, 두 구조는 25℃의 실온에서 보관했을 때 안정성에서 훨씬 더 큰 차이를 보였다. 4일 보관 후, iCP-mParkin은 단 2%의 단량체 순도 손실을 나타냈다(도 15). 따라서 iCP-mParkin이 37℃및 25℃에서 단량체를 유지하는 능력을 측정하기 위해 HPLC 분석을 수행하였다. 37℃에서 8시간 동안 응집이 일어나지 않은것을 확인한 결과, 체온에서 8시간 동안 안정한 것으로 판단되며, 상온(25
에서는iCP-mParkin이 4일 동안 안정화 될 수 있어 단백질 치료제로써 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
더 높은 단백질 농도(10ug/ul)에서 안정성이 평가되었을 때, 다량체 부분이 더 많이 증가된 iCP-Parkin과 비교하여, iCP-mParkin은 20ug/ul에서도 안정적으로 유지되었다(도 16). 이는 급격한 수율 저하(iCP-Parkin 농축 시(10ug/ul 이상) 시에 비해 우수한 안정성이다.
결론적으로, 공정 개발 및 구조 변형을 통해, iCP-mParkin은 이전 발명된 iCP-Parkin이 갖던 여러 가지 기존의 한계 및 문제(예: 낮은 안정성 및 불균일한 단량체 수율, 및 고비용 SEC 사용)를 해결할 수 있다. 이는 상호 심사 저널 출판물에서 기 입증된 iCP-Parkin의 강력한 치료 잠재력을 활용한 첨단 약물 소재로의 개발로 이어진다. FP로 생산했을 때의 우수한 순도, 균질성, 안정성 및 생물학적 활성을 바탕으로, Ubl 도메인이 삭제된 iCP-Parkin의 변형된 구조인 iCP-mParkin을 다음과 같이 iCP-Parkin의 최종 구조로 선택되었다(도 17):
- 구조 최적화: UBL 결실(열안정성, 31℃ → 37℃)
- 공정 최적화(1): 변성/재접힘 조건을 수정하여 증가된 균질성(단량체 수율, 81% → 92%)
- 공정 최적화(2): IB 세척/용출 조건을 재최적화하여 제거된 불순물.
- 공정 최적화(3): 교체된 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼.
- 공정 최적화(4): 대량 생산을 위한 유가식 발효 전반에 걸쳐 20배 증가된 단백질 수율(4 → 80mg/L).
(3) 세포량 증가를 위한 유가식 발효(fed-batch fermentation)
새로 개발된 iCP-mParkin은 구조적으로 안정적이고 치료적으로 기능적이었으나, 단백질 수율이 부족하였다. 단백질의 최종 수율을 높이기 위해 회분식 발효(batch fermentation) 대신 유가식 발효를 사용하였다. 회분식 발효와 달리 유가식 발효는 영양소의 지속적인 공급을 사용하여 세포 질량과 단백질 수율을 최대화하므로 후속 정제 작업에 사용될 세포 수확량이 약 10배 증가하였다(도 18).
유가식 발효는 셀리버리(Cellivery)의 기존 발효 공정에 비해 약 20배의 수율 증가를 보였다. 이 수율과 공정은 cGMP 인증 CMO로 기술 이전하기에 충분한 것으로 간주되었다(도 19). 또한, E.coli 배양 방법으로서 유가식 발효를 최적화하여 약물 개발을 위한 GMP 수준의 CMO에서 고수율로 iCP-mParkin을 생산하였다. 이 방법으로 세포 질량이 20배 증가하였다.
새로운 유가식 발효와 이전 배치 발효의 iCP-mParkin 제품은 동일하다(도 20).
(4) 대규모 생산을 위한 CMO에서의 iCP-mParkin 생산
셀리버리가 개발한 FP는 글로벌 cGMP급 CDMO로 기술이전 됐다. CMO에서 iCP-mParkin을 생산하기 위해 E.coli 세포주 개발이 완료되었다(도 21 및 22). 10종의 숙주 균주와 5종의 플라스미드를 조합하여 만든 E.coli 세포주(16종)를 클로닝 및 형질전환하여 스크리닝하였다. 고처리량 스크리닝을 통해 배양조건뿐만 아니라 벡터, 유도계(예: IPTG, Rhamnose), 첨가제(예: proline/glucose)에 따른 발현량 및 순도를 비교하여 최적의 조건 및 세포주를 선정하였다. 그 결과 NEB express가 가장 높은 iCP-Parkin 생산성(순도 및 발현 수율)을 보였다(도21).
NEB 발현 염색 시스템에서 IB 수율의 고밀도 가능성은 7.4g/L로 예상되며, 이는 전체 규모의 유가식 발효에 의한 BL21 스타(DE3) 염색보다 훨씬 높다(도 22).
이 세포주를 이용하여 iCP-mParkin을 15L 규모로 생산하였다. 단백질 품질의 장소별 변동을 확인하기 위해, CMO 세포 덩어리(NEB Express) 및 FP 공정을 이용한 iCP-mParkin의 기업내 생산은 CMO에서 생산된 것과 유사한 순도와 균질성을 보여주었다(도 23 및 24).
정제 후 단백질 특성(예: 순도, 균질성 및 안정성) 및 활성은 SDS-PAGE, HPLC로 조사되었다. 안정성에 관하여는, 셀리버리 사내와 CMO에서 생산된 iCP-mParkin의 반복적 동결/해동 및 열적 안정성이 조사되었다(도25). 그 결과 iCP-mParkin은 물리적 스트레스에 대한 구조적 완전성과 안정성을 유지했으며, 이는 FP가 CMO에서 생산한 iCP-mParkin가 임상 약물 개발을 위해 대규모로 제조될 수 있음을 나타낸다.
또한 CMO에서 생산된 iCP-mParkin은 셀리버리에서 생산된 iCP-mParkin과 유사한 뛰어난 생물학적 활성을 보인다(도 26).
2. 발명의 효과
2-1. 파킨슨병(PD) 모델에서 iCP-mParkin의 효능
(1) Parkin 재조합 단백질의 세포투과성
이전에, iCP-Parkin은 세포 투과성이 있음이 입증되었다. iCP-mParkin은 구조적 변형 및 개선된 정제 과정을 통해 생성되었으므로, 새로운 Parkin 재조합 단백질의 세포 투과성을 기존의 Parkin 재조합 단백질과 비교하여 조사하였다. Parkin 재조합 단백질의 세포 투과성은 단백질 처리 2시간 후 C2C12 세포에서 평가되었다. FITC로 표지된 aMTD 함유 Parkin 재조합 단백질, iCP-Parkin 및 iCP-mParkin은 유사한 세포 투과성을 나타내었는데, 이를 위해 단백질 세포내 국소화를 관찰하기 위해 형광 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하였다(도 27A). 다음으로, 세포 투과성을 정량화하기 위해 FITC와 1시간 인큐베이션 후 C2C12 세포 및 A549 세포에서 유세포 분석을 수행하였다. iCP-mParkin의 세포 투과성은 iCP-Parkin보다 약간 우수하다(도 27B 및 C). 이러한 결과는 iCP-mParkin이 짧은 시간 내에 성공적으로 세포에 침투할 수 있고 iCP-Parkin에 비해 향상된 세포 투과성을 가지고 있음을 보여주었다.
손상된 상태에서 세포 투과성을 조사하기 위해 파킨슨병을 모방한 6-OHDA를 세포에 처리한 후 iCP-Parkin과 iCP-mParkin과 함께 2시간 동안 인큐베이션 하였다. iCP-Parkin 및 iCP-mParkin의 세포 투과성을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. iCP-Parkin과 iCP-mParkin 모두 정상 및 손상된 상태에서 세포로 침투할 수 있었다(도 28). 이 결과는 iCP-mParkin이 iCP-Parkin에 비해 유사한 세포 투과성을 나타냄을 보여주었다.
Parkin 재조합 단백질의 전달. 세포 투과성의 시각화를 위해 Parkin 재조합 단백질을 제조업체의 지침에 따라(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) FITC(fluorescein isothiocyanate)에 접합하였다. C2C12 세포를 24웰 챔버 슬라이드의 커버슬립에서 24시간 동안 배양하고, 10μM의 비히클(배양 배지, DMEM), FITC 단독, FITC-접합 재조합 단백질을 2시간동안 37℃에서 처리한 후 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 처리된 세포를 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA, Junsei, Tokyo, Japan)에 고정하고 PBS로 3회 세척하고, 핵 염색을 위해 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)와 함께 마운팅 베지(Mounting Medium, Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)에 봉입하였다. 형광 신호의 세포내 위치는 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 확인하였다.
정량적 세포 투과성을 위하여, C2C12 세포를 37℃에서 1시간 동안 10μM의 FITC 표지된 재조합 단백질로 처리하고, 차가운 PBS로 3회 세척하고, 37℃에서 10분 동안 프로테이나아제 K(5μg/ml)로 처리하여 세포 표면 결합 단백질을 제거하였다. 이러한 재조합 단백질의 세포 투과성은 플로우조(FlowJo) 분석 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석기(FACS Calibur; BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 의해 분석되었다.
세포 투과성의 웨스턴 블롯 분석을 위해, C2C12 세포를 6-OHDA(30μM), iCP-Parkin(10μM) 및 iCP-mParkin(10μM)으로 2시간 동안 처리하였다. 인큐베이션 후, 세포를 용해시키고 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다.
(2) Parkin 재조합 단백질의 생물학적 활성
iCP-mParkin은 ATP Glo 분석에서 E3 유비퀴틴 리가아제와 동등한 자가 유비퀴틴화 활성 및 세포 보호 활성을 나타낸다(도 29 및 30). 또한, iCP-mParkin은 동등한 이중 작용 모드를 보여주었다(도 31-35): 1) 미토파지 및 미토콘드리아 생합성에 의한 미토콘드리아 회복, 2) 병리학적 α-시누클레인 축적 감소.
효소 활성을 알아보기 위해 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin에서 자동 유비퀴틴화가 평가되었다. iCP-mParkin의 E3 유비퀴틴 리가아제로서의 생화학적 활성을 분석하기 위하여 시험관에서 자동 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. iCP-Parkin은 유비퀴틴(FK2)에 대한 항체로 입증된 바와 같이 시험관 내에서 자체적으로 유비퀴틴화되었다(도 29). iCP-Parkin의 결과와 일치하게, iCP-mParkin은 ATP의 존재 여부에 관계없이 자동 유비퀴틴화할 수 있었다. 이러한 결과는 iCP-mParkin이 UBL 도메인을 포함하지 않더라도 iCP-mParkin은 활성형 E3 리가제인 반면 CI-iCP-Parkin은 E3 리가제 유비퀴틴 활성 없이 촉매적으로 비활성임을 의미한다.
이전에 우리는 iCP-Parkin이 용량 의존적으로 신경독소[1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) and 6-hydroxydopamine (6-OHDA)]로부터 신경 세포를 보호할 수 있다고 발표했었다. iCP-mParkin의 세포 보호 효과는 SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA를 사용하여 확인되었다(도 30). 그 결과는 iCP-mParkin이 세포독성으로부터 유의하게 보호되었음을 의미한다.
E3 유비퀴틴 리가아제로서의 iCP-Parkin의 자동 유비퀴틴화 활성. iCP-Parkin 및 iCP-mParkin에서 자동 유비퀴틴화를 평가하여 효소 활성을 확인하였다. E3 유비퀴틴 리가아제로서의 iCP-Parkin및 iCP-mParkin의 생화학적 활성을 분석하기 위하여 제조사의 지시에 따라 자동 유비퀴틴화 분석(Boston Biochem)을 이용하여 시험관 내 Parkin E3 리가아제 활성을 측정하였다. 요약하면, 정제된 Parkin 단백질 1μg을 0.1μM E1, 1μM E2, 50μM 유비퀴틴 및 10μM Mg-ATP와 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 항-유비퀴틴 항체(1:1,000, Enzo Life Science)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
iCP-mParkin의 세포 보호 효과. iCP-Parkin의 세포보호 효과는 신경독소인 6-하이드록시도파민 (6-hydroxydopamine, 6-OHDA)을 이용하여 확인하였다. 인간 뇌종양(SH-SY5Y) 세포(한국세포주은행)를 배양 및 도말하고 70% 컨플루언스로 SH-SY5Y 세포를 37℃에서 24시간 동안 30μM 6-OHDA 및 10μM Parkin 재조합 단백질로 전처리하였다. 그 후 셀 타이터 글로 분석(CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega)으로 세포보호 분석이 평가되었다. 셀 타이터 글로 분석은 ATP의 존재량을 정량화하여 배양 중인 생존 세포의 수를 결정하는 균질한 방법으로, 대사적 활성형 세포의 존재를 나타낸다. 세포 생존력은 셀 타이터 글로 세포 생존력 분석에 의해 평가되었고 발광 플레이트 판독기(luminescence plate reader, Synergy H1, Biotek Instruments)를 사용하여 정량화되었다.
(3) 작용 방식(MoA 1 & 2): iCP-mParkin은 손상된 미토콘드리아(1) 및 병적 α-시누클레인(2)의 축적으로부터 뉴런을 지킨다.
파킨은 손상된 미토콘드리아를 제거하는 자가포식 과정 중 하나인 미토파지에 관여한다. CCCP와 같은 화학 물질의 처리로 유도된 미토콘드리아 손상은 PINK1의 축적 및 그 후 미토콘드리아에 대한 Parkin 활성화에 의한 일련의 미토파지 과정을 야기한다. 따라서, 우리는 iCP-mParkin 처리가 미토콘드리아가 손상된 조건에서 미토파지를 가속화할 수 있다고 가정하였다. 이 연구에서 미토파지 유동의 촉진은 미토콘드리아가 리소좀으로의 증가된 국소화나 독소 처리 조건에서 증가된 미토파지와 상관관계가 있었다. 미토파지 유동은 자가포식소체 막에 위치한 자가포식 마커인 LC3B-II의 수준을 측정하여 분석하였다.
CCCP 처리는 LC3B-II/LC3B-I 비율의 수준을 점진적으로 증가시켰다. 그러나 iCP-mParkin은 시간이 지남에 따라 CCCP 처리된 세포에서 LC3B-II/LC3B-I 비율을 더욱 향상시켰으며, 이는 iCP-mParkin 처리 후 미토파지의 증가와 일치했다(도 32).
따라서 이러한 데이터는 iCP-mParkin이 손상된 미토콘드리아를 대체하기 위해 미토파지 및 미토콘드리아 생합성(도 31-32)을 촉진함을 나타낸다.
산발성 파킨슨병은 α-시누클레인 단백질의 병리학적(올리고머화, 섬유질화 및 인산화) 형태뿐만 아니라 신필린-1(Synphilin-1, α-시누클레인 상호작용 단백질) 및 패일-R(Pael-R, 루이소체의 누적 단백질의 일종)을 갖는 루이소체로 알려진 구조와 연관되어 있다. 신필린-1 및 패일-R은 Parkin 기질로 알려져 있다; 반면, 상충되는 보고에도 불구하고 α-시누클레인은 단백질이 글리코실화되는 경우를 제외하고는 Parkin 기질로 보이지 않는다. 녹색 형광 단백질(TagGFP2-α-Synuclein)로 태그된 α-시누클레인을 발현하도록 조작된 SH-SY5Y 세포를 사용하여, iCP-mParkin이 아비산나트륨(NaAsO2)에 의해 유도된 α-시누클레인 침착 수준에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 우리는 아비산나트륨이 올리고머화/섬유질화 α-시누클레인의 수준을 증가시켰고 iCP-mParkin이 올리고머화/섬유질화 α-시누클레인의 응집 수준을 감소시켰음을 확인하였다(도 34 A & B).
미토콘드리아가 손상된 상태에서 iCP-Parkin 매개 미토파지. 파킨은 손상된 미토콘드리아를 제거하는 자가포식 과정 중 하나인 미토파지에 관여한다. CCCP와 같은 화학 물질의 처리로 유도된 미토콘드리아 손상은 PINK1의 축적과 그 후 미토콘드리아에 대한 Parkin 활성화에 의한 일련의 미토파지 과정을 야기한다. 미토파지 유동의 촉진을 조사하기 위해 자가포식소체막에 위치한 오토파지 마커인 LC3B-II의 수준을 CCCP(10μM), 클로로퀸(40μM) 및 iCP-mParkin(40μM) 처리로 분석하였다. 인큐베이션 후, 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석하여 LC3B-II/LC3B-I 비율 수준을 측정하였다.
TagGFP2-α-시누클레인-발현 SH-SY5Y 신경 세포에서 α-시누클레인 응집체의 분해 평가를 위한 시험관 내 연구. 새로운 녹색 형광 SH-SY5Y 세포주는 TagGPF2-α-시투클레인으로 안정적인 형질감염을 통해 발현되었다. TagGFP2-α-시누클레인 세포주는 안정적으로 형질감염 되었으며 세포 기반 분석 응용 분야에서 사용가능 하다. 이 안정적으로 형질감염된 세포주는 일관된 수준의 α-시누클레인 발현을 보인다. 이 세포주는 파킨슨병 연구를 위한 "시험관 내" 모델로 사용하기 위한 것이다. 아비산염은 강력한 유비쿼터스 환경 독성 금속이다. 비소는 미토콘드리아 막 전위의 손실을 유도하고 활성 산소 종(ROS)의 생성과 지질 과산화를 유도한다. TagGFP2-α-시누클레인-발현 SH-SY5 세포를 iCP-mParkin(20μM)과 아비산나트륨(20μM)으로 처리하였다. 인큐베이션 후, 세포 용해물은 항-알파-시누클레인 응집체 항체 및 인간 알파-시누클레인 Gly111-Tyr125 항체로 ELISA 분석하였다.
(4) iCP-Parkin 및 iCP-mParkin의 생체 내 독성
새로 개발된 iCP-Parkin의 생체 내 독성 여부를 알아보기 위해 일반 독성 점수를 측정하였다. 이 두 그룹의 마우스에 60 mg/kg의 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin을 처리하였다. 각 그룹은 2주 동안 주 3회 정맥 주사하였다. 주사 후, 마우스의 체중, 털 상태 및 행동을 분석하였다. iCP-Parkin을 주사한 마우스 그룹은 iCP-mParkin과 비교하여 독성 점수를 나타냈다(도 36).
새로 개발된 iCP-mParkin이 생체 내 독성이 있는지 알아보기 위해 비장 독성 분석을 측정했다. 이 두 그룹의 마우스에 60 mg/kg의 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin을 처리하였다. 각 그룹은 2주 동안 주 3회 정맥 주사하였다. 주사 후 쥐의 비장 무게와 체중의 비율을 분석하였다. iCP-Parkin이 주사된 마우스 그룹은 iCP-mParkin과 비교하여 높은 비장 독성 점수를 나타냈다(도 37). 이러한 결과는 iCP-mParkin이 생체 내 독성이 없음을 시사한다.
(5) iCP-Parkin 및 iCP-mParkin의 생체 내 효능
iCP-Parkin 및 iCP-mParkin의 신경보호 활성은 6-하이드록시도파민(6-OHDA)-유도 마우스 모델에서 테스트하였다. iCP-Parkin 및 iCP-mParkin 투여의 치료 효능을 확인하기 위해 6-OHDA로 유도된 PD 마우스 모델에서 4주 주사 프로토콜을 수행하였다(도 38). iCP-Parkin과 iCP-mParkin을 4주간 주 3회 정맥주사하였다. 로타-로드 테스트(rota-rod test)는 iCP-Parkin 및 iCP-mParkin으로 처리된 마우스에서 유사한 운동 기능 장애 회복을 보여주었다.
iCP-Parkin 및 iCP-mParkin의 생체 내 독성. iCP-Parkin과 iCP-mParkin(60 mg/kg)을 2주 동안 주 3회 정맥주사하였다. 일반 독성 점수(체중, 털 상태 및 마우스 행동 포함) 및 비장 중량과 체중 간의 비율을 분석하였다.
iCP-mParkin 투여의 치료 효능을 확인하기 위해 6-OHDA로 유도된 PD 마우스 모델에서 4주 주사 프로토콜을 수행하였다. iCP-mParkin을 4주간 주 3회 정맥주사하였다. 로타-로드 테스트는 iCP-mParkin 처리가 운동 기능 장애를 개선함을 보여준다(도 39 및 40). 또한 iCP-mParkin 처리는 PD 마우스 모델에서 TH 발현 수준(90%)을 회복시켰다.
6-OHDA 유도 PD 마우스 모델. iCP-Parkin은 PD 관련 운동 증상을 예방 및/또는 회복하는 능력에 대해 여러 동물 모델에서 테스트되었다. 각 모델에서 운동 증상의 발병은 iCP-mParkin 처리를 시작하기 전에 아포모르핀 회전 테스트를 통해 확인되었다. 동물에게 아포모르핀(0.1% 아스코르브산 용액에 새로 용해하고, 사용하기 전에 어두운 곳에서 얼음 위에 보관) 0.1mg/kg을 피하 주사하고 병변이 있는 마우스의 측면 편향 회전이 20분 이상 60턴 정도의 비율보다 빠른 유증상으로 판단하였다. Parkin 단백질은 정맥 내(i.v.) 투입되었다. 본문에 설명된 시간과 용량, 그리고 운동 기능의 변화를 아래 설명된 대로 모니터링하였다. C57BL/6 마우스(13주 수컷)는 알팍산:롬펀(Alpaxan:Rompun, Bayer)의 3:7 혼합물로 마취되었다. 뇌고정 장치에 위치시킨후 0.02% 아스코르브산(Sigma-Aldrich) 0.8μL에 용해된 4μg 6-OHDA(Sigma-Aldrich)를 다음 좌표에서 선조체에 0.2μL/min의 속도로 주입하였다(전두천문에 상대적): 전방-후방(AP) =+0.6mm, 내측-측면(ML) = -2.2 mm 및 등쪽-복부(DV) = -3.2 mm(경막에서) 평평한 두개골 위치로. 대조군 마우스에는 0.02% 아스코르브산 용액만 주사하였다.
로타-로드(Rota-rod) 테스트. 안정적인 성능을 달성하기 위해 마우스는 300초 또는 720초 동안 15rpm으로 로타-로드 장치에서 사전 훈련되었다. 테스트는 300초에 걸쳐 4에서 40rpm으로 점진적으로 가속된 속도로 수행되었으며 각 마우스가 막대에 머무를 수 있는 시간을 기록하였다. 동물당 3번 테스트되었다.
동물 연구에서 티로신 수산화효소에 대한 웨스턴 블롯 분석. 뇌 샘플에서 티로신 하이드록실라아제를 분석하기 위해, 분리된 뇌를 프로테아제 억제제(Thermo Fisher Scientific)가 포함된 예비 용해 완충액(iNtRON Biotechnology)에서 균질화하였다. 정량화된 세포 용해물을 10% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. 막을 TH(1:2,000; Millipore, AB152) 및 β-액틴(1:100,000; Sigma-Aldrich, A3854)에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후 2차 항체를 인큐베이션하였다. 슈퍼시그널 웨스트 듀라(Supersignal West Dura, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 시각화한 후, 면역블롯을 이미지제이 (ImageJ) 소프트웨어로 정량화하였다.
2-2. 추가적인 시사점(알츠하이머병, AD): AD 모델에서 iCP-mParkin의 효능
(1) 피브릴 아밀로이드-베타(fibril amyloid-beta, fAβ)-유도 AD 모델에서 2주간 iCP-mParkin 투여 후 인지기능 개선 효과
정위 수술을 통해 4μg의 피브릴 아밀로이드-베타(fAβ)를 뇌에 주입하여 AD 마우스 모델을 유도하였다. 수술 2주 후 인지기능(자발적 변경) 검사인 Y-미로 검사를 통해 알츠하이머병 마우스 모델의 유도 여부를 확인하였다. 동물을 무작위로 분류한 후, iCP-mParkin을 용량 의존적으로 총 2주 동안 주 3회 정맥내(IV) 투여하였다. 3주와 4주차에 Y-미로 테스트를 통하여 iCP-mParkin 투여에 의해 인지기능이 향상되었는지 여부를 확인하였다(도 41A). 그 결과, iCP-mParkin을 4주차에 투여했을 때, iCP-mParkin 100 mg/kg에서 인지 기능이 122% 향상되었다(도 41B).
동물. 연구는 대한바이오링크(음성군, 한국)에서 구입한 연령이 일치된 C57BL/6 수컷 마우스(7-8주령)를 사용하여 수행하였다. 온도(설정점 23±2℃상대 공기 습도(설정점 50%) 및 명조건(8:00-20:00시에 조명 켜기/끄기)가 엄격하게 통제된 기관 동물방에서 5마리의 그룹으로 보존되었다. 연구 전반에 걸쳐 수돗물과 표준 실험실 음식이 임의로 제공되었다.
피브릴 아밀로이드-베타(fAβ)-유도 AD 마우스 모델. C57BL/6 수컷 마우스를 알팍산:롬펀 7:3 혼합물로 마취시킨 후 뇌고정 장치에 위치시킨 다음 좌표에서 정위수술을 통해 fAβ(rPeptide, A1170) 4㎍을 뇌에 주입하였다(전두천문에 상대적): 전방-후방(AP): -2 mm, 내측-측면(ML): 0 mm 및 등쪽-복부(DV): -3 mm(경막에서) 평평한 두개골 위치로. 대조군 마우스에는 0.01% 아스코르브산 용액만 주사하였다.
행동 테스트(Y-미로). AD 마우스 모델은 인지기능(자발적 교체) 테스트인 Y-미로 테스트를 통해 검증하였다. Y-미로 장치(팔 길이: 35 cm, 벽 높이: 9 cm)는 흰색 폴리염화비닐(PVC)로 형성된 동일한 길이의 팔 3개가 중간에서 결합되어 'Y'자 모양을 형성한다. 이 생태학 연관 테스트는 새로운 영역을 탐색하려는 설치류의 타고난 호기심을 기반으로 하며 부정적인 또는 긍정적인 강화물이 없으며 마우스에 대한 스트레스가 거의 없다. Y-미로에 마우스를 배치한 직후 비디오 녹화 시스템을 활성화한다. 재생을 누르고 8분 동안 각 마우스에 대한 자발적인 동작을 기록한다. 세션이 완료되면 마우스를 홈 케이지에 부드럽게 놓고 케이지를 선반에 회수한다. 각 세션 사이에 무향 표백제 살균 70% EtOH 물수건으로 미로를 잘 청소한다. 자발적 교대 측정은 마우스가 3개의 연속적인 팔 입구 각각에서 미로의 다른 팔로 들어갈 때 이뤄진다. 교대 비율은 실제 교대 횟수 대 최대 교대 수의 비율로 계산되었다.
(2) fAβ 유발 AD 모델에서 4주간 iCP-mParkin 투여 후 인지기능 개선 효과
AD 마우스 모델은 정위 수술을 통해 4μg의 피브릴-아밀로이드-베타(fAβ)를 뇌에 주입하여 유도하였다. 수술 2주 후, Y-미로 테스트를 통해 AD 마우스 모델의 유도 여부를 확인하였다. 동물을 무작위로 분류한 후, iCP-Parkin을 용량 의존적으로 총 4주 동안 주 3회 정맥 주사하였다. 3주, 4주, 5주, 6주차에 Y-미로 테스트를 통해 iCP-mParkin 투여에 의한 인지기능이 향상되었는지 여부를 확인하였다(도 42A). iCP-Parkin을 AD 모델에 투여했을 때 인지 기능은 시간 및 용량 의존적으로 개선되었다. 또한, iCP-mParkin을 6주에 투여했을 때, 인지 기능은 50 mg/kg의 iCP-mParkin에서 105% 개선되었다(도 42B).
동물. 연구는 대한바이오링크(음성군, 한국)에서 구입한 연령이 일치된 C57BL/6 수컷 마우스(7-8주령)를 사용하여 수행되었다. 온도(설정점 23±2℃상대 공기 습도(설정점 50%) 및 명조건(8:00-20:00시에 조명 켜기/끄기)가 엄격하게 통제된 기관 동물방에서 5마리의 그룹으로 보존되었다. 연구 전반에 걸쳐 수돗물과 표준 실험실 음식이 임의로 제공되었다.
섬유소 아밀로이드-베타(fAβ) 유도 AD 마우스 모델. C57BL/6 수컷 마우스를 알팍산:롬펀 7:3 혼합물로 마취시킨 후 뇌고정 장치에 올려놓은 다음 좌표에서 정위수술을 통해 fAβ(rPeptide, A1170) 4㎍을 뇌에 주입하였다(전두천문에 상대적): 전방-후방(AP): -2 mm, 내측-측면(ML): 0 mm 및 등쪽-복부(DV): -3 mm(경막에서) 평평한 두개골 위치로. 대조군 마우스에는 0.01% 아스코르브산 용액만 주사하였다.
행동 테스트(Y-미로). AD 마우스 모델은 인지기능(자발적 교체) 테스트인 Y-미로 테스트를 통해 검증하였다. Y-미로 장치(팔 길이: 35 cm, 벽 높이: 9 cm)는 흰색 폴리염화비닐(PVC)로 형성된 동일한 길이의 팔 3개가 중간에서 결합되어 'Y'자 모양을 형성한다. 이 생태학 연관 테스트는 새로운 영역을 탐색하려는 설치류의 타고난 호기심을 기반으로 하며 부정적인 또는 긍정적인 강화물이 없으며 마우스에 대한 스트레스가 거의 없다. Y-미로에 마우스를 배치한 직후 비디오 녹화 시스템을 활성화한다. 재생을 누르고 8분 동안 각 마우스에 대한 자발적인 동작을 기록한다. 세션이 완료되면 마우스를 홈 케이지에 부드럽게 놓고 케이지를 선반에 회수한다. 각 세션 사이에 무향 표백제 살균 70% EtOH 물수건으로 미로를 잘 청소한다. 자발적 교대 측정은 마우스가 3개의 연속적인 팔 입구 각각에서 미로의 다른 팔로 들어갈 때 이뤄진다. 교대 비율은 실제 교대 횟수 대 최대 교대 수의 비율로 계산되었다.
(3) AD 모델의 뇌에서 병적 Aβ 플라크 제거
모든 마우스 행동 실험이 완료된 후, 뇌를 제거하였다. 크레실 바이올렛 염색은 fAβ로 유도된 AD 쥐의 뇌 해마에서 뉴런이 감소했으며 iCP-mParkin이 신경 보호 효과가 있음을 보여주었다. 또한, 면역조직화학 염색은 Aβ 플라크가 iCP-mParkin에 의해 해마로부터 제거되었음을 보여주었다(도 43A). 도트 블롯 분석은 Aβ 플라크가 iCP-mParkin에 의해 AD 뇌에서 97% 감소되었음을 보여주었다(도 43 B & C).
면역조직화학. 마우스를 알팍산:롬펀(Alfaxan : Rompun) 혼합물로 깊이 마취하고 식염수와 4% 파라포름알데히드(PFA; BIOSESANG)로 15~20분 동안 관류하였다. 뇌는 4°C에서 2시간 동안 4% PFA로 빠르게 고정되었고, 4°C에서 30% 수크로즈(대정사)로 48시간 동안 인큐베이션 되었으며, 최적 절단 온도(OCT) 화합물(Leica Biosystems)로 포매시킨 후 냉동절편(20 μm 두께)을 절단하였다. 절편을 PBS 존재 하에 0.3% H2O2(대정)를 이용하여 30분 동안 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. PBS로 세척한 후, 절편을 차단 용액(PBS 중 5% 정상 염소 혈청; Vector Laboratories, S-1000)으로 60분 동안 인큐베이션하였다. 절편을 마우스 단클론 6E10 항체(1:250; Biolegend, SIG-39320)의 존재하에 4℃에서 18시간 동안 인큐베이션한 후 비오틴화된 염소 항-마우스 면역글로불린 G(IgG; 1:200; Vector Laboratories, BA-9200)으로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다; 이어서 ABC 키트(Vector Laboratories, PK-6100)를 사용하여 실온에서 60분 동안 절편을 아비딘-비오틴화 퍼옥시다제 복합체로 처리하였다. 그런 다음 절편을 발색원으로써 3,30-디아미노벤지딘(3,30-diaminobenzidine, DAB peroxidase substrate kit, Vector Laboratories)으로 처리하였다. 영구 장착된 슬라이드를 관찰하고 디지털 이미징 시스템(DSRi2, Nikon)이 장착된 현미경을 사용하여 사진을 촬영하였다. 슬라이드에 뇌 조직 절편을 부착시켰다. 뇌 절편을 PBS로 2시간 동안 세척하여 저장 완충액을 제거하고 완전히 건조되도록 하였다. 슬라이드는 이후 5분 동안 DW에서 수화되었다. 0.1% 크레실 바이올렛 아세테이트(Abcam, ab246817)로 5분간 염색하기 전, 절편을 DW로 3회씩 바꾸어 헹구고 1분 동안 70 → 80 → 90 → 100% 에탄올에 넣었다. 절편을 건조시킨 다음 자일렌에 담궈 투명화한 후 커버 슬립을 하고 디지털 이미징 시스템(DSRi2, Nikon)을 사용하여 관찰하였다.
도트 블롯 분석. 도트 블롯 분석은 웨스턴 블롯 분석 및 실험 기법과 유사하다. 불용성 세포 분획을 다른 곳에서 설명한 대로 준비하였다. 도트 블롯 분석을 위해, 중력 여과에 의해 바이오-닷 미세여과 장치(Bio-Rad)를 사용하여 세포 용해물(단백질 10㎍)을 니트로셀룰로오스 막에 결합시켰다. 이 수동 여과는 정량적 항원 결합을 위해 필요하다.
(4) iCP-mParkin은 HT22 세포에서 Aβ로 인한 상대적 산화 스트레스(ROS) 수준을 감소시킨다
상대 산화 스트레스(ROS) 수준은 Aβ(2.5μM) 처리된 HT22 세포에서 iCP-mParkin(10μM) 처리로 3시간 및 6시간차에 104% 및 151% 감소하였다(도 44).
상대 산화 스트레스(ROS)의 측정. HT22 세포(마우스 해마 신경 세포)를 96-웰 플레이트(1 x 104 세포/웰)에 첨가하였다. 24시간 후 ROS 완충액으로 세척하였다. 25μM의 DCFDA(Cellular ROS Assay Kit, Abcam, ab113851)를 ROS 완충액에 처리하고 각 웰에 100μl씩 45분간 반응시켰다. 그런 다음 ROS 완충액으로 세척한 후 Aβ 2.5μM와 iCP-mParkin 10μM을 ROS 완충액에 희석하여 웰에 처리하였다. 3, 6시간 인큐베이션 후, 여기 및 방출 파장을 각각 488 및 535로 설정한 마이크로플레이트 시스템을 사용하여 ROS 수준을 나타내는 DCFDA 형광 강도를 검출하였다.
(5) AD 모델의 뇌에서 파킨의 농도 및 iCP-mParkin의 전달
TSDT 플랫폼을 사용하면 뇌에 존재하는 Parkin 농도가 TSDT 플랫폼이 없을 때보다 452% 더 높다(도 45A). AD 모델에서 정상에 비해 최대 2.9% 더 높은 iCP-mParkin의 뇌간 전달이 이루어졌다(도 45B).
LC-MS/MS에 의한 iCP-mParkin의 측정. iCP-mParkin의 SDB 영역에서 시그니처 펩타이드는 뇌 조직의 LC-MS/MS 분석에 의해 검출되었다[Envigo (Huntingdon, UK)와의 계약하에 있음]. 요약하면, 뇌 용해물은 스마트 다이제스트(SMART Digest, Thermo Fisher Scientific) 및 프로틴웍스(ProteinWorks, Waters)의 두 가지 다른 소화 키트를 사용하여 분해되었으며, 펩티드는 아세토니트릴 구배가 있는 ACE 울트라코어 슈퍼C18 컬럼(ACE UltraCore Super C18 column, Advanced Chromatography Technologies)에서 분리되었고, 싸이엑스 API 6500+ 질량분석계(a Sciex API 6500+ mass spectrometer, SCIEX)로 분석하였다.
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of modified parkin
<400> 1
Gln Glu Met Asn Ala Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Cys Glu Arg Glu Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser
20 25 30
Ser Val Leu Pro Gly Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr
35 40 45
Asp Ser Arg Lys Asp Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser
50 55 60
Ile Tyr Asn Ser Phe Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val
65 70 75 80
Gln Pro Gly Lys Leu Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr
85 90 95
Leu Thr Leu Thr Gln Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro
100 105 110
Asn Arg Met Ser Gly Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser
115 120 125
Ala Glu Phe Phe Phe Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu
130 135 140
Thr Ser Val Ala Leu His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr
145 150 155 160
Cys Ile Thr Cys Thr Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys
165 170 175
Asn Ser Arg His Val Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val
180 185 190
Thr Arg Leu Asn Asp Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr
195 200 205
Ser Leu Pro Cys Val Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu
210 215 220
His His Phe Arg Ile Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln
225 230 235 240
Tyr Gly Ala Glu Glu Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro
245 250 255
Arg Pro Gly Cys Gly Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys
260 265 270
Val Thr Cys Glu Gly Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys
275 280 285
Arg Glu Cys Lys Glu Ala Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe
290 295 300
Glu Ala Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala
305 310 315 320
Ala Glu Gln Ala Arg Trp Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys
325 330 335
Thr Thr Lys Pro Cys Pro Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly
340 345 350
Gly Cys Met His Met Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp
355 360 365
Cys Trp Asn Cys Gly Cys Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His
370 375 380
Trp Phe Asp Val
385
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<223> Amino acid Sequence of aMTD900
<400> 231
Ala Leu Val Ala Val Ile Ala Pro Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 232
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD901
<400> 232
Ala Leu Val Ala Val Leu Pro Ala Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 233
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD902
<400> 233
Ala Leu Val Ala Pro Leu Leu Ala Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 234
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD904
<400> 234
Ala Val Leu Ala Val Val Ala Pro Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 235
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD905
<400> 235
Ala Val Ile Ala Val Ala Pro Leu Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 236
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD906
<400> 236
Ala Val Ile Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 237
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD907
<400> 237
Val Ala Ile Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD908
<400> 238
Val Ala Leu Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD910
<400> 239
Val Ala Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Val Ala Pro
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD911
<400> 240
Val Ala Leu Ala Leu Pro Ala Val Val Val Ala Pro
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD912
<400> 241
Val Ala Leu Leu Ala Pro Ala Val Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 242
<211> 99
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of SD
<400> 242
Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Leu Ile Leu His His
20 25 30
Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly Glu
35 40 45
Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe Glu
50 55 60
Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro Ser
85 90 95
Glu Thr Leu
<210> 243
<211> 499
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of iCP-mParkin
<400> 243
Ala Val Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Leu Ala Pro Gln Glu Met Asn
1 5 10 15
Ala Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg
20 25 30
Glu Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro
35 40 45
Gly Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys
50 55 60
Asp Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Phe Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys
85 90 95
Leu Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr
100 105 110
Gln Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser
115 120 125
Gly Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe
130 135 140
Phe Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala
145 150 155 160
Leu His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys
165 170 175
Thr Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His
180 185 190
Val Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn
195 200 205
Asp Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys
210 215 220
Val Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg
225 230 235 240
Ile Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu
245 250 255
Glu Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys
260 265 270
Gly Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu
275 280 285
Gly Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys
290 295 300
Glu Ala Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly
305 310 315 320
Thr Thr Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala
325 330 335
Arg Trp Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro
340 345 350
Cys Pro Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His
355 360 365
Met Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys
370 375 380
Gly Cys Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val
385 390 395 400
Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu
405 410 415
Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Leu Ile Leu His His
420 425 430
Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly Glu
435 440 445
Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe Glu
450 455 460
Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr Ile
465 470 475 480
Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro Ser
485 490 495
Glu Thr Leu
Claims (21)
- i) 변형 Parkin 단백질(modified Parkin protein); 및
ii) aMTD(advanced macromolecule transduction domain)을 포함하고,
상기 변형 Parkin 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고,
상기 aMTD는 서열번호 2 내지 241로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인, iCP(improved cell-permeable) - mParkin 재조합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 하나 또는 그 이상의 가용화 도메인(solubilization domain; SD)(들)을 추가로 포함하는 것인, iCP-mParkin 재조합 단백질.
- 제2항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 하기의 구조식 중 어느 하나로 표현되며,
A-B, B-A, A-B-C, A-C-B, B-A-C, B-C-A, C-A-B, C-B-A and A-C-B-C
상기 A는 aMTD(advanced macromolecule transduction domain)이고,
B는 변형 Parkin 단백질(modified Parkin protein)이고, 그리고
C는 가용화 도메인(solubilization domain; SD)인 것인, iCP-mParkin 재조합 단백질.
- 제2항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 서열번호 243의 아미노산을 갖는 것인, iCP-mParkin 재조합 단백질.
- 제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 가용화 도메인(들)은 서열번호 242의 아미노산 서열을 갖는 것인, iCP-mParkin 재조합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 퇴행성 뇌질환의 치료에 사용되고,
상기 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병 및 헌팅턴병을 포함하는 것인, iCP-mParkin 재조합 단백질.
- 제1항에 따른 iCP-mParkin 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
- 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제8항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
- 활성 성분으로서 제1항에 따른 iCP-mParkin 재조합 단백질을 포함하는 조성물
- 활성 성분으로서 제1항에 따른 iCP-mParkin 재조합 단백질; 및 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료용 약제학적 조성물로,
상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 헝틴턴병을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
- 퇴행성 퇴질환의 치료용 약제로서 제1항에 따른 iCP-mParkin 재조합 단백질의 용도로서,
상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 헝틴턴병을 포함하는 것인, 용도.
- 제1항에 따른 iCP-mParkin 재조합 단백질을 포함하는 약제.
- 퇴행성 뇌질환의 치료용 약제의 제조를 위한 제1항에 따른 iCP-mParkin 재조합 단백질의 용도로서,
상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 헝틴턴병을 포함하는 것인, 용도.
- 제1항에 따른 iCP-mParkin 재조합 단백질의 치료적으로 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 환자의 치료 방법.
- 제1항에 따른 iCP-mParkin 재조합 단백질의 제조 방법으로, 상기 방법은:
제8항에 따른 재조합 발현 백터를 제조하는 단계;
상기 재조합 발현 벡터를 사용하여 형질전환체를 제조하는 단계;
상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
상기 배양에 의해 발현된 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 재조합 단백질을 수득하는 단계는:
봉입체(inclusion body)를 세척하는 단계;
제1차 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
제2차 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 세척하는 단계는 pH 8 세척 완충액을 이용한 1 단계 세척을 포함하는 것인, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 제1차 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이고, 그리고
상기 제2차 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피인 것인, 방법.
- 제19항에 있어서,
상기 제2차 이온 교환 크로마토그래피는:
8.0mS/Cm 전도도 조건에서 세척하는 단계; 및
9.0mS/Cm 전도도 조건에서 용출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 배양하는 단계는 유가식 발효를 포함하는 것인, 방법.
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