KR102041671B1 - β-아밀로이드 단백질의 응집을 억제하는 생체친화적 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 β-아밀로이드 단백질의 응집을 억제하는 생체친화적 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드(β-amyloid)와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 생체친화적 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 β-아밀로이드 응집 억제제 및 β-아밀로이드 응집 관련 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 β-아밀로이드와의 결합력이 강하고, β-아밀로이드 단백질의 응집체 형성을 억제하고, 신경세포 사멸을 방지하여 알츠하이머병과 같은 퇴행성 신경질환을 치료하는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 세포독성이 없어서 면역체계를 교란시키는 등의 부작용이 없다는 장점이 있다.

Description

β-아밀로이드 단백질의 응집을 억제하는 생체친화적 펩타이드{Natural peptides for inhibition of aggregation of β-amyloid protein}
본 발명은 β-아밀로이드 단백질의 응집을 억제하는 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드(β-amyloid)와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 생체친화적 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 β-아밀로이드 응집 억제제 및 β-아밀로이드 응집 관련 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 가장 흔한, 그리고 치명적인 퇴행성 뇌 질환이다. 100년 이상 집중적으로 연구가 진행되고 있으나, 여전히 치료방법이 없고, 발병 후, 약 10년 안에 사망에 이르는 치명적인 질환이다.
아밀로이드 플라크(Amyloid plaques)는 β-아밀로이드(beta-amyloid, Aβ)의 세포 외 침전물(extracellular deposit)의 형태이며, 퇴행성 신경질환의 원인이 된다.
일반적으로 세포 외 β-아밀로이드 단백질의 응집체가 알츠하이머병의 병리학적 현상에 주요한 기능을 하는 것으로 알려졌다. 하지만 최근 연구에 따르면, β-아밀로이드가 신경세포 내에 축적되면, 이 신경세포 내 β-아밀로이드 가 신경세포 외 β-아밀로이드 단백질의 응집체 형성을 야기한다고 밝혀졌다. 이러한 연구결과를 통해, 알츠하이머병을 치료하기 위해서는 알츠하이머병 환자의 뇌로부터 신경세포 외 β-아밀로이드 및 신경세포 내 β-아밀로이드 단백질의 응집체를 제거해야 한다는 것을 알 수 있다.
현재 알츠하이머병을 치료하는 방법에는 i) β-아밀로이드의 생성을 감소시키는 방법, ⅱ) β-아밀로이드 단백질 응집체를 억제하는 방법, ⅲ) β-아밀로이드 형성에 관여하는 세크래타제(secretase)의 효소활성을 조절하는 방법 및 ⅳ) β-아밀로이드 항체를 이용하여 β-아밀로이드 플라크(plaque)를 제거하는 방법이 있다.
이러한 치료 방법은 종종 인지능력의 악화와 면역체계의 변화와 같은 부작용을 야기시키는 문제가 있다. 또한, 이러한 효소활성 조절은 또 다른 단편 단백질(Aβ 펩타이드)의 축적을 유도, 신경 활동을 포함한 세포 항상성을 방해하는 한다는 문제가 있다.
상기 문제를 해결하기 위하여 β-아밀로이드와 결합하는 세포 내 단백질(specific cellular Aβ-binding partner)을 동정하고, β-아밀로이드 단백질 응집체 형성을 억제시키는 분자생물학적 메커니즘을 이해하며, β-아밀로이드 단백질 감소에 따른 부작용을 방지해야 한다. 이런 측면에서 특이적 β-아밀로이드 단백질에 근거한 면역 치료법은 임상시험에서 광범위하게 연구되고 있으며, 알츠하이머병에 대한 유망한 치료법으로 평가된다.
본 발명의 목적은 SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드(β-amyloid)와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 생체친화적 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 β-아밀로이드 응집 억제제를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 펩타이드를 포함하는 단백질의 생산 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드(β-amyloid)와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 생체친화적 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 SOD1의 β 2 내지 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 SOD1의 β 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 SOD1의 β 1 내지 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 아미노산 서열 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 자가 응집(self-aggregate)하지 않을 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 세포독성이 없을 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 β-아밀로이드 간의 β-sheet 상호결합을 차단할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 β-아밀로이드의 응집을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 포함하는 β-아밀로이드 응집 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명은 SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 포함하는 β-아밀로이드 응집 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환은 근위축성 측삭경화증(루게릭병), 파킨슨병, 알츠하이머병(제3형 당뇨병), 헌팅턴병, 척수소뇌변성증 및 제2형 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단에 결합된 FLAG 태그 핵산 서열 및 C-말단에 결합된 myc 태그 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단에 결합된 EGFP 태그 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단에 결합된 GST 태그(Glutathione S-transferase tag) 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터 중 어느 한 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 숙주세포는 인간배아신장세포(HEK293T), 마우스신경모세포종세포(Neuro 2A, N2a), 신경교종세포(neuroglioma H4)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 β-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 생산 방법을 제공한다. 상기 펩타이드의 생산 방법은:
(A) β-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
(B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계: 및
(C) 상기 형질전환체를 배양하여 상기 펩타이드의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 SOD1에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 SOD1의 β 2 내지 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 SOD1의 β 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 SOD1의 β 1 내지 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 아미노산 서열 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 β-아밀로이드와의 강하게 결합하고, β-아밀로이드 단백질의 응집체 형성을 억제며, 신경세포 사멸을 방지하여 알츠하이머병과 같은 퇴행성 신경질환을 치료하는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 세포독성이 없어서 면역체계를 교란시키는 등의 부작용이 없다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드 응집을 억제함으로써, 신경세포사멸을 억제하는 기전을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드가 유래되는 SOD1 및 SOD1의 β 1 내지 8의 구조를 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드에 결합하는 결정 부위를 동정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드(NABi)가 자가 응집을 하지 않는다는 실험 결과이다.
도 5은 본 발명의 펩타이드(NABi)가 세포 독성이 없다는 것을 확인한 IFA 실험 결과이다.
도 6는 본 발명의 펩타이드(NABi)가 세포 독성이 없다는 것을 확인한 IB 실험 결과이다.
도 7는 본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드의 응집을 억제하는 것을 확인한 IFA 실험 결과이다.
도 8은 본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드의 응집을 억제하는 것을 확인한 IB 실험 결과이다.
도 9은 본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드와 결합한 상태에서의 이동성을 검증한 FRAP assay 실험 결과이다.
도 10은 본 발명의 펩타이드(NABi)가 신경세포사멸을 억제하는 것을 PI 염색법을 통해 확인한 실험 결과이다.
도 11은 본 발명의 펩타이드(NABi)가 신경세포사멸을 억제하는 것을 핵의 형태적 변환(Nuclear morphology)를 통해 확인한 실험 결과이다.
도 12는 본 발명의 펩타이드(NABi)의 농도에 따라 신경세포사멸을 억제하는 것을 Annexin V 염색을 통해 확인한 실험 결과이다.
도 13은 본 발명의 펩타이드(NABi)가 신경세포사멸을 억제하는 것을 분자적 수준에서 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
용어의 정의
본 명세서에서 사용된 용어 "NABi"는 N atural A myloid β B inder and Amyloid β aggregation i nhibitor의 약자로서 SOD1 단백질 중 β 1 내지 β5 strand 서열로 이루어진 단백질을 의미한다. 상기 β1 내지 β5 strand 서열은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 서열번호 1 또는 2와 상동성 있는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "퇴행성 신경질환"은 신경세포(nerve cell)가 퇴행하는 병태 전부를 포함하지만 일반적으로는 뇌혈관장해, 외상(外傷), 대사이상 등, 뚜렷한 신경계 세포 외의 요인이 될 수 있는 것은 포함하지 않으며 알츠하이머병(Altzheimer Disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측색 경화증(루게릭병, Amyotrophic Lateral Sclerosis), 폴리글루타민병(헌팅턴무도병, Huntingtons disease) 또는 척수소뇌변성 등 신경변성이 생기는 병을 총칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "β-아밀로이드"는 베타 아밀로이드, 아밀로이드 베타 또는 Aβ를 나타내며, 일반적으로 36 내지 43개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공 되는 추가단편에 작동 가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료 암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
본 발명에 따른 발현 벡터에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현 벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다
본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질주입"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 발현 벡터를 형질전환시키는 방법은 전기천공 법(electrophoration), 인산칼슘(CaPO4)법, 염화칼슘(CaCl2)법, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것을 아니다.
본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA 도입 효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드의 아미노산 서열
본 발명의 펩타이드는 SOD1의 β 2 내지 3, β 1 내지 3 또는 β 1 내지 5의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 펩타이드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다.
상기 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.
따라서 본 발명의 펩타이드는 SOD1의 β 2 내지 3, β 1 내지 3 또는 β 1 내지 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 펩타이드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 SOD1의 β 2 내지 3의 아미노산 서열은 서열번호 1일 수 있고, β 1 내지 3의 아미노산 서열번호 2일 수 있으며, 상기 SOD1의 β 1 내지 5의 아미노산 서열은 서열번호 3 또는 4일 수 있다. 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다. 서열번호 3은 자연형(wild type)이고 서열번호 4는 돌연변이형(mutant type, G85R)이다.
서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열
서열번호 1 gdgpvqgiin feqkesngpv kvwgsikglt
서열번호 2 atkavcvlk gdgpvqgiin feqkesngpv kvwgsikglt
서열번호 3 atkavcvlkg dgpvqgiinf eqkesngpvk vwgsikglte glhgfhvhef gdntagctsa gphfnplsrk hggpkdeerh vgdlgnvtad
서열번호 4 atkavcvlkg dgpvqgiinf eqkesngpvk vwgsikglte glhgfhvhef gdntagctsa gphfnplsrk hggpkdeerh vgdl r nvtad
본 발명의 펩타이드(NABi)는 SOD1과 β-아밀로이드의 β-sheet 구조적 특성에 기초하고, SOD1이 β-아밀로이드에 결합하는 결정부위를 근거로 하여, SOD1의 β 1 내지 5를 동정하였다. 이를 NABi(Natural Aβ Binder and Aβ aggregation inhibitor)로 명명하였다.
본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드 단백질 사이의 분자간 β-sheet 상호결합을 차단함으로써 β-아밀로이드 단백질 응집체를 효과적으로 억제함을 확인하였다. β-아밀로이드 단백질 응집체 형성을 억제함으로써 β-아밀로이드 연관 신경세포사멸을 억제한다는 것을 확인하였다.
도 1에서 본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드 단백질 응집체 형성을 억제함으로써 β-아밀로이드 연관 신경세포사멸을 억제하여 알츠하이머병을 치료하는 기전을 도식화하였다.
본 발명의 펩타이드(NABi)는 생체 내 단백질로부터 유래하였고, 분자간 β-sheet 억제제(intermolecular β-sheet breaker)로서, 자가응집(self-aggregate)을 형성하지 않으며, 세포 독성이 없다. 따라서 안전하고 새로운 퇴행성 신경질환 치료제로서 개발 가능하다.
또한, 본 발명의 펩타이드(NABi)는 제3형 당뇨병(뇌 당뇨병)으로 알려지고 있는 알츠하이머 치료제로서 이용 가능하다. 더 나아가, β-아밀로이드 단백질 응집체 형성에 의해 발병하는 다른 퇴행성 신경질환인 루게릭병(ALS), 파킨슨병 및 헌팅턴병 에 대한 치료제로서 활용 가능하다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed. Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주입용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 ㎎을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 ㎎을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 펩티드를 암호화는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 103~1012 IU(10 내지 1010 PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 105 내지 1010 IU를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 경우, 103 내지 108개를 함유하는 것이 바람직하고, 104 내지 107개를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3 회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 본 발명의 조성물은 비경구투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 뇌척수 주사가 가장 효율적이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝 솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 1 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 화합물 및 항체(Chemicals and antibodies)
본 발명에서 달리 명시하지 않는 한, 모든 화합물은 Sigma-Aldrich Co. LLC에서 구입하였다. 하기 항체는 공동 면역 침전(Co-immunoprecipitation, Co-IP), 면역 블로팅(Immunoblotting, IB), 면역 형광 분석(Immunofluorescence assay, IFA)에 사용되었다. β-아밀로이드(6E10) 모노클론 항체(mAb, 카탈로그 번호 803015, Biolegend Inc.), 녹색 형광 단백질(GFP) mAb(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), SOD1 폴리클론 항체(pAb, 카탈로그 번호 sc-11407, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), FLAG mAb(카탈로그 번호 F3165), SOD1 mAb(B8H10, 카탈로그 번호 MM-0070, Medimabs Inc.), Ub mAb(P4D1, 카탈로그 번호 sc-8017, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), LC3A/B mAb(Sigma-Aldrich), γ-H2AX mAb(카탈로그 번호 05-636, Millipore Co.) 및 β-액틴 mAb (카탈로그 번호 A5441, Sigma-Aldrich Co.). Procaspase Ab 샘플러 키트(카탈로그 번호 12742, Cell Signaling Tech.)를 사용하여 신경세포사멸 관련 단백질 확인에 이용하였다.
2. 플라스미스 제조( Plasmis construction )
RNeasy 컬럼(Clontech Laboratories Inc.)을 이용하여 인간 림프구와 HEK293 세포에서 RNA를 추출한 뒤, 상기 RNA 주형을 역전사하고 1차 cDNA를 합성하여 플라스미드 제작을 위한 PCR의 주형으로 사용하였다. 실험에 사용한 플라스미드의 종류는 하기와 같다.
1) 포유류 세포 발현 플라스미드인 pSOD1-FLAG(WT)와 pSOD1-FLAG(G93A)로서 C-말단에 FLAG (F)-tag를 코딩하고, 프레임 내(in frame) SOD1-F(WT) 및 SOD1-F(G93A) 단백질을 코딩한다.
2) 원핵 세포 발현 플라스미드인 pGST-SOD1(WT)과 pGST-SOD1(G93A)로서 N-말단에 GST-tag를 코딩하고, 프레임 내(in frame) GST-SOD1(WT)과 GST-SOD1(G93A) 단백질을 코딩한다.
3) pGFP-SOD1 플라스미드인 pSOD1-F를 EcoRI과 ApaI 제한효소로 절단한 후에, SOD1 단편을 pEGFP-C1 플라스미드(BD Bioscience Clontech Inc.)에 삽입하여 제작하였다. 이 플라스미드로부터 N-말단에 GFP-tag를 가지는 GFP-SOD1 단백질이 발현되었다.
4) N-말단을 절단한 SOD1을 발현하는 플라스미드를 제작하였다.
5) C-말단을 절단한 SOD1을 발현하는 플라스미드를 제작하였다.
6) QuickChange Site-Directed Mutagenesis를 사용하여 특정 위치에 정지 코돈을 삽입한 플라스미드를 제작하였다. 상기 플라스미드는 93 번째 아미노산 글리신에서 알라닌(G93A), 4 번째 알라닌에서 발린(A4V), 37 번째 글리신에서 아르기닌(G37R), 43 번째 히스티딘에서 아르기닌(H43R), 85 번째 글리신에서 아르기닌, 93 번째 글리신에서 시스테인으로(G93C) 이루어져 있다.
7) isomers(aa 1-40 및 1-43)를 발현하는 플라스미드를 제작하였다.
8) C-말단에 Apple-tag를 발현하고 프레임 내(in-frame) Aβ-mApple을 발현하는 플라스미드를 제작하였다.
3. 세포 배양 및 형질주입( Transfection )
인간배아신장세포(HEK293T), 마우스신경모세포종세포(Neuro 2A, N2a) 및 신경교종세포(neuroglioma H4)는 10%(v/v) 태아혈청(FEBS)을 포함하는 Dulbecco 's Modified Eagles Medium(DMEM)에서 5% CO2 배양기로 37℃로 배양하였다.
상기 DMEM은 'Life Technologies, Inc.'에서 제작된 것으로 50 U/mL의 페니실린 및 스트렙토 마이신을 포함했다.
H4 세포의 약 40 내지 50%는 신경아세포종(NSE, Neuronspecific enolase)에 대해 양성이었다. β-아밀로이드의 응집체에 민감하며, β-아밀로이드의 응집체로 인해 신경세포사멸이 발생하므로 신경세포사멸 분석에 사용하였다.
세포는 100 mm 배양 접시에 1.5 × 106 세포 밀도로 접종하였다. 14시간 후, 제조업체의 지침에 따라 FuGENE® 6 Transfection Reagent(Promega Co.)로 플라스미드를 세포에 형질주입(transfection) 하였다. 세포는 5% CO2 배양기에서 20 내지 30 시간 더 배양하였다.
4. 공동 면역 침전 분석(Co-IP, Co- immunoprecipitation )
형질주입한 HEK293T, H4 및 N2a 세포를 NETN 완충액으로 용해하여, 얼음에서 1시간 동안 배양하였다. 이 용액은 100 mM 농도의 NaCl, 1 mM 농도의 EDTA, 20 mM 농도의 Tris-HCl(pH 8.0), 0.5%(v/v)의 NP-40 및 프로테아제 저해제를 포함한다. 상기 프로테아제 저해제는 aprotinin 및 leupeptin의 농도가 2 ㎍/ml이고, PMSF의 농도가 0.1 mM이다.
단백질 추출물 1 mg과 1차 항체 1 ㎍와 혼합하여 4℃에서 12시간 동안 배양하였다. Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE-healthcare)와 섞은 후, 4℃에서 1시간 동안 배양한 뒤, 원심분리로 결합된 면역 복합체를 회수하였다. 침전된 Sepharose에 샘플 버퍼를 넣고 끓였으며, 상기 버퍼는 44 mM Tris-HCl(pH 6.8), 2% SDS, 144 mM β-mercaptoethanol, 10%(v/v) glycerol, 0.004%(v/v) bromophenol blue를 포함한다.
면역 침강된 샘플을 12% SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)한 뒤에, 단백질을 막(membrane)으로 이동시키고, FLAG 항체, SOD1 항체 및 GFP 항체로 면역 블로팅을 하였다.
5. 면역 블로팅 분석( IB , Immunoblotting )
세포를 RIPA 완충액에 용해한 뒤, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 RIPA 완충액은 0.15 M NaCl, 0.5%(v/v) sodium-deoxycholate, 0.1%(v/v) SDS, 0.05M Tris-HCl(pH 8.0), 1%(v/v) NP-40, aprotinin 및 leupeptin을 포함하는 조성물 2 μg/mL, 1 mM PMSF 및 포스파타아제 저해제를 포함한다.
상기 포스파타아제 저해제는 1 mM Na3VO4 및 1 mM NaF를 포함하였다. Bradford assay(Bio-Rad Laboratories)로 단백질 농도를 측정하였다. 샘플은 12% 또는 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔에서 분리하였다.
세포를 세포 신호 제조사의 용해 완충액(Catalog No. 9803, Cell Signaling Tech.)에서 용해시키고, 제조사의 설명서(MitoSciences Inc.)에 따라 13% 청색 겔상에서 샘플을 분리하였다.
단백질을 Protran® Nitrocellulose Membranes(Sigma-Aldrich Co. LLC)로 옮긴 후 Membrane을 5% non-fat dried milk/TBST 용액에서 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 상기 milk/TBST 용액은 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl 및 0.1% Tween-20을 포함한다.
Membrane은 1차 항체와 함께 1시간 동안 상온에서 배양한 다음, 2차 항체와 1시간 동안 다시 하였다. 항원-항체 복합체는 강화된 화학 발광 키트(enhanced chemiluminescence kit, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로 검출하였다.
6. 면역형광측정법 ( IFA , Immunofluorescence assay)
형질주입한지 24시간 후, N2a 세포를 4% 파라포름알데히드 고정용액에서 15 분간 배양하였다. PBS로 3회 세정하고, 50 mM NH4Cl/PBS 켄칭(quenching)용액에서 10 분간 배양하였다.
이어서, 세포를 PBS로 3회 세정하고, 0.1% Triton X-100/PBS 용액으로 5분간 배양하였다. 2% FBS/블로킹 완충액으로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 1/100로 희석된 FLAG 항체로 상온에서 2시간 동안 배양하고, PBS로 3회 세정하고 goat anti-mouse Alexa Fluor®-red 594 dye와 함께 배양하였다.
샘플을 PBS로 3회 세정하고, FluoroGuard Antifade Reagent(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 유리 슬라이드에 봉입(mounting)하였다. 형광 이미지는 공촛점 레이저 스캐닝 현미경(Zeiss LSM 510 Meta, Carl Zeiss AG)을 사용하여 획득하고, 이미지는 Adobe® Photoshop®에서 처리하였으며, 형광 신호 강도는 ZEN 2009 라이트 에디션 소프트웨어 프로그램에 의해 측정하였다.
7. GST pull-down assay
GST-SOD1(WT 또는 G93A) 단백질을 포함하는 대장균 세포 용해액(lysate)에 10 ㎕의 Glutathione Sepharose 4B beads를 넣고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 3 회 세척한 후, GST-SOD1 단백질을 정제하였다.
약 8 ㎍의 GST-SOD1 단백질을 포함하는 용액에 구아니딘 히드로 클로라이드(Gu-HCl)를 섞어 농도를 0.6 M로 맞추고, 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, GFP-SOD1 단백질을 포함하고 있는 HEK293T 세포 용해물(단백질 2mg)을 섞어 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. GST 풀 다운(pull down)된 단백질 복합체를 PBST 완충 용액으로 3회 세척하였다.
단백질 복합체는 20 ㎕ 2X 샘플 버퍼를 넣고 끓여서 12% SDS-PAGE로 분리하고 GFP 항체(1:5000), GST 항체(1:10,000)로 면역 반응한 후, 분석하였다.
8. 형광 복구( FRAP , fluorescence recovery after photobleaching )를 이용한 단백질 이동성의 정량 분석
광탈색 후 형광 복구(FRAP, fluorescence recovery after photobleaching) 기술은 살아있는 세포 내에서 형광 태그 분자의 이동성을 검사하는 기술이다. N2a 세포를 35 mm 세포배양접시에 5 x 104 세포 밀도로 배양하고 12시간 후, 상기 세포에 타겟 플라스미드를 형질주입하였다,
36시간 이후, 응집체 여부를 레이저 공촛점 현미경으로 분석하였다. 특정 지역(하얀색 박스 부분)을 594 nm 레이저로 15회 반복하여 광탈색(photobleaching)을 진행하였고, 3초 간격으로 광탈색된 부분의 형광 회복 정도를 측정하였다.
9. β-아밀로이드 응집체의 형성
단량체 재조합 Aβ42(카탈로그 번호 03-111, InvitrogenTM Co.) 펩티드를 1,1,1,3,3,3-헥사 플루오로-2-프로판올(HFIP, Sigma-Aldrich Co. LLC)에 넣고 80℃ 냉동고에 보관하다가 사용 직전에 상기 HFIP를 증발시켜 제거하였다. β-아밀로이드의 응집체 형성을 위해, 20 μM의 β-아밀로이드 펩티드를 0.1 M HEPES/TBS 완충액 또는 0.01 M HCl/TBS 완충액에 녹여 37℃에서 14일간 배양하였다. TBS 완충액은 50 mM Tris-HCl 및 150 mM NaCl을 포함하였다.
10. 통계 분석
모든 데이터는 평균 ± SEM(평균의 표준 오차)으로 나타내었다. P-value가 0.05이하인 경우는 통계적으로 유의하다고 간주했다. 편도 분석(ANOVA) 및 SPSS 버전 24.0을 사용하는 Tukey의 사후 비교를 통해 통계적 유의성을 평가하였다.
<실시예>
실시예 1. β1 -5 서열의 펩타이드의 안정성 및 β-아밀로이드와 결합여부
단백질 표면에 노출되고, β-아밀로이드와의 상호결합을 통해 β-아밀로이드 단백질 응집체 형성을 억제하는 β-strand를 동정하기 위해, 8개의 β-strand(β 1 내지 8)로 구성된 SOD1의 각종 잘린 SOD1 절편(truncated SOD1 fragment)을 체계적으로 디자인하여 제작하였다(도 2). 도 2에서 SOD1 및 SOD1의 β 1 내지 8 구조를 도식화하였고, 펩타이드 1 내지 6의 서열을 나타내었다.
β-아밀로이드와 결합하는 결정부위를 알아보기 위해 특정 β-strand를 제거한 다양한 펩타이드를 제작하였다. 펩타이드 2는 펩타이드 1에서 β 2 strand에 연결된 β-turn을 제거하여 만들었다. 펩타이드 1 내지 6의 β-strand 서열은 하기 표 2와 같다. 상기 펩타이드 1 내지 6과 β-아밀로이드를 신경세포(N2a)에서 과발현시킨 후, Co-IP assay를 수행하였다.
펩타이드 1 내지 6의 아미노산 서열
펩타이드 1 펩타이드 2 펩타이드 3 펩타이드 4 펩타이드 5 펩타이드 6
β 2-7 β 2-7/T β 4-6 β 1-3 β 1-5 β 5-8
β-아밀로이드 결합 부위의 동정
아미노산
개수		 β-아밀로이드
와 작용		 β-아밀로이드
와 결합력		 자가 응집
여부		 발현 정도
펩타이드 1
β2-7		 135 aa 작용 6 응집 5
펩타이드 2
β 2-7/T		 130 aa 작용 3.5 응집 5
펩타이드 3
β 4-6		 75 aa 작용 안 함 0 미응집 5
펩타이드 4
β 1-3		 39 aa 작용 1 미응집 1
펩타이드 5
β 1-5(NABi)		 90 aa 작용 1 미응집 5
펩타이드 6
β 5-8		 74 aa 작용 안 함 0 미응집 5
실험 결과는 상기 표 3 및 도 3과 같다. 도 3.a에 의하면, 펩타이드 1 및 2는 β-아밀로이드와 결합하였으나, 펩타이드 3은 β-아밀로이드와 결합하지 않았다. 펩타이드 1 및 2는 강한 결합력을 가지나, 자가응집을 한다는 문제가 있다. 펩타이드 1에서 AC2(amyloidogenic core region 2)를 제거해야만 자가응집(self-aggregate)을 형성하지 않았다.
도 3.b에 의하면, 펩타이드 4 및 5는 β-아밀로이드와 비슷한 세기로 결합한다. 펩타이드 5가 펩타이드 4보다 단백질 발현이 5배 잘 되었다.
도 3.c에 의하면, 펩타이드 5는 β-아밀로이드와 결합하지만 펩타이드 6은 β-아밀로이드와 결합하지 않았다.
상기 실험 결과를 통해서, β 2 내지 3 서열의 펩타이드가 β-아밀로이드와 결합에 필수적이라는 것을 알 수 있었고, 안정적인 단백질 발현을 위해 β 4 내지 5 서열의 펩타이드가 필요하다는 것을 확인하였다.
β 1 내지 5의 β-strand 펩타이드 골격(backbone)에서, 아민(amine)의 수소(hydrogen)와 카보닐기(carbonyl)의 산소(oxygen) 간의 수소 결합이 펩타이드를 안정시켰다. 상기 수소결합은 단백질 접힘(folding)이 잘 일어나도록 하는 중요한 역할을 담당하였다. 즉, β 2 내지 3의 에너지적으로 안정한 2차 구조(energetically stable secondary structure)가 β-아밀로이드 결합에 필수적이라는 것을 시사하였다.
따라서 펩타이드 5(β1 내지 5 서열)는 β-아밀로이드와 강하게 결합하고 안정성이 우수하며, 자가응집을 하지 않기 때문에 β-아밀로이드 단백질 응집제 억제제로서 바람직하며, 펩타이드 5(β 1 내지 5 서열)를 NABi로 명명하였다.
실시예 2. 본 발명의 펩타이드(NABi)의 안정성
본 발명의 펩타이드(NABi)의 자가응집여부를 확인하기 위하여, 신경세포(N2a)에 본 발명의 펩타이드를 과발현시킨 후 면역형광법으로 측정했다.
그 결과, G93A 발현 신경세포는 60% 이상의 세포에서 단백질 응집체가 확인되었다. 반면에 본 발명의 펩타이드는 단백질 응집체가 거의 없었다(도 4). 이는 AC2와 AC3가 제거되어, 자가응집이 일어나지 않는 것이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드(NABi)는 β-아밀로이드의 결합 결정인자를 가지고 있으며, 자가 응집되지 않았다.
실시예 3. IFA를 통한 본 발명의 펩타이드 세포 독성 검증
본 발명의 펩타이드(NABi)의 세포독성을 확인하기 위하여, 신경세포(N2a)에서 본 발명의 펩타이드를 과발현시킨 후, IFA를 통해 핵 형태를 관찰하였다. 대조군인 정상 신경세포(N2a)의 핵 형태 및 G93A를 과발현시킨 신경세포(N2a)의 핵 형태와 비교하였다.
그 결과 G93A를 발현시킨 세포의 약 50%에서 응축되고 조각난 핵(condensed, fragemented nuclei)이 관찰되었으며, 이는 신경세포 사멸(apoptotic cell death)이 유도된 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드(NABi)를 발현시킨 세포는 대조군과 유사하게 정상의 핵 형태(normal nuclear morphology)가 관찰되었다(도 5). 이는 본 발명의 펩타이드(NABi)는 신경세포 사멸(neuronal cell death)을 유도하지 않는다는 것을 의미한다.
실시예 4. IB를 통한 본 발명의 펩타이드 세포 독성 검증
본 발명의 펩타이드(NABi)의 세포 독성을 확인하기 위해서, 신경세포(N2a)에 STS(staurosporine)를 처리하고, 본 발명의 펩타이드를 발현 시켜, 신경세포사멸 연관 단백질의 발현과 활성을 평가하였다.
대조군은 정상 신경세포(N2a)에 STS(staurosporine)를 처리하여 세포 사멸(apoptotic cell death)을 유도(apoptosis positive control)한 후 신경세포사멸 연관 단백질의 발현과 활성을 평가하였다.
그 결과, 본 발명의 펩타이드(NABi)는 active caspase-3, active caspase-8, active caspase-9 및 γ-H2AX가 검출되지 않았다. 따라서 caspase-3의 기질(substrate)인 PARP1, Lamin A/C 및 caspase-6의 substrate의 절단된 형태(form)도 검출되지 않았다(도 6). 이는 본 발명의 펩타이드(NABi)는 세포 독성이 없으며, 신경세포 사멸을 유도하지 않는다는 것을 의미한다.
상기 Lamin A/C는 핵에서 구조적 안정성과 전사조절(transcriptional regulation)에 관여한다. 상기 H2AX는 인산화(phosphorylated)된 상태에서 DNA 손상에 대한 마커(maker)로서 사용된다.
실시예 5. IFA를 통한 본 발명의 펩타이드(NABi)의 β-아밀로이드 응집 억제 검증
본 발명의 펩타이드(NABi)의 β-아밀로이드 응집 억제를 확인하기 위해서, 본 발명의 펩타이드와 β-아밀로이드를 신경세포에서 발현시킨 후, IFA를 통해 β-아밀로이드 단백질 응집체를 정량적으로 분석하였다.
대조군은 β-아밀로이드를 신경세포에서 발현시킨 후, IFA를 통해 β-아밀로이드 단백질 응집체를 정량적으로 분석하였다.
그 결과 대조군에서는 신경세포의 약 50%에서 β-아밀로이드 단백질 응집체 관찰되었다. 본 발명의 펩타이드(NABi)를 발현시킨 경우는 신경세포의 80% 이상에서 β-아밀로이드 단백질 응집체가 관찰되지 않았다(도 7).
실시예 6. IB를 통한 본 발명의 펩타이드(NABi)의 β-아밀로이드 응집 억제 검증
본 발명의 펩타이드(NABi)의 β-아밀로이드 응집 억제를 확인하기 위해서, ⅰ) 0.1 M HEPES/TBS(pH 7.4) 조건 또는 ⅱ) 0.01 M HCl/TBS 조건에서 본 발명의 펩타이드(NABi)와 β-아밀로이드를 배양한 후, IB를 통해서 β-아밀로이드 응집체 형성 정도를 측정하였다.
대조군은 β-아밀로이드 응집체 형성 조건인 ⅰ) 0.1 M HEPES/TBS(pH 7.4) 조건 또는 ⅱ) 0.01 M HCl/TBS 조건에서 IB를 실시하여 β-아밀로이드 응집체 형성 정도를 측정하였다.
그 결과 본 발명의 펩타이드(NABi)는 대조군에 비해서 β-아밀로이드 응집체가 상기 ⅰ) 조건에서는 1/10로 감소하였고, 상기 ⅱ) 조건에서는 1/3로 감소하였다(도 8).
이는 본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드에 대해 높은 친화력(affinity)을 가지고, β-아밀로이드와 강력하게 결합함으로써 β-아밀로이드 응집체 형성을 효과적으로 차단한다는 것을 의미한다.
본 발명의 펩타이드가 β-아밀로이드 단량체와 결합하여 β-아밀로이드 단량체 간의 분자간 β-sheet 상호작용(intermolecular β-sheet interaction)을 방지할 수 있으며, β-아밀로이드 단량체들의 β-sheet 구조를 파괴하거나 본 발명의 펩타이드(NABi)의 특정 아미노산의 역할로 인해 β-아밀로이드 간에 결합하는 것을 차단할 수 있다.
실시예 7. FRAP assay를 통한 본 발명의 펩타이드(NABi)의 β-아밀로이드 응집 억제 검증
본 발명의 펩타이드(NABi)의 β-아밀로이드 응집 억제를 확인하기 위해서, 신경세포(N2a)에서 본 발명의 펩타이드와 β-아밀로이드를 과발현시킨 후, FRAP(Fluorescence recovery after photobleaching) assay를 수행하여 지정한 영역에 고강도 레이저 빔을 반복적 노출시켰다. 그 후 레이점 빔에 노출된 영역의 β-아밀로이드 단백질을 제거한 후, 주변의 β-아밀로이드 단백질 이동 여부에 따른 형광 발현 회복을 실시간으로 측정하였다.
대조군은 신경세포(N2a)에서 β-아밀로이드를 과발현시킨 후, FRAP assay 를 수행하여 주변의 β-아밀로이드 단백질 이동 여부에 따른 형광 발현 회복을 실시간으로 측정하였다.
그 결과, 대조군은 광탈색(photobleaching)에 의해 제거된 형광이 거의 회복되지 않았으나, 본 발명의 펩타이드(NABi)는 광탈색(photobleaching)에 의해 제거된 형광이 20초 내에 50%, 90초에서 75% 이상 회복되었다(도 8). 이는 본 발명의 펩타이드가 β-아밀로이드의 응집체와 결합하여 β-아밀로이드의 응집을 분해 및 억제시켰다는 것을 의미한다.
실시예 8. PI 염색법을 통한 신경세포사멸 정도를 정량적으로 분석
본 발명의 펩타이드(NABi)가 신경세포사멸을 억제시키는지 확인하기 위해서, 신경세포(H4 세포)에서 본 발명의 펩타이드와 β-아밀로이드를 과발현시킨 뒤. 사멸세포를 PI(propidium iodide, 죽은 세포만 염색하는 dye)로 염색하였다.
대조군은 신경세포(H4 세포)에서 β-아밀로이드를 과발현시켰다.
그 결과, 본 발명의 펩타이드(NABi)는 대조군보다 PI로 염색된 수가 약 1/3로 감소하였다(도 10). 이는 본 발명의 펩타이드에 의해서 신경세포의 생존력이 증가하였음을 의미한다.
실시예 9. Nuclear morphology를 통한 신경세포사멸 정도를 정량적으로 분석
본 발명의 펩타이드(NABi)가 신경세포사멸을 억제시키는지 확인하기 위해서, β-아밀로이드 및 본 발명의 펩타이드(NABi)를 과발현시킨 후, 신경세포(H4 세포)를 형태적 변화가 일어난 핵의 수를 측정하였다.
대조군은 신경세포(H4 세포)에서 β-아밀로이드를 과발현시켰다.
그 결과, 본 발명의 펩타이드(NABi)는 대조군에 비해 염색체 응축 및 단편화와 같은 핵의 형태학적 변화가 적었으며, 정상세포와 비슷한 수준이었다(도 11). 이는 본 발명의 펩타이드에 의해 β-아밀로이드 단백질 응집체 형성이 억제되어, β-아밀로이드 단백질 응집체에 의해 유도되는 세포 사멸(apoptotic cell death)이 감소한다는 것을 의미한다.
실시예 10. 본 발명의 펩타이드(NABi)의 농도에 따른 신경세포사멸의 정량적 분석
본 발명의 펩타이드(NABi)가 신경세포사멸을 억제시키는지 확인하기 위해서, 신경세포(H4 세포)에서 본 발명의 펩타이드(NABi) 및 β-아밀로이드를 과발현시킨 뒤에 AnnexinV 염색을 하였다. 본 발명의 펩타이드의 발현 수준을 차등적으로 조절하였다.
그 결과, 본 발명의 펩타이드(NABi)가 발현된 모든 경우, 신경세포사멸이 억제된 것을 알 수 있었다(도 12). 이는 본 발명의 펩타이드가 초기 신경세포사멸(apoptotic cell death)를 억제할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 11. 분자적 수준에서 본 발명의 펩타이드의 농도에 따른 신경세포사멸 정도 분석
본 발명의 펩타이드(NABi)가 신경세포사멸을 억제시키는지 확인하기 위해서, 신경세포(H4 세포)에서 본 발명의 펩타이드(NABi) 및 β-아밀로이드를 발현시킨 뒤에 신경세포사멸 연관 단백질의 발현과 활성을 IB를 통해서 측정하였다. 본 발명의 펩타이드를 차등적으로 발현시켰다.
대조군은 신경세포(H4 세포)에서 β-아밀로이드를 발현시킨 뒤에 신경세포사멸 연관 단백질의 발현과 활성을 IB를 통해서 측정하였다.
그 결과, 대조군에서는 절단된 caspase-3와 절단된 PARP1이 검출되었다. 이는 caspase-dependent β-아밀로이드 응집 유도 신경세포사멸(aggregate-induced neural cell death)이 발생하는 것을 의미한다(도 13, lane 4). 본 발명의 펩타이드(NABi)를 발현시킨 경우는 절단된 caspase-3, 절단된 PARP 및 절단된 Lamin A/C의 검출이 크게 감소했다(도 13, lane 6~8).
상기 Lamin A/C는 caspase-6의 substrate이고, 상기 caspase-6는 신경세포의 신경 재생(axon regeneration)에 중요한 역할을 담당한다.
퇴행성 신경질환 치료의 궁극적인 목적은 β-아밀로이드 단백질 응집체 의해 유도된 신경퇴행(neurodegeneration) 및 신경세포사멸을 차단하는 것이다. 본 발명의 펩타이드(NABi)가 β-아밀로이드에 의해 유도되는 신경세포사멸(neural cell death)을 억제시키는 것이 확인되었다. 따라서, 본 연구에서 동정하고 분석한 펩타이드(NABi)는 β-아밀로이드 단백질 응집체에 의해 유도되는 신경퇴행(neurodegeneration)을 완화시킬 수 있는 안전하고 효과적인 치료제로서 개발될 수 있을 것이다.
이상의 상세한 설명은 본 발명을 예시하는 것이다. 또한 전술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명하는 것이며, 본 발명은 다양한 다른 조합, 변경 및 환경에서 사용할 수 있다. 즉 본 명세서에 개시된 발명의 개념의 범위, 저술한 개시 내용과 균등한 범위 및/또는 당업계의 기술 또는 지식의 범위내에서 변경 또는 수정이 가능하다. 전술한 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 구현하기 위한 최선의 상태를 설명하는 것이며, 본 발명의 구체적인 적용 분야 및 용도에서 요구되는 다양한 변경도 가능하다. 따라서 이상의 발명의 상세한 설명은 개시된 실시 상태로 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 또한 첨부된 청구범위는 다른 실시 상태도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (25)

  1. SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드(β-amyloid)와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드로서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 자가 응집(self-aggregate)하지 않는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 세포독성이 없는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 β-아밀로이드 간의 β-sheet 상호결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 β-아밀로이드의 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  10. SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드(β-amyloid)와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 포함하는 β-아밀로이드 응집 억제제로서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 아미노산 서열 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 β-아밀로이드 응집 억제제.
  11. 삭제
  12. SOD1에서 유래하고 β-아밀로이드(β-amyloid)와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 아미노산 서열 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경질환은 근위축성 측삭경화증(루게릭병), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 척수소뇌변성증 및 제2형 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료용 약학적 조성물.
  14. 제1항, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 펩타이드의 N-말단에 결합된 FLAG 태그 핵산 서열 및 C-말단에 결합된 myc 태그 서열을 포함하는 발현벡터.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 펩타이드의 N-말단에 결합된 EGFP 태그 서열을 포함하는 발현벡터.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 펩타이드의 N-말단에 결합된 GST 태그(Glutathione S-transferase tag) 서열을 포함하는 발현벡터.
  18. 제14항의 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 숙주세포는 인간배아신장세포(HEK293T), 마우스신경모세포종세포(Neuro 2A, N2a) 및 신경교종세포(neuroglioma H4)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  20. β-아밀로이드와 특이적으로 결합하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
    상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계: 및
    상기 형질전환체를 배양하여 상기 펩타이드의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 펩타이드의 생산 방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
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