JP7496997B2 - 神経変性疾患治療用の改善された細胞透過性を有する変形パーキン組換えタンパク質及びその用途 - Google Patents

Description

［関連出願に関する相互参照］
本発明は、２０２０年９月４日付で出願された米国仮特許出願番号６３／０７４，６９７の利益と優先権を主張し、その全体が本明細書に参考として含まれる。

本発明は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎに関する。ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、神経細胞の損傷と関連した病気を治療するのに適した生物学的特性を有する。これにより、本発明で提供するｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、パーキンソン病、アルツハイマー病及びハンチントン病を含む神経変性疾患を、治療、予防又は改善するための組成物又は方法に利用できる。さらに、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、既存のｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎより高い安定性を有するため、タンパク質医薬品としての使用に適した特性を有する。また、本発明で提供する製造方法によって収得されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、高い純度を有し、上記製造方法は、大量生産に適した特性を有する。

神経変性疾患及びその未充足の医療ニーズ
神経変性疾患（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ＮＤＤ）は、身体の構造や機能が漸進的に劣化する疾患であり、特に脳と脊髄に発病し、神経伝達物質の不均衡によって学習、記憶などの障害を引き起こす。神経変性疾患は、主な症状及び侵される脳領域を考慮して分類することができ、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＨＤ）が含まれる。神経発生に適用でき、かつ神経細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制できる適切な治療法がこれまでに存在しない現状である。

パーキンソン病
パーキンソン病は、脳の黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｐａｒｓ ｃｏｍｐａｃｔａ）と線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）との間の黒質線条体システム（ドーパミンシステム）のドーパミン作動性神経細胞が選択的に消失して発生する退行性疾病である。全世界の患者数は、約１０００万人であり、その数は増加しつつある。パーキンソン病は、黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ：ＳＮ）の不完全なドーパミンの生成及び作用で運動神経の皮質の刺激が減少して発生する。パーキンソン病は、 振戦（ｔｒｅｍｏｒ）、動作緩徐（ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ）、固縮（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）などの運動性障害及び鬱病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、不眠症（ｉｎｓｏｍｎｉａ）、認知障害などの非運動性障害のような臨床的症状を伴うＰＤ関連因子によって引き起こされる家族性ＰＤに分類される。これは、ＰＤの病因が広範な神経系で神経細胞の死滅を誘発する多系統疾患であることを暗示する。

遺伝的欠陥による家族性パーキンソン病の場合、α－シヌクレイン（ＰＡＲＫ１／４）、ＬＲＲＫ２（ＰＡＲＫ８）、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、Ｐａｒｋｉｎ（ＰＡＲＫ２）、ＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）などがよく知られている。また、家族性パーキンソン病の遺伝的要因は、散発性パーキンソン病、及び、発病の重要な段階に位置するパーキンのようなパーキンソン病の原因遺伝子において非常に重要な役割をすると考えられる。パーキン突然変異によるＥ３ユビキチンリガーゼ機能の喪失は、ドーパミン放出を抑制し、特定の基質の蓄積を招来したりドーパミン作動性ニューロンの退化を誘発したりして細胞死滅を招く。また、パーキンは、ミトコンドリアで保護機能を有し、ストレスによるミトコンドリアの膨潤及びアポトーシスを減少させる細胞保護効果を示すものであると報告されている。病理学的タンパク質凝集体の異常な蓄積は、該当機転によって脳ニューロンの死を誘発し、パーキンソン病：ミトコンドリア機能障害及びユビキチン－プロテアソームシステム（ＵＰＳ）機能障害を引き起こす。

近年、パーキンソン病の病理学的分析によれば、α－シヌクレインは、嗅球（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｂｕｌｂ）と腸筋神経叢（ｅｎｔｅｒｉｃ ｐｌｅｘｕｓ）から誘導され、延髄（ｍｅｄｕｌｌａｏｂｌｏｎｇａｔａ）及び脳橋（ｐｏｎｓ）に移動及び伝播され、パーキンソン病に発展する。α－シヌクレインは、中脳、次に大脳辺皮質（ｌｉｍｂｉｃ ｃｏｒｔｅｘ）を含む大脳領域に伝播され、認知症に関連した多様な退行性症状が現れる。症状が悪化すると、症状に関連した薬物だけではパーキンソン病の進行を緩和することができない。

現在、パーキンソン病の治療法は、一時的な症状改善にとどまり、患者の安全性と有効性を満たすことができず、深刻な副作用を誘発する根本的な状態を改善することができない現状である。未充足ニーズは、その規模が約１０億８０００万ドルと推定され、病気を根本的な治療ができる新しい機転－特異的な疾病調節薬の開発が必要となっている。現在、抗体治療剤のようなバイオ医薬品は、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ：ＢＢＢ）を通過し難く、また、病理学的物質が生成される脳神経細胞内に伝達され難い。パーキンソン病の診断技術の発展によって、パーキンソン病の治療可能性が大きくなっている。これにより、関連治療剤市場は拡大しつつある。新規な薬物送達技術を基盤とした治療剤の開発は、競争力を有することから、根本的な治療を提供できる機転－特異的な疾病調節治療薬の開発が必要となっている。

アルツハイマー病
アルツハイマー病は、認知症において最も一般的なタイプであって、中年と老年期（６５歳以上）に発生し、認知症全体の約６０～７０を占める。アルツハイマー病の原因を探すための努力が長期間なされてきたが、まだ明らかではない部分が多い。アルツハイマー病患者の主な症状は、記憶と認知機能の低下である。初期には最近の記憶を忘れ、また過去の記憶も忘れ、さらにはコミュニケーション障害が現れる。病気の進行中には、不安、焦燥、憂鬱、妄想などの精神症状と行動障害が伴われるが、認知的、神経学的症状の進行は非常にゆっくりと進む。

神経細胞中で異常に縺れ合った神経原線維もつれ（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ）もアルツハイマー病の特徴である。タウ（ｔａｕ）タンパク質のリン酸化が、生化学的反応を介して神経細胞破壊を促進する。但し、神経原線維もつれは、アルツハイマー型認知症患者の脳でのみ発見されるわけではなく、正常人からも発見されるが、アルツハイマー型認知症患者の脳中には多量存在する。オリゴマーＡβや神経原線維もつれのような神経毒性物質による細胞内損傷したミトコンドリアの蓄積とＵＰＳの過活性化が脳神経細胞死を誘発すると報告されている。ＵＰＳ機能障害が発生すると、Ａβの異常とｐ－Ｔａｕタンパク質がニューロンの細胞質への凝集によるニューロンの細胞死によってアルツハイマー病が誘発される。しかし、分子メカニズムの詳細はまだ明らかではない。

２０１０年基準で、世界の認知症に関連した市場規模は、６，０４０億ドル（世界ＧＤＰの約１％）と推計され、先進国だけでなく、発展途上国でも患者数が増加しており、認知症に関連した治療薬の確保が急務である。特に、米国のベビーブーム世代は、２０１１年１月１日に６５歳になり、２０２２年１２月３１日まで毎日１万人が６５歳になって高齢人口に進入する。米国で認知症に関連した医療及び介護にかかる費用は、年間約２，２６０億ドルと推定され、この傾向が続けば、２０５０年には、認知症にかかる医療費は、１兆１，０００億ドルに達すると予想されている。

認知症の原因のうちの６０％以上を占めるアルツハイマー病では、記憶、言語能力、実行機能、運動能力などの認知機能が次第に低下する。アミロイド－β（Ａβ）及びＴａｕタンパク質の病理学的マーカーは、蓄積されても生体内で分解されない。アルツハイマー病認知症の主な原因は、皮質／海馬ニューロンが死ぬという退行性にある。まだ明らかではない他の病理、遺伝的異常、年齢、原因など、多様な危険因子が存在する。アルツハイマー病の病理学的特徴として、代表的に老人斑（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ；ＳＰ）があり、これは、代謝異常によって、アミロイド前駆体タンパク質（Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）から生成されたＡβが、水に対する溶解度が低いため、脳に凝集及び蓄積されて形成される。形成された老人斑は、細胞毒性を持つため、脳部位にある神経細胞の破壊を促進し、神経伝達物質に影響を及ぼし、臨床的に認知症状態を招く。

Ｔａｕタンパク質は、また、リン酸化過程で生化学反応によって異常に縺れ合った形態である神経原線維もつれを形成し、同時に神経毒性（細胞毒性）を持つため、脳中で神経細胞の破壊を促進する。しかし、神経原線維もつれは、正常状態でも発見されるが、特にアルツハイマー病患者の脳中に多量存在する。オリゴマーＡβや神経原線維もつれのような神経毒性物質による細胞内損傷したミトコンドリアの蓄積とＵＰＳの過活性化が脳神経細胞死を誘発すると報告されている。ＵＰＳ機能障害が発生すると、Ａβの異常とｐ－Ｔａｕタンパク質がニューロンの細胞質への凝集によるニューロンの細胞死によってアルツハイマー病が誘発される。しかし、分子メカニズムの詳細はまだ明らかではない。従って、市場のニーズに応じて新しい認知症治療メカニズムの開発が求められている。

改善された細胞透過性を有する変形パーキンの開発（ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ）
パーキンは、神経細胞死に対する抗アポトーシス効果が立証されており、基礎研究で証明されたタンパク質である。パーキンソン病の動物モデルにおいて、パーキンを供給（補充）した場合、神経細胞が再活性化してパーキンソン病の症状が治療されるという報告がある。パーキンが非活性化されているドーパミン作動性神経細胞を活性化することで、パーキンソン病の根本的な治療薬として作用できるという証拠を立証する。パーキンの機能喪失がパーキンソン病の病理学的因子であることが明らかになり、パーキンによるマイトファジーが重要な機転として作用することが示された（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００８）。パーキンは、損傷したミトコンドリアを除去し、及び/又はマイトファジーを誘導するＥ３ユビキチンリガーゼである（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ、２０１２）。

Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを用いたパーキンソン病モデルから、パーキン又はＰＩＮＫ１遺伝子を除去した場合、ミトコンドリア機能障害及び運動機能喪失が生じ、パーキン発現ＰＩＮＫ１機能阻害のショウジョウバエにおいてＰＩＮＫ１突然変異による欠陥の表現型は、パーキンの補充によって回復すると報告されている（Ｎａｔｕｒｅ、２００６）。また、パーキンソン病患者の脳においてパーキン発現に問題があると報告されている（Ｎａｔ Ｍｅｄ、２００５）。なお、パーキンソン病の主要病因は、脳中に存在するα－シヌクレインが、機能異常によって蓄積が起こり、追加的なミトコンドリア複合体Ｉ分解、酸化ストレス及びユビキチンプロテアソーム阻害と共にドーパミン作動性神経細胞の漸進的アポトーシスを招くことになる。パーキン突然変異は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性の喪失によって発生するタンパク質の異常蓄積を誘発し、ドーパミン放出阻害とドーパミン作動性神経細胞の劣化を誘発させ、結局、神経細胞死滅を生じる。即ち、パーキンの機能異常は、α－シヌクレインの蓄積を引き起こす。

ＴＳＤＴプラットフォームを用いて、最適なパーキンソン病の治療標的候補を導出するため、次のような構造的にスクリーニングする過程を経て、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎが開発された。

（１）ａＭＴＤ３２１配列を無作為に抽出し、可溶化ドメイン［Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓのプロテインＳに由来するＳＤＡ（１８４Ａ／ａ）又はＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのシトクロムｂに由来するＳＤＢ（９９Ａ／ａ）］に融合し、Ｈｉｓ－ａＭＴＤ３２１－Ｐａｒｋｉｎ－ＳＤＡ（ＨＭ３２１ＰＳＡ）及びＨｉｓ－ａＭＴＤ３２１－Ｐａｒｋｉｎ－ＳＤＢ（ＨＭ３２１ＰＳＢ）を誘導した。

（２）ａＭＴＤ３２１とＳＤＢとの組み合わせの融合を基本骨格構造と決定した。

（３）Ｏｐｔｉｍａｌ ａＭＴＤ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ：ａＭＴＤシーケンスの置換によって、組換えタンパク質の溶解度、収率、細胞透過度、生物学的活性を比較分析し、最適なａＭＴＤ（ａＭＴＤ５２４）を決定した。１０種類のａＭＴＤがパーキンと可溶化ドメインＢ（ＳＤＢ）とを結合した基本構造にスクリーニングされた。１０種のａＭＴＤのうち、ａＭＴＤ５２４が最も優れた溶解度と収率を示した。

また、１０個のａＭＴＤ融合パーキン組換えタンパク質の細胞透過度を確認した結果、すべてのタンパク質が細胞透過性を有し、ａＭＴＤ５２４が４番目に優れている。さらに、神経毒素である６－ＯＨＤＡによって誘発された細胞毒性環境でａＭＴＤ５２４が最も優れた細胞保護効果があることが確認された。

（４）他のＣＰＰ（ＴＡＴ、ＰｏｌｙＲ、ＤＰＶ０３）との比較によって、ａＭＴＤが融合したパーキンの優秀性を立証した。

（５）Ｈｉｓ－Ｔａｇを除去し、同等性を立証した。

（６）ａＭＴＤ５２４－Ｐａｒｋｉｎ－ＳＤＢ（Ｍ５２４ＰＳＢ）を、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎのリードと決定した。

また他の神経毒素であるＭＰＰ＋によって誘発された細胞毒性環境でａＭＴＤ５２４が３番目に細胞保護効果があり、６－ＯＨＤＡによって誘導された細胞毒性環境でアポトーシス細胞を染色できるアネキシンＶアッセイでａＭＴＤ５２４が最高の細胞保護効果を有することが示された。これに基づいて、最適化されたリード構造によって、ａＭＴＤ５２４／ＳＤＢ融合ヒトパーキン組換えタンパク質を選別した。この構造は、メカニズム特異的パーキンソン病の標的治療剤であり、改善された細胞透過性のパーキン（ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ）と初めて確認された。即ち、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎは、細胞保護効果を有するパーキンタンパク質の機能的ドメインにａＭＴＤ５２４（ＡＶＡＬＩＶＶＰＡＬＡＰ（配列番号１２３））を結合して製造した細胞透過度の高い組換えタンパク質である。

ＰＣＴ／ＫＲ２０１６／００８１７４

上述のように、先行技術であるｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎは、神経保護活性及び抗パーキンソン病効果を示す、大きな潜在力を持っている。しかし、新しい治療剤開発のための医薬品としてｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎを生産するためには、生産収率を高め、大量生産が可能である効果的な工程を開発する必要がある。このため、本発明は、先行技術の進歩したシステムであって、１）ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの構造を変形（即ち、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ）させることでタンパク質の安定性を向上させる、２）先行技術の治療活性及び作用方式を維持しながら大規模製造が可能であるタンパク質の適切な精製工程を開発することを含む。

本開示は、ｉＣＰ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）―ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を提供する。

一実施形態において、上記組換えタンパク質は、
ｉ）変形パーキンタンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）；及び、
ｉｉ）ａＭＴＤ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；を含み、
上記変形パーキンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、
上記ａＭＴＤは、配列番号２～２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

一実施形態において、上記組換えタンパク質は、１つ又はその以上の可溶化ドメイン（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＳＤ）等をさらに含む。

一実施形態において、上記組換えタンパク質は、下記構造式のうちのいずれか１つで示され、
Ａ－Ｂ、Ｂ－Ａ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｃ－Ｂ、Ｂ－Ａ－Ｃ、Ｂ－Ｃ－Ａ、Ｃ－Ａ－Ｂ、Ｃ－Ｂ－Ａ、及びＡ－Ｃ－Ｂ－Ｃ
上記Ａは、ａＭＴＤであり、
Ｂは、変形パーキンタンパク質であり、また、
Ｃは、可溶化ドメインである。

一実施形態において、上記組換えタンパク質は、配列番号２４３のアミノ酸を有する。

一実施形態において、上記可溶化ドメイン等は、配列番号２４２のアミノ酸配列を有する。

一実施形態において、上記組換えタンパク質は、神経変性疾患の治療に使用される。

一実施形態において、上記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病を含む。

一実施形態において、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。

一実施形態において、上記ポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターが提供される。

一実施形態において、上記組換え発現ベクターに形質転換された形質転換体が提供される。

一実施形態において、活性成分として、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含む組成物が提供される。

一実施形態において、活性成分として、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質、及び、薬学的に許容可能な担体を含む神経変性疾患の治療用薬学的組成物が提供される。

これと関連して、上記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病を含む。

一実施形態において、神経変性疾患の治療用薬剤としての上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の使用が提供される。

これと関連して、上記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病を含む。

一実施形態において、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含む薬剤が提供される。

一実施形態において、神経変性疾患の治療用薬剤の製造のための上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の使用が提供される。

これと関連して、上記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病を含む。

一実施形態において、神経変性疾患患者の治療方法が提供される。

これと関連して、上記方法は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の治療的に有効量を患者に投与するステップを含む。

一実施形態において、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の製造方法が提供される。

これと関連して、上記方法は、
上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを製造するステップ；
上記組換え発現ベクターを使用して形質転換体を製造するステップ；
上記形質転換体を培養するステップ；及び、
上記培養によって発現した組換えタンパク質を収得するステップ；を含む。

一実施形態において、上記組換えタンパク質を収得するステップは、
封入体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｙ；ＩＢ）を洗浄するステップ；
第一次のイオン交換クロマトグラフィーを行うステップ；及び、
第二次のイオン交換クロマトグラフィーを行うステップ；を含む。

一実施形態において、上記洗浄するステップは、ｐＨ８の洗浄緩衝液を用いた１段階洗浄を含む。

一実施形態において、上記第一次のイオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーであり、また、
上記第二次のイオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーである。

一実施形態において、上記第二次のイオン交換クロマトグラフィーは、
８．０ｍＳ／Ｃｍの導電率の条件で洗浄するステップ；及び、
９．０ｍＳ／Ｃｍの導電率の条件で溶出するステップ；を含む。

一実施形態において、上記培養するステップは、流加式発酵を含む。

ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎは、工程開発及び構造変形によって、従来のｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの様々な限界及び問題点（例えば、低い安定性、単量体収率のばらつき、及び高コストＳＥＣの使用）を解決することができるため、既にピアレビューとジャーナル出版物で立証されているｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの強力な治療潜在力を持つ先端的薬物材料として開発することが可能である。ｉＣＰ－ＰａｒｋｉｎのＵｂｌドメインが削除された変形構造であるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、優れた純度、均質性、安定性、及び生物学的活性に基づいて、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの最終構造と選択された。

図１は、パーキンタンパク質の構造及び疎水性領域を示す。 図２は、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ変異体の構造スクリーニング結果を示す。 図３は、ＨＰＬＣ分析を用いたｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ変異体のタンパク質分析結果を示す。 図４は、システインからセリンに変化したｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ変異体の構造を示す。 図５は、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ（従来技術）及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの構造図を示す。 図６は、より高い均質性と純度を有する組換えタンパク質を精製するための改良プロセス（ＩＰ）の開発を例示する。 図７は、ＩＢ洗浄によって生成されたタンパク質の不純物が減少されることを示すダイヤグラムである。 図８は、組換えタンパク質の不純物を除去するために変形した溶出方法を示す。 図９は、より高い部分の単量体ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを得るために最適化された溶出方法を使用した１段階ＩＢ洗浄及び２段階カラム精製工程の開発を示す。 図１０は、２段階のカラム精製工程で不純物を効果的に除去することを説明する図である。 図１１は、単量体ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの大規模生産のためのステップ－溶出の統合を示す。 図１２は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの前臨床及び臨床開発のためのタンパク質製造の最終工程（ＦＰ）を示す。 図１３は、同一の条件で精製されたｉＣＰ－ＰａｒｋｉｎとｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎとのクロマトグラムの比較を示す。 図１４は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの改善された安定性を示す。 図１５は、３７℃で４８時間及び２５℃で４日間におけるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの安定性を示す。 図１６は、濃度によるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの安定性を示す。 図１７は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの特性要約を示し、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、臨床開発水準で適用可能な構造的安定性を有している。 図１８は、流加式発酵の結果を示す。 図１９は、細胞質量の収量によるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎのＩＢ収率を比較した図である。 図２０は、流加式発酵から生産されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ細胞質量を用いた精製結果を示す。 図２１は、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎ発現のための細胞株開発を示す。 図２２は、ＣＭＯにおける細胞株開発の最終結果セットを示す。 図２３は、ＣＭＯにおいて最終工程（ＦＰ）方法で生産されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを示す。 図２４は、ＣＭＯ及びセリバリー（Ｃｅｌｌｉｖｅｒｙ）社で生産されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの純度を示す。 図２５は、ＣＭＯで生産されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの凍結／解凍及び熱安定性を示す。 図２６は、ＣＭＯ及びセリバリー（Ｃｅｌｌｉｖｅｒｙ）社で生産されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの優れた生物学的活性に対する立証を示す。 図２７は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが細胞透過性であることを示す。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の可視化された細胞透過度を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞は、３７℃で２時間、ａＭＴＤに融合したＦＩＴＣ標識されたタンパク質（１０μＭ）で処理した。（Ａ）タンパク質の細胞透過度は、共焦点レーザー顕微鏡で可視化した。フローサイトメトリーによるｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の細胞透過度の測定を行った。両パーキン組換えタンパク質の細胞透過度は、それぞれＣ２Ｃ１２（Ｂ）とＡ５４９（Ｃ）で視覚的に比較した。白色バーは、未処理の細胞（ビヒクル）を示し、黒色バーは、同じモル濃度のＦＩＴＣ（ＦＩＴＣのみ）で処理された細胞を示し、青色バーは、ＦＩＴＣ標識されたｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎで処理された細胞を示し、赤色バーは、ＦＩＴＣ標識されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎで処理された細胞を示す。細胞透過度は、フローサイトメトリー分析によって測定した。 図２８は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが損傷した細胞において細胞透過性であることを示す。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の細胞透過度の測定結果を示す。両パーキン組換えタンパク質の細胞透過度は、６－ＯＨＤＡ処理後、Ｃ２Ｃ１２で互いに視覚的に比較した。２時間のインキュベーション後、細胞を溶解させ、ウェスタンブロットで分析した。 図２９は、パーキン組換えタンパク質のオートユビキチン化アッセイの結果を示す。ＡＴＰの有無によるｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎのｉｎ ｖｉｔｒｏオートユビキチン化活性の結果を示す。オートユビキチン化は、抗ユビキチン（ＦＫ２）を使用して、ウェスタンブロット分析で評価した。 図３０は、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによる細胞生存率の分析結果を示す。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、３０μＭの６－ＯＨＤＡ及び１０μＭのｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ又はｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎで処理した。（Ａ）２４時間のインキュベーション後、細胞をＡＴＰ－Ｇｌｏアッセイに適用した。両組換えタンパク質による細胞生存率は、ほぼ同一であることが注目される。（Ｂ）処理から細胞形態の変化を光学顕微鏡でモニタリングした。 図３１は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがミトコンドリア損傷状態でマイトファジーを促進することを示す。（Ａ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＣＣＣＰ及びｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ／ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎと共に４時間培養した。オートファジーインヒビターとしてクロロキンを処理したＣＣＣＰ又はＣＣＣＰ＋ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ処理ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の溶解物からオートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂ－ＩＩをウェスタンブロット分析によって検出した。（Ｂ）マイトファジーを検出するための共焦点顕微鏡の画像を示す。 図３２は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがミトコンドリア損傷状態でミトコンドリア生合成を促進し、ＲＯＳ生成を抑制することを示す。 図３３は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ＰａｒｋｉｎのコンペアラブルＭｏＡ１に対する立証結果を示す。 図３４は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがヒ素ナトリウムで誘導された細胞死滅及びα－シヌクレイン凝集の形態を抑制することを示す。ヒ素ナトリウムは、ＴａｇＧＦＰ２－α－シヌクレインＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に毒性があり、凝集されたα－シヌクレインの蓄積を誘導する（Ａ、Ｂ）。ＥＬＩＳＡ分析は、８時間で、可溶性フラクションにおいて、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによるオリゴマー化及び繊維化α－シヌクレインのような病理学的α－シヌクレイン形態の相当な減少が示される。 図３５は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ＰａｒｋｉｎのコンペアラブルＭｏＡ２に対する立証を示す。 図３６は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎと比較して生体内毒性が示されないことを示す。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ（６０ｍｇ／ｋｇ）を２週間、週３回、静脈注射した。マウスの体重、毛の状態及び行動を分析した。 図３７は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎと比較してｉｎ ｖｉｖｏ毒性を示さないことを示す。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ（６０ｍｇ／ｋｇ）を２週間、週３回、静脈注射した。処理されたマウスから、脾臓重量に対する体重の比率を分析した。 図３８は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎと同様に６－ＯＨＤＡ誘導性パーキンソン病動物モデルにおいて行動及び分子欠陥を改善することを示す。６－ＯＨＤＡ誘導性パーキンソン病（ＰＤ）マウスモデルにおいて、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの効能を示す。６－ＯＨＤＡ（４μｇ／ｈｅａｄ）を線条体の右側に注入した。ロータロッドテスト（ｒｏｔａ－ｒｏｄ ｔｅｓｔ）。相対行動の活動は１００％で希釈剤対照群の値を基準とした。 図３９は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが６－ＯＨＤＡ誘導性パーキンソン病動物モデルにおいて行動及び分子欠陥を改善することを示す。Ａは、実験プロトコルの概略図を示す。６－ＯＨＤＡ（４μｇ／ｈｅａｄ）を線条体の右側に注入した。ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを右脳のＳＴに６－ＯＨＤＡを注入した後、２週間から４週間、週３回、静脈注入した。Ｂは、ロータロッドテストを示す。相対行動の活動は１００％で希釈剤対照群の値を基準とした。 図４０は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが６－ＯＨＤＡ誘導性パーキンソン病動物モデルにおいて行動及び分子欠陥を改善することを示す。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現のウェスタンブロット分析及びＩｍａｇｅＪを用いて定量化された相対ＴＨ発現のグラフを示す。Ｌ及びＲは、それぞれ脳の左側及び右側を示す。 図４１は、投与２週間後のアルツハイマー病マウスモデルにおけるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによる認知機能の改善を示す。Ａは、２週間、アルツハイマー病モデルにおいてｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの用量依存的な実験の設計を示す。Ｂは、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの投与がアルツハイマー病モデルにおいて用量依存的方式で認知機能を有意に改善することを示す。 図４２は、投与４週間後のアルツハイマー病マウスモデルにおけるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによる認知機能の改善を示す。Ａは、４週間、アルツハイマー病モデルにおいてｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの用量依存的な実験の設計を示す。Ｂは、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの投与がアルツハイマー病モデルにおいて低用量依存方式で認知機能を有意に改善することを示す。 図４３は、アルツハイマー病モデルの脳からｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが病理学的タンパク質を除去することを示す。（Ａ）代表的な免疫組織染色画像は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによるアミロイドβ（Ａβ）のプラーク除去及び神経保護効果を示す。（Ｂ）代表的なドットブロット画像は、可溶性フラクションにおいて、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによる病理学的Ａβのプラーク形態の相当な減少を示す。（Ｃ）ドットブロット画像の定量化は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによるＡβプラークの顕著な減少を示す。 図４４は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが、Ａβ処理されたＨＴ２２細胞において、３及び５時間で、反応性酸化ストレス（ＲＯＳ）蓄積を遮断することを示す。 図４５は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によってアルツハイマー病モデルにおいて高い脳伝達力を持っていることを示す。（Ａ）ＡＤモデルの脳におけるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの定量的量は、Ｎｏｎ－ＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎよりも豊富であった。（Ｂ）ＡＤモデルにおいて、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの最大脳伝達は、２．９％であった。時点：０．５及び１時間。＊＊ｐ＜０．０１、データは、それぞれスチューデントのｔ検定を使用した平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである。

本明細書で使用された全ての技術及び科学用語は、特に定義されない限り、本発明が属する技術分野での専門家が通常理解できるものと同じ意味を持つ。本明細書で言及された全ての刊行物、特許、及びその他の参考文献は、全体が参考として含まれる。

本明細書全体にわたって、特に言及のない限り、「含む」又は「含有」とは、ある構成要素（又は構成成分）を特に制限なく含むことを指し、他の構成要素（又は構成成分）の付加を除くものと解釈されてはならない。

本明細書で使用された用語「アミノ酸」は、広義には、自然に発生するＬα－アミノ酸又はその残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）だけでなく、さらにＤ－アミノ酸及び化学的に変性した（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）アミノ酸を含む。例えば、上記アミノ酸の模倣体及び類似物を含み、本発明において、上記模倣体及び類似物は、機能的に等価なものを含むことができる。

本明細書で使用された用語「予防」とは、本開示によるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の投与によって神経変性疾患が抑制、又は発病が遅延される全ての行為を意味し、「治療」とは、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の投与によって神経変性疾患の症状が好転し、又は有利に変更される全ての行為を意味する。

本明細書で使用された用語「投与」とは、任意の適切な方法で対象体に所定の本開示の薬学的組成物を提供することを意味する。

本明細書で使用された用語「対象体」とは、神経変性疾患を発病した、又は発病する可能性があるヒトを含む全ての動物を意味する。上記動物は、ヒトだけでなく、それと類似した症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、山羊、駱駝、レイヨウ（antelope）、犬、又は猫を含むことができるが、これに限定されない。

Ｉ．ｉＣＰ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質

１．変形パーキン（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐａｒｋｉｎ）
本開示の一実施形態において、変形パーキンを含むｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を提供する。上記変形パーキンは、先行技術のｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎと比較してタンパク質の安定性が増加する効果を奏することができる。

上記変形パーキンは、パーキンタンパク質から一部のドメインが除去された形態であり得る。一実施例において、パーキンタンパク質のＵｂｌ、ＲＩＮＧ０、ＲＩＮＧ１、ＩＢＲ、及びＲＩＮＧ２からなる群から選択された１つ以上のドメインが除去された形態であり得る。具体的な実施例において、上記変形パーキンは、Ｕｂｌドメインが除去された形態であり得る。より具体的な実施例において、上記変形パーキンは、
QEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYNSFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQGPSCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGFAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV（SEQ ID No :1）
のアミノ酸配列を有することができる。但し、上記変形パーキンは、上記配列番号１のアミノ酸配列を有するものに限定されず、上記配列と同一又は類似した効果を示す全ての変性体を含むことができる。

２．生物学的活性分子を細胞の原形質膜内に伝達することを容易にするドメイン
本開示の一実施形態において、生物学的活性分子を細胞の原形質膜内に伝達することを容易にするドメインを含むｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を提供する。上記生物学的活性分子を細胞の原形質膜内に伝達することを容易にするドメインは、一実施例において、ａＭＴＤドメインを含むが、これに制限されず、細胞透過性を有する陽イオン、キメリック、疎水性ＣＰＰ（細胞透過性ペプチド）を含むことができる。

ここで、上記生物学的活性分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、化合物などを含む。本開示において、ａＭＴＤドメインとは、上記ＳＯＣＳ３タンパク質のＳＨ２ドメインを原形質膜内に伝達することを容易にするペプチドを意味することができる。なお、上記ａＭＴＤドメインに関しては、韓国登録特許１０－１９７１０２１に記載の全文が参考として組み込まれる。

一実施形態において、上記ａＭＴＤドメインは、配列番号２～２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。具体的な一実施例において、上記ａＭＴＤドメインは、配列番号１２３のアミノ酸配列を有することができる。

１．可溶化ドメイン
本開示の一例から得られるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、変形パーキン及びａＭＴＤドメインの他に、さらに１つ以上の可溶化ドメインを含むことができる。一実施形態において、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、変形パーキン、ａＭＴＤドメイン、及び可溶化ドメインを含むことができる。

本開示の一例において、可溶化ドメインを含むｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、生体内で可溶性が増加した効果を有することができる。上記可溶化ドメインは、一実施形態において、生物学的活性分子の溶解度を増加させる役割をするペプチドを含む。上記可溶化ドメインは、具体的な実施例において、
MAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWLILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL（SEQ ID No : 242）
のアミノ酸配列を有することができる。但し、これに制限されず、生物学的活性分子の可溶性を高めるものとして公知の物質のいずれも含むことができる。

ＩＩ．ｉＣＰ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の具体的な例示

本開示の一実施形態から得られるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、Ａ－Ｂ、Ｂ－Ａ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｃ－Ｂ、Ｂ－Ａ－Ｃ、Ｂ－Ｃ－Ａ、Ｃ－Ａ－Ｂ、Ｃ－Ｂ－Ａ、及びＡ－Ｃ－Ｂ―Ｃからなる群から選択される構造式で表現され得る。このとき、上記Ａは、ａＭＴＤドメインであり、Ｂは、変形パーキンであり、Ｃは、可溶化ドメインである。

本開示の一例から得られるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、具体的な一実施例において、次のようなアミノ酸配列を有することができる。但し、これに制限されず、上記Ｉ．ｉＣＰ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質に記載の内容を組み合わせて製造できるアミノ酸配列を有するｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質のいずれも含むことができる（表２に具体的なｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を例示）。

また、本開示の一例では、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を、アミノ酸配列の形態だけでなく、これをエンコードするポリヌクレオチドの形態、上記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、又は上記組換え発現ベクターに形質転換された形質転換体の形態で提供することができる。

ＩＩＩ．ｉＣＰ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の使用

１．薬学的組成物
本開示の一実施形態は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含む組成物を提供する。本開示の他の一例は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を有効成分として含む組成物を提供する。一実施形態において、上記組成物は、疾患又は予防用薬学的組成物であり得る。

本開示の一実施形態から得られる薬学組成物は、担体をさらに含むことができ、本開示の上記薬学組成物に含まれる薬学的に許容される担体としては、製剤時に通常使用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸、マグネシウム、及びミネラルオイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の上記薬学組成物は、上記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．， １９９５）に詳細に記載されている。

本開示の一例に係る上記薬学組成物を製剤化する場合、当該分野で通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を一つ以上混合して製造することができる。

一実施形態において、経口投与のための固形製剤として、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などが挙げられ、このような固形製剤は、一つ以上の本開示で示される化合物に、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）又はゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤の他に、マグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤も使用される。他の一実施例において、経口投与のための液状製剤として、懸濁剤、内用液剤、乳剤又はシロップ剤などが挙げられるが、よく使用される単純な希釈剤である、水、リキッドパラフィンの他に、種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤として、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤などを含むことができる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどを使用することができる。

上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、細胞透過性を有し、神経毒素から神経細胞を保護する役割を果たすことができる。より具体的には、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、損傷したミトコンドリアの条件でマイトファジーを促進する役割を果たすことができる。また、病理学的α－シヌクレインの蓄積を抑制する役割を果たす。即ち、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、上記のような機転によって神経細胞を保護する役割を行うことができる。

これにより、上記ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、神経細胞の損傷に関連した病気の予防、治療、改善のための薬学的組成物に含まれるか、薬物としての使用、又は薬物の製造に使用され得る。神経細胞の損傷と関連した疾病には、一実施形態において、神経変性疾患が含まれる。このとき、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、及び運動ニューロン疾患を含むが、これに制限されず、神経細胞の損傷に関連した疾患として知られた公知の疾患のいずれも含まれる。

２．治療方法
本開示の一実施形態において、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質は、病気の治療に使用され得る。より具体的に、本開示の一実施形態において、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含む薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与することを含む疾患の治療方法が提供される。このとき、上記個体は、ヒトを含む哺乳動物を意味することができる。

本開示の一実施形態から得られる組成物は、目的とする方法によって、経口投与或いは非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、又は局所に適用）することができ、投与量は、患者の病状及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与の経路及び時間によって異なるが、当業者によって適宜選択され得る。

上記組成物は、治療学的に有効な量で投与される。上記「治療学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な恵沢／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量の水準は、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物などのような要素、並びにその他の医学分野によく知られている要素によって決定され得る。本発明の一例に係る組成物は、単独治療剤として投与、又は他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤と順次又は同時に投与でき、単独で又は多重投与できる。上述の要素を全て考慮して副作用なしに最小の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。

具体的には、本開示の一例に係る化合物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって異なり、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．１～１００ｍｇ、好ましくは、０．５～１０ｍｇを、毎日又は隔日投与するか、１日１～３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満度、性別、体重、年齢などによって増減することができるので、上記投与量によって本開示の範囲が限定されることはない。

このとき、上記疾患の治療方法において、疾患は、２．薬学的組成物に記載された疾患に関する内容をすべて含む。即ち、本発明の一例において、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含む薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与することを含む、神経変性疾患の治療方法が提供される。また、本発明のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含む薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与することを含む、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び運動ニューロン疾患を含む神経細胞の損傷に関連した疾病の治療方法が提供される。

IV．ｉＣＰ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の製造方法

本開示の一実施形態は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の製造方法を提供する。上記方法は、後述するステップを含むことができる。

１．ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを製造するステップ
上記製造方法は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを製造するステップを含むことができる。このとき、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質に関しては、Ｉ．ｉＣＰ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質に記載の内容が全て含まれる。

本発明の「組換え発現ベクター」とは、組換えペプチド又はタンパク質を発現させるためのベクターを意味することができる。また、本開示のベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主細胞にして製造することができる。本開示の組換え発現ベクターとしては、例えば、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（酵母人工染色体）ベクター、プラスミドベクターなどが挙げられる。本開示に使用されるベクターは、当業界で公知の種々の方法によって製造することができる。

２．組換え発現ベクターを用いて形質転換体を製造するステップ
上記製造方法は、組換え発現ベクターを用いて形質転換体を製造するステップを含むことができる。このとき、上記組換え発現ベクターに形質転換させる宿主細胞は、組換えタンパク質を生産する宿主細胞として公知のものであれば、特に制限されずに使用できる。宿主細胞としては、バクテリア、酵母、カビなどが挙げられるが、これに制限されない。一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株が使用され得る。具体的な実施例において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１スター（ＤＥ３）、ＮＥＢ ｅｘｐｒｅｓｓ菌株が使用され得る。より具体的な実施例において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ ｅｘｐｒｅｓｓ菌株が使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ ｅｘｐｒｅｓｓ菌株の場合、より高いＩＢ（封入体）収率が得られる。但し、これに制限されず、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属菌株、バチルス・サブティリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株を宿主細胞として使用することができ、本開示は、上述した例示に制限されない。

３．形質転換体を培養するステップ
上記製造方法は、形質転換体を培養するステップを含むことができる。このとき、上記培養は、一実施形態において、回分式発酵（ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）又は流加式発酵（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を含むことができる。具体的な一実施例において、上記培養は、流加式発酵を含むことができ、この場合、回分式発酵と比較して、組換えタンパク質の収率が増加する効果が得られる。

４．上記培養によって発現された組換えタンパク質を収得するステップ
上記製造方法は、上記培養によって発現された組換えタンパク質を収得するステップを含むことができる。このとき、上記組換えタンパク質を収得するステップは、後述のステップを含むことができる。

１）封入体を洗浄するステップ
上記収得するステップは、封入体を洗浄するステップを含むことができる。この時、上記洗浄するステップは、１回以上の洗浄を含むことができる。一実施形態において、２回以上の洗浄を含むことができる。但し、タンパク質の消失を考慮して、１回の洗浄に、洗浄するステップを簡素化することができる。具体的な一実施例において、上記洗浄するステップは、５Ｍ ｕｒｅａ及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含む洗浄バッファー（ｐＨ８）を用いたワンステップ洗浄を含むことができる。但し、これに制限されない。

２）イオン交換クロマトグラフィーを行うステップ
上記収得するステップは、イオン交換クロマトグラフィーを行うステップを含むことができる。このとき、一実施形態において、上記イオン交換クロマトグラフィーは、２回遂行され得る。より具体的な一実施例において、２回のイオン交換クロマトグラフィーにおいて、第一次のイオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーであり、第二次のイオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。上記収得するステップにおいて、２回のイオン交換クロマトグラフィーが行われる場合は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の製造方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＳＥＣ）を行わないこともできる。

上記第二次のイオン交換クロマトグラフィーを行うステップは、一実施形態において、ステップ溶出（ｓｔｅｐ－ｅｌｕｔｉｏｎ）を含むことができる。上記ステップ溶出は、８．０ｍＳ／Ｃｍの導電率の条件で洗浄するステップ、及び、９．０ｍＳ／Ｃｍの導電率の条件で溶出するステップを含む。上記ステップ溶出によって、単量体ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが高い割合で収得される。

３）追加的なステップ
上記収得するステップは、上記封入体を洗浄するステップ及び上記イオン交換クロマトグラフィーを行うステップの他に、追加的なステップをさらに含むことができる。一実施例において、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ、リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）ステップ、及び溶解（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）ステップを含むことができる。具体的な一実施例において、上記収得するステップは、封入体を洗浄するステップ、変性ステップ、第一次のイオン交換クロマトグラフィーを行うステップ、第二次のイオン交換クロマトグラフィーを行うステップ、リフォールディングステップ、及び溶解ステップをこの順で含むことができる。但し、これに制限されず、組換えタンパク質の効率的な収得のために、各ステップを変形して行うことができる。

ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパクの効率的な収得のための好適な製造方法が図１２に示されている。

以下、実施例を挙げて本開示について詳述する。なお、実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を者であれば、容易に理解できるだろう。

１．改善された細胞透過性を有する変形パーキン（ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ）の開発及び技術的意味

（１）均質性及び安定性の向上のためのｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの構造的変形及びスクリーニングの開発
パーキンタンパク質は、Ｎ末端ユビキチン様（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ：Ｕｂｌ）、ＲＩＮＧ（ｒｅａｌｌｙ ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ ｎｅｗ ｇｅｎｅ）０、１、２、ＩＢＲ（ｉｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｉｎｇ）、及びリプレッサー要素（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＲＥＰ）ドメインを含む種々のドメインから構成される。ＲＩＮＧドメインは、パーキン構造の形成に重要な亜鉛結合部位を含む。ＲＩＮＧ１ドメインは、Ｅ２－Ｕｂ結合部位であり、ＲＩＮＧ２ドメインは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ）で主要な活性部位であり、パーキンドメインの酵素活性に対する臨界点を含む（図１）。なお、疎水性高密度領域は、疎水性相互作用によってパーキンタンパク質の凝集及び不安定性を誘発することがある（図１）。このような構造活性相関（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ－Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：ＳＡＲ）及び疎水性密度などの理論的根拠に基づいて、より安定したパーキンの構造を生成するため、変形されたｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎタンパク質の種々の構造を発現するクローンを開発し、当該タンパク質の誘導及び精製を調査した（図２）。

ほとんどのｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ変異体は、リフォールディングステップで凝集され、分析不可となり（図２）、一部の変異体（Ｎｏ．１３－１５）は、ＨＰＬＣ分析で精製した後、分析を行ったが、異質なものであった（図３）。

既存のパーキン配列に存在するシステイン残基（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）は、分子内及び分子間の二硫化結合の形成を防止するため、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）に変更して構造的安定性を増加させた（図４）。

合計２５個の変形構造が設計及びスクリーニングされ、１個の構造のみが、優れた安定性を示した。残りの２４個は、深刻な凝集を示し、カラム精製作業の前に精製過程を中断しなければならなかった。既存のパーキンからＵｂｌドメインが削除された構造［ａＭＴＤ５２４－Ｐａｒｋｉｎ（ΔＵＢＬ）－ＳＤＢ］は、凝集を示さなかった（図５）。このような変形された構造を、改善された細胞透過性を有する変形パーキン（ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ）と命名し、次の実験に供した。要するに、変異体欠失のＵＢｌドメインのみが進歩したｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎに非常に安定的に精製できたが、これは、ＰＤ細胞及び動物モデルを使用した既存の研究において治療可能性が既に立証されている。

ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの配列は次の通りである。
MAVALIVVPALAPQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYNSFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQGPSCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGFAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDVMAEQSDKDVKYYTLEEIQKHKDSKSTWLILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLGEQAGGDATENFEDVGHSTDARELSKTYIIGELHPDDRSKIAKPSETL（SEQ ID No:243）

（２）大量生産のための精製ステップの最適化
この問題を解決するため、Ｅ．ｃｏｌｉシステムにおいて、変性及びリフォールディング中、物理化学的条件を変化させることで再最適化した後、改良プロセス（ＩＰ）を開発した。これによって、高純度の単量体組換えタンパク質の製造が可能となった（図６）。

工程条件のスクリーニングは、封入体（ＩＢ）洗浄、カラムスクリーニング、及び溶離法スクリーニングを含む広範囲にわたる手順に重点を置いた。ｐH条件及び緩衝剤は、変性及びリフォールディング過程のために変更された。ＨＩＣ精製後にリフォールディングが行われるという以前の工程とは異なり、ＨＩＣは、ＡＩＥＸに代替され、リフォールディング工程後に行われた。リフォールディングのタンパク質濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌに補正された。ＡＩＥＸに続いてＳＥＣ精製が追加された。変性前に追加して行われたＩＢ洗浄は、組換えタンパク質の純度を増加させることができた（図７）。ＩＢ洗浄過程は、１）より低いｐＨバッファーで１次洗浄、２）より低い尿素濃度及びより高いｐＨバッファーで２次洗浄、の２段階で構成される。この過程を経て不純物を減らすことができた（図８）。

大規模生産の以前には、改良プロセス（ＩＰ）において追加的な工程開発が要求された。改良プロセス（ＩＰ）において、ＡＩＥＸとＳＥＣとの２段階のカラム精製は、ＣＩＥＸとＡＩＥＸに代替され、大容量のより多くの作業量を考慮して、溶出工程を単純化するためにグラジエント溶出（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ）をステップ溶出（ｓｔｅｐ－ｅｌｕｔｉｏｎ）に代替した。２段階のＩＢ洗浄は、ｐＨ８の洗浄緩衝液を使用した１段階の洗浄工程に単純化され、不純物を効果的に除去しながら標的タンパク質の消失を減らした（図９及び１０）。単量体ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、次のように種々の溶出方法で精製された（ＣＩＥＸで低ｐＨから高ｐＨまで直接溶出、及びＡＩＥＸで高ｐＨから低ｐＨへのグラジエント溶出（図９及び１０）。

また、溶出方法の追加的な変形として、グラジエント溶出方式が、ステップ溶出に代替された。具体的には、２次ＬＣの溶出ステップの前に、８．０ｍＳ／Ｃｍの導電率の条件を用いて洗浄ステップを追加し、不純物の洗浄を行った。９．０ｍＳ／Ｃｍの導電率の条件を標的溶出に適用し、単量体ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの収率をさらに高めた（図１１）。

従って、このような大規模生産に適した変形工程を最終工程（Ｆｉｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ；ＦＰ）として開発した。上述した最適化に基づいて開発されたＦＰを用いて、ＳＣＥカラム精製をすることなく９０％（～９２％）以上の均質性／純度を有するｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎを製造することができた（図１２）。

これに対し、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎは、はるかに高い単量体部分を示した（図１３）。

３７℃でｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎの改善された構造的安定性を確認するため、円形動的（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ：ＣＤ）分析を行った。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ（～６００秒）に比べて、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎは、熱的安定性を示し、１，０００秒間の測定中に、構造が維持されていることが確認された（図１４Ａ）。これは、３７℃でのｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎの安定性より６７％増加した数値である。１，０００秒以降での安定性は測定されていないため、より高い安定性が得られると考えられ、今後アップデートされる予定である。ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎのＴｍは、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎより６℃高く測定された（図１４Ｂ）。ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎの優れた安定性をさらに立証するために拡張された実験を行った。

ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎに比べて、３７℃でより安定していることが示された（図１５）。ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎは、３７℃２４時間後、単量体部分の損失の５％未満を示す反面、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎは、１５％以上の損失を示した。これは、臨床的効果が示されるまで体内で安定的に維持されなければならないという治療剤の必要性を考慮して、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎが臨床治療剤としてより適していることを示唆する。

ＦＰを用いて精製する際において、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎは、ＨＰＬＣ分析で９２％の均質性／純度を示した。また、両構造は、２５℃の室温での保管時に、安定性の面で大きな差が見られた。４日間保管後、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎは、たった２％の単量体純度損失を示した（図１５）。従って、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎが３７℃及び２５℃で単量体を維持する能力を測定するため、ＨＰＬＣ分析を行った。３７℃で８時間凝集が生じていないことを確認し、その結果、体温で８時間安定していると判断され、また常温（２５℃）では、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎが４日間安定しているため、タンパク質治療剤として使用可能であるものと判断される。

より高いタンパク質濃度（１０uｇ／uｌ）で安定性の評価を行った時、多量体部分がより多く増加したｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎと比較して、ｉＣＰ―ｍＰａｒｋｉｎは、２０uｇ／uｌでも安定的に維持された（図１６）。これは、収率の急な低下時（ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの濃縮時（１０uｇ／uｌ以上）に比べて優れた安定性を示している。

結論的に、工程開発及び構造変形によって、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、以前に発明されたｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎが持っていた種々の限界及び問題（例えば、低い安定性、単量体収率のばらつき、及び高コストＳＣＥの使用）を解決することができる。これは、ピアレビューとジャーナル出版物で既に立証されたｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの強力な治療潜在力を活用した先端的薬物材料の開発につながる。ＦＰで生産した場合における優れた純度、均質性、安定性及び生物学的活性に基づいて、Ｕｂｌドメインが削除されたｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの変形された構造であるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが、以下のようにｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの最終構造と選択された（図１７）：
－構造の最適化：ＵＢＬの欠失（熱安定性３１℃→３７℃）
－工程の最適化（その１）：変性／リフォールディングの条件を修正して向上した均質性（単量体収率、８１％→９２％）、
－工程の最適化（その２）：ＩＢ洗浄／溶出の条件を再最適化して除去された不純物、
－工程の最適化（その３）：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに交替、
－工程の最適化（その４）：大量生産のための流加式発酵によって全般的に２０倍増加したタンパク質収率。

（３）細胞量増加のための流加式発酵（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）
新たに開発されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、構造が安定的でかつ治療が機能的であったが、タンパク質収率が十分でなかった。タンパク質の最終収率を高めるため、回分式発酵の代わりに、流加式発酵を用いた。回分式発酵とは異なり、流加式発酵は、栄養素を継続的に供給して細胞質量とタンパク質の収率を最大化することで、後続の精製作業に使用される細胞の収量が約１０倍も増加した（図１８）。

流加式発酵は、セリバリー（Ｃｅｌｌｉｖｅｒｙ）社での既存の発酵工程に比べて約２０倍収率を増加させた。この収率と工程は、ｃＧＭＰ認証のＣＭＯに技術移転するに足りるものとみなされた（図１９）。また、Ｅ．ｃｏｌｉ培養方法として流加式発酵を最適化することで、薬物開発のためのＧＭＰ級のＣＭＯにおいて高収率でｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを生産した。この方法で細胞質量が２０倍増加した。新しい流加式発酵及び既存のバッチ発酵のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ品は、同一である（図２０）。

（４）大規模生産のためのＣＭＯでのｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの生産
セリバリー社で開発されたＦＰは、グローバルｃＧＭＰ級のＣＤＭＯに技術移転された。ＣＭＯにおいてｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを生産するため、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株の開発が完了した（図２１及び２２）。１０種の宿主菌株と５種のプラスミドを組み合わせて製造したＥ．ｃｏｌｉ細胞株（１６種類）をクローニング及び形質転換してスクリーニングした。ハイスループットスクリーニングによって、培養条件だけでなく、ベクター、誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ、ラムノース）、添加剤（例えば、プロリン／グルコース）による発現量及び純度を比較して、最適の条件及び細胞株を選定した。その結果、ＮＥＢ ｅｘｐｒｅｓｓが最も高いｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ生産性（純度及び発現収率）を示した（図２１）。

ＮＥＢ発現染色システムにおいて、ＩＢ収率の高密度の可能性については、７．４ｇ／Ｌと予想され、これは、全体規模の流加式発酵によるＢＬ２１スター（ＤＥ３）染色より遥かに高い（図２２）。

この細胞株を用いてｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを１５Ｌ規模に生産した。タンパク質の品質の場所による変化を確認するためのＣＭＯの細胞塊（ＮＥＢ ｅｘｐｒｅｓｓ）及びＦＰ工程を用いたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの企業内での生産では、ＣＭＯにおいて生産されたものと類似した純度と均質性を示した（図２３及び２４）。

精製後、タンパク質特性（例えば、純度、均質性及び安定性）及び活性については、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣで調査した。安定性については、セリバリー社内及びＣＭＯにおいて生産されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの反復凍結／解凍及び熱的安定性を調査した（図２５）。その結果、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、物理的ストレスに対する構造的完全性及び安定性を維持し、これは、ＦＰが、ＣＭＯで生産したｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが臨床薬剤開発のための大規模製造が可能であることを示している。また、ＣＭＯで生産されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、セリバリー社で生産されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎと類似した優れた生物学的活性を示す（図２６）。

２．発明の効果
２－１．パーキンソン病（ＰＤ）モデルにおけるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの効能

（１）パーキン組換えタンパク質の細胞透過性
従来、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎは、細胞透過性を有することが立証されている。ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、構造的変形及び改善された精製の過程を経て生成されているため、新しいパーキン組換えタンパク質の細胞透過性を、既存のパーキン組換えタンパク質と比較して調査した。パーキン組換えタンパク質の細胞透過性は、タンパク質処理２時間後、Ｃ２Ｃ１２細胞で評価された。ＦＩＴＣ標識されたａＭＴＤ含有パーキン組換えタンパク質、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、類似した細胞透過性を示したが、このため、タンパク質細胞内局在化を観察するため、蛍光共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用した（図２７Ａ）。次に、細胞透過性を定量化するため、ＦＩＴＣと１時間のインキュベーションを行った後、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＡ５４９細胞でフローサイトメトリー分析を行った。ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの細胞透過性は、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎよりやや優れている（図２７Ｂ及び２７Ｃ）。このような結果は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが短時間で首尾よく細胞に浸透することができ、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎに比べて向上した細胞透過性を有することを示している。

損傷した状態で細胞透過性を調査するためにパーキンソン病を模倣した６－ＯＨＤＡを細胞に処理した後、ｉＣＰ－ＰａｒｋｉｎとｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎとを共に２時間インキュベーションした。ＩＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びＩＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの細胞透過性をウェスタンブロットで分析した。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎのいずれでも、正常及び損傷した状態で細胞に浸透することができた（図２８）。この結果は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎと同様な細胞透過性を有することを示している。

パーキン組換えタンパク質の伝達。 細胞透過性の視覚化のために、パーキン組換えタンパク質をメーカ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）の指針に従ってＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）に接合した。Ｃ２Ｃ１２細胞を２４ウェルチャンバースライドのカバースリップで２４時間培養し、１０μＭのビヒクル（培養培地、ＤＭＥＭ）、ＦＩＴＣ単独、ＦＩＴＣ接合組換えタンパク質を、２時間、３７℃で処理した後、冷たいＰＢＳで３回洗浄した。処理された細胞を、室温で１０分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｊｕｎｓｅｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、核染色のため、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）と共にマウンティングメディウム（封入剤、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｂｕｒｌｉｇｎａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に封入した。蛍光信号の細胞内位置は、共焦点レーザー走査型顕微鏡で確認した。

細胞透過性を定量的に評価するため、Ｃ２Ｃ１２細胞を、３７℃で１時間、１０μＭのＦＩＴＣ標識された組換えタンパク質で処理し、冷たいＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で１０分間、プロテイナーゼＫ（５μｇ／ｍｌ）で処理して、細胞表面結合タンパク質を除去した。このような組換えタンパク質の細胞透過性は、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトを用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ；ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって分析された。

細胞透過性のウェスタンブロット分析のため、Ｃ２Ｃ１２細胞を、６－ＯＨＤＡ（３０μＭ）、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ（１０μＭ）及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ（１０μＭ）で２時間処理した。インキュベーション後、細胞を溶解させ、ウェスタンブロットで分析した。

（２）パーキン組換えタンパク質の生物学的活性
ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、ＡＴＰ ＧｌｏアッセイでＥ３ユビキチンリガーゼと同等の自己ユビキチン化活性及び細胞保護活性を示した（図２９及び３０）。また、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、同等な二重作用モードを示した（図３１～３５）：１）マイトファジー及びミトコンドリア生合成によるミトコンドリアの回復、２）病理学的α－シヌクレイン蓄積減少。

酵素活性を調べるため、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎにおいて自己ユビキチン化が評価された。ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎのＥ３ユビキチンリガーゼとしての生化学的活性を分析するため、試験管で自己ユビキチン化分析を行った。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎは、ユビキチン（ＦＫ２）に対する抗体として立証されたように、試験管内で自動ユビキチン化された（図２９）。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの結果と一致するように、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、ＡＴＰの存在有無に無関係に自動ユビキチン化できた。このような結果は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがＵＢＬドメインを含んでいなくても、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、活性型Ｅ３リガーゼである反面、ＣＩ－ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎは、Ｅ３リガーゼのユビキチン活性なしに触媒的に非活性であることを意味する。

以前に我々は、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎが用量依存的に神経毒素［１－メチル－４－フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）と６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）］から神経細胞を保護できると発表した。ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの細胞保護効果は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞で６－ＯＨＤＡを使用して確認された（図３０）。その結果は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが細胞毒性から有意に保護されたことを意味する。

Ｅ３ユビキチンリガーゼとしてのｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの自動ユビキチン化活性。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎにおいて自動ユビキチン化を評価し、酵素活性を確認した。Ｅ３ユビキチンリガーゼとしてのｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの生化学的活性を分析するため、メーカの指示に従って自動ユビキチン化分析（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて試験管内パーキンＥ３リガーゼ活性を測定した。要するに、精製されたパーキンタンパク質１μｇを、０．１μＭ Ｅ１、１μＭ Ｅ２、５０μＭ ユビキチン、及び１０μＭ Ｍｇ－ＡＴＰと、３７℃で１時間反応させた後、抗ユビキチン抗体（１：１，０００、エンゾライフサイエンス社）を用いてウェスタンブロット分析を行った。

ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの細胞保護効果。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの細胞保護効果は、神経毒素である６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）を用いて確認した。ヒト脳腫瘍（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ）細胞（韓国細胞株銀行）を培養及び塗抹し、７０％コンフルエンスでＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、３７℃で２４時間、３０μＭの６－ＯＨＤＡ及び１０μＭのパーキン組換えタンパク質で前処理した。その後、セルタイターＧｌｏアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０ Ａｓｓａｙ、プロメガ社）で細胞保護分析が評価された。セルタイターＧｌｏアッセイは、ＡＴＰの存在量を定量化して培養中の生存細胞の数を決定する均質な方法であり、代謝的活性型細胞の存在を示す。細胞生存力は、セルタイターＧｌｏ細胞生存力分析によって評価され、発光プレートリーダー（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１、Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて定量化された。

（３）作用方式（ＭｏＡ１＆２）：ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、損傷ミトコンドリア（１）及び病的α－シヌクレイン（２）の蓄積からニューロンを保護する。
パーキンは、損傷したミトコンドリアを除去するオートファジー過程の一つであるマイトファジーに関与する。ＣＣＣＰのような化学物質の処理で誘導されたミトコンドリアの損傷は、ＰＩＮＫ１の蓄積、及びその後ミトコンドリアに対するパーキン活性化による一連のマイトファジー過程を引き起こす。従って、我々は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ処理が、損傷したミトコンドリアの条件で、マイトファジーを加速化できると仮定した。この研究において、マイトファジー流動の促進は、ミトコンドリアがリソソームへの増加した局在化や毒素処理条件で増加したマイトファジーと相関関係があった。マイトファジー流動は、オートファゴソーム膜に位置するオートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂ－ＩＩの水準を測定して分析した。

ＣＣＣＰ処理は、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ／ＬＣ３Ｂ－Ｉ比の水準を漸進的に増加させた。しかし、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、時間が経つにつれてＣＣＣＰ処理された細胞においてＬＣ３Ｂ－ＩＩ／ＬＣ３Ｂ－Ｉ比をさらに向上させ、これは、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ処理後、マイトファジーの増加と一致した（図３２）。

従って、このようなデータは、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが、損傷したミトコンドリアを代替するため、マイトファジー及びミトコンドリア生合成（図３１～３２）を促進することを示している。

孤発性パーキンソン病は、α－シヌクレインタンパク質の病理学的（オリゴマー化、線維化、及びリン酸化）形態だけでなく、Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ－１（α－シヌクレイン相互作用タンパク質）及びＰａｅｌ－Ｒ（レビー小体の累積タンパク質の一種）を有するレビー小体と知られている構造と関連している。Ｓｙｎｐｈｉｌｉｎ－１及びＰａｅｌ－Ｒは、パーキン基質として知られている。その反面、相反する報告にもかかわらず、α－シヌクレインは、タンパク質がグリコシル化される場合を除いては、パーキン基質とは見なされない。緑色蛍光タンパク質（ＴａｇＧＦＰ２－α－シヌクレイン）にタグされたα－シヌクレインを発現するように操作されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用いて、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが亜ヒ酸ナトリウム（ＮａＡｓＯ２）によって誘発されたα－シヌクレイン沈着の水準に影響を及ぼすか否かを調査した。我々は、亜ヒ酸ナトリウムがオリゴマー化／線維化α－シヌクレインの水準を増加させ、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎがオリゴマー化／線維化α－シヌクレインの凝集水準を減少させたことを確認した（図３４Ａ～３４Ｂ）。

ミトコンドリアが損傷した状態でｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎを介したマイトファジー。パーキンは、損傷したミトコンドリアを除去するオートファジー過程の一つであるマイトファジーに関与する。ＣＣＣＰのような化学物質の処理により誘発されたミトコンドリア損傷は、ＰＩＮＫ１の蓄積と、その後ミトコンドリアに対するパーキン活性化による一連のマイトファジー過程を引き起こす。マイトファジー流動の促進を調査するため、オートファゴソーム膜に位置するオートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂ－ＩＩの水準を、ＣＣＣＰ（１０μＭ）、クロロキン（４０μＭ）、及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ（４０μＭ）処理で分析した。インキュベーション後、細胞溶解物をウェスタンブロットで分析し、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ／ＬＣ３Ｂ－Ｉ比の水準を測定した。

ＴａｇＧＦＰ２－α－シヌクレイン発現ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞においてα－シヌクレイン凝集体の分解評価を行うための試験管内研究。新しい緑色蛍光ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株は、ＴａｇＧＦＰ２－α－シヌクレインで安定した形質感染によって発現された。ＴａｇＧＦＰ２－α－シヌクレイン細胞株は、安定的に形質感染され、セルベースアッセイ応用分野で使用可能である。この安定的に形質感染された細胞株は、一定水準のα－シヌクレイン発現が示される。この細胞株は、パーキンソン病研究のための「試験管内」モデルとして使用するためのものである。亜ヒ酸塩は、強力なユビキタス環境毒性金属である。ヒ素は、ミトコンドリア膜電位の消失を誘発し、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成と脂質過酸化を誘発する。ＴａｇＧＦＰ２－α－シヌクレイン発現ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ（２０μＭ）と亜ヒ酸ナトリウム（２μＭ）で処理した。インキュベーション後、細胞溶解物は、抗α－シヌクレイン凝集体抗体及びヒトα－シヌクレインＧｌｙ１１１－Ｔｙｒ１２５抗体でＥＬＩＳＡ分析した。

（４）ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの生体内毒性
新たに開発されたｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎの生体内毒性の有無を調べるため、一般の毒性点数を測定した。この両グループのマウスに、６０ｍｇ／ｋｇのｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの処理を施した。各グループは、２週間、週３回、静脈注射をした。注射後、マウスの体重、毛の状態、及び行動を分析した。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎを注射したマウスグループは、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎのグループと比較して毒性点数を示した（図３６）。

新たに開発されたｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが生体内毒性があるかを調べるため、脾臓毒性分析を行った。この両グループのマウスに、６０ｍｇ／ｋｇのｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの処理を施した。各グループは、２週間、週３回、静脈注射をした。注射後、マウスの脾臓の重さと体重との割合を分析した。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎが注射されたマウスグループは、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎのグループと比較して、高い脾臓毒性点数が示された（図３７）。このような結果は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが生体内毒性がないことを示唆する。

（５）ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの生体内効能
ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの神経保護活性は、６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）誘導マウスモデルでテストした。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ投与による治療効能を確認するため、６－ＯＨＤＡによって誘導されたＰＤマウスモデルにおいて、４週間、注射プロトコルを行った（図３８）。ｉＣＰ－ＰａｒｋｉｎとｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを、４週間、週３回、静脈注射した。ロータロッドテストは、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎで処理されたマウスにおいて類似した運動機能障害の回復が示された。

ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの生体内毒性。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを、２週間、週３回、静脈注射した。一般の毒性点数（体重、毛の状態、及びマウス行動を含む。）、及び脾臓の重さと体重との割合を分析した。

ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ投与による治療効能を確認するため、６－ＯＨＤＡによって誘発されたＰＤマウスモデルにおいて、４週間、注射プロトコルを行った。ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを、４週間、週３回、静脈注射した。ロータロッドテストは、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ処理が運動機能障害を改善することを示している（図３９及び４０）。また、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ処理は、ＰＤマウスモデルにおいてＴＨ発現水準（９０％）を回復させた。

６－ＯＨＤＡ誘導ＰＤマウスモデル。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎは、ＰＤに関連した運動症状を予防及び／又は回復する能力について、種々の動物モデルでテストされた。各モデルにおいて運動症状の発症は、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ処理の開始前に、アポモルヒネの回転テストによって確認された。動物にアポモルヒネ（０．１％アスコルビン酸に新たに溶解し、使用する前に暗所で氷上に保管）０．１ｍｇ／ｋｇを皮下注射し、病変のあるマウスの側面偏向回転が２０分以上、６０ターン程度の比率より速い有症状であると判断した。パーキンタンパク質は、静脈内（ｉｖ）投入された。本明細書に説明された時間と容量、また運動機能の変化を後述のようにモニタリングした。Ｃ５７ＢＬ／6マウス（１３週齢雄性）は、Ａｌｆａｘａｎ：Ｒｏｍｐｕｎ（Ｂａｙｅｒ社）の３：７混合物で麻酔した。脳定位固定装置にセットさせた後、０．０２％アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．８μＬに溶解した４μｇの６－ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を次の座標で線条体に０．２μＬ／ｍｉｎの速度で注入した（前頭泉門に相対的）：前方－後方（ＡＰ）＝＋０．６ｍｍ、内側－側面（ＭＬ）＝－２．２ｍｍ、及び背部－腹部（ＤＶ）＝－３．２ｍｍ（硬膜から）、平らな頭蓋骨の位置に。対照群マウスには、０．０２％アスコルビン酸溶液のみを注射した。

ロータロッドテスト。安定した性能を達成するため、マウスは、３００秒又は７２０秒間、１５ｒｐｍでロータロッド装置で事前訓練された。テストは、３００秒にわたって４～４０ｒｐｍで漸進的に加速した速度で行われ、各マウスがロッドに留まる時間を記録した。動物一匹当たり３回テストされた。

動物研究でチロシン水酸化酵素に対するウェスタンブロット分析。脳サンプルにおいてチロシンヒドロキシラーゼを分析するため、分離された脳をプロテアーゼ阻害剤（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）が含まれた予備溶解緩衝液（イントロンバイオテクノロジー社）で均質化した。定量化された細胞溶解物を、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（バイオラッド社）に移した。膜をＴＨ（１：２，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ１５２）及びβ－アクチン（１：１００，０００；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ３８５４）に対する１次抗体と共にインキュベーションした後、２次抗体をインキュベーションした。スーパーシグナルウェストデュラ（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して視覚化した後、免疫ブロットをソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）で定量化した。

２－２．追加的な示唆点（アルツハイマー病、ＡＤ）：ＡＤモデルにおけるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの効能

（１）βアミロイド線維（ｆｉｂｒｉｌ ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ、ｆＡβ）誘導ＡＤモデルにおいて２週間ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ投与した後の認知機能の改善効果
定位手術により４μｇのβアミロイド線維（ｆＡβ）を脳に注入してＡＤマウスモデルを誘導した。手術２週間後、認知機能（自発的交替）検査であるＹ迷路テストによってアルツハイマー病マウスモデルが誘導されたかを確認した。動物を無作為に分類した後、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを、用量依存的に計２週間、週３回、静脈内（ＩＶ）投与した。３週目と４週目に、Ｙ迷路テストを通じてｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ投与により認知機能が向上したか否かを確認した（図４１Ａ）。その結果、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ投与４週目の時に、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ１００ｍｇ／ｋｇで認知機能が１２２％向上している（図４１Ｂ）。

動物。研究は、大韓バイオリンク社（陰城郡、大韓民国）から購入した、週齢が一致したＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（７～８週齢）を用いて行った。温度（設定点２３±２℃）、相対湿度（設定点５０％）及び明るさ条件（８：００～２０：００時に、照明をオン／オフ）が厳しく管理された動物飼育室で５匹のグループにして保存された。研究全般にわたって、水道水と標準的な飼料が任意提供された。

βアミロイド線維（ｆＡβ）誘導ＡＤマウスモデル。Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスを、 Ａｌｆａｘａｎ：Ｒｏｍｐｕｎ（７：３）の混合物で麻酔した後、脳定位固定装置にセットした後、座標で定位手術によりｆＡβ（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、Ａ１１７０）４μｇを脳に注入した（前頭泉門に相対的）：前方－後方（ＡＰ）：－２ｍｍ、内側－側面（ＭＬ）：０ｍｍ、及び背部－腹部（ＤＶ）：－３ｍｍ（硬膜から）、平らな頭蓋骨位置に。照群マウスには０．０１％アスコルビン酸溶液のみを注射した。

行動テスト（Ｙ迷路）。ＡＤマウスモデルは、認知機能（自発的交替）テストであるＹ迷路テストにより検証した。Ｙ迷路装置（アームの長さ：３５ｃｍ、壁面の高さ：９ｃｍ）は、白色ポリ塩化ビニール（ＰＶＣ）製の同じ長さを有するアーム３本が途中で結合されて「Ｙ」字型を形成する。この生態学的テストは、新しい領域を探索しようとする齧歯類の生まれつきの好奇心を基盤にしており、否定的又は肯定的な強化刺激がなく、マウスに与えるストレスがほとんどない。Ｙ迷路にマウスを配置した直後、ビデオ録画システムを活性化する。再生を押してから８分間、各マウスの自発的動作を記録する。セッションが完了すると、マウスをホームケージに用心深く入れ、ケージを棚に回収する。各セッションの間に、無香料漂白剤殺菌７０％ＥｔＯＨのウェットティッシュで迷路をよく掃除する。自発交替の測定は、マウスが３つの連続したアームの各入口から迷路の他のアームに入る時に行われる。交替率は、実際の交替回数に対する最大の交替回数の割合で計算された。

（２）ｆＡβ誘発ＡＤモデルにおいて４週間ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ投与した後の認知機能の改善効果
ＡＤマウスモデルは、定位手術により４μｇのβアミロイド線維（ｆＡβ）を脳に注入して誘導した。手術２週間後、Ｙ迷路テストによってＡＤマウスモデルが誘導されたかを確認した。動物を無作為に分類した後、ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎを、用量依存的に計４週間、週３回、静脈注射した。３週、４週、５週、６週目に、Ｙ迷路テストによって、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ投与によって認知機能が向上しているかを確認した（図４２Ａ）。ｉＣＰ－Ｐａｒｋｉｎ投与後のＡＤモデルにおける認知機能は、時間及び用量依存的に改善された。また、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎを６週間投与した場合、認知機能は、５０ｍｇ／ｋｇのｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎで１０５％改善された（図４２Ｂ）。

動物。研究は、大韓バイオリンク社（陰城郡、大韓民国）から購入した、週齢が一致したＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（７～８週齢）を用いて行った。温度（設定点２３±２℃）、相対湿度（設定点５０％）及び明るさ条件（８：００～２０：００時に、照明をオン／オフ）が厳しく管理された動物飼育室で５匹のグループにして保存された。研究全般にわたって、水道水と標準的な飼料が任意提供された。

βアミロイド線維（ｆＡβ）誘導ＡＤマウスモデル。Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスを、Ａｌｐａｘａｎ：Ｒｏｍｐｕｎ（７：３）の混合物で麻酔した後、脳定位固定装置にセットした後、座標で定位手術によりｆＡβ（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、Ａ１１７０）４μｇを脳に注入した（前頭泉門に相対的）：前方－後方（ＡＰ）：－２ｍｍ、内側－側面（ＭＬ）：０ｍｍ、及び背部－腹部（ＤＶ）：－３ｍｍ（硬膜から）、平らな頭蓋骨位置に。照群マウスには０．０１％アスコルビン酸溶液のみを注射した。

行動テスト（Ｙ迷路）。ＡＤマウスモデルは、認知機能（自発的交替）テストであるＹ迷路テストにより検証した。Ｙ迷路装置（アームの長さ：３５ｃｍ、壁面の高さ：９ｃｍ）は、白色ポリ塩化ビニール（ＰＶＣ）製の同じ長さを有するアーム３本が途中で結合されて「Ｙ」字型を形成する。この生態学的テストは、新しい領域を探索しようとする齧歯類の生まれつきの好奇心を基盤にしており、否定的又は肯定的な強化刺激がなく、マウスに与えるストレスがほとんどない。Ｙ迷路にマウスを配置した直後、ビデオ録画システムを活性化する。再生を押して８分間、各マウスの自発的動作を記録する。セッションが完了すると、マウスをホームケージに用心深く入れ、ケージを棚に回収する。各セッションの間に、無香料漂白剤殺菌７０％ＥｔＯＨのウェットティッシュで迷路をよく掃除する。自発交替の測定は、マウスが３つの連続したアームの各入口から迷路の他のアームに入る時に行われる。交替率は、実際の交替回数に対する最大の交替回数の割合で計算された。

（３）ＡＤモデルの脳から病的Ａβプラークの除去
全てのマウス行動実験が完了した後、脳を除去した。クレシルバイオレット染色によって、ｆＡβ誘発されたＡＤマウスの脳の海馬からニューロンが減少し、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎが神経保護効果があることが示された。なお、免疫組織化学染色によって、ＡβプラークがｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによって海馬から除去されたことが示された（図４３Ａ）。ドットブロット分析によって、ＡβプラークがｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎによってＡＤ脳から９７％減少したことが示された（図４３Ｂ及び４３Ｃ）。

免疫組織化学。Ａｌｆａｘａｎ：Ｒｏｍｐｕｎの混合物でマウスを深く麻酔し、食塩水と４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ＢｉｏＳＥＳＡＮＧ社）で１５～２０分間、灌流した。脳は、４℃から２時間、４％ＰＦＡで速やかに固定し、４℃で３０％スクロース（ＤＡＥＪＵＮＧ社）で４８時間インキュベーションし、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物（ライカバイオシステムズ社）で包埋した後、凍結切片（２０μｍの厚さ）を切断した。切片をＰＢＳ存在下で０．３％ Ｈ_２Ｏ_２（ＤＡＥＪＵＮＧ社）を用いて３０分間インキュベーションし、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。ＰＢＳで洗浄した後、切片を遮断溶液（ＰＢＳ中、５％正常ヤギ血清；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｓ－１０００）で６０分間インキュベーションした。切片をマウス単クローン６Ｅ１０抗体（１：２５０；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、ＳＩＧ－３９３２０）の存在下、４℃で、１８時間インキュベーションした後、ビオチン化されたヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ；１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＢＡ－９２００）で、室温で１時間インキュベーションした。次いで、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＰＫ－６１００）を用いて、室温で６０分間、切片をアビジン－ビオチン化パーオキシダーゼ複合体で処理した。その後、切片を、発色源として３，３０－ジアミノベンジジン（３，３０－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＤＡＢパーオキシダーゼ基質キット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて処理した。永久取り付けスライドを観察し、デジタルイメージングシステム（ＤＳＲｉ２、ニコン社）を備えた顕微鏡を用いて写真を撮影した。スライドガラス上に脳組織の切片を貼り付けた。脳切片をＰＢＳで２時間洗浄し、貯蔵緩衝液を除去し、完全に乾燥させた。スライドガラスは、その後、５分間、ＤＷで水和された。０．１％クレシルバイオレットアセテート（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４６８１７）で５分間染色する前、切片をＤＷで３回ずつ変えて濯ぎ、１分間、７０→８０→９０→１００％エタノールに入れた。切片を乾燥させた後、キシレンに漬けて透明化した後、カバースリップをしてデジタルイメージングシステム（ＤＳＲｉ２、ニコン社）を使用して観察した。

ドットブロット分析。ドットブロット分析は、ウェスタンブロット分析及び実験技法に類似している。不溶性細胞の分画を上述した通りに準備した。ドットブロット分析のため、重力濾過によりバイオドット精密濾過装置（バイオラッド社）を使用して細胞溶解物（タンパク質１０μｇ）をニトロセルロース膜に結合させた。この手動濾過は、定量的抗原結合のために必要である。

（４）ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎは、ＨＴ２２細胞においてＡβによる反応性酸化ストレス（ＲＯＳ）水準を低下させる
反応性酸化ストレス（ＲＯＳ）水準は、Ａβ（２．５μＭ）処理されたＨＴ２２細胞において、ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ（１０μＭ）処理により、３時間及び６時間に１０４％及び１５１減少している（図４４）。

反応性酸化ストレス（ＲＯＳ）の測定。ＨＴ２２細胞（マウス海馬由来の神経細胞）、を９６ウェルプレート（１×１０^４細胞／ウェル）に加えた。２４時間後、ＲＯＳ緩衝液で洗浄した。２５μＭのＤＣＦＤＡ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＯＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ａｂｃｏｍ、ａｂ１１３８５１）をＲＯＳ緩衝液に処理し、各ウェルに、１００μｌずつ、４５分間反応させた。その後、ＲＯＳ緩衝液で洗浄した後、Ａβ２．５μＭとｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ１０μＭとをＲＯＳ緩衝液に希釈してウェルに処理した。３、６時間インキュベーションした後、励起及び放出波長をそれぞれ４８８及び５３５に設定したマイクロプレートシステムを用いてＲＯＳの水準を示すＤＣＦＤＡ蛍光強度を検出した。

（５）ＡＤモデルの脳においてパーキンの濃度及びｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの伝達
ＴＳＤＴプラットフォームを使用する場合、脳に存在するパーキンの濃度が、ＴＳＤＴプラットフォームがない場合に比べて４５２％高い（図４５Ａ）。ＡＤモデルにおいて、正常に比べて最大２．９％より高いｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの脳幹伝達が行われた（図４５Ｂ）。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎの測定。ｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎのＳＤＢ領域において、シグネチャーペプチドは、脳組織のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって検出された［Ｅｎｖｉｇｏ（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）との契約下にある］。要するに、脳溶解物は、スマートダイジェスト（ＳＭＡＲＴ Ｄｉｇｅｓｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びプロテインワークス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｏｒｋｓ、Ｗａｔｅｒｓ社）の２つの異なる消化キットを用いて分解され、ペプチドは、アセトニトリル勾配のあるＡＣＥウルトラコアスーパーＣ１８カラム（ＡＣＥ ＵｌｔｒａＣｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で分離され、サイエックスＡＰＩ６５００＋質量分析計（Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ６５００＋マススペクトロメータ、ＳＣＩＥＸ社）で分析した。

Claims (20)

1. ｉ）変形パーキンタンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）；及び、
   ｉｉ）ａＭＴＤ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；を含み、
   上記変形パーキンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなり、
   上記ａＭＴＤは、配列番号２～２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するものである、ｉＣＰ（ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質。
2. 上記組換えタンパク質は、１つ以上の可溶化ドメイン（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＳＤ）をさらに含むものである、請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質。
3. 上記組換えタンパク質は、下記構造式のうちのいずれか１つで示され、
   Ａ－Ｂ、Ｂ－Ａ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｃ－Ｂ、Ｂ－Ａ－Ｃ、Ｂ－Ｃ－Ａ、Ｃ－Ａ－Ｂ、Ｃ－Ｂ－Ａ、及びＡ－Ｃ－Ｂ－Ｃ
   Ａは、ａＭＴＤであり、
   Ｂは、変形パーキンタンパク質であり、及び、
   Ｃは、可溶化ドメインである、請求項２に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質。
4. 上記組換えタンパク質は、配列番号２４３のアミノ酸配列を有するものである、請求項２に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質。
5. 上記可溶化ドメインは、配列番号２４２のアミノ酸配列を有するものである、請求項２に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質。
6. 上記組換えタンパク質は、神経変性疾患の治療に使用され、
   上記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である、請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質。
7. 請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
9. 請求項８に記載の組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体。
10. 活性成分として、請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含む組成物。
11. 活性成分として、請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質、及び、薬学的に許容可能な担体を含む神経変性疾患の治療用薬学的組成物であって、
    上記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である、神経変性疾患の治療用薬学的組成物。
12. 神経変性疾患の治療用薬剤であって、
    請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含み、
    上記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病を含むものである、神経変性疾患の治療用薬剤。
13. 請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質を含む薬剤。
14. 神経変性疾患の治療用薬剤の製造のための請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の使用であって、
    上記神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病を含むものである、使用。
15. 請求項１に記載のｉＣＰ－ｍＰａｒｋｉｎ組換えタンパク質の製造方法であって、上記方法は、
    請求項８に記載の組換え発現ベクターを製造するステップ；
    上記組換え発現ベクターを使用して形質転換体を製造するステップ；
    上記形質転換体を培養するステップ；及び、
    上記培養によって発現した上記組換えタンパク質を収得するステップ；
    を含む、方法。
16. 封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を洗浄するステップ；
    第一次のイオン交換クロマトグラフィーを行うステップ；及び、
    第二次のイオン交換クロマトグラフィーを行うステップ；
    によって、上記組換えタンパク質を収得するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 上記洗浄するステップは、ｐＨ８の洗浄緩衝液を用いた１段階洗浄を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 上記第一次のイオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーであり、及び、
    上記第二次のイオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１６に記載の方法。
19. 上記第二次のイオン交換クロマトグラフィーは、
    ８．０ｍＳ／Ｃｍの導電率の条件で洗浄するステップ；及び、
    ９．０ｍＳ／Ｃｍの導電率の条件で溶出するステップ；
    を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 上記培養するステップは、流加式発酵を含む、請求項１５に記載の方法。