KR102374047B1 - N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민(N,N′-Diacetyl-p-phenylenediamine; DAPPD) 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, DAPPD 화합물은 알츠하이머병 형질전환 마우스를 이용한 실험에서 미세아교세포의 손상된 식세포작용 기능을 복구시킴으로써 아밀로이드-베타 종의 제거를 촉진하여 인지적 결함을 효과적으로 개선시키는 것을 확인하였으며, 또한 DAPPD는 매우 작고 단순한 구조로 혈관-뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)를 통과해 뇌로 흡수되며 독성이 거의 없다는 특성을 확인하였는바, 본 발명에 따른 DAPPD는 신경보호 제제로써 신경퇴행성 염증을 조절하여 신경퇴행성 질환, 구체적으로 알츠하이머병에 대한 유망한 치료제로써 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민(N,N′-Diacetyl-p-phenylenediamine; DAPPD) 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
신경퇴행(Neurodegeneration)은 신경 구조와 기능의 점진적인 소실로 정의되며, 중추신경계의 선천적 면역기전인 신경염증이 신경퇴행의 주요한 병리학적 기여자임을 제시하는 다양한 증거들이 보고되어 왔다. 미세아교세포(Microglia)는 중추신경계에 상주하는 식세포(phagocyte)로 병원체를 식별하고 제거하여 상기 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 정상 조건하에서 미세아교세포의 면역반응은 세포의 동원 및 손상된 뉴런 제거에 관여하는 전염증성 매개인자들을 분비하거나 신경세포 증식 및 시냅스 가소성을 촉진할 수 있는 항염증성 매개인자들을 생산할 수 있는 양방향적 기능의 균형을 조절한다. 대조적으로, 신경 손상 및 단백질 응집체와 같은 병리학적 유발인자가 지속적으로 존재하면 미세아교세포의 만성적 활성화 및 손상이 발생하며, 미세아교세포의 기능 이상은 종종 1) 신경독성 전염증성 매개인자들의 발현 증가; 2) 신경영양 항염증성 매개인자들의 생산 감소; 및 3) 식세포작용 능력 상실에 의한 병원체 제거 능력의 손상으로 나타난다. 또한 이러한 미세아교세포의 변화들은 자가-증식 및 양성-피드백 루프를 통해 신경세포에 부정적인 결과를 초래한다. 따라서, 미세아교세포의 기능 장애는 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 파킨슨 병(Parkinson disease) 및 근위축성측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis)을 포함하는 신경퇴행성 질환에 대한 약물 개발의 잠재적 치료 표적이 될 수 있다.
알츠하이머병은 치매의 가장 흔한 형태로, 2016년에 약 4,700만 건이 보고되었으며 2050년까지 환자 수가 약 1억 3,100만 명에 이를 것으로 예상되고 있다. AD의 다발성 병인은 신경염증 및 아밀로이드-베타(amyloid-β; Aβ)를 포함한 아밀로이드성 단백질과 같은 다양한 병리학적 인자를 포함한다. 또한, 신경염증과 Aβ 사이에 밀접한 관련성이 보고되었으며 이러한 상관관계는 알츠하이머병의 발달에 결정적인 영향을 미치는 것으로 여겨지고 있다. 미세아교세포의 기능 이상에 의한 식세포작용 능력의 상실은 Aβ 제거율을 유의하게 감소시키고, 이에 의한 Aβ의 증가는 만성적 활성화를 통해 미세아교세포의 손상을 유발할 수 있다(Lancet Neurol. 14, 388?405 (2015)). 이러한 악성 주기는 신경 퇴행을 강력하게 유도하므로, 미세아교세포의 기능 회복은 알츠하이머병에서 신경세포의 항상성을 회복시킬 수 있다. 따라서 미세아교세포의 기능을 회복시킴으로써 신경세포를 보호하는 제제의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 알츠하이머병에 우수한 치료 효과를 갖는 저분자 화합물을 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 아세트아미노펜과 유사한 구조를 갖는 N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민(N,N′-Diacetyl-p-phenylenediamine; 이하, DAPPD) 화합물에 의한 우수한 인지적 결함 개선 효과 및 아밀로이드-베타 수준 감소를 확인하였고, 미세아교세포의 기능 이상 복구를 통한 작용 기전을 규명하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 상기 DAPPD 화합물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 조성물은 미세아교세포의 식세포작용 손상을 복구시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 미세아교세포를 매개하여 신경염증을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 뇌에서 아밀로이드-베타(Amyloid-beta) 수준을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 손상된 인지기능을 회복시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 알츠하이머병 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따르면, DAPPD 화합물은 알츠하이머병 형질전환 마우스를 이용한 실험에서 미세아교세포의 손상된 식세포작용 기능을 복구시킴으로써 아밀로이드-베타 종의 제거를 촉진하여 인지적 결함을 효과적으로 개선시키는 것을 확인하였으며, 또한 DAPPD는 매우 작고 단순한 구조로 혈관-뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 통과해 뇌로 흡수되며 독성이 거의 없다는 특성을 확인하였는바, 본 발명에 따른 DAPPD는 신경보호 제제로써 신경퇴행성 염증을 조절하여 신경퇴행성 질환, 구체적으로 알츠하이머병에 대한 유망한 치료제로써 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 DAPPD의 특성을 분석한 결과로서, 도 1a는 DAPPD의 화학적 구조 및 작용기전을 도시한 것이고, 도 1b는 DAPPD 및 아세트아미노펜(AAP) 각각을 투여한 C57BL/6 마우스의 혈장(plasma), 전체 뇌(brain) 및 뇌척수액(CSF)에서 상기 각 약물의 뇌-흡수율을 분석한 크로마토그램 및 정량적 수치 결과이며, 도 1c는 N2a 신경아세포종 세포에서 DAPPD의 처리 농도에 따른 세포독성을 MTT 어세이로 분석한 결과이다.
도 2는 알츠하이머병의 마우스 모델인 APP/PS1 마우스에서 DAPPD에 의한 효과를 분석한 in vivo 결과로서, 도 2a 및 도 2b는 야생형(WT) 및 APP/PS1 마우스에 각각 비히클 또는 DAPPD를 처리한 기간 동안 생존율(도 2a) 및 체중 변화(도 2b)를 측정한 결과이고, 도 2c는 상기 각 마우스 군에 대하여 MWM 테스트를 실시하는 동안 탈출 지연 시간(Escape-latency time) 및 이동 거리(distance traveled)를 측정한 결과 및 훈련 10일째에 헤엄친 경로를 그림으로 도시한 결과이며, 도 2d 및 도 2e는 프로브 시험에서 표적 플랫폼이 있는 사분면에 도달하는데 걸리는 시간(도 2d) 및 헤엄친 경로(도 2e)를 도시한 결과이고, 도 2f는 60초의 프로브 시험 동안 각 군의 마우스가 표적 위치에 진입한 횟수(Crossing platform), 이동 거리(distance traveled) 및 헤엄친 속도(Swim speed)를 측정하여 나타낸 결과이며, 도 2g는 비히클 또는 DAPPD를 투여한 APP/PS1 마우스의 대뇌 피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus) 조직에서 각각 티오플라빈-S(ThS) 및 6E10(항-Aβ 항체)를 통해 Aβ 플라크가 침착된 정도를 관찰하고 정량화한 결과이다.
도 3은 야생형 및 APP/PS1 마우스에 각각 비히클 또는 DAPPD를 투여하고 신경염증의 변화를 분석한 결과로서, 도 3a 및 도 3b는 각 군 마우스 뇌의 대뇌 피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus) 조직에서 각각 Iba1(도 3b) 및 GFAP(도 3b) 항체를 이용한 면역염색을 통해 활성화된 미세아교세포 및 성상세포를 관찰하고 이를 정량화한 결과이고, 도 3c 및 3d는 상기 각 군 마우스 뇌의 대뇌 피질(도 3c) 및 상기 피질에서 분리된 미세아교세포(도 3d)에서 전염증성 사이토카인(Pro-inflammatory Cytokines; Tnf-α, Il-1β, Il-6, 및 iNos) 및 항염증성 사이토카인(Anti-inflammatory Cytokines; Il-4, Tgf-β, 및 Arg1)들의 mRNA 수준을 측정한 결과이며, 도 3e는 상기 각 군 마우스 뇌의 대뇌피질에서 분리된 미세아교세포에서 MGnD 미세아교세포 유전자 및 M0-항상성 미세아교세포 유전자의 mRNA 수준을 측정한 결과이고, 도 3f 및 도 3g는 상기 각 군 마우스 뇌의 대뇌피질에서 면역염색을 통해 각각 CLEC7A(도 3f) 및 P2RY12(도 3g) 단백질의 발현을 관찰하고 이를 정량화한 결과이다.
도 4는 Aβ의 미세아교세포 식세포작용 및 NLRP3 인플라마좀 관련 단백질의 발현에 대한 DAPPD의 영향을 분석한 결과로서, 도 4a는 비히클 또는 DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스에서 미세아교세포(Iba1, 녹색)와 Aβ 응집체(6E10, 빨강)에 대한 면역염색 이미지 및 이를 정량화한 결과이고, 도 4b는 상기 각 군의 마우스 뇌에서 미세아교세포(Iba1, 빨강)의 파골리소좀(Lamp1, 파랑) 내에 존재하는 Aβ 응집체(6E10, 녹색)의 면역염색 이미지, 및 파골리소좀의 부피, Aβ-로드 파골리소좀 및 파골리소좀 내 Aβ에 의해 점유되는 미세아교세포에 대한 정량 결과이며, 도 4c는 각 군 마우스의 대뇌피질에서 Aβ로 둘러싸인 미세아교세포의 형태를 보여주는 면역염색 이미지 및 공초점 이미지 결과로부터 3차원 재구성한 정량 결과이고, 도 4d는 각 군 마우스에서 Aβ 플라크의 크기에 따른 분석 결과이다.
도 5는 DAPPD가 NLRP3 인플라마좀 관련 단백질에 미치는 영향 및 NLRP3 인플라마좀에 대한 DAPPD-매개 조절과 관련된 상위 경로를 분석한 결과로서, 도 5a 및 도 5b는 비히클 또는 DAPPD가 투여된 야생형 및 APP/PS1 마우스의 대뇌 피질에서 NLRP3 인플라마좀(도 5a), NF-κB 신호전달 및 카텝신 B(도 5b)와 관련된 단백질의 발현에 대한 DAPPD의 영향을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 6은 in vitro 알츠하이머병 환경에서 미세아교세포 기능에 대한 DAPPD, PBMA, 및 AAP의 영향을 분석한 결과로서, 도 6a 및 도 6b는 Aβ를 처리하거나 또는 처리하지 않은 인간 미세아교세포에 DAPPD, PBMA, 또는 AAP를 처리하고 웨스턴 블롯을 통해 NLRP3 인플라마좀(도 6a), NF-κB 신호전달 및 카텝신 B(도 6b)와 관련된 단백질의 발현수준을 분석한 결과이고, 도 6c는 상기 도 6a 및 6b와 동일한 군에서 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 mRNA 수준을 측정한 결과이며, 도 6d는 상기 도 6a 및 6b와 동일한 군에서 MGnD 미세아교세포 유전자 및 M0-항상성 유전자의 mRNA 수준을 측정한 결과이고, 도 6e는 상기 도 6a 및 6b와 동일한 군에서 시간에 따른 비드 섭취 분석을 실시한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 DAPPD 및 이와 유사한 구조를 갖는 아세트아미노펜을 주성분으로 하는 타이레놀 약물의 효능을 비교분석한 결과로서, 도 7a는 5xFAD 마우스(3.5개월령)에 30일 동안 2mg/kg/day로 비히클 또는 각 약물을 복강 내 투여하고 Aβ42 및 Aβ17-24 수준을 측정하여 비교한 결과이고, 도 7b는 상기 각 군의 마우스에 대하여 인지적 결함 개선 효과를 비교분석하기 위하여 MWM 테스트를 실시한 결과이다.
도 2는 알츠하이머병의 마우스 모델인 APP/PS1 마우스에서 DAPPD에 의한 효과를 분석한 in vivo 결과로서, 도 2a 및 도 2b는 야생형(WT) 및 APP/PS1 마우스에 각각 비히클 또는 DAPPD를 처리한 기간 동안 생존율(도 2a) 및 체중 변화(도 2b)를 측정한 결과이고, 도 2c는 상기 각 마우스 군에 대하여 MWM 테스트를 실시하는 동안 탈출 지연 시간(Escape-latency time) 및 이동 거리(distance traveled)를 측정한 결과 및 훈련 10일째에 헤엄친 경로를 그림으로 도시한 결과이며, 도 2d 및 도 2e는 프로브 시험에서 표적 플랫폼이 있는 사분면에 도달하는데 걸리는 시간(도 2d) 및 헤엄친 경로(도 2e)를 도시한 결과이고, 도 2f는 60초의 프로브 시험 동안 각 군의 마우스가 표적 위치에 진입한 횟수(Crossing platform), 이동 거리(distance traveled) 및 헤엄친 속도(Swim speed)를 측정하여 나타낸 결과이며, 도 2g는 비히클 또는 DAPPD를 투여한 APP/PS1 마우스의 대뇌 피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus) 조직에서 각각 티오플라빈-S(ThS) 및 6E10(항-Aβ 항체)를 통해 Aβ 플라크가 침착된 정도를 관찰하고 정량화한 결과이다.
도 3은 야생형 및 APP/PS1 마우스에 각각 비히클 또는 DAPPD를 투여하고 신경염증의 변화를 분석한 결과로서, 도 3a 및 도 3b는 각 군 마우스 뇌의 대뇌 피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus) 조직에서 각각 Iba1(도 3b) 및 GFAP(도 3b) 항체를 이용한 면역염색을 통해 활성화된 미세아교세포 및 성상세포를 관찰하고 이를 정량화한 결과이고, 도 3c 및 3d는 상기 각 군 마우스 뇌의 대뇌 피질(도 3c) 및 상기 피질에서 분리된 미세아교세포(도 3d)에서 전염증성 사이토카인(Pro-inflammatory Cytokines; Tnf-α, Il-1β, Il-6, 및 iNos) 및 항염증성 사이토카인(Anti-inflammatory Cytokines; Il-4, Tgf-β, 및 Arg1)들의 mRNA 수준을 측정한 결과이며, 도 3e는 상기 각 군 마우스 뇌의 대뇌피질에서 분리된 미세아교세포에서 MGnD 미세아교세포 유전자 및 M0-항상성 미세아교세포 유전자의 mRNA 수준을 측정한 결과이고, 도 3f 및 도 3g는 상기 각 군 마우스 뇌의 대뇌피질에서 면역염색을 통해 각각 CLEC7A(도 3f) 및 P2RY12(도 3g) 단백질의 발현을 관찰하고 이를 정량화한 결과이다.
도 4는 Aβ의 미세아교세포 식세포작용 및 NLRP3 인플라마좀 관련 단백질의 발현에 대한 DAPPD의 영향을 분석한 결과로서, 도 4a는 비히클 또는 DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스에서 미세아교세포(Iba1, 녹색)와 Aβ 응집체(6E10, 빨강)에 대한 면역염색 이미지 및 이를 정량화한 결과이고, 도 4b는 상기 각 군의 마우스 뇌에서 미세아교세포(Iba1, 빨강)의 파골리소좀(Lamp1, 파랑) 내에 존재하는 Aβ 응집체(6E10, 녹색)의 면역염색 이미지, 및 파골리소좀의 부피, Aβ-로드 파골리소좀 및 파골리소좀 내 Aβ에 의해 점유되는 미세아교세포에 대한 정량 결과이며, 도 4c는 각 군 마우스의 대뇌피질에서 Aβ로 둘러싸인 미세아교세포의 형태를 보여주는 면역염색 이미지 및 공초점 이미지 결과로부터 3차원 재구성한 정량 결과이고, 도 4d는 각 군 마우스에서 Aβ 플라크의 크기에 따른 분석 결과이다.
도 5는 DAPPD가 NLRP3 인플라마좀 관련 단백질에 미치는 영향 및 NLRP3 인플라마좀에 대한 DAPPD-매개 조절과 관련된 상위 경로를 분석한 결과로서, 도 5a 및 도 5b는 비히클 또는 DAPPD가 투여된 야생형 및 APP/PS1 마우스의 대뇌 피질에서 NLRP3 인플라마좀(도 5a), NF-κB 신호전달 및 카텝신 B(도 5b)와 관련된 단백질의 발현에 대한 DAPPD의 영향을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 6은 in vitro 알츠하이머병 환경에서 미세아교세포 기능에 대한 DAPPD, PBMA, 및 AAP의 영향을 분석한 결과로서, 도 6a 및 도 6b는 Aβ를 처리하거나 또는 처리하지 않은 인간 미세아교세포에 DAPPD, PBMA, 또는 AAP를 처리하고 웨스턴 블롯을 통해 NLRP3 인플라마좀(도 6a), NF-κB 신호전달 및 카텝신 B(도 6b)와 관련된 단백질의 발현수준을 분석한 결과이고, 도 6c는 상기 도 6a 및 6b와 동일한 군에서 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 mRNA 수준을 측정한 결과이며, 도 6d는 상기 도 6a 및 6b와 동일한 군에서 MGnD 미세아교세포 유전자 및 M0-항상성 유전자의 mRNA 수준을 측정한 결과이고, 도 6e는 상기 도 6a 및 6b와 동일한 군에서 시간에 따른 비드 섭취 분석을 실시한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 DAPPD 및 이와 유사한 구조를 갖는 아세트아미노펜을 주성분으로 하는 타이레놀 약물의 효능을 비교분석한 결과로서, 도 7a는 5xFAD 마우스(3.5개월령)에 30일 동안 2mg/kg/day로 비히클 또는 각 약물을 복강 내 투여하고 Aβ42 및 Aβ17-24 수준을 측정하여 비교한 결과이고, 도 7b는 상기 각 군의 마우스에 대하여 인지적 결함 개선 효과를 비교분석하기 위하여 MWM 테스트를 실시한 결과이다.
본 발명자들은 알츠하이머병에 대한 우수한 치료 효과를 갖는 저분자 화합물로써 N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민(N,N′-Diacetyl-p-phenylenediamine; 이하, DAPPD)을 발굴하였으며, 이의 우수한 인지적 결함 개선 효과 및 아밀로이드-베타 수준 감소를 확인하였고, 미세아교세포의 기능 이상 복구를 통한 작용 기전을 규명하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민(N,N′-Diacetyl-p-phenylenediamine; DAPPD)으로 명명되며, 파라 위치에 2개의 아세트아마이드(acetamide) 그룹만을 갖는 벤젠 고리(benzene ring)로 구성된 구조로 이루어진 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, “입체이성질체(stereoisomer)”란 동일한 화합구조를 가지고 있고 구성하는 원자 간의 결합 순서도 동일하지만 삼차원적 구조가 다른 분자를 말한다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 입체이성질체는 광학이성질체, 라세미체, 라세믹 혼합물, 단일의 이넨티오머, 부분입체이성체 혼합물 및 각각의 부분입체이성체로서 존재할 수 있다. 이러한 이성질체는 관 크로마토그래피 또는 HPLC 등의 분할에 의해 분리가 가능하다.
본 발명에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
또한 염기를 사용하여 약제학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명에서 예방, 개선 또는 치료 대상으로 하는 질환인 “알츠하이머병”은 아밀로이드-베타 및 타우 단백질과 같은 이상 단백질들이 뇌 속에 쌓이면서 뇌 신경세포가 서서히 사멸하는 퇴행성 신경질환의 하나로서, 확실한 원인이 모두 규명되지는 않았으나 몇 가지 유전자에 의한 위험 인자가 밝혀져 있다. 가장 흔하게 기억장애가 나타나고 언어장애, 일상적인 생활에서 옷입기와 같은 동작에 장애를 보이는 실행증, 시력은 정상인데 사물을 구별하지 못하는 실인증, 시공간능력장애, 판단력 장애, 우울증상 및 감정변화 등의 증상이 나타난다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 알츠하이머병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 알츠하이머병에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 알츠하이머병에 대한 효과 및 이의 작용기전을 규명하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 종래 연구결과에 근거하여 DAPPD 저분자 화합물을 항신경염증성 화합물로써 유효한 효과를 나타낼 것이라 가정하고, 생체 내에서의 효능을 평가하기 전에 대사적 안정성, BBB 투과성 및 세포독성을 분석한 결과, DAPPD 화합물은 체내에서 화학적으로 변형되지 않아 대사적 안정성이 높고, BBB를 투과하여 뇌로 흡수되며 신경아세포종 세포에서 500μM 이하의 농도에서는 유의미한 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 알츠하이머병 마우스 모델을 이용해 DAPPD에 의한 효과를 검증한 결과, 행동 연구를 통해 DAPPD가 인지기능 손상을 개선시키는 우수한 효과가 있음을 확인하였고, 상기 마우스 모델의 뇌조직 분석을 통해 아밀로이드-베타의 응집체의 수준이 현저히 감소된 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, DAPPD가 투여된 마우스 모델에서 신경염증이 감소되는 것을 확인하였고(실시예 4 참조), DAPPD가 미세아교세포에서 기능적인 표현형을 조절하여 아밀로이드-베타에 의해 유도되는 신경염증을 완화시키는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 알츠하이머병 마우스 모델을 이용해 DAPPD가 신경염증 조건에서 미세아교세포의 식세포작용 결함을 회복시켜 아밀로이드-베타의 분해를 촉진시키는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, Aβ에 의해 유도되는 신경염증과 NLRP3 인플라마좀 간에 상관관계가 있다는 종래 연구 결과에 근거하여, DAPPD에 의한 항염증 효과가 NLRP3 인플라마좀 형성 조절과 관련이 있는지 분석한 결과 DAPPD에 의해 NLRP3 및 ASC의 발현이 저해되고 결과적으로 caspase-1 및 IL-1β의 활성이 감소되는 것을 확인하였으며, DAPPD에 의한 NLRP3 인플라마좀 저해는 상위의 NF-κB 경로 억제를 통해 야기되는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인간 미세아교세포를 이용하여 in vitro 알츠하이머병 환경에서 DAPPD에 의한 미세아교세포 기능 이상 개선효과를 분석한 결과, DAPPD에 의해 NF-κB 경로가 저해되고 이에 따라 NLRP3 인플라마좀 형성이 하향 조절되는 것을 확인하였고, 미세아교세포에서 아밀로이드-베타에 의해 변화되는 염증성 사이토카인의 발현 변화가 DAPPD에 의해 복구되는 것을 확인하였다. 나아가 FITC 비드를 이용한 식세포작용 분석 실험을 통해 DAPPD가 아밀로이드-베타에 의해 유발되는 미세아교세포의 기능 이상을 복구시키는 것을 확인하였다(실시예 8 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, DAPPD와 유사한 구조의 아세트아미노펜을 주성분으로 포함하는 타이레놀 약물과 DAPPD의 독성 및 효능을 비교분석한 결과, 타이레놀에 비하여 DAPPD의 LD50 농도가 더 높아 더욱 높은 농도에서도 안전한 것을 확인하였고, 타이레놀에 비하여 DAPPD가 아밀로이드-베타 수준 감소 및 인지기능 손상 개선 효과가 더욱 우수한 것을 확인하였다(실시예 10 참조).
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.001 내지 150㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미하며, 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “식품 조성물”은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 첨가 할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다. 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 다른 조성물은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토오스, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐키롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피로리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험재료 및 실험방법
1-1. 세포 생존능 분석
마우스의 신경아세포종 Neuro-2a(N2a) 세포주(ATCC)는 DMEM(GIBCO, NY, Grand Island, NY)과 opti-MEM(GIBCO)을 1:1로 혼합한 배지에 5%(v/v) 소태아혈청(FBS; SigmaAldrich, MO, St. Louis, MO) 및 100U/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토 마이신(GIBCO)을 첨가하여 5% CO2 및 37℃ 조건에서 배양하였다.
한편, DAPPD 처리에 따른 세포 생존능은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 통해 분석하였다. 보다 구체적으로, 세포를 96-웰 플레이트(웰 당 100 ㎕ 배지에 10,000개 세포)에 분주한 다음, DAPPD를 다양한 농도(10, 50, 100, 200 및 500 μM; 1% v/v 최종 DMSO 농도)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, MTT[25㎕; PBS(pH 7.4) 중 5mg/mL] 용액을 세포가 분주된 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 세포에 의해 생성된 포르마잔(Formazan)을 N, N-디메틸포름아마이드(DMF; 50% v/v, aq) 및 소듐 도데실 설페이트(SDS; 20% w/v)의 산성 용액을 이용하여 밤새 암실에서 실온 조건으로 반응시켜 가용화되도록 하였다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 이용해 600nm에서 흡광도를 측정하였으며, 동등한 양의 DMSO를 함유하는 세포에 대하여 세포 생존능을 측정하였다.
1-2.
In vivo
실험 설계
형질전환 알츠하이머병(AD) 마우스를 이용하여 항염증 효과를 통한 DAPPD의 신경보호 기능을 조사하고자 하였다.
1-2-1. APP/PS1 마우스 모델에서의 약물 처리 및 결과 분석
인간 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP) 695[K670N/M671L(스웨덴)] 및 프레세닐린-1(presenilin-1; PS1)(M146V) 돌연변이를 과발현하는 형질전환 APP/PS1 마우스는 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline, Harlow, UK)에서 제작된 것이다. APP/PS1 마우스는 질병 진행에서 성별에 따른 차이를 나타내기 때문에 수컷 마우스만을 사용하였다. 데이터 분석은 9.5개월령에 실시하였고, 연령 및 성별을 매칭시킨 C57BL/6 마우스를 야생형(WT) 마우스로 사용하였다. 상기 마우스들을 실험군에 분배하기 위해 블록 무작위화 방법을 사용하였으며, 편견을 없애기 위해 데이터 수집 및 데이터 분석과 같은 실험 과정은 블라인드 테스트로 진행하였다. 12시간 낮/밤 주기로 물과 사료를 자유롭게 공급하였으며, 모든 프로토콜은 경북대학교 실험동물운영위원회(IACUC)의 승인을 받은 후 진행하였다. DAPPD는 비히클(vehicle)[식염수 중 85% DMSO]에 용해시켜 투여 직전에 새로 제조하였고, 7.5개월령부터 시작하여 2mg/kg의 용량으로 2개월 동안 매일 아침에 복강 내 투여하였다.
이후, 상기 DAPPD를 투여한 마우스에 대하여 모리스 수중 미로(MWM) 테스트를 통해 공간 학습 및 기억 능력을 평가하기 위한 행동 연구를 수행하였다. 상기 마우스들이 미리 학습할 수 있도록 10일 동안 하루에 4번의 테스트를 실시하였고, 11일째에 플랫폼을 제거한 프로브 시험을 진행하였다.
한편, 조직학적 분석을 위해, 마취시킨 마우스에 대하여 PBS로 심혈관류로 관류하여 뇌 순환을 통해 잔류 혈액을 씻어낸 다음, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde; PFA)를 추가로 관류시켰다. 이어서 뇌를 적출하고 4℃에서 밤새 4% PFA로 고정시킨 후, 뇌 조직을 비브라톰(vibratome)을 사용하여 30㎛의 두께로 관상면으로 절단하여 절편을 얻었다. 이후 상기 조직 절편에 대하여 티오플라빈-S(Thioflavin-S; ThS) 염색을 실시하였고, 또한 6E10(마우스, 1:100, SIG39300; Biolegend, CA, USA), Iba1(토끼, 1:500, 019-19941; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan), GFAP(토끼, 1:500, N1506; Dako, CA, USA), Clec7a(rat, 1:100, MABG-MDECT; Invivogen, CA, USA), P2ry12(토끼, 1:100, ab188968; Abcam, Cambridge, UK), Lamp1(랫트, 1:100, ab25245; Abcam, Cambridge, UK) 및 Lamp1(마우스, 1:200, ab24170; Abcam, Cambridge, UK) 항체를 이용하여 조직학적 분석을 위한 면역염색을 실시하였다. 결과 분석은 레이저스캐닝 공초점 현미경(FV1000; Olympus, Tokyo, Japan) 또는 BX51 현미경(Olympus)으로 진행하였고, MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용해 값을 정량화하였다. 또한 미세아교세포의 3차원 재구성을 기록하고 IMARIS 소프트웨어(Bitplane, Belfast, UK)를 사용하여 분석하였다.
1-2-2. 5×FAD 마우스 모델에서의 약물 처리 및 결과 분석
본 발명자들은 또 다른 알츠하이머병 동물 모델로써 돌연변이 인간 APP695[K670N/M671L(스웨덴), I716V(플로리다), 및 V717I(런던)] 및 PS1(M146L 및 L286V)을 과발현하는 형질전환 5×FAD 마우스를 이용하였다. 12시간 낮/밤 주기로 물과 사료를 자유롭게 공급하였으며, 아산생명과학연구원의 실험동물운영위원회의 승인을 받은 후 실험을 진행하였다. DAPPD를 비히클(vehicle)[1% DMSO v/v; 20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl]에 용해시켜 투여 직전에 새로 제조하였고, 3개월령부터 시작하여 2mg/kg의 용량으로 30일 동안 매일 아침에 복강 내 투여하였다.
상기 DAPPD를 투여한 마우스 모델에서 투여 27일째부터 모리스 수중 미로(MWM) 테스트를 통해 공간 학습 및 기억 능력을 평가하고자 하였다. 이를 위해 5일 동안 하루에 3번 테스트를 실시하였으며, 마지막 시험 후 3시간이 지난 다음 플랫폼 없이 MWM에서 60초 동안 프로브 시험을 진행하였다. 시험 변수는 SMART 비디오 추적 시스템(Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA) 상에서 수집 및 분석되었다.
한편, 아밀로이드-베타(Amyloid-beta; 이하, Aβ) 플라크의 침착은 인간 Aβ17-24 특이적 항체 4G8(Covance, Princeton, NJ, USA) 및 Accustain® Congo Red 아밀로이드 염색 용액을 사용하여 각각 면역조직화학염색을 실시한 후 좌반구의 시상면(12μm 두께)에서 평가하였다. 이후 염색된 부분을 광학 현미경(Eclipse 80i; Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰 및 촬영하였다. 아밀로이드 침착물은 4G8-면역 반응성 침착 물의 백분율 면적 또는 뇌 영역의 mm2 당 congophilic 플라크의 수로 나타내었다.
또한, Aβ의 정량화를 위해 우측 뇌반구의 연속적인 원심분리 분획 후에 PBS-, SDS-, 또는 포름산-가용성 분획에서 Aβ40, Aβ42(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 올리고머 Aβ를 샌드위치 ELISA로 측정하였다.
1-3. 세포 배양
E18 C57BL/6 마우스의 피질을 적출하고 37℃에서 15분 동안 파파인(papain)에서 배양하여 해리시켰다. 뉴런을 2% v/v B27 보충제(GIBCO), 1mM 글루타맥스 보충제(GIBCO) 및 100U/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토마이신이 함유된 무혈청 Neurobasal 배지(GIBCO)인 신경세포 배양배지와 함께 폴리-L-라이신이 코팅된 커버슬립 상에 플레이팅하고 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
1차 성상세포 배양물은 C57BL/6 마우스로부터 제조하였다. 간략하게, 출생 후 7일된(P7) 마우스에서 수막을 제거한 후 뇌 조직을 다지고 0.25% v/v 트립신-EDTA(Sigma-Aldrich)의 존재하에 30분 동안 37℃의 교반 수조에서 배양하였다. 효소분해를 통해 해리된 세포를 성상세포-특이적 배지(10% v/v FBS, 0.2 및 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12) 하에서 분쇄하고 1,300rpm에서 8분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 DMEM/F12에 재현탁시키고 40-μm 세포 여과기를 이용해 여과한 다음, 세포 여과액을 배양접시에 분주하기 전에 섬유아세포로부터 임의의 오염물을 제거하기 위해 30분 동안 미리 부착되도록 하고 성상세포-특이적 배지를 첨가하였다. 성상세포의 분열을 위해, 배양접시에 Ara-C를 첨가하고 6 내지 7시간 동안 가열 진탕기에 두었다. 이후 배양접시에서 배지를 제거하고, 트립신-EDTA를 첨가하고 37℃에서 5-10분 동안 배양한 다음 1,300 rpm에서 8분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 성상세포는 성상세포-특이적 배지를 1-2주마다 공급하여 배양을 유지하였다.
또한, 하기와 같은 과정에 따라 마우스 뇌로부터 일차 미세아교세포를 분리하였다. 야생형(1개월령) 마우스의 피질을 Hibernate A(GIBCO)/B27(Invitrogen) 배지에서 다진 다음 파파인(Worthington Biochemical Corporation, NJ, USA) 용액을 이용하여 해리시켰다. 이후 조직을 분쇄하고, Optiprep(Sigma-Aldrich) 밀도 구배 원심분리를 통해 세포를 분리하였다. 분획된 미세아교세포는 10% v/v FBS, 0.2 및 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12에서 배양하거나 염증성 사이토카인 또는 미세아교세포 유전자의 발현수준 분석에 이용하였다. 본 발명자들은 각 개시된 방법에 따라 마우스의 뇌에서 일차세포를 성공적으로 분리하였다. 또한 불멸화된 인간 미세아교세포(Applied Biologics Materials, T0251)를 PriGrow Ⅲ(Applied Biologics Materials, TM003)(10% v/v FBS 및 1% v/v 페니실린/스트렙토마이신 보충)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
1-4. 웨스턴 블롯팅
뇌 샘플 또는 인간 미세아교세포를 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology, MA, USA)에 용해시킨 후 소듐 도데실 설페이트 폴리 아크릴아마이드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 수행한 다음 니트로셀룰로스 멤브레인으로 분리된 단백질들을 이동시켰다. 다음으로, 상기 멤브레인에 5% 밀크를 첨가하여 비특이적인 반응을 차단하고, 1차 항체와 함께 반응시킨 다음 홀스레디쉬 퍼옥시다제가 접합된 2차 항체와 함께 배양하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체는 다음과 같다: NLRP3(토끼, 1:1,000; 15101, Cell Signaling Technology), ASC(토끼, 1:1,000; 67824, Cell Signaling Technology), Caspase-1(마우스, 1:1,000; AG-20B-0042, Adipogen Life Sciences, CA, USA), IL-1β(마우스, 1:1000; 12242, Cell Signaling Technology), pNF-κB p50(토끼, 1:1,000, 13586; Cell Signaling Technology), pNF-κB p65(토끼, 1:1,000, 3033; Cell Signaling Technology), pIκB(토끼, 1:1,000, 9246; Cell Signaling Technology), Cathepsin B(토끼, 1:1,000, 31718; Cell Signaling Technology), COX-1(마우스, 1:500, ab695; Abcam, Cambridge, UK), COX-2(토끼, 1:500, ab15191; Abcam, Cambridge, UK), 및 β-actin(1:1,000; SC-47778, Santa Cruz Biotechnology, TX, USA). 토끼-HRP(1:1,000; 7074s, Cell Signaling Technology) 및 마우스-HRP(1:1,000; sc2005, Santa Cruz Biotechnology)는 2차 항체로 이용하였다. 이후 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 단백질 발현수준을 정량화하였다.
1-5. RNA 분리 및 Real-time PCR 분석
뇌조직 균질액 및 세포 용해물에서 RNeasy Lipid Tissue Mini kit 및 RNeasy Plus Mini kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용해 RNA를 추출하였다. 이후 상기에서 추출된 RNA 5㎍에 대하여 상업적으로 이용 가능한 키트(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 정량적 실시간 PCR은 Corbett research RG-6000 실시간 PCR 기기를 이용해 수행하였다.
실시예 2. DAPPD의 특성 분석
본 발명자들은 알츠하이머병 치료를 위한 저분자 화합물로 선정한 DAPPD 화합물이 경증 항신경염증 활성을 나타내는 해열제 및 진통제인 아세트아미노펜(Acetaminophen; AAP)과 구조적으로 유사함에 근거하여, DAPPD의 항신경염증 효과를 조사하고자 하였다. DAPPD의 작고 대칭적인 구조는 친유성을 포함하여 합성의 용이성과 이상적인 특성을 나타내며, 이는 분자에 혈관-뇌 장벽(blood-brain barrier; BBB)을 침투하는 능력을 부여한다. DAPPD의 화학적 구조는 도 1에 도시된 바와 같으며, 페닐아세트아마이드(phenylacetamide)와 추가적인 아세트아마이드(acetamide) 부분으로 구성되어 있다. DAPPD의 페닐아세트아마이드 구조는 AAP에서 찾을 수 있으며, DAPPD에 존재하는 추가적인 아세트아마이드 작용기는 생리학적으로 관련된 조건 하에서 개선된 효소적 및 대사적 안정성을 나타낼 수 있다. 종합적으로 DAPPD는 생체 내 항신경염증성 화합물로써 이상적인 후보물질일 수 있다고 판단하였다.
본 발명자들은 생체 내에서 DAPPD 화합물의 효능을 조사하기 전에, DAPPD의 생물학적 적용 가능성을 평가하기 위해 대사적 안정성, BBB 투과성 및 세포독성 등을 먼저 분석하고자 하였다. 먼저, 상기 화합물의 1) 혈장 내 안정성 및 2) 혈장 단백질에 결합하는 능력을 평가하기 위해, DAPPD를 인간 혈장에서 120분 동안 배양한 결과 상기 화합물의 97%가 남아있는 것을 확인하였으며, 이를 통해 DAPPD는 혈장 내 안정성이 현저히 높은 것을 알 수 있었다. 두 번째로, DAPPD는 혈장 단백질에 대하여 현저히 낮은 결합력을 나타냈다(0% 결합, 덱사메타손 및 와파린에 대해서는 각각 69% 및 99% 결합). 이러한 결과는 DAPPD가 혈장에서 안정하며, 투여 시 비교적 잘 분포된다는 것을 시사한다.
다음으로, DAPPD가 화학적 변형에 의해 AAP로 변화될 가능성을 검증하기 위하여, 생체 내에서 DAPPD의 대사적 안정성을 평가하였다. 보다 구체적으로, DAPPD의 뇌 접근성 및 대사를 검증하기 위해, 상기 화합물을 C57BL/6 마우스에 복강 내 투여(10mg/kg)한 다음, 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 실시하였다. 그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 화합물 처리 후 혈장(Plasma), 뇌(Brain) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid; CSF)에서 DAPPD가 검출되었으며, 반면에 AAP는 검출되지 않은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 DAPPD가 생체 내에서 AAP로 대사되지 않고 BBB를 통과할 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 생체 내로 DAPPD(10mg/kg)를 경구 투여한 경우에도 뇌로 흡수되는 것을 확인하였다.
한편, 인간 간 마이크로솜(microsomes)을 이용한 DAPPD의 in vitro 대사 연구를 실시하였다. 그 결과 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 DAPPD는 중간 정도의 대사적 안정성(반감기 [t1/2] > 60분; 고유 제거율 [Clint] = 3.9)을 갖는 것을 알 수 있었다.
| t 1/2 e | Cl int f | |
| DAPPD | > 60 | 3.9 |
|
Verapamil
(Reference) |
9.7 | 155 |
또한 CEREP Safety-screen44 패널을 통해 전통적인 약리학적 표적들에 대한 DAPPD의 선택성 프로파일링을 수행하였다. 스크리닝 결과, DAPPD는 시험한 44개의 표적에 대해 주목할만한 활성(>50% 억제)을 갖지 않는 것으로 나타났다. 마지막으로, DAPPD를 마우스 신경아세포종 세포인 Neuro-2a(N2a)에 다양한 농도(10, 50, 100, 200, 500uM)로 처리한 다음 세포 생존능을 분석하였다. 그 결과 도 1c에서 볼 수 있는 바와 같이 500μM 이하의 농도에서 유의미한 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
종합적으로, 상기 결과들을 통해 DAPPD는 생체 내 신경보호 활성 평가에 적합한 것으로 판단하였다.
실시예 3. 알츠하이머병 마우스 모델에서 DAPPD 처리에 의한 인지기능 손상 개선 및 Aβ 축적의 감소 확인
3-1. 인지기능 손상 개선효과 확인
먼저, 야생형(WT) 및 APP/PS1 마우스(7.5개월령)에 2개월 동안 DAPPD 또는 비히클(vehicle)을 2mg/kg/day로 복강 내(i.p.) 투여하였다. 투여 후 30일째에, 비히클 또는 DAPPD가 투여된 각 마우스의 공간 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 모리스 수중 미로(Morris Water Maze; MWM) 테스트를 실시하였다. 그 결과 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, DAPPD의 투여기간 동안 야생형 및 APP/PS1 마우스 모두 생존율 및 체중의 변화가 없는 것을 통해 DAPPD 투여가 마우스의 생존 및 체중에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 나아가 MWM 테스트 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 비히클이 처리된 APP/PS1 마우스(Vehicle (APP/PS1))의 경우 비히클 및 DAPPD가 처리된 야생형 마우스에 비해 현저하게 더 긴 탈출 지연(Escape Latency)을 나타내었고 플랫폼까지 더 먼 거리로 이동(Distance Traveled)하는 것을 확인하였다. 이에 반해 DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스(DAPPD (APP/PS1))의 경우에는 초기 시점에서 탈출 플랫폼을 찾았으며 야생형 마우스와 유사한 방식으로 플랫폼까지 더 짧은 거리를 이동하는 것으로 나타났다. 상기와 같은 탈출 지연 및 이동 거리에서의 차이는 특히 훈련 5일 및 7일째에 두드러지게 나타났으며, 이때 비히클 및 DAPPD가 각각 투여된 APP/PS1 마우스의 탈출 지연 시간은 대략 2배 정도 차이가 나는 것을 확인하였다. 또한, 도 2d 내지 도 2f에서 볼 수 있는 바와 같이 10일 동안의 훈련 후에 수행된 프로브 시험에서, DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스는 비 표적 사분면보다 표적 사분면에 더 오랜 시간 동안 머물렀고 비히클을 투여한 APP/PS1 마우스에 비해 표적 위치를 더 빈번하게 횡단한 것으로 나타났다. 흥미롭게도, DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스는 야생형 마우스와 유사한 결과를 보여 주었고, 프로브 시험에서 비히클 또는 DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스 간에 마우스의 이동 거리 및 수영 속도에 현저한 차이가 없는 것을 통해 DAPPD가 APP/PS1 마우스의 운동 능력에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 나아가 본 발명자들은 상기 결과들에 더하여 5xFAD 마우스 모델을 이용하여 AD 형질전환 마우스에서 DAPPD가 인지기능을 회복시키는 효과가 있음을 추가적으로 확인하였다.
상기 결과들을 통해 DAPPD가 알츠하이머병 마우스 모델에서 손상된 인지기능을 효과적으로 개선시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
3-2. Aβ 축적 감소효과 확인
나아가 본 발명자들은 DAPPD가 AD의 인지 장애와 관련된 Aβ 응집체 축적에 영향을 미치는지 여부를 검증하기 위해, DAPPD를 투여하고 2개월 동안 APP/PS1 마우스의 해마(Hippocampus) 및 대뇌 피질(Cortex)에서 Aβ 응집체의 축적을 모니터링하였다. 각각 티오플라빈-S(thioflavin-S; ThS) 및 6E10(항-Aβ 항체)를 통해 Aβ 플라크의 침착을 관찰한 결과, 도 2g에 나타낸 바와 같이 비히클이 투여된 APP/PS1 마우스에 비하여 DAPPD가 투여된 마우스에서 각각 Aβ 응집체의 축적이 6배 및 2배 감소된 것을 확인하였다. 또한 5xFAD AD 형질전환 마우스 모델을 이용하여 분석한 결과, DAPPD가 투여된 5xFAD 마우스의 뇌에서 4G8-면역반응성 아밀로이드 플라크의 백분율 면적이 비히클이 투여된 마우스에 비해 대략 40% 감소된 것을 확인하였다. 더욱이, Aβ40의 총, 가용성 및 불용성 수준은 각각 약 40, 20 및 50% 감소된 것으로 나타났으며(Aβ42는 각각 약 30, 35 및 20% 감소가 관찰됨), 독성 Aβ 종으로 인식되는 가용성 올리고머 Aβ의 수준은 30% 감소하였고, congophilic 아밀로이드 플라크의 양 또한 10% 완화되었다. 종합적으로, 2종의 AD 형질전환 마우스 모델을 이용한 상기 실험결과들은 DAPPD가 인지적 결함을 유의하게 회복시키고 Aβ 종의 축적을 감소시킨다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 4. 알츠하이머병 마우스 모델에서 DAPPD 투여에 의한 신경염증 감소 확인
본 발명자들은 DAPPD에 의한 Aβ 종의 축적 감소가 항염증 효과에 의한 것인지 여부를 조사하기 위하여, 비히클 또는 DAPPD를 투여한 야생형 및 APP/PS1 마우스의 대뇌피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus)에서 염증반응에 관여하는 주요 상주 면역세포인 미세아교세포 및 성상세포를 항-Iba1 및 항-GFAP 항체를 각각 사용하여 조직학적으로 모니터링 하였다(2mg/kg/day, i.p.; 2개월; 7.5개월령). 그 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 마우스에서 만성 신경염증에 의해 증가된 미세아교세포의 활성이 DAPPD 투여에 의해 감소된 것으로 나타났다. 구체적으로 대뇌피질 및 해마 부위 모두에서 비히클이 투여된 APP/PS1 마우스와 비교하여 DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스에서 미세아교세포의 활성이 대략 50% 감소되었으며, 성상세포의 활성은 대략 30% 정도 감소된 것을 확인하였다. 또한, 도 3c에서 볼 수 있는 바와 같이 비히클이 투여된 마우스의 대뇌피질에서 전염증성 사이토카인(Tnf-α, Il-1β, Il-6 및 iNos) 및 면역 조절 사이토카인(Il-10)의 발현이 증가하였으나 DAPPD 투여에 의해 야생형 마우스와 유사한 수준으로 감소된 것을 확인하였다. 한편, 비히클이 투여된 APP/PS1 마우스에서 하향 조절된 항염증성 마커(Il-4, Tgf-β 및 Arg1)의 수준은 DAPPD가 투여된 군에서 증가한 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과들을 통해 DAPPD가 신경염증 조건하에서 미세아교세포 및 성상세포의 만성적인 활성화를 저해할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 미세아교세포에서 DAPPD에 의한 항신경염증 효과 확인
뇌에서는 다양한 종류의 세포가 염증 과정에 관여한다. 면역반응에서, 세포로부터 방출된 신호전달 분자(예컨대, 사이토카인)는 세포간 소통 및 염증 과정을 조절하는 역할을 한다. 이에 본 발명자들은 뇌에서 DAPPD의 항염증 활성을 유도하는 세포를 알아보기 위해, 3가지 유형의 1차 마우스 뇌세포 즉, 미세아교세포, 성상세포 및 뉴런을 배양하였다. 이후 배양된 세포에 대하여 먼저 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H 테트라 졸리움(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium; WST-1) 및 TUNEL 분석을 통해 이들 세포에 대한 DAPPD의 독성을 조사하였다. 그 결과, DAPPD는 상기 3종의 세포들에 대하여 특별한 세포 독성을 유발하거나 아폽토시스를 유도하지 않는 것을 확인하였다.
다음으로, in vitro 수준에서 상기 세포들에 DAPPD를 처리 또는 미처리한 조건에서 Aβ에 의해 유도되는 염증성 마커의 발현변화를 조사하고자 하였다. 이를 위해, 상기 3가지 유형의 세포로부터 다양한 신호전달 매개인자들이 분비된 혼합물을 함유하는 조건 배지(CM)를 수집하여 성상세포(미세아교세포 유래 CM) 또는 미세아교세포(성상세포 또는 뉴런 유래 CM)에 처리하였다. 그 결과 Aβ42의 존재하에 미세아교세포의 경우 전염증성 마커(Tnf-α, Il-1β, Il-6 및 iNos) 및 면역 조절 사이토카인(Il-10) 발현수준이 증가된 것으로 나타났고, 뿐만 아니라 Aβ42와 배양하지 않은 미세아교세포 대조군에 비해 항염증성 마커(Il-4, Tgf-β 및 Arg1)의 수준이 감소된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 미세아교세포에 DAPPD 및 Aβ42의 동시에 처리함으로써 대조군과 유사한 수준으로 염증성 마커의 발현이 복구되는 것을 확인하였으며, 이는 DAPPD가 미세아교세포에서 Aβ-매개 염증반응을 완화시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
성상세포의 경우, Aβ가 처리된 미세아교세포 유래 조건배지에서 염증성 마커의 발현의 변화를 확인함으로써 성상세포에서 염증반응을 유발하는 것을 알 수 있었으며, DAPPD가 처리된 미세아교세포 유래 조건배지에서 배양된 성상세포는 대조군으로부터 얻어진 조건배지에서 배양된 성상세포와 유사한 수준으로 염증성 마커를 발현시키는 것을 확인하였다. 대조적으로, 성상세포에서는 DAPPD의 직접적인 처리가 Aβ에 의해 유발되는 염증반응을 완화시키지 않는 것으로 나타났다. Aβ42 및 DAPPD를 함께 처리하여 배양한 성상세포로부터 얻어진 조건배지는 미세아교세포에서 염증반응을 유도하였고, 이는 DAPPD가 미세아교세포에서 염증성 신호전달의 성상세포-매개 조절을 전환시킬 수 없음을 시사한다. 또한, DAPPD는 미세아교세포의 휴지 상태를 유지하는 뉴런 "오프" 신호(즉, Bdnf, Cd47 및 Cd200) 및 미세아교세포의 활성화를 유도하는 대부분의 "온" 신호 (즉, Cxcl10 및 Ccl21)의 발현에서 Aβ에 의해 유도된 변화를 저해할 수 없는 것을 알 수 있었다. 더욱이, Aβ가 처리된 뉴런 유래 조건배지와 유사하게, DAPPD가 처리된 뉴런 유래 조건배지는 미세아교세포에서 염증반응을 유발하였다. 종합적으로, 이러한 결과들은 본 연구에서 시험된 3가지 유형의 세포 중에서 DAPPD가 미세아교세포에서 Aβ에 의해 유도된 염증반응을 직접적으로 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
나아가 미세아교세포 특이적 염증성 사이토카인의 변화를 확인하기 위해, 본 발명자들은 비히클 또는 DAPPD를 투여한 야생형 및 APP/PS1 마우스의 피질로부터 분리된 미세아교세포에서 전염증성 및 항염증성 사이토카인의 발현을 분석하였다. 그 결과 도 3d에 나타낸 바와 같이 상기 도 3c의 대뇌피질의 조직학적 분석 결과와 일치하는 것을 확인하였다. 따라서 상기 결과들을 통해 DAPPD의 항염증 효과는 염증성 신호전달의 전파를 담당하는 미세아교세포에 의한 직접적인 영향에서 기인하는 것임을 알 수 있었다.
한편, 미세아교세포는 건강한 뇌에서 P2ry12, Tmem119, Tgfßr1 및 Sall1과 같은 M0-항상성 미세아교세포 유전자를 발현하는 항상성 기능성 시그니처를 제시한다. 신경변성 과정에서 미세아교세포는 항상성 분자 시그니처를 잃고 Clec7a, Trem2, Apoe 및 Gpnmb(MGnD 미세아교세포 유전자)를 포함한 염증성 분자를 상향 조절하여 질병 관련 표현형을 나타낸다고 보고되어 있다. 이러한 연구결과에 기초하여, 본 발명자들은 비히클 또는 DAPPD를 투여한 야생형 또는 APP/PS1 마우스에서 M0-항상성 유전자 및 MGnD 미세아교세포 유전자의 mRNA 수준을 조사하였다. 그 결과, 도 3e에 나타낸 바와 같이 비히클이 투여된 야생형 마우스에 비해 비히클이 투여된 APP/PS1 마우스의 피질 유래 미세아교세포에서 Clec7a, Trem2, Apoe 및 Gpnmb의 수준이 상향 조절되는 것으로 나타났다. 그러나 DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스에서는 상기 유전자들읜 발현이 유의하게 감소된 것을 확인하였다. 또한, 야생형 마우스에 비해 APP/PS1 마우스에서 M0-항상성 미세아교세포 유전자의 발현이 감소된 것으로 나타났으나, DAPPD의 처리에 의해 유의하게 증가된 것을 확인하였다.
이에 더하여, 면역형광 실험을 통해 APP/PS1 마우스에서 각각 상향 조절 및 하향 조절된 CLEC7A 및 P2RY12A의 단백질 수준을 분석한 결과, 도 3f 및 도 3g에서 볼 수 있는 바와 같이 비히클이 투여된 APP/PS1 마우스와 비교하여 DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스에서 상기 CLEC7A 및 P2RY12A 단백질의 발현이 각각 현저히 감소 및 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 APP/PS1 마우스에서 DAPPD가 미세아교세포의 기능적인 표현형을 조절하여 신경염증을 약화시키는 것을 보여주는 것이다.
실시예 6. 만성 신경염증에서 DAPPD에 의한 미세아교세포의 식세포작용 촉진 확인
미세아교세포의 식세포작용 능력은 Aβ와 같은 외부 자극에 대한 염증반응의 중요한 측면을 제시하며, 외부 자극의 지속적인 존재는 미세아교세포 만성적인 활성화를 유도할 수 있다. 본 발명자들은 상기 실시예 결과들을 통해 DAPPD의 항염증 활성이 미세아교세포에서 유래한다는 것을 확인하였는바, AD 관련 병리학적 조건하에서 DAPPD가 미세아교세포의 식세포작용 결함에 영향을 미치는지 여부를 알아보기 위해 공초점 현미경을 사용하여 생체 내에서 분석하였으며, 3차원 재구성을 통한 중첩 형광 영역의 부피 정량은 미세아교세포의 식세포 과정의 수치적 표현을 부여하였다.
구체적으로, 비히클 또는 DAPPD를 투여한 APP/PS1 마우스(2mg/kg/day, i.p.; 2개월; 7.5개월령)의 뇌조직 절편을 항-Iba1(미세아교세포) 및 6E10(Aβ 응집체) 항체로 공동 면역염색하여 관찰한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 Aβ-연관 미세아교세포의 이동이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 미세아교세포의 식세포작용의 기능을 보다 면밀히 조사하기 위해, 미세아교세포의 리소좀에서 발현되는 막단백질인 Lamp1을 Iba1+/6E10+ 아밀로이드 플라크와 함께 모니터링하였다. 그 결과, 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이 3개 형광 이미지의 중첩 영역을 통해 비히클이 투여된 APP/PS1 마우스와 비교하여 DAPPD이 투여된 APP/PS1 마우스에서 미세아교세포의 파골리소좀의 부피, Aβ-로드 파골리소좀 및 파골리소좀 내 Aβ에 의해 점유되는 미세아교세포가 각각 대략 2.8-, 1.3- 및 2.3배 증가한 것으로 나타났다.
또한, 미세아교세포의 기능과 밀접한 관련이 있는 미세아교세포의 형태를 분석하여 미세아교세포의 식세포작용 기능에 대한 DAPPD의 효과를 분석하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스에서 Aβ-관련 미세아교세포가 아메바 모양의 형태인 것이 관찰되었으며, 이는 DAPPD가 Aβ에 대한 미세아교세포의 식세포작용을 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다. 상기 형태학적 변수를 정량화한 결과 DAPPD와 배양한 미세아교세포가 식세포작용 상태를 위해 형태가 변화된 것을 확인했다. 구체적으로 DAPPD 처리에 의해 미세아교세포의 체적(volume), 수상돌기 길이(Dendrite Length)뿐만 아니라 세그먼트(segments), 말단점(Terminal point) 및 분지점(Branch point)의 수를 감소시키고 세포체 크기(Cell body size)가 증가된 것을 확인하였다.
마지막으로, DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스와 비히클이 투여된 APP/PS1 마우스에서 Aβ 응집체의 크기를 비교하였다. 그 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이 비히클이 투여된 경우에 비해 DAPPD가 투여된 경우 작은 Aβ 종(< 25μm)의 양은 증가된 반면에 더 큰 Aβ 응집체 (25-50μm, > 50μm)의 양은 감소된 것을 확인하였다. 따라서 상기 결과를 통해 DAPPD 처리에 의해 향상된 미세아교세포의 식세포작용은 더 큰 Aβ 종의 분해를 증가시키는 것으로 유추할 수 있다.
결론적으로, 상기와 같은 DAPPD 처리에 의한 미세아교세포 내 Aβ 플라크 및 라이소좀의 공존 증가, 미세아교세포 형태의 변화, 및 Aβ 응집체의 크기 변화 결과들은 DAPPD가 APP/PS1 마우스에서 미세아교세포의 식세포작용 결함을 회복시킬 수 있음을 입증하는 것이다.
실시예 7. DAPPD 매개 NF-κB 경로의 억제를 통한 NLRP3 인플라마좀 단백질의 하향 조절 확인
NLRP3 인플라마좀(inflammasome)은 NLRP3, ASC(CARD를 함유하는 아폽토시스 관련 스펙-유사 단백질(apoptosis-associated speck-like protein)) 및 프로카스파제-1(procaspase-1)으로 구성된 신호 전달 매개인자이다. 활성화된 NLRP3 인플라마좀은 caspase-1을 생성하기 위해 procaspase-1을 절단하는 역할을 하며, 이후 대표적인 전염증성 사이토카인인 IL-1β의 성숙을 촉진한다. 최근의 연구에 따르면 NLRP3 인플라마좀과 Aβ에 의해 유도되는 염증간에 상관관계가 있음이 보고되었으며, 또한 미세아교세포에서 NLRP3의 발현은 AD 형질전환 마우스에서 뇌 Aβ 침착 및 인지기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이에 미세아교세포에서 NLRP3 인플라마좀 형성을 조절하는 것이 AD에서 신경염증을 감소시키는 유망한 전략으로 주목받고 있다.
DAPPD의 항염증 활성을 이해하기 위해, 본 발명자들은 상기 종래 연구결과들에 근거하여 비히클 또는 DAPPD가 각각 투여된 야생형 및 APP/PS1 마우스에서 DAPPD가 NLRP3 인플라마좀 관련 단백질, 즉 NLRP3, ASC 및 IL-1β의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 DAPPD는 NLRP3, ASC 및 IL-1β의 발현을 하향 조절하는 것으로 나타났으며, procaspase-1에 대한 cleaved caspase-1 비율이 현저히 감소된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 DAPPD에 의한 NLRP3 및 ASC의 발현 저해가 결과적으로 caspase-1 및 IL-1β의 활성을 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 이에 추가적으로 핵자기공명 분광법을 통해 DAPPD와 NLRP3 사이의 직접적인 상호작용 여부를 분석하였으나, 직접적인 상호작용은 관찰되지 않았다.
한편, NLRP3 인플라마좀 형성은 상위에서 주로 NF-κB 경로를 통해 조절된다고 알려져 있으며, 구체적으로 NF-κB 신호전달이 활성화되면 NLRP3의 상향 조절을 유도하여 NLRP3 인플라마좀의 수준을 증가시킬 수 있다고 보고되어 있다. NF-κB는 P50 및 P65 이량체로 구성된 단백질 복합체로써 세포 생존, 염증 및 면역 반응에 관여한다. 정상적인 조건하에서, NF-κB 이량체는 IκB라 불리는 특정 억제제 단백질에 결합되어 비활성 상태로 세포질에 존재한다. 그러나 세포외 또는 세포내 병원체에 의해 NF-κB가 활성화되면 NF-κB 이량체는 IκB 단백질로부터 분리되고 세포질에서 핵 내로 이동한 다음, NLRP3 및 염증성 사이토카인과 같은 하위 유전자들의 전사를 매개한다. 또한, NLRP3 인플라마좀을 조절하는 다른 상위 과정으로 엔도좀 파열 및 카텝신 B의 방출이 알려져 있다. AD에서, 세포 내 Aβ 피브릴(fibril)은 카텝신 B(Cathepsin B)의 방출 시 파골리소좀의 파괴 및 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 유도할 수 있다고 알려져 있다.
상기 연구결과에 기초하여, 본 발명자들은 NF-κB 및 카텝신 B 경로가 NLRP3 인플라마좀에 대한 DAPPD-매개 조절과 관련된 상위 경로인지 여부를 조사하고자 하였다. 이를 위해, 먼저 야생형 및 APP/PS1 마우스(7 내지 7.5개월령)에 비히클 또는 DAPPD를 2mg/kg/day로 2개월 동안 복강 내 투여한 다음, 상기 마우스들로부터 대뇌피질을 확보하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 비히클이 투여된 APP/PS1 마우스의 피질은 pNF-κB p50, pNF-κB p65 및 pIκB의 발현수준이 증가된 것으로 나타난 반면에 DAPPD가 투여된 경우 상기 NF-κB 관련 단백질의 발현이 유의하게 감소된 것을 확인하였다. 이에 반해, DAPPD가 투여된 APP/PS1 마우스에서 카텝신 B의 발현에는 유의한 차이가 나타나지 않았다.
종합적으로, 상기 결과들을 통해 DAPPD가 NF-κB 경로에 영향을 미침으로써 NLRP3의 발현을 저해하는 것을 알 수 있었다.
실시예 8.
in vitro
알츠하이머병 환경에서 DAPPD에 의한 미세아교세포 기능이상의 개선효과 확인
미세아교세포에 대한 DAPPD의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 in vitro에서 인간 미세아교세포를 이용하여 DAPPD-매개 미세아교세포의 기능 조절 효능을 분석하였다. 또한, DAPPD 이외에 PBMA 및 AAP를 미세아교세포에 처리하여 그 효과를 분석하고 구조-활성간의 상관관계를 조사하였다. 이를 위해, 인간 미세아교세포를 24시간 동안 Aβ와 함께 배양한 다음 DAPPD, PBMA 또는 AAP를 처리하고 24시간 동안 추가적으로 배양하였다. 이후 세포들을 회수하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 Aβ와 배양된 인간 미세아교세포에서 NLRP3 및 ASC가 상향 조절되어, 상층액에서 절단된 카스파제-1(cleaved caspase-1)과 IL-1β의 분비가 증가된 것을 확인하였다. 그러나 이후 DAPPD를 처리한 결과 NLRP3와 ASC의 발현이 현저하게 감소하였고 cleaved caspase-1과 IL-1β의 분비 역시 유의하게 감소하였다. 이에 반해, PBMA 또는 AAP를 처리한 경우에는 인간 미세아교세포에서 cleaved caspase-1 및 IL-1β은 하향 조절되었으나, DAPPD에 비해서는 훨씬 약한 수준으로 나타났다. 더욱이 도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이 DAPPD가 처리된 경우에는 Aβ에 의해 유도되는 NF-κB 신호전달의 활성화가 억제되었고 카텝신 B(cathepsin B)의 방출은 억제되지 못한 것으로 나타났으며, PBMA 또는 AAP를 처리한 경우에는 이러한 효과가 나타나지 않은 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 DAPPD가 미세아교세포에서 NF-κB 경로를 효과적으로 저해하여 NLRP3를 하향 조절할 수 있음을 나타낸다. 또한 PBMA 및 AAP가 처리된 경우 미세아교세포에 대한 약한 효과를 유도한 결과는 DAPPD의 아세트아마이드 그룹이 미세아교세포의 기능을 복구시키는 분자적 효능에 중요할 수 있음을 암시하는 것이다.
다음으로, Aβ를 처리하거나 처리하지 않은 인간 미세아교세포에 DAPPD, PBMA 또는 AAP를 처리하고 M0-항상성 및 MGnD 미세아교세포 유전자뿐만 아니라 전염증 및 항염증성 사이토카인의 발현을 분석하였다. 그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이 Aβ가 처리된 인간 미세아교세포는 전염증성 사이토카인의 발현이 상향 조절되고 항염증성 사이토카인은 하향 조절되는 결과를 나타내었고, DAPPD가 처리된 경우 상기와 같은 염증성 사이토카인의 발현 변화가 복구되는 것을 확인하였다. 또한, 도 6d에서 볼 수 있는 바와 같이 M0-항상성 및 MGnD 미세아교세포 유전자의 발현 수준을 분석한 결과에서도 DAPPD에 의한 유사한 결과를 확인하였다. 반면에 PBMA 및 AAP는 Aβ에 의한 염증성 사이토카인 및 미세아교세포 유전자의 비정상적인 발현을 복구시키는 효과를 거의 나타내지 않았다. 이러한 결과는 in vitro AD 환경에서 DAPPD가 NLRP3 인플라마좀(inflammasome) 및 미세아교세포의 기능적 표현형을 조절함으로써 신경염증을 회복시킬 수 있음을 제시한다.
마지막으로, 본 발명자들은 미세아교세포의 식세포작용에 대한 DAPPD의 영향을 검증하였다. 실험 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이 Aβ가 처리된 인간 미세아교세포는 FITC 비드에 대한 식세포작용에 현저히 더 오랜 시간이 걸리고 포식된 FITC 비드의 총 수가 유의하게 감소된 것을 통해 식세포작용 능력이 전반적으로 감소된 것을 나타냈다. 그러나 DAPPD를 처리한 경우에는 Aβ가 처리된 인간 미세아교세포의 결핍된 식세포작용 능력이 복구된 것으로 나타났으며, 이에 반해 PBMA 및 AAP가 처리된 인간 미세아교세포는 상기와 같은 효과가 나타나지 않은 것을 확인하였다. 종합적으로, 상기 결과들은 DAPPD가 Aβ에 의해 유발되는 미세아교세포의 기능 이상을 완화시키는 능력이 있음을 시사하는 것이다.
한편, AAP는 미세아교세포에서 시클로옥시게나아제 1(COX-1) 또는 2(COX-2)의 활성을 억제함으로써 염증을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 DAPPD의 항신경염증 효과가 COX에 미치는 영향에 따른 결과인지를 추가적으로 확인하기 위해, 본 발명자들은 미세아교세포에서 DAPPD 처리에 따른 COX-1 및 COX-2의 발현 변화를 분석하였다. 그 결과, Aβ는 미세아교세포에서 COX-1 및 COX-2의 발현을 상향 조절하였으며 AAP가 처리된 우에는 상기 Aβ에 의해 상향 조절된 COX-1 및 COX-2의 발현이 효과적으로 저해된 것으로 나타났다. 그러나 DAPPD와 PBMA가 처리된 경우에는 COX의 발현수준이 변화하지 않는 것을 확인하였다. 또한, DAPPD는 in vitro에서 COX-2에 대하여 매우 약한 억제 활성을 나타내었고, IC50(half maximal inhibitory concentration) 값은 22 ± 1 mM이었다. 이러한 결과는 DAPPD 매개 미세아교세포의 기능 복구 효과가 COX의 발현 또는 활성에 의한 것이 아닌 미세아교세포의 NLRP3 인플라마좀 및 기능적 표현형의 조절을 통해 발생한다는 것을 의미하는 것이다.
실시예 9. Aβ 응집 및 Aβ 분해 효소의 발현에 대한 DAPPD의 영향 조사
본 발명자들은 DAPPD가 투여된 AD 형질전환 마우스의 뇌에서 관찰된 Aβ 축적의 감소가 실제로 DAPPD의 항염증 활성의 산물임을 입증하기 위해, Aβ의 2가지 주요 아형인 Aβ40 및 Aβ42의 응집 및 Aβ-분해 효소의 발현에 대한 조절 효과를 in vitro 및 in vivo 수준에서 조사하였다. 먼저, Aβ 응집체 형성 억제에 대한 DAPPD의 효과 및 미리 형성된 Aβ 응집체의 분해에 대한 DAPPD의 효과를 조사하기 위해 겔/웨스턴 블롯 및 투과전자현미경 관찰을 통해 분석한 결과, DAPPD와의 배양으로 인해 Aβ 종의 크기 분포 및 형태에 현저한 변화가 나타내지 않은 것을 확인하였다. 즉, DAPPD가 Aβ40 및 Aβ42 모두의 응집을 변화시키지 않았으며 이는 화합물과 Aβ 간의 직접적인 상호작용이 없음을 의미하는 것이다.
또한, 비히클 또는 DAPPD이 투여된 APP/PS1의 뇌 샘플에서 Aβ 분해를 담당하는 효소(즉, 네프릴리신[neprilysin; Nep], 매트릭스 메탈로펩티다아제 9[matrix metallopeptidase 9; Mmp9] 및 인슐린 분해 효소[insulin-degrading enzyme; Ide])의 발현을 분석하였다. 그 결과 비히클이 투여된 야생형 마우스와 비교하여, 비히클 투여된 APP/PS1 마우스에서 Nep, Mmp9 및 Ide이 감소된 것으로 나타났다. 그러나 DAPPD가 투여된 마우스(2mg/kg/day, i.p.; 2개월; 7.5개월령)에서도 상기 효소들의 발현이 동일하게 감소된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 DAPPD가 Aβ-분해 효소의 생성에 영향을 미치지 않음을 의미하는 것이다.
따라서 본 발명은 AD 형질전환 마우스의 뇌에서 Aβ 종의 축적이 완화된 것은 DAPPD의 처리에 의한 미세아교세포의 복구된 식세포작용에 의한 것임을 제시한다.
실시예 10. 타이레놀 약물과 DAPPD의 독성 및 효능 비교
본 발명자들은 DAPPD의 구조와 유사한 아세트아미노펜(AAP)이 주성분인 타이레놀(Tyrenol) 약물과 독성 및 효능적 측면에서 직접적인 비교실험을 진행하여 본 발명에 따른 DAPPD 화합물의 우수한 효능을 검증하고자 하였다.
10-1. 독성 비교분석
본 발명자들은 생체 내에서 DAPPD와 타이레놀 약물의 일회량 독성을 비교분석하기 위해 임상 예정 경로에 따라 각 약물을 랫트(rat)에 1일 1회 경구투여로 11시 53분 이전에 단회 투여하였다. 투여량은 산출 투여 당일 측정한 절식체중을 기준으로 산출하였고, 투여 전 3-4시간 동안 랫트를 절식시켜 위 내용물을 모두 비운 후 경구투여용 존데를 장착한 시린지 튜브를 이용해 위 내에 직접 투여하였으며, 투여 종료 약 1-2시간 후에 사료를 재급여하였다.
DAPPD와 타이레놀에 대하여 시험 동물군에서 50% 치사율을 야기하는 농도(LD50)를 분석한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 타이레놀의 경우 1,944 mg/kg인 반면에 DAPPD는 > 5,000 mg/kg으로 나타나 독성을 유발하는 농도가 타이레놀보다 현저히 높아 안전성이 더욱 높은 것을 알 수 있었다.
| Compound | Test Type | Organism | Route | LD50 |
| DAPPD | LD50 | rat | oral | > 5,000 mg/kg |
| Tylenol | LD50 | rat | oral | 1,944 mg/kg |
10-2. 아밀로이드-베타 감소 효과 비교분석
본 발명자들은 알츠하이머병 마우스 모델에서 아밀로이드-베타 침착에 대한 상기 두 가지 약물의 효과를 비교하기 위하여, 알츠하이머병 동물 모델인 5xFAD 마우스(3.5개월령)에 30일 동안 2mg/kg/day로 비히클 또는 각 약물을 복강 내 투여하고 상기 마우스의 뇌 조직에서 Aβ42 및 Aβ17-24의 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이 비히클을 투여한 대조군 마우스에 비하여 타이레놀을 투여한 경우 Aβ42 및 Aβ17-24 양이 감소된 것으로 나타났으며, DAPPD를 투여한 경우에는 타이레놀을 투여한 경우보다 더욱 유의한 수준으로 감소된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 DAPPD가 타이레놀에 비해 Aβ 종의 수준을 감소시키는 효과가 더욱 우수한 것을 알 수 있었다.
10-3. 인지기능 손상 개선 효과 비교분석
마지막으로, 알츠하이머병 마우스 모델에서 DAPPD와 타이레놀의 인지기능 손상 개선 효과를 비교분석하기 위하여, 야생형 마우스, 및 비히클, 타이레놀 또는 DAPPD를 투여한 5xFAD 마우스(3.5개월령)에 대하여 MWM 테스트를 실시하고 5일 동안의 훈련기간 동안 탈출 지연 시간을 매일 측정하였으며, 각 사분면에서 머무른 시간을 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이 타이레놀을 투여한 마우스에서는 야생형 마우스와 달리 탈출 지연 시간이 증가하고 표적 부위에 머무른 시간이 감소된 반면, DAPPD를 투여한 경우에는 모두 야생형 마우스와 매우 유사한 수준을 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 행동연구 결과를 통해 DAPPD가 타이레놀과 비교하여 알츠하이머병의 손상된 인지기능을 개선하는데 현저히 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (10)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 미세아교세포(Microglia)의 식세포작용 손상을 복구시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 뇌에서 신경염증(Neuroinflammation)을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 뇌에서 아밀로이드-베타(Amyloid-beta) 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 손상된 인지기능을 회복시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease) 예방 또는 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 미세아교세포의 식세포작용 손상을 복구시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 뇌에서 신경염증을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 뇌에서 아밀로이드-베타(Amyloid-beta) 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 조성물은 손상된 인지기능을 회복시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200030371A KR102374047B1 (ko) | 2020-03-11 | 2020-03-11 | N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200030371A KR102374047B1 (ko) | 2020-03-11 | 2020-03-11 | N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210114790A KR20210114790A (ko) | 2021-09-24 |
| KR102374047B1 true KR102374047B1 (ko) | 2022-03-15 |
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ID=77914812
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| KR1020200030371A KR102374047B1 (ko) | 2020-03-11 | 2020-03-11 | N,N′-디아세틸-p-페닐렌디아민 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107488151B (zh) | 2017-08-28 | 2019-10-29 | 广东工业大学 | 一种用于检测铜离子或制备防治阿尔茨海默症药物的化合物及其制备方法和产品 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101721608B1 (ko) * | 2015-02-25 | 2017-03-30 | 울산과학기술원 | 다중 타겟을 표적으로 하는 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 치료 또는 예방용 약학조성물 |
-
2020
- 2020-03-11 KR KR1020200030371A patent/KR102374047B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| AUTUMN R. MEEK ET AL, CAN. J. CHEM.,2012, 90, PP.865_873 |
| 디멘시아뉴스, 2019.11.07 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20210114790A (ko) | 2021-09-24 |
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