KR101705766B1 - 신경퇴행성 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알츠하이머 질환, 헌팅턴병 및 파킨슨 질환 등의 신경퇴행성 질환을 포도씨 추출물 또는 이로부터 유래되는 하나 이상의 화합물을 이용하여 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 포도씨 추출물 또는 그로부터 유래되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을, 아밀로이드 베타 또는 그것의 올리고머의 축적, 응집, 또는 침착을 감소시키거나, 및/또는 타우(tau) 단백질 또는 다른 단백질의 미스폴딩(misfolding), 축적 및/또는 응집을 감소시키기 위해 치료학적 양으로 환자에게 투여함으로써, 신경퇴행성 질환의 발병 위험성이 있거나, 또는 신경퇴행성 질환으로 진단된 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

신경퇴행성 질환 치료용 조성물{COMPOSITION FOR TREATING A NEURODEGENERATIVE DISEASE}

본 출원은 2008년 5월 9일자로 출원된 미국 특허출원 제61/051,866 호에 대해 35 USC 제119조에 따른 우선권을 주장하며, 상기 미국 출원의 내용은 전체로서 본원에서 원용한다.

본 발명은 National Institute of Health에 의해 주어진 등록 번호 NIH 1 PO1 AT004511-02 하에, 정부의 지원에 의해 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.

본 발명은 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방을 위한 포도씨 추출물의 사용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포도씨 추출물 또는 그로부터 유래되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을, 아밀로이드 베타 또는 그것의 올리고머의 축적, 응집, 및/또는 침착을 감소시키거나, 및/또는 타우(tau) 단백질 또는 다른 단백질의 미스폴딩(misfolding), 축적 및/또는 응집을 감소시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여함으로써, 신경퇴행성 질환의 발병 위험에 있거나, 또는 신경퇴행성 질환으로 진단된 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다.

신경퇴행성 질환은 신경 세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 종종 사멸하는 경우의 증상들과 관련된다. 이들은 주로 진행성이기 때문에, 신경퇴행성 질환의 결과는 종종 대단히 파괴적이다. 신경퇴행성 질환을 가진 환자들은 인지(cognitive) 또는 운동(motor) 능력에 있어서의 극심한 퇴화를 겪을 수 있다. 결과적으로, 그들의 삶의 질 및 삶에 대한 기대는 현저히 감소될 수 있다. 인간에게 있어서, 이들 질환은, 이들에 제한되지는 않지만, 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 파킨슨병(Parkinsons's Disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 및 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration) 및 다른 질병들을 포함한다.

파킨슨병은 근육 운동을 통제하는 뇌 신경 세포에 영향을 미치는 진행성 질병이다. 이들 신경 세포들은 도파민을 생성하는데, 도파민은 신체의 운동을 용이하게 하기 위해 세포 사이에서 신호를 전달하기 위한 중요한 화학 물질이다. 따라서, 이들 뉴론들의 손상은 파킨슨병 환자들에게서 전형적으로 나타나는 떨림(tremor) 및 언어능력 손상과 같은 운동성 질환을 야기한다. 신경학적 질환 및 뇌졸증에 대한 국립연구원(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)에 따르면, 미국에서 최소 백만명의 사람들이 파킨슨병을 앓고 있으며, 매년 약 50,000 명의 새로운 환자들이 보고되고 있다.

고도로 보존적인 시냅스 앞부분 단백질인 α-시누클레인(α-synuclein)이 파킨슨병의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. α-시누클레인에서의 구조적인 변화가 이 질병의 특징적인 원섬유형성(fibrillogenesis) 및 단백질성(proteinaceous) 축적을 이끄는 것으로 생각된다. 미국특허 제7,045,290 호를 참조하라(Lindquist 등). 현재의 치료적 선택은 레보도파(levodopa) 및 도파민 작용제들을 포함한다. 이들 약물들은, 그러나, 상기 증상들에 대한 일시적인 완화만을 제공하며, 다량 사용될 경우 심각한 부작용을 갖는다. 모노아민 옥사이드 B 억제제인 데프레닐(Deprenyl)은 증상을 완화시키고 상기 질병의 진행을 약화시킴으로써 파킨슨병의 일상적인 치료제로서 처음 제안된 약물이었으나, 데프레닐의 치료 효과에는 논란이 있다. 미국 특허 제6,417,177호(특허권자: Nelson)을 보라.

헌팅턴병(HD)은 비정상적 신체 운동 및 손상된 정신 능력의 증상을 가지는 유전적 신경성 질환이다. 헌팅턴병은 헌팅턴 유전자(htt)에 있어서의 3염기(trinucleotide) 반복 팽창에 의해 야기되는데, 그것은 결국 폴리글루타민(PolyQ) 경로의 병리학적 팽창을 가지는 htt 단백질의 변이체 형태를 생성한다. 상기 변이체 htt 단백질은 미스폴딩되고 뇌 및 다른 영향받은 조직에서 응집체를 형성하여, 신경 세포의 사멸을 결과한다(Wolfgang et al., Proc Nat Acad Sci 2005; 102: 11563-11568). 헌팅턴병의 증상을 치료하기 위해 사용되는 대부분의 약물은 피로, 만성피로감(restlessness), 또는 과잉민감성(hyperexcitability)와 같은 부작용을 가진다.

알츠하이머병(AD)은 일반적으로 노인성 치매(senile dementia)로 알려져 있는 진행성 뇌 질환이다. 450만 이상의 미국인들이 AD로 진단받았으며, 이 수는 향후 40-50 년 후에는 세 배로 될 것으로 예측된다(Lyketsos et al., Am J. Geriatr Psychiatry 2006; 14(7): 561-72).

AD의 병리생리학적 근원이, 부분적으로는 아밀로이드 전구체 단백질의 미스 프로세싱(miss processing) 또는 변이에 있다고 생각된다. 미스 프로세싱된 단백질은 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ) 또는 그의 변이체 형태의 증가된 양을 생산할 수 있다. Aβ의 축적은 불용성 Aβ 플라크의 침착을 야기하고, 궁극적으로는 시냅스성 실패, 신경 손상, 과잉인산화된 tau 단백질 엉킴(tangle)의 형성, 및 세포자살적(apoptotic) 뉴론 사멸을 이끈다. 뉴론의 손상 또는 사멸은 복수의 신경전달체의 손실을 야기하고, 이는 결국 상기 질환의 인지적 및 기능적 증상들의 발현으로 이끌게 된다.

현재 가능한 의약들은 일부 환자들에게 있어 상대적으로 작은 증상적 이점을 제공하지만 질병의 진행을 늦추지는 못한다. 따라서, AD를 예방 또는 치료하기 위한 여러 가지 증상적 전략이 진행되고 있다. 예를 들어, AD는 뇌 염증과 관련된 것으로 밝혀졌으며, 따라서, 이부프로펜 및 인도메타신과 같은 비스테로이드성 항염증 약물이 AD 발병의 위험을 낮추기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 상기 약물들의 장기간 사용은 위장 출혈 및 신장 질환의 위험을 가지며, 희귀하게는 심장정맥 독성과 관련된다. AD와 산소 프리 라디칼의 관련성 또한 항산화제 요법의 가능성을 제기하였다. American Psychiatric Association 및 American Academy of Neurology Treatment Guidelines for AD 양자는 치료적 선택으로서 고용량의 비타민 E를 권장하였다. 그러나, 이 권장은 비타민 E 요법이 AD와 관련된 완만한 인지 손상의 진행을 지연시키지 못하며, 매우 고용량의 비타민 E는 고령자들에게 있어서 치사율을 증가시킨다는 최근의 발견에 의해 완화되고 있다. Lyketsos et al., 2006, supra.를 참조하라.

AD에 대한 또다른 치료는 아세틸콜린 에스테라제(AChE)로 알려진 효소에 의한 자연적으로 발생하는 아세틸콜린의 분해를 감소시키는 것이다. AChE의 억제는 증가된 아세틸콜린 수준을 이끈다. U.S. Food and Drug Administration은 AD의 치료를 위한 네 가지 콜린에스테라제 억제제, 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine), 및 갈란타민(galanthamin)을 승인하였다. 콜린에스테라제 억제제의 단기간(6개월 이하)의 임상 시험은 이들 약물이 AD와 관련된 인지 손상을 개선하거나 지연시키는 것을 보였으나, 이들의 장기간의 이점에 대한 결과는 결정적이지 않다. Lyketsos et al., 2006, supra. 을 참조하라.

뇌로부터 Aβ를 제거하는 것을 목표로 하는 AD의 치료가 개발 중에 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,262,223호(Kong et al.)는 아밀로이드-관련 질환의 치료에 있어서의 아미딘 화합물의 사용을 기술하며; 미국 특허 제7,279,501호(to Kim)는 Aβ-유도된 질환의 치료를 위한 식물(예를 들어 울금(turmeric), 은행나무(gingko biloba), 및 생강(ginger)) 및 그들의 합성 화학적 유사체의 사용을 기술한다. 최근의 증거는 적포도주의 완만한 소비가 AD의 발생을 감소시킬 수 있으며 AD-타입의 인지 퇴화 및 아밀로이드 신경성 병변을 완화할 수 있다고 제시한다(Dartigues et al ., Therapie 1993; 48: 185-187; Dorozynski, BMJ 1997; 314: 997; Luchsinger et al ., J Am Geriatr Soc 2004; 52: 540-546). 뇌 내 수용성 세포외 고분자량(HMW: high molecular weight)올리고머성 Aβ종의 축적은 인지 퇴화의 시작 및 진행에 주요한 위험 요소로 생각된다(Klyubin et al ., Nat Med 2005; 11: 556-561; Selkoe, J Alzheimer's Dis 2001; 3: 75-80). It has also been suggested that grape-derived polyphenolic compounds may inhibit oligomerization of A in vitro (Porat et al ., Chem Biol Drug Des 2006; 67: 27-37). 그러나, 현재까지의 연구는 시험관내(in vitro ) 테스트로 제한되어 있다.

많은 종류의 신경퇴행성 질환들은 비정상적 단백질 폴딩(folding), 축적, 응집, 및/또는 단백질의 침착과 연관되어 있다. 예를 들어, 알츠하이머병 환자들의 뇌 내에는 두 가지 종류의 비정상적 단백질 침착이 있다. 뇌 내 유조직(parenchyma)의 세포 외부 및 뇌척수 부근에 침착되는 아밀로이드 베타 펩티드로 구성되는 아밀로이드 플라그들과, 퇴화하는 뉴론의 세포질 내에 위치된 과잉 인산화된 tau 단백질의 응집체로 구성되는 신경원섬유성 매듭(tangle)들이 그것이다. 파킨슨병을 가지는 환자들에 있어서, 흑질(substantia nigra) 뉴론의 세포질 내에서 루이바디(Lewy bodies)가 관찰되었다. 루이바디의 주성분은 α-시누클레인으로 명명된 단백질의 단편들이다. 헌팅턴병을 가지는 환자들에 있어서는, 변이체 헌팅턴 단백질의 폴리글루타민 풍부 형태의 핵 내 침착이 전형적인 형태의 뇌이다. 유전적 루게릭병을 가지는 환자들은 세포 바디 및 운동 뉴론의 액손 내에 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase)로 주로 구성되는 응집물을 가진다. 또한, 다양한 형태의 전염성 스폰지 형 뇌병증(transmissible spongiform encephalopathy)은 프리온 단백질의 프로테아제-내성 응집물의 축적에 의해 특징된다.

생화학, 유전학, 및 신경병리학적 연구로부터의 증거는 신경퇴행성 질환의 병변에 있어 단백질 미스폴딩 및/또는 응집의 적극적 관련을 제시한다. 예를 들어, 비정상적 응집체의 존재는 주로 상기 질병에 의해 가장 손상된 뇌 영역에서 일어난다. 미스폴딩된 단백질을 암호화하는 유전자에 있어서의 변이는 상기 질병의 특성적인 형태를 나타내며, 이는 주로 산발적인 형태에 비해 보다 빠른 시작 및 보다 심한 표현형을 가진다. 그러한 미스폴드된 단백질에 대한 인간 변이체 유전자를 발현하는 유전자 이식동물은 전형적인 인간 질병의 신경병리학적 및 임상학적 특성들의 일부를 발현한다. 또한, 시험관내(in vitro)에서 생성된 미스폴드된 단백질 응집체들은 신경독성이며 세포 사멸을 유도한다.

타우병증(Tauopathies)은 tau 단백질(밀접하게 연관된 세포내 마이크로튜불-관련된 단백질의 한 패밀리)의 작동 이상을 내포하는 신경퇴행성 질환의 한 패밀리이다. 이들 신경퇴행성 질환은, 예를 들어 알츠하이머병, 진행성 핵상마비(Progressive Supranuclear Palsy), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal Degeneration), 아지오필릭 그레인 질환(Argyrophilic Grain Disease), 픽병(Pick's Disease), 및 다른 질환들을 포함한다. 타우병증들 간의 공통된 특징은 tau의 비정상적 과잉 인산화 및 뇌 내 뉴론 또는 신경아교세포(glial cell) 사이의 신경섬유성 매듭(NETs: Neurofibrillary tangles)로 알려진 세제-내성 세포내 함유물 내로의 tau의 축적이다. 비정상적으로 과잉 인산화된 rau 단백질은 마이크로튜뷸로부터 즉시 분리되어 올리고머성 tau 짝지워진 나선형 필라멘트로 응집하며, 이들은 궁극적으로 세포 내 NFTs로서 침착한다(Mi, K. et al., Curr Alzheimer Res 2006; 3: 449-463). 올리고머의 형성은 부가의 과잉 인산화된 tau 및 정상적인 비-인산화된 rau가 섬유성 응집체로 되는 것을 격리하는 핵화 위치로서 작용한다(Sorrentino et al ., Neurol Sci 2007; 28: 63-71). 따라서, tau-중재된 신경퇴행의 이론은 "기능의 독성 이득(toxic gain of fuction)" 모델에 기초하며, 여기서는 비정상적으로 인산화된 tau 단백질들은 과잉 인산화 및 정상적인 tau 단백질을 마이크로튜불로부터 분리하는 것을 촉진한다. 이는 마이크로튜불의 불안정성 및 액소성 수송과 같은 마이크로튜불-중재된 프로세스의 변형을 이끌며, 이는 결국 뇌 내에서 신경 및 신경아교세포의 손상된 기능 및 감소된 생존성을 야기한다(Sorrentino et al ., 2007, supra).

미국특허출원 제2007/0122504호(to Moon et al.)는 포도씨 추출물을 제조하는 방법 및 AD를 비롯한 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해 그러한 포도씨 추출물을 사용하는 방법을 개시한다. 상기 추출물은 (1) 포도씨를 pH 8~11의 알칼리 용액 내에서, 바람직하게 20-50℃의 온도에서 추출하여 알칼리성 수용성 물질을 얻고; (2) 산성 용액으로 중화하여 pH를 2 내지 4의 범위로 조정하고, 그리고 결과 용액을 원심분리하여 침전 층을 얻고; (3) 저급 알콜을 가하여 상층액을 얻은 후, 상기 상층액을 농축시키고; 그리고 (4)qlrmrtjd 용매를 첨가하고 비극성 용매 수용성 층을 분리하여 정제된 분획을 얻어 반복 정제하고 동결건조하여 건조된 포도씨 추출물을 얻음으로써 제조된다(See Moon, paragraphs [0030]-[0035]).

신경퇴행성 질환의 유행 및 그러한 신경퇴행성 질환과 관련된 증상을 치료하기 위한 방법 또는 검증된 효과적인 약제학적 조성물의 부재로 인하여, 그들의 치료 및 예방을 위한 개선된 약학 조성물 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다.

본 발명은, 필요로 하는 개체에 약학 조성물을 투여함으로써 개체의 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이때 상기 약학 조성물은 포도씨 추출물 또는 그로부터 유래되는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 약학 조성물은 항산화제, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 활성 성분을 또한 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 포도씨 추출물은 상기 추출물 내 프로안토시아니딘(proanthocyanidins)의 총 중량을 기초로 갈로일화된(galloylated) 프로안토시아니딘을 약 12 중량% 미만으로 포함한다.

본 발명의 방법은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 및/또는 타우병증(tauopathy)과 같은 신경퇴행성 질환을 예방하거나, 그 위험을 감소시키거나, 이들 질환을 치료 또는 완화시키기 위해 사용된다. 본 발명에 의해 고려되는 상기 여러 타우병증들은 알츠하이머병, 진행성 핵상마비(Progressive Supranuclear Palsy), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal Degeneration), 아지오필릭 그레인 질환(Argyrophilic Grain Disease), 피크병(Pick's Disease), 및 유전성 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia)를 포함한다.

한 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구로 투여된다. 상기 경구 투여 형태는 산제, 정제, 캡슐, 구강내 분산성 정제, 연질 캡슐, 수성 의약품(aqueous medicine), 시럽, 엘릭시르제(elixir), 또는 포제(sachet)를 포함한다. 또다른 구현예에서는, 상기 약학 조성물은 경피적으로 투여된다. 다른 구현예에서는, 상기 약학 조성물은 경비 투여된다.

특정 구현예에서, 개체는 인간 개체이다. 투여 빈도는 매월, 2주마다, 일주마다, 또는 매일일 수 있고, 단회 투여 또는 분할 투여될 수 있다. 상기 포도씨 추출물의 화합물의 효과량은 하루 약 100 내지 1000 mg의 투여량이며, 바람직하게는 하루 약 200 내지 약 600 mg의 투여량이다.

도 1A-1F: 도 1은 포도씨 추출물(GSE:Grape Seed Extract) MegaNatural?-AZ (또는 MNG-AZ)의 성분 분석 결과를 나타낸다. 도 1A는 전형적인 헤테로폴리머성 프로안토시아니딘의 분자 구조를 나타낸다. 도 1B는 MNG-AZ의 정상 상(normal phase) HPLC 분석을 나타낸다. 도 1C는 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate)로 구성되는 호모 4분체 프로안토시아니딘(좌측 칼럼) 및 결과 디갈로일화된 프로안토시아니딘과 분리된 갈릭산 구조(우측 패널)를 개략적으로 나타낸다. 도 1D는 네 개의 다른 상업적으로 구입 가능한 GSE 제조물: MegaNatural?-Gold, GSE 브랜드 A, GSE 브랜드 B, 및 GSE 브랜드 C와 비교한 MNG-AZ에서의 갈로일화된 프로안토시아니딘(총 프로안토시아니딘 중)의 퍼센트를 나타낸다(브랜드 A는 San Joaquin Valley Concentrates 로부터 입수한 GSE인 "액티빈(Activin)"이고; 브랜드 B는 France 에서 입수한 GSE, "Masquelier? OPC"이고; 그리고 브랜드 C는 Indena S.p.A., Italy로부터 입수한 GSE이다). 도 1E와 도 1F는 MNG-AZ 내 및 다른 상업적으로 구입 가능한 GSE들에서의 갈로일화된 프로안토시아니딘의 수준을 나타낸다.
도 2A-2D: 도 2는 Aβ 단백질이 시험관 내(in vitro)에서 그들의 수용성 올리고머 형태로 전환하는 경우에 대한 MNG-AZ GSE의 영향을 나타낸다. 도 2A와 2B는 다양한 양의 MNG-AZ GSE를 포함하는 Aβ_1-42 (2A) 및 Aβ_1-40 (2B) 배양물의 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 일렉트로포러시스(SDS-PAGE)를 나타낸다. 도 2C와 2D는 비수식 단백질의 광-유도된 가교결합(Photo-Induced Cross-linking of Unmodified Proteins (PICUP)) 화학 후 MNG-AZ GSE의 존재 또는 부재 하에서 Aβ_1-42 (2C) 및 Aβ_1-40 (2D)의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다.
도 3A-3D: 도 3은 Circular Dichroism (CD) 분광기에 의해 조사된 MNG-AZ의 Aβ 억제 효과를 나타낸다. 도 3A 및 3C는 처리되지 않은 Aβ_1-40 및 Aβ_1-42 각각의 CD 스펙트럼을 나타내고; 도 3B 와 3D는 MNG-AZ 처리된 Aβ_1-40 및 Aβ_1-42 각각의 CD 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼은 배양주기 시작일로부터 즉시(- - - -), 그리고 2일 후(-- - - ---), 3일 후(--- - ----), 6일 후(------ ------), 및 7일 후(------)에 얻어진 것이다. 각 시간에 제시된 스펙트럼은 세 번의 독립적인 실험 각각 동안에 얻어진 것들의 대표 값들이다.
도 4A-4D: 도 4는 ThT 결합 분석에 의해 조사된 MNG-AZ의 Aβ 억제 효과를 나타낸다. 도 4A 및 4C는 Med1 대조군 화합물의 상이한 농도들에서, 각각 처리되지 않은 Aβ_1-40 및 Aβ_1-42의 형광 스펙트럼을 나타내고; 도 4B 및 4D는 각각 MNG-AZ 처리된 Aβ_1-40 및 Aβ_1-42의 형광 스펙트럼을 나타낸다. Med1(또는 MNG-AZ)의 농도는 도 4A-4D에서 각각 0(◆), 5(■), 또는 25(▲)μM 이다.
도 5A-5F: 도 5는 전자 현미경(electron microscopy)에 의해 조사된 MNG-AZ의 Aβ 억제 효과를 나타낸다. 도 5A 및 5B는 각각 처리되지 않은 Aβ_1-40 및 Aβ_{1- 42} 의 예시적 형태를 나타낸다. 도 5C 및 5E는 각각, 낮은(5μM) 및 높은(μM) 농도의 MNG-AZ의 존재 하에서 Aβ_{1- 40} 의 형태를 나타낸다. 도 5D 및 5F는 각각, 낮은(5μM) 및 높은(μM) 농도의 MNG-AZ의 존재 하에서 Aβ_{1- 42} 의 형태를 나타낸다.
도 6A-6D: 도 6은 MTT 대사에 의해 조사된 MNG-AZ의 Aβ 억제 효과를 나타낸다. 도 6A (및 6C)는 저분자량 Aβ_1-40 (및 Aβ_1-42 )의 독성 및 상기 독성을 감소시킴에 있어서의 MNG-AZ의 효과를 나타낸다. 도 6B (및 6D)는 Aβ_1-40 응집체 (및 Aβ_1-42 응집체)의 독성 및 상기 독성을 감소시킴에 있어서의 MNG-AZ의 효과를 나타낸다.
도 7A-7G: 도 7은 Tg2576 마우스의 신경변리학 상에 미치는 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸다. 도 7A-7B는 체중(7A) 또는 액체 소비(7B)에 대한 MNG-AZ GSE의 영향을 나타낸다. 도 7C-7D는 Tg2576 마우스의 뇌 내 수용성, 세포외 HMW-Aβ의 함량 평가를 제시한다. 도 7E는 MNG-AZ GSE 처리군 및 대조군 마우스의 뇌 내 Aβ_1-42 및 Aβ_{1- 40} 의 펩티드 농도의 평가를 나타낸다. 도 7F는 MNG-AZ GSE 처리군 및 대조군 마우스에서 대뇌피질 및 해마조직 형성 Aβ-아밀로이드 플라크 축적의 평가를 나타낸다. 도 7G는 MegaNatural?-Gold 처리군 및 대조군 마우스의 뇌 내 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40 펩티드 농도의 평가를 나타낸다.
도 8A-8F: 도 8은 MNG-AZ GSE의 유리한 효과에 대한 잠재적인 메커니즘을 설명하기 위한 다양한 실험들의 결과를 나타낸다. 도 8A는 약 5 개월 동안 MNG-AZ를 처리한 Tg2576 마우스에서의 총 APP 발현의 웨스턴(western) 분석을 나타낸다. 도 8B는 α-, β-, 및 γ-세크레타아제(secretase) 활성의 평가를 나타낸다. 도 8C는 MNG-AZ GSE 처리된 Tg2576 마우스 대 대조군 마우스에서의 수용성 APP_α 및 APP_β ㅂ발현의 웨스턴 분석을 나타낸다. 도 8D와 8E는 MNG-AZ GSE 처리된 Tg2576 마우스 대 대조군 마우스의 뇌 내 Aβ분해 효소 네프릴신(neprilysin)과 인슐린 분해 효소의 발현을 나타낸다. 도 8F는 효소-연결된 면역솔번트 검정(ELISA)에 의한 혈장 Aβ_1-40(좌측 패널) 및 Aβ_1-42(우측 패널) 함량의 평가를 나타낸다.
도 9A-9C: 도 9는 MNG-AZ GSE로 처리된 Tg2576 마우스에서의 인지 퇴행의 완화를 나타낸다. 도 9A 및 9B는 Morris water maze 테스트에 의해 결정된 바와 같은, Tg2576 마우스에서의 Aβ관련된 공간 기억에 대한 MNG-AZ GSE 의 영향을 나타낸다. 도 9C는 Tg2576 마우스의 뇌 내 수용성, 세포외 고분자량 Aβ펩티드 함량의 평가를 제시한다.
도 10A-10B: 도 10A 및 10B는 Morris water maze 테스트에 의해 측정된 것과 종(strain-), 연령-, 및 성별(gender-)을 맞춘 야생형 동물에서의 인지 기능에 대한 MNG-AZ GSE 처리의 효과를 나타낸다.
도 11A-11B: 도 11은 MNG-AZ GSE의 존재 또는 부재 하에서의 tau 펩티드의 응집 키네틱스(kinetics). 도 11A는 MNG-AZ의 여러 농도에서의 응집된 tau의 시간-의존적 ThS-형광 스펙트럼을 나타내고; 도 11B는 MNG-AZ의 여러 농도에서의 tau 응집체의 최대 축적을 나타낸다.
도 12A-12B: 도 12는 tau 펩티드의 예비-형성된 응집체를 분리함에 있어서의 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸다. 도 12A는 여러 농도의 MNG-AZ에서의 응집된 tau의 시간-의존적 ThS-형광 스펙트럼을 나타내고; 도 12B는 MNG-AZ의 여러 농도의 함수로서 tau 응집체의 분해 속도를 나타낸다.
도 13A-13D: 도 13은 초파리(Drosophila) 모델에서의 MNG-AZ GSE의 이점을 나타낸다. 도 13A는 GSE 부재 하의 초파리에 있어서의 눈(eye) 생성 결과를 나타내며; 도 13B는 GSE 존재 하에서의 초파리에서의 눈(eye) 생성 결과를 나타내고; 도 13C는 대표 실험(GSE의 존재 및 부재 하)에서 수컷 초파리 눈의 가시적인 수를 나타내며; 도 13D 는 도 13C에서와 동일한 실험에서 눈이 없는 것의 숫자를 나타낸다.
도 14. 도 14는 헌팅턴병의 초파리 모델에서의 수일에 걸친 생존 퍼센트를 나타낸다. 개방된 원은 포도씨 추출물로 처리된 군으로부터의 결과를 나타내고, 채워진 원은 대조군으로부터의 결과를 나타낸다.
도 15A-15C: 도 15는 Aβ 올리고머화에 미치는 MNG-AZ GSE의 영향을 나타낸다. 도 15A는 Aβ_1-40에 대한 결과를 나타내고; 도 15B는 Aβ_1-42에 대한 결과를 나타내고; 도 15C는 글루타치온 S-트랜스퍼라제에 대한 결과를 나타낸다. 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 가교결합 없이 단백질만; 레인 3: 단백질만; 레인 4: 단백질 + Med1 (25 μM); 레인 5: 단백질 + Med1 (250 μM); 레인 6: 단백질 + MNG-AZ (25 μM); ㄹ레레인 7: 단백질 + MNG-AZ (250 μM). 젤은 세 번의 독립적인 실험 각각의 대표 값이다.
도 16. 도 16은 PICUP 검정을 사용한 tau 펩티드 응집에 대한 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸다. 제른 등몰량(25 μM)의 GSE의 존재(레인 2, 4, 6, 8) 또는 부재(레인 1, 3, 5, 7) 하의 25 μM 가교결합된 tau 펩티드의 대표적 분석을 나타낸다. 예측되는 작은 펩티드들의 비효과적인 염색으로 인해, 모노머성 tau 펩티드들은 이 실험에서 검출되지 않았다. ~2.1 및 ~3.5 kDa 밴드들이 각각 3량체 및 5량체 tau 펩티드 응집체에 해당한다. CTR: 비가교결합된 tau 펩티드; 레인 1-8: 암모늄 퍼설페이트(APS) 및 1x (레인 1, 2), 2x (레인 3, 4), 3x (레인 5, 6) 및 4x (레인 7, 8) Ru(Bpy)를 가지는 tau 펩티드.
도 17A 및 17B. 도 17은 Circular Dichroism 분광법을 이용한 tau 펩티드 응집에 미치는 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸다. 도 17A에는 MNG-AZ 부재 하에서의 tau 펩티드 응집이 나타나 있으며, 여기서 tau 펩티드에 대해 1:1 몰비의 MNG-AZ가 존재하는 경우의 tau 펩티드 응집은 도 17B에 나타나 있다. 도 17A 및 17B에서 d0, d1, d2, 및 d3으로 표시된 것은 각각, 합성(37℃에서) tau 펩티드의 배양 코스 중 0, 1, 2, 3 일째에 얻어진 스펙트럼을 나타낸다. 화살표는 배열된 이형체들의 분광 특성을 나타낸다.
도 18A 및 18B. 도 18은 전자현미경을 이용한 tau 섬유 형태에 대한 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸 것이다. MNG-AZ 부재 하에서의 tau 섬유 형태는 도 18A에 나타나 있고; MNG-AZ 존재 하에서의 tau 섬유 형태는 도 18B에 나타나 있다. 치수 바는 100 nm를 나타낸다.
도 19A-19D. 도 19는 AD 뇌 표본으로부터 분리된 천연 쌍 나선상 섬유(PHFs: paired helical fibrils)의 초구조적 특성에 대한 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸다. 도 19A는 MNG-AZ GSE 부재 하에서 정제된 PHFs의 전자 현미경 사진을 나타내고; 도 19B와 19C는 100 μM MNG-AZ GSE 존재 하에서 5초(도 19B) 및 1 시간(도 19C) 동안의 정제된 PHFs의 전자 현미경 사진을 나타낸다. 도 19A 및 19C에서, 전자밀도가 높은 입자들은 pSer214tau 라벨링을 나타낸다(C에서의 화살표). 도 19D는 처리 시간의 함수(5 내지 60분)로서 PHFs에 대한 GSE 처리의 정량 분석을 나타내며, 여기서 막대 그래프는 표준 편차를 가지는 평균 최대 폭을 나타낸다; 측정된 PHFs의 수는 괄호 안에 나타나 있다. 처리되지 않은 PHFs(0-시간)와 비교하여, 일방 ANOVA(P < 0.0001) 후, Bonferroni's Multiple Comparison Test, **p < 0.001에 의한 통계 분석.
도 20A-20D. 도 20은 PHFs의 트립신 소화에 대한 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸다. 도 20A는 트립신 처리하지 않은 AD 뇌로부터 분리된 천연 PHFs의 전자현미경 사진을 나타낸다. 도 20B는 MNG-AZ (100 μM, 1 시간)로 예비 처리되고 트립신으로 처리되지 않은 PHFs의 전자현미경 사진을 나타낸다. 도 20C는 트립신(1 μg/ml, 10 분)으로 처리된 천연 PHFs의 전자현미경 사진을 나타낸다. 도 20D는 MNG-AZ(100 μM, 1 시간)로 예비 처리되고 트립신(1 μg/ml, 10 분)으로 처리된 PHFs의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 21A-21G. 도 21은 변이체 tau 초파리 모델의 비정상 눈 표현형에 대한 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸다. 도 21A 및 21D는 야생형 파리들에서의 대표적인 눈 표현형을 나타내고; 도 21B 및 21E는 GSE 처리 없는 R406W 변이체 tau 파리의 눈을 나타내며; 도 21C 및 21F는 MNG-AZ로 처리한 R406W 변이체 tau 파리의 눈을 나타내고; 도 21G는 세 번의 독립 실험들을 통해, 수컷 및 암컷 파리들에 있어서 네 지점에서의 계수 시스템(여기서 0 은 눈 없음, 4는 정상 눈을 나타냄)을 사용하여 성체 눈 형태의 정량 분석을 나타낸다. 실험 당 계수된 파리의 수가 나타나 있다. 막대 그래프는 평균 + SEM을 나타낸다.
도 22A-22D. 도 22는 타우병증의 유전자이식 NJPL3 마우스 모델에 대한 뒷다리 신장 검증(hind limb extension assay)을 사용한 평가 구조를 나타낸다. 꼬리로 거꾸로 매달릴 때 뒷다리를 평행하게 뻗는 동물들의 자연적인 경향을 다음 네 가지 등급에 따라 평가했다: 4 = 정상 기능(도 22A), 3 = 약간의 손상(도 22B), 2 = 중간 손상(도 22C), 및 1 = 심한 손상(도 22D).
도 23A 및 23B. 도 23은 타우병증의 유전자이식 NJPL3 마우스 모델에 대한 GSE 처리의 효과를 나타낸다. 도 23A는 각각, GSE로 처리되지 않은 것들에 비해 GSE로 처리될 때 5 개월 및 13 개월의 JNPL3 마우스의 운동기능 손상을 나타낸다. 도 23B는 GSE로 처리된 것 및 처리되지 않은 JNPL3 마우스 사이의 치사율 비교를 나타내며, 여기서 선 그래프는 시간에 따른 % 생존율을 나타낸다.
도 24A 및 24B. 도 24는 형광 현미경을 이용한 htt 단백질의 응집 감소에 대한 MNG-AZ GSE의 효과를 나타낸다. 도 24A는 12.5 μM 및 25 μM GSE로 처리한 후 뮤리스테론 A 유도 처리한 세포와 담체 처리된 대조군(Ctrl) 세포의 이미지를 나타낸다. 도 24B는 GSE 12.5 μM 및 25 μM 처리하거나 처리하지 않은(Ctrl) 경우의 GFP-Htt 융합 단백질 응집체의 고분자량 응집체로의 응집에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다(좌측 패널: GFP-Htt 융합 단백질의 고분자량 종으로의 응집을 확인하기 위한 항-GFP 항체로 프로브된 웨스턴 블롯; 우측 패널: GFP-Htt 단백질 및 고분자량 htt 응집체의 분포를 나타내는 웨스턴 블롯의 농도적 분석).
도 25A 및 25B. 도 25는 등산 검정(climbing assay)에 의해 측정되는 것과 같은, 초파리 HD 모델에서의 운동기능 손상에 대한 GSE 처리의 효과를 나타낸다. 도 25A와 25B는 각각 9일 및 16일째의 등산 검정 결과를 나타낸다. 세 번의 독립적인 등산 실험을 각 테스트 날에 수행하였다. 막대 그래프는 등산 과제를 성공적으로 완수한 파리의 %의 평균 + SEM 값이다. GSE 처리되지 않은 군에 대해 GSE 처리된 군을 ㅂ비빅비교함에 있어서, Student's t-test, ** p < 0.001 통계 분석을 사용했다.
도 26A 및 26B. 도 26은 HD의 초파리 모델에서 일자에 따른 생존율의 퍼센트를 나타낸다. 채워진 역삼각형은 MNG-AZ GSE 처리된 군으로부터의 결과를 나타내고, 채워진 다이아몬드는 대조군으로부터의 결과를 나타낸다. 데이터는 4 번의 독립적인 실험으로부터의 결과들을 나타낸다.
도 27. 도 27은 상이한 주령(week ages)에서 로타로드(rotarod) 평가를 사용하여 측정된, HD 마우스 모델에서의 운동기능 손상에 대한 GSE 처리의 효과를 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험으로부터 얻어진 결과들을 나타낸다.
도 28. 도 28은 HD 마우스 모델의 치사율에 대한 GSE 처리의 효과를 나타낸다. 선 그래프는 시간에 따른 % 생존율을 나타낸다.

본 발명은 Aβ, 올리고머성 Aβ, tau 단백질, 또는 신경퇴행성 질환과 관련된 다른 단백질의 침착 또는 응집, 축적, 미스폴딩을 감소시키는 방법을 유리하게 제공한다. 상기 방법은 포도씨 추출물 또는 그로부터 유래되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것과 관련된다. 이들 및 본 발명의 다른 측면들을 이하 기술하는 설명 및 실시예에서 자세히 논의한다.

본 발명은 포도씨 추출물로부터의 화합물이 Aβ, tau 단백질, 또는 신경퇴행성 질환과 관련된 다른 단백질의 침착, 응집, 축적, 및/또는 미스폴딩에 대한 효과적인 억제제로 작용한다는 발견에 기초한다. 특히, 본 발명은 부분적으로, (1) 시험관내(in vitro)에서 합성 Aβ_1-40 (Aβ40) 및 Aβ_1-42 (Aβ42) 의 올리고머 형성; (2) Tg2576 마우스(변이체 아밀로이드 전구체 단백질을 발현하고 AD-타입 인지 퇴행을 나타내는 유전자이식 마우스)의 뇌 내 올리고머성 Aβ의 양; (3) 시험관 내에서, 여러 타우병증에서 발견된 것과 같은 쌍을 이룬 나선형 필라멘트에 의해 특징되는 구조로의 tau 응집체를 결과하는 핵화(nucleation)의 개시 및 tau 응집체의 안정화; (4) 유전자이식 R406W 초파리 표현형에서의 tau 단백질의 해로운 효과, 및 시험관 내에서의 유전자이식 JNPL3 마우스 모델에서의 tau 단백질의 해로운 효과; (5) 시험관 내 폴리글루타민 함유 htt 단백질 종의 응집; (6) 시험관 내에서 유전자이식 elav > Q93httexon1 초파리 표현형에서의 변이체 htt 단백질의 해로운 효과, 및 유전자이식 R6/2 마우스 모델에서의 변이체 htt 단백질의 해로운 효과를, 포도씨 추출물의 특정 타입이 억제하거나 감소시킨다는 발견에 기초한다. 이들 관찰은 놀랍게도 포도씨 추출물 또는 그로부터 유도된 화합물들이 아밀로이드, htt, 및 tau-관련된 신경병리학의 생성을 감소시키는데 사용될 수 있음을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 포도씨 추출물 또는 그로부터 유래되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학 조성물 및 그러한 약학 조성물을 신경퇴화, 세포 독성, 인지 손상 EH는 퇴행, 및 운동기능 퇴화와 같은 신경퇴화성 질병의 신경병리학적 특성을 치료하거나 예방하기 위해 사용하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 포도씨 추출물은 총 프로안토시아니딘 양을 기준으로 약 12 중량% 미만의 갈로일화된 프로안토시아니딘을 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어들은, 본 발명의 내용 및 명세서 문장 내에서 각 용어가 사용되는 경우에 있어서, 일반적으로 당해 기술 분야에서 통상적으로 그들이 의미하는 바를 나타낸다. 특정 용어들은 본 발명에 따른 상기 조성물 및 방법을 기술하기 위한 부가적인 안내를 제공하기 위해 하기에서 정의된다.

정의

용어 "치매"는 기억 및 다른 인지 영역의 전반적인 인지 저하와 관련된 임상적 증상을 의미한다.

용어 "퇴행성 질환"은 염증성 질환과 대조적으로, 시간에 따라 영향을 받은 조직 또는 기관의 구조 또는 기능이 점점 퇴화되는 질병을 일컫는다.

용어 "신경퇴행성 질환"은 세포 사멸에 의해 신경 세포가 손실되는 상태 또는 질병을 의미한다.

용어 "알츠하이머병" (또는 "노인성 치매")은 노인성 플라크, 신경염증 엉킴(tangles), 및진행성 신경 손실로 특징되는 특정 퇴행성 뇌 질환과 관련된 정신적인 퇴화를 일컫는다.

용어 "파킨슨병"은 종종 운동 기능 및 언어능력을 손상시키는 중추 신경계의 만성 및 진행성 퇴행성 질환이다. 파킨슨병은 운동 질환으로 불리는 상태의 군에 속하며 근육경직, 떨림, 신체움직임의 느림, 및 심각한 경우에는 신체적 운동의 손실에 의해 특징된다.

용어 "헌팅턴병"은 헌팅턴 단백질을 암호화하는 유전자 내 3 염기 반복 팽창에 의해 야기되는 유전적 신경학적 질환을 의미한다. 헌팅턴병의 증상은 비정상적인 신체 움직임 및 통제 부족을 포함한다.

용어 "타우병증"은 tau 단백질(세포내 마이크로튜불-관련 단백질과 밀접하게 관련된 패밀리)의 오작동을 의미하는 신경퇴행성 질환의 패밀리를 일컫는다. 이들 신경퇴행성 질환(타우병증)은, 예를 들어, 알츠하이머병, 진행성 핵상마비(Progressive Supranuclear Palsy), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal Degeneration), 아지오필릭 그레인 질환(Argyrophilic Grain Disease), 픽병(Pick's Disease), 및 유전적 전두측엽 치매(fronto-temporal dementia)을 포함한다.

용어 "아밀로이드 베타(Aβ)"는 아밀로이드 베타 전구체 단백질(APP)의 절단에 의해 생성되며, 그것의 침착 및 축적은 개체의 뇌 내에 플라크를 형성한다. Aβ의 가장 흔한 이형체는 Aβ_1-40 (Aβ₄₀) 및 Aβ_1-42(Aβ₄₂)이다. "올리고머 Aβ"라는 표현은 화학 결합에 의해 연결된 하나 이상의 Aβ 단위를 가지는 펩티드, 또는 화학 결합 및/또는 물리적 힘에 의해 연결된 다수의 Aβ펩티드들을 일컫는다. 용어 "올리고머화"는, Aβ와 같은 작은 화학적 또는 생물학적 분자가 화학적 결합 및/또는 물리적 결합을 통해 보다 큰 결합체로 조합하거나 뭉쳐지는 것을 의미한다.

용어 "감소(reduece)"는 화학적 또는 생화학적 물질의 농도 또는 양을 낮추거나 약하게 하는 것, 또는 진행되고 있는 화학적 또는 물리적 과정의 속도를 낮추거나 역전시키는 것을 의미한다.

용어 "축적(accumulation)"은 펩티드와 같은 화학적 또는 생물학적 물질의 양 또는 농도를 특정 영역 또는 공간에 있어서 증가시키는 것을 의미한다.

용어 "응집(aggregation)"은 보다 작은 다수의 화학적 또는 생물학적 분자가 화학적 결합 및/또는 물리학적 결합을 통해 보다 큰 덩어리로 조합되거나 모이는 것을 의미한다.

용어 "침착(deposition)"은 세포벽 또는 혈관벽과 같은 생물학적 표면에 화학적 또는 생물학적 물질이 부착하는 것을 의미한다.

용어 "폴리페놀" 또는 "폴리페놀성 화합물"은 분자 당 하나의 페놀기의 존재에 의해 특징되는 화합물을 의미한다.

용어 "치료학적으로 유효한 투여량" 또는 "치료학적 유효량" 또는 "효과량"은 치료적 반응으로 결과되기에 충분하게 함유되는 포도씨 추출물 또는 그 안에 포함되는 화합물의 양을 의미한다. 치료적 반응이란, 증상 및 대용 임상 마커들을 평가함으로써와 같은, 치료에 대한 효과적인 반응으로서 사용자(즉, 임상시험자)가 인식할 것인 임의의 반응일 수 있다. 따라서, 치료적 반응은 일반적으로 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 완화일 것이다.

표현 "약학적으로 허용가능한"은 생리학적으로 허용가능하며 전형적으로 인간에게 투여되었을 때 예상 밖의 반응을 일으키지 않는 조성물 및 분자들을 의미한다. 바람직하게, 여기서 사용되는 바와 같이, 상기 용어 "약학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주정부의 규칙 또는 U.S. Pharmacopeia 또는 포유동물 및 특히 인간에의 사용에 관해 다른 일반적으로 알려진 약전에 의해 승인되는 것을 의미한다.

용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물을 그것의 산 또는 염기 염으로 제조하여 수식된 화합물의 유도체를 의미한다. 약학적으로 허용가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 광물성 또는 유기산 염; 및 카르복시산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염은 종래의 비독성 염 또는 예를 들어 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 4차 암모늄염을 포함한다. 그러한 종래의 비독성 염은 염산, 붕소산, 황산, 설파민산, 인산, 및 질산과 같은 무기산으로부터 유도되는 것, 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콘산, 스테아릭산, 락틱산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팔모익산, 말레익산, 히드록시말레익산, 페닐아세트산, 글루타믹산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄디설폰산, 옥살산, 및 이스에티오닉산(isethionic acid)과 같은 유기산으로부터 제조되는 염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염은 염기성 또는 산성 잔기를 포함하는 모 화합물로부터 종래의 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 그러한 염은 이들 화합ㅁ물의 자유 산 또는 염기 형태를 화학당량적 양의 적절한 염기 또는 산과 물 또는 유기 용매, 또는 이 둘의 혼합물 내에서 반응시켜 제조될 수 있다.

용어 "담체" 또는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 아쥬번트, 부형제, 또는 담체를 일컫는다. 그러한 약학적 담체들은 살균액, 예컨대 물과 오일일 수 있다. 물 또는 수성 용액 생리식염수와 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액들이 담체로서 바람직하게 사용된다. 적절한 제약학적 담체들은 "Remington's Pharmaceutical Sciences"by E.W. Martin, 18^th Edition 또는 다른 편집물들에 기술되어 있다.

용어 "항산화제"는 개체의 신체 내에서 해로운 자유 라디칼들을 중화하거나 억제할 수 있는 일련의 화학 물질들을 의미한다.

용어 "개체"는 아밀로이드 베타, 아밀로이드 베타의 올리고머, tau 단백질, 또는 다른 단백질들의 미스폴딩, 축적, 응집, 또는 침착이 일어날 수 있는 살아있는 유기체를 포함한다. 용어 "포유동물"은, 예를 들어 마우스, 래트, 래빗, 개, 고양이, 및 특히 인간을 포함하여, 유선에 의해 분비되는 젖으로 그들의 자손에게 영양을 공급하는 고등 척추동물의 "포유류" 클래스의 임의의 유기체를 의미한다. 용어 "인간"은 호모 사피엔스의 일원을 의미한다. 용어 "환자"는 본 발명에 따른 조성물에 의한 치료가 제공되는 인간 개체를 의미한다.

용어 "치료"는 본 발명의 조성물을, 이들에 제한되지 않는, 아밀로이드 베타, 아밀로이드 베타의 올리고머, tau 단백질, 알파-시누클레인 등을 포함한 단백질의 침착, 응집, 축적, 또는 미스폴딩 및/또는 신경퇴행성 질환과 관련된 하나 이상의 증상 및/또는 상태를 역전시키거나, 지연시키거나, 진행을 늦추거나, 약화시킬 목적으로 개체에게 투여하는 것을 의미한다.

용어 "예방"은 아밀로이드 베타, 아밀로이드 베타의 올리고머, tau 단백질, 또는 다른 단백질의 침착, 응집, 축적, 또는 미스폴딩과 관련된 증상 또는 상태의 개시 전에 개체에게 본 발명의 조성물을 투여함으로써 그러한 증상 또는 상태의 발생을 막는 것을 의미한다.

개체에서 증상 또는 상태가 일어나는 것의 "감소된 위험"이라는 용어는, 비교가능한 대조군 개체에 비해 증상 또는 상태가 그 개체에게서 보다 덜 발발할 것 같음을 의미하며, 예를 들어, 여기서 상기 개체는 본 발명의 약학 조성물을 투여받은 개체이고, 대조군은 처리되지 않거나 위약을 투여받은 경우이다.

용어 "약" 또는 "대략"은, 수치를 측정 또는 결정하는 방법, 즉, 제한된 측정 방법에 얼마간 의존하여, 당업자에 의해 결정되는 특정 수치가 허용가능한 오차 범위에 있음을 의미한다. 예를 들어, "약"은 당해 분야의 관례에 따라 표준 편차의 범위가 3 이내이거나 그 이상인 것을 의미할 수 있다. 또한, "약"이라는 용어는 주어진 수치의 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 1% 이하인 범위를 의미할 수 있다. 또한 특히 생물계나 그 공정과 관련하여, 상기 용어는 어떤 수치에서 그 10배 이내의 범위, 바람직하게는 5배 이내의 범위, 더욱 바람직하게는 2배 이내의 범위를 의미한다.

약제학적 조성물

포도씨 추출물

본 발명의 일 구현예는 단백질의 미스폴딩, 축적, 응집 및/또는 침착(deposition)과 관련된 신경변성 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 포도씨 추출물 유래의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 용어 '포도씨 추출물 (GSE)'은 포도씨, 껍질 또는 찌꺼기로부터 추출된 물질 또는 하나 이상의 화합물을 의미한다.

포도씨 추출물은 다양한 소스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, Polyphenolics 사(Constellation Wines U.S., Inc.의 사업부)는 MegaNatural?이라는 상표로 포도씨 추출물 제품을 시판하고 있다. MegaNatural? 제품의 시판품의 예로는, MegaNatural? GSKE 포도 찌꺼기 추출물, MegaNatural?-BP, 및 MegaNatural?-Gold를 들 수 있다. 포도씨 추출물은 또한 특정 추출 및/또는 정제 공정에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 포도씨 추출물은 미국 특허 제6,544,581호 (Shrikhande 등, '581 특허), 또는 미국 특허 출원 공보 제2007/0071871호 (Shrikhande 등)에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있으며, 상기 특허 문헌들은 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.

상업적으로 입수할 수 없는 실험 제품인 MegaNatural?-AZ (또는 MNG-AZ)는, 폴리페놀 성분에서 갈레이트 부분이 제거되어 있기 때문에, 장점막을 통해 쉽게 흡수되는 특수한 성질을 가지고 있다. MNG-AZ의 제조 방법에서, 비정제 폴리페놀 추출물은, 갈레이트 모노머 및 프로안토시아니딘 올리고머로부터 갈릭산(gallic acid)을 가수분해하는 시간 동안 혼합배양 효모 발효를 시킨다. 상기 추출물은 90 중량% 초과의 폴리페놀 및 3 중량% 초과의 갈릭산을 포함하는 분말 형태로 추가로 가공된다 ('581 특허 참조). 포도씨 모노머 및 폴리머로부터 갈릭산을 유리시키는 타나제 활성(tannase activity)을 위해, 효모 배양이 선택된다. 또한 비정제 타나제 효소가 효모와 몰드를 이용한 발효 공정에 의해 제조될 수 있으며, 비정제 포도씨 추출물에 추가되어 갈릭산을 유리시킨다. 이로부터 생성된 MNG-AZ는 프로안토시아닌의 총량을 기준으로 갈로일화(galloylated) 프로안토시아니딘이 약 12 중량% 미만으로 포함된 것을 특징으로 한다. 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 갈릭산 측기(side group)를 제거하면 MNG-AZ의 생물학적 활성이 현저히 증가되는 것으로 생각된다.

포도씨 추출물 내 주요 화합물군인 폴리페놀은 효과적인 항산화제로 인식되어 있다. 폴리페놀의 하위 물질인 프로안토시아니딘은 카테킨 및 에피카테킨 염기 단위 및 이들의 유도체 (즉, 갈릭산의 추가로 에피카테킨이 수식된 에피카테킨 갈레이트)로부터 유래된 폴리머 화합물이다. 포도씨 추출물 MNG-AZ의 성분 분석 결과는 도 1에 나타내었다. 일반적인 헤테로폴리머 프로안토시아니딘의 분자 구조는 카테킨, 에피카테킨, 에피갈로카테킨 및 그의 유도체 (에피갈로카테킨 및 에피카테킨 갈레이트)를 포함한다 (도 1A). 또한 MNG-AZ의 순상 HPLC 분석 결과는 프로안토시아니딘의 모노머 및 폴리머 단위의 존재를 보여준다 (도 1B).

에피카테킨 갈레이트를 포함하는 프로안토시아니딘은 미생물 또는 효소 전환에 의해 탈갈로일화(degalloylated)될 수 있다 (도 1C). 이러한 갈릭산 측쇄의 제거가, MNG-AZ와 다른 상업적으로 입수가능한 포도씨 추출물을 구별 짓게 한다. MNG-AZ는 4가지 다른 상업적으로 입수가능한 GSE 제제와 비교할 때, MNG-AZ 내 (전체 프로안토시아니딘 중) 갈로일화 프로안토시아니딘의 비율에서 확인할 수 있듯이, 갈릭산 측쇄를 거의 또는 전혀 포함하지 않는다 (도 1E 및 1F). 본 발명에서, MNG-AZ는 동물 질환 모델에서 Ab 및 타우(타우)-관련 신경변성 질환에 대해 놀랄만한 생체내 생물학적 활성을 나타낸다.

본 발명의 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 특정 포도씨 추출물, 즉, MegaNatural?-AZ을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 포도씨 추출물 유래의 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 하나 이상의 화합물은 하나 이상의 폴리페놀, 하나 이상의 프로안토시아니딘, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 폴리페놀의 예는 모노머 카테킨 및 에피카테킨 염기 단위를 포함하나, 이에 제한하지 않는다.

다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 상기 담체는 용법 및 적용 방법에 따라 적절한 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 경구 투여를 위한 본 발명의 적절한 약제학적 담체는, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 자일리톨, 에리트리톨, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일을 포함하나, 이에 제한하지 않는다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제(anti-agglutinating agent), 활택제, 습윤제, 향미제, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 분말제, 정제, 캡슐제, 구강 분산성(orodispersible) 정제, 연질 캡슐제, 수성 의약품, 시럽제, 엘릭시르제, 및 포제(sachet)를 포함하나 이에 제한되지 않는 경구 투여 제형으로 제조될 수 있다.

또한 상기 약제학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 피부에 직접 적용되거나 경피 장치를 통하여 간접적으로 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 겔, 크림, 로션, 유제, 오일, 연고, 현탁제, 에어로졸, 스프레이 등과 같은 직접적인 경피 투여 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명은 조성물은 패치, 밴드, 테이프 또는 다른 밀봉 드레싱을 포함하는 경피 장치의 성분과 같은, 간접적인 경피 투여 제형으로 제조될 수 있다. 추가로 상기 약제학적 조성물은 예컨대, 경비 스프레이로서, 경피 투여될 수 있다. 피부 또는 점막 표면을 통해 흡수되는 기타 수동 또는 능동 장치가 또한 고려된다.

본 발명의 조성물을 경피 투여하기 위한 적절한 약제학적 담체로는, 경피 약물 투여에 적합한 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체 물질일 수 있다. 그러한 담체는 액체, 겔 용매, 용해화제 등과 같이 당해 분야에 공지된 물질을 포함한다. 적절한 담체는 무독성이며, 조성물의 다른 성분들에 유해하게 작용하지 않는다. 본 발명에 사용되는 적절한 담체의 예는 물, 실리콘, 액당, 왁스, 석유 젤리를 포함한다. 담체는 또한 안정화제, 보강제, 침투 강화제(penetration enhancer) 또는 경피 약물 전달을 촉진하는 다른 형태의 첨가제를 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 화합물은 적용 가능한 경우 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 단독으로 또는 다른 약제학적 활성 화합물과 함께 조합하거나 적절히 결합하여 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항산화제 및/또는 콜린에스테라제 저해제를 추가로 포함할 수 있다.

치료 방법

본 발명의 약제학적 조성물은 신경변성 질환과 관련된 상태나 위험 인자가 있는 개체에 투여될 수 있다. 상기 개체는 인간 또는 고양이, 개, 래트, 마우스, 양, 염소, 소, 원숭이, 침팬지 및 이들의 형질전환 종을 포함하나 이에 제한하지 않는 하급 포유동물일 수 있다. 약제학적 조성물은 원하는 결과를 얻는데 필요한 시간 동안 치료학적 유효량으로 개체에 투여된다. 본 발명에서 신경변성 질환은 일반적으로 단백질 또는 펩티드의 미스폴딩, 축적, 응집 및/또는 침착을 포함하여, 개체의 뇌 내 하나 이상의 단백질 또는 펩티드의 농도가 증가하는 것을 특징으로 한다. 상기 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴병, 전두측두엽성 치매(Fronto-Temporal Dementia), 및 피질 기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 및/또는 타우병증(tauopathy)을 포함하나, 이에 제한하지 않는다. 타우병증은 특히 알츠하이머병, 진행성 핵상마비(Progressive Supranuclear Palsy), 피질 기저핵 퇴행증, 은친화성 그레인 질환(Argyrophilic Grain Disease), 픽 질환(Pick's Disease), 및 가족성 전두측두엽 치매(familial fronto-temporal dementia)일 수 있다.

본 명세서에서, 본 발명의 치료 방법에서 표적이 되는 하나 이상의 단백질 (또는 "펩티드"와 상호호환적으로 사용됨)은 펩티드 결합에 의해 연결된 다중 아미노산 단위로 이루어진 분자를 의미하며, 여기서 상기 분자는 전술한 하나 이상의 신경변성 질환과 관련이 있다. 상기 단백질은 야생형, 돌연변이, 형질전환 및 합성 단백질 모두를 포함한다. 예를 들어, 상기 단백질은 특정 신경변성 질환과 관련된 특정 단백질을 포함하나 이에 제한하지 않는다. 예를 들어, 아밀로이드 베타 단백질 (즉, Aβ_1-40, Aβ_1-42) 및/또는 신경원섬유 매듭(neurofibrillary tangle)이 알츠하이머병 환자에서의 표적 단백질이다. 또한 헌팅턴병에서는 돌연변이 htt 단백질이 표적 단백질이다. 단백질이 파킨슨 질환 환자에서 α-시뉴클레인(synuclein)이 표적 단백질이고, 타우병증 환자에서는 타우 단백질이 표적이 된다.

또한 본 발명에 따른 치료 방법은 단백질 수준의 증가나 미스폴딩과 관련된 질병이 진행 중이지만, 개체가 명백한 외적 증상을 보이지 않는 경우의 개체 치료를 포함하는 것으로 생각된다. 또한 본 발명의 치료 방법은 개체가 외적 증상을 나타내는 경우, 진행 중인 질환의 증상을 치료하는 것을 포함한다.

본 발명의 조성물의 용량은 개체의 체중 및 상태, 조성물의 형태, 투여 방법 및 기간에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 화합물의 최적 용량은 뇌의 특정 영역에서 원치 않거나 미스폴딩된 단백질 농도의 감소 효과를 극대화하는데 필요한 양에 따라서 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량 범위는 1일 약 100 내지 약 1000 mg일 수 있다. 바람직하게는, 용량 범위는 1일 약 200 내지 600 mg이다. 조성물은 단일 용량 또는 분할된 양으로 매달, 두달마다, 매주, 매일 또는 1일 여러 회 투여될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

실시예 1. 합성 Aβ의 올리고머 형성에 미치는 포도씨 추출물의 효과에 대한 시험관내 시험

본 실시예는 Aβ의 올리고머화를 감소시키기 위한 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물의 효과에 대한 시험관내 시험 결과를 제공한다.

재료 및 방법

시험관내 Aβ _1-40 및 Aβ _{1- 42} 응집 분석. 포도씨 추출물 제품인 MegaNatural?-AZ를 Phenolics 사(Madera, CA)에서 입수하였다. 시험관내 Aβ_1-40 및 Aβ_1-42 응집 분석을 위해, Aβ_1-40 및 Aβ_1-42 펩티드를 American Peptide 사(Sunnyvale, CA)로부터 구입하였다. 펩티드는 HFIP (Sigma)에 용해시키고, 실온에서 밤새 건조한 후, 10분간 고속 진공(speed-vacuumed) 시켰다. 펩티드를 dH₂O에서 1 mg/ml로 용해시키고, MNG-AZ GSE 원액(stock)을 H₂O에서 400 μM로 용해시켰다. Aβ_1-40 및 Aβ_1-42 (100 ㎍/ml)을 1:1 부피에서 상이한 농도의 MNG-AZ GSE와 혼합하고, 3일간 37℃에서 인큐베이션 시켰다. Aβ 응집에 대한 MNG-AZ의 효과를 6E10 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

비접힘 단백질 광-유도 교차 결합 ( PICUP ) 분석. 새롭게 분리된 저분자량 (LMW) Aβ_1-42 또는 Aβ_1-40 펩티드를 pH 7.4에서 10 mM 포스페이트 중 50 μM의 MNG-AZ GSE의 존재 또는 부재 하에서, 1 ㎕의 1(x1), 2(x2), 5(x5) 또는 10(x10) mM 트리스(2,2'-비피리딜)디클로로루테늄(II) (Ru(bpy)) 및 1㎕의 20(x1), 40(x2), 100(x5) 또는 200(x10) mM 암모늄 퍼설페이트 (APS)와 혼합하였다. 이 혼합물을 1초간 방사선 조사시킨 다음, 5% β-머캅토에탄올이 첨가된 트리신 샘플 완충액 (Invitrogen, CA) 10 ㎕로 즉시 퀀칭시켰다. 이 반응물에 대해 SDS-PAGE를 수행하고, 은 염색(SilverXpress, by Invitrogen, CA)으로 가시화하였다. 글루타치온 S-트랜스퍼라제를 유사한 조건에서 교차 결합시키고, 대조 펩티드로 사용하였다.

결과 및 고찰

Aβ의 올리고머화 저해에 대한 MNG-AZ의 효과를 도 2에 나타낸다. SDS-PAGE를 통해 확인된 바와 같이, 합성 Aβ_1-42 (2A) 및 Aβ_1-40 (2B)의 올리고머화는 농도 의존적인 방식으로 MNG-AZ에 의해 저해되었다(도 2A 및 2B의 레인 1-6: 0, 0.2, 1, 5, 25 및 100 μM의 Aβ; CTR은 인큐베이션하지 않은 시료임). PICUP 케미스트리에 따른 Aβ_1-42 (도 2C) 및 Aβ_1-40 (도 2D)의 SDS-PAGE에서 유사한 결과가 관찰되었다 (도 2C 및 2D의 레인 1 및 2: 각각 MNG-AZ의 존재 및 부재 하에서 1x Ru(Bpy) 및 APS를 사용한 Aβ펩티드; 레인 3 및 4: 각각 MNG-AZ의 존재 및 부재 하에서 2x Ru(Bpy) 및 APS를 사용한 Aβ펩티드; CTR: 대조 모노머로 사용된 비-교차결합된 Aβ_1-42 (2C) 또는 Aβ_1-40 (2D)).

상기 결과는 MNG-AZ가 시험관내에서 Aβ의 올리고머화를 효과적으로 저해한다는 점을 일관 되게 시사한다. 또한 MNG-AZ의 저해 효과는 농도 또는 용량 의존적인 것으로 보인다. 이들 결과는 MNG-AZ GSE가 Aβ의 축적, 응집 또는 침착과 관련된 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인시켜 준다.

실시예 2. TG2576 마우스의 AD -타입 신경병증에 대한 평가

본 실시예는 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물을 투여한 형질전환 마우스 모델에서 Aβ 신경병증에 대한 시험관내 효과를 입증한다.

재료 및 방법

Tg2576 마우스 및 MNG - AZ GSE 처리. 성인 암컷 Tg2576 마우스 (Taconic, Germantown Inc.)를 다음 2개의 그룹으로 나누었다: MNG-AZ GSE 처리군 및 물 대조군. MNG-AZ GSE는 1.2 g/L의 농도로 마실 물에 첨가하여, 최종 섭취량이 200 mg/kg/day이 되도록 하였다. 이 양은 체표면적을 기준으로 종간 약물 등가량을 환산하기 위한 FDA 기준에 따를 때 인간에서의 용량 1 gm/day에 대응된다 (인간 등가량 (mg/kg) = 동물에서의 용량 (mg/kg) x (동물 체중(kg)/인간 체중(kg))^0.33) (http://www.fda.gov/cber/gdlns/dose.htm). 동물들은 액체 및 표준 식사에 자유롭게 접근하도록 하였다. 음료수는 3일마다 교체하였다. 액체 섭취량 및 동물은 연구 기간 동안 매주 모니터하였다. 5개월 후, 마우스를 표준 마취제인 케타민 HCL 및 자일라진(Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa)으로 마취시키고, 단두술로 희생시켰다. 뇌를 채취하고, 반구 절제하였다(hemidissected). 형태학적 연구를 목적으로 하나의 반구(hemisphere)를 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 생물화학적 연구를 위해서, 해마 및 신피질을 반대쪽 반구로부터 절제하고, 급속 냉동시킨 후, 액체 질소에서 분쇄하고, 80℃에서 저장하였다.

AD -타입 아밀로이드 신경병증에 대한 평가. 뇌 Aβ 펩티드의 정량적인 평가를 위해, 냉동 분쇄된 조직을 5 mol/L 구아니딘 완충액에서 균질화시키고, 0.05% (vol/vol) Tween?-20 및 1 mmol/L Pefabloc 프로테아제 저해제 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)가 첨가된 인산완충 식염수에서 1:10의 비율로 희석한 후, 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 전체 Aβ_1-40 및 Aβ_1-42를 샌드위치 ELISA (BioSource, Camarillo, CA)로 정량하였다. Tg2576 마우스에서 AD-타입 아밀로이드 부하의 스테레오로직(stereologic) 평가를 위해, 새롭게 채취한 뇌 반구를 4% 파라포름알데히드에서 밤새 침지-고정하고, 정상 두께 50 ㎛로 진동절편기(vibratome) 상에서 관상면으로 절단하였다. 무작위적 개시 위치로부터 15번째 절편마다 선택하고, 티오플라빈-S 염색을 위해 가공하였다. Zeiss 모니터 스테이지 및 MSP65 스테이지 컨트롤러가 장착된 Zeiss Axiophot 광학현미경, 고해상도 Zeiss ZVS-47E 디지탈 카메라 및 맞춤형 소프트웨어 NeuroZoom을 작동시키는 Macintosh G3 컴퓨터를 사용하여, 스테레오로직 분석을 수행하였다. 포인트 카운팅에 대해 소규모 그리드(small size grid) (50 X 50 ㎛)로 카발리에리의 원리(Cavalieri principle)에 따라 아밀로이드 부하를 평가하였다; 이 과정은, 신피질 또는 해마의 용적 백분율로 표현된 - 아밀로이드 플라크에 의해 차지되는 용적분율의 불편추정치(unbiased estimate)를 제공한다. 플라크 용적의 추정치는 X40 배율로 무작위적 표본 추출 과정에 따라 얻었다.

뇌 가용성 Aβ 올리고머의 분석. 닷 블랏 및 웨스턴 블랏 분석법으로 가용성 Aβ 올리고머의 수준을 측정하였다. 특히 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)이 보충된 PBS에서 분쇄된 피질 조직을 용해시켜, 가용성 아밀로이드 펩티드를 추출하였다. 4℃에서 1시간 동안 78,500g으로 원심분리 후, 상등액을 분석하였다. 5 ㎍의 전체 단백질을 니트로셀룰로스 막에 스팟팅하고, 10% 무지방 우유로 블록시킨 후, Aβ의 올리고머 형태를 특이적으로 인식하는 항체인 항체 A11 (Invitrogen, CA)로 인큐베이션 하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션 후, 블랏을 HRP가 결합된 염소 항토끼 항체로 인큐베이션하고, 면역반응성 신호를 강화된 화학발광 검출(SuperSignal Chemiluminescent Detection Kit, Pierce, Rockford, IL)로 시각화한 후, 농도계측식으로(densitometrically) 정량하였다 (Quantity One, Bio-Rad). 동일한 시료를 웨스턴 분석에 사용하였다. 75 ㎍의 전체 단백질을 10-20% 트리스-트리신 겔로 분리하고, 니트로셀룰로스 막에 옮긴 후, 10% 무지방 우유로 1시간 동안 블록시켰다. 막을 6E10 (Signet), 또는 A11로 인큐베이션 하였다. 면역반응성 신호를 강화된 화학발광 검출로 시각화하고, 농도계측식으로 정량하였다.

APP 가공 및 α-, β-, γ- 세크리타아제 활성. 홀로(holo)-APP의 발현을, (인간 APP 세포질내 영역의 AA 676-695에 대해 제시된) C8 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 시험하였다. 전술한 바와 같이 (Wang et al ., FASEB J 2005; 19: 659-661), sAPP-α, sAPP-β의 검출을 위해, 면역침강법을 실시하였다. 상업적으로 입수가능한 키트(R & D Systems)로 α-, β-, γ- 세크리타아제 활성을 평가하였다. 네프릴라이신 및 인슐린 분해 효소의 발현을 상업적으로 입수가능한 항체를 사용한 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

통계적 분석. 본 실시예의 모든 데이터와 수치는 평균 및 평균의 표준편차(SEM)로 나타내었다. 평균의 차는 이원 반복 측정 ANOVA 또는 양측(2-tailed) 스튜던트 t-테스트를 이용하여 분석하였다. 모든 분석에서, 0.05 수준에서 귀무 가설(null hypothesis)이 기각되었다. 모든 통계적 분석은 Prism Stat 프로그램 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA)을 사용하여 실시되었다.

결과 및 고찰

Tg2576 마우스의 신경병증에 대한 MNG-AZ GSE의 효과를 도 7에 나타낸다. 도 7A 및 7B는 5개월 처리 후, Tg2576 마우스에서 체중 (7A) 또는 액체 소비량 (7B)에 대한 MNG--AZ GSE의 효과를 보여준다. 도 7C는 닷 블랏 분석에서 HMW 올리고머 Aβ 펩티드에 특이적인 항체를 이용하여, 뇌 내 가용성 세포외 HMW-Aβ 펩티드 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 7D는 Tg2576 마우스의 뇌 내, 가용성 세포외 HMW 올리고머 Aβ 펩티드 (항체 A11) 및 모노머 Aβ 펩티드 (항체 6E10)의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7E는 MNG-AZ GSE 처리 및 대조 마우스의 뇌 내에서 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40 펩티드 농도의 측정 결과를 보여준다. 도 7F는 국소 용적 백분율로서 티오플라빈-S의 양성 용량으로 나타낸, MNG-AZ GSE 처리 및 대조 마우스에서 대뇌 피질 및 해마에서의 Aβ-아밀로이드 플라크 부하에 대한 스테레오로직 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7F의 삽입도는 비처리 대조군 (상부 패널) 및 MNG-AZ 처리 Tg2576 마우스 (하부 패널)의 신피질 (CTX) 및 해마 형성체(Hippo)에서 티오플라빈-S에 양성인 Aβ 아밀로이드 플라크의 신경병증를 보여주는 대표적인 사진이다. 수치는 군의 평균 ± SEM(각 군당 n=5-6 마우스)을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01 (양측 스튜던트 t-테스트 분석). 도 7G는 MegaNatural?-Gold의 생체내 효능에 대한 뇌의 평형 연구(parallel studies)에서 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40 펩티드 농도의 측정 결과를 나타낸 것이다.

상기 결과들은 MNG-AZ GSE가 체중 변화 (도 7A) 또는 물의 소비 (도 7B)를 포함하여, 검출가능한 역효과를 일으키지 않음을 확인시켜 준다. 5개월 처리 후 Tg2576 마우스의 신경병증과 관련하여, Aβ올리고머에 특이적인 항체를 이용한 면역-닷 블랏 분석 (p<0.05, 도 7C) 및 A11-항체를 이용한 웨스턴 블랏 (p<0.01, 도 7D)에 의해 측정한 결과, 내인성 Aβ 펩티드의 HMW Aβ종으로의 올리고머화를 2 내지 3배 감소시키는 것으로 나타났다. Tg2576 마우스의 뇌 내 HMW A11-면역활성 올리고머 Aβ 종의 감소가 모노머 Aβ 펩티드의 증가와 동시에 비례적으로 일어나는 것으로 밝혀졌으며(p<0.05, 도 7D), 이것은 MNG-AZ GSE가 Aβ 올리고머화를 저해함으로써 AD에 유익한 영향을 미친다는 것을 시사한다.

도 7G는, 평형 연구에서, 다른 상업적으로 입수가능한 GSE 제제, 즉, MegaNatural?-Gold로 Tg2576 마우스를 처리하는 경우, 대조 Tg2576 마우스와 비교할 때, Tg2576 마우스의 해마 형성체에서 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40 펩티드의 축적을 조절하지 못하였음을 보여준다. 도 7G의 결과는, MNG-AZ가 갈로일화 프로안토시아니딘의 함량이 실질적으로 낮기 때문에, 뇌 내에서 아밀로이드-타입 신경변증을 조절하는 효능에 있어서, 현재 상업적으로 입수가능한 GSE 제제 가운데 가장 특별하다는 점을 시사한다.

최근 연구에 의하면, 가능하게는 올리고머 Aβ 종에 비례하여 모노머 Aβ 펩티드를 뇌로부터 우선적으로 제거한 결과, 뇌 내에서 HMW 종으로의 Aβ 올리고머화가 저해되면, 뇌 내 전체 Aβ 펩티드의 농도, 및 궁극적으로는 아밀로이드 신경성 플라크 농도가 보충적으로 감소되는 것으로 생각되고 있다 (Morelli et al., Biochem 2005: 38: 129-145). 이러한 가설에 부합하여, 본 실시예의 결과는, HMW 올리고머 Aβ 종의 수준을 감소시키는 것 이외에도(도 7C, 7D), 장기간 MNG-AZ GSE 처리 시, 연령 및 성별이 일치하는 물로 처리한 대조 마우스에 비해, Aβ_1-42 (도 7E, 좌측 패널) 및 Aβ_1-40 펩티드의 양 (도 7E, 우측 패널) 및 아밀로이드 신경성 플라크 부하 (도 7F)가 상대적으로 감소하였음을 보여주었다.

또한, 아밀로이드 신경병증에 대한 MNG-AZ GS의 유의한 효과에 기여할 수 있는 대안적인 잠재적 기전이 평가되었다. 홀로-APP 함량의 검출가능한 변화는 확인되지 않았으며 (도 8A), α-, β-, γ- 세크리타아제의 효소 활성 또는 가용성 APPα 및 가용성 APPβ의 함량도 전혀 변화하지 않았다 (도 8B, 8C). 나아가 Aβ 분해에 원인이 되는 주된 단백분해 효소인 네프릴라이신(도 8D) 또는 인슐린 분해 효소(도 8E)의 함량에서도 검출가능한 변화가 관찰되지 않았다. 마지막으로 말초 혈청 내 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40 펩티드 수준의 검출가능하게 변화도 발견되지 않았다 (도 8F).

이러한 결과들은, 시험관내 시험에서 확인된 바와 같이, MNG-AZ GSE가 가용성 HMW 종으로의 Aβ올리고머화를 우선적으로 방지하여, 생체내에서 유의한 효과를 나타냄을 시사한다.

실시예 3. TG2576 마우스에 대한 AD -타입 인지 기능 평가

본 실시예는 Tg2576 형질전환 동물의 인지 기능에 대한 본 발명의 일부 구현예에 따른 조성물을 투여한 효과를 입증한다.

재료 및 방법

Tg2576 마우스는 5개월간 MNG-AZ GSE로 처리하고, 11월령일 때 인지 기능을 평가하였다. 공간적 학습 기억력을 전술한 모리스 수중 미로 행동 검사(Morris water maze behavioral test)로 평가하였다 (Morris, J Neurosci Methods 1984; 11: 47-60). 공간 기억력은 학습기간 동안 학습 시험의 함수로서, 물로부터 잠수 탈출 플랫폼으로 탈출하는 동물의 응답지연시간을 기록하여 평가한다. 학습기간에서 24시간 경과 후, 시각적 단서를 변화시키지 않은 채로 탈출 플랫폼을 제거하여, 검사를 시행하였다. 최소한의 자극(예를 들어, 최소한의 소음, 움직임 또는 광 또는 온도의 변화)을 주는 환경에서 광주기의 마지막 4시간의 낮 부분 동안 일정하게 행동을 분석하였다.

결과 및 고찰

도 9는 세포외 HMW 올리고머 Aβ의 감소와 동시에 MNG-AZ GSE로 처리된 Tg2576 마우스에서의 인지 장애가 경감되었음을 보여주는 것이다. 도 9A 및 9B는, 모리스 수중 미로 검사에서 측정된 것처럼, Tg2576 마우스에서 Aβ와 관련된 공간 기억력에 대한 MNG-AZ GSE의 영향을 보여준다. 도 9A는 치료 시간의 함수에 따른 (물로부터 플랫폼으로 탈출하는데 걸리는 시간을 나타내는) 지연 점수를 도시한 것이다. 도 9B는 (욕조의 나머지에서 소요하는 시간에 대해 대상 사분면 영역(target quadrant area)에서 소요하는 시간의 비율로 산출된) 대상 사분면에서 Tg2576 마우스가 소요하는 프로브 검사 시간의 비율을 나타낸 것이다. 도 9C는 닷 블랏 분석에서 HMW 올리고머 Aβ 펩티드에 특이적인 항체를 이용하여, 뇌 내 가용성 세포외 HMW-Aβ 펩티드 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 9C의 삽입도는 HMW-가용성 Aβ 함량의 대표적인 닷-블랏 분석을 보여준다. 수치는 군의 평균 ± SEM(각 군당 n=7-9 마우스)을 나타낸다; 도 9B에서, ***p<0.0001; 도 9C에서, *p<0.01 (양측 스튜던트 t-테스트 분석).

11월령의 Tg2576 마우스가, 모리스 수중 미로 검사의 학습 시험 중 공간 참고 단서를 이용하여 감춰진 탈출 플랫폼의 위치를 찾는 법을 습득하지 못한 점에서 알 수 있듯이, 공간 참고 기억 기능에서 심각한 손상을 보였다 (도 9A). 이와는 대조적으로 MNG-AZ-처리된 Tg2576 마우스의 경우, 진행성 학습 시험에서 탈출 지연 시간이 현저히 감소한 점에서 알 수 있듯이, 공간 기억력 행동 기능 시험에서 현저히 우수하였고, 공간 참고 단서를 사용하여 탈출 플랫폼을 위치를 찾는 법을 습득할 수 있었다 (이원 반복 측정 ANOVA; GSPE 대 대조군: F_1,11=4.90; GSPE-처리군에 대해 p=0.049, F_7,77 = 4.25; 시간에 대해 p=0.0005, 및 F₇,₇₇=1.63; 상호작용에 대해 p=0.140) (도 9A). Tg2576 마우스에서 MNG-AZ에 의해 유도된 인지 손상의 경감 효과는, 물 처리된 대조군 마우스에 비해 MNG-AZ 처리된 마우스가 대상 사분면 영역에서 더 많은 시간을 소요한다는 것을 보여주는, 프로브 검사에서 공간 기억력의 유지를 분석하여 확인되었다 (도 9B). 이러한 인지 기능의 향상은, 대조군 마우스에 비해 MNG-AZ 처리된 Tg2576 마우스의 뇌에서 HMW 올리고머 Aβ 종의 현저한 감소와 동시에 일어난다 (도 5C).

대조 시험에서, MNG-AZ GSE 처리가 계통, 연령 및 성별이 일치하는 야생형 동물의 인지 기능에 아무런 영향을 미치지 않는 것을 밝혀졌다 (도 10A 및 10B). 상기 결과는, MNG-AZ GSE가 선택적으로 뇌내 AD-타입 Aβ 매개 반응의 경감을 통하여, Tg2576 마우스의 공간 기억력 참고 결합에 유익할 수 있음을 시사한다.

실시예 4. 타우 단백질의 응집에 대한 MNG - AZ 의 시험관내 효과

본 실시예는 타우 펩티드 응집, 형성된 타우 응집체의 분해, 및 AD 뇌 표본으로부터 얻은 천연 타우 원섬유(fibril)의 안정성에 대한 본 발명의 구현예에 따른 조성물의 시험관내 효과를 입증한 것이다.

재료 및 방법

MNG - AZ 의 시험관내 항- 타우 응집 생물활성의 평가. 타우의 잔기 306 내지 311에 상당하는, 6-아미노산 N-아세틸화 펩티드 (Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹) 타우 펩티드를 상업적으로 입수하였다. 상기 합성 타우 펩티드는 타우 단백질의 미세소관 결합 부위에서 발견되는 짧은 펩티드 세그먼트이다. 이 짧은 펩티드 세그먼트는 타우 중합에 필수적인 것으로 입증되고 있다 (Goux et al ., J. Biol . Chem . 2004; 279: 26868-26875). 이러한 사실은 짧은 Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 펩티드가 염 존재 하에서 필라멘트로 자발적으로 응집된다는 생물리학적 관찰에 의해 뒷받침된다 (Goux et al., 2004, supra). Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 펩티드의 올리고머화는 문헌 Goux et al ., 2004, supra에 상세히 기술되어 있다. 요약하면, 합성 타우 펩티드는 pH 7.2에서 20 mM MOPS에 용해되었다. 타우 펩티드의 중합은 2.2 μM 펩티드 및 10 μM 티오플라빈-S (ThS)가 추가된 75 ㎕의 20 mM MOPS (pH 7.2) 최종 용액에서 수행되었다. 반응은 최종 농도 0.15 M로 염의 추가에 의해 개시되었다. 다양한 농도의 MNG-AZ의 부재 또는 존재 하에서 1시간에 걸쳐 타우 펩티드 응집의 역학을 평가한 결과, ThS가 응집된 펩티드 종에 결합하면서 ThS 형광이 증가되었다; 436 nm에서 형광 여기가 유도되고, 470 nm에서 형광 방출이 검출되었다.

또한, PICUP, 원편광 이색성 (Circular Dichroism: CD) 분광법, 및 전자현미경법을 사용하여, 타우 펩티드 응집체의 형성에 필요한 초기 단백질-단백질 상호작용에 대한 MNG-AZ의 영향력을 시험하였다.

PICUP 분석을 위해, 25 μM의 타우 펩티드를 등몰(25 μM) MNG-AZ의 존재 또는 부재 하에서 교차 결합시키고, 복합(multimeric) 타우 펩티드을 SDS-PAGE로 분해하고 은 염색으로 시각화하였다.

CD 분광법을 위해, 타우 펩티드을 10 mM 포스페이트(pH 7.4)의 존재 하에 1-3일간 37℃에서 인큐베이션하고, 인큐베이션 초기 (0일) 및 이후 각 3일째에 CD 스펙트럼을 얻었다.

전자현미경법을 위해, 타우 펩티드에 대한 몰비가 1:1인 GSE의 부재 또는 존재 하에 타우 펩티드를 10 mM 포스페이트(pH 7.4) 중에서 3일간 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액을 5분간 16,000 X g에서 원심분리한 다음, 상등액 200 ㎕를 크기 배제 컬럼으로 분별하였다. 타우 원섬유를 검출하고, 254 nm UV 흡광으로 ~12 분의 용리 시간에서 회수하였다.

미리 형성된( pre - formed ) 타우 응집체의 시험관내 분해에 대한 MNG - AZ 효능의 평가. 합성 Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 타우 펩티드는 MNG-AZ GSE의 부재 하에서 응집하였다. 타우 응집체를 형성한 후, 다양한 농도의 MNG-AZ를 반응물에 가하고, GSE의 추가에 따른 타우 응집체 함량의 변화를 ThS 형광으로 모니터하였다.

AD 뇌 표본으로부터 얻은 천연 타우 원섬유를 불안정화시키는 MNG - AZ GSE 효능의 평가. AD 사례의 사후 뇌 표본으로부터 PHF를 분리 및 정제하고, 일부 PHF 샘플을 5초 또는 1시간 동안 MNG-AZ (100 μM)로 처리하였다. 결과는 전자 현미경 (Hitachi H700)으로 관찰하였다.

타우 원섬유의 트립신 소화에 대한 MNG - AZ GSE 의 영향 평가. PHF를 AD 뇌 표본으로부터 분리하였다. PHF의 샘플 일부를 10분간 100 μM MNG-AZ로 처리하였다. (MNG-AZ로 전처리하거나 하지 않은) PHF의 샘플 일부를 10분간 1 ㎍ 트립신으로 추가로 인큐베이션하였다. 결과는 전자 현미경 (Hitachi H700)으로 관찰하였다.

결과 및 고찰

MNG - AZ 는 타우 응집을 저해한다. MNG-AZ GSE에 의한 타우 응집 저해 결과를 도 11에 도시하였다 (도 11에서 MNG-AZ는 MegN로 표시함). 반응 시간 함수에 따른 ThS 형광이 증가하는 점에서 알 수 있듯이, 합성 Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 타우 펩티드는 염 존재 하에서 시간이 경과함에 따라 쉽게 응집체를 형성한다(도 11A, 시간 함수에 따라 응집된 타우의 축적을 평가하는 경우의 ThS-형광; 0.22 μM, 2.2 μM 및 22 μM에서 GSE의 농도는 각각 타우 펩티드에 대한 GSE 몰비 1:10, 1:1, 및 10:1에 상당함).

MegaNatural?-AZ GSE 0.22 내지 22 μM의 추가가 용량 의존적으로 타우 펩티드의 응집을 유의성 있게 방해하였다 (일원 ANOVA, p < 0.0001); GSE의 부재 하에 산출된 평균 최대 형광 방출은 122.9 ±1.3 단위인데 비해, 0.22, 2.2 및 22 μM의 MegaNatural?-AZ GSE의 존재 하에 산출된 평균 최대 방출이 각각 114.2 ±1.1, 109.6 ±0.6 및 100.6 ±0.3 단위이다 (도 11B에 도시, 이때 타우 응집체의 최대 축적량은 6-10분에서 평균 형광 단위로 산출함). 또한 MNG-AZ GSE의 함량이 각각 순차적으로 증가하면 ThS 형광이 현저히 감소하였다 (터키 사후검정 페어 분석(Tukey post-hoc pair analysis), MNG-AZ 없음 대 0.22 μM MNG-AZ, 0.22 대 2.2 μM MNG-AZ, 및 2.2 대 22 μM MNG-AZ에 대해 p < 0.001). 흥미롭게도, 타우 펩티드에 대한 GSE의 몰비 1:10에 상당하는, 저함량의 0.22 μM MNG-AZ GSE에서 타우 펩티드 응집체의 축적이 검출가능하게 감소된 것으로 관찰되었다. 타우 펩티드 응집은 22 μM의 GSE에서 완전히 저해되었으며, 이때 타우 펩티드에 대한 GSE의 몰비는 10:1를 초과하였다 (도 11A 및 11B).

타우 응집체는 PICUP 분석 결과에 나타난 바와 같이, MNG-AZ의 존재 하에 현저히 감소하였다 (도 16, 이때 시약 농도는 다음과 같다. 대조군: Ru(Bpy) 및 APS 없음; 레인 1, 2: 1 ㎕의 1 mM Ru(Bpy) 및 1 ㎕의 20 mM APS; 레인 3, 4: 2 ㎕의 1 mM Ru(Bpy) 및 2 ㎕의 20 mM APS; 레인 5, 6: 3 ㎕의 1 mM Ru(Bpy) 및 3 ㎕의 20 mM APS; 레인 7, 8: 4 ㎕의 1 mM Ru(Bpy) 및 4 ㎕의 20 mM APS). 이것은 MNG-AZ가 부분적으로는 타우 펩티드 자가 응집의 초기 단계를 방해하여, 타우 펩티드의 응집을 저해할 수 있음을 의미한다.

원편광 이색성 분광 결과에 나타난 바와 같이(도 17A 및 17B), 타우 펩티드를 인큐베이션하는 동안(1-3 일) 타우 펩티드의 입체형태 분석으로부터, MNG-AZ가 타우 펩티드 조립(assembly)에 영향을 미친다는 점이 확인되었다. ~198 nm를 중심으로 크기가 증가하는 스펙트럼 부분에서 확인할 수 있듯이 (도 17A), GSE의 부재 시, 타우 펩티드의 무작위적인 결합이 인큐베이션 2-3 일 후에는 점차 정렬된 β-시트 입체형태(conformer)로 전환되었다. 이와는 대조적으로, 타우 펩티드에 대해 1:1의 몰비로 GSE가 존재하는 경우, GSE와 함께 타우 펩티드를 인큐베이션하면, 타우 펩티드가 정렬된 2차 구조로 변환되는 것을 방지하였다 (도 17B).

전자현미경으로 조사한 바와 같이, MNG-AZ의 부재 및 존재 하에서 타우 펩티드 입체 형태 분석 결과, 타우 펩티드가 나선형의 원시섬유(helical protofibril)로 자발적으로 응집하는 것으로 나타났다 (도 18A). 그러나 GSE의 존재는 타우 펩티드의 원시섬유 형성을 완전하게 저해하였다 (도 18B).

결론적으로 상기 관찰 결과는 MNG-AZ가 타우 단백질의 올리고머 PHF로의 응집을 저해한다는 것을 보여준다.

MNG - AZ 는 미리 형성된 타우 응집체의 분해를 촉진한다. MNG-AZ는 이미 형성된 Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹ 타우 펩티드 응집체를 분해하는 것으로 나타났다. 특히 시간 함수에 따른 ThS-양성 타우 응집체의 양이 현저히 낮아지는 점에서 알 수 있듯이, 타우 펩티드에 대한 MNG-AZ의 몰비 1:1에 상당하는, 1.1 μM의 MNG-AZ를 추가하면, 미리 형성된 타우 펩티드 응집체의 함량을 감소시킬 수 있다 (도 12A는 MNG-AZ의 농도 변화에 따른 (0.55-4.4 μM) 타우 응집체 함량의 ThS 형광을 도시한 것이다). 기대한 대로, 고농도의 MNG-AZ (2.2 μM 및 4.4 μM MNG-AZ)를 이용한 평형 연구 결과, 이미 형성된 타우 펩티드 응집체의 분해가 촉진되었다. 하기 도 12A 및 도 12B에서 MNG-AZ는 MegN로 표기하였다. ThS 형광 방출의 선형 회귀 분석으로 상이한 농도의 MNG-AZ GSE가 존재하는 경우, 타우 응집체의 용해 속도를 산출하여, 미리 형성된 타우 응집체를 분해하는 MNG-AZ의 용량 반응 효능을 조사하였다 (도 12B). MNG-AZ GSE from 1.1 내지 4.4 μM로 MNG-AZ GSE의 농도를 증가시켜 추가하면, 용량 의존적인 방식으로 미리 형성된 타우 펩티드 응집체의 분해가 더욱 촉진되는 것으로 보인다. 즉, 응집된 타우 펩티드의 분해 속도는 MNG-AZ GSE의 농도와 직접적인 연관이 있다 (Pearson R = 0.96654, p < 0.05).

MNG - AZ 는 타우 원섬유의 안정성을 저해한다. 타우 원섬유의 안정성에 대한 MNG-AZ의 효과를 전자현미경으로 조사하고 도 19에 도시하였다. 도 19A는 AD 유래의 PHF를 나타낸 것인데, PHF는 평균 너비 18.9 + 3.4 nm이고 평균 나선형 꼬임 길이가 81.3 + 10.8 nm인 전형적인 조직적 원섬유 구조를 보이고 있으며, PHF1 항체를 이용하는 면역 금(immunogold) 표지가 PHF 타이트 코어에 근접하게 포스포세린 396/404 에피토프를 위치시킨다. 흥미롭게도, GSE를 이용하여 분리된 PHF를 인큐베이션하면, GSE 노출 시간이 지속될수록 단계적인 PHF 펴짐(unfolding)이 유도되었다 (도 19B-19D); GSE를 이용하여 1 h 인큐베이션하면, 평균 나선형 꼬임 길이에는 어떠한 영향을 미치지 않으면서, 원섬유의 너비가 (31.6 + 3.8 nm로) 67% 증가하였다 (GSE-처리된 PHF의 평균 너비 및 나선형 꼬임 길이는 각각 31.6 + 3.8 및 77.4 + 10.8 nm임) (도 19C, 19D). 또한 GSE 처리가 PHF1 항체에 대한 분리된 타우 원섬유의 면역반응성을 방해하는 것으로 확인되었다 (도 19B 및 19C; 도 19A와 비교).

또한 GSE로 분리된 타우 미세섬유를 처리하면, 타우 미세섬유의 트립신 소화가 촉진되는 것으로 밝혀졌다 (도 20). AD 뇌로부터 분리된 PHF를 10분간 1 ㎍/ml 트립신을 사용하거나 (도 20C 및 20D) 사용하지 않은 채로(도 20A, 20B) 인큐베이션하였다. 도 20B 및 20D의 샘플들은 GSE (100μM GSE, 1h)로 전처리하였다. 트립신 처리 후에도 PHF는 그들의 미세섬유 외관을 유지하였다 (도 20C의 삽입도를 참조). 트립신 소화 전 GSE로 전처리하면, PHF가 AH-1?항-타우 항체에 면역반응성인 무정형의 타우 분획으로 분해되도록 하였다 (도 20D의 화살표 및 삽입도 참조). 이 결과는, 타우 미세섬유의 입체 형태에 대한 GSE-매개 조절에 의해, 세포 프로테아제에 의한 타우 분해가 촉진될 수 있음을 의미한다.

요약하면, MNG-AZ GSE는 합성 타우 펩티드가 미세섬유로 응집되는 것을 저해하고, 미리 형성된 타우 응집체를 분해하는 것으로 확인되었다. 이는, MNG-AZ가 타우와 상호작용하여, 다양한 타우-관련 신경변성 질환들의 주요한 신경변성 특징인 타우 응집체의 축적을 경감시킬 수 있음을 의미한다. 또한 MNG-AZ GSE는 신경독성인 타우 원시섬유의 생성 및/또는 안정성을 저해하여, 타우-매개 표현형을 완화시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서 상기 관찰 결과는, MNG-AZ 또는 이의 구성 화합물이 타우병증의 개시를 늦추는 예방적 수단으로서, 또는 타우-관련 신경변성 질환을 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있음을 입증하는 강력한 증가를 제공한다.

실시예 5. 타우 및 HTT 펩티드의 폴리글루타민 확장 형태( POLYGLUTAMINE EXPANDED FORM )에 대한 포도씨 추출물의 생체내 효과

질환 관련 응집성 단백질의 형질전환 과발현을 유도하는 Gal4/UAS 시스템 (Brand, et al ., Development, 1993; 118: 401-415)을 이용하는 초파리 모델은 R406W 돌연변이 타우의 과발현을 통하여 타우병증의 성공적인 모델이 되고, Q93httexon1의 과발현을 통하여 헌팅턴병의 성공적인 모델이 된다 (즉, Sang et al ., NeuroRx. 2005; 2: 438-446.; Berger et al ., Hum Mol Genet 2006; 15: 433-442을 참조). 특히 눈을 형성하는 세포 (ey > R406W)에서 R406W가 과발현되면, 눈이 극적으로 작아지거나 눈이 형성되지 않고; 형성된 눈은 비정상적인 형태를 가진다. 또한 UAS-Q93httexon1을 함유하는 형질전환세포에서 범신경적(pan-neural) 형태로 Gal4가 발현되면, 성인기 발증형 신경변성을 초래하고, 수명을 감소시킨다.

본 실시예는 각각 타우병증 및 헌팅턴병의 특정 형태의 모델이 되는 돌연변이 타우 (R406W) 또는 htt의 폴리글루타민 확장 형태 (Q93httexon1)를 지니는 초파리 표현형에 대한 포도씨 추출물의 시험관내 유용성을 입증한다.

재료 및 방법

ey > R406W 파리의 눈 표현형 조사. ey > R406W의 알을 대조군 사료(예, 파리 배지 포뮬러 4-24 블루) 또는 2.8 ㎍/ml MNG-AZ GSE (또는 도 13 및 14에서 GSPE)이 보충된 사료에 넣어 사육하였다. 초파리의 눈을 현미경으로 관찰하였다.

elav > httQ3 초파리의 수명 모니터링 . elav-Gal4 (elav > Q93httexon1)을 이용하여 범신경계 패턴에서 Q93httexon1을 과다 발현하는 수컷 초파리를 부화한지 1일 이내에 채집하여, 대조군 사료 또는 2.8 ㎍/ml MNG-AZ GSE이 보충된 사료가 든 바이얼에 10마리씩 넣었다. 살아있는 초파리의 수를 매일 측정하고, 수일 간격으로 신선한 바이얼로 이동시켰다.

결과 및 고찰

GSE 는 초파리의 눈에서의 R406W 과다 발현을 억제한다. 눈 발생 초기에 R406W 과다 발현되면 눈이 작거나 눈이 형성되지 않지만(도 13A), GSE 처리는 눈 크기 감소를 억제시켰다(도 13B)(수컷의 눈을 나타냄). ey > R406W 표현형의 수준은 시험마다 차이가 있어, 시험을 개별적으로 수행하였다. 각 실험에서 수컷 눈의 눈 점수를 부화 3일이내에 매겼다(0 = 눈 형성 안됨, 4 = 거의 정상적인 눈)(도 13C). 동일 실험에서 GSE 처리(우측)시 눈이 없는 경우의 수가 감소되었다(도 13D).

GSE 처리는 elav > httQ3 초파리의 수명을 연장시킨다. GSE 처리한 elav>Q93httexon1 초파리는, 무처리 대조군과 비교하여 전체 수명이 상당히 증가되는 것으로 확인되었다(도 14). 평균적으로, 대조군 사료에서 사육한 elav>Q93httexon1 수컷 파리의 50%이었으며, GSE에서 사육한 경우에는 20%에 불과하였다.

이러한 결과는, GSE 처리가 생체내 단백질 응집에 관여하는 2가지 독립적인 신경퇴행성 초파리 모델을 억제함을 의미한다. 이러한 사실은, GSE가 단백질 응집성 신경퇴행성 질환을 예방 및/또는 치료하는데 치료학적으로 유용할 수 있음을 시사한다.

실시예 6. Aβ 자가-조립 및 세포독성에 대한 포도씨 추출물의 효과

본 실시예는 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물의 Aβ의 자가-조립 및 세포독성을 감소시키는 효과를 입증한다.

재료 및 방법

화합물 및 시약. 화합물을 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO) 사로부터 구입하였고, 최고 순도를 사용하였다. Medysin #1 ("Med1")은 호주 그레이즈의 Aurora Fine Chemicals Ltd. 사로부터 입수하였다. MegaNatural-AZ (MNG-AZ)는 Polyphenolics (Madera, CA) 사로부터 입수하였다. (MNG-AZ 및 Med1은 Aβ와의 혼합물로 언급되는 경우 "화합물"로서 지칭됨) 물을 Milli-Q system (Millipore Corp., Bedford, MA)으로 2번 증류 및 탈이온화하였다.

펩타이드 및 단백질. Aβ 펩타이드를 기존 방법(Walsh, et al., J Biol Chem 1997; 272: 22364-22372)으로 합성, 정제 및 특정화하였다. 간략하게는, 자동 펩타이드 합성기(model 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 사전 장착한 Wang 레진 상에 9-플루오레닐메톡시카르보닐계 방법을 이용하여 수행하였다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 펩타이드를 정제하였다. 각 펩타이드에 대해 정량 아미노산 분석과 질량 분광 분석을 실시하여 조성과 분자량을 산출하였다. 정제된 펩타이드는 -20℃에서 동결건조물로서 보관하였다. 동결건조물을 60 mM NaOH에 250 μM의 농도로 용해시켜 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 스톡 용액을 준비하고, 분액을 10 mM 소듐 포스페이트, pH 7.4로 10배 희석하였다.

Aβ 스톡 용액의 제조. Aβ의 응집물이 없는 스톡 용액을 크기차 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 제조하였다. 아주 적은 모노머 분획은 저분자량(LMW) Aβ라고 칭하였는데, 그 이유는 펩타이드 실험 농도에서, 이 분획에 모노머와 저분자 올리고머의 혼합물이 신속한 평형 상태로 포함되어 있기 때문이다. Aβ를 제조하기 위해, 디메틸설폭사이드 중의 200 ㎕의 2 mg/ml (낮은 농도) 펩타이드 용액을 조 음파기(Branson Ultrasonics, Danbury, CT)를 이용하여 1분간 음파 처리한 다음 10분간 16,000 xg로 원심분리하였다. 수득되는 상층물을 Superdex 75 HR 컬럼에서 10 mM 포스페이트 완충액(pH 7.4)을 유속 0.5 ml/min으로 이용하여 분획 분리하였다. 중간 Aβ 피크를 50초간 채집하여 즉시 모든 실험에 사용하였다. 분액 10 ㎕을 아미노산 분석에서 취하여, 각 조제물내 펩타이드 농도를 정량 측정하였다. 전형적으로, Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42}의 농도는 각각 30-40 μM 및 10-20 μM이었다.

Aβ 인큐베이션 . Aβ 샘플을 상기 내용과 같이 준비한 다음, 분액 0.5 ml을 1 ml 미세원심분리관에 넣었다. 테스트 화합물을 최종 농도 2.5 mM으로 에탄올에 용해한 다음 10 mM 포스페이트(pH 7.4)로 희석하여, 10 및 50 μM 농도로 만들었다. 각 화합물 용액의 절반을 Aβ 시험관 각각에 넣어, 최종 펩타이드 농도가 각각 ~20 μM (Aβ_{1 -40}) 및 ~10 μM (Aβ_{1 -42})가 되고, 최종 저해제 농도가 5 및 25 μM이 되게 하였다. 즉, 화합물 : 펩타이드 비율은 화합물 저 농도에서는 ~1:4 (Aβ_{1 -40}) 및 ~1:2 (Aβ_{1 -42})이고, 화합물 고 농도에서는 5:4 (Aβ_1-40) 및 5:2 (Aβ_{1 -42})이다. 펩타이드만 들어있는 대조군 시험관에는 완충액 0.5 ml을 넣었다. 이들 시험관들을 교반하지 않고 37℃에서 0-7일간 인큐베이션하였다.

화학적 가교 및 올리고머 빈도 분포. 준비한 후 바로, 샘플을 PICUP 기법으로 가교시켰다. 간략하게는, 단백질 용액 18 ㎕에 1 mM Ru(bpy) 1 ㎕와 20 mM 암모늄 퍼설페이트 (APS) 1 ㎕를 첨가하였다. Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42}의 최종적인 단백질:Ru(bpy):APS 몰 농도는 각각 0.29:1:20 및 0.16:1:20이었다. 이 혼합물을 1초간 가시광에 노출시킨 다음, 반응물을 5% β-머캅토에탄올이 첨가된 트리신 샘플 완충액(Invitrogen, Carlsbad, CA) 10 ㎕로 퀀칭시켰다. 모노머와 올리고머의 빈도 분포 결정은 SDS-PAGE 및 은 염색으로 수행하였다. 간단히 설명하면, 각 가교시킨 샘플 20 ㎕를 10-20% 구배의 트리신 젤에서 전기영동하고, 은으로 염색하여 가시화하였다(SilverXpress, Invitrogen). 비가교시킨 샘플을 각 실험의 대조군으로 사용하였다. 세기 프로파일을 만들고 각 올리고머 타입의 상대적인 양을 계산하기 위해, 세기를 측정하고, One-Dscan software (v. 2.2.2; BD Biosciences Bioimaging, Rockville, MD)를 이용하여 베이스라인으로 보정한 데이타의 피크 면적을 측정하였다. 일부 실험들에서는, Ru(bpy) 및 APS의 몰량은 펩타이드에 비해 2, 5, 10 및 20배 증가되었다.

CD 스펙트로스코피 . Aβ 용액의 CD 스펙트럼을. 샘플 조제 후 또는 인큐베이션 후 2, 3, 6 또는 7일 후에, 취득하였다. CD 측정은, 반응 혼합물에서 분액 200 ㎕을 취한 다음 이를 1 mm폭의 CD 큐벳(Hellma, Forest Hills, NY)에 넣고, J-810 spectropolarimeter (JASCO, Tokyo, Japan)에서 스펙트럼을 수득하였다. CD 큐벳을 스펙트로미터에 넣기 전에는 얼음 위에 두었다. 온도를 평형화시킨 후, CD 스펙트럼을 22℃ ~190-260 nm에서 0.2 nm 해상도 및 스캔 속도 100 nm/min으로 기록하였다. 10개의 스캔을 입수하여, 각 샘플에 대한 데이타를 평균하였다. 원 데이타는 제조사의 지침에 따라 간략하게 하고 완충액 스펙트럼을 제하여 가공하였다.

티오플라빈 T ( ThT ) 결합 분석. 샘플 10 ㎕를 10 mM 포스페이트 완충액(pH 7.4)에 용해한 ThT 190 ㎕에 첨가하고, 혼합물을 간단히 볼텍싱하였다. Hitachi F-4500 형광측정기를 이용하여 10초 간격으로 3번 형광을 측정하였다. 여기 및 발산 파장은 각각 450 및 482 nm이었다. 3번의 측정값의 평균을 내고 ThT 블랭크를 제하여, 샘플의 형광을 구하였다.

전자 현미경 ( EM ). 각 샘플 10 ㎕를 글로우 방전된, 탄소-피복된 Formvar 그리드(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)에 스팟팅하여, 20분간 인큐베이션하였다. 액적에 동일 부피의 2.5% (v/v) 글루타르알데하이드 수용액을 점적하고 다시 5분간 인큐베이션하였다. 마지막으로, 펩타이드를 1% (v/v) 여과(0.2 ㎛) 한 수중 우라닐 아세테이트 용액 8 ㎕로 염색하였다(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). 이 용액을 제거하고, 그리드를 공기 중 건조시켰다. JEOL CX100 투과 전자 현미경으로 샘플을 검경하였다.

3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5- 디페닐테트라졸륨 브로마이드( MTT ) 대사. 래트의 갈색세포종 PC12 세포를 75 cm² 플라스크(#430641, Corning Inc., Corning, NY)내에서 15% (v/v) 말 혈청, 2.5% (v/v) 우태아 혈청, 100 units/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 및 25 ㎍/ml 암포테리신 B가 첨가된 F-12K 배지(ATCC, Manassas, VA)에서 37℃ 및 5% (v/v) CO₂ 대기 조건으로 배양하였다. 세포를 분석하기 위해, 배지를 제거하고, 세포를 0.5% (v/v) 우태아 혈청, 100 units/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 및 25 ㎍/ml 암포테리신 B가 첨가된 F-12K 배지로 헹구었다. 세정에 사용한 배지에 신경 성장 인자(Invitrogen, CA) 100 ㎍/ml이 첨가하고, 이를 세포에 첨가한 다음 플라스크를 교반하여, 세포 현탁물을 제조하였다. 트립판 블루로 세포 수를 측정한 다음, 세포를 96웰 분석 플레이트(Costar #3610, Corning Inc., Corning, NY)에 30,000 cells/well (90 ㎕ 총 부피/웰)의 밀도로 넣었다. 세포의 신경 성장 인자에 의해 분화되도록 48시간 두었고, 이때 독성 분석도 수행하였다.

Aβ 독성은 2가지 방식으로 분석하였다. 펩타이드를 10 mM 포스페이트(pH 7.4) 중에 0 또는 25 μM의 MNG-AZ와 함께 37℃에서 0, 2, 3 또는 7일 예비 인큐베이션하였고, 이때 펩타이드 용액 10 ㎕를 웰에 첨가하였다. 다른 방법으로는, Aβ를 MNG-AZ 없이 상기와 같이 인큐베이션하였다. 이 경우, 펩타이드 용액은 세포에 첨가하기 직전에 0 또는 25 μM MNG-AZ와 혼합하였다. 세포를 0 또는 ~2 μM Aβ-단독, 또는 MNG-AZ 처리한 2.5 μM MNG-AZ 함유성 Aβ의 농도로 24시간 처리하였다. Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 펩타이드의 펩타이드/화합물 비율은 각각 0.72 및 0.39이었다. 실제, 각각의 2가지 실험 과정에서 "0시간"의 샘플은, 성분들을 동일 시간대에 세포와 혼합하였기 때문에 동일하다.

독성을 측정하기 위해, 15 ㎕의 MTT 용액(Promega, Madison, WI)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 다시 3.5시간 동안 CO₂ 인큐베이터에 두었다. 그런 후, 세포에 가용화 용액 100 ㎕(Promega, Madison, WI)을 첨가하여 밤새 인큐베이션하여, 세포를 용혈시켰다. 이를 570 nM에서 BioTek Synergy HT 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek Instruments, Winooski, Vermont)를 이용하여 흡광도를 측정하여 MTT 환원을 분석하였다(630 nm에서의 백그라운드 흡광으로 보정함). 대조군은 소듐 포스페이트("음성"), 원섬유(fibril)("양성"), 및 1 μM 스타우로스포린 ("최고 양성")이 첨가된 배지이다. 원섬유의 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42}를 각각 최종 농도 10 μM 및 5 μM로 세포에 첨가하였다. 동일한 원섬유 조제물을 모든 실험에 사용하였고, 분석간의 가변성을 조절하였다. 분석 간 비교를 위해, 각 실험에서의 독성을 먼저 측정하였다. 각 처리군에 대해 6번 반복 수행하였고, 3번의 독립적인 실험에서 수득한 데이타를 조합하여 평균 ± S.E.로 기록하였다. 독성%, T = ((AAβ - A_medium) / (A_{staurosporine} - A_medium)) x 100이며, AAβ, A_medium, A_{staurosporine}는 Aβ-함유성 샘플, 배지 단독 또는 스타우로스포린 단독 각각의 흡광도이다.

통계 분석. 일원 배치 ANOVA 및 다중 비교 테스트를 통계 분석에 하용하였고, GraphPad Prism (version 4.0a, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)의 통계 과정으로 수행하였다. p-value<0.05는 유의한 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰

Aβ 올리고머화 . PICUP 가교가 없는 경우, Aβ_{1 -40} 모노머(도 15A, 2번 레인)와 Aβ_{1 -42} 모노머와 트리머(도 15B, 2번 레인)만 관찰되었다. Aβ_{1 -42} 트리머 밴드는 SDS-유발성 인공 산물인 것으로 확인되었다. 가교 후, Aβ_{1 -40}은 2-4 단계의 모노머와 올리고머의 혼합물(도 15A, 3번 레인)로서 존재하였지만, Aβ_1-42는 2-6단계의 모노머 및 올리고머를 포함하고 있었다(도 15B, 3번 레인).

MNG-AZ를 Aβ_{1 -40}과 화합물: 펩타이드 비율 ~5:4로 혼합한 경우, 올리고머화는 거의 완벽하게 저지되었다(도 15A, 레인 6). 트리머 밴드가 겨우 보였으며, 다이머의 세기도 약하였다. 화합물:펩타이드 비율 10배 증가시 유사한 수준의 저해가 나타났다(도 15A, 레인 7). MNG-AZ의 Aβ_{1 -42} 올리고머화에 대한 효과는 동등하게 상당하였다(도 15B). 화합물:펩타이드 비율이 ~5:2인 경우, MNG-AZ는 Aβ_1-42 무처리한 경우와 거의 동일한 올리고머 분포를 형성하였는데, 이는 올리고머화의 근본적인 완벽한 저해와 일치된다(비교, 레인 6(처리) 및 레인 2(무처리, 도 15B). 화합물:펩타이드의 비율을 10배 높이면, 비슷한 수준의 저해가 나타났다(도 15B, 레인 7). 이러한 데이타들은, Aβ 올리고머화의 근본적인 완전한 저해는 화합물:펩타이드의 비율이 ~5:2 또는 그 이하에서 달성될 수 있음을 시사한다.

화합물 대조군인 Med1은 MNG-AZ의 구조와는 다른 구조를 가진 비활성 폴리사이클릭 분자로서, 이를 이용하였다. 도 15A 및 15B의 레인 4에 나타낸 바와 같이, Aβ_1-40 및 Aβ_{1 -42}는, Med1 존재시, 각 펩타이드 단독의 경우와는 구별할 수 없는 올리고머 분포를 나타내었다. 화합물:펩타이드 비율을 10배 높이면 유사한 올리고머 분포가 나타났다(도 15A 및 15B의 레인 5).

기존에, Aβ 올리고머화의 강력한 저해는 PICUP 화합물 자체에 대한 저해제 효과로 인한 것일 수 있다는 가능성이 고려되었다. 이러한 가능성을 확인하기 위해, 가교 화학의 양성 대조군인 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST; ~26 kDa)에 대한 가교 반응을 수행하였다. 가교되지 않은 GST는 모노머 밴드가 강하게 나타났으며, 다이머 밴드는 상대적으로 약하였다(도 15C, 레인 2). GST는 본래 호모다이머로 존재할 뿐만 아니라 고도로 가교되는 종이기 때문에, 예상한 바와 같이 가교가 다이머 밴드를 진하게 하였다. Med1 존재 조건 하에, 2가지 테스트한 화합물:단백질 비율 1:1 (도 15C, 레인 4) 또는 10:1 (도 15C, 레인 5)에서, GST의 가교 변형은 관찰되지 않았다. 또한, 1:1 비율 (도 15C, 레인 6)에서 MNG-AZ와 정량적으로 비슷한 분포가 관찰되었다. GST 올리고머화에 대한 MNG-AZ의 유의한 효과는 단지 10:1 비율에서만 관찰되었는데, 이는 Aβ 실험에서 사용된 최고 농도 보다 4-8배 높았다. 이러한 효과는 화합물:GST의 직접 효과 또는 화합물에 대한 효과로 인한 것일 수 있다. 그러나, 화학적 효과는 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 올리고머화의 강력한 저해와 도 15의 레인 6에서 보여진 GST 올리고머화의 강력한 저해가 소실(또한 다른 분석에서의 저해 활성)을 설명할 수 없다. 이러한 결과는, MNG-AZ가 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 올리고머화를 모두 저해할 수 있다는 확고한 증거를 제공해준다.

원편광 이색성 스펙트럼. Aβ의 이차 구조 및 올리고머에 대한 MNG-AZ 효과를 CD 스펙트럼(도 3)으로 조사하였다. 단독 인큐베이션한 경우, Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42}는 대게 무질서한 컨포머(conformer)의 초기 스펙트럼 특징들을 보여주었다(도 3A 및 3C). 이들 스펙트럼의 주된 특징은 ~198 nm에 중심이 위치한 가장 큰 최소이다. 이후 3일간 인큐베이션하는 동안, 대규모의 배좌 전이가 이루어져, 결국 α-나선과 β-시트 특징이 혼성된 집단이 나타났다(~195, ~210, 및 ~220 nm에서의 굴곡 참조). 반대로, MNG-AZ (도 3B 및 3D) 존재 시에는 전이가 관찰되지 않았다. MNG-AZ 처리한 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 스펙트럼 모두 매우 무질서한 컨포머 집단으로 나타났는데, 이는 MNG-AZ가 성공적으로 Aβ의 이차 구조, 특히 Aβ의 β-시트의 형성을 방해하여, Aβ의 비정상적인 응집에 관여됨을 의미한다.

ThT 결합. ThT 결합을 이용하여 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 조제물내 β-시트 구조의 수준을 측정하였다. Aβ_{1 -40}은 약 2일 지연 기간이 특징적인 준-시그모이드 결합 곡선을 나타내었고, 약 3일에 ThT 결합(원섬유 형성과 상호 관련있음)을 성공적으로 증가시켰고, 약 5일 후 결합 안정 상태가 되었다(도 4). Aβ_{1 -40}을 Med1과 화합물:펩타이드 비율 1:4 또는 5:4로 인큐베이션한 경우, 결합 곡선은 무처리 펩타이드의 경우와 동일하여 실험 에러에 해당되었다(도 4A). 반면, 유의한 효과는 MNG-AZ에 의해 나타났다(도 4B). 이는, 지연 시가의 MNG-AZ 농도-의존 증가, β-시트 생장율 감소 및 최종 β-시트 수준 감소(표 1)를 포함한다. Aβ_1-40 어셈블리의 거의 완벽한 저해는 좀더 농도가 높은 (25 μM) MNG-AZ 경우에서 관찰되었다.

Aβ 어셈블리의 카이네틱스

샘플	지연 시긴 (d) a	생장율 ( FU /d) b	최대 강도 ( FU ) c
Aβ1 -40	1.6	6.1	20.7
Aβ1 -40 + 5 μM Med1	1.6	6.1	20.2
Aβ1 -40 + 25 μM Med1	1.6	5.4	19.5
Aβ1 -40 + 5 μM MNG-AZ	1.8	2.6	8.3
Aβ1 -40 + 25 μM MNG-AZ	2.4	0.8	2.5
Aβ1 -42	0	2.5	13.5
Aβ1 -42 + 5 μM Med1	0	2.5	13.5
Aβ1 -42 + 25 μM Med1	0	2.3	13.1
Aβ1 -42 + 5 μM MNG-AZ	0	1.0	2.2
Aβ1 -42 + 25 μM MNG-AZ	>7	0	1.0

무처리 Aβ_1-42 및 Med1-처리 샘플은 Aβ_1-40과 마찬가지로 어셈블리되었다(도 4C). 분석의 시간 분할에서, 형광 발현에서 지연 시기는 거의 또는 전현 관찰되지 않았고, 4일간 준-선형으로 증가된 후 일정하게 유지되었다. MNG-AZ의 Aβ_1-42 어셈블리에 대한 효과는 Aβ_{1 -40} 어셈블리에 대한 효과 보다 크게 높았다. Aβ_{1 -42}를 MNG-AZ와 화합물:펩타이드 비율 1:2로 인큐베이션하면, 1일간의 지연 시기가 관찰되었고, 거의 1일 후에 발생되는 최대 ThT 결합은 무처리 펩타이드의 경우 보다 6배 낮았다(도 4D; 표 1). 그러나, 화합물:펩타이드 비율이 5:2인 경우, β-시트 형성은 관찰되지 않았다. 따라서, MNG-AZ는 농도 의존적인 양상으로 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42}에 의한 β-시트 형성을 모두 저해하고, 저해는 특히 Aβ_{1 -42}에 대해 더 효과적이었다.

EM 결과. 이차 구조 파라미터들은 Aβ 어셈블리와 상호관련있지만, 그 자체가 어셈블리들의 4차 구조를 확립하지 않았으며, 이는 전자 분광광도계에서 더 잘 관찰되었더(도 5). 전형적인 아밀로이드 원섬유들이 무처리 Aβ_{1 -40} 및 Aβ_1-42 샘플들에서 관찰되었다(각각 도 5A 및 5B). Aβ_{1 -40} 원섬유는 비분지형의 나선형 필라멘트로서, 직경은 ~7 nm이고 나선 주기(helical periodicity)는 ~220 nm이었다. Aβ_{1 -42}는 폭 ~8 nm의 비분지형 필라멘트로서, 나선 구조의 각도는 다양하였다. 또한, Aβ₄₂ 어셈블리에서는, 보다 두껍고, 선형의 비분지형인 폭 ~12 nm의 필라멘트가 관찰되었다. 낮은 농도(5 μM)의 MNG-AZ에서는, 원섬유가 무처리 Aβ에 의해 형성된 경우 보다 더 가늘(4 vs. 8 nm)었다(도 5C). 또한, 다수의 작고 비교적 비정질의 응집체들도 관찰되었다. Aβ_{1 -40}에 25 μM MNG-AZ 처리시 원섬유의 수가 현저하게 감소되었고, 짧은 원섬유와 비정질의 응집체의 수가 상대적으로 증가되었다(도 5E). MNG-AZ의 Aβ_{1 -42} 어셈블리에 대한 효과는 원섬유 수와 길이가 감소되고, 비정질 응집체의 출현 빈도가 증가된다는 점에서는, 비슷하였다(도 5D 및 5F).

MTT 대사(독성 분석). Aβ의 독성 분석 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6A-6D에서, 좌측 그룹은 (Aβ_{1 -40} 및 Aβ_{1 -42} 2가지 펩타이드에 대해) 0일간 인큐베이션한 후의 독성 결과이고, 가운데 그룹은 Aβ_{1 -40}에 대해 3일(도 6A 및 6B), 또는 Aβ_{1 -42}에 대해 2일(도 6C 및 6D)간 인큐베이션한 후의 독성 결과이고, 우측 그룹은 (2가지 펩타이드에 대해) 7일간 인큐베이션한 후의 독성 결과이다. 실험 한 세트에서(도 6A 및 6C), 펩타이드들을 Med1 또는 MNG-AZ와 함께 인큐베이션하였다. 실험의 제2 세트에서(도 6B 및 6D)는, Med1 및 MNG-AZ는 인큐베이션한 다음 혼합물을 분화된 PC12세포에 첨가하기 직전에 첨가하였다.

Aβ_{1 -40}은 세포에 독성인 것으로 나타났으며, 독성 수준은 원섬유의 대한 독성의 ~20%이었다(도 6A). Aβ_{1 -40}과 Med1의 혼합물 역시 ~20%의 독성을 보였다. 반면에, MNG-AZ는 Aβ_1-40가 무독성이 되게 하였다. 올리고머, 프로토피브릴 및 원섬유가 형성되는 시간인 3일 동안 Aβ_1-40을 인큐베이션하면, 현저한 독성을 보이는 조성물(~60%, 도 6A의 가운데 그룹)이 형성되었다. Aβ_1-40에 MNG-AZ를 처리하면 독성은 <10%로 감소되었다(p<0.005). 3가지 실험 그룹들에서 동일한 정성적인 관련성은 7일간의 인큐베이션 이후에 관찰되었는데(도 6A의 우측), 무처리군과 Med1-처리한 Aβ_1-40 둘다 독성은 ~35-40%이었지만, MNG-AZ 처리한 Aβ_1-40의 독성은 <10%이었다. 비슷한 결과는 Aβ_1-42 실험(도 6C)에서도 관찰되었다. Aβ_1-42은 모든 시간대에 Aβ_{1 -40} 보다 독성이 높았다.

MNG-AZ가 Aβ_{1 -40} 펩타이드 어셈블리 진행 후 독성을 유도하는 것은 도 6B에 나타내었다. 3가지 인큐베이션 시간들 모두에서, 무처리 및 Med1-처리한 펩타이드는 비슷한 독성 수준을 나타내었다. 반면에, MNG-AZ 처리한 펩타이드는 무독성(0일)이거나 또는 독성이 현저하게 감소되었다(3일 또는 7일). 정성적으로 비슷한 결과들은 Aβ_{1 -42} 실험에서도 확인되었다(도 6D). MNG-AZ의 Aβ_{1 -42}에 대한 효과는 Aβ_{1 -40}에 대한 효과 보다 현저하였다.

상기한 결과들은, 일관되게, MNG-AZ가 Aβ의 올리고머화 및 뇌에서의 독성을 효과적으로 저해함을 나타낸다. 이러한 사실들은, MNG-AZ가 Aβ의 미스폴딩, 축적, 응집 또는 침착과 관련있는 질환을 예방 또는 치료한다는 증거이다.

실시예 7. 타우병증(TAUOPATHIES)의 형질전환 초파리 및 마우스 모델에 대한 포도씨 추출물의 생체내 효과

본 실시예는, 타우병증의 특정 형태인 돌연변이 tau (R406W)를 가지고 있는 초파리 표현형 및 타우병증의 형질전환 JNPL3 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물의 생체내 유용성을 설명한다.

재료 및 방법

ey > R406W 초파리의 눈 표현형 조사. 본 실험은 실시예 5에 나타낸 실험의 연속이다. 간략하게 설명하면, ey > R406W 알을 2.8 ㎍/ml MNG-AZ GSE (또는 도 21에서 GSPE)이 보강된 초파리 사료 또는 동일 부피의 물이 첨가된 대조군 사료(GSE 용매, 비히클 대조군)에 넣어 사육하였다. 초파리가 성체가 될 때까지 계속적으로 GSE(또는 비히클)을 처리하였다. 초파리의 눈을 현미경으로 관찰하였다.

JNPL3 마우스의 운동 기능 손상과 사망률 평가. JNPL3 마우스 모델은 노인성 신경퇴행을 일으키는 인간 유전성 P301L 돌연변이 tau를 발현하도록 조작된 것으로 운동 기능 부전으로 나타난다. JNPL3 마우스에는, 약 7월령에서 시작하여 전형적으로 12연령까지 발병하기 시작하는 돌연변이 tau-매개 운동 손상이 발생되기 전까지 MNG-AZ GSE를 150 mg/kg BW/day로 처리하였다. 뒷다리 신장 테스트(도 22에 기술)를 실시하여, 4점 등급 체계를 기초로 운동 기능 손상을 평가하였다.

결과 및 고찰

GSE 처리는 R406W 돌연변이 tau 초파리에서 비정상적인 눈 표현형을 억제하였다. R406W 돌연변이 tau 초파리 성체의 눈은 야생형 초파리 성체(도 21A 및 21D)와 비교하여 크기 감소와 비정상적인 형태를 특징적으로 보였다(도 21B 및 21E). 하지만, GSE-처리한 돌연변이 tau 초파리는 눈 크기가 훨씬 더 감소된 이상을 보였다(도 21C 및 21F).

눈 형태에 대한 눈 변화를 0은 눈이 없음이고, 4는 정상 눈으로 판단하는, 4점 등급 점수 체계를 이용한 성체 눈 형태의 정량적 분석에서, GSE 처리는 수컷 성체 및 암컷 R406W 돌연변이 tau 초파리의 눈 표현형을 3번의 독립적인 실험에서 현저하게 개선시키는 것으로 나타났다(도 21G) (ANOVA: P<0.0005, F= 57.29; DF=1,531; *P <0.05, 각 실험에서 GSE-처리군 vs. 무처리 초파리 비교).

GSE 처리는 JNPL3 마우스의 타우 병증의 전-임상( pre - clinical ) 표현형을 약화시켰다. 지속적인 GSE 처리는 JNPL3 마우스에게 검출가능한 수준의 부작용, 예컨대 체중 변화 또는 물 섭취율 변화는 없는 것으로 나타났다(미기재). GSE의 JNPL3 마우스 처리시, 이 마우스 모델에서 노화에 따라 정상적으로 발생하는 운동 결함의 중증도가 감소되었다(도 23A). 운동 결함 약화와 동시에, 또한 GSE 처리는 무처리 JNPL3 대조군과 비교하여 JNPL3 마우스의 사망률을 현저하게 감소시켰다(도 23B는, JNPL3 마우스의 사망률이 13개월에 ~30%로 감소됨을 보여줌)(Logrank statistics, p=0.05; 사망율; 무처리 마우스 = 27%, GSE 처리 마우스 = 0%).

총체적으로, 실시예 4, 5 및 7의 시험관내 및 생체내 증거는, MNG-AZ GSE가 tau의 tau 응집체로 미스 폴딩되는 것을 방해함으로써 tau-매개 신경병증 표현형을 좋게 조절할 수 있음을 보여주며, 이는 GSE를 tau-관련 신경퇴행성 질환, 예컨대 AD, 진행성 핵상 마비, 피질-기저핵 퇴행증, 아지오필릭 그레인 질환(Argyrophilic Grain Disease), 피크 질환, FTDP-17 등을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용할 수 있는 가능성을 뒷받침한다. 또한, GSE가 Aβ-매개(실시예 1-3 및 6에 설명됨) 및 tau-매개 신경병증 메카니즘 모두를 방해한다는 증거는, AD 예방 및/또는 치료에 MNG-AZ 적용가능성을 강력하게 뒷받침해준다.

실시예 8. 폴리글루타민 HTT -매개 HD 신경병증성 표현형에 대한 포도씨 추출물의 시험관내 효과

본 실험은, 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물의 폴리글루타민-함유성 htt 단백질 종들에 대한 시험관내 효과를 설명한다.

재료 및 방법

htt 단백질 종들은, 엑디손-유도성 폴리글루타민-함유 htt-융합 단백질을 포함하고 있는 PC-12 세포주를 이용하여 수득하였으며, 상기 단백질은 htt 단백질의 처음 17개의 아미노산 + 103개의 글루타민이 증강된 GFP (Htt103Q-EGFP)와 융합된 형태이며, 엑디손 유사체인 무리스테론 A를 이용하여 유도하면 htt 융합 단백질이 발현되어 플루오레센트 htt 응집체가 형성되게 된다(Apostol et al., Proc Nat Acad Sci 2003; 100:5950-5955). GFP-Htt 융합 단백질은. 0.2 μM 무리스테론 A로 유도하였고, 형광 현미경 및 웨스턴 블롯 분석에 의해, GFP-Htt 융합 단백질 응집체를 MNG-AZ GSE 부재 또는 존재(12.5μM 및 25μM)하에 분석하였다. GSE의 존재 및 부재시의 htt 응집체의 축적은, GFP-Htt 융합 단백질이 응집체로 사용된 후 형광 방사에 의해 나타났다.

결과 및 고찰

GSE 처리는 용량 의존적인 방식으로 플루오레센트 htt 응집체의 축적을 현저하게 감소시켰으며, 고용량의 GSE 처리로 인해 고분자량의 htt 응집체가 훨씬 더 감소되었다(도 24A). 또한, 이러한 결과는 독립적인 웨스턴 블롯 분석에서도 확인되었다(도 24B).

상기한 결과는, MNG-AZ가 폴리글루타민 htt-매개 HD 신경병증성 표현형을 간섭할 수 있다는 시험관내 증거를 제공한다.

실시예 9. 형질전환 초파리 및 헌팅턴 질환의 마우스 모델에 대한 포도씨 추출물의 생체내 효과

본 실시예는 elav > Q93httexon1 Drosophila HD 모델, 및 HD의 R6/2 형질전환성 JNPL3 마우스 모델에 대한, 본 발명의 일 구현예에 따른 조성물의 생체내 유용성을 설명한다.

재료 및 방법

HD 초파리의 운동 기능 및 사망율 평가. Elav > Q93httexon1 Drosophila HD 모델을 본 실험에 사용하였다. 이 HD 모델은, 선별을 수행하기 위한 elav-Gal4/UAS 조절 시스템, 인간 htt 유전자의 엑손 1에 의해 코딩되며 93개의 폴리글루타밀 잔기를 가지고 있는, 절단된 인간 돌연변이 htt 단백질의 범-신경성 과다 발현을 이용한다(Sang et al., NeuroRx, 2005; 2:438-446). 이것은 눈의 광수용체 세포의 파괴, 등반 능력(climbing ability)의 결함 및 수명 감소 등의 성인기에 개시되는 신경퇴행을 유발한다(Sang et al., 2005, supra).

운동 결함 분석에서, 성체 elav > Q93httexon1 초파리를 부화 1일이내(번데기 시기로부터 성체가 부화)에 채집하여, 대조군 사료 또는 MNG-AZ GSE-주입된 사료(그룹 당 30마리)를 제공하는 바이얼에 10마리씩 넣었다. 9일 및 16일에 각각, 파리를 시험관의 바닥에서 가볍게 두드려, 8초안에 미리 결정한 높이이상(예, 9일에는 최대 7 cm 표시하고, 16일에는 2 cm 표시부)으로 성공적으로 올라가는 파리의 퍼센트를 모니터링하여, 운동력을 평가하였다. 사망율 평가에서는, 수컷 Elav > Q93httexon1 초파리를 부화 1일이내에 채집하고, 표준(대조군) 사료 또는 GSE-주입된 사료를 제공하는 바이얼에 10마리씩 넣었다. 살아있는 파리의 수를 매일 측정하였다.

HD 마우스의 운동 기능 및 사망률 평가. 이러한 실험들은 Bates 박사와 동료(Mangiarini et al. Cell, 1996; 87:493-506)에 의해 최초로 제작된 R6/2 마우스 HD 모델을 이용하여 수행하였는데, 이 모델은 가장 일반적으로 사용되는 형질전환 마우스 HD 모델이다. R6/2 마우스는 148-153개의 폴리글루타민 반복체를 가지고 있는 htt 엑손 1 단편을 발현한다. 돌연변이 htt의 조절은 인간 htt 프로모터에 의해 수행된다. R6/2 마우스는 매우 공격적인 신경성 표현형을 보이며, 전임상 실현성 연구에 이상적인 명확한 실험 엔드포인트(endpoint)를 제공한다(Ramaswamy et al. ILAR J, 2007; 48:356-73).

Jackson's Laboratories로부터 입수한 난소 이식한 암컷 마우스를 무작위로 2개의 그룹 (100 mg/kg/day MNG-AZ GSE-처리구 및 H₂O-처리 대조군)으로 나누고, 야생형 수컷 마우스와 교배시켰다. 이유기 마우스에는 동일한 GSE 또는 대조군 처리 요법으로 계속적으로 제공하였다.

로타로드(Rotarod test) 테스트를 이용하여, HD의 노화성 발병 및 진행기 동안에 R6/2 마우스에서의 운동 조합의 변화에 대한 GSE-처리 효과를 분석하였다. HD 형질전환 마우스를 6주령에 가속성(1-분에 4 rpm- 40 rpm) 로타로드 장치내 좁은 로드에 있도록 훈련시고, 루타로드 수행능력을 8주령에 시작하여 매주에 1회 모니터링하였다. 각 테스트에서 3번 시도하였고, 3번 시도의 결과를 평균내어 기록하였다. 운동 기능 소실은, 동물이 장치에서 떨어지기 전까지의 대기 시간 감소로 반영되었다. R6/w 마우스의 사망률 평가에서, 마우스에게 100 mg/kg/day MNG-AZ GSE, 또는 H₂O (대조군)을 처리하고, 생존율을 매일 기록하였다.

결과 및 고찰

HD 초파리 모델에서의 운동 기능과 사망률. elav > Q93httexon1 초파리의 운동 성능은 초파리가 약한 HD 증상을 나타내는 9일째에 평가하였는데, GSE가 9일째의 등반 분석에서 운동 성능을 개선시키는 것으로 나타났다(무처리한 대조군 초파리의 ~40% 및 GSE 처리한 초파리의 ~50%는 동반 시도를 성공적으로 달성함)(도 25A). 그러나, 이러한 결과는 통계학적으로 유의하진 않았다. elav > Q93httexon1 초파리가 보다 심각한 운동 결함을 나타내는 16일째에 평가하였을 때, 현저하게 높은 비율의 GSE-처리 초파리가 동반 시도를 성공적으로 완수하였다(무처리 초파리의 ~15%, 및 GSE 처리한 초파리의 ~47%는 동반 시도를 성공적으로 완수함) (도 25B). 이러한 결과는, GSE가 초파리 HD 모델에서 생체내 생활성을 발휘하여 운동 결함을 감소시킨다는 것을 시사한다.

운동 결합 외에, 돌연변이 htt 단백질이 초파리 HD 모델에서 발현되면 수명 감소를 유도한다. GSE 처리를 계속 실시하여(실시예 5에서 논의). 이 초파리 모델의 수명 향상에 대한 효과를 평가하였다. GSE 처리가 Htt-매개 운동 결함을 현저하게 경감시킨다는 이전의 관찰 결과와 일관되게(도 25), GSE는 또한 elav>Q93httexon1 초파리의 수명을 현저하게 연장시켰다(모두 4번의 시도에서 살아남은 초파리에 대한 Kaplan-Maier 분석에서, GSE-처리가 elav > Q93httexon1 초파리의 수명을 현저하게 증가시키는 것으로 확인됨: χ2= 21.73, df = 1, p = 0.0001) (도 26).

HD 마우스에서의 운동 기능 및 사망률. R6/2 마우스의 운동 기능의 경우, 동물애 대부분 증상이 없는, 6주령에서는, 대조군과 GSE-처리군 간의 행동 차이가 없었다. 마우스의 운동 기능을, 운동 결함이 개시되는 9주령과 HD 표현형이 중간 수준의 운동 결함으로 진행되는 11주령에 계속하여 검사하였다. GSE 처리는, 도 27에 나타낸 바와 같이(막대 그래프는 로타로드에 있을 수 있는 동물의 시간(초)의 평균 + SE임, 통계 분석은 Student's t-test로 분석함, *p < 0.05는 GSE-처리군과 무처리 대조군 비교), R6/2 HD 마우스의 운동 기능을 임상 질환 개시(9주령) 및 진행(11주령) 시기 모두에서 현저하게 개선시켰다.

R6/2 마우스의 사망률 연구의 경우, GSE 처리가 R6/2 HD 마우스의 생존율을 현저하게 연장시키는 것으로 확인되었다. 무처리 R6/2 마우스의 수명 중앙값은 90일인데 반해, GSE 처리군은 HD 마우스의 수명 중앙값을 100일로 크게 증가시켰다(Kaplan-Maier 분석으로, GSE-처리가 HD 마우스의 수명을 크게 연장시키는 것으로 확인됨: X2=4.018, df =1, p=0.045) (도 28).

즉, 독립적이로, 계통발생학적으로 상이한 초파리와 마우스 종으로 제조한 HD 실험 모델을 이용한 상기 생체내 실험에서, 돌연변이 Htt-매개 병리학적 표현형을 약화시키는 MNG-AZ GSE 효과가 입증되었다. 시험관내 실험에서 나온 증거(실시예 5 및 8)과 조합하면, 이러한 결과는, HD 예방 및/또는 치료에 GSE를 사용하는 잠재적인 가치를 뒷받침한다.

본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 공개공보, 제품 설명 및 프로토콜들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 용어가 상충되는 경우, 본 발명의 의미를 사용한다.

본 발명은 전술한 유용성과 이점을 달성하도록 계획된 것이 자명하지만, 본 발명은 본원에 기술된 구체적인 구현에들로 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 본 발명의 사항의 범위내에서 수정, 변형 및 변화를 가할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

Claims (18)

1. 추출물 내 프로안토시아니딘(proanthocyanidins)의 총 중량을 기초로 갈로일화된(galloylated) 프로안토시아니딘을 0 중량% 초과 및 12 중량% 미만으로 포함하는 포도씨 추출물을 포함하는, 개체의 신경퇴행성 질환 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 알츠하이머 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 파킨슨 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 헌팅턴 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 타우병증(tauopathy)인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 타우병증이 알츠하이머 질환, 진행성 핵상 마비, 피질-기저핵 퇴행증, 아지오필릭 그레인 질환(Argyrophilic Grain Disease), 피크 질환 및 유전성 전측두엽 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 산제, 정제, 캡슐제, 구강 분산성 정제, 연질 캡슐제, 수성 의약품, 시럽제, 엘릭시르제(elixir) 및 포제(sachet)로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구 투약 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 포도씨 추출물은 추출물 내 프로안토시아니딘의 총 중량을 기초로 갈로일화된 프로안토시아니딘을 11 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 삭제
11. 삭제
12. 제1항에 있어서, 항산화제, 아세틸콜린 에스테라제 저해제 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제1항에 있어서, 1일 100 내지 1000 mg의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 용량은 1일 200 내지 600 mg인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제13항에 있어서, 투여 빈도는 매달, 격주, 매주 또는 매일인 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 투여 빈도는 매일인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 투여는 단회 투여인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제16항에 있어서, 상기 투여는 분할 투여인 것을 특징으로 하는 조성물.
    

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