JP6797840B2 - フペルジンを含有する組合せ組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、全体として、フペルジン（huperzine）を含有する組成物、その調製法及び神経変性疾患を治療するためのその使用に関する。より詳しくは、本発明は、神経変性疾患又は病態、特にアルツハイマー病に罹患している対象における神経変性衰退及び不全の予防又は治療に使用する組合せ組成物に関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、その急速な増加、長期持続、介護者の負担、及び介護の高額な経費から、公衆衛生上の大きな問題である。アルツハイマー病において、最も特徴的な神経病理的な変化は、変性する神経突起及び神経細胞体で蓄積する対らせん繊維束の存在で特徴付けられる神経原繊維変化及び老人斑である。代表的な老人斑は、中央にあるβ―アミロイドペプチドの有芯を有し、その周囲を変性神経突起のコロナ（corona）が取り囲んでいる（Esiri MMら、J Neurol Neurosurg Psychiatry (1998) 65 : 29-33）。対らせん繊維のタンパク質組成は不明確であるが、複数の微小管関連タンパク質がこれらの病変において関係することが示唆されている。そのため、アルツハイマー病に罹患した脳内では、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ ２）のレベルは通常低下することが報告されている[Adlard PA, Vickers JC; Acta Neuropathol (2002) 103 : 377-383; Hsia AYら; Proc Natl Acad Sci USA (1999) 96: 3228-3233]。
現時点では、アルツハイマー病の治療法はない。アルツハイマー病の有効な治療法を開発するための現在の取り組みは、アルツハイマー病の患者はコリン作動性神経伝達系に大幅な障害があり、その結果、中枢神経系のアセチルコリン濃度が減少するという知見に基づいている。治療の取り組みには、アセチルコリン合成のための前駆体、コリン作動薬、アセチルコリン遊離エンハンサー及びアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤が含まれる。現在までに、最も有効な取り組みは、タクリン、ドネペジル、リバスチグミン等のＡＣｈＥ阻害剤の使用である。
アルツハイマー病の発症は、中枢神経系の毒性β―アミロイドペプチド（Ａβ）の蓄積及び沈着によって引き起こされることが従来研究で示されている[Callizotら、Neurosc. Res. (2013) 91(5) : 706-16]。Ａβの蓄積を基礎とする機構を標的とする漢方療法は、該疾患を防止するための有効な取り組みでありうる。パーキンソン病（ＰＤ）は米国において第２の最も一般的な神経変性障害である。緩慢な動作、休止時振戦、筋固縮及び歩行障害を含むパーキンソン病の主な運動症状は、黒質（ＳＮ）におけるドーパミン作動性ニューロンの損失によって引き起こされる。疫学調査によれば、殺虫剤の使用は、恐らくは黒質におけるミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの活性が低下することを介して、パーキンソン病のリスクを増加させ、その結果パーキンソン病が発症されることを示唆している。１−メチルー４−フェニルー１，２，３，６―テトラヒドロピリジン（ＭＴＰＴ）とその誘導体（ＭＰＰ＋）、ミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤は、孤発性パーキンソン病の毒素モデルを作製するために広く使用されている。この毒素は生体外でパーキンソン病様病態を引き起こすために使用されている[Visanjiら、FASEB J. 2008; 22(7) :2488-97]。
ルー・ゲーリック病又は典型的運動ニューロン疾患とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンの両方が関係した最も一般的な形態の運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）である。この形態の疾患は、四肢の脱力及び萎縮によって特徴付けられる。筋脱力と萎縮は身体の両側で起こる。罹患者は、体がぐったりして、腕と脚を動かす能力、及び身体をまっすぐに保持する能力を失う。他の症状には、痙縮、痙攣、筋痙攣、及び線維束性収縮が含まれる。話すことは、早口で不明瞭となるか鼻にかかったようになることがある。横隔膜及び胸壁が正常に機能しないと、ヒトは機械の助けなしでは呼吸能力を失う。前記疾患は通常ヒトの精神又は人格を害しないが、最近の研究によれば、ＡＬＳの患者の中には、言語流暢性、意思決定、及び記憶を含む認知的問題を生じうることが示唆されている。ＡＬＳ患者の大部分は、通常発症から３〜５年以内に呼吸不全で死亡する。ＡＬＳの複合した病態生理は、多くの潜在的治療標的を呈している。しかしながら、広範囲の物質が研究されたものの、リルゾール（Rilutek：登録商標）、グルタミン酸塩遊離阻害剤だけが一貫した効果を示しており、前記疾患の唯一の承認薬である。
しかし、リルゾールによる恩恵はあまり多くはない。それはＡＬＳ患者の生存を数ヶ月延ばす（〜７％）が機能尺度では最小の効果を有する。現状では、ＡＬＳは、利用できる有効治療法の選択肢が限定的である疾患であり続けている。他の作用機序：成長因子、イオン変質、炎症、ミトコンドリア変化、アポトーシス等を介して作用する有益な物質に対する満たされていない要求がある。
セスキテルペンアルカロイドであるフペルジンＡは、Lycopodium serratumとしても知られる中国のヒカゲノカズラ科のトウゲシバ（Huperzia serrata）から単離されている。該植物は、主にはアルカロイド、トリテルペン類、フラボン類及びフェノール酸類を含有する。リコポジン型、リコジン型（フペルジンＡが属する）、フォーセチミン型、及びその他の型を含む４つの主要なリコポジウムアルカロイドの構造分類が特定されている。
フペルジンＡとフペルジンＢは強力なアセチルコリンエステラーゼ阻害剤であり、アルツハイマー病の有望な治療上のアプローチである。フペルジンＡについては、アルツハイマー病と他の中枢神経疾患の治療における使用可能性について研究がなされている [Xuら、Acta Phamacol. Sin. (1999), 20 : 486-49; Wangら、J Neural Transm 2009, 116 : 457-465 ]。その結果において、フペルジンＡはアルツハイマー病に対し、特に１日の用量が３００〜５００μｇのときに、忍容性が良好で有益であることが示されている[Wangら、2009既述 ; Xingら、Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, volume 2014, Article ID 363985, 10 pages]。アセチルコリンエステラーゼ阻害作用に加えて、フペルジンＡは他の様々な薬理作用を有している。これらの非コリン作動性の作用は、例えば、ＮＭＤＡ受容体に対する拮抗作用、β―アミロイド、フリーラジカル及び低酸素虚血誘導損傷に対する神経細胞の保護は、アルツハイマー病の治療に重要でありうる。中国の薬草又は薬草抽出物、例えば、緑茶ポリフェノール類又はカテキン類、オタネニンジン及びジンセノサイド、イチョウ及びＥＧｂ ７６１、タデ、ライコウトウからのトリプトリド、キョウチクトウの花からの多糖類、霊芝胞子からの油、フペルジン及びステホリジンは、in vitro及びin vivoの条件下で、神経毒１−メチルー４−フェニルー１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）及び６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）によって引き起こされるドーパミンニューロン変性及び症状を減じることを示す研究結果が増えている。加えて、蓄積されているデータによれば、中国の薬草又は薬草抽出物は、神経細胞の生存及び神経突起の成長を促進し、脳障害の機能回復を容易化することが示唆されている[Liang-Wei Cheng et al. in CNS & Neurological Disorders-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders), 2007, 6(4), 273-281]。
動物及び臨床研究によると、フペルジンＡは、経口投与されたとき、急速に吸収されて体全体に分布し、緩やかな速度で消失すること、及びフペルジンＡは、重大な肝臓毒性の可能性のあるタクリンのような他の薬物に比べて毒性が低いことが示されている。
植物トウゲシバの少量アルカロイドであり、フペルジンＡの類縁体であるフペルジンＢ（Hup B）は、フペルジンＡに比べるとアセチルコリンエステラーゼ阻害の点で作用は低く限定的である。しかしながら、フペルジンＢは、作用持続がより長いフペルジンＡよりも高い治療指数を有している。行動研究によると、Hup Bは、成人及び老化マウスにおいて、記憶保持と記憶想起を改善し、マウスにおいて、スコポラミン、亜硝酸ナトリウム、電気痙攣ショック及びシクロヘキシミドによって誘導される記憶保持の障害を回復に向かわせた[Zhu X. D.ら、Acta Pharmacol. Sin. (1988) 9(6) : 492-497]。また最近の研究によると、Hup Bの新たな１６―置換誘導体が、過酸化水素誘導の神経毒性を減ずることにより、神経保護効果を表すことが示されている[Shiら、Acta Pharmacologica Sinica (2009) 30 : 1195-1203]。
複数の合成されたフペルジンＡ類似体が存在する。例えばフプリンＸは、フペルジンＡの二式炭素環部分構造とタクリンの４−アミノキノリン部分構造を組み合わせた融合産物である[Badia Aら、Bioorg Med Chem 1998, 6:427-440]。他の合成類似体はＺＴ−１であり、これは生体内で徐々に加水分解されてフペルジンＡになるプロドラッグである。これらの「ハイブリッド」産物は、低い用量で効果があり、それゆえ副作用が少ないため興味深い。
ヒドロキシ桂皮酸類は、果物、野菜及びコーヒーに存在するフェノール性植物化学物質である。このポリフェノール類のグループには、カフェ酸、フェルラ酸、クロロゲン酸、イソフェルラ酸及びクマル酸が含まれ、これらは抗酸化活性と関連した有益な効果を奏することが知られている。
フェルラ酸は、４−ヒドロキシー３−メトキシ桂皮酸とも命名され、様々な植物に広く見出されるフェノール酸である。フェルラ酸は、抗炎症作用、抗殺菌作用、抗酸化作用及び抗腫瘍作用等の広範な薬理作用を有している。その様々な有益性の中で、アルツハイマー病に対するフェルラ酸の抑制作用に多くの注目が集まっている[Nakamura, Sら、Geriat. Med. 46, 1511-1519 (2008)]。
ヒドロキシ桂皮酸誘導体であるカフェ酸は、抗酸化作用、抗炎症作用、鎮痛作用及び免疫調節作用を有している。またカフェ酸の神経保護作用を報告している文献がある[Anwar J.ら、Pharmacol Biochem Behav; 2:386-394 (2012), Jeong CHら、Chin Med, 6 : 25 (2011)]。
フペルジン類及びヒドロキシ桂皮酸類は神経変性疾患の治療のための臨床試験で別々に使用されてきたが、アルツハイマー病に対するフペルジンとヒドロキシ桂皮酸類を組み合わせた組成物の効果を評価した研究はない。
ＷＯ２０１１／１３２１５７には、フペルジンＡを含有する徐放性製剤とアルツハイマー病等の医学的状態を治療するために該製剤を使用する方法が開示されている。
ＥＰ２３４３０６５ Ａ１には、フェルラ酸とマトリン化合物の組み合わせを含む組成物とアルツハイマー病等の種々の疾患を治療するためにその治療上の使用が開示されている。
ＷＯ２００８／１０８８２５には、特にパラカルノシン酸、パラＬ―ドーパ、パラカフェ酸又はこれらの薬理学的に許容されるプロドラッグ、塩又は溶媒和物を含む群から選択される神経保護量の化合物を含む医薬組成物が開示されている。
このように、上記先行技術には、フペルジンとヒドロキシ桂皮酸類の特定の組み合わせは開示されていない。
このため、本発明者は初めて、フペルジンとヒドロキシ桂皮酸類は、アルツハイマー病の治療のために組み合わせて使用したときに、相乗作用を有することを示した。本発明者は、グルタミン酸塩（glutamate）で損傷させたラットの初代皮質ニューロンに対するトウゲシバ（Huperzia serrata）の植物抽出物の神経保護作用をアルツハイマー病のin vitroモデルで検討した。得られた結果及び前記抽出物の化学的プロフィールの解析に照らして神経保護作用に関与する３つの潜在的化合物：フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸を特定した。これらの化合物の相乗作用についても検討した。
前記化合物の作用についてはさらに、β―アミロイドペプチドで損傷させた初代皮質ニューロンであるアルツハイマー病の第２のin vitroモデルで検討した。
それゆえ、本発明の１つの目的は、アルツハイマー病及び他の中枢神経疾患の治療のための組合せ組成物とその調製方法を提供することである。
本発明は、有効成分として相乗作用的に有効な量で
（ｉ）天然又は合成起源のフペルジン、又はフペルジンを含有する植物抽出物、並びに
（ｉｉ）天然又は合成起源のヒドロキシ桂皮酸類、アントキサンチン類及びアントシアニン類からなる群から選択される少なくとも２つの化合物、それらの混合物、及びそれらを含有する植物抽出物
を含む、組合せ組成物である。
（ｉ）天然又は合成起源のフペルジン、又はフペルジンを含有する植物抽出物、並びに
（ｉｉ）天然又は合成起源のヒドロキシ桂皮酸類、アントキサンチン類及びアントシアニン類からなる群から選択される少なくとも２つの化合物、それらの混合物、及びそれらを含有する植物抽出物
を含む、組合せ組成物である。
前記フペルジンは、フペルジンＡ、フペルジンＢ、それらの類似体及びそれらの混合物からなる群から選択される。本発明においては、前記組成物は、フペルジンＡ単独、フペルジンＢ単独、それらの類似体単独、又はフペルジンＡ、フペルジンＢ及び類似体の２以上の組み合わせを含むことができる。
前記活性化合物は、そのまま又は薬理学的に許容できる塩の形態で使用することができる。
前記活性化合物は、天然起源又は合成物である。非天然起源の活性物質は、従来技術に従って、天然起源化合物の側鎖基及び／又は側鎖原子を修飾することにより適当に調製することができる。
植物、特にトウゲシバの抽出物も使用することができる。したがって、本発明においては、前記組合せ組成物は、前記活性化合物の水性混合物若しくは有機混合物又は植物抽出物でありうる。この抽出物は従来技術によって調製することができる。
本発明の好ましい態様においては、少なくとも２つの化合物（ｉｉ）は、天然又は合成起源のヒドロキシ桂皮酸類である。本発明においては、前記ヒドロキシ桂皮酸類はα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、カフェ酸、チコリ酸、桂皮酸、クロロゲン酸、ジフェルラ酸、クマル酸、クマリン、フェルラ酸、シナピン酸からなる（又は含む）群から選択される。
最も好ましい態様においては、前記ヒドロキシ桂皮酸類はカフェ酸及びフェルラ酸である。有利には、フペルジン、特にフペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸を異なる比率で使用し、フペルジン／カフェ酸／フェルラ酸のモル比は、例えば、０．０１／０．５／１０〜０．１／５／１０００、優先的には０．０１／０．５／１０〜０．１／０．５／１０００の間であり、有利には０．０１／０．５／１００に等しく、他の可能な比率は０．０１／５０／１００又は０．０１／５／１００である。前記薬物の実際の投与量は、治療する病態、投与する正確な組成物、年齢、体重、個々の患者の反応、患者の症状の重症度、及び選択した投与ルートを含む関連状況に照らして、医師によって決定されると理解される。それゆえ、前記用量の範囲は、一般的なガイダンス及びここでの教示を提供することを意図しており、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の有利な点は、患者に対して実体のある臨床的利点を組み合わせでもたらしつつ、各化合物は併用療法において低用量で使用することができることである。上記併用療法は、前記化合物が個々で低い効果又は効果がない用量で実際に効果がありうる。したがって、本発明の特定の利点は、各化合物の最適下限用量、換言すれば、通常処方される治療用量よりも少ない用量、好ましくは治療用量の１／２、より好ましくは１／３、１／４、１／５、又はさらにより好ましくは治療用量の１／１０を使用できる点にある。特定の例においては、治療用量の１／２０、１／３０、１／５０、１／１００又はさらに少なく使用される。このような治療量以下の用量においては、本発明に係る組み合わせはアルツハイマー病及び他の中枢神経疾患の治療のために十分に有効である一方、副作用を呈さない。
本発明の他の目的によれば、神経変性疾患又は病態の予防、抑制、遅延又はそれに罹患している対象の神経変性の治療における使用のための、前記組合せ組成物が提供される。
より詳しくは、本発明は、以下の群から選択される疾患又は病態の予防、抑制、遅延又はそれに罹患している対象の神経変性の治療における使用のための、前記組合せ組成物が提供される。
アルツハイマー病（ＡＤ）；ＡＤ型老人性認知症（ＳＤＡＴ）；パーキンソン病；レビー小体型認知症；血管性認知症；自閉症；重症筋無力症；ランバート・イートン病；軽度認知障害（ＭＣＩ）；加齢性記憶障害（ＡＡＭＩ）；及び加齢に関連する問題；パーキンソン病、脳炎後パーキンソン症候群、鬱病、統合失調症、筋ジストロフィー（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー及びブルース型筋ジストロフィーを含む）、フックスジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、角膜ジストロフィー、反射性交感神経性ジストロフィー症候群（ＲＳＤＳＡ）、神経血管ジストロフィー、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む運動ニューロン疾患、多発性硬化症、体位性低血圧、外傷性神経変性、バッテン病、コケイン症候群、ダウン症候群、大脳皮質基底核神経節変性症、多系統萎縮症、脳萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症、歯状核赤核萎縮症、淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性萎縮症、視神経炎、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、注意欠陥障害、ウイルス感染後脳炎、ポリオ後症候群、ファール症候群、ジュベール症候群、ギラン・バレー症候群、滑脳症、もやもや病、神経細胞移動障害、自閉性症候群、ポリグルタミン病、ニーマン・ピック病、進行性多巣性白質脳症、偽脳腫瘍、レフサム病、ツェルベルガー症候群、核上麻痺、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症２型、レット症候群、シャイ・ドレーガー症候群、結節性硬化症、ピック病、慢性疲労症候群、神経障害（遺伝性神経障害、糖尿病性神経障害及び抗有糸分裂性神経障害を含む）、プリオンに基づく神経変性（クロイツフェルト・ヤコブ病（ＯＤ）、変異型ＣＪＤ、新変異型ＣＪＤ、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、ＧＳＳ、ＦＦＩ、クールー及びアルパーズ症候群を含む）、ジョセフ病、急性散在性脳脊髄炎、くも膜炎、中枢神経系の血管病変、四肢神経機能喪失、シャルコー・マリー・トゥース病、心不全、喘息、及び黄斑変性に対する感受性、のいずれかに罹患している又はいずれかに感受性のあるヒト又は非ヒト動物対象における、（ｉ）非認知的神経変性、（ｉｉ）非認知的神経筋変性、（ｉｉｉ）運動感覚神経変性、又は（ｉｖ）認知、神経及び神経筋障害不在の受容体機能不全又は喪失。前記組成物は特にアルツハイマー病の治療及び予防に役に立つ。
アルツハイマー病（ＡＤ）；ＡＤ型老人性認知症（ＳＤＡＴ）；パーキンソン病；レビー小体型認知症；血管性認知症；自閉症；重症筋無力症；ランバート・イートン病；軽度認知障害（ＭＣＩ）；加齢性記憶障害（ＡＡＭＩ）；及び加齢に関連する問題；パーキンソン病、脳炎後パーキンソン症候群、鬱病、統合失調症、筋ジストロフィー（顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー及びブルース型筋ジストロフィーを含む）、フックスジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、角膜ジストロフィー、反射性交感神経性ジストロフィー症候群（ＲＳＤＳＡ）、神経血管ジストロフィー、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む運動ニューロン疾患、多発性硬化症、体位性低血圧、外傷性神経変性、バッテン病、コケイン症候群、ダウン症候群、大脳皮質基底核神経節変性症、多系統萎縮症、脳萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症、歯状核赤核萎縮症、淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性萎縮症、視神経炎、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、注意欠陥障害、ウイルス感染後脳炎、ポリオ後症候群、ファール症候群、ジュベール症候群、ギラン・バレー症候群、滑脳症、もやもや病、神経細胞移動障害、自閉性症候群、ポリグルタミン病、ニーマン・ピック病、進行性多巣性白質脳症、偽脳腫瘍、レフサム病、ツェルベルガー症候群、核上麻痺、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症２型、レット症候群、シャイ・ドレーガー症候群、結節性硬化症、ピック病、慢性疲労症候群、神経障害（遺伝性神経障害、糖尿病性神経障害及び抗有糸分裂性神経障害を含む）、プリオンに基づく神経変性（クロイツフェルト・ヤコブ病（ＯＤ）、変異型ＣＪＤ、新変異型ＣＪＤ、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、ＧＳＳ、ＦＦＩ、クールー及びアルパーズ症候群を含む）、ジョセフ病、急性散在性脳脊髄炎、くも膜炎、中枢神経系の血管病変、四肢神経機能喪失、シャルコー・マリー・トゥース病、心不全、喘息、及び黄斑変性に対する感受性、のいずれかに罹患している又はいずれかに感受性のあるヒト又は非ヒト動物対象における、（ｉ）非認知的神経変性、（ｉｉ）非認知的神経筋変性、（ｉｉｉ）運動感覚神経変性、又は（ｉｖ）認知、神経及び神経筋障害不在の受容体機能不全又は喪失。前記組成物は特にアルツハイマー病の治療及び予防に役に立つ。
本発明のさらに別の目的によれば、神経変性疾患の予防、抑制、遅延又はそれに罹患している対象の神経変性の治療のための方法であって、該方法が前記対象に本発明に係る組成物の有効量を投与することを含む方法が提供される。
ここで述べたように、本発明に係る組合せ組成物は、医薬組成物、特にアルツハイマー病の治療に役立つ医薬組成物として調製することができる。該組成物は、薬理学的に許容される賦形剤とともに前述した活性化合物（ｉ）及び（ｉｉ）を含むことができる。
本発明のさらなる形態においては、前記組合せ組成物は、栄養補助的に許容される賦形剤とともに前述した活性化合物（ｉ）及び（ｉｉ）を含む栄養補助組成物として調製することができる。
本発明に係る組合せ組成物は、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与又はこれらの組み合わせのために処方することができる。
経口投与に対して好適な形態には、錠剤、圧縮又は被覆丸剤、糖衣錠、サチェット、トローチ、顆粒剤、ハード又はソフトゼラチンカプセル、舌下錠、シロップ、液剤、懸濁剤、エアロゾルが含まれ、非経口投与に対しては、本発明は、水性若しくは非水性溶液又はエマルジョンを含むアンプル又はバイアルを提供し、直腸投与に対しては、親水性又は疎水性の担体をもつ坐薬が提供され、軟膏や経皮送達のような局所適用に対しては、例えば、パッチのような従来技術として知られている適当な送達システムが提供される。
前記組成物中の活性原料の好ましい用量は、当業者の一般的知識に基づき、当業者によって決定される。該用量は１又は複数のアウトレットで毎日取得することができる。
本発明によれば、前記組成物は、即効性、徐放性、又は持続放出性用に処方することができる。本発明のさらなる形態においては、前記組合せ組成物は、神経変性疾患又は病態の治療又は予防において、同時、個別又は逐次使用とすることができる。
本発明はさらに、フペルジンＡ／カフェ酸／フェルラ酸を１／０．１／０．１〜１／０．４／０．６の間に含まれるモル比、優先的には１／０．１／０．５のモル比で含む、トウゲシバの抽出物である。該抽出物は、良好な治療効果を有しており、神経変性疾患又は病態の治療又は予防における同時、個別又は逐次使用に好適である。
以下、本発明を下記の限定されない実施例及びそれらの添付図面１〜１１でより詳しく記載する。
実施例１：トウゲシバ（ＨＳ）抽出物による、神経細胞に対するグルタミン酸塩毒性の防止
グルタミン酸塩の興奮毒性は、神経変性疾患を含む急性神経疾患における神経細胞死の一因である。カルシウム恒常性の欠如は、グルタミン酸塩により誘導される細胞死の重要な媒介因子である。本発明者は、トウゲシバからの抽出物を、グルタミン酸塩により損傷された初代皮質ニューロンに対するグルタミン酸塩の毒性作用を防止又は軽減するそれらの能力に関して試験した。
グルタミン酸塩の興奮毒性は、神経変性疾患を含む急性神経疾患における神経細胞死の一因である。カルシウム恒常性の欠如は、グルタミン酸塩により誘導される細胞死の重要な媒介因子である。本発明者は、トウゲシバからの抽出物を、グルタミン酸塩により損傷された初代皮質ニューロンに対するグルタミン酸塩の毒性作用を防止又は軽減するそれらの能力に関して試験した。
１．試験の項
トウゲシバ（ＨＳ）抽出物は、Zha Shenghuaら及びSun Yuan-Mingら［Zha Shenghuaら, Natural Product Research and Development (2005) 17(1) : 7-10 ; Sun Yuan-Mingら, Chinese Traditional and Herbal Drugs (2002) 33(12) : 1078-1092］により記載されているように、乾燥植物材料から、慣例の還流、超音波及びマイクロ波により補助される抽出を含むいくつかの方法によって得られる。ここで使用した溶媒は純水であった。実施した各抽出物中のフペルジンＡ（ＨＡ）及びポリフェノール酸の用量を決定するためにＨＰＬＣに基づく分析法を用いた。
トウゲシバ（ＨＳ）抽出物は、Zha Shenghuaら及びSun Yuan-Mingら［Zha Shenghuaら, Natural Product Research and Development (2005) 17(1) : 7-10 ; Sun Yuan-Mingら, Chinese Traditional and Herbal Drugs (2002) 33(12) : 1078-1092］により記載されているように、乾燥植物材料から、慣例の還流、超音波及びマイクロ波により補助される抽出を含むいくつかの方法によって得られる。ここで使用した溶媒は純水であった。実施した各抽出物中のフペルジンＡ（ＨＡ）及びポリフェノール酸の用量を決定するためにＨＰＬＣに基づく分析法を用いた。
種々の抽出方法から得られたＨＡ／ＣＡ／ＦＡ比を以下の表１に示す。
ＨＳ抽出物の神経保護効果を、グルタミン酸作動性ニューロンを特異的に可視化する神経突起ネットワークの定量化により評価した。
ラット皮質ニューロンを、Singerら，1999［J. Neuroscience 19(7), 2455-2463］及びCallizotら 2013［J. Neurosc. Res. 91(5), 706-716］により記載されているように培養した。
簡単に述べれば、妊娠１５日目の妊娠雌（ウィスター；JanvierLabs、サン・ベルトヴァン、フランス）を頚椎脱臼により屠殺した。胎児を回収し、すぐに２％ペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液（ＰＳ; Pan Biotech、アイデンバッハ、ドイツ）と１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Pan Biotech、アイデンバッハ、ドイツ）を含む氷冷Ｌ１５ライボビッツ培地（Pan Biotech、アイデンバッハ、ドイツ、バッチ：４１２０４１３）に入れた。皮質を、終濃度０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡのトリプシン−ＥＤＴＡ（Pan Biotech、アイデンバッハ、ドイツ）溶液で３７℃にて２０分間処理した。ＤＮアーゼＩグレードＩＩ（終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ；Pan Biotech、ドイツ）及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Invitrogen、セルジー・ポントワーズ、フランス）を含有する、４．５ｇ／リットルのグルコースを含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Pan Biotech、アイデンバッハ、ドイツ）の添加によって解離を停止させた。細胞を１０ｍｌピペットのチップに３回強制的に通すことによって機械的に解離させた。次に、細胞を５１５ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをＢ２７サプリメント（Invitrogen、セルジー・ポントワーズ、フランス）の２％溶液、２ｍｍｏｌ／リットルのＬ−グルタミン（Pan Biotech、アイデンバッハ、ドイツ）、２％のＰＳ溶液、及び１０ｎｇ／ｍｌの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Pan Biotech、アイデンバッハ、ドイツ）を含むニューロベーサル培地（Invitrogen、セルジー・ポントワーズ、フランス）からなる規定培養培地に再懸濁させた。生細胞をノイバウワーサイトメーターにてトリパンブルー排除試験を用いて計数した。これらの細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでプレコートされた９６ウェルプレート（Corning Biocoat、トゥックズベリー、ＵＳＡ）にウェル当たり３０，０００の密度で播種し、空気（９５％）−ＣＯ２（５％）インキュベーター内で、３７℃で培養した。培地は２日毎に交換した。
１３日目に、培養物をトウゲシバ抽出物の不在下又は存在下でグルタミン酸塩４０μΜに２０分間曝した。次に、これらの細胞を洗浄し、トウゲシバ抽出物を含有する又は含有しない新たな新鮮培地を加えてさらに４８時間置いた。
その後、これらの細胞を冷エタノール／酢酸（９５：５ｖ／ｖ）溶液により５分間、−２０℃で固定した。０．１％のサポニン（Sigma）での透過処理後、細胞を、１％ウシ胎仔血清（Invitrogen）及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／４００希釈の微小管関連タンパク質２(microtubule-associated-protein 2)（ＭＡＰ２；Sigma）に対するマウスモノクローナル抗体とともに２時間インキュベートした。この抗体を、１％ウシ胎仔血清及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／４００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）で室温にて１時間可視化した。
ニューロン生存率の評価：各条件につき６ウェルを評価し、ウェル当たり２０枚の写真を、ＩｎＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）１０００（GE Healthcare）を用いて倍率２０倍で撮影して細胞体を評価した（ＭＡＰ２染色）。写真の解析はＤｅｖｅｌｏｐｅｒソフトウエア（GE Healthcare）を用いて行い、写真１枚当たりのニューロンの数を記録した。各ウェルについて写真２０枚のニューロン数の平均を自動計算した後、各ウェルにつき１つのデータを示した（各条件につき合計６の生データを示した）。
神経突起ネットワーク長の評価：各条件につき６ウェルを評価し、ウェル当たり２０枚の写真を、ＩｎＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）１０００を用いて倍率２０倍で撮影して（２０倍で２０枚の写真はウェルの全表面の約８０％に相当する）ＭＡＰ−２染色を評価した。写真の解析はＤｅｖｅｌｏｐｅｒソフトウエア（GE Healthcare）を用いて行い、写真１枚当たりの総神経突起長を記録した。各ウェルについて写真２０枚の平均神経突起長を自動計算した後、各ウェルにつき１つのデータを示した（各条件につき合計６の生データを示した）。
２．結果
結果を図１に示す。
結果を図１に示す。
これらの結果は、ＨＳ抽出物はグルタミン酸塩により引き起こされる毒性に対して実質的な保護効果を誘導することを示す。
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意な神経細胞死（約２５％）（図１ａ）及び神経突起の大規模な損失（２５％）（図１ｂ）を誘導した。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したトウゲシバ抽出物Ｎ６００１−１（３３．３μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び２．５μｇ／ｍｌ）の存在下では、ニューロン生存率（約９０％の生存率）（図１ａ）並びに神経突起ネットワーク（図１ｂ）に有意な保護効果が見られた。
同様の結果が、いずれの抽出法でも、抽出物Ｎ６００２−５（これにはＦＡが存在しなかった）以外の全ての抽出物で得られた。
実施例２：フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸による、神経細胞に対するグルタミン酸塩毒性の防止
ＨＳ抽出物での結果及び使用したＨＳ抽出物の化学特性の解析的分析を考慮して、神経細胞に対する保護効果に関与する可能性のある３つの化合物、すなわち、フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸を特定した。
ＨＳ抽出物での結果及び使用したＨＳ抽出物の化学特性の解析的分析を考慮して、神経細胞に対する保護効果に関与する可能性のある３つの化合物、すなわち、フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸を特定した。
上記候補化合物を、神経細胞に対するグルタミン酸塩毒性を防止又は軽減するそれらの能力に関して試験した。これらの化合物をまず個々に試験した後、それらの組合せ作用のアッセイを行った。これらの化合物及びそれらの組合せの有効性は、初代皮質ニューロン細胞で評価した。
１．試験の項
これらのアッセイに用いたプロトコールは、実施例１に記載したものと同じである。１３日のニューロン培養の後、候補化合物をＤＭＳＯに溶かし、培養培地で希釈した。次に、候補化合物をグルタミン酸塩暴露（２０分、４０μΜ）の１時間前に種々の濃度にて単独で又は混合物として皮質ニューロンとともにプレインキュベートし、毒性適用中及び洗浄後さらに４８時間放置した。候補化合物は、９６ウェルプレート中、各条件につき６ウェルとし、初代皮質培養物で試験した。
これらのアッセイに用いたプロトコールは、実施例１に記載したものと同じである。１３日のニューロン培養の後、候補化合物をＤＭＳＯに溶かし、培養培地で希釈した。次に、候補化合物をグルタミン酸塩暴露（２０分、４０μΜ）の１時間前に種々の濃度にて単独で又は混合物として皮質ニューロンとともにプレインキュベートし、毒性適用中及び洗浄後さらに４８時間放置した。候補化合物は、９６ウェルプレート中、各条件につき６ウェルとし、初代皮質培養物で試験した。
２．結果
結果を図２及び３に示す。これらの結果は、単独で試験した化合物の全てが、グルタミン酸塩により引き起こされる毒性に対して実質的な保護効果を誘導することを示す。
結果を図２及び３に示す。これらの結果は、単独で試験した化合物の全てが、グルタミン酸塩により引き起こされる毒性に対して実質的な保護効果を誘導することを示す。
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は有意な神経細胞死（約３０％）及び神経突起の大規模な損失（３０％）を誘導した。図２に示されるように、
− フペルジンＡ（ＨＡ）は、１０ｎＭの用量で、ニューロン生存率（９４％）並びに神経突起ネットワーク（＞９０％）に有意な保護効果を誘導し、最低活性用量は１ｎＭであった（図２ａ、ｂ）；
− カフェ酸（ＣＡ）は、１μΜ及び５μΜの用量で、ニューロン生存率（＞８０％の生存率）に有意な保護効果並びに神経突起ネットワークに中等度の効果を誘導する（図２ｃ、ｄ）；
− フェルラ酸（ＦＡ）は、１０μΜ及び１００μΜの用量で、ニューロン生存率（＞８０％の生存率）並びに神経突起ネットワークに有意な保護効果を誘導する（図２ｅ、ｆ）。
− フペルジンＡ（ＨＡ）は、１０ｎＭの用量で、ニューロン生存率（９４％）並びに神経突起ネットワーク（＞９０％）に有意な保護効果を誘導し、最低活性用量は１ｎＭであった（図２ａ、ｂ）；
− カフェ酸（ＣＡ）は、１μΜ及び５μΜの用量で、ニューロン生存率（＞８０％の生存率）に有意な保護効果並びに神経突起ネットワークに中等度の効果を誘導する（図２ｃ、ｄ）；
− フェルラ酸（ＦＡ）は、１０μΜ及び１００μΜの用量で、ニューロン生存率（＞８０％の生存率）並びに神経突起ネットワークに有意な保護効果を誘導する（図２ｅ、ｆ）。
これらの結果はまた、ＨＡ、ＣＡ並びにＦＡは、最低濃度では、このモデルにおけるグルタミン酸塩毒性に効果がほとんどないか全くないことを示す。
図３に示されるように、本発明による組合せは、上記の試験条件下で、グルタミン酸塩毒性からニューロンを強く保護する。
グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分）は、有意な神経細胞死（約３０％）及び神経突起の大規模な損失（４０％）を誘導した。
以下の混合物濃度は、皮質ニューロン生存率の有意な増大をもたらした：
− １０ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）、
− １０ｐＭ／５０ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）及び
− １ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）。
− １０ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）、
− １０ｐＭ／５０ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）及び
− １ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）。
これらの混合物はまた、神経突起ネットワークに対しても保護性があった。
加えて、１０ｐＭ／５ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）の混合物濃度も、神経突起ネットワークに対して保護性があった。
また、混合物濃度１ｐΜ／５ｎΜ／１０ｎΜ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）、１ｐΜ／５００ｐΜ／１０ｎΜ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）及び１ｐΜ／５０ｐΜ／１０ｎΜ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）でも、有意には達しないものの保護効果が見られた。
単独で使用した化合物が保護効果を示すことができなかった化合物濃度を用いて有効な保護が認められることは注目に値する。
初めて、これらの化合物の相乗的保護効果が明らかに示された。
実施例３：神経細胞に対するΑβ−ペプチド毒性の防止
さらなる一連の試験で、上記で特定された候補化合物を、皮質ニューロンに対するヒトΑβ１−４２の毒性作用を防止又は軽減するそれらの能力に関して試験した。Αβ１−４２は、アルツハイマー病に侵されたヒト患者からの生検に見られる凝集物を構成する全長ペプチドである［Sakonoら 2010, FEBS Journal 277(6), 1348-1358; Callizotら，2013,既掲］。
さらなる一連の試験で、上記で特定された候補化合物を、皮質ニューロンに対するヒトΑβ１−４２の毒性作用を防止又は軽減するそれらの能力に関して試験した。Αβ１−４２は、アルツハイマー病に侵されたヒト患者からの生検に見られる凝集物を構成する全長ペプチドである［Sakonoら 2010, FEBS Journal 277(6), 1348-1358; Callizotら，2013,既掲］。
１．試験の項
本試験では、Αβ−オリゴマーを含有するΑβ−ペプチド溶液を用い、アルツハイマー病の神経病理学的特徴を再現することを可能とする、Callizotら［２０１３，既掲］によって確立されたアルツハイマー病のin vitroモデルを使用した。
本試験では、Αβ−オリゴマーを含有するΑβ−ペプチド溶液を用い、アルツハイマー病の神経病理学的特徴を再現することを可能とする、Callizotら［２０１３，既掲］によって確立されたアルツハイマー病のin vitroモデルを使用した。
薬物はまず個々に試験した後、それらの組合せ作用のアッセイを行った。
Αβ１−４２調製物は、Callizotら［２０１３，既掲］により記載されている手順に従って得た。簡単に述べれば、Αβ１−４２ペプチドを、血清を含まない上述の規定培養培地に、４０μｍｏｌ／リットルの初期濃度で溶かした。この溶液を暗所、３７℃で３日間、穏やかに撹拌し、培養培地で使用濃度に希釈した後すぐに使用した。
培養１１日目に、ＨＡ、ＣＡ、ＦＡ及びそれらの混合物を培養培地に溶かして希釈した後、Αβ１−４２ペプチド適用の１時間前に皮質ニューロンとともにプレインキュベートした。次に、Αβ１−４２調製物をコントロール培地で希釈して終濃度２０μΜとなるように加えた。２４時間のΑβ毒性化（intoxication）状態の後、培養物を固定し、免疫標識し、ニューロン生存率及び神経突起ネットワーク長を上記実施例に記載の通りに評価した。
２．結果
結果を図４及び図５に示す。
結果を図４及び図５に示す。
Αβ（２０μΜ、２４時間）は、有意な神経細胞死（約２５％）及び神経突起の大規模な損失（３５％）を誘導した。
− フペルジンＡ（ＨＡ）は、ニューロンを損傷から有意に保護することができなかった（図４ｂ）。対照的に、ＨＡは、１０ｐＭ及び１０ｎＭの濃度で、神経突起ネットワークに有意な効果を示した（図４ａ）；
− カフェ酸は、５ｎＭから５μΜまでの濃度で、ニューロンを損傷から有意に保護することができた。５００ｐＭ以下の濃度では、ニューロン生存率に効果は見られなかった（図４ｄ）。神経突起ネットワークに対する保護効果は、より低い濃度でも見られた（図４ｃ）；
− フェルラ酸は、試験したいずれの濃度でも、ニューロンを損傷から保護することができなかった（図４ｆ）。神経突起ネットワークに対しては若干の効果が見られ、１０及び１００μΜでは有意な効果であった（図４ｅ）。
− カフェ酸は、５ｎＭから５μΜまでの濃度で、ニューロンを損傷から有意に保護することができた。５００ｐＭ以下の濃度では、ニューロン生存率に効果は見られなかった（図４ｄ）。神経突起ネットワークに対する保護効果は、より低い濃度でも見られた（図４ｃ）；
− フェルラ酸は、試験したいずれの濃度でも、ニューロンを損傷から保護することができなかった（図４ｆ）。神経突起ネットワークに対しては若干の効果が見られ、１０及び１００μΜでは有意な効果であった（図４ｅ）。
Αβにより損傷された初代皮質ニューロンに対するＨＡ、ＣＡ及びＦＡの混合物の効果を図５に示す。本発明によるこのような組合せは、上記の試験条件下でニューロンをΑβ毒性から強く保護する。
Αβ（２０μΜ、２４時間）は、有意な神経細胞死（約２５％）及び神経突起の大規模な損失（４０％）を誘導した。
ＨＡ／ＣＡ／ＦＡの混合物の存在下では、ニューロン生存率に対して有意な保護効果が見られ（約９０％の生存率）、試験した全ての濃度が保護効果を示した。以下の混合物濃度が皮質ニューロン生存率の有意な増大をもたらした：それぞれ１ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）；１ｐＭ／５０ｐＭ／１０ｎＭ（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）（図５ａ）。最も重要なこととして、これら３つの化合物の全ての濃度組合せが神経突起ネットワークに有意な保護効果を示し、それをほぼ完全に保存した。試験した全ての混合物がΑβにより誘導される神経突起の損失から９０％を上回るまでに保護を示した（図５ｂ）。
使用した濃度では、これら３つの化合物に、単独で使用した場合に保護効果を示すことができたものは無かったことに留意しなければならない（図４）。
本試験は、フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸は、グルタミン酸塩により、またβ−アミロイドペプチドにより誘導される損傷からニューロンを保護できたことを証明した。より興味深く、また、驚くことに、本発明者は、本試験で、フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸が、個々の成分が有効でない濃度で組み合わせて使用した場合に、グルタミン酸塩性の損傷及びβ−アミロイド性の損傷の両方でほぼ完全な神経保護をもたらし得たことを示した。初めて、これらの化合物の混合物の相乗的神経保護作用が明らかに示された。よって、本発明は、有利には、低濃度のフペルジンＡを含有する、したがって、発汗、悪心、嘔吐、めまい、及び痙攣等の、アルカロイド薬によって通常生じる不快な副作用［Yang G.ら，PLOS ONE (2013), 8(9) : e74916］を軽減できる組成物を提供する。
同様の結果が、いずれの抽出法でも、抽出物Ｎ６００２−５（これにはＦＡが存在しなかった）以外の全ての抽出物で得られた。
実施例４：神経細胞に対するＭＰＰ毒性の保護
これらの従前の結果を考慮して、十分に検証されたパーキンソン病（ＰＤ）モデルである１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）で損傷されたチロシン水酸化酵素（ＴＨ）陽性ニューロン［Visanji NP，ら FASEB J. 2008; 22 (7) : 2488-97］に対するＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１（バッチ：ａ）の推定有効性を試験するために、さらなる検討を行った。
これらの従前の結果を考慮して、十分に検証されたパーキンソン病（ＰＤ）モデルである１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）で損傷されたチロシン水酸化酵素（ＴＨ）陽性ニューロン［Visanji NP，ら FASEB J. 2008; 22 (7) : 2488-97］に対するＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１（バッチ：ａ）の推定有効性を試験するために、さらなる検討を行った。
１．試験の項
ａ．植物抽出物ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１
トウゲシバ（ＨＳ）抽出物ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１を、煎出（ｐＨ７；３０分）などの抽出により得た。この抽出物は１／０．１／０．６比のＨＡ／ＣＡ／ＦＡを含有する。
ａ．植物抽出物ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１
トウゲシバ（ＨＳ）抽出物ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１を、煎出（ｐＨ７；３０分）などの抽出により得た。この抽出物は１／０．１／０．６比のＨＡ／ＣＡ／ＦＡを含有する。
ｂ．中脳ニューロンの培養
ＨＳ抽出物の神経保護効果を、ドーパミンニューロンの生存を特異的に可視化するＴＨ陽性ニューロンの定量化により評価した。ラットドーパミンニューロンは、Schinelliら，J Neurochem. 1988 Jun; 50(6) : 1900-7及びVisanjiら，2008［前掲］により記載されているように培養した。
ＨＳ抽出物の神経保護効果を、ドーパミンニューロンの生存を特異的に可視化するＴＨ陽性ニューロンの定量化により評価した。ラットドーパミンニューロンは、Schinelliら，J Neurochem. 1988 Jun; 50(6) : 1900-7及びVisanjiら，2008［前掲］により記載されているように培養した。
簡単に述べれば、１５日齢のラット胚（Janvier Labs、フランス）から入手した中脳を顕微鏡下で解剖した。胚の中脳を取り出し、２％のペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ、Pan Biotech）及び１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Pan Biotech）を含有する氷冷ライボビッツ培地（Ｌ１５、Pan Biotech）に入れた。発達中の脳のドーパミンニューロンに富む領域である中脳屈の副側部を細胞の調製に使用した。中脳を３７℃で２０分間のトリプシン処理（トリプシン０．０５％ ＥＤＴＡ０．０２％、PanBiotech）により解離させた。この反応を、ＤＮＡアーゼＩグレードＩＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ、PanBiotech）及び１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Gibco）を含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、PanBiotech）の添加によって停止させた。次に、細胞を、１０ｍｌピペットに３回通すことにより機械的に解離させた。その後、細胞をＬ１５培地中、ＢＳＡ（３．５％）層の上で、１８０ｘｇ、１０分間、及び４℃にて遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、Ｂ２７（２％、Invitrogen、バッチ：１５８９８８９）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、PanBiotech）及び２％のＰＳ溶液及び１０ｎｇ／ｍｌの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、PanBiotech）及び１ｎｇ／ｍｌのグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ、PanBiotech）を添加したニューロベーサル（Invitrogen）からなる規定培養培地に再懸濁させた。生細胞をノイバウワーサイトメーターにてトリパンブルー排除試験を用いて計数した。これらの細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでプレコートされた９６ウェルプレート（Corning Biocoat）に４０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気の加湿インキュベーター内で維持した。培地の半分を２日毎に新鮮培地と交換した。
培養６日目に、培地を除去し、コントロール培地で希釈した４μΜのＭＰＰ＋（Sigma）を含まない又は含む新鮮培地を加え、各条件につき６ウェルを評価した。
ｃ．試験化合物及びＭＰＰ ＋ 暴露
培養６日目に、ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１（２．５、５、５０、５００ｎｇ／ｍｌ、２．５、５、２５、３３．３μｇ／ｍｌ）を培養培地に溶解させるか、又は培養培地で希釈し、その後、ＭＰＰ＋適用の１時間前に初代中脳ニューロンとともにプレインキュベートした。ＭＰＰ＋溶液をコントロール培地で希釈して終濃度４μΜとなるように加えた。
培養６日目に、ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１（２．５、５、５０、５００ｎｇ／ｍｌ、２．５、５、２５、３３．３μｇ／ｍｌ）を培養培地に溶解させるか、又は培養培地で希釈し、その後、ＭＰＰ＋適用の１時間前に初代中脳ニューロンとともにプレインキュベートした。ＭＰＰ＋溶液をコントロール培地で希釈して終濃度４μΜとなるように加えた。
ｄ．ＴＨ陽性ニューロンの評価
４８時間の毒性化状態の後、細胞をＰＢＳ（ＰＡＮ）、ｐＨ＝７．３中、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Sigma）の溶液により、室温で２０分間固定した。細胞を再びＰＢＳで２回洗浄した後、透過処理を施し、非特異的部位を、０．１％サポニン（Sigma）及び１％ＦＣＳを含有するＰＢＳ溶液で、室温にて１５分間ブロッキングした。その後、細胞を、１％ＦＣＳ、０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／１００００希釈の、マウスで作製したモノクローナル抗チロシン水酸化酵素（ＴＨ、Sigma）抗体とともに室温で２時間インキュベートした。この抗体を、１％ＦＣＳ、０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／８００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular probe）で、室温にて１時間可視化した。
４８時間の毒性化状態の後、細胞をＰＢＳ（ＰＡＮ）、ｐＨ＝７．３中、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Sigma）の溶液により、室温で２０分間固定した。細胞を再びＰＢＳで２回洗浄した後、透過処理を施し、非特異的部位を、０．１％サポニン（Sigma）及び１％ＦＣＳを含有するＰＢＳ溶液で、室温にて１５分間ブロッキングした。その後、細胞を、１％ＦＣＳ、０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／１００００希釈の、マウスで作製したモノクローナル抗チロシン水酸化酵素（ＴＨ、Sigma）抗体とともに室温で２時間インキュベートした。この抗体を、１％ＦＣＳ、０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／８００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular probe）で、室温にて１時間可視化した。
これらの免疫標識培養物を、ＬＥＤを備えたＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Molecular Devices）を用い、倍率１０倍で自動的に検査した。各条件（６培養ウェル）について、ウェル当たり２０の自動視野（ウェルの全表面の約８０％に相当する）を分析した。ＴＨニューロンの総数を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウエア（Molecular Devices）を用いて自動的に分析した。データは、ＭＰＰ＋損傷を表すために、コントロール条件（毒性化無し、ＭＰＰ＋不含＝１００％）に対するパーセンテージで表した。値は全て、６ウェルの平均±ＳＥＭ（ｓ．ｅ．平均）として表した。グラフ化及び統計分析は異なる条件（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、許容される場合には、ＡＮＯＶＡとその後のダネット又はＰＬＳＤフィッシャー検定）で行った。
２．結果
結果を図６に示す。
結果を図６に示す。
ＭＰＰ＋（４μΜ−４８時間）は、従前に文献［Visanjiら，2008 前掲］に示されているように、有意な細胞死（＞３５％）を誘導した。図６に示されるように、ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１（５０ｎｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまで）の存在下では、ＴＨ陽性ニューロンに対して大きくかつ有意な保護効果が見られた（２．５及び５μｇ／ｍｌ用量で＞９０％の生存率）。釣鐘型曲線が見られた。最高濃度（２５及び３３．３μｇ／ｍｌ）では、ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１は、保護効果を示さなかった。２つの最低試験用量（２．５及び５ｎｇ／ｍｌ）は不活性であった。
これらの結果は、ニューロンをＭＰＰ＋損傷（十分に検証されたＰＤモデル）から保護できたこと、及びＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１は従前の検討で神経保護活性の起点にあることが証明された３つの必須成分（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）の特定の比率を含んでいたことを示す。
実施例５：フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸による神経細胞に対するＭＰＰ＋毒性の予防
前記抽出物が皮質ニューロンと神経突起をグルタミン酸塩による損傷から保護したことを示す、ＮＳＰ０１Ｅ０１（バッチＮ６００１―６及びＮ６００２−６、トウゲシバ）で得られた結果とその後の化学的プロフィールの解析で得られた結果を考慮して、フペルジンＡ（ＨＡ）、カフェ酸（ＣＡ）及びフェルラ酸（ＦＡ）はこの作用に関与していると推測し、実施例４に従い、十分に検証されたパーキンソン病（ＰＤ）モデルである１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）で損傷されたチロシン水酸化酵素（ＴＨ）陽性ニューロンに対して試験した。
前記抽出物が皮質ニューロンと神経突起をグルタミン酸塩による損傷から保護したことを示す、ＮＳＰ０１Ｅ０１（バッチＮ６００１―６及びＮ６００２−６、トウゲシバ）で得られた結果とその後の化学的プロフィールの解析で得られた結果を考慮して、フペルジンＡ（ＨＡ）、カフェ酸（ＣＡ）及びフェルラ酸（ＦＡ）はこの作用に関与していると推測し、実施例４に従い、十分に検証されたパーキンソン病（ＰＤ）モデルである１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）で損傷されたチロシン水酸化酵素（ＴＨ）陽性ニューロンに対して試験した。
１．試験の項
これらのアッセイで用いたプロトコールは、実施例４に記載したものと同じである。培養６日目に、試験化合物（ＨＡ、ＣＡ及びＦＡ）を培養培地に溶解させ、培養培地に希釈し、その後、ＭＰＰ＋適用の１時間前に中脳ニューロンとともにプレインキュベートした。
これらのアッセイで用いたプロトコールは、実施例４に記載したものと同じである。培養６日目に、試験化合物（ＨＡ、ＣＡ及びＦＡ）を培養培地に溶解させ、培養培地に希釈し、その後、ＭＰＰ＋適用の１時間前に中脳ニューロンとともにプレインキュベートした。
ＨＡ（１，１０，１００ｎＭ、１，１０，１００μＭ）、ＣＡ（５，５０，５００ｐＭ、５，５０，５００ｎＭ、１μＭ）、ＦＡ（１００ｐＭ、１，１０，１００ｎＭ、１，１０，１００μＭ及び１ｍＭ）及びそれらの混合物を培養培地に溶解させるか、又は培養培地で希釈し、その後、ＭＰＰ＋適用の１時間前に初代中脳ニューロンとともにプレインキュベートした。ＭＰＰ＋溶液をコントロール培地で希釈して終濃度４μΜとなるように加えた。
４８時間の毒性化状態の後、実施例４で述べているように、細胞を固定し、ＴＨ陽性ニューロンの数を評価した。
２．結果
結果を図７ａ―ｄに示す。
結果を図７ａ―ｄに示す。
図７ａはＭＰＰ＋（４μＭ―４８時間）が、文献[Visanjiら、2008, 前掲]で従前に示されているように、有意な細胞死（＞３５％）を誘導したことを示している。ＨＡの存在下（１０ｎＭから１０μＭまで）では、大きくかつ有意な保護効果が見られた（１００ｎＭ濃度で＞９０％の生存率）。
釣鐘型曲線が見られた。最高濃度（１００μＭ）では、ＨＡは、保護効果を示さなかった（いくつかのウェルでは毒性が生じた。）。
一方、最低試験用量（１ｎＭ）では不活性であった（図７ａ）。
図７ｂはＭＰＰ＋（４μＭ―４８時間）が、文献[Visanjiら、2008, 前掲]で従前に示されているように、有意な細胞死（＞３５％）を誘導したことを示している。ＣＡの存在下（５ｎＭから１μＭまで）では、大きくかつ有意な保護効果が見られた。
図７ｃはＭＰＰ＋（４μＭ―４８時間）が、文献[Visanjiら、2008, 前掲]で従前に示されているように、有意な細胞死（＞３５％）を誘導したことを示している。ＦＡの存在下（１μＭから１ｍＭまで）では、有意な保護効果が見られた。低濃度は不活性であり（１００ｐＭから１００ｎＭまで）、効果は１０μＭで最大効果をもつ釣鐘型曲線となった。
図７ｄはＭＰＰ＋（４μＭ―４８時間）が、文献[Visanjiら、2008, 前掲]で従前に示されているように、有意な細胞死（＞３５％）を誘導したことを示している。ＭＰＰ＋適用の１時間前に添加され、ＭＰＰ＋適用の間４８時間放置されたＨＡ／ＣＡ／ＦＡ混合物の存在下、ニューロン生存率に対して有意な保護効果が見られた（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ：１ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭに対して生存率約８２％）。試験した全ての混合物は、該混合物中のＨＡ、ＣＡ又はＦＡの濃度が何であれ保護効果を示し、以下のＨＡ／ＣＡ／ＦＡ混合物：１ｐＭ／５０ｐＭ／１０ｎＭ；１ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ；１０ｐＭ／５０ｐＭ／１０ｎＭ及び １０ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭで有意な効果が見られた。一方、前記濃度で前記化合物単独では不活性であった。
実施例６：フペルジンＡ、カフェ酸、シナピン酸、フェルラ酸、ｐ―クマリン酸及び没食子酸による、神経細胞に対するグルタミン酸塩毒性の防止
本試験においては、ＨＡと他のポリフェノール、例えば、シナピン酸（ＳＡ）、
ｐ―クマリン酸（ｐＣｏｕＡ）、没食子酸（ＧＡ）、フェルラ酸（ＦＡ）又はカフェ酸（ＣＡ）とを組み合わせた相乗効果について、十分に検証されたアルツハイマー病（ＡＤ）のin vitroモデルであるグルタミン酸塩で損傷された皮質ニューロンに対して評価した[Campos-Penaら、(2014). Alzheimer Disease: The Role of Aβ in the Glutamatergic System, Neurochemistry, Dr. Thomas Heinbockel(Ed), ISBN : 978-953-51-1237-2, InTech, DOI : 10.5772/57367]。
本試験においては、ＨＡと他のポリフェノール、例えば、シナピン酸（ＳＡ）、
ｐ―クマリン酸（ｐＣｏｕＡ）、没食子酸（ＧＡ）、フェルラ酸（ＦＡ）又はカフェ酸（ＣＡ）とを組み合わせた相乗効果について、十分に検証されたアルツハイマー病（ＡＤ）のin vitroモデルであるグルタミン酸塩で損傷された皮質ニューロンに対して評価した[Campos-Penaら、(2014). Alzheimer Disease: The Role of Aβ in the Glutamatergic System, Neurochemistry, Dr. Thomas Heinbockel(Ed), ISBN : 978-953-51-1237-2, InTech, DOI : 10.5772/57367]。
１．試験の項
ラット皮質ニューロンを実施例１に従って培養した。
ラット皮質ニューロンを実施例１に従って培養した。
ニューロンは、培養１３日後にグルタミン酸塩溶液（下記参照）で毒性化した。
培養１３日目に、試験化合物の不在下又は存在下でグルタミン酸塩（Sigma Aldrich, Lyon, France, Batch : SLBL7326V）をコントロール培地で希釈して終濃度４０μΜとなるように細胞培養物に加えてさらに４８時間置いた。２０分後に、該細胞を洗浄し、試験化合物を含有する又は含有しない新たな新鮮培地を加えてさらに４８時間加えた。１３日の培養後、試験化合物（ＨＡ、ＣＡ、ＳＡ、ＧＡ、ｐーＣｏｕＡ及びＦＡ）をＤＭＳＯに溶かし、培養培地で希釈した。次に、試験化合物をグルタミン酸塩適用前に１時間、皮質ニューロンとともにプレインキュベートした。
ＨＡ（１０ｐＭ）（不活性濃度、実施例２参照）、ＣＡ（５００ｐＭ、不活性濃度、実施例２参照）、ＦＡ（１０ｎＭ、不活性濃度、実施例２参照）、ＳＡ（１０，１００ｐＭ、１，１０，１００ｎＭ、１，１０，５０μΜ）、ＧＡ（１０，１００ｐＭ、１，１０，１００ｎＭ、１，１０，５０μΜ）、及びｐＣｏｕＡ（１０，１００ｐＭ、１，１０，１００ｎＭ、１，１０，５０μΜ）又は不活性濃度におけるそれらの３化合物の混合物を培養培地に溶解し、培養培地で希釈し、その後、グルタミン酸塩適用前に１時間、初代皮質ニューロンとともにプレインキュベートした。グルタミン酸塩は４０μΜで加えて２０分間置いた。
４８時間のグルタミン酸塩での毒性化の後、細胞をエタノール（９５％、Sigma, Batch: SZBD 1470V）と酢酸（５％、Sigma, Batch: SZBD 1760V）の冷溶液により５分間、−２０℃で固定した。０．１％のサポニン（Sigma, Batch: BCBJ8417V）での透過処理後、細胞を、１％ウシ胎仔血清及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ（Pan biotech, Batch : 1870415）中、１／４００希釈の微小管関連タンパク質２(microtubule-associated-protein 2)（ＭＡＰ２；Sigma, Batch: 063M4802）に対するマウスモノクローナル抗体とともに２時間インキュベートした。
この抗体を、１％ウシ胎仔血清及び０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／４００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen, Batch: 1664729）で室温にて１時間可視化した。
ニューロン生存率及び神経突起ネットワーク長の評価：前記の免疫標識培養物を、ＬＥＤを備えたＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Molecular Devices、ＵＳＡ）を用い、倍率２０倍で自動的に検査した。各条件（６培養ウェル）について、ウェル当たり３０の自動視野（ウェルの全表面の約８０％に相当する）を分析した。ニューロンの総数と神経突起ネットワークの総数を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウエア（Molecular Devices）を用いて自動的に分析した。
データは、グルタミン酸塩損傷を表すために、コントロール条件（毒性化無し、グルタミン酸塩不含＝１００％）に対するパーセンテージで表した。値は全て、６ウェルの平均±ＳＥＭ（ｓ．ｅ．平均）として表した。グラフ化及び統計分析は異なる条件（ＳｔａｔｖｉｅｗとＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、許容される場合には、ＡＮＯＶＡとその後のＰＬＳＤフィッシャー検定）で行った。
２．結果
結果を図８ａ―ｄに示す。
結果を図８ａ―ｄに示す。
図８ａは、グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分間）が有意な神経細胞死（＞３０％）とニューロンの神経突起ネットワークの大きな損傷（＞４０％）を誘導したことを示す。ＳＡ（１００，１０及び１ｎＭ）をグルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したときには、ニューロン生存率に有意な保護効果が見られた（約８０％の生存率）（図８ａ）。ＳＡは最低濃度では不活性であった（図８ａ）。加えて、神経突起ネットワークには保護効果が見られなかった（図８ｂ）。
図８ｃは、グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分間）が有意な神経細胞死（＞３０％）とニューロンの神経突起ネットワークの大きな損傷（＞４０％）を誘導したことを示す。ｐＣｏｕＡ（１００ｎＭ及び１μΜ）をグルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したときには、有意な保護効果が見られた（約８０％の生存率、図８ｃ）。神経突起ネットワークに対しては、１μＭのｐＣｏｕＡだけが保護効果を示した（図８ｄ）。最低濃度では、ｐＣｏｕＡは生存率及び神経突起ネットワークの両方で不活性であった。
図８ｅは、グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分間）が有意な神経細胞死（＞３０％）とニューロンの神経突起ネットワークの大きな損傷（＞４０％）を誘導したことを示す。ＧＡ（１０及び５０μΜ）をグルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したときには、最低濃度を除き（１μΜまで、図８ｅ）、有意な保護効果が見られた（約８０％の生存率）。神経突起ネットワークに対しては、保護効果は見られなかった（図８ｆ）。
図８ｇは、グルタミン酸塩（４０μΜ、２０分間）が有意な神経細胞死（＞３０％）とニューロンの神経突起ネットワークの大きな損傷（＞４０％）を誘導したことを示す。グルタミン酸塩の１時間前に添加し、毒性適用中及び洗浄後４８時間放置したＨＡ／ＣＡ／ｐーＣｏｕＡ（１０ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ）、及びＨＡ／ｐーＣｏｕＡ／ＦＡ（１０ｐＭ／１０ｎＭ／１０ｎΜ）の存在下では、ニューロン生存率に有意な保護効果が見られた（＞８０％）（図８ｇ）。これらの混合物は、また神経突起ネットワークに対して保護効果を示した（図８ｈ）。加えて、ＨＡ／ＣＡ／ＳＡ（１０ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ）、ＨＡ／ＣＡ／ｐーＣｏｕＡ（１０ｐＭ／５００ｐＭ／１０ｎＭ）、ＨＡ／ＧＡ／ＦＡ（１０ｐＭ／１μＭ／１０ｎＭ）、ＨＡ／ＣＡ／ＧＡ（１０ｐＭ／５００ｐＭ／１μＭ）、ＨＡ／ＳＡ／ＦＡ（１０ｐＭ／１０ｎＭ／１０ｎＭ）及びＨＡ／ｐーＣｏｕＡ／ＦＡ（１０ｐＭ／１０ｎＭ／１０ｎＭ）も神経突起ネットワークに対して保護効果を示した（図８ｈ）。
これら使用された全ての濃度において、３つの化合物は単独で使用されたときには、全く保護効果を示すことができなかった点に注意すべきである（実施例２及び図２ａ−ｆ参照）。
実施例７：フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸による、神経／筋共培養物に対するグルタミン酸塩毒性の防止
本試験においては、フペルジンＡ（ＨＡ）／カフェ酸（ＣＡ）／フェルラ酸（ＦＡ）／混合物の神経保護効果を、十分に検証されたCombesらによるＡＬＳのin vitroモデルであるグルタミン酸塩で損傷された神経／筋共培養物に対して評価した[(2015). (J Neurosci es.;93(4) :633-43) ]。これらの化合物の相乗作用についても検討した。前記化合物の混合物の存在下、神経筋接合部（ＮＭＪ）の完全性（数及び平均サイズ）及び筋細胞を神経支配する神経突起ネットワークを評価した。
本試験においては、フペルジンＡ（ＨＡ）／カフェ酸（ＣＡ）／フェルラ酸（ＦＡ）／混合物の神経保護効果を、十分に検証されたCombesらによるＡＬＳのin vitroモデルであるグルタミン酸塩で損傷された神経／筋共培養物に対して評価した[(2015). (J Neurosci es.;93(4) :633-43) ]。これらの化合物の相乗作用についても検討した。前記化合物の混合物の存在下、神経筋接合部（ＮＭＪ）の完全性（数及び平均サイズ）及び筋細胞を神経支配する神経突起ネットワークを評価した。
１．試験の項
ヒト筋肉（promocell, Batch : 3061107）を、健康な対象の生検の一部から前述した方法に従って調製した（Braunら、(1996) J.Neurol Sci. 136 : 17-23）。ヒト筋肉細胞株を解離細胞（２１０００細胞／ウェル）から樹立し、水中０．１％ゼラチン被覆（Sigma, Batch : 051M0012V）４８ウェルプレート（Greiner, Batch : E13111ME）に入れ、６２％ＭＥＭ培地（PAN, Batch : 2761113）及び２５％Ｍ １９９培地（PAN, Batch : 6720314）の混合物からなり、グルタミン２ｍＭ（PAN, Batch : 8150713）、ヒトインスリン１０μｇ／ｍｌ（PAN, Batch : 1481013）、ヒト組換え体上皮細胞成長因子１０ｎｇ／ｍｌ（EGF, GIBCO, Batch : 1291552A）、ヒト組換え体線維芽細胞増殖因子ベーシック２ｎｇ／ｍｌ（bFGF, PAN, Batch : H080113）、１０％ウシ胎仔血清（FCS、GIBCO,Batch：41Q7218K）及び２％ペニシリン１０．０００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１０．０００Ｍｇ／ｍｌ（PS, PAN, Batch : 1451013）を添加した増殖用培地で培養した。培地は２日毎に交換した。培養開始後５日目、衛星細胞分化の直後に、４つの後根神経節（DRG）が接合した１３日齢のラット胚（Janvier Labs、フランス）脊髄のトランスバース・スライスを筋単層上に置いた（中央領域にウェル当たり１移植片）。ＤＲＧは良好な割合の神経支配を達成するために必要である。神経支配された培養物を、ＭＥＭと培地１９９からなり、５％ＦＣＳ、インスリン５μｇ／ｍｌ、グルタミン２ｍＭ及び２％ＰＳを添加した混合培地（６７％／２５％）に維持した。２４時間の共培養後、神経突起が脊髄移植片から成長しているのが見られた。この神経突起は筋管と接触し、約８日後に最初の収縮を誘導した。その後すぐに、脊髄移植片の近傍に位置した神経支配された筋繊維が、実質的に連続して収縮していた。神経支配された繊維は、神経支配されていない繊維からは、形態学的に及び空間的に離れており、容易に区別することができた。
ヒト筋肉（promocell, Batch : 3061107）を、健康な対象の生検の一部から前述した方法に従って調製した（Braunら、(1996) J.Neurol Sci. 136 : 17-23）。ヒト筋肉細胞株を解離細胞（２１０００細胞／ウェル）から樹立し、水中０．１％ゼラチン被覆（Sigma, Batch : 051M0012V）４８ウェルプレート（Greiner, Batch : E13111ME）に入れ、６２％ＭＥＭ培地（PAN, Batch : 2761113）及び２５％Ｍ １９９培地（PAN, Batch : 6720314）の混合物からなり、グルタミン２ｍＭ（PAN, Batch : 8150713）、ヒトインスリン１０μｇ／ｍｌ（PAN, Batch : 1481013）、ヒト組換え体上皮細胞成長因子１０ｎｇ／ｍｌ（EGF, GIBCO, Batch : 1291552A）、ヒト組換え体線維芽細胞増殖因子ベーシック２ｎｇ／ｍｌ（bFGF, PAN, Batch : H080113）、１０％ウシ胎仔血清（FCS、GIBCO,Batch：41Q7218K）及び２％ペニシリン１０．０００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１０．０００Ｍｇ／ｍｌ（PS, PAN, Batch : 1451013）を添加した増殖用培地で培養した。培地は２日毎に交換した。培養開始後５日目、衛星細胞分化の直後に、４つの後根神経節（DRG）が接合した１３日齢のラット胚（Janvier Labs、フランス）脊髄のトランスバース・スライスを筋単層上に置いた（中央領域にウェル当たり１移植片）。ＤＲＧは良好な割合の神経支配を達成するために必要である。神経支配された培養物を、ＭＥＭと培地１９９からなり、５％ＦＣＳ、インスリン５μｇ／ｍｌ、グルタミン２ｍＭ及び２％ＰＳを添加した混合培地（６７％／２５％）に維持した。２４時間の共培養後、神経突起が脊髄移植片から成長しているのが見られた。この神経突起は筋管と接触し、約８日後に最初の収縮を誘導した。その後すぐに、脊髄移植片の近傍に位置した神経支配された筋繊維が、実質的に連続して収縮していた。神経支配された繊維は、神経支配されていない繊維からは、形態学的に及び空間的に離れており、容易に区別することができた。
２７日目に、共培養物を、グルタミン酸塩適用の１時間前に、単独で又は３化合物の混合物で試験される試験化合物（種々の濃度）とともにプレインキュベートした。
ＨＡ、ＣＡ又はＦＡ化合物及び混合物（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）のインキュベーション１時間後、グルタミン酸塩を、３化合物又は化合物の混合物が存在するコントロール培地で希釈して終濃度６０μΜとなるように加えて２０分間置いた。
２０分間の損傷後、共培養物を洗浄し、個々の試験化合物及び混合物をさらに４８時間加えた。
４８時間後、前記共培養物をエンドポイント評価のために調製した（下記参照）。
４８時間の毒性化後、細胞を培養神経支配培地で３７℃、１５分間、Alexa 488（Molecular probes, Batch : 1434893）と一緒に５００ｎＭのα―ブンガロトキシンとともにインキュベートした。ＰＢＳ（Pan Biotech, Batch : 7560414）で２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ、ｐＨ＝７．３中、４％パラホルムアルデヒド（Sigma Aldrich, Batch : SLBF7274V）の溶液により、室温で２０分間固定した。該細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、透過処理を施し、非特異的部位を、０．１％サポニン（Sigma-Aldrich, Batch : BCBJ8417V）及び１％ＦＣＳ（Gibco, Batch : 41F0423K）を含有するＰＢＳ溶液で、室温にて１５分間ブロッキングした。共培養物を、１％ＦＣＳ、０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／４００希釈の、マウスで作製したモノクローナル抗ニューロフィラメント２００ＫＤ抗体（NF, Sigma Aldrich, Batch : 053M4756）とともに室温で２時間インキュベートした。ＮＦに対する抗体は、運動ニューロンの軸索を染色した。この抗体を、１％ＦＣＳ、０．１％サポニンを含有するＰＢＳ中、１／４００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen, Batch : 1218263）で、室温にて１時間可視化した。ニューロンの核はＨｏｅｃｈｓｔ溶液、同溶液中の蛍光標識（Hoechst solution, SIGMA, batch: 011M4004V）１μｍ／ｍｌで染色した。
ＮＭＪのＮＭＪ平均サイズ（面積）及び神経突起の全長を下記の実験条件にて評価した（Combesら、2015参照）。各条件につき、ウェル当たり２０枚の写真を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（Molecular Devices）を用い、中央エリアで倍率１０倍で撮影した。画像の全ては同じ条件にて撮影した。
以下のエンドポイントは自動的に評価した。
ＮＭＪ面積：ＮＭＪの平均サイズは、神経支配の質を評価するために測定した。
ＮＭＪ面積：ＮＭＪの平均サイズは、神経支配の質を評価するために測定した。
神経突起長：神経突起長は、共培養物の神経突起ネットワークの程度を評価するために測定した。
データは、グルタミン酸塩損傷を表すために、コントロール条件（毒性化無し、グルタミン酸塩不含＝１００％）に対するパーセンテージで表した。値は全て、平均±ＳＥＭ（ｓ．ｅ．平均）（培養物当たり条件当たりｎ＝６ウェル）として表した。グラフ化及び統計分析は異なる条件（Ｐｒｉｓｍ ｓｔａｔソフトウエア・ヴァージョン５．０を用い、許容される場合には、ＡＮＯＶＡとその後のＰＬＳＤフィッシャー検定）で行った。
２．結果
結果を図９及び１０に示す。
結果を図９及び１０に示す。
図９ａ−ｄは、文献で従前に示されているように[Combesら、2015、前掲]、グルタミン酸塩（６０μΜ、２０分）が有意なＮＭＪ平均サイズの縮小を誘導したことを示している。
ＨＡを添加すると（試験した全濃度）、わずかな保護効果が見られ、１００ｎＭでは有意性が見られた（図９ａ）。ＨＡで釣鐘型曲線の作用が見られた。ＣＡをグルタミン酸塩の１時間前に加えると、最高用量（５ｎＭ）でのみＮＭＪを保護することができ、低濃度では損傷からＮＭＪを保護できなかった（図９ｂ）。
ＨＡと同様に、ＦＡはＮＭＪの完全性を保護することができたが、１００ｎＭでだけであった（図９ｃ）。釣鐘型曲線の作用が見られた（最低及び最高濃度は不活性であった。）。
ＨＡ／ＣＡ／ＦＡの混合物の存在下では、ほぼ全ての試験混合物で大きくかつ有意な保護効果が見られた（図９ｄ）。
前記３化合物の混合物は、個々の化合物では活性ではなかった全ての試験濃度において活性であったと言及することができる。
図１０は、文献で従前に示されているように[Combesら、2015、前掲]、グルタミン酸塩（６０μΜ、２０分）が筋細胞を神経支配する神経突起ネットワーク総数の大きくかつ有意な減少を誘導したことを示している。
ＨＡを添加すると（試験した全濃度）、有意には達しないものの１００ｎＭでわずかな神経保護が認められた以外には、神経保護効果は示されなかった（図１０ａ）。
ＣＡをグルタミン酸塩の１時間前に加えると、神経突起ネットワークに対してわずかな保護を示し（図１０ｂ）、最高用量（５ｎＭ）で有意性が見られた。加えて、ＦＡは、試験した最高濃度（１０μＭ）に対して中程度の効果を示した（図１０ｃ）。
ＨＡ／ＣＡ／ＦＡの混合物の存在下では、ほとんど全ての試験混合物で大きくかつ有意な神経保護効果が見られた（図１０ｄ）。
これらの結果は、非活性濃度の３分子（ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ）の組合せが、グルタミン酸塩による損傷後にＮＭＪの完全性を保護することができることを示している。同様の効果が神経突起ネットワークでも観察された。初めて、これら３化合物の混合物による相乗作用的保護効果が、グルタミン酸塩で損傷させた神経―筋共培養物（十分に検証されたＡＬＳモデル）に認められた。
実施例８：フペルジンＡ、カフェ酸及びフェルラ酸による、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の副作用の防止
これら３つの単独分子、フペルジンＡ（ＨＡ）、カフェ酸（ＣＡ）及びフェルラ酸（ＦＡ）の前記効果を、十分に検証されたアルツハイマー病のin vitroモデルであるグルタミン酸塩で損傷された皮質ニューロンに対して評価した（Meraz-Riosら(2014) Oxid Med Cell Longev. 2014: 375968）。
これら３つの単独分子、フペルジンＡ（ＨＡ）、カフェ酸（ＣＡ）及びフェルラ酸（ＦＡ）の前記効果を、十分に検証されたアルツハイマー病のin vitroモデルであるグルタミン酸塩で損傷された皮質ニューロンに対して評価した（Meraz-Riosら(2014) Oxid Med Cell Longev. 2014: 375968）。
これらの結果を考慮して、該３化合物の混合物のＡＣｈＥ作用に対する効果を評価した。ＨＡは、ＡＣｈＥの強力な選択的阻害剤として広く証明されている[Wangら(2006), Acta Pharmacol Sin.;27(1) 1-26参照]。特異的ＡＣｈＥ阻害剤（ＡＣｈＥＩ）として、ＨＡの副作用はよく知られているコリン作用に関係している。
本試験における目的は、この特異的ＡＣｈＥＩ作用が前記混合物によって増強されるかどうか、及びＨＡの副作用が前記混合物によって増強されるかどうかを調べることである。
１．試験の項
ａ．ＨＡ、ＣＡ及びＦＡ並びにＨＡ／ＣＡ／ＦＡ混合物
単独で又は混合物として試験化合物を種々の濃度にて培地に溶解し、その後、ＡＣｈＥ測定キット（Promega, France）とともにプレインキュベートした。
ａ．ＨＡ、ＣＡ及びＦＡ並びにＨＡ／ＣＡ／ＦＡ混合物
単独で又は混合物として試験化合物を種々の濃度にて培地に溶解し、その後、ＡＣｈＥ測定キット（Promega, France）とともにプレインキュベートした。
ｂ．ＨＡ、ＣＡ及びＦＡ並びにＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１（トウゲシバ抽出物、ＨＡ／ＣＡ／ＦＡ混合物を使用）
実施例４に従って調製した単独の又はＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１としての試験化合物を種々の濃度にて培地に溶解し、その後、ＡＣｈＥ測定キット（Promega, France）とともにプレインキュベートした。
実施例４に従って調製した単独の又はＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１としての試験化合物を種々の濃度にて培地に溶解し、その後、ＡＣｈＥ測定キット（Promega, France）とともにプレインキュベートした。
ｃ．ＡＣｈＥアッセイ
キット アセチルコリンエステラーゼ（Abeam ref ab138871）を使用した。簡単に述べれば、５０μLの各化合物（ＨＡ、ＣＡ若しくはＦＡ又は混合物若しくは抽出物）を５０μLの標準液に加えた。１０分間インキュベートした。吸光度は４１０ｎｍで評価した。
キット アセチルコリンエステラーゼ（Abeam ref ab138871）を使用した。簡単に述べれば、５０μLの各化合物（ＨＡ、ＣＡ若しくはＦＡ又は混合物若しくは抽出物）を５０μLの標準液に加えた。１０分間インキュベートした。吸光度は４１０ｎｍで評価した。
ＡＣｈＥ活性は、ＡＣｈＥ活性標準曲線と対置して評価した。
データは、コントロール条件（化合物不含＝１００％）に対するパーセンテージで表した。値は全て、平均±ＳＥＭ（ｓ．ｅ．平均）（培養物当たり条件当たりｎ＝６ウェル）として表した。グラフ化及び統計分析は異なる条件（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア・ヴァージョン５．０を用い、許容される場合には、ＡＮＯＶＡとその後のダネット又はＰＬＳＤフィッシャー検定）で行った。
２．結果
結果を図１１及び１２に示す。
結果を図１１及び１２に示す。
図１１はＨＡの用量作用曲線を示す。前記酵素の阻害は１０ｐＭから１０ｎＭまで見られた。興味深いことに、ＣＡとＦＡは、試験した用量（それぞれ５０ｐＭ及び１００ｐＭ）において、ほとんど不活性（約８％阻害）であった。
前記３化合物の混合物は、前記酵素の阻害において特に良い又は低い有効性を示さなかった。該効果は、単独化合物として使用したＨＡの同量で見られた効果と同様であった。前記３化合物（ＨＡ １００ｐＭ）の混合物の最大用量においては、阻害効果はＨＡを単独で使用したときの阻害と類似していた。図１２は、ＨＡの用量作用曲線を示す。前記酵素の阻害は１０ｐＭから１０ｎＭまで見られた。
実施例４に従って調製したＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１について、ＡＣｈＥ活性に関して試験した。該抽出物の用量は試験したＨＡ単独のときと同量とした。
興味深いことに、ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１、前記３化合物の混合物、及びＨＡ（等価用量）の間に同様の用量作用曲線が認められ、ＡＣｈＥ酵素の阻害効果の増加、減少は認められなかった。
ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１（ＨＡ、ＣＡ及びＦＡ含有）に対しては、相乗効果の増強は認められなかった。
これら全ての結果は、オリジナル抽出物（ＮＳＰ０１−００１−Ｅ００１）が、ＨＡの安全使用を可能にすることを初めて示している。この抽出物は、安全な濃度範囲（すなわち、有害事象が生じない濃度）において神経保護作用及び神経再生作用を示す。
Claims (12)
- 有効成分として相乗作用的に有効な量で
（ｉ）天然又は合成起源のフペルジン、その薬学上許容される塩又はフペルジンを含有する植物抽出物、並びに
（ｉｉ）天然又は合成起源のヒドロキシ桂皮酸類からなる群から選択される少なくとも２つの化合物、それらの混合物、及びそれらを含有する植物抽出物
を含む、組合せ組成物であって、
前記ヒドロキシ桂皮酸類がカフェ酸及びフェルラ酸であり、
フペルジン／カフェ酸／フェルラ酸のモル比が０．０１／０．５／１０〜０．１／５／１０００の間に含まれるか、又は０．０１／５０／１００に等しく、若しくは０．０１／５／１００に等しい組合せ組成物。 - フペルジン／カフェ酸／フェルラ酸のモル比が０．０１／０．５／１０〜０．１／０．５／１０００の間に含まれる請求項１に記載の組合せ組成物。
- 前記フペルジンがフペルジンＡ、フペルジンＢ、それらの類似体及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組合せ組成物。
- 前記フペルジン／カフェ酸／フェルラ酸のモル比が０．０１／０．５／１００又は０．０１／５／１００である、請求項１に記載の組合せ組成物。
- 神経変性疾患又は病態の予防、抑制、遅延又はそれに罹患している対象の治療における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組合せ組成物。
- 前記神経変性疾患又は病態が、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ型老人性認知症（ＳＤＡＴ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む運動ニューロン疾患からなる群から選択される、請求項５に記載の組合せ組成物。
- 少なくとも１つの薬学上許容される又は栄養補助的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組合せ組成物。
- 経口投与、経皮投与、局所投与又は非経口投与に好適である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組合せ組成物。
- 同時、個別又は逐次使用による神経変性疾患又は病態の予防、抑制、遅延又は治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組合せ組成物。
- フペルジンＡ／カフェ酸／フェルラ酸を１／０．１／０．１〜１／０．４／０．６の間に含まれるモル比で含む、トウゲシバの抽出物。
- フペルジンＡ／カフェ酸／フェルラ酸を１／０．１／０．５のモル比で含む、請求項１０に記載のトウゲシバの抽出物。
- 同時、個別又は逐次使用による神経変性疾患又は病態の予防、抑制、遅延又は治療における使用のための、請求項１０に記載のトウゲシバの抽出物。
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