IT202000006517A1

IT202000006517A1 - Small molecules che inducono la degradazione della proteina prionica cellulare

Info

Publication number: IT202000006517A1
Application number: IT102020000006517A
Authority: IT
Inventors: Emiliano Biasini; Maria Letizia Barreca; Pietro Faccioli
Original assignee: Istituto Naz Fisica Nucleare; Univ Degli Studi Di Perugia; Univ Degli Studi Di Trento; Fond Telethon
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2021-09-27
Also published as: WO2021191883A1; CA3173357A1; EP4126225A1; US20230145822A1; AU2021244941A1

Description

Titolo: "Piccole molecole che inducono la degradazione della proteina prionica cellulare"

DESCRIZIONE

La presente invenzione trova applicazione in campo medico e, in particolare, nel trattamento dei disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrP<C>).

Campo tecnico dell'invenzione

L'invecchiamento ? legato a molteplici cambiamenti molecolari, cellulari e funzionali, che influenzano in particolare l'integrit? del sistema nervoso.

Un processo fondamentale alterato dall'invecchiamento ? la ripiegatura delle proteine. Quando le proteine si ripiegano male, acquisiscono conformazioni alternative, ricche di foglietti-?, in grado di innescare unacascata di eventi molecolari, portando infine a disfunzioni neuronali e alla morte. Gli aggregati associati alle malattie, spesso denominati fibrille amiloidi, possono derivare da proteine prive di sequenza o omologia strutturale ed essere associati ad una vasta gamma di sindromi e fenotipi clinici; esempi includono disturbi comuni come il Parkinson e il morbo di Alzheimer, cos? come disturbi pi? rari come la sclerosi laterale amiotrofica o le malattie da prioni.

Le malattie da prioni, che comprendono la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD), la sindrome di GerstmannStr?ussler-Scheinker (GSS) e l'insonnia familiare fatale (FFI), sono patologie legate al misfolding proteico che pu? manifestarsi in modo sporadico, ereditario o trasmissibile o acquisito.

Le malattie prioniche, note anche come encefalopatie spongiformi trasmissibili, sono associate alla conversione conformazionale della PrP<C>, una glicoproteina ancorata alla superficie cellulare tramite glicosil-fosfatidilinositolo endogeno (GPI), in una isoforma erroneamente piegata chiamata "forma di scrapie della PrP" (o PrPSc) che si accumula che si accumula nel sistema nervoso centrale degli individui colpiti.

La PrPSc ? una proteina infettiva (prione) priva di qualsiasi informazione codificata tramite acido nucleico in grado di propagarsi come un agente infettivo (prione) legandosi direttamente alla PrP<C >e innescando il suo riassetto conformazionale in nuove molecole di PrPSc, catalizzando la conversione strutturale della sua controparte fisiologica.

Nonostante queste caratteristiche peculiari, crescenti evidenze derivanti da studi genetici, biofisici e biochimici indicano che i meccanismi patogeni che operano nelle malattie da prioni possono essere alla radice dei percorsi neurodegenerativi che si verificano in diversi altri disturbi.

Ad esempio, sta diventando evidente che la PrP<C >svolge un duplice ruolo nelle malattie da prioni, essendo sia un substrato per la replicazione della PrPSc, sia un mediatore della sua tossicit? [1].

Questo concetto ? stato inaspettatamente ampliato da dati che coinvolgono gli assemblaggi oligomerici del peptide ? amiloide (A?) e della proteina alfa-sinucleina, che si ritiene causino la sinaptotossicit? alla base del declino cognitivo del Parkinson e del morbo di Alzheimer, rispettivamente. Infatti, diversi studi hanno fornito la prova che la PrP<C >potrebbe mediare la tossicit? degli assemblaggi oligomerici di A? e alfa-sinucleina, suggerendo che assemblaggi sbagliati di diverse proteine patogene potrebbero esercitare i loro effetti dannosi bloccando, potenziando o alterando la normale attivit? della PrPC. Inoltre, la ricerca in campi ancora pi? lontani ha evidenziato ruoli sorprendenti per la PrPC in diversi contesti fisiologici e di malattia al di fuori del cervello, come i disturbi mielinici, le malattie autoimmuni e il cancro (Kuffer, A., et al., La proteina prionica ? un ligando agonistico del recettore Adgrg6 accoppiato alla proteina G. Natura, 2016; Mabbott, N.A., Immunologia della proteina Prion e Prioni. Prog Mol Biol Transl Sci, 2017; Hirsch, T.Z., S. Martin-Lanneree, e S. Mouillet-Richard, Funzioni della proteina Prion. Prog Mol Biol Transl Sci, 2017).

? importante notare che molti dati indicano che inibire la funzione della PrP<C >nei pazienti pu? essere la strategia pi? efficace per contrastare gli eventi neurotossici senza causare gravi effetti collaterali dannosi [4].

Questa ipotesi ? stata recentemente rafforzata dall'identificazione di alleli con perdita di funzione in individui sani, a sostegno della sicurezza delle strategie terapeutiche mirate alla PrP<C>.

Cos?, i composti in grado di modulare l'espressione e/o l'attivit? della PrP<C >potrebbero fornire una prospettiva terapeutica completamente nuova per le malattie legate alla proteina prionica cellulare (PrP<C>) o agli interattori della PrP<C >o a vie di segnale tossici che coinvolgono la PrP<C>.

Questi includono disturbi neurodegenerativi, come le malattie prioniche sporadiche, ereditarie o acquisite, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e altre asinucleinopatie; disturbi neuroinfiammatori e malattie demielinizzanti, come la sclerosi multipla; il cancro, in particolare il glioblastoma, il cancro gastrico, il cancro al seno, il cancro al colon.

L'evidenza sperimentale supporta la logica dell'impiego di tecnologie computazionali all'avanguardia per identificare nuove terapie per una variet? di patologie umane.

Tale processo, spesso indicato come scoperta di farmaci assistita dal computer, si basa su informazioni precise riguardanti la struttura tridimensionale delle proteine (la cosiddetta "conformazione nativa") associata alla malattia di interesse e, opzionalmente, su come tale struttura possa essere alterata per generare isoforme mal piegate.

L'elucidazione dei meccanismi molecolari alla base dei percorsi di ripiegamento e di misfolding delle proteine associate alla malattia ? un prerequisito per la progettazione di terapie efficaci.

Tuttavia, gli approcci sperimentali volti ad affrontare le dinamiche di ripiegamento delle proteine sono seriamente influenzati dal tradeoff tra le risoluzioni temporali e spaziali delle tecniche biofisiche disponibili. Le tecnologie basate sul computer, come le simulazioni di dinamica molecolare (MD), potrebbero in linea di principio superare questi limiti e aiutare a prevedere l'evoluzione nel tempo della conformazione delle proteine. In pratica, tuttavia, le simulazioni classiche MD non sono applicabili per studiare molti processi molecolari fondamentali, come la cascata di eventi alla base del ripiegamento di un tipico polipeptide biologicamente rilevante pi? grande di 100 aminoacidi. Il motivo ? che i tempi che possono essere simulati da MD, anche sui supercomputer pi? potenti, sono comunque di ordini di grandezza inferiori a quelli in cui avvengono le principali transizioni strutturali.

Gli inventori hanno impiegato i recenti progressi tecnologici nel campo della biochimica computazionale per progettare un paradigma di scoperta di farmaci completamente nuovo, basato sulla logica della regolazione negativa dell'espressione delle proteine, mirando agli intermedi di ripiegamento. L'approccio applicato alla proteina prionica ha sorprendentemente portato all'identificazione di una tasca all'interno di un intermedio di ripiegamento di detta proteina e alla progettazione di nuove molecole che, legando tale tasca, inibiscano efficacemente l?espressione della proteina prionica.

Riassunto dell'invenzione

Gli inventori hanno sorprendentemente scoperto che, per superare i limiti dei metodi dell'arte nota, si potrebbe applicare un paradigma sperimentale innovativo per la scoperta di farmaci, denominato "inattivazione della proteina farmacologica mediante il folding intermediate targeting" (PPI-FIT), in grado di identificare piccoli ligandi organici per intermedi di folding di una proteina pi? cineticamente e termodinamicamente rilevanti al fine di stabilizzare tale conformazione, promuovere la sua degradazione da parte del macchinario di controllo della qualit? cellulare e quindi inibire la formazione della proteina matura.

Gli inventori hanno identificato molecole caratterizzate da diverse impalcature (strutture) chimiche, che sono in grado di interagire con un intermedio di ripiegamento della proteina prionica cellulare (PrP<C>). Questi composti hanno la notevole capacit? di sopprimere l'espressione della PrP<C >nelle cellule aumentandone la degradazione post-traslazionale.

Di conseguenza, le impalcature (strutture chimiche) scoperte sono utili per il trattamento di malattie o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrP<C>).

Oggetto dell'invenzione

Un primo oggetto dell'invenzione ? rappresentato dai composti all'interno delle formule generali della rivendicazione 1, e dalle rivendicazioni dipendenti, in grado di indurre la degradazione della proteina prionica cellulare e che sono identificati utilizzando la metodologia PPI-FIT.

Composti specifici all'interno della presente invenzione rappresentano particolari forme di realizzazione.

In un secondo oggetto, la presente invenzione descrive le composizioni farmaceutiche che comprendono i composti dell'invenzione.

In un terzo oggetto, l'invenzione descrive i composti all'interno della formula generale dell'invenzione, i composti specifici cos? come le composizioni farmaceutiche che li compongono, per l'uso come medicinale.

In particolare, i composti dell'invenzione sono divulgati per l'uso nel trattamento di malattie o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrP<C>) o di interattori della PrP<C >o di vie di segnale tossiche che coinvolgono la PrP<C>, compresi i disturbi neurodegenerativi, come le malattie prioniche sporadiche, ereditarie o acquisite, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e altre ?-sinucleinopatie; disturbi neuroinfiammatori e malattie demielinizzanti, come la sclerosi multipla; il cancro, in particolare il glioblastoma, il cancro gastrico, il cancro al seno, il cancro al colon.

In un ulteriore oggetto, viene divulgato un metodo per il trattamento di malattie e/o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrP<C>) o di interattori della PrP<C >o di vie di segnale tossiche che coinvolgono la PrP<C >che comprendono la somministrazione di un composto dell'invenzione o di una composizione farmaceutica che comprende un composto dell'invenzione a un paziente che ne ha bisogno.

Un composto dell'invenzione pu? essere eventualmente somministrato in combinazione con altre molecole terapeutiche.

Breve descrizione delle figure

Figura 1: strutture 3D del dominio globulare, C-terminale del dominio nativo PrP<C >(a sinistra) e del suo intermedio di ripiegamento FI-PrP (a destra). In FI-PrP ? stata identificata un'unica tasca di legame (a destra). Tale tasca non ? accessibile nella PrP<C >nativa (sinistra).

Figura 2: Rappresentazione della struttura di PrP. A. rappresentazione schematica della struttura di PrP umana. La proteina ? organizzata come segue: un peptide di segnale (residui 1-22), precede cinque ripetizioni di ottapeptidi contenenti istidina (residui 51-89), che possono legare ioni divalenti. La regione centrale comprende un dominio idrofobico altamente conservato (residui 111-134). Il C-terminale, dominio globulare (risolto da NMR, PDB 1QLX, mostrato nel pannello B) comprende due brevi ?-fili anti-parallelo (residui 127-129; e 166-168) e tre a-eliche (H1, H2 e H3, residui 143-152, 171-191 e 199-221, rispettivamente). Un peptide C-terminale (residui 232-253) viene rimosso per consentire l'attacco di una frazione di glicosilfosfatidilinositolo (GPI), che fissa la proteina al foglietto esterno della membrana plasmatica. Il dominio globulare contiene anche due catene oligosaccaridiche legate tramite N (a Asn-181 e Asn-197) e un legame disolfuro tra i residui 179 e 214.

Figura 3: tasca di legame unica identificata nell'intermedio di ripiegamento PrP, evidenziata in grigio. Il riquadro mostra i residui specifici che definiscono il sito.

Figura 4: Schema sintetico di SM875. Reagenti e condizioni: (a) soluzione acquosa di NaHCO3; (b) riflusso di etanolo, 2 h; (c) 1:1 metanolo/aqueo 2M NaOH, riflusso lh; (d) 180?C, 10 min; 61%; (e) riflusso di etanolo 2,5 h, purificazione HPLC, 25%. La numerazione arbitraria dell'intermedio sintetico [1-(4-bromofenil)-1H-pirazol-5-ammina] viene utilizzata per l'assegnazione di 1H-NMR:

[?H 7.58(d, J 8.7 Hz, H-3?and H-5?), 7.47(d, J 8.7 Hz, H2?and H-6?), 7.41(s, H-3), 5.62 (s, H-4)].

Figura 5: Caratterizzazione strutturale di SM875.

A. Spettro 1H-NMR di SM875 (pannello superiore, 400 MHz) in CDC13 con CHC13 residuo a 7,25 ppm. Spettro 113C-NMR (pannello inferiore, 100 MHz) di SM875 in CDC13. B. Analisi ESI-MS per infusione diretta di una soluzione di metanolo dello spettro SM875 in modalit? ionica negativa con m/z 412.1/414.1 corrispondente al segnale [M-H] (pannello superiore); frammentazione che mostra m/z 397.1/399.1 (pannello inferiore); C. Spettro IR del prodotto finale SM875. Bande rilevanti (cm-1): 1681s, 1543s, 1515s, 1490s, 1274s, 991m, 828m, 728 vs; D. (i) Il pannello superiore mostra l'analisi LC-ESI-MS di SM875 separata da una colonna RP18 in acetonitrile/acqua 70:30 e rilevata a 254 nm (flusso 1 mL-min-1). Il pannello inferiore mostra il cromatogramma a ioni estraibili corrispondente a (ii) m/z 414/416 [M+H]+ ione per C19H1779BrN303/ C19H1781BrN303.

Figura 6: A. Struttura chimica di SM875. B-C. Trattamento dose-risposta di SM875 in cellule HEK293 (ATCC, CRL-1573) stabilmente trasfettate con PrP<C >murina o NEGR-1, come rilevato da Western blot utilizzando con specifici anticorpi anti-PrP<C >(B) o anti-NEGR-1 (C). D.

Trattamento dose-risposta di SM875 nella linea di cellule tumorali della mammella umana ZR-75 che esprimono la PrP<C >umana in modo endogeno, come rilevato dal trattamento dei blot con un anticorpo specifico anti-PrP<C>.

Figura 7: Effetto SM785 sull'elaborazione posttraslazionale di PrPc. cellule HEK293 murine che esprimono stabilmente PrP<C >sono state esposte a diverse concentrazioni di SM875 (mostrato) o veicolo (DMSO, volume equivalente) per 24 ore, lisate, trattate con l'enzima PNGase-F per rimuovere residui di zucchero, e analizzati tramite Western blotting.

Figura 8: Effetto di SM875 sulla localizzazione cellulare di PrP<c>. Analisi di immunofluorescenza di cellule HEK293 che esprimono in modo stabile la PrP<C >marchiata (?taggata? con) EGFP incubata con SM875 (B e C) o controllo del veicolo (DMSO) (A).

Figura 9: A. Struttura chimica del derivato SM875 SM898. B. Saggio di vitalit? cellulare in cellule HEK293 che esprimono PrP<C >, tramite il saggio MTT. C. Effetti di SM875 e SM898 sull'espressione della PrP<C>, tramite il saggio Western blotting.

Figura 10: Analisi degli effetti del composto derivato da PPI-FIT SM930 sull'espressione di PrP<C>. A.

Struttura chimica di SM930; B. Saggio di vitalit? cellulare in HEK293 (pannello sinistro) o cellule ZR-75 (pannello destro), tramite il saggio MTT, dimostrando che SM930 induce morte cellulare alla pi? alta concentrazione testata (30 ?M); C. Immagini rappresentative da Western blotting e grafici di quantificazione che mostrano che SM930 sopprime significativamente l'espressione PrP<C >del mouse alla pi? alta concentrazione (30 ?M), ma non la proteina di controllo NEGR-1, quando testato in cellule HEK293 trasformate stabilmente; D. Immagini rappresentative da Western blotting e grafici di quantificazione che mostrano che SM930 sopprime significativamente l'espressione PrP<C >umana (a partire dalla concentrazione di 3 ?M), ma non la proteina di controllo Thy-1, quando testato in cellule tumorali del seno umano ZR-75 non trasformate. Le differenze statistiche sono state stimate da Anova a senso unico, test Dunnet post-hoc. valori p sono: *<O.05, **<0.01, ***<0.001.

Figura 11: Analisi degli effetti del composto derivato da PPI-FIT SM940 sull'espressione di PrP<C>. A. Struttura chimica di SM940; B. Saggio di vitalit? cellulare in cellule HEK293 o ZR-75, tramite il saggio MTT, dimostra che che SM940 non induce la morte cellulare rilevabile alle concentrazioni testate (indicato); C.

Immagini rappresentative da Western blotting e grafici di quantificazione che mostrano che SM940 sopprime significativamente l'espressione PrP<C >murina a partire da 3 ?M, ma non la proteina di controllo NEGR-1, quando testato in cellule HEK293 stabilmente trasformate; D. Immagini rappresentative da Western blotting e grafici di quantificazione che mostrano che SM940 sopprime significativamente l'espressione PrP<C >umana (a partire dalla concentrazione di 3 ?M), ma non la proteina di controllo Thy-1, quando testata in cellule tumorali del seno umano ZR-75 non trasformate. Le differenze statistiche sono state stimate da Anova a senso unico, test Dunnet post-hoc. valori p sono: *<O.05, **<0.01.

Figura 12: Analisi degli effetti del composto derivato da PPI-FIT SM950 sull'espressione PrP<C>. A Struttura chimica di SM950; B. Saggio di vitalit? cellulare in cellule HEK293 o ZR-75, tramite saggio MTT, dimostra che SM950 induce morte cellulare ad alcune delle concentrazioni testate (indicato); C. Immagini rappresentative da Western blotting e grafici di quantificazione che mostrano che SM950 sopprime significativamente l'espressione PrP<C >del mouse a partire da 10 ?M, ma non la proteina di controllo NEGR-1, quando testato in cellule HEK293 stabilmente trasformate; D.

Immagini rappresentative da Western blotting e grafici di quantificazione che mostrano che SM950 sopprime significativamente l'espressione PrP<C >umana (a partire dalla concentrazione di 1 ?M), ma non la proteina di controllo Thy-1, quando testata in cellule tumorali del seno umano ZR-75 non trasformate. Le differenze statistiche sono state stimate da Anova a senso unico, test Dunnet post-hoc. p valori sono: *<0.05, **<0.01, ***<0.001.

Figura 13: Analisi PCR in tempo reale dei livelli di mRNA della PrP<C >dopo il trattamento con il composto. SM875 non diminuisce i livelli di mRNA di PrP<C >in: A, cellule HEK293 stabilmente trasfettate; B, cellule umane non trasformate di cancro al seno ZR-75; o C, fibroblasti di topo L929. Allo stesso modo, i composti SM940 (D) e SM950 (E) non sopprimono i livelli di mRNA di PrP<C >murina nelle cellule HEK293. Questi risultati dimostrano che i diversi composti non diminuiscono la quantit? di mRNA di PrP<C>, dimostrando cos? che agiscono a livello posttraslazionale. ? interessante notare che un aumento significativo di mRNA di PrP<C >? stato occasionalmente rilevato per alcune cellule/concentrazioni, indicando eventualmente una risposta compensatoria delle cellule alla diminuzione indotta della PrP<C >a livello proteico. Le differenze statistiche sono state stimate da Anova a senso unico, Dunnet post-hoc test. p valori di p sono: *<0.05.

Figura 14: I composti derivati da PPI-FIT SM875 e SM940 inducono l'aggregazione di PrP<C >ricombinante in modo dipendente dalla temperatura. A. Schema dell'esperimento. Al fine di osservare un effetto diretto delle molecole identificate sulla PrP<C >in vitro, ? stato progettato un paradigma sperimentale in cui la PrP<C >nella sua forma matura ripiegata viene riscaldata a diverse temperature con la speranza di fornire energia sufficiente a consentire la sua transizione conformazionale al previsto intermedio di ripiegatura (FI-PrP). Se l'intermedio di ripiegatura appare come conseguenza dell'innalzamento della temperatura, allora gli inventori hanno previsto che i composti dell'invenzione, per esempio SM875 o SM940, dovrebbero essere in grado di legarlo, causandone la stabilizzazione e quindi probabilmente inducendone l'aggregazione, poich? l'FI-PrP espone residui idrofobici di solvente che sono invece sepolti all'interno del nucleo proteico della PrP<C >nella forma ripiegata (matura). L'aggregazione della proteina ricombinante PrP ? stata valutata con un test di insolubilit? in detergente. B. Immagini rappresentative da Western blotting che mostrano gli effetti dipendenti dalla temperatura sull'aggregazione di PrP esercitati dai composti SM875 e SM940. L'aumento di temperatura ? stato il seguente: corsie 1,5, T = 25?C; corsie 2,6, T = 37?C; corsie 3,7, T = 45?C; corsie 4,8, T = 55?C. C. Grafici di distribuzione che illustrano i risultati. I composti SM875 e SM940 hanno causato l?aumento della quantit? di PrP ricombinante insolubile in funzione della temperatura. Al contrario, non sono stati rilevati effetti nei controlli non trattati, o quando la proteina ? stata incubata con la molecola SM935. Questi risultati indicano che il composto SM875 e SM940 si legano ad un intermedio di ripiegamento di PrPC (cio? FI-PrP). Le differenze statistiche sono state stimate da Anova unidirezionale, Dunnet post-hoc test. p valori sono: *<0.05, **<0.01.

Figura 15: SM875 induce l'attivazione dell'autofagia in modo dipendente dalla PrP<C >e i suoi effetti sono inibiti dall'inibitore dell'autofagia Bafilomicina A1. A. In primo luogo, le cellule HEK293 stabilmente trasformate con PrP<C >murina o non trasformate sono state trattate con SM875 a diverse concentrazioni e poi i livelli del marcatore autofagico LC3II sono stati valutati da Western blotting. Immagini rappresentative (sopra) e la quantificazione corrispondente (grafico a barre qui sotto) mostrano che SM875 induce un grande aumento di LC3II in cellule esprimenti PrP<C>- (HEK293 WT-PrP) e un aumento molto minore in cellule non trasformate. Tuttavia, si deve notare che le cellule non trasformate esprimono endogenamente livelli di PrP<C >bassi ma ancora rilevabili, che possono eventualmente spiegare il piccolo aumento di LC3III rilevato in queste cellule.

I dati sono stati normalizzati sull'effetto del trealosio (TRE), un induttore autofagico noto, che come previsto ha aumentato i livelli di LC3-II sia nelle cellule che esprimono la PrP<C >che in quelle non trasfettate. B.

Successivamente, le cellule tumorali della mammella ZR-75 che esprimono la PrP<C >umana in modo endogeno sono state trattate con concentrazioni crescenti di SM875, in presenza o meno di Bafilomicina A1 (BAF), un noto inibitore della degradazione lisosomiale. Le immagini rappresentative (sopra) e la corrispondente quantificazione (grafico a barre sotto) mostrano che il BAF impedisce quasi completamente la diminuzione dei livelli di PrP<C >indotta da SM875. Collettivamente, questi dati indicano che SM875 promuove la degradazione posttraslazionale della PrP<C >attraverso la via autofagica dipendente dal lisosoma. Le differenze statistiche sono state stimate da Anova a senso unico, Dunnet post-hoc test. p valori di p sono: *<0.05, **<0.01, ***<0.001.

Figura 16: SM875 inibisce la replicazione dei prioni nei fibroblasti di topo. A. Lo schema illustra il layout sperimentale, utilizzando come esempio l'effetto del Fe (III) -TMPyP, un composto anti-prione descritto precedentemente (Massignan et al. SciRep 2016). B. Le cellule sono state incubate con concentrazioni crescenti di SM875 (indicato) o con TMPyP (10 ?M) e il livello di PrP resistente alla PK ? stato quantificato tramite Western blotting. I risultati hanno mostrato che, analogamente al controllo positivo TMPyP, SM875 inibisce i livelli di prioni in modo dose-dipendente. Le differenze statistiche sono state stimate da Anova a senso unico, test Dunnet post-hoc. p valori di p: *<0.05, **<0.01, ***<0.001.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

Definizioni

Ai sensi della presente invenzione, una malattia o patologia ? una condizione risultante da una risposta fisiopatologica a fattori esterni o interni.

Un disturbo ? un'alterazione delle funzioni normali o regolari del corpo o di una parte del corpo a causa di una malattia.

Sindrome ? un termine che si riferisce a una malattia o a un disturbo che ha pi? di una caratteristica o sintomo identificativo.

Nell'ambito della presente invenzione, i termini malattia, disturbo, patologia sono utilizzati in modo intercambiabile e vanno intesi nel significato pi? ampio di malattia.

Come usato nella presente invenzione, il termine "trattamento" si riferisce all'uso di un composto per scopi terapeutici, che includono la diminuzione o la prevenzione dei sintomi della malattia, la progressione pi? lenta di tali sintomi, l'abrogazione dei sintomi, cos? come l'abrogazione totale o parziale della causa della malattia.

All'interno della presente invenzione, una malattia neurodegenerativa ? una malattia risultante da processi neurodegenerativi, ad esempio la progressiva perdita di struttura o funzione dei neuroni, compresa la morte neuronale.

Le malattie neurodegenerative includono, ma non sono limitate a, il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, la malattia di prione, la sclerosi laterale amiotrofica.

I disturbi neuroinfiammatori sono condizioni in cui le risposte immunitarie danneggiano i componenti del sistema nervoso.

Una malattia demielinizzante ? una malattia del sistema nervoso in cui la guaina mielinica dei neuroni ? danneggiata.

Come definito nel presente documento e nella WO 2020/021493, la fase di modellazione di una sequenza nel tempo di un percorso di ripiegatura delle proteine viene effettuata mediante simulazioni al computer basate sugli approcci di Meccanica Molecolare (MM) o Meccanica Quantistica-Meccanica Molecolare (QM-MM). Tali simulazioni al computer sono basate sulla dinamica molecolare Ratchet-and-pawl, e/o su un approccio di calcolo funzionale Bias, e/o per mezzo di un approccio di calcolo Self-Consistent Path Sampling.

Maggiori dettagli sugli algoritmi esemplari che possono essere efficacemente utilizzati per effettuare la suddetta fase di modellazione dell'evoluzione temporale di un percorso di piegatura delle proteine si possono trovare nei lavori scientifici "S. Orioli, S. a Beccara, e P. Faccioli, J. Chem. Phys. 147, 064108 (2017)"; "C. Camilloni, R. A. Broglia, e G. Tiana, J. Chem. Fis. 134, 045105 (2011)"; "S. a Beccara, L. Fant, e P. Faccioli, Phys. Rev. Lett. 114, 098103 (2015)".

Nel contesto della presente invenzione, il "percorso di ripiegatura" descrive il passaggio da una proteina dispiegata alla sua piega nativa nel corso del tempo, cio? come una catena di aminoacidi raggiunge il suo stato termodinamicamente stabile. Nel contesto delle "vie di ripiegamento delle proteine" e delle "vie di ripiegamento", menzionate nella presente descrizione, si intende all'interno della sintesi proteica endogena, e non correlate a processi di denaturazione o di rinaturazione o a conformeri o "conformazioni di breve durata".

La "drogabilit?" ? la capacit? di una proteina, o di qualsiasi "conformero" di una proteina, di consentire il legame di un farmaco (ad esempio, una piccola molecola, qualsiasi altro composto organico, un peptide o un anticorpo), causando cos? potenziali benefici terapeutici per i pazienti. Un "conformero" ? ogni conformazione alternativa dello stesso polipeptide. Esso riflette l'isomerismo conformazionale dei polipeptidi e il carattere statistico degli stati termodinamici delle macromolecole.

Nella presente descrizione, coerentemente con una terminologia comunemente usata nel campo della ricerca farmaceutica, il termine "tasca" indica una regione spaziale della struttura proteica terziaria adatta a legare una piccola molecola.

In particolare, il concetto di sacche drogabili si riferisce ad uno specifico sito di legame di un bersaglio proteico legato alla malattia in grado di legare molecole simili ai farmaci ottenendo cos? una modulazione della funzione biologica della proteina.

Quando il sito di legame non ? noto da una struttura 3D (ad esempio, complesso ligando-proteico) o da altri dati sperimentali (ad esempio, mutazioni della resistenza ai farmaci), si possono utilizzare metodi di calcolo per suggerire le posizioni probabili.

Di conseguenza, diverse propriet? e/o parametri e/o descrittori di tasche globali (e rispettivi valori esemplari) possono essere utilizzati per caratterizzare i siti/tasche di rilegatura.

Ad esempio, un'adeguata tasca drogabile pu? essere caratterizzata da una deviazione radice-media-quadrata (RMSD) pi? grande di una soglia di deviazione radicemedia-quadrata dalla tasca presente allo stato nativo.

In un esempio non limitativo, detta soglia di deviazione radice-media-quadrato ? pari a 2 ?ngstr?m (?) o superiore a 2 ?ngstr?m (?).

Secondo la presente invenzione, la tasca ? definita in termini di parametri di tasca che sono strumentali per prevedere la sua drogabilit? attraverso il confronto di tali parametri di tasca con le rispettive soglie.

Tali parametri di tasca comprendono i parametri dimensionali, e/o i parametri di forma, e/o i parametri di posizione, e/o il rapporto tra carattere idrofobico e idrofilo.

In particolare, i parametri dimensionali della tasca possono comprendere il volume della tasca e/o la profondit? della tasca e/o dell'involucro e l'esposizione della tasca. L'esposizione e le propriet? dell'involucro forniscono una misura diversa di quanto il sito sia aperto al solvente.

In un esempio di implementazione, la soglia di volume tascabile ? di almeno 300 ?3.

In un esempio di implementazione, la soglia di esposizione della tasca ? inferiore a 0,5 e la soglia della custodia della tasca ? almeno 0,7.

In un esempio di implementazione, la soglia di profondit? della tasca ? di almeno 10?.

I parametri di punteggio per l'identificazione dei ?hot spots? della proteina comprendono "SiteScore", e/o "Dscore", e/o "DrugScore" e/o il bilancio tascabile.

Questi parametri sono noti nel campo della modellazione e della caratterizzazione delle proteine e degli intermedi proteici, e si basano su un mix di valori, relativi a diverse propriet?, adatti a valutare la "drogabilit?" di una proteina allo stato nativo o di un intermedio proteico di ripiegamento.

Infatti, tali parametri di punteggio derivano da pacchetti di software di valutazione noti.

Ad esempio, SiteMap (Halgren TA (2009) "Identificazione e caratterizzazione di siti vincolanti e valutazione della drogabilit?", J. Chem. Inf. Modello 49: 377-389) prevede un punteggio del sito (SiteScore) e un punteggio di drogabilit? (DScore) attraverso una combinazione lineare di soli tre singoli descrittori: la dimensione della tasca di rilegatura, il suo recinto, e una penalit? per la sua idrofilia.

Un altro esempio ? DoGSiteScorer (A. Volkamer, D. Kuhn, T. Grombacher, F. Rippmann, M. Rarey, "Combining global and local measures for structure-based druggability predictions" J. Chem. Inf. Modello.

2012,52,360-37), che genera anche un punteggio di drogabilit? (DrugScore) che va da zero a uno.

La selezione si basa sul confronto dei parametri di punteggio con le rispettive soglie.

All'interno della presente invenzione, i parametri di punteggio sono stati definiti come segue:

la soglia SiteScore tascabile ? di 0,8.

la soglia del DScore tascabile ? di 0,9.

la soglia tascabile di DrugScore ? di 0,5.

la soglia di equilibrio tascabile ? di 1,0.

Mentre i criteri per l'identificazione e la selezione dell'intermedio di ripiegamento e della tasca di legame con il composto come sopra elencati, si basano su un confronto di parametri e/o valori relativi alle propriet? scelte con le rispettive soglie, la persona esperta nell'arte pu? capire che i valori esemplari e le rispettive soglie possono essere soggetti a modifiche a seconda del tipo di proteina o di altri requisiti, senza che ci? influisca sulla definizione di tasca di legame con il composto.

L'inattivazione delle proteine farmacologiche tramite il Folded Intermediate Targeting (metodologia PPI-FIT)

Il metodo per identificare gli intermedi di ripiegamento della proteina bersaglio adatti ad essere testati come bersagli per le procedure di scoperta del farmaco divulgate in WO 2020/021493 ? applicato nella presente invenzione alla progettazione e selezione di composti contro l'intermedio di ripiegamento pi? cineticamente e termodinamicamente rilevante della proteina prionica, al fine di stabilizzare tale intermedio e inibire la sua transizione alla forma nativa. In un ambiente cellulare, detto intermedio stabilizzato di ripiegamento ? riconosciuto dalla macchina di controllo di qualit? della cellula come un polipeptide impropriamente piegato e inviato alla degradazione.

Cos?, gli inventori hanno selezionato composti terapeuticamente rilevanti in grado di diminuire l'espressione della proteina prionica con benefici terapeutici nelle malattie prioniche, ed eventualmente altri disturbi, per esempio i disturbi neurodegenerativi, legati all'attivit? di trasmissione della tossicit? proprio a di questa proteina.

Come primo passo, gli inventori hanno ricostruito l'intera sequenza di eventi alla base del percorso di ripiegamento della proteina prionica con un livello di risoluzione atomistica.

Questo ? stato fatto per mezzo di simulazioni molecolari atomiche basate sull'approccio Bias Functional (BF), come dettagliato in Metodi.

Secondo questo approccio, una prima serie di conformazioni proteiche completamente denaturate si ottiene per mezzo di simulazioni di dinamica molecolare (MD) eseguite a grande temperatura, partendo dalla struttura nativa del cristallo proteico.

Successivamente, da ciascuna delle configurazioni iniziali dispiegate vengono generati molti percorsi di piegatura indipendenti per mezzo di uno specifico algoritmo chiamato rMD (ratchet-and-pawl molecular dynamics), che contiene una forza di polarizzazione per promuovere il tasso di transizione di piegatura.

Infine, la traiettoria meno orientata (LBT) nell'insieme delle traiettorie di piegatura rMD generate a partire dalla stessa condizione dispiegata ? stata selezionata calcolando il punteggio funzionale definito Eq.(4) in Metodi.

Per identificare gli intermedi di ripiegatura, tutte le configurazioni visitate dalle traiettorie rMD sono tracciate nel piano definito dalla deviazione quadratica radice-metallo-principale istantanea (RMSD)alla struttura nativa e alla frazione di contatti nativi.

L'intermedio di ripiegamento ? identificato con una regione ad alta densit? nell'istogramma di frequenza su questo piano, separata dall'alta densit? associata allo stato nativo della proteina.

Le configurazioni nell'intermedio di piegatura vengono poi raggruppate strutturalmente utilizzando algoritmi di clustering standard.

Infine, i target proteici sono stati identificati tra i conformeri dei suddetti cluster, selezionati tra i LBT e che soddisfano i criteri PPI-FIT.

Poi, gli inventori hanno impiegato tecniche di modellazione in-silico e di screening virtuale dei farmaci per identificare ligandi specifici per l'intermedio di ripiegatura PrP<c >qui identificato. Potenziali siti di legame unici nella struttura dell'intermedio di ripiegatura e non presenti nella conformazione nativa sono stati identificati sulla superficie dell'intermedio di PrP, tenendo conto delle propriet? tipiche delle tasche di di legame ai composti, come il volume, la profondit?, l'involucro/esposizione e l'idrofobicit?, come mostrato nella tabella 1.

Tabella 1

Tra l'elica spostata 1 e l'elica 3, definita da 14, residui non continui (152, 153, 156, 157, 158, 187, 196, 197, 198, 202, 203, 205, 206, 209 con riferimento alla sequenza PDB 1QLX), ? stata selezionata una tasca di droga accessibile ai solventi. La conformazione di questa tasca ? stata oggetto di una campagna di screening virtuale eseguita utilizzando il software BioSolvelT e impiegando la collezione Asinex Gold & Platinum di piccole molecole (~3,2 x 105 composti disponibili in commercio). I risultati positivi sono stati filtrati da diversi strumenti di chemioinformatica per prevedere l'interferenza del Pan-assay (ad esempio la selezione di composti di interferenza del Pan-assay (PAINS) che reagiscono in modo non specifico con numerosi bersagli biologici piuttosto che influenzare specificamente un bersaglio desiderato), e propriet? come la farmacodinamica, la fisico-chimica e le propriet? ADME (adsorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione). I composti sono stati raggruppati in base alla loro impalcatura chimica ed ? stata generata una graduatoria dei candidati colpiti.

A seguito della validazione biologica, come descritto negli esempi qui riportati, sono stati selezionati quattro impalcature (classi) chimiche di molecole terapeutiche e diversi composti attivi.

Di conseguenza, un primo oggetto dell'invenzione ? rappresentato da impalcature (classi) chimiche in grado di indurre la degradazione della proteina prionica cellulare, identificate mediante la metodologia di inattivazione farmacologica di proteine tramite il folded intermediate targeting (PPI-FIT).

Secondo la metodologia dettagliata di cui sopra, le impalcature dell'invenzione hanno sorprendentemente dimostrato di legare in silico una specifica tasca corrispondente ad un sito di legame nell'intermedio di ripiegatura della proteina PrP, che ? assente nella sua conformazione nativa.

Secondo una prima forma realizzativa preferita, i composti identificati secondo la presente invenzione sono caratterizzati dal seguente impalcatura di Formula I generale (impalcatura I):

in cui:

l'anello B pu? essere parzialmente saturo, per esempio un anello di di-idropiridinone quando R<1 >? O e/o quando uno o entrambi X ? N, o insaturo, per esempio un anello di piridinone quando R<1 >? O;

R<1 >pu? essere O o S;

ogni atomo di carbonio sull'anello B pu? essere indipendentemente un atomo C o N;

X pu? essere selezionato indipendentemente da -C- o -O- o ?N(R<4>)-, dove R<4 >pu? essere -H, or -C1-4 lineare o ciclico alchilico;

l'anello C ? un anello aromatico a 5- o 6- elementi in cui ogni atomo di carbonio pu? essere -C- o -N, ad esempio Y pu? essere indipendentemente -C(R<3>)o -N(R<3>)-;

R<3 >? selezionato tra -H, c1-4 gruppo alchilico lineare o ciclico, alchossilico o arilossilico, anello A o anello Z A;

preferibilmente, l'anello C ha uno o due eteroatomi;

Z pu? essere -CH2- o -O- o -N(H)- o -S(02)- o -S(0)-;

l'anello A pu? essere un anello aromatico o eteroaromatico a 5- o 6- membri, preferibilmente un anello fenilico; l'anello A pu? essere sostituito in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R<2 >selezionati indipendentemente da: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2, -CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH.

Ai fini della presente invenzione, una formula generale preferita I ? l'impalcatura della formula I.1:

in cui si applicano le definizioni di cui sopra. Secondo forme realizzative preferite della presente invenzione, sono composti esemplari secondo la formula generale I:

SM 875

CAS n. 919023-94-2

1-(4-bromofenil)-4-(4-idrossi-3-metossifenil)-5,7 diidro-4H-pirazolo[3,4-b]piridina-6-one

e

SM 898

CAS n. 919024-19-4

1-(3-fluorofeni1)-4-(4-idrossi-3-metossifeni1)-5,7-diidro-4H-pirazolo[3,4-b]piridina-6-one

Secondo una seconda forma realizzativa esemplificativa, i composti identificati secondo la presente invenzione sono caratterizzati dalla seguente impalcatura di formula generale II (impalcatura II):

in cui:

ogni atomo di carbonio su ogni anello pu? essere indipendentemente un -C- o -N- atomo;

Z pu? essere -H, -CH2-, -S(O2)-, -S(O)-,

R<1 >pu? essere assente (quando Z ? -H) o pu? essere un gruppo selezionato indipendentemente da: H, C1-4 lineare, ramificato, alchilico ciclico o alcossilico o arilossilico opzionalmente sostituito con uno o pi? di uno: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2,-CF3, -OH, OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -S, un anello tetraidrofurano o un anello tetraidropiranico in cui ogni atomo di carbonio dell'anello pu? essere sostituito indipendentemente con -H o -OH, un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri sostituito in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R<2 >selezionati indipendentemente: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2, -CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH;

l'anello A e l'anello B sono ciascuno indipendentemente un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri, preferibilmente un anello fenilico; l'anello A e l'anello B possono essere sostituiti indipendentemente in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R<2 >selezionati indipendentemente tra: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2,-CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH.

Secondo le forme realizzative preferite della presente invenzione, un composto esemplare secondo la formula generale II ?:

SM 930

CAS n. 173157-92-1

3-(3,6-dibromocarbazol-9-il)propano-1,2-diolo Secondo una terza forma realizzativa esemplificativa, i composti identificati secondo la presente invenzione sono caratterizzati dalla seguente impalcatura di formula generale III (impalcatura III):

in cui:

ogni atomo di carbonio su ogni anello aromatico pu? essere indipendentemente un atomo C o N;

l'anello B e l'anello C sono anelli di imidazolo fusi,

l'anello D ? un anello di pirimidina, opzionalmente l'anello D pu? essere un anello di citosina o di uracile;

R<2 >sono ciascuno indipendentemente -H, -OH, -CH2OH, -CH3, -CH2CH3, alogeno selezionato nel gruppo che comprende: - F, -Cl, -Br, -I, -CF3, -OCH3;

X pu? essere indipendente: =O, - NH2, =S;

R<3 >? selezionato indipendentemente da -H, C1-4 lineare, ramificato o ciclico alchilico, anello A o Z-ring A;

Z pu? essere -CH2 o -S(O2)- o -S(O)-,

l'anello A pu? essere un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri, preferibilmente un anello fenilico; l'anello A pu? essere sostituito in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R<l >selezionati indipendentemente da: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2, -CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH.

Ai fini della presente invenzione, una formula generale preferita III ? l'impalcatura della formula III.1:

in cui si applicano le definizioni di cui sopra.

Secondo una forma realizzativa preferita, un composto esemplare secondo la formula generale III ?:

SM 940

CAS n. 919012-03-6

6-(2-idrossifeni1)-4,7,8-trimetil-2-[(2-metilfenil)metil]purino[7,8-a]imidazolo-1,3-dione Secondo una quarta forma realizzativa esemplificativa, i composti identificati secondo la presente invenzione sono caratterizzati da un'impalcatura di formula generale IV (impalcatura IV):

in cui:

ogni atomo di carbonio su ogni anello pu? essere indipendentemente un atomo C o N;

l'anello A e A' sono ognuno indipendentemente un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri, preferibilmente un anello fenilico;

gli anelli A, A' e B possono essere sostituiti in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R<1 >selezionati indipendentemente da: -H, -F, -Cl, -Br, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2,-CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH;

l'anello B ? un anello aromatico o non aromatico in cui ogni atomo pu? essere indipendentemente uno o pi? atomi di C o N o O o S o S(O2) e preferibilmente ? un anello di piperidina;

X ? -CH2, -O-, -S-, -N(H), -C(O)-, -C(S)-, -

C(H)=C(H)-, -S(O2), -S(O).

Ai fini della presente invenzione, una formula generale IV preferita ? la seguente formula generale IV.1:

in cui si applicano le definizioni di cui sopra.

Secondo forme realizzative preferite della presente invenzione, un composto esemplare secondo la formula generale I ?:

SM 950

CAS n.332939-23-8

(3-clorofeni1)-(6,7-dimetossi-3,4-diidro-1H-isochinolin-2-il)metanone

Come da specifiche forme realizzative della presente invenzione, i composti preferiti identificati con l'inattivazione delle Proteine Farmacologiche con la metodologia del Folded Intermediate Targeting (PPI-FIT) secondo quanto sopra esposto hanno una delle seguenti formule:

SM 875

CAS n. 919023-94-2

-(4-bromofeni1)-4-(4-idrossi-3-metossifeni1)-5,7-diidro-4H-pirazolo[3,4-b]piridina-6-one

SM 898

CAS n. 919024-19-4

SM 940

CAS n. 919012-03-6

6-(2-idrossifeni1)-4,7,8-trimetil-2-[(2-metilfenil)metil]purino[7,8-a]imidazolo-1,3-dione

SM 930

CAS n. 173157-92-1

3-(3,6-dibromocarbazol-9-il)propano-1,2-diolo

CAS n.332939-23-8

(3-clorofeni1)-(6,7-dimetossi-3,4-diidro-1H- isochinolin-2-il)metanone

In particolare, i composti preferiti

dell'invenzione sono SM875, SM898 e SM940.

I composti divulgati nella presente invenzione sono tutti disponibili in commercio e/o possono essere preparati secondo metodi noti nell'arte.

In un secondo oggetto, la presente invenzione descrive le composizioni farmaceutiche che compongono i composti dell'invenzione.

In un terzo oggetto, l'invenzione descrive i composti della formula generale (I, II, III e IV) e i composti specifici sopra riportati, nonch? le composizioni farmaceutiche che li compongono, per l'uso come medicinale.

In particolare, i composti dell'invenzione sono descritti per l'uso come medicamento nel trattamento di malattie o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrPC) o interagenti della PrPC o di vie di segnale tossiche che coinvolgono la PrPC, compresi i disturbi neurodegenerativi, come le malattie prioniche sporadiche, ereditarie o acquisite, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e altre ?sinucleinopatie; disturbi neuroinfiammatori e malattie demielinizzanti, come la sclerosi multipla; il cancro, in particolare il glioblastoma, il cancro gastrico, il cancro al seno, il cancro al colon.

In una forma realizzativa preferita, i composti della formula generale (I, II, III e IV) e i composti specifici sopra riportati sono divulgati per l'uso come medicinale nel trattamento delle malattie da prioni, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi multipla, glioblastoma, cancro gastrico, cancro al seno, cancro al colon.

In particolare, le malattie da prioni comprendono la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD), la sindrome di Gerstmann-Str?ussler-Scheinker (GSS) e l'insonnia familiare mortale (FFI).

Secondo un'ulteriore forma realizzativa dell'invenzione, i composti dell'invenzione sono descritti per l'uso nel trattamento di una malattia, dove il termine "trattamento" si riferisce a scopi terapeutici, che includono la diminuzione o la prevenzione dei sintomi della malattia, la progressione pi? lenta di tali sintomi, l'abrogazione dei sintomi, cos? come l'abrogazione totale o parziale della causa della malattia.

In un'altra forma realizzativa, le impalcature scoperte vengono divulgate per il trattamento dei disturbi demielinizzanti, tra cui, ma non solo, la sclerosi multipla.

Secondo un'ulteriore forma realizzativa, i composti dell'invenzione sono descritti per l'uso nel trattamento delle malattie sopra menzionate insieme ad altri trattamenti farmacologici o non farmacologici.

In particolare, si pu? dimostrare una sinergia farmacologica tra i composti dell'invenzione e:

? piccole molecole

? anticorpi,

- terapia genica o approcci terapeutici di

modificazione genica,

contro la PrP<C >o gli interattori della PrP<C >o vie di segnale tossici che coinvolgono la PrP<C>.

Pertanto, i composti dell'invenzione sono descritti per uso medico in combinazione con piccole molecole, anticorpi, terapia genica o approcci terapeutici di modificazione genica, contro malattie o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrP<C>) o interattori della PrP<C >o vie di segnale tossici che coinvolgono la PrP<C>.

In particolare, tali malattie o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrP<C>) o interattori della PrP<C >o vie di segnale tossiche che coinvolgono la PrP<C >comprendono disturbi neurodegenerativi, come le malattie prioniche sporadiche, ereditarie o acquisite, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e altre ?sinucleinopatie; disturbi neuroinfiammatori e malattie demielinizzanti, come la sclerosi multipla; il cancro, in particolare il glioblastoma, il cancro gastrico, il cancro al seno, il cancro al colon.

In un ulteriore oggetto, viene descritto un metodo per il trattamento di disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrP<C>) o di interattori della PrP<C >o di vie di segnale tossiche che coinvolgono la PrP<C >che comprendono la somministrazione di un composto dell'invenzione o di una composizione farmaceutica che comprende un composto dell'invenzione, ad un paziente che ne ha bisogno.

Secondo un'ulteriore forma realizzativa dell'invenzione, viene divulgato un metodo che comprende la somministrazione di un composto dell'invenzione per il trattamento di una malattia, in cui il termine "trattamento" si riferisce a scopi terapeutici, che includono la diminuzione o la prevenzione dei sintomi della malattia, la progressione pi? lenta di tali sintomi, l'abrogazione dei sintomi, cos? come l'abrogazione totale o parziale della causa della malattia.

In particolare, nell'ambito del metodo dell'invenzione, tale somministrazione pu? essere iniziata prima dell'insorgenza della malattia (in particolare nel caso di disturbi genetici per i quali sono state valutate le mutazioni che causano la malattia), subito dopo la diagnosi del disturbo, o una volta che altri trattamenti farmaceutici si sono dimostrati inefficaci.

In un'altra forma realizzativa, le impalcature scoperte vengono divulgate in un metodo per il trattamento dei disturbi demielinizzanti, tra cui, ma non solo, la sclerosi multipla.

Nell'ambito del metodo descritto, i composti dell'invenzione possono essere somministrati insieme ad altri trattamenti farmacologici o non farmacologici.

? piccole molecole

? anticorpi,

? terapia genica o approcci terapeutici di modificazione genica,

contro la PrP<C >o gli interattori della PrP<C >o vie di segnale tossiche che coinvolgono la PrP<C>.

Pertanto, i composti dell'invenzione sono descritti in un metodo di trattamento in combinazione con piccole molecole, anticorpi, terapia genica o approcci terapeutici di modificazione genica, contro malattie o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrP<C>) o interattori della PrP<C >o vie di segnale tossiche che coinvolgono la PrP<C>.

La presente invenzione sar? ulteriormente illustrata con riferimento alla seguente sezione sperimentale.

Metodi

Metodi funzionali di polarizzazione per simulazioni di percorsi pieghevoli.

Caratteristiche generali e software. Il metodo BF ? una procedura in tre fasi che permette la simulazione di percorsi di ripiegatura delle proteine a livello di risoluzione atomistica e consiste in: (i) generazione della condizione denaturata per dispiegamento termico, (ii) produzione di traiettorie di piegatura a partire dagli stati di dispiegamento e (iii) punteggio delle traiettorie di piegatura basato su un principio di variabilit?. Il software per eseguire queste simulazioni si basa sul motore MD di Gromacs 4.6.5 patchato con il plugin per l'analisi variabile collettiva Plumed 2.0.2. Generazione di condizioni denaturate. Le conformazioni dispiegate sono generate dallo svolgimento termico a partire dalla struttura nativa. Questo si ottiene eseguendo traiettorie indipendenti di 3-5 ns di dinamica molecolare ad alta temperatura (800K) nell'insieme NVT.

Per ogni traiettoria viene estratta una singola conformazione denaturata.

Generazione di percorsi di piegatura. Per ogni conformazione denaturata, viene generato un insieme di traiettorie di piegatura utilizzando l'algoritmo rMD. In questo schema, l'avanzamento di piegatura ? descritto in funzione di una coordinata di reazione, definita come z(X):

Dove Cij(X) ? la mappa di contatto della configurazione istantanea del sistema e Cij(X)Native ? la mappa di contatto nello stato nativo di riferimento. Lo stato nativo di riferimento ? ottenuto riducendo al minimo l'energia della struttura sperimentale recuperata dalla banca dati delle proteine. Le voci Cij(X) di z(X) si interpolano senza problemi tra O e l secondo la seguente funzione:

Dove rij ? la distanza euclidea tra l'iesimo e il jth atom, r0 ? una tipica distanza che sfida i contatti residui (impostata a 7,5 ?) e rc ? una distanza di taglio (impostata a 12,3 ?) oltre la quale il contatto ? impostato a 0. In rMD, la proteina si evolve secondo il plain-MD finch? la reazione procede spontaneamente verso lo stato nativo (cio? abbassando il valore della coordinata z(x)). D'altra parte, quando la catena cerca di fare marcia indietro lungo z(X), viene introdotta una forza di polarizzazione esterna che reindirizza la dinamica verso lo stato nativo. La forza di polarizzazione che agisce su un dato atomo, FirMD, ? definita come:

dove zm(t) indica il pi? piccolo valore della coordinata di reazione z(X) fino al tempo t e kr ? una costante di accoppiamento.

Scelta della traiettoria meno inclinata. Per ogni serie di traiettorie a partire dalla stessa condizione iniziale, viene selezionata la traiettoria di ripiegamento con la pi? alta probabilit? di realizzarsi in assenza di forza di polarizzazione esterna. Questo schema viene applicato definendo prima una soglia di ripiegamento: si considera che una traiettoria abbia raggiunto lo stato di ripiegamento se la sua deviazione media al quadrato delle posizioni atomiche (RMSD) rispetto alla struttura nativa ? ? 4 ?. Successivamente, le traiettorie che raggiungono con successo lo stato nativo sono segnate dalla loro T funzionale di polarizzazione calcolata, definita come:

Dove t ? il tempo di piegamento della traiettoria, mi e yi sono la massa e il coefficiente di attrito dell'iesimo atomo e FirMD ? la forza che agisce su di esso. La traiettoria di piegamento che riduce al minimo il bias funzionale per ogni set ? indicata come traiettoria Least Biased (LB).

Analisi computazionale della Proteina Prionica Cellulare.

Struttura e topologia del dominio C-terminale della proteina prionica cellulare (PrP). La struttura nativa del dominio C-terminale della PrP umana ? stata recuperata da PDB 1QLX, la struttura va dal residuo 125 a 228 e contiene il dominio globoso strutturato della PrP. La topologia delle proteine ? stata generata in Gromacs 4.6.5 utilizzando il campo di forza Amber99SB-ILDN in acqua TIP3P.

Simulazioni di piegatura di PrP. La struttura nativa del dominio C-terminale di PrP umano (PDB 1QLX) ? stata posizionata in una scatola dodecaedrica con una distanza minima di 40 ? dalle pareti. La scatola ? stata riempita con molecole d'acqua spc216 e neutralizzata con 3 ioni Na+. Il sistema ? stato ridotto al minimo l'energia utilizzando l'algoritmo di discesa pi? ripida. L'equilibrio NVT ? stato poi eseguito per 500 ps a 800 K utilizzando il termostato a scala V con vincoli di posizione sugli atomi pesanti. I vincoli sono stati poi rimossi e sono stati eseguiti 9 ns indipendenti 3 ns di semplice MD nell'insieme NVT a 800 K, ottenendo 9 conformazioni denaturate. Ogni condizione iniziale ? stata riposizionata in una scatola dodecaedrica con 15 ? di distanza minima dalle pareti, l'energia ? stata minimizzata utilizzando l'algoritmo di discesa pi? ripida e poi equilibrata prima nell'insieme NVT (utilizzando il termostato Nos?-Hoover a 350 K, ?T = 1 ps) e poi nell'insieme NPT (utilizzando il termostato Nos?-Hoover a 350 K, ?T = 1 ps, e il barostato Parrinello-Rahman a 1 bar, ?P = 2 ps). Per ogni condizione iniziale sono state generate 20 traiettorie utilizzando l'algoritmo rMD nell'insieme NPT (350 K, 1 bar). Ogni traiettoria consiste in passi da 1,5-10<6 >rMD generati con un integratore di rMD con passo di 2 fs. I frame sono stati salvati ogni 5?10<2 >passi. La costante di cricchetto kr ? stata impostata a 5?10<-4 >kJ/mol. Le interazioni non legate sono state trattate come segue: Il taglio Van-der-Waals e Coulomb era impostato a 16 ?, mentre il Particle Mesh Ewald era impiegato per l'elettrostatica a lungo raggio. Per ogni serie di traiettorie, lo schema funzionale di bias ? stato applicato con un ulteriore filtraggio sul contenuto della struttura secondaria per la definizione della piegatura. In particolare, le traiettorie che raggiungono una conformazione finale con meno dell'85% del contenuto medio della struttura secondaria rispetto alla struttura NMR non sono state considerate in classifica.

Analisi delle traiettorie. RMSD ? stato calcolato utilizzando Gromacs, mentre la frazione di contatti nativi (Q) ? stata calcolata utilizzando VMD 1.9.2. Un'approssimazione pi? bassa del paesaggio energetico G(Q, RMSD) ? stata generata tracciando il logaritmo negativo della distribuzione di probabilit? 2D delle variabili collettive Q e RMSD, ottenuta dalle traiettorie di 180 rMD (115x115 bins). Sono state campionate le conformazioni proteiche appartenenti alle traiettorie LB e che si estendono sui pozzi energetici di interesse (G < 3,7 kBT). Le conformazioni appartenenti allo stato intermedio sono state raggruppate utilizzando un clustering k-mean in R-Studio utilizzando le seguenti metriche per definire una distanza tra due strutture:

Dove D(XA, XB) ? la metrica della distanza tra due conformazioni proteiche, Cij(XA) e Cij(XB) sono le voci della mappa di contatto delle conformazioni A e B rispettivamente (definite nell'equazione 2). Il numero appropriato di cluster (k = 3) ? stato selezionato con il metodo del gomito. La configurazione rappresentativa di ciascun cluster ? stata selezionata calcolando la mappa di contatto media delle conformazioni del cluster e quindi estraendo la struttura minimizzando la distanza D(XA, XB) tra se stessa e la mappa di contatto media. I dati sono stati rappresentati usando la libreria Matplotlib in python, il diagramma di energia 2D [Q, RMSD] ? stato lisciato con un kernel gaussiano. Le immagini delle conformazioni delle proteine sono state prodotte utilizzando UCSF Chimera.

Analisi di scoperta del farmaco assistita dal computer.

Approccio consenso per l'identificazione del sito di legame per il ligando drogabile. Un approccio di consenso basato sulla SiteMap (Schr?dinger Release 2017-4: SiteMap, Schr?dinger, LLC, New York, NY, 2017; Halgren, T., J. Chem. Inf. Model., 2009, 49, 377-389) e DoGSiteScorer (A. Volkamer, J. Chem. Inf. Modello. 2012, 52 (2), pagg. 360-372) l'analisi ? stata applicata per trovare e valutare le tasche di legame per il farmaco. I parametri di base sono stati utilizzati per entrambi gli strumenti. Considerando il carattere innovativo del target qui riportato (cio? una struttura intermedia di ripiegamento), sono state quindi selezionate soglie meno stringenti nella ricerca di tasche di legame per il farmaco da esplorare in screening virtuale: volume ? 300 ?3; profondit? ? 10 ?; equilibrio ? 1,0; esposizione ? 0,5; involucro ? 0,70; SiteScore ? 0,8; DScore ? 0,90; DrugScore ? 0,5; SimpleScore ? 0,5 (Supp. Tabella 2 e 3).

Identificazione di una tasca di legame per il farmaco nel PrP Folding Intermediate. L'intermedio di ripiegatura ? stato preparato con la procedura guidata per la preparazione delle proteine di Schroedinger. Durante la preparazione, le reti di legame dell'idrogeno sono state ottimizzate attraverso un campionamento esaustivo di gruppi ossidrilici e tiolici. I residui terminali N e C sono stati ricoperti rispettivamente con i gruppi ACE e NMA. Poi, gli atomi di idrogeno e le catene laterali delle proteine sono stati minimizzati in termini di energia utilizzando il campo di forza OPLS3. La struttura ottenuta ? stata (i) solvatata da molecole di acqua TIP3P in una scatola di simulazione cubica di 12,5 ? distante dalla proteina in ogni direzione, (ii) neutralizzata con l'aggiunta di tre ioni Na+, e (iii) equilibrata per 100 ps di simulazione MD (insieme NPT) a 300 K utilizzando il termostato Langevin. In tale simulazione, le posizioni relative degli atomi di Ca sono state mantenute fisse (costante di forza 1 Kcal/mol), al fine di campionare esclusivamente la disposizione delle catene laterali. Le simulazioni MD sono state eseguite utilizzando il campo di forza OPLS3 nel software Desmond 5.0 (Schr?dinger Release 2017-4: Desmond Molecular Dynamics System, D. E. Shaw Research, New York, NY, 2017) e sono state eseguite per 50ns. L'intervallo di registrazione ? stato impostato a 50ps, consentendo la raccolta di 1001 fotogrammi. La traiettoria ? stata raggruppata utilizzando lo strumento "Desmond trajectory clustering" in Maestro (Maestro-Desmond Interoperability Tools, Schr?dinger, New York, NY, 2017) basato sul RMSD dei residui 152, 153, 156, 156, 157, 157, 158, 187, 196, 197, 198, 202, 202, 203, 205, 206 e 209 (cio? i residui che compongono il sito interessato). ? stato effettuato un clustering gerarchico per ottenere 10 cluster del sito esplorato. Il centroide di ciascun cluster ? stato quindi selezionato come struttura rappresentativa e sottoposto a una previsione del sito in silico ligando vincolante e a una valutazione della drogabilit? utilizzando i metodi di consenso di cui sopra che prevedono l'analisi DogSiteScorer e SiteMap. Preparazione della biblioteca chimica virtuale. La Asinex Gold & Platinum Library ? stata scaricata dalla pagina web Asinex (~3,2x10<5 >composti disponibili in commercio, www.asinex.com). Un primo ciclo di preparazione del ligando ? stato eseguito in LigPrep (Schr?dinger Release 2017-4: LigPrep, Schr?dinger, LLC, New York, NY, 2017). In questa fase sono state create le diverse forme tautomeriche per i centri chirali non definiti. Al contrario, per la chiralit? specificata, ? stato mantenuto solo l'enantiomero specificato. Successivamente, i composti sono stati importati all'interno di SeeSAR (vedi versione 5.6 di SeeSAR, BioSolveIT GmbH, Sankt Augustin, Germania, 2016). Si ? cos? ottenuta una libreria finale di ~4,3 x 105 clienti docking.

Identificazione di In Silico Hits attraverso lo screening virtuale. Il workflow di screening virtuale ? stato sviluppato utilizzando la piattaforma analitica KNIME (Berthold, Michael R. AcM SIGKDDD esplorazioni Newsletter 11, n. 1 (2009): 26-31) e i nodi di BioSolveIT KNIME. In particolare, il flusso di lavoro ? stato organizzato come segue: (i) il nodo "Preparare il recettore con LeadIT" ? stato utilizzato per la preparazione delle proteine e la definizione dei parametri di aggancio in LeadIT (LeadIT versione 2.2.0; BioSolveIT GmbH, Sankt Augustin, Germania, 2017, www.biosolveit.de/LeadIT). Il sito di binding ? stato definito sulla base dei residui che compongono la sacca di drogaggio identificata (Supp Table 3). Gli stati di protonazione dei residui, cos? come le forme tautomeriche, sono stati valutati automaticamente in LeadIT utilizzando il metodo ProToss, che genera le posizioni di idrogeno pi? probabili sulla base di una rete ottimale di legame dell'idrogeno utilizzando una funzione di punteggio empirico; (ii) il nodo "Compute LeadIT Docking" ? stato selezionato per eseguire le simulazioni di docking dei client di docking ~4.3x10<5 >utilizzando l'algoritmo FlexX (Rarey M, et al. J Mol Biol. 1996 Aug 23;261(3):470-89). Sono state prodotte dieci pose per ogni ligando; (iii) il nodo "Assess Affinity with HYDE in SeeSAR" ha generato energia libera di legame raffinata (cio? ?G) e l'affinit? HYDE stimata (KiHYDE) per ogni posa del ligando utilizzando la funzione di ripristino HYDE (N. Schneider, et al. J. Comput. Aiutati. Mol. Des., 27 (2013), pp. 15-29); (iv) per ogni ligando ? stata estratta la posa con il KiHYDE pi? basso. Solo i composti con un range di KiHYDE previsto inferiore a 5uM sono stati mantenuti per le fasi successive; (v) le pose rescored sono state filtrate sulla base di filtri fisico-chimici e ADME utilizzando i modelli Optibrium integrati in SeeSAR (Optibrium 2018, www.optibrium.com/stardrop). In particolare sono stati utilizzati i seguenti filtri: 2 ? LogP ? 5, dove LogP ? il coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua calcolato; 1,7 ? LogD ? 5, dove LogD ? il coefficiente di distribuzione ottanolo/acqua calcolato;

TPSA ? 90; LogS ? 1, dove TPSA ? la superficie polare topologica; LogS7,4 ? 1, dove LogS7,4 ? la solubilit? acquosa intrinseca a pH 7.4 (un LogS ? 1 corrisponde ad una solubilit? acquosa intrinseca superiore a 10 ?M); HIA = , dove HIA ? la classificazione per l'assorbimento intestinale umano (prevede una classificazione di '+' per i composti che sono ?30% assorbiti e '-' per i composti che sono < 30% assorbiti); 300 ? MW ? 500, dove MW ? il peso molecolare; numero di legami rotabili ? 3; categoria PgP = - , dove la categoria PgP ? la classificazione del trasporto di P-glicoproteine (il composto deve appartenere alla categoria "-" per evitare l'efflusso attivo); numero di donatori di legami a idrogeno ? 3; numero di stereocentri ? 1. Inoltre, sono state scaricate molecole che potenzialmente agiscono come composti di interferenza pan-assay. Questo approccio ha prodotto una lista di 275 risultati virtuali, che sono stati sottoposti per la prima volta ad una selezione basata sulla diversit?. Per ogni composto, un'impronta digitale binaria ? stata derivata per mezzo dell'utility canvasFPgen fornita da Schr?dinger (Tipo di impronta digitale: MolPrint2D; precisione:XP) (Schr?dinger Release 2017-4: Canvas, Schr?dinger, LLC, New York, NY, 2017). Utilizzando l'impronta digitale creata, i 10 composti pi? diversi (cio? ASN 03578729, ASN 15755504, ASN 16356773, ASN 17325626, ASN 19380113, BAS 00312802, BAS 00340795, BAS 00382671, BAS 01058340, BAS 01849776) sono stati estrapolati applicando l'utility canvasLibOpt Schr?dinger (Schr?dinger Release 2017-4: Canvas, Schr?dinger, LLC, New York, NY, 2017). Inoltre, l'ispezione visiva ha guidato la selezione dei leganti promettenti in base alla modalit? di rilegatura prevista e alle interazioni stabilite con la tasca di rilegatura identificata. In totale, sono state selezionate 30 molecole, 8 dalla diversa selezione e 22 dopo l'ispezione visiva (Figura 6 e Tabella 4). Infatti, anche se in origine sono stati scelti 10 diversi composti, il BAS 00340795 non era in stock e l'ASN 03578729 ? stato successivamente sostituito dal suo vicino analogo ASN 05397475, selezionato dalla visualizzazione 3D e dotato di una migliore affinit? prevista.

Sintesi chimica di SM875.

Reagenti e strumentazione. I reagenti (Sigma Aldrich) e i solventi (Merck) sono stati utilizzati senza purificazione. Le rese di reazione non sono state ottimizzate e calcolate dopo la purificazione cromatografica. La cromatografia a strato sottile (TLC) ? stata effettuata su Merck Kieselgel 60 PF254 con visualizzazione con luce UV. Reazioni assistite da microonde sono state effettuate utilizzando un reattore monomodale CEM Discover in un contenitore sigillato.

Cromatografia preparatoria a strato sottile (PLC) su lastre da 20 x 20 cm Merck Kieselgel 60 F254 0,5 mm. La purificazione HPLC ? stata effettuata da un apparecchio Merck Hitachi L-6200, dotato di un rivelatore a serie di diodi Jasco UVIDEC 100V e di una colonna LiChrospher a fase inversa RP18, in condizioni isocratiche con eluente acetonitrile/acqua 1:1, flusso 5 mL?min<-1>, rivelazione a 254 nm. Lo spettro IR del prodotto finale ? stato registrato utilizzando uno spettrometro Bruker FT-IR Tensor 27 dotato di dispositivo ATR (Attenuated Transmitter Reflection) a 1 cm<-1 >risoluzione nella regione di assorbimento ?v 4000 ? 1000 cm<-1>. Un sottile strato solido ? stato ottenuto dall'evaporazione della soluzione di cloroformio nel campione. Lo strumento ? stato spurgato con un flusso di azoto secco costante. L'elaborazione degli spettri ? stata effettuata utilizzando la confezione del software Opus. Gli spettri NMR sono stati registrati su uno spettrometro Bruker-Avance 400 utilizzando una sonda 5 mm BBI <1>H a 400 MHz e

<13>C a 100 MHz in CDC13 rispetto ai segnali residui di solvente ?H 7,25 e ?C 77,00 ppm, J valori in Hz. Le assegnazioni strutturali sono confermate dall'esperimento di correlazione multipla eteronucleare (HMBC). Gli spettri ESI-MS sono stati prelevati con uno spettrometro di massa Bruker Esquire-LC dotato di una sorgente ionica elettrospray, iniettando i campioni nella sorgente da una soluzione di metanolo condizioni MS: temperatura della sorgente. 300<?>C, gas di nebulizzazione N2, 4 L?min<-1>, tensione del cono 32 V, range di scansione m/z 100-900. Esperimenti di frammentazione sono stati effettuati utilizzando l'elio per attivare collisionalmente gli ioni primari selezionati. Lo spettro LC-ESI-MS ? stato acquisito utilizzando una colonna C-18 Kinetex 5pm, eluizione con acetonitrile/acqua 70:30, flusso 1 mL?min-1 utilizzando la sorgente ESI come rivelatore in modalit? ionica positiva. La misura ad alta risoluzione ESI-MS per il prodotto finale, compresi gli esperimenti di frammentazione tandem MS2, sono stati ottenuti per infusione diretta utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion Tribrid.

Colture cellulari e trattamenti.

Le linee cellulari utilizzate nella presente invenzione sono state coltivate nel Minimal Essential Medium di Dulbecco (DMEM, Gibco, #11960-044), siero bovino fetale fetale inattivato a calore al 10% (?56-FBS), penicillina/Streptomicina (Pen/Strep, Corning #20-002-Cl), aminoacidi non essenziali (NEAA, Gibco, #11140-035) e L-Glutammina (Gibco, #25030-024), se non diversamente specificato. Le cellule HEK293 e N2a sono state ottenute da ATCC (ATCC CRL-1573 e CCL-131, rispettivamente).

Abbiamo usato un subclone (A23) di HEK293 che esprime stabilmente un mouse wild-type PrP o un costrutto EGFP-PrP, entrambi gi? descritti e caratterizzati in precedenza (Stincardini et al. 2017). I fibroblasti di topo L929 e le cellule inducibili RK13 sono stati gentilmente forniti da Ina Vorberg (DZEN, Bonn, Germania) (Vorberg et al. 2004) e Didier Villette (INRA, Tolosa, Francia) (Arellano-Anaya et al. 2017), rispettivamente. Le linee cellulari tumorali umane (H358, ZR-75, A549, H460, MCF7, H1299, SKBR3 e T47D), tutte appartenenti alla collezione di linee cellulari tumorali umane del NCI, sono state gentilmente fornite a Valentina Bonetto (Istituto Mario Negri, Milano, Italia). Le cellule sono state passate in matracci T25 o in scatole di Petri da 100 mm in supporti contenenti 200 ?g/ml di igromicina o 500 ?g/ml di G418 e divise ogni 3-4 giorni. Ogni linea cellulare impiegata in questo studio non ? stata passata pi? di 20 volte dal magazzino originale. I composti utilizzati negli esperimenti sono stati risospesi a 30 o 50 mM in DMSO, e diluiti per fare una soluzione stock 1000X, che ? stata poi utilizzata per diluizioni seriali. Un'aliquota di 1 ?l di ogni punto di diluizione del composto ? stata poi aggiunta alle cellule placcate in 1 mL di media senza antibiotici di selezione. Per gli esperimenti di impulso, le cellule RK13 inducibili sono state seminate su piastre a 24 pozzetti ad una confluenza del 50%. Dopo 24 h cellule sono state trattate con doxiciclina (0,01 mg/ml) o veicolo (DMSO), in presenza o meno di Brefeldina lA (10 ?M) o SM875 (10 ?M). Alla fine di ogni punto di tempo (2, 4, 8 e 24 ore) le cellule sono state lavate con PBS e poi lisate in tampone di lisi. Per gli esperimenti di inseguimento, le cellule RK13 sono state seminate su piastre a 24 pozzetti ad una confluenza del 30%. Dopo 24 h cellule sono state trattate con Doxiciclina (0,01 mg/ml) per 24 h. Il terreno contenente doxiciclina ? stato poi rimosso e le cellule mantenute in terreno fresco per 4 h prima di aggiungere SM875 (10 ?M). Dopo 5, 19 e 24 ore di incubazione i pozzetti delle cellule sono stati lavati con PBS e lisati.

Plasmidi.

Le strategie di clonazione utilizzate per generare la codifica dei cDNA per il WT o la PrP con marchio EGFP sono state descritte in precedenza (Ivanova et al. 2001). Il costrutto EGFP-PrP contiene una versione monomerizzata di EGFP inserita dopo il codone 34 del mouse PrP. L'identit? di tutti i costrutti ? stata confermata dal sequenziamento dell'intera regione di codifica. Tutti i costrutti sono stati clonati nel pcDNA3.1(+)/hygro expression plasmid (Invitrogen). Lo Strep-FLAG pcDNA3.1(+)/G418 NEGR-1 ? stato gentilmente fornito da (Universit? di Trento, Italia) (Pischedda et al. 2014). Tutti i plasmidi sono stati trasfettati con Lipofectamina 2000 (Life Technologies), seguendo le istruzioni del produttore.

Western Blotting & Anticorpi.

I campioni sono stati lisati in tampone di lisi (Tris 10mM, pH 7,4, 0,5% NP-40, 0,5% TX-100, 150mM NaCl pi? completo EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche, #11697498001), diluito 2:1 in 4X Laemmli campione tampone (Bio-Rad) contenente 100 mM di ditiotreitolo (CAS No. 3483-12-3, SigmaAldrich), bollito 8 min a 95 <?>C e caricato su SDS-PAGE, utilizzando gel pre-fuso di acrilammide al 12% (Bio-Rad) e poi trasferito su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) (Thermo Fisher Scientific). Le membrane sono state bloccate per 20 minuti nel 5% (p/v) di latte secco non grasso in soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0,01% di Tween-20 (TBS-T). Le macchie sono state sondate con anticorpo anti-PrP D18 (gentilmente fornito da D. Burton, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) o 6D11 (1:5.000) in BSA 3% in TBS-T durante la notte a 4<?>C, lavate 3 volte con TBS-T 10 min ciascuna, poi sondate con una diluizione di 1:8.000 di capra coniugata con rafano antiumano (Jackson Immunoresearch) o IgG anti-topo (Santa Cruz) per 1 h a RT. Dopo 2 lavaggi con TBS-T e uno con acqua Milli-Q, i segnali sono stati rivelati utilizzando 1'ECL Prime Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare), e visualizzati con un sistema di imaging ChemiDoc XRS Touch (Bio-Rad).

Dot Blotting.

I campioni sono stati trasferiti su membrana in PVDF in un sistema a 96 pozzetti. Un apparato di 96 pozzetti (Schleicher & Schuell) ? stato dotato di una membrana di polivinilidene difluoruro 0.45-?m-pore-size (PVDF) (Immobilon-P; Millipore), e ogni punto ? stato risciacquato con 500 ?l di TBS. Sotto vuoto, lisati cellulari sono stati aggiunti all'apparecchio risciacquato con 500 ?l di TBS. La membrana ? stata poi bloccata con 5% latte-0,05% Tween 20 (Sigma) in TBS (TBST-latte) per 30 min e sondato con l'anticorpo anti-PrP 6D11 (1:4.000) seguito da capra anti-topo IgG (Pierce). I segnali sono stati rivelati utilizzando chemiluminescenza migliorata (Luminata, Bio-Rad) e visualizzati da un sistema di imaging ChemiDoc XRS Touch (Bio-Rad).

PCR in tempo reale.

In seguito ai trattamenti, le cellule sono state raccolte da 24 piastre di pozzetti e 1'RNA ? stato estratto utilizzando TRIzol (Invitrogen) o RNeasy Plus mini kit (Quiagen). Un'aliquota di 800 ng per ogni campione ? stata trascritta al contrario utilizzando il kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacit? (Applied Biosystems) secondo le istruzioni del produttore. La RT-PCR quantitativa ? stata eseguita in un termociclatore CFX96 Touch (Bio-Rad) utilizzando PowerUp SYBR Green Master mix (Invitrogen) con un programma di 40 cicli di amplificazione. Il set PrP del mouse l e il set 2 sono stati usati rispettivamente per amplificare la PrP endogena e transgenica (tabella sottostante). La quantificazione relativa ? stata normalizzata per la HPRT del topo o umana (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi).

Immunofluorescenza e imaging ad alto contenuto. L'immunocitochimica ? stata eseguita su cellule RK13 inducibili trattate per 2, 4, 8 o 24 ore con doxiciciclina 0,01 (1x) o 0,1 (10x) mg/mL, in presenza o meno di SM875 (10 ?M). Le cellule sono state seminate su micropiastre CellCarrier-384 Ultra (Perkin Elmer) ad una concentrazione di 6.000 cellule/pozzetto, coltivate per circa 24 ore, per ottenere uno strato semiconfluente (60%) e poi trattate con il composto. Le cellule sono state fissate per 12 minuti a RT aggiungendo paraformaldeide senza metanolo (PFA, Thermo Fisher Scientific) ad una concentrazione finale del 4%. I pozzi sono stati poi lavati tre volte con PBS, e la permeabilizzazione ? stata effettuata incubando le cellule per l min con PBS contenente una concentrazione finale di 0,1% Triton X100. I pozzi sono stati lavati tre volte con PBS e le cellule sono state incubate con soluzione bloccante (FBS 2% in PBS) per lh a RT. L'anticorpo primario anti-PrP (D18) ? stato diluito nella soluzione bloccante e aggiunto ai pozzetti ad una concentrazione finale di 1:400. Dopo tre lavaggi con PBS, l'anticorpo secondario (anti-IgG umane IgG di capra coniugate con Alexa 488 diluito 1:500 in soluzione bloccante) ? stato incubato per 1 h a RT. Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific) diluito in PBS 0,5 mM ? stato poi aggiunto dopo due ulteriori lavaggi. Per esperimenti di imaging ad alto contenuto, le cellule che esprimono EGFP-PrP sono state placcate su micropiastre CellCarrier-384 Ultra (Perkin Elmer) ad una concentrazione di 12.000 cellule/pozzetto e sono cresciute per circa 24 ore, per ottenere uno strato semiconfluente (60%). SM875 ? stato somministrato ad una concentrazione finale di 0,1, 0,3, 1, 3 o 10 ?M, in due pozzetti replicati. Il veicolo (DMSO, volume equivalente) ? stato utilizzato come controllo negativo. Le cellule sono state trattate per 24 ore e poi fissate per 12 minuti a RT aggiungendo paraformaldeide senza metanolo (Thermo Fisher Scientific) ad una concentrazione finale del 4%. Le piastre sono state poi lavate due volte con PBS e contate con Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific). La localizzazione cellulare di EGFP-PrP e PrP inducibile ? stata monitorata utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto di Operetta (Perkin Elmer). L'imaging ? stato eseguito in modalit? ad ampio campo utilizzando un obiettivo 20X High NA (0,75). Cinque campi sono stati acquisiti in ogni pozzetto su due canali (380-445 Excitation-Emission per Hoechst e 475-525 per EGFP e Alexa 488). L'analisi delle immagini ? stata effettuata utilizzando il software Harmony versione 4.1 (Perkin Elmer).

Vitalit? cellulare.

Le cellule sono state seminate su piastre a 24 pozzetti a circa ~60% di confluenza. Composti a diverse concentrazioni o controllo del veicolo (DMSO, volume equivalente) sono stati aggiunti dopo 24 ore, il mezzo ? stato sostituito il secondo giorno, e poi rimosso dopo un totale di 48 trattamenti. Le cellule sono state incubate con 1 mg/ml di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT, Sigma Aldrich) in PBS per 15 minuti a 37?C. Dopo aver accuratamente rimosso MTT, le cellule sono state risospese in 500 ?L DMSO, e valori di vitalit? cellulare ottenuti da uno spettrofotometro a piastra (BioTek Instruments, VT, USA), misurando l'assorbanza a 570 nm.

Produzione di PrP ricombinante. RecHuPrPrP23-231 ? stato espresso dal competente vettore di espressione del batterio E. coli Rosetta (DE3) che ospita il vettore di espressione pOPIN E contenente il gene di tipo wild type I109 bank vole Prnp (Erana et al. 2019). I batteri provenienti da un glicerolato mantenuto a -80<?>C sono stati coltivati in una beuta da 250 ml contenente 50 ml di brodo LB per una notte. La coltura ? stata poi trasferita in due beute da 2 L contenenti ciascuna 500 ml di terreno minimo integrato con 3 g/L di glucosio, 1 g/L NH4C1, 1M MgSO4, 0,1 M CaCl2, 10 mg/mL di tiamina e 10 mg/mL di biotina. Quando la coltura ha raggiunto un OD600 di ?0,9-1,2 AU, ? stato aggiunto Isopropyl ?-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) per indurre l'espressione di PrP durante la notte alla stessa temperatura e condizioni di agitazione. I batteri sono stati poi pellettati, lisati, corpi di inclusione raccolti per centrifugazione, e solubilizzati in 20 mM Tris-HC1, 0,5 M NaCl, 6M Gnd/HC1, pH = 8. Anche se la proteina non contiene un His-tag, la purificazione della proteina ? stata eseguita con una colonna di affinit? istidina (HisTrap FF grezzo 5 ml, GE Healthcare Amersham) sfruttando l?istidina naturale presente nella regione di ripetizione octapeptide di PrP. Dopo l'eluizione con tampone contenente 20 mM Tris-HC1, 0,5 M NaCl, 500 mM imidazolo e 2 M guanidina HC1, pH = 8, la qualit? e la purezza dei lotti di proteine ? stata valutata da BlueSafe (NZYTech, Lisbona) colorazione dopo elettroforesi in gel SDS-PAGE. La proteina ? stata rinaturata alla conformazione PrP<C >mediante dialisi contro 20 mM di tampone NaAcetato, pH = 5. Il materiale aggregato ? stato rimosso per centrifugazione. La corretta piegatura ? stata confermata dalla concentrazione di CD e proteine, mediante misurazione dell'assorbanza a 280 nm. La proteina ? stata concentrata utilizzando dispositivi di centrifugazione Amicon e la soluzione concentrata conservata a -80<?>C fino al momento dell'utilizzo.

Ridistribuzione dinamica della massa.

Il lettore di piastre multimodali EnSight (Perkin Elmer) ? stato utilizzato per effettuare analisi DMR. L'immobilizzazione della lunghezza totale (residui 23230) o del topo N-terminalmente troncato (111-230) ricombinante PrP (15 ?L/pozzetto di una soluzione di 2,5 ?M di PrP in 10 mM di tampone di acetato di sodio, pH 5) su micropiastre senza etichetta (micropiastre ad alta sensibilit? EnSpire-LFB, Perkin Elmer) ? stata ottenuta mediante chimica di accoppiamento amminico. L'interazione tra Fe<3+>-TMPyP, SM875 e SM940 diluito a diverse concentrazioni (0,03-100 ?M, otto diluizioni seriali 1:3) in tampone di saggio (10 mM PO4, pH 7,5, 2,4 mM KCl, 138 mM NaCl, 0,05% Tween-20) e PrP, ? stata monitorata dopo un'incubazione di 30 minuti a RT. Tutti i passaggi sono stati eseguiti utilizzando una stazione di lavoro Zephyr Compact Liquid Handling Workstation (Perkin Elmer). I dati sono stati ottenuti normalizzando ogni segnale sulla superficie intra-bene vuoto, e poi per sottrazione dei pozzi di controllo. Per acquisire ed elaborare i dati ? stato impiegato il software Kaleido (Perkin Elmer).

Saggio di insolubilit? del detergente in funzione della temperatura.

Una soluzione madre 800 ?M di PrP ricombinante di topo appena purificato (residui 111-231) ? stata diluita 1:10 in Acetato di Sodio (10 mM NaAc, pH 7) per ottenere aliquote di 80 ?M. Per evitare la precipitazione di PrP ricombinante, le aliquote sono state congelate in flash freeze in azoto liquido, conservate a -80<?>C, e poi tenute in ghiaccio durante il loro utilizzo. Per effettuare il saggio, la PrP ricombinante ? stata diluita ad una concentrazione finale di 0,5 ?M in tampone di precipitazione (10 mM NaAc, 2% TX100, pH 7), divisa in 8 aliquote identiche, ed incubata per 1 h a diverse temperature (25, 37, 45, e 55<?>C), in presenza o meno di ogni molecola, o di controllo del veicolo (DMSO, volume equivalente). Ogni campione ? stato poi accuratamente caricato su un doppio strato di saccarosio (60% e 80%) preparato in tampone di precipitazione e depositato sul fondo delle provette di ultracentrifuga. I campioni sono stati poi sottoposti a ultracentrifugazione a 100.000 x g per 1 ora a 4<?>C. I pellet proteici ottenuti sono stati diluiti in 2X LMSB e poi analizzati con Western blotting.

Rilevamento di prioni nelle cellule.

I fibroblasti L929 sono stati coltivati in coltura e sono passati 5-7 volte dopo l'infezione con il ceppo prionico RML (derivato dai corrispondenti topi infetti da prioni, per gentile concessione del Dr. Roberto Chiesa, Istituto Mario Negri, Milano). Al fine di testare gli effetti anti-prione dei composti, le cellule sono state seminate in piastre a 24 pozzetti (giorno 1) a circa il 60% di confluenza, con diverse concentrazioni di ogni molecola, o di controllo del veicolo (DMSO, volume equivalente). Il mezzo contenente composti freschi o veicolo ? stato sostituito il giorno 2, e le cellule sono state divise (1:2) il giorno 3, evitando l'uso di tripsina pipettando direttamente sulla superficie del pozzo. Le cellule sono state raccolte il giorno 4 in PBS e centrifugate a 3.500 rpm x 3 min. I pellet risultanti sono stati poi immagazzinati rapidamente a -80<?>C. Per valutare i carichi di prioni, i pellet delle cellule sono stati risospesi in 20 pL di tampone di lisi (Tris 10mM, pH 7,4, 0,5% NP-40, 0,5% TX-100, 150mM NaCl) e incubati per 10 minuti a 37<?>C con 2.000 unit?/mL di DNase I (New England BioLabs). La met? del campione risultante ? stata incubata con 10 ?g/mL di PK (Sigma Aldrich) per lh a 37<?>C, mentre l'altra met? ? stata incubata nelle stesse condizioni in assenza di PK. Entrambi i campioni trattati con PK e non trattati sono stati poi mescolati 1:2 con 4X Laemmli campione tampone (Bio-Rad) contenente DTT, bollito per 8 minuti a 95?C ed eseguito da SDS-PAGE.

Analisi statistiche di dati biologici.

Tutti i dati sono stati raccolti e analizzati alla cieca da due diversi operatori. Le analisi statistiche, effettuate con il software Prism versione 7.0 (GraphPad), comprendevano tutti i punti di dati ottenuti, ad eccezione degli esperimenti in cui i controlli negativi e/o positivi non hanno dato il risultato atteso. Non ? stato utilizzato alcun test per i valori anomali. ? stato applicato il test di normalit? Kolmogorov-Smirnov (quando possibile, n?5). I risultati sono stati espressi come la media ? errori standard, se non specificato. In alcuni casi, gli esperimenti dose-risposta sono stati dotati di un modello di regressione non lineare logistico a 4 parametri (4PL) e l'adattamento ? stato stimato calcolando l'R<2>. Tutti i dati sono stati analizzati con il test ANOVA unidirezionale, inclusa una valutazione della normalit? dei dati, e corretti con il test Dunnet post-hoc. I valori di probabilit? (p) < 0,05 sono stati considerati significativi (*<0,05, **<0,01, ***<0,001). Esempio l

Identificazione di un intermedio di ripiegatura PrP

La metodologia PPI-FIT ? stata utilizzata per identificare un intermedio drogabile lungo il percorso di piegatura della PrPC (denominato FI-PrP, Figura 1, a destra). Per caratterizzare il percorso di piegatura della proteina e identificare gli intermedi cineticamente rilevanti gli inventori si sono affidati ad una tecnica di campionamento del percorso migliorata (Bias Functional approach) utilizzando il campo di forza AMBER ff99SB-ILDN in solvente esplicito.

La proteina prionica ? costituita da un segmento N-terminale flessibile (residui 24-120 della sequenza umana con riferimento alla sequenza PDB 1QLX), e un dominio C-terminale strutturato (residui 121-230) composto da tre ?-eliche e due brevi (3-fili che affiancano l'elica 1. Il segmento N-terminale ? nativamente non strutturato e preclude il suo utilizzo per approcci in-silico. Quindi, come struttura di riferimento ? stato utilizzato il dominio globulare della PrP umana (residui 121-230, come mostrato in Figura 2). Abbiamo generato 9 conformazioni di PrP dispiegate per dispiegamento termico e abbiamo usato rMD per produrre 20 traiettorie di piegatura per ogni conformazione. Lo schema BF ? stato poi impiegato per definire il percorso di piegatura statisticamente pi? significativo per ogni serie di traiettorie, portando a 9 percorsi di piegatura meno distorti. Le conformazioni che risiedono all'interno dei pozzi di energia osservati nella distribuzione bidimensionale sono state campionate da ogni traiettoria meno polarizzata. Le analisi hanno rivelato l'esistenza di uno stato semi-nativo, intermedio di ripiegamento PrP esplorato da tutti i percorsi meno distorti. La successiva analisi di clustering dell'insieme di conformatori che popolano lo stato intermedio ha permesso la definizione di una struttura a tutti gli atomi per l'intermedio di piegamento PrP (come mostrato in figura 3, a sinistra). Rispetto alla conformazione nativa di PrP, questa struttura ? caratterizzata da un'elica spostata-1 che manca i contatti di aggancio con l'elica 3, lasciando esposti al solvente diversi residui idrofobici nativamente sepolti all'interno del nucleo proteico (ad esempio Y157, M206, V209; Figura 3, a destra).

Identificazione virtuale dei ligandi ad alta affinit? per l'intermedio di piegatura PrP.

Sono state impiegate tecniche di modellazione in silico e di screening virtuale dei farmaci per identificare piccoli ligandi specifici per l'intermedio di piegatura PrP selezionato. In primo luogo, gli inventori hanno cercato potenziali siti di legame unici nella struttura dell'intermedio e non presenti nella conformazione nativa. Il software SiteMap e DoGSiteScorer sono stati utilizzati per esplorare la superficie dell'intermedio PrP, tenendo conto delle propriet? tipiche delle tasche di legante, come il volume, la profondit?, l'involucro/esposizione e l'idrofobicit? (come mostrato nella Tabella 1). Queste analisi hanno identificato una sacca drogabile accessibile ai solventi tra l'elica spostata 1 e l'elica 3, definita da 14, residui non continui (152, 153, 156, 156, 157, 157, 158, 187, 196, 197, 198, 202, 203, 205, 206, 209). La conformazione di questa tasca, affinata eseguendo MD con reticolo posizionale degli atomi della spina dorsale, come mostrato in figura 3), ? stata oggetto di una campagna di screening virtuale eseguita utilizzando il software BioSolvelT e impiegando la collezione Asinex Gold & Platinum di piccole molecole (~3,2x10<5 >composti disponibili in commercio). I risultati positivi sono stati filtrati da diversi strumenti chemioinformatici per prevedere, l'interferenza del pan-assay (cio? composti chimici che potrebbero dare risultati falsi positivi in diversi schermi ad alto rendimento), la farmacodinamica, le propriet? fisico-chimiche e ADME (adsorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione). I composti sono stati anche raggruppati in base alla loro impalcatura chimica. Queste analisi hanno generato una graduatoria dei candidati, da cui sono state ulteriormente selezionate 31 molecole per la validazione biologica.

Selezione in vitro dei risultati positivi

La biogenesi della PrP segue un percorso di traffico tipico dei polipeptidi di ancorati tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI). La proteina viene sintetizzata direttamente nel lume del reticolo endoplasmatico (ER), dove si piega e riceve l'elaborazione post-traslazionale della struttura primaria (rimozione del peptide di segnale e ancoraggio del gruppo GPI) cos? come l'aggiunta di due catene di glicosilazione legate a N (a Asn-181 e Asn-197). In linea di principio, un composto che si lega ad un intermedio di piegatura PrP pu? produrre un conformero a lunga durata e immaturo che potrebbe essere riconosciuto dal macchinario di controllo di qualit? ER (ERQC), portando alla sua degradazione da parte del percorso di clearance associato all'ER e/o dall'autofagia dipendente dal lisosoma. Seguendo questo principio, i 31 ligandi putativi sono stati testati direttamente in cellule per la loro capacit? di abbassare l'espressione di PrP a livello post-traslazionale. Ogni composto ? stato somministrato per 24 ore a diverse concentrazioni (1-310-30 ?M) a cellule di HEK293 che esprimono stabilmente la PrP del topo. L'espressione e/o alterazioni post-traslazionale di PrP sono stati rilevati da Western blotting. Composti che mostrano una capacit? di abbassare la quantit? o alterare l'elaborazione post-traslazionale di PrP (? 30%) ad almeno una concentrazione sono stati testati contro una proteina di controllo, NEGR-1. Questa molecola ancorata GPI segue la stessa via di espressione della PrP, rappresentando cos? un controllo ideale per valutare la specificit? del composto.

Inoltre, anche la citotossicit? di ogni molecola ? stata valutata nella stessa gamma di concentrazioni, utilizzando il test MTT.

L'attivit? di screening effettuata ha portato alla selezione di quattro composti, chiamati SM875, SM930, SM940 e SM950.

Esempio 2

Sintesi chimica di SM875.

Il prodotto target SM875 ? stato ottenuto secondo la strategia sintetica riportata in figura 4. La sequenza prevede la preparazione del precursore 1-(4-bromofenil)-1H-pirazol-5-ammina [1], che ? stato utilizzato in una successiva reazione a tre componenti con 4-idrossi-3-metossibenzaldeide e acido Meldrum (2,2-dimetil-1,3-diossano-4,6-dione) secondo un metodo modificato da Zeng et al. [2]. Il 1-(4-bromofenil)-1H-pirazol-5-ammina ? stato sintetizzato a partire da 4-(bromofenil)idrazina che ? stato ottenuto dal cloridrato commerciale mediante trattamento con una soluzione acquosa satura di NaHCO3 (50 mL), seguita da estrazione di diclorometano (50 mL x3), trattamento con Na2SO4 anidro ed evaporazione. Ad una soluzione mescolata magneticamente di 4-(bromofenil)idrazina (100 mg, 0,53 mmol, in 5 mL di etanolo 5), (E)-etil 2-ciano-3-etossiacrilato (89,6 mg, 0,53 mmol) ? stato aggiunto e reflusso per 2 h. La miscela di reazione ? stata concentrata in vacuo, il residuo ? stato sospeso in soluzione 1:1 metanolo / 2M NaOH aq. soluzione (5 mL) e reflussato per 1 h. Dopo il raffreddamento, la miscela ? stata neutralizzata con 1M HC1 aq. soluzione (5 mL) e concentrato in vacuo utilizzando un bagno d'acqua a 40 ? C. Il residuo ? stato riscaldato a 180<?>C per 10 minuti, sospeso in etanolo dopo il raffreddamento e conservato per una notte a 4<?>C. Il supernatante ? stato recuperato e concentrato per dare un residuo che ? stato mescolato in presenza di una soluzione di NaHCO3 (10 mL). L'estrazione con acetato di etile (10 mL x3), seguita dal trattamento con Na2SO4 anidro delle fasi organiche combinate e la concentrazione in vacuo ha dato il prodotto (79 mg, 61%), che ? stato utilizzato nella seguente reazione a tre componenti. La sintesi di successo di 1-(4-bromofenil)-1H-pirazol-5-amina ? stata verificata da 1H-NMR [?H 7,58(d, J 8,7 Hz, H-3'e H-5'), 7,47(d, J 8,7 Hz, H-2'e H-6'), 7,41(s, H-3), 5,62 (s, H4)] e ESIMS (m/z 239,8 [M+H]+). Nell'ultimo stadio di reazione, 1-(4-bromo-fenil)-1H-pirazol-5-ammina (79 mg, 0,33 mmol), 4-idrossi-3-metossibenzaldeide (41 mg, 0,27 mmol) e 2,2-dimetil-1,3-diossano-4,6-dione (46 mg, 0.32 mmol) in etanolo (5 mL) sono stati reimmessi sotto agitazione per 2,5 h, o in alternativa sostituendo il riscaldamento convenzionale con l'irradiazione a microonde a 110?C per 1 h. La miscela di reazione ? stata poi raffreddata a temperatura ambiente ed essiccata in vacuo. Il prodotto grezzo ? stato purificato mediante cromatografia a strato sottile preparatoria a base di silice (PLC) eluizione con n-esano/etil acetato (1:1). La banda raccolta al fattore di ritenzione 0,4 ? stata prima utilizzata per la caratterizzazione strutturale e poi iniettata in HPLC preparatorio (colonna RP-18, acetonitrile / acqua 1:1, rilevamento UV a 254 nm, flusso 5 mL?min<-1>, tempo di ritenzione 4,5 min) per dare il prodotto di destinazione (per l'uso su colture cellulari) come polvere bianca dopo l'evaporazione dell'eluente: 34 mg, 25% con riflusso in etanolo; un rendimento di ~25% si ottiene anche con l'irradiazione a microonde.

Caratterizzazione strutturale di SM875.

NMR, spettri ESI-MS insieme a LC-MS (UV, EIC e MS) sono riportati in figura 5, A-D. I valori di spettrometria di massa ad alta risoluzione riportati corrispondono alla media di 100 misure: HRESI(+)MS: m/z 414.04426 ? 0.00126 [M+H]+ (calcolato per C19H1779BrN303, 414.04478); HRESI(+)MS/MS (414): m/z 399.02055 ? 0.00190 [M+H]+ (calcolato per C18H1479BrN303, 399.02131); m/z 372,03349 ? 0,00195 (calcolato per C17H1579BrN302, 372,03422); m/z 289,99184 ? 0,00175 (calcolato per C12H979BrN30, 372,03422).

Caratterizzazione dell'attivit? terapeutica di SM875 Il composto SM875 (mostrato in Figura 6A) induce una diminuzione dose-dipendente dell'espressione di PrP<C>, accompagnata da uno spostamento progressivo del segnale dall'atteso ~35 kDa di PrP<C >nativo a lunghezza piena, diglicosilato, a bande di peso molecolare pi? basse (>28 kDa), probabilmente corrispondenti a forme di PrP scisse. Questi effetti erano gi? evidenti a concentrazioni fino a 3 pM (Figura 6B, corsie 7-10). ? importante notare che SM875 non ha prodotto alcun effetto su NEGR-1, una proteina non rilevante GPI-anchored sintetizzata nel ER come la PrPC (Figura 6B). Le cellule HEK293 (ATCC, CRL-1573) sono state stabilmente trasfettate con il mouse PrP<C >o NEGR-1 ed esposte a diverse concentrazioni di SM875 (mostrato) o veicolo (DMSO, volume equivalente) per 24 ore, lisate e analizzate tramite Western blotting. I segnali sono stati rilevati utilizzando uno specifico anticorpo primario anti-PrPC o anti-NEGR-1, e anticorpi secondari rilevanti accoppiati con HRP, rivelati utilizzando un sistema di imaging ChemiDoc Touch (Bio-Rad, CA, USA) Effetti simili sono stati ottenuti in cellule ZR-75, una linea di cellule di cancro al seno umano che esprimono la PrP<C >in modo endogeno (Figura 6D). ? importante notare che la diminuzione dell'espressione di PrP<C >non ? stata accompagnata da una diminuzione del suo mRNA, come saggiato da RT-PCR (Figura 13), dimostrando che il composto agisce a livello posttraslazionale.

Successivamente si ? verificato se SM875 poteva modificare l'elaborazione post-traslazionale della PrP<C>. La proteina ? nota per essere fisiologicamente sottoposta ad una scissione primaria post-traslazionale chiamato alfa-cleavage, che divide i domini N e C-terminale di PrP<C>, producendo una met? membrana-c-terminale C (residui ~111-231) e un frammento solubile chiamato N1 (residui ~23-110). L'esatta posizione della scissione, cos? come l'identit? precisa degli enzimi responsabili sono ancora oggetto di dibattito. Al fine di testare l'effetto di SM875 sulla scissione alfa, le cellule HEK293 che esprimono stabilmente la PrP<C >sono state incubate con diverse concentrazioni di composto (1-10 pM) per 24 ore. I lisati delle cellule sono stati poi trattati con l'enzima PNGase-F per rimuovere i mutati di zucchero, e analizzati da Western blotting (Figura 7). Al trattamento con SM875, ? stato osservato un aumento dose-dipendente di Cl PrP, accompagnato da una diminuzione proporzionale della PrP<C >a lunghezza intera, indicando che il composto aumenta l'alfa-cleavage. Collettivamente, questi dati indicano che SM875 induce una specifica diminuzione dosedipendente della PrP<C >nativa a lunghezza intera, favorendo la sua degradazione.

SM875 riduce la quantit? di PrP<C >a piena lunghezza sulla superficie della cella

Sulla base degli effetti osservati di SM875 sull'espressione della PrP<C>, si ? ipotizzato che il composto potrebbe anche diminuire la quantit? totale della proteina sulla superficie cellulare. Al fine di testare direttamente questa ipotesi, Le cellule HEK293 stabilmente trasfettate con un modulo PrP<C >marcato con una molecola EGFP monomerizzata al suo estremo N-terminale (EGFP-PrP<C>) sono state seminate su un vetrino da camera a 8 pozzetti e incubate con SM875 (Figura 8, B e C) o controllo del veicolo (DMSO) (Figura 8 A). I vetrini coprioggetto sono stati montati con un supporto in gel (Sigma Aldrich), e visualizzati con una stazione di imaging Cell-R (Olympus) accoppiata ad un microscopio invertito (IX 81, Olympus). I segnali fluorescenti derivanti dall'EGFP sono stati acquisiti con una telecamera ad alta risoluzione (ORCA) dotata di un filtro di eccitazione a 488 nm, e un filtro di emissione con una gamma di 510 ? 40 nm. In condizioni di controllo, l'EGFP-PrP<C >si localizza quasi interamente sulla membrana al plasma, dando luogo ad una tipica colorazione "a nido d'ape" della superficie cellulare. Composti che alterano il traffico di PrP<C>, come il derivato della fenotiazina clorpromazina, hanno dimostrato in precedenza di alterare tale modello di localizzazione [12]. ? importante notare che l'incubazione con SM875 per 24 ore ha indotto una drastica riduzione di EGFP-PrP<C >sulla superficie cellulare, alle stesse concentrazioni (3-10 pM) alle quali la molecola ha prodotto effetti sull'espressione e sull'elaborazione della PrP<C >(Figura 8). ? interessante notare che in poche cellule trattate con SM875 ? stata osservata la comparsa di strutture simili a punti, indicando il possibile l'accumulo di EGFP-PrP<C >in specifici compartimenti intracellulari, compatibili con un modello in cui la proteina viene rimossa dalla ER e inviata alla degradazione intracellulare.

Generazione e caratterizzazione di SM898, un derivato di SM875

In diversi esperimenti ? stata notata una evidente citotossicit? di SM875 a concentrazioni vicine a quelle in cui il composto esercitava il massimo effetto biologico. Nel tentativo di ridurre la citotossicit? di SM875, ? stato progettato un derivato fluorurato (chiamato SM898, Figura 9A). SM898 ha mostrato una citotossicit? fortemente ridotta (~3 volte), come saggiato in cellule HEK293 esposte a ciascun composto per 48 ore, e successivamente analizzato con il saggio MTT (Figura 9B; la dose letale mediana stimata, LD50, ? stata di 4,6 ?M per SM875, e 37,9 pM per SM898). ? importante notare che non sono state osservate differenze apprezzabili tra SM875 e SM898 nella loro capacit? di ridurre l'espressione PrP<C >(Figura 9C). Collettivamente, questi risultati indicano che SM898 ? meno tossico del suo composto genitore, pur mantenendo la sua attivit? biologica.

Esempio 3

Caratterizzazione dell'attivit? terapeutica di SM930, SM940 e SM950

Tre composti aggiuntivi, denominati SM930, SM940 e SM950 (mostrati nelle Figure 10, 11 e 12 rispettivamente) hanno indotto una riduzione specifica dei livelli di PrP<C >nelle cellule, come saggiato dall'analisi Western Blotting, seguendo lo stesso protocollo sperimentale descritto sopra per SM875. Queste molecole sono state analizzate anche per la tossicit? intrinseca dal saggio MTT. SM930 ha soppresso l'espressione della PrP<C>, ma non il NEGR-1, alla massima concentrazione testata (30 ?M) quando testato in cellule HEK293 stabilmente trasformate. La molecola ha anche indotto la morte cellulare alla massima concentrazione testata (30 ?M). SM940 ha soppresso l'espressione PrP<C>, ma non il NEGR-1, quando testato in cellule HEK293 stabilmente trasformate, a partire da una concentrazione di 3 ?M. Il test di vitalit? cellulare nelle cellule HEK293 e Zr-75, come testato da MTT, ha mostrato che SM940 non ha indotto una morte cellulare significativa anche alla pi? alta concentrazione testata (30 ?M). Infine, SM950 ha soppresso l'espressione PrP<C>, ma non il NEGR-1, quando testato in cellule HEK293 stabilmente trasformate, a partire da una concentrazione di 10 ?M. Il test di vitalit? cellulare nelle cellule HEK293 e Zr-75, come saggiato da MTT, ha mostrato che questo composto induceva una morte cellulare significativa gi? ad una concentrazione di 3 ?M nelle cellule HEK293, anche se la molecola era molto meno tossica quando testata nelle cellule Zr-75 (dove ha mostrato una modesta tossicit? solo a 30 ?M). Al contrario, nessuno dei composti ha diminuito l'espressione della proteina di controllo NEGR-1 a qualsiasi concentrazione.

Esempio 4

Attivit? di SM875, SM940 e SM950 nella diminuzione dei livelli di mRNA PrP<C>

Al fine di escludere la possibilit? che SM875, SM940 e SM950 abbiano agito diminuendo i livelli di mRNA di PrP<C>, gli inventori hanno effettuato l'analisi PCR in tempo reale della trascrizione di PrP<C >in diverse linee cellulari al trattamento composto (Figura 13). I risultati hanno mostrato che nessuna di queste molecole sopprime l'espressione di PrP<C >diminuendo i livelli del suo mRNA.

Esempio 5

I composti SM875 e SM940 inducono l'aggregazione di PrP<C >ricombinante in modo dipendente dalla temperatura

I composti SM940 e SM875 sono stati identificati sulla base della logica PPI-FIT di puntare su un intermedio di ripiegamento di PrP<C>. Al fine di osservare un effetto diretto di queste molecole sulla PrP<C >in vitro, ? stato progettato un paradigma sperimentale in cui la PrPC nella conformazione nativa viene riscaldata a diverse temperature con la speranza di fornire energia sufficiente a consentire la sua transizione conformazionale all'intermedio di piegatura previsto (Figura 14). Se l'intermedio di piegatura appare come conseguenza dell'innalzamento della temperatura, allora gli inventori hanno previsto che i composti dell'invenzione, per esempio SM875 o SM940, dovrebbero essere in grado di legarlo, causandone la stabilizzazione e quindi probabilmente inducendone l'aggregazione, poich? il FI-PrP espone ai residui idrofobici di solvente che invece sono sepolti all'interno del nucleo proteico nella conformazione nativa della PrP<C>.

L'aggregazione di PrP ricombinante ? stata valutata con un test di insolubilit? al detergente. I composti SM875 e SM940 hanno aumentato la quantit? di PrP ricombinante insolubile nel detergente e in modo dipendente dalla temperatura; al contrario, non sono stati rilevati effetti nei controlli non trattati, o quando la proteina ? stata incubata con la molecola SM935 (che ? stata trovata negativa dopo lo screening cellulare e qui utilizzata come controllo negativo), come mostrato da Western blot. Questi risultati indicano che i composti SM875 e SM940 si legano ad un intermedio di ripiegamento di PrP<C >(cio? FI-PrP). Le differenze statistiche sono state stimate da Anova a senso unico, Dunnet post-hoc test. p valori di p sono: *<0,05, **<0,01.

Esempio 6

SM875 induce la degradazione della PrP<C >nel comparto lisosomiale

Gli inventori hanno cercato di testare la possibilit? che la molecola SM875 e i suoi derivati potessero indurre la degradazione della PrP<C >tramite autofagia dipendente dal lisosoma. In primo luogo, hanno osservato che SM875 induce l'attivazione dell'autofagia nelle cellule in modo dipendente dalla PrP<C>, come dimostrato rilevando il Marcatore autofagico LC3-II (Figura 15 A).

Successivamente, hanno trovato che l'inibitore dell'autofagia Bafilomicina Al inibisce la diminuzione della PrP<C >indotta da SM875 nelle cellule (Figura 11 B).

Collettivamente, questi risultati suggeriscono che SM875 promuove la degradazione della PrP<C >per via autofagica dipendente dal lisosoma.

Esempio 7

SM875 inibisce la replicazione dei prioni nei fibroblasti dei topi

In seguito all'osservazione che SM875 sopprime l'espressione della PrP<C>, il substrato per la replicazione dei prioni, gli inventori hanno cercato di testare la capacit? di questa molecola di abbassare la quantit? di molecole PrP resistenti alla proteinasi-K (PK) nei fibroblasti di topo persistentemente infettati dal ceppo prionico dei Rocky Mountain Laboratories (RML). Come mostrato in figura 16, hanno scoperto che il composto SM875 inibisce la replicazione dei prioni in modo dose-dipendente, diminuendo i carichi di prioni in modo simile al composto TPM, un potente composto antiprione precedentemente segnalato (Massignan et al. SciRep 2016).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un composto con formula generale (I):

in cui: l'anello B pu? essere parzialmente saturo, ad esempio un anello di di-idropiridinone quando R1 ? O e/o quando una o entrambe le X ? N, oppure insaturo, ad esempio un anello di piridinone quando R1 ? O; R1 pu? essere O o S; ogni atomo di carbonio sull'anello B pu? essere indipendentemente un atomo C o N; X pu? essere selezionato indipendentemente tra -C- o -O- o -N(R4)-, dove R4 pu? essere -H, o -C1-4 lineare o ciclico alchilico; l'anello C ? un anello aromatico a 5 o 6 elementi in cui ogni atomo di carbonio pu? essere -C- o -N-, ad esempio Y pu? essere indipendentemente -C(R3) o -N(R3)-; R3 ? selezionato tra -H, C1-4 gruppo alchilico lineare o ciclico, alchossile o arilossile, anello A o anello Z A; preferibilmente, l'anello C ha uno o due eteroatomi; Z pu? essere -CH2- o -O- o -N(H)- o -S(O2)- o -S(O)-; l'anello A pu? essere un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri, preferibilmente un anello fenilico; l'anello A pu? essere sostituito in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R2 selezionati indipendentemente tra: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2, -CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH; o formula generale (II):

in cui: ogni atomo di carbonio su ogni anello pu? essere indipendentemente un atomo -C- o -N-; Z pu? essere -H, -CH2-, -S(O2)-, -S(O)-, R1 pu? essere assente (quando Z ? -H) o pu? essere un gruppo selezionato indipendentemente tra: H, C1-4 lineare, ramificato, alchilico ciclico o alchossilico o arilossilico opzionalmente sostituito con uno o pi? di uno: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2,-CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -S, un anello tetraidrofurano o un anello tetraidropiranico in cui ogni atomo di carbonio dell'anello pu? essere sostituito indipendentemente con -H o -OH, un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri sostituito in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R2 selezionati indipendentemente tra: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2, -CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH; l'anello A e l'anello B sono ciascuno indipendentemente un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri, preferibilmente un anello fenilico; l'anello A e l'anello B possono essere sostituiti indipendentemente in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R2 selezionati indipendentemente tra: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2,-CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH; o formula generale (III):

in cui: ogni atomo di carbonio su ogni anello aromatico pu? essere indipendentemente un atomo C o N; l'anello B e l'anello C sono anelli di imidazolo fusi, L'anello D ? un anello di pirimidina, opzionalmente l'anello D pu? essere un anello di citosina o di uracile; R2 sono ciascuno indipendentemente -H, -OH, -CH2OH, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH3, alogeno selezionato nel gruppo che lo compone: -F, -Cl, -Br, -I, -CF3, -OCH3; X pu? essere indipendentemente =O, -NH2, =S; R3 ? selezionato indipendentemente da -H, C1-4 lineare, ramificato o ciclico alchilico, anello A o Z-ring A; Z pu? essere -CH2 o -S(O2)- o -S(O)-, L'anello A pu? essere un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri, preferibilmente un anello fenilico; l'anello A pu? essere sostituito in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R1 selezionati indipendentemente da: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2, -CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH; o formula generale (IV):

in cui: ogni atomo di carbonio su ogni anello pu? essere indipendentemente un atomo C o N; l'anello A e A' sono ciascuno indipendentemente un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri, preferibilmente un anello fenilico; l'anello A, A' e B possono essere sostituiti in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R1 selezionati indipendentemente tra: -H,-F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2,-CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH; l'anello B ? un anello aromatico o non aromatico in cui ogni atomo pu? essere indipendentemente uno o pi? atomi di C o N o O o S o S(O2) e preferibilmente ? un anello di piperidina; X ? -CH2, -O-, -S-, -N(H), -C(O)-, -C(S)-, -C(H)=C(H)-, -S(O2), -S(O).
2. Il composto secondo la rivendicazione 1, con formula (I.1):

in cui ogni atomo di carbonio sull'anello B pu? essere indipendentemente un atomo C o N, X pu? essere selezionato indipendentemente tra -C- o -O- o N(R4)-, R4 pu? essere -H, o -C1-4 lineare o ciclico alchilico, R1 pu? essere O o S, R2 pu? essere selezionato indipendentemente tra: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2, -CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH.
3. Il composto secondo la rivendicazione 1 o 2 con formula:
4. Il composto secondo la rivendicazione 1 avente formula:
5. Il composto secondo la rivendicazione 1 con formula (III.1)
in cui ogni atomo di carbonio su ogni anello aromatico pu? essere indipendentemente un atomo C o N, L'anello B e l'anello C sono anelli di imidazolo fusi, L'anello D ? un anello di pirimidina, opzionalmente l'anello D pu? essere un anello di citosina o di uracile; X pu? essere indipendentemente =O, - NH2, =S; R1 pu? essere selezionato indipendentemente tra: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2, -CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH; R2 pu? essere ciascuno indipendentemente -H, -OH, -CH2OH, -CH2OH, -CH3, -CH2CH3, alogeno selezionato nel gruppo che comprende: -F, -Cl, -Br, -I, -CF3, -OCH3, R3 ? selezionato indipendentemente da -H, C1-4 lineare, ramificato o ciclico alchilico, anello A o Z-ring A, Z pu? essere -CH2 o -S(O2)- o -S(O)-, L'anello A pu? essere un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 componenti, preferibilmente un anello fenilico; l'anello A pu? essere sostituito in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R1. 6. Il composto secondo la rivendicazione 1 o 5 avente formula:
7. Il composto secondo la rivendicazione 1 avente formula (IV.1):
l'anello A e A' possono essere ognuno indipendentemente un anello aromatico o eteroaromatico a 5 o 6 membri, preferibilmente un anello fenilico, L'anello B pu? essere un anello aromatico o non aromatico in cui ogni atomo pu? essere indipendentemente uno o pi? atomi di C o N o O o S o S(O2) e preferibilmente ? un anello di piperidina, Gli anelli A, A' e B possono essere sostituiti in qualsiasi posizione con uno o pi? gruppi R1, R1 pu? essere selezionato indipendentemente da: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -C(CH3)3, -CHF2,-CF3, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCF3, -OCH(CH3)2, -CN, -NO2, -NH2, -SH. 8. Il composto secondo la rivendicazione 1 o 7 con formula:
9. Un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 1 a 8 per l'uso come medicinale.
10. Un composto secondo la precedente rivendicazione per l'uso come medicinale nel trattamento di disturbi neurodegenerativi, disturbi neuroinfiammatori e malattie demielinizzanti, cancro.
11. Un composto secondo la rivendicazione precedente, in cui tali disturbi neurodegenerativi sono selezionati nel gruppo che comprende le malattie prioniche sporadiche, ereditarie o acquisite, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e altre ?-sinucleinopatie; tali disturbi neuroinfiammatori e malattie demielinizzanti che comprendono la sclerosi multipla; tale cancro ? selezionato nel gruppo che comprende il glioblastoma, il cancro gastrico, il cancro al seno, il cancro al colon.
12. Un composto secondo la rivendicazione precedente, in cui la malattia prionica comprende: Malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD), sindrome di Gerstmann-Str?ussler-Scheinker (GSS) e insonnia familiare mortale (FFI).
13. Un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti 9-12, per l'uso come medicinale in combinazione con composti chimici, anticorpi, terapia genica o approcci terapeutici di modificazione genica, contro malattie o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrPC) o interattori di PrPC o vie di segnale tossiche che coinvolgono PrPC.
14. Il composto secondo la precedente rivendicazione, in cui tali malattie o disturbi legati alla proteina prionica cellulare (PrPC) o agli interattori della PrPC o alle vie di segnale tossiche che coinvolgono la PrPC comprendono disturbi neurodegenerativi, come malattie prioniche sporadiche, ereditarie o acquisite, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e altre ?-sinucleinopatie; disturbi neuroinfiammatori e malattie demielinizzanti, come la sclerosi multipla; cancro, in particolare glioblastoma, cancro gastrico, cancro al seno, cancro al colon.