CN102083444A - 用于预防和治疗神经退行性疾病的方法 - Google Patents

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L·霍
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Abstract

本发明提供了一种采用葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物来预防和治疗包括阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等神经退行性疾病的方法。特别是，本发明提供了一种对诊断患有神经退行性疾病或具有发生神经退行性疾病风险的患者进行治疗的方法，通过给予患者治疗量的含有葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物的药物组合物，以减少β淀粉样蛋白或其低聚体的积累、聚集或沉积，和/或减少tau蛋白或其他蛋白的错误折叠、积累和/或聚集。

Description

用于预防和治疗神经退行性疾病的方法
优先权
本申请主张对2008年5月9日递交的美国专利申请第61/051,866号享有美国专利法35U.S.C第119条的优先权，其内容在此整体引用作为参考。
资金信息
本发明是在国立卫生研究院提供的资金NIH 1 PO1 AT004511-02号的政府资助下产生的。美国政府对本发明享有一定的权利。
发明领域
本发明涉及采用葡萄籽提取物来预防和治疗神经退行性疾病。特别是，本发明提供了对诊断患有神经退行性疾病或具有患神经退行性疾病风险的患者进行治疗的方法，通过给予患者有效量的含有葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物的药物组合物，以减少β淀粉样蛋白或其低聚体的积累、聚集或沉积，和/或减少tau蛋白或其他蛋白的错误折叠、积累和/或聚集。
发明背景
神经退行性疾病是与神经细胞退化、丧失功能和常常死亡相关的的病症。由于他们一般是进行性的，神经退行性疾病的结果往往是灾难性的。患有神经退行性疾病的患者可能会认知或运动机能严重退化。因此，他们的生活质量和预期寿命可能会大大降低。在人类中，这些疾病包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，亨廷顿病，额颞痴呆症，皮质基底豆状核退化症，等等。
帕金森病是一种影响控制肌肉运动的脑神经细胞的进行性疾病。这些神经细胞制造多巴胺，这是细胞之间传递信息以促进身体运动的一种重要化学物质。因此，缺失这些神经元会导致运动失调，例如帕金森病患者通常表现出的颤抖和语言障碍。根据国立神经疾病和中风研究院所说，美国至少100万人患有帕金森病，并且每年报告约5万个新病例。
已经知道，帕金森病的机理涉及一种高度保守的突触前蛋白，α-突触核蛋白(α-synuclein)。认为α-突触核蛋白的构象变化会导致疾病特征性的蛋白质积累和纤维形成。参见美国专利第7,045,290号(Lindquist等)。现有的治疗选择包括左旋多巴胺和多巴胺拮抗剂。然而，这些药物只能暂时性缓解症状，并且如果大量使用会产生严重的副作用。丙炔苯丙胺，一种单胺氧化酶B抑制剂，是第一种提示能提供针对帕金森病病因进行治疗、通过减轻症状并且减缓疾病发展的药物，但是丙炔苯丙胺的治疗效果是有争议的。参见美国专利第6,417,177号(Nelson)。
亨廷顿病(HD)是一种遗传性神经系统疾病，具有身体运动异常和智力下降的症状。亨廷顿病是由于亨廷顿基因(htt)的三核苷酸重复延伸造成的，而这依次又产生了一种带有多聚谷氨酰胺(polyQ)串的病理延伸的突变形式htt蛋白。突变的htt蛋白错误折叠并且在脑和其他受到影响的组织中形成聚集物，导致神经细胞死亡(Wolfgang等，Proc Nat Acad Sci 2005；102：11563-11568)。用于治疗亨廷顿病的症状的多数药物具有副作用，如疲劳、烦躁、或过度兴奋。
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性脑疾病，一般称为老年性痴呆。超过450万美国人已经被诊断患有AD，并且预计在未来40-50年这个数字将增加到三倍(Lyketsos等，Am J Geriatr Psychiatry 2006；14(7)：561-72)。
认为AD的病理生理学根源，部分在于淀粉样前体蛋白的错误加工或突变。这种错误加工的蛋白会使得β淀粉样肽(Aβ)或其变体形式的量增加。Aβ的累积导致不可溶的Aβ斑块沉积，并且最终导致突触失灵、神经损伤、形成过度磷酸化tau蛋白的缠结、以及凋亡性神经元死亡。神经元的损伤或死亡导致缺失多种神经递质，从而导致出现该疾病的认知和功能症状。
目前可用的药物对于一些患者的症状改善相当小，并且不减缓病情的发展。因此，正在研究治疗或预防AD的各种症状的策略。例如，已经发现AD与脑部炎症相关，因此非类固醇消炎药物例如布洛芬和茚甲新等已经用于降低发生AD的风险。然而，长期使用这些药物具有胃肠出血或肾病的风险，并且与罕见的心血管毒性相关。氧自由基与AD的相关性也提出了抗氧化治疗的可能性。美国精神病学协会和美国神经学学会AD治疗指导方针都建议采用高剂量的维生素E作为治疗选择。然而，这一建议是缓和性的，最近发现维生素E治疗不会延缓AD相关的轻度认知障碍的发展，并且相当高剂量的维生素E提高了老年人的死亡率。参见Lyketsos等，2006，见上。
AD的另一种治疗选择是减少通过一种称为乙酰胆碱酯酶(AChE)的酶天然发生的乙酰胆碱降解。抑制AChE导致乙酰胆碱水平升高。美国食品和药品管理局有4种已经批准用于治疗AD的胆碱酯酶抑制剂药物：他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利凡斯的明(rivastigmine)和加兰他敏(galanthamine)。胆碱酯酶抑制剂的短期(最多6个月)临床试验表明，这些药物改善或减缓了AD相关的认知丧失，但是它们的长期功效的临床试验结果不明确。在非常轻度或更严重的AD中，胆碱酯酶抑制剂的功效没有被证实。参见Lyketsos等，2006，见上文。
针对从脑中去除Aβ的AD治疗正在开发中。例如，美国专利第7,262,223号(Kong等)描述了采用脒化合物来治疗淀粉样蛋白相关疾病；美国专利第7,279,501号(Kim)描述了采用从植物中分离的天然产物化合物(如姜黄、银杏和生姜)及其合成的化学类似物来治疗Aβ诱导的疾病。最近的证据表明，适量饮用红酒可以降低AD的发病率，并且可以减弱AD类认知功能减退和淀粉样神经病理症状(Dartigues等，Therapie 1993；48：185-187；Dorozynski，BMJ 1997；314：997；Luchsinger等，J Am Geriatr Soc 2004；52：540-546)。脑中可溶性胞外高分子量(HMW)低聚Aβ物质的积累被认为是认知功能减退发生和发展的主要风险因素(Klyubin等，Nat Med2005；11：556-561；Selkoe，J Alzheimer’s Dis 2001；3：75-80)。也已经表明，来源于葡萄的多酚类化合物可以在体外抑制Aβ的低聚化(Porat等，Chem Biol Drug Des2006；67：27-37)。然而，目前的研究还限于体外测试。
多种神经退行性疾病与异常的蛋白折叠、蛋白积累、聚集和/或沉积相关。例如，阿尔茨海默病患者脑中有两种异常的蛋白沉积。由β淀粉样肽构成的淀粉样蛋白斑块在脑实质中核脑血管壁周围发生细胞外沉积，由过磷酸化的tau蛋白聚集构成的神经原纤维缠结位于退化神经元的细胞质中。在帕金森病患者中，在黑质的神经元的细胞质中发现了路易小体。路易小体的主要成分是一种叫做α-突触核蛋白的蛋白的片段。在亨廷顿病的患者中，脑中的典型特征是富含多聚谷氨酰胺的突变亨廷顿蛋白的核内沉积。遗传性肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者，在运动神经元的细胞体和轴突中具有主要由超氧化物歧化酶构成的聚集物。此外，各种形式的传染性海绵状脑病的特征在于抗蛋白酶的朊蛋白聚集物的积累。
生化、遗传、神经病理学研究的证据表明，在神经退行性疾病的病理学中，蛋白错误折叠和/或聚集发挥了积极作用。例如，异常聚集物通常发生在被疾病大部分损伤的大脑区域。编码错误折叠蛋白的基因突变产生了疾病的遗传形式，其通常比零星形式的疾病发生更早且表型更为严重。表达错误折叠蛋白的人突变基因的转基因动物会产生人类疾病的一些典型神经病理学和临床特性。而且，在体外产生的错误折叠的蛋白聚集是神经毒性的，并且诱导细胞死亡。
tau蛋白病(taupathy)是一种神经退行性疾病的类型，涉及tau蛋白(一种密切相关的细胞内微管相关蛋白家族)的功能异常。这些神经退行性疾病包括，例如，阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、嗜银颗粒病，皮克病以及其他疾病。tau蛋白病的共同特征是tau蛋白的异常过度磷酸化以及tau蛋白积累，在脑中的神经元或胶质细胞之间形成称为“神经原纤维缠结”(NFT)的抗去垢剂的细胞内内含物。异常过磷酸化的tau蛋白很容易从微管上解离下来，并且聚集形成主要是沉积为细胞内NFT的低聚tau配对螺旋纤丝(Mi，K.等，Curr Alzheimer Res 2006；3：449-463)。低聚体的形成作为成核位置，使得其它过磷酸化tau以及正常的非磷酸化tau形成纤维聚集物(Sorrentino等，Neurol Sci 2007；28：63-71)。因此，tau介导的神经退化的原理是基于一个“毒性功能获得”模型，其中异常磷酸化的tau蛋白促进从微管上去除过磷酸化和正常的tau蛋白。这导致了微管不稳定性以及例如轴突传送等微管介导过程的改变，这从而导致了脑中神经细胞和胶质细胞的功能受损和成活力降低(Sorrentino等，2007，见上文)。
美国专利申请公报第2007/0122504号(Moon等)公开了葡萄籽提取物的制造过程，以及采用这样的葡萄籽提取物来治疗包括AD等神经退行性疾病的方法。提取物的制备是通过(1)在pH8-10的碱性溶液中提取葡萄籽，优选在20-50℃，以获得碱性可溶的物质；(2)用酸性溶液中和，将pH调节到2-4，并且离心所得的溶液，获得沉淀层；(3)加入低碳醇并且获得上清层，然后浓缩上清层；并且(4)加入非极性溶剂，且去除非极性溶剂可溶层，以获取纯化的馏分，再进行重复纯化和冻干，以获得干燥的葡萄籽提取物(参见Moon，第[0030]-[0035]段)。
因为神经退行性疾病流行并且缺乏已证实有效的治疗与神经退行性疾病相关症状的药物组合物和方法，还需要有改良的药物组合物和方法来治疗和预防神经退行性疾病。
发明简述
本发明涉及一种通过给予有需要的对象一种药物组合物来治疗对象的神经退行性疾病的方法，其中药物组合物包含葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物。在一些实施方式中，药物组合物还可包含选自下组的活性成分：抗氧化剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂以及上述物质的组合。在一个特定实施方式中，葡萄籽提取物中没食子酰原花色素占原花色素的总重量的重量比低于约12％。
本发明的方法用于治疗、改善、降低风险或预防神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和/或tau蛋白病。本发明考虑的各种tau蛋白病包括阿尔茨海默病，进行性核上性麻痹，皮质基底变性，嗜银颗粒病，皮克病以及家族性额颞痴呆症。
在一个实施方式中，药物组合物是通过口服给药的。口服剂型包括粉末、片剂、胶囊、口腔分散片、软胶囊、水性药物、糖浆、酏剂或药囊。在另一个实施方式中，药物组合物是经皮给药的。在一个不同实施方式中，药物组合物是经鼻给药的。
在特定实施方式中，对象为人类对象。给药频率为每月、每两周、每周或每天，并且可以为单剂给药或分多剂给药。葡萄籽提取物的化合物的有效量为每天约100-1000毫克的剂量，优选为每天约200-600毫克。
附图简述
图1A-1F.图1显示了葡萄籽提取物(GSE)产品MegaNatural
Figure BPA00001293415500051
-AZ(或MNG-AZ)的组分分析结果。图1A显示了典型的异源多聚原花色素的分子结构。图1B呈现了MNG-AZ的正相HPLC分析。图1C显示了由表儿茶素没食子酸酯构成的同源四聚原花色素(左图)和所得的去没食子酰原花色素加上一个独立的没食子酸结构(右图)。图1D显示了MNG-AZ中没食子酰原花色素(占总原花色素)的百分比，与四种其它市售GSE制剂相比：MegaNatural
Figure BPA00001293415500052
-Gold、A品牌GSE、B品牌GSE和C品牌GSE(图1D)(A品牌为“Activin”，一种从圣华金河浓缩物公司(San Joaquin ValleyConcentrates)获得的GSE；B品牌为“Masquelier
Figure BPA00001293415500061
OPC”，来自法国的GSE；并且C品牌为来自意大利英德纳公司(Indena S.p.A.，Italy)的GSE)。图1E和1F呈现了MNG-AZ和一些其他市售GSE中的没食子酰原花色素的水平。
图2A-2D.图2呈现了在体外MNG-AZ GSE对于将Aβ肽转化成它们的可溶低聚体形式的影响。图2A和2B显示了Aβ1-42(2A)和Aβ1-40(2B)与各种量的MNG-AZGSE的孵育产物的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。图2C和2D显示了在有或无MNG-AZ GSE时Aβ1-42(2C)和Aβ1-40(2D)的未修饰蛋白光致交联(PICUP)反应后的SDS-PAGE结果。
图3A-3D.图3显示了圆二色谱(CD)观测的MNG-AZ的Aβ抑制作用。图3A和3C分别显示了未处理的Aβ1-40和Aβ1-42的CD谱；图3B和3D分别显示了MNG-AZ处理的Aβ1-40和Aβ1-42的CD谱。光谱分别是在孵育期开始时立即获得的
Figure BPA00001293415500062
以及在2天后
Figure BPA00001293415500063
3天后
Figure BPA00001293415500064
6天后
Figure BPA00001293415500065
和7天后
Figure BPA00001293415500066
获得的。在每个时间点的光谱代表了在三个独立实验中每一个获得的光谱。
图4A-4D.图4呈现了用ThT结合测试测得的MNG-AZ的Aβ抑制作用。图4A和4C分别显示了在不同浓度的对照化合物Med1下未处理的Aβ1-40和Aβ1-42的荧光光谱。图4B和4D分别显示了MNG-AZ处理的Aβ1-40和Aβ1-42的荧光光谱。在图4A-4D中，Med1(或MNG-AZ)的浓度为0(◆)、5(■)或25(▲)μM。
图5A-5F.图5显示了用电子显微镜测得的MNG-AZ的Aβ抑制作用。图5A和5B分别显示了未处理的Aβ1-40和Aβ1-42的示例性形态。图5C和5E分别显示了在较低浓度(5μM)和较高浓度(25μM)的MNG-AZ存在下Aβ1-40的形态。图5D和5F分别显示了在较低浓度(5μM)和较高浓度(25μM)的MNG-AZ存在下Aβ1-42的形态。
图6A-6D.图6显示了MTT代谢测得的MNG-AZ的Aβ抑制作用。图6A(和6C)显示了低分子量Aβ1-40(和Aβ1-42)的毒性和MNG-AZ对于降低这一毒性的效果。图6B(和6D)显示了Aβ1-40聚集(和Aβ1-42聚集)的毒性，以及MNG-AZ对于降低这一毒性的效果。
图7A-7G.图7显示了MNG-AG GSE对于Tg2576小鼠的神经病理学作用。图7A-7B显示了MNG-AZ GSE对体重(7A)或液体消耗(7B)的效果。图7C-7D显示了在Tg2576小鼠的脑中可溶的胞外HMW-Aβ肽量的评估结果。图7E显示了在MNG-AZ GSE治疗小鼠和对照小鼠的脑中Aβ1-42和Aβ1-40肽浓度的评估结果。图7F显示了在MNG-AZ GSE治疗小鼠和对照小鼠的脑中大脑皮层和海马体形成Aβ-淀粉样蛋白斑块负担的体视学评估结果。图7G显示了在MegaNatural
Figure BPA00001293415500071
-Gold治疗小鼠和对照小鼠的脑中Aβ1-42和Aβ1-40肽浓度的评估结果。
图8A-8F.图8显示了阐明MNG-AZ GSE的有利作用的潜在机制的各种实验结果。图8A显示了用MNG-AZ治疗约5个月的Tg2576小鼠中总APP表达的蛋白免疫印迹分析。图8B显示了α-、β-和γ-分泌酶活力的评估结果。图8C显示了在用MNG-AZ GSE治疗的Tg2576小鼠与对照组中可溶APPα和APPβ表达的蛋白免疫印迹分析。图8D和8E显示了在用MNG-AZ GSE治疗的Tg2576小鼠相比对照小鼠的脑中Aβ降解酶脑啡肽酶和胰岛素降解酶的表达。图8F显示了用酶联免疫吸附测试(ELISA)进行的血清Aβ1-40(左图)和Aβ1-42(右图)量的评估结果。
图9A-9C.图9显示了用MNG-AZ GSE治疗的Tg2576小鼠中的认知功能退化减轻。图9A和9B显示了莫里斯水迷宫(Morris water maze)测试测得的MNG-AZGSE对于Tg2576小鼠中Aβ相关的空间记忆的效果。图9C呈现了Tg2576小鼠的脑中可溶性胞外高分子量Aβ肽量的评估结果。
图10A-10B.图10A和10B显示了用莫里斯水迷宫测试测得的品系-、年龄-和性别-匹配的野生型动物中MNG-AZ GSE治疗对于认知功能的影响。
图11A-11B.图11显示了在缺乏MNG-AZ GSE存在的情况下tau肽聚集的动力学。图11A显示了在不同浓度的MNG-AZ下聚集的tau蛋白的时间依赖的ThS-荧光光谱；图11B显示了在不同浓度的MNG-AZ下tau聚集物的最大累积。
图12A-12B.图12显示了MNG-AZ GSE对于解离预先形成的tau肽聚集物的影响。图12A显示了在不同浓度的MNG-AZ下聚集的tau蛋白的时间依赖的ThS-荧光光谱；图12B显示了tau聚集物的解离速度与MNG-AZ浓度的关系。
图13A-13D.图13显示了MNG-AZ GSE在果蝇模型上的作用。图13A显示了在缺乏GSE时果蝇眼发育的结果；图13B显示了在存在GSE时果蝇眼发育的结果；图13C显示了在一个代表性实验中(在存在和缺乏GSE时)雄性果蝇眼睛的视觉评分；图13D显示了在与图13C相同的测试中缺失眼睛的数量。
图14.图14显示了在亨廷顿病的果蝇模型中存活百分比随天数的变化。空心圆代表来自葡萄籽提取物治疗组的结果；而实心圆代表来自对照组的结果。
图15A-15C.图15显示了MNG-AZ GSE对于Aβ低聚化的影响。图15A显示了对Aβ1-40的结果；图15显示了对Aβ1-42的结果；图15C显示了对于谷胱甘肽巯基转移酶的结果。第1道：分子量标记物；第2道：只有蛋白，没有交联；第3道：只有蛋白；第4道：蛋白加Med1(25μM)；第5道：蛋白加Med1(250μM)；第6道：蛋白加MNG-AZ(25μM)；第7道：蛋白加MNG-AZ(250μM)。胶代表三次独立试验中每一次。
图16.图16显示了采用PICUP测试得到的MNG-AZ GSE对于tau肽聚集的影响。胶显示了在存在(第2、4、6、8道)或不存在(第1、3、5、7道)等摩尔(25μM)的GSE时25μM tau肽交联的代表性分析。因为预期对于小肽的染色效果欠佳，在这个实验中单体tau肽是检测不到的。～2.1和～3.5kDa条带分别对应于三聚体和五聚体tau肽聚集物。CTR：未交联的tau肽；第1-8道：tau肽和过硫酸铵以及1x(第1、2道)、2x(第3，4道)、3x(第5、6道)和4x(第7、8道)Ru(Bpy)。
图17A和17B.图17显示了采用圆二色谱测得的MNG-AZ GSE对于tau肽聚集的影响。图17A显示了在缺乏MNG-AZ时的tau肽聚集；而图17B显示了当MNG-AZ对tau肽的摩尔比为1∶1时的tau肽聚集。图17A和17B中标有注释d0、d1、d2和d3的曲线分别代表在孵育过程(37℃)中合成的tau肽在第0、1、2、3天获得的光谱。箭头指示有序的构象异构体的特征性光谱。
图18A和18B.图18显示了用电子显微镜测得的MNG-AZ GSE对tau纤维形态的影响。图18A显示了缺乏MNG-AZ时的tau纤维形态；图18B显示了在存在MNG-AZ时的tau纤维形态。比例尺表示100nm。
图19A-19D.图19显示了MNG-AZ GSE对于从AD脑标本中分离的天然成对螺旋纤维(PHF)的超微结构特征的影响。图19A显示了在没有MNG-AZ GSE时纯化的PHF的电子微观图；图19B和19C显示了在存在100μM MNG-AZ GSE5秒(图19B)或1小时(图19C)时纯化的PHF的电子微观图。在图19A和19C中，电子致密颗粒代表pSer214tau标记(C中的箭头)。图19D显示了GSE处理对PHF的定量分析与处理时间(5到60分钟)的关系，其中柱状图表示带有标准差的平均最大宽度；测得的PHF数量在括号内呈现。统计学分析用单因素方差分析(P＜0.0001)，接着用邦弗朗尼多重比较试验，与未处理PHF(0-时间)比较，**p＜0.001。
图20A-20D.图20显示了MNG-AZ GSE对PHF的胰酶消化的影响。图20A显示了从没有与胰酶孵育的AD脑中分离的天然PHF的电子微观图；图20B显示了没有与胰酶孵育的预先用MNG-AZ(100μM，1小时)处理的PHF的电子微观图；图20C显示与胰酶(1μg/ml，10分钟)孵育的天然PHF的电子微观图；图20D显示了与胰酶(1μg/ml，10分钟)孵育的预先用MNG-AZ(100μM，1小时)处理的PHF的电子微观图。
图21A-21G.图21显示了MNG-AZ GSE对于tau突变的果蝇模型的异常眼表型的影响。图21A和21D显示了野生型果蝇中的代表性眼表型；图21B和21E显示了在没有GSE处理时R406W突变tau的果蝇的眼，图21C和21F显示了用MNG-AZ处理的R406W突变tau的果蝇的眼；图21G显示了成年眼形态的定量分析，在三个独立测试中在雄性和雌性果蝇中采用4分制评分系统(其中0＝无眼且4＝正常眼)。标出了每个测试中评分的果蝇的数量。柱状图代表平均值+SEM。
图22A-22D.图22显示了采用后腿伸展测试对tau蛋白病的转基因JNPL3小鼠模型的评估方案。采用4分制评分系统评估当小鼠被拉着尾巴倒挂起来时横向伸展后腿的天然倾向：4＝天然功能(图22A)，3＝轻微障碍(图22B)，2＝中度障碍(图22C)，和1＝严重障碍(图22D)。
图23A和23B.图23显示了GSE治疗在tau蛋白病的转基因JNPL3小鼠模型上的作用。图23A分别显示了与没有用GSE治疗的小鼠相比，用GSE治疗的5月龄和13月龄的JNPL3小鼠的运动障碍。图23B显示了用和不用GSE治疗的JNPL3小鼠之间死亡率的比较，其中线形图表示了存活百分比随时间的变化。
图24A和24B.图24显示了采用荧光显微镜观察到的MNG-AZ GSE对于减少htt蛋白聚集物的影响。图24A显示了用赋形剂处理的对照细胞(Ctrl)和用12.5μM和25μM GSE处理的细胞在用米乐甾酮A诱导后的图片。图24B显示了在缺乏(Ctrl)或存在12.5μM和25μM GSE处理的情况下，GFP-Htt融合蛋白聚集形成高分子量聚集物的蛋白免疫印迹分析(左图：用抗-GFP抗体做探针的蛋白免疫印迹来识别GFP-Htt融合蛋白聚集形成较高分子量的物质；右图：显示GFP-Htt蛋白和较高分子量的htt聚集物的分布的蛋白免疫印迹的光密度分析)。
图25A和25B.图25显示了用攀登测试评估GSE治疗对于果蝇HD模型中运动机能障碍的影响。图25A和25B分别显示了第9天和第16天的攀登测试结果。每个测试日进行3次独立的攀登试验。柱状图代表了成功完成攀登任务的果蝇的百分比的平均值+SEM。统计学测试采用学生t检验，**GSE-治疗组与未治疗组相比p＜0.001。
图26A和26B.图26显示了果蝇HD模型中存活百分比随时间的变化。实心的倒三角代表了来自用MNG-AZ GSE治疗组的结果，并且实心的菱形代表了来自对照组的结果。数据代表了来自4个独立测试的结果。
图27.图27显示了GSE治疗对于HD小鼠模型中运动机能障碍的影响，用旋转杆测试在不同周龄进行评估。数据代表了从3个独立测试获得的结果。
图28.图28显示了GSE治疗对于HD小鼠模型的死亡率的影响。线形图代表了存活百分比随时间的变化。
发明详述
本发明提供了一种用于减少Aβ、低聚Aβ、tau蛋白或与神经退行性疾病相关的其他蛋白的错误折叠、积累、聚集或沉积的方法。方法涉及给予有效量的含有葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物的药物组合物。本发明的这些和其他方面在下文提供的介绍和实施例中详细描述。
本发明基于一个发现，即来自葡萄籽提取物的化合物作为针对Aβ、tau蛋白或与神经退行性疾病相关的其他蛋白的错误折叠、积累、聚集或沉积的有效抑制剂发挥作用。特定地，本发明部分基于一项发现，即特定类型的葡萄籽提取物(1)在体外减少或抑制合成的Aβ1-40(Aβ40)和Aβ1-42(Aβ42)形成低聚体；(2)减少或抑制Tg2576小鼠(表达突变的淀粉样蛋白前体蛋白并且表现出AD型认知功能退化的转基因小鼠)脑中低聚Aβ的量，并且(与未处理小鼠相比)Tg2576小鼠的认知功能丧失略有改善或减缓；(3)在体外抑制成核现象的发生，该成核现象使得tau聚集物形成在各种tau蛋白病中发现的配对螺旋纤丝的特征性结构，并且降低tau聚集物的稳定性；(4)在体内，减轻tau蛋白在转基因R406W果蝇表型中的有害作用，以及减轻tau蛋白在转基因JNPL3小鼠模型中的有害作用；(5)在体外抑制带有多聚谷氨酰胺的htt蛋白物质的聚集；(6)在体内，减轻突变的htt蛋白在转基因elav＞Q93httexon1果蝇表型中的有害作用，以及减轻突变的htt蛋白在转基因R6/2小鼠模型中的有害作用。这些发现表明，葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的化合物可用于减轻淀粉样蛋白、htt和tau-相关的神经病理学。
因此，本发明提供了包含葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物的药物组合物，以及使用这样的药物组合物来治疗或预防神经退行性疾病的神经病理学特征的方法，所述神经病理学特征例如神经退化、细胞毒性、认知功能障碍或退化、运动机能退化。优选地，葡萄籽提取物的特征在于，其中没食子酰原花色素占原花色素的总重量的重量比低于约12％。
在本发明的内容中以及在每个术语使用的特定上下文中，本说明书所用术语一般具有它们在本领域的普通含义。某些术语在下文中定义，以提供描述本发明的组合物和方法的附加说明。
定义
术语“痴呆症”指与记忆和其他认知领域的整体认知能力下降相关的临床综合征。
术语“退行性疾病”指与传染病相反，一种受影响的组织或器官的功能或结构随着时间逐步退化的疾病。
术语“神经退行性疾病”指一种由于细胞死亡导致神经细胞丢失的疾病或病症。
术语“阿尔茨海默病”(或“老年性痴呆”)指与特定退行性脑病相关的智力退化，其特征在于老年斑、神经炎性缠结和进行性神经元丢失。
术语“帕金森病”是一种中央神经系统的慢性和进行性退化病症，通常运动机能和语言出现障碍。帕金森病属于一种称为运动障碍的疾病类型，其特征在于肌肉强直、颤抖、身体运动迟缓，以及在极端情况下，身体不能运动。
术语“亨廷顿病”指一种由于编码亨廷顿蛋白的三核苷酸重复延伸导致的遗传性神经疾病。亨廷顿病的症状包括身体运动异常和缺乏协调能力。
术语“tau蛋白病”指涉及tau蛋白(一个密切相关的细胞内微管相关蛋白家族)功能异常的一类神经退行性疾病。这些神经退行性疾病(tau蛋白病)包括，例如阿尔茨海默病，进行性核上性麻痹，皮质基底变性，嗜银颗粒病，皮克病以及家族性额颞痴呆症。
术语“β淀粉样蛋白”(Aβ)指由于β淀粉样蛋白前体蛋白(APP)切割产生的一种肽，它的积累和沉积在对象的脑中形成斑块。Aβ最常见的异构体为Aβ1-40(Aβ40)和Aβ1-42(Aβ42)。短语“Aβ的低聚体”指一种由化学键连接的带有一个以上Aβ单位的肽，或是由化学键和/或由物理作用力相连的大量的Aβ肽。术语“低聚化”指多个例如Aβ等较小化学或生物分子通过化学键和/或物理结合而结合或组装成为
术语“减少”指减少或降低化学或生物物质的量或浓度，或是减缓或逆转正在进行的化学或物理过程。
术语“积累”指在特定的区域或空间内例如肽等化学或生物物质的浓度或量上升。
术语“聚集”指多个较小化学或生物分子或其集合通过化学键和/或物理结合而结合或组装成一个较大的集合。
术语“沉积”指化学或生物物质粘附到生物表面，例如细胞膜或血管壁。
术语“多酚”或“多酚化合物”指一种特征在于每个分子存在一个以上酚基团的化合物。
术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”，或“有效量”指葡萄籽提取物或葡萄籽提取物中含有的化合物的量足以导致治疗应答。治疗应答可为用户(如临床医生)会将其识别为对治疗的有效应答的任何应答，例如通过评估症状和替代临床标记物。因此，治疗应答通常为疾病或病症的一种或多种症状的改善。
短语“药学可接受的”指生理可耐受的并且当给予人时通常不产生不良反应的分子实体和组合物。优选地，如本发明所用，术语“药学可接受的”指由联邦或州政府的监管机构批准的、或是美国药典或其他普遍认同的药典中列出的、可用于动物，并更为特定的可用于人。
短语“药学可接收的盐”指通过制成其酸性或碱性盐修饰的化合物衍生物。药学上可接受的盐包括例如胺等碱性残基的矿物盐或有机酸盐；和例如羧酸等酸性残基的碱性或有机盐。药学可接受的盐包括亲本化合物形成的传统无毒性盐或季铵盐，例如从无毒性的无机酸或有机酸。这种传统的无毒性盐包括来源于无机酸的盐，例如盐酸，氢溴酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸，硝酸等；以及由有机酸制备的盐，例如醋酸，丙酸，琥珀酸，甘醇酸，硬脂酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，棕榈酸，马来酸，羟基马来酸，苯乙酸，谷氨酸，苯甲酸，水杨酸，对氨基苯磺酸，2-乙酰氧基苯甲酸，富马酸，对甲基苯磺酸，甲磺酸，乙烷二磺酸，草酸，和羟乙基磺酸等。药学可接受的盐可以通过传统化学方法从包含碱性或酸性基团的亲本化合物合成。通常，这样的盐是通过这些化合物的游离酸或碱形式与化学当量的合适的碱或酸在水或有机溶剂或在两者的混合物中反应来制备的。
术语“运载体”或“药学运载体”指与化合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这样的药学运载体可为无菌液体，例如水和油。优选采用水或水性溶液、盐溶液以及水性右旋糖和甘油溶液作为运载体。合适的药学运载体在E.W.Martin的《雷明顿药典》第18版(“Remington’s Pharmaceutical Sciences”by E.W.Martin，18thEdition)或其他版本中有描述。
术语“抗氧化剂”指一系列能够抑制或中和对象体内有害自由基的化学物质。
术语“对象”包括会发生β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白低聚体、tau蛋白或其他蛋白的错误折叠、积累、聚集或沉积的生物活体。术语“哺乳动物”指通过乳腺分泌的乳汁来哺育幼体的高等脊椎动物的哺乳动物纲的生物体。术语“人”指智人(Homo Sapiens)种的成员。术语“患者”指接受本发明提供的组合物治疗的人对象。
术语“治疗”指给予对象本发明的组合物，用于减轻、减缓进程、延迟或逆转病情，和/或与神经退行性疾病相关的一种或多种症状，和/或蛋白的错误折叠、积累、聚集或沉积，所述蛋白包括但不限于β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白低聚体、tau蛋白、α-突触核蛋白等。
术语“预防”指在与β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白低聚体、tau蛋白或其他蛋白的错误折叠、积累、聚集或沉积相关的疾病或症状发生前，给予对象本发明的组合物，以避免疾病或症状的发生。
术语“降低对象中疾病或症状发生的风险”指对象发生疾病或症状的可能性低于同等对照个体的可能性，例如对象给予了本发明的药物组合物并且对照没有治疗或接受了安慰剂。
术语“约”或“大约”指相对于本领域的普通技术人员确定的特定值在一个可接受的误差范围内，其部分取决于该值是如何检测或确定的，即检测系统的局限性。例如，“约”可表示在本领域的每个测试中在3个或大于3个标准差范围内。任选地，“约”可表示在给定值的20％范围内，优选在10％范围内，更优选在5％范围内，或更优选在1％范围内。任选地，尤其是对于生物系统或过程，术语可表示在数值的一个数量级内，优选在5倍内，且更优选在2倍内。
药物组合物
葡萄籽提取物
本发明的一个方面涉及使用来源于葡萄籽提取物的药物组合物来治疗或预防与蛋白的错误折叠、积累、聚集和/或沉积相关的神经退行性疾病。如本发明所用，术语“葡萄籽提取物(GSE)”指从葡萄籽、皮或果渣提取的物质或一种或多种化合物。
葡萄籽提取物可以从各种来源获得。例如，普利芬尼公司(Polyphenolics，美国星座酒业有限公司(Constellation Wines U.S.，Inc)的一个分支)以商标MegaNatural
Figure BPA00001293415500141
销售一系列的葡萄籽提取物产品。商品化的MegaNatural
Figure BPA00001293415500142
产品的例子包括MegaNatural
Figure BPA00001293415500143
GSKE葡萄果渣提取物，MegaNatural
Figure BPA00001293415500144
-BP和MegaNatural
Figure BPA00001293415500145
-Gold。葡萄籽提取物也可以根据一些特殊的提取和/或纯化过程来制备。例如，葡萄籽提取物可以采用如美国专利第6,544,581号(Shrikhande等，‘581专利)或美国专利申请公报2007/0071871(Shrikhande等)中描述的方法来获得，其内容在此整体引用作为参考。
MegaNatural
Figure BPA00001293415500146
-AZ(或MNG-AZ)是实验性的且市场上没有销售，因为从多酚组分上去除了没食子酰基团，其具有可通过肠道黏膜被吸收的独特性质。在MNG-AZ的制造过程中，粗多酚提取物与酵母发酵物混合培养一段时间，使得没食子酸从没食子酰单体和原花色素低聚体上水解下来。提取物进一步处理成含有超过90％重量的多酚和超过3％重量的没食子酸的粉末形式(参见’581专利)。选择酵母培养物的单宁酶活力，使得没食子酸从葡萄籽单体和聚合物上释放出来。任选地，粗单宁酶可以通过酵母和霉菌的发酵过程来制备，并且可以加入到粗葡萄籽提取物中使没食子酸释放出来。所得的MNG-AZ的特征在于没食子酰原花色素占原花色素的总重量的重量比低于约12％。虽然没有联系到任何特定的理论，但相信去除没食子酸侧基团能显著提高MNG-AZ的生物利用度。
多酚，葡萄籽提取物中的一类重要的化合物，被认为是有效的抗氧化剂。原花色素，一种多酚亚类，是来源于儿茶素和表儿茶素基础单元及其各自的衍生物的多聚化合物(如表儿茶素被修饰加上了没食子酸的表儿茶素没食子酸酯)。葡萄籽提取物MNG-AZ的组分分析结果显示在图1中。典型的异源多聚原花色素的分子结构包含儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素及其衍生物(表没食子儿茶素和表儿茶素没食子酸酯)(图1A)。MNG-AZ的正相HPLC分析也表明存在单体和多聚单元的原花色素(图1B)。
含有表儿茶素没食子酸酯的原花色素可以通过微生物或酶转化来进行去没食子酰化(图1C)。去除没食子酸侧链是MNG-AZ与其它市售葡萄籽提取物质间的主要区别。与四种其它市售GSE制剂相比，如MNG-AZ中没食子酰原花色素(占总原花色素)的百分比所示，MNG-AZ包含极少或没有没食子酸侧链(图1E和1F)。在本发明中，MNG-AZ在动物疾病模型的与Aβ和tau蛋白相关的神经退行性疾病中表现出惊人的体内生物活性。
在本发明的一个特定实施方式中，药物组合物包含特定的葡萄籽提取物，称为MegaNatural-AZ。本发明的药物组合物也可包含来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物。一种或多种化合物可包括但不限于，一种或多种多酚，一种或多种原花色素，或其混合物。示例性的多酚包括但不限于单体儿茶素和表儿茶素基本单元。
在其他实施方式中，本发明的组合物还包含运载体。优选所述运载体用作相对于使用和应用方法而言合适的物质。例如，对于口服给药，本发明的合适药物运载体包括但不限于，乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯胶，木糖醇，赤藓醇，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟苯甲酯，羟苯丙酯，硬脂酸镁和矿物油。组合物还可包含填充剂，抗粘着剂，润滑剂，润湿剂，调味剂，乳化剂，防腐剂等等。
本发明的药物组合可配制成口服剂型，包括但不限于，粉末，片剂，胶囊，口腔分散片，软胶囊，水性药物，糖浆，酏剂和药囊。
任选地，药物组合物可以经皮给药。本发明的组合物可以直接施用到皮肤或是通过透皮装置间接给药。本发明的组合物可以配制成直接透皮剂型，例如凝胶、乳霜、洗剂、乳剂、油、药膏、分散剂、气雾剂，喷雾剂等等。本发明的组合物可以配制成间接透皮剂型，作为包括胶布、绷带、胶带、或其它封闭敷料等透皮装置的组分。另外，药物组合物可以经鼻给药，例如作为经鼻喷雾剂。用于通过皮肤或粘膜表面吸附的其他被动或主动透皮装置也包括在内。
用于本发明组合物透皮给药的合适的药物运载体可为适合于透皮给药的任何药学可接受的运载体材料。这样的运载体包括本领域已知的材料，例如液体、凝胶溶剂、液体稀释剂、增溶剂等等。合适的运载体是无毒的并且不与组合物的其他组分发生有害的相互作用。用于本发明的合适运载体的例子包括水、硅胶、液体糖、蜡、凡士林油。运载体还可包括稳定剂、佐剂、增渗剂或用于促进药物透皮递送的其他类型的添加剂。
在一些实施方式中，当应用时，本发明的化合物可以它们药学可接受的盐的形式使用，而且也可以单独使用或是与合适的其他药物活性化合物联合或组合使用。在特定实施方式中，本发明的组合物还可包含抗氧化剂和/或胆碱酯酶抑制剂。
治疗方法
本发明的药物组合物可以给予具有神经退行性疾病相关的风险因素或病症的对象。对象可为人，或低等哺乳动物，包括但不限于，猫、狗、大鼠、小鼠、绵羊、山羊、牛、猴、黑猩猩，及其转基因种类。药物组合物以治疗有效量给予对象，在这样的量和这样的时间是达到预期效果所必需的。本发明包括的神经退行性疾病通常特征在于对象的脑中一种或多种蛋白或肽的水平升高，包括它们的错误折叠、积累、聚集和/或沉积。这些疾病，包括但不限于，阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，亨廷顿病，额颞痴呆症，皮质基底豆状核退化症和/或tau蛋白病。tau蛋白病可为阿尔茨海默病，进行性核上性麻痹，皮质基底变性，嗜银颗粒病，皮克病以及家族性额颞痴呆症等等。
如本发明所用，本发明的治疗方法中攻击的一种或多种蛋白(或者可与“肽”互换使用)指由肽键连接的多个氨基酸单元构成的分子，其中分子与所述一种或多种神经退行性疾病相关。蛋白包括野生型、突变的、转基因的和合成的蛋白。例如，它们可包括但不限于，与特定的神经退行性疾病相关的特定蛋白。例如β淀粉样蛋白(如Aβ1-40，Aβ1-42)和/或神经原纤维缠结是阿尔茨海默病患者中的靶蛋白。另外，突变的htt蛋白是亨廷顿病患者中的靶蛋白。α-突触核蛋白是帕金森病患者中的靶蛋白，且tau蛋白是tau蛋白病患者中的靶标。
此外，根据本发明进行治疗的方法包括治疗对象，所述对象中正在发生与蛋白水平升高或错误折叠相关的疾病，但是对象还没有表现出有害症状。另外，本发明的治疗方法包括治疗已有疾病的症状，其中对象表现出外部症状。
本发明的组合物的剂量可以根据对象的体重和病情、组合物的剂型、给药的方式和时间而变化，并且可由本领域的技术人员来确定。可以根据在脑的特定区域中最大程度降低不需要的或错误折叠的蛋白浓度所需要的量，来确定化合物的最佳剂量。例如，剂量范围可为每天约100-1000毫克。优选地，剂量范围为每天约200-600毫克。组合物可以每月、每两周、每周、每天或每天几次以单剂量或分多个剂量给药。
实施例
下列实施例只用于说明本发明，而不应理解为以任何形式限制本发明的范围。
实施例1.葡萄籽提取物对于合成的Aβ的低聚体形成的影响的体外证据
本实施例提供了如本发明的一种实施方式所述的组合物对于减少Aβ低聚化的影响的体外证据。
材料与方法
体外Aβ1-40和Aβ1-42聚集测试。葡萄籽提取物产品MegaNatural
Figure BPA00001293415500171
-AZ从公司费罗利公司(马德拉，加利福尼亚州(Phenolics，(Madera，CA))获得。体外Aβ1-40和Aβ1-42聚集测试的Aβ1-40和Aβ1-42肽是从美国肽公司(森尼韦尔，加利福尼亚州)(American Peptide(Sunnyvale，CA))购得的。肽溶解在HFIP(西格玛公司，Sigma)中，室温干燥过夜，并且真空抽吸10分钟。肽在去离子水中溶解成1mg/ml，并且将MNG-AZ GSE原料在水中溶解成400μM。将Aβ1-40和Aβ1-42(100μg/ml)与不同浓度的MNG-AZ GSE按照体积比1∶1混合并且在37℃孵育3天。采用6E10抗体的蛋白免疫印迹分析来研究MNG-AZ对Aβ聚集的影响。
未修饰蛋白的光致交联(PICUP)测试。在存在或不存在50μM MNG-AZ GSE的10mM磷酸盐溶液(pH 7.4)下，新鲜分离的低分子量(LMW)Aβ1-42或Aβ1-40肽与1μl的1(x1)、2(x2)、5(x5)或10(x10)mM三(2，2’-联吡啶基)二氯化钌(II)(Ru(bpy))和1μl的20(x1)、40(x2)、100(x5)或200(x10)mM过硫酸铵(APS)混合。混合物照射1秒钟，然后立即用10μl含有5％β-巯基乙醇的Tricine样品缓冲液(英杰公司，加利福尼亚州(Invitrogen，CA))淬灭。然后反应物进行SDS-PAGE电泳，并且用银染显色(加利福尼亚州英杰公司的SilverXpress(Invitrogen，CA))。在相似的条件下交联谷胱甘肽巯基转移酶，并且用作对照肽。
结果与讨论
图2中显示了MNG-AZ抑制Aβ低聚化的作用。MNG-AZ以浓度依赖的形式抑制合成的Aβ1-42(2A)和Aβ1-40(2B)的低聚化，如在SDS-PAGE(图2A和2B中的第1-6道：0、0.2、1、5、25和100μM Aβ；CTR是没有孵育的样品)中所示。在PICUP反应处理后的Aβ1-42(图2C)和Aβ1-40(图2D)的SDS-PAGE结果中观察到相似的结果(图2C和2D中的第1和2道：分别为存在和不存在MNG-AZ时Aβ肽与1x Ru(Bpy)和APS的结果；第3和4道：分别为存在和不存在MNG-AZ时Aβ肽与2x Ru(Bpy)和APS的结果；CTR：未交联的Aβ1-42(2C)或Aβ1-40(2D)用作单体对照。
上述结果一致表明MNG-ZA能够在体外有效地抑制Aβ的低聚化。此外，MNG-AZ的抑制效果表现为浓度或剂量依赖的。这些结果表明MNG-AZ GSE能预防或治疗与Aβ的积累、聚集或沉积相关的疾病。
实施例2.评估TG2576小鼠的AD型神经病理学
本实施例显示了给予如本发明的一个实施方式所述的组合物对于转基因小鼠的Aβ神经病理学的体内效果。
材料与方法
Tg2576小鼠和MNG-AZ GSE治疗。成年雌性Tg2576小鼠(泰克尼有限公司，日耳曼城(Taconic，Germantown Inc.))分成2个不同的组：MNG-AZ GSE治疗组和水对照组。MNG-AZ GSE在它们的饮水中以浓度1.2g/L递送，使得最终摄入量为200毫克/公斤/天。这等于采用FDA的药物等价剂量跨物种转换标准得到的人1克/天的剂量，根据体表面积(人等价剂量(毫克/公斤)＝动物剂量(毫克/公斤)x(动物体重(公斤)/人体重(公斤)0.33)(http://www.fda.gov/cber/gdlns/dose.htm)。动物可以自由饮水和食用标准饲料。饮用溶液每3天更换一次。在研究过程中每周监测液体消耗和动物体重。在治疗5个月后，小鼠采用全身麻醉的氯胺酮和甲苯噻嗪(富道动物保健公司，道奇堡，爱荷华州(Fort Dodge Animal Health，Fort Dodge，Iowa))进行麻醉并且断颈处死。收取脑部并且对切。一个半球在4％多聚甲醛中固定24小时用于形态学研究。从对应的半球上切下海马体和新皮层，快速冷冻，在液氮中研磨并且存储在-80℃用于生化研究。
AD-型淀粉样蛋白神经病理学的评估。为了对脑中的Aβ肽进行定量评估，冷冻研磨的组织在5mol/L胍缓冲液中匀浆，并且1∶10稀释在含有0.05％(体积/体积)Tween
Figure BPA00001293415500191
-20和1mmol/L Pefabloc蛋白酶抑制剂(罗氏应用科学，印第安纳波利斯，印第安纳州(Roche Applied Science，Indianapolis，IN))的磷酸盐缓冲液中，在4℃离心20分钟。总Aβ1-40或Aβ1-42用夹心ELISA(BioSource，Camarillo，CA)进行定量。为了对Tg2576小鼠中的AD型淀粉样蛋白负担进行体视学评估，新鲜收取的脑半球浸没在4％多聚甲醛中固定过夜，并且沿冠状面用切片机切成名义厚度50μm的切片。从随机起始位置选择每第15个切片，并且用硫磺素S染色。所有的体视学分析采用蔡司Axiphot显微照相机进行，该显微照相机配有蔡司运动平台和MSP65平台控制器，高分辨率的蔡司ZVS-47E数码照相机和一个运行定制软件NeuroZoom的Macintosh G3电脑。淀粉样蛋白负担的评估采用卡瓦列利原则用小尺寸的网格(50X50μm)进行点计数；这种方法提供了对于淀粉样蛋白斑块所占的部分体积无偏差的评估-用新皮层或海马体体积的百分比表示。斑块体积的评估采用x40放大倍数下的系统随机抽样方法获得。
脑中可溶Aβ低聚体分析。可溶Aβ低聚体的水平采用斑点杂交测试和蛋白免疫印迹分析来测量。具体地说，通过将研磨成粉的皮层组织溶解在加有蛋白酶抑制剂混合物(罗氏应用科学，印第安纳波利斯，印第安纳州(Roche Applied Science，Indianapolis，IN))的PBS中，提取可溶淀粉样蛋白肽。在4℃78,500g离心1小时后，分析上清。5μg总蛋白点在硝酸纤维素膜上，用10％脱脂牛奶封闭，并且与抗体A11(英杰公司，加利福尼亚州(Invitrogen，CA))孵育，该抗体特异性的识别Aβ的低聚形式。在室温下孵育2小时后，膜与HRP偶联的羊抗兔抗体一起孵育，免疫反应信号用增强化学发光检测(强信号化学发光检测试剂盒，皮尔斯公司，罗克福德，伊利诺斯州(SuperSignal Chemiluminescent Detection Kit，Pierce，Rockford，IL))来显色，并且通过光密度定量(Quantity One，伯乐公司(Bio-Rad))。相同的样品也用于蛋白免疫印迹分析。75μg总蛋白用10-20％Tris-Tricine凝胶分离，并且转到硝酸纤维素膜上，用10％脱脂奶粉封闭1小时。膜与6E10(西格纳公司(Signet))或A11孵育。免疫反应信号用增强化学发光检测来显色，并且通过光密度定量。
APP加工和α-、β-、γ-分泌酶活力。用C8抗体(针对人APP胞内结构域的AA676-696产生)的蛋白免疫印迹分析来检测全-APP的表达。如前所述(Wang等，FASEB J 2005；19：659-661)，进行免疫沉淀来检测sAPP-α、sAPP-β。α-、β-和γ-分泌酶活力采用市售试剂盒(安迪生物公司(R&D Systems))进行评估。脑啡肽酶和胰岛素降解酶的表达采用市售抗体用蛋白免疫印迹测试进行分析。
统计学分析。这些实施例中的所有数据和值用平均值和平均值的标准差(SEM)表示。采用双因素重复测量的方差分析或学生双尾t检验来分析平均值之间的差异。在所有分析中，零假设为在0.05水平被弃去。采用Prism Stat程序(GraphPad软件有限公司，圣地亚哥，加州(GraphPad Software，Inc.，San Diego CA))进行所有的统计学分析。
结果与讨论
图7中显示了MNG-AZ GSE对于Tg2576小鼠的神经病理学作用。图7A和7B显示了在治疗5个月的Tg2576小鼠中MNG-AZ GSE对于体重(7A)和液体消耗(7B)的影响。图7C呈现了采用特异性针对HMW低聚Aβ肽的抗体在斑点杂交分析中对可溶性胞外HMW-Aβ肽含量的评估。图7D描述了Tg2576小鼠脑中可溶性胞外HMW低聚Aβ肽(抗体A11)和单体Aβ肽(抗体6E10)的蛋白免疫印迹分析。图7E显示了对于MNG-AZ GSE治疗和对照小鼠脑中的Aβ1-42和Aβ1-40肽浓度评估。图7F显示了在MNG-AZ GSE治疗和对照小鼠中的大脑皮层和海马体形成Aβ-淀粉样蛋白斑块负担的体视学评估，用硫磺素S阳性体积占区域体积的百分比来表示。图7F显示了在未治疗对照(上图)和MNG-AZ治疗Tg2576小鼠(下图)的新皮层(CTX)和海马体结构(Hippo)中硫磺素S阳性Aβ淀粉样蛋白斑块神经病理学的代表性照片。值用组平均值±SEM表示，n＝每组5-6个小鼠。学生双尾t检验分析的*p＜0.05，**p＜0.01。图7G显示了研究MegaNatural
Figure BPA00001293415500201
-Gold的体内功效的平行研究中评估脑中的Aβ1-42和Aβ1-40肽浓度。
这些结果表明MNG-AZ GSE不会导致可检测到的副作用，包括体重(图7A)或水消耗(图7B)的变化。在治疗5个月后的Tg2576小鼠的神经病理学显示内源Aβ肽转化成HMW Aβ的低聚化降低约2-3倍，如采用特异性针对Aβ低聚体的抗体的免疫斑点杂交测试(p＜0.05，图7C)和采用A11-抗体的蛋白免疫印迹(p＜0.01，图7D)来评估所示。发现Tg2576小鼠脑中HMW A11-免疫反应的低聚Aβ物质的减少，与单体Aβ肽的相应升高(p＜0.05，图7D)相一致，表明MNG-AZ GSE通过预防Aβ低聚化对AD产生有益影响。
图7G显示了在平行研究中，用另一种叫做MegaNatural
Figure BPA00001293415500211
-Gold的市售GSE制剂对Tg2576小鼠进行治疗，与对照Tg2576小鼠相比，没有调控Tg2576小鼠海马结构内Aβ1-42和Aβ1-40肽的积累。图7G中的结果表明，MNG-AZ在现有的GSE制剂中唯一具有调控脑中淀粉样蛋白型神经退化的功效，因为它的没食子酰原花色素含量大大降低。
最近的研究表明，预防脑中Aβ低聚化形成HMW物质可使得脑中总Aβ肽以及最终淀粉样蛋白神经炎性斑块补偿性降低，可能是相对于低聚Aβ物质优先从脑中清除单体Aβ肽的结果(Morelli等，Biochem 2005：38：129-145)。与这一假设相一致，本实施例的结果表明，与年龄和性别匹配的水治疗对照小鼠相比，除了降低HMW低聚Aβ物质的水平(图7C，7D)，长期MNG-AZ GSE治疗也会显著降低Aβ1- 42(图7E，左图)和Aβ1-40肽(图7E，右图)以及淀粉样蛋白神经斑块负担(图7F)的量。
此外，评估了MNG-AZ GSE对于淀粉样蛋白神经病理学的有益效果的可选潜在机制。发现全-APP的量没有发生可检测的变化(图8A)，且α-、β-和γ-分泌酶的酶活力或可溶性APPα和可溶性APPβ量也没有任何变化(图8B、8C)。而且，观测到脑啡肽酶(图8D)或胰岛素降解酶(图8E)的量没有可检测的变化，这是负责Aβ降解的主要蛋白水解酶。最后，发现在外周血清中Aβ1-42和Aβ1-40肽的水平没有可检侧的变化(图8F)。
这些观察表明，如体外所发现的，MNG-AZ GSE在体内主要通过预防Aβ低聚化形成可溶的HMW物质来发挥有益作用的。
实施例3Tg2576小鼠中AD型认知功能评估
该实施例显示了给予如本发明的一些实施方式所述的组合物对于Tg2576转基因小鼠的认知功能的影响。
材料和方法
Tg2576小鼠用MNG-AZ GSE治疗5个月，并且在11月龄进行认知功能评估。如前所述(Morris，J Neurosci Methods 1984；11：47-60)，用莫里斯水迷宫行为测试来评估空间学习记忆。空间记忆是通过记录动物从水中逃到浸没的逃生平台的等待时间与学习期内学习尝试的关系来评估的。在学习期24小时后，通过移走逃生平台而没有改变视觉提示的空间觅向能力测试对小鼠进行测试。在具有最小刺激的环境(如噪音、移动、或光或温度的变化)下，在光循环的最后4小时白天部分，进行行为分析。
结果与讨论
图9显示了用MNG-AZ治疗的Tg2576小鼠中认知功能退化减轻，这与胞外HMW低聚Aβ的降低一致。图9A和9B显示了如莫里斯水迷宫测试中所测定的，MNG-AZ对Tg2576小鼠中Aβ相关的空间记忆的影响。图9A描述了等待时间评分(代表从水中逃到平台上花的时间)与治疗时间的关系。图9B显示了空间觅向能力测试中Tg2576小鼠花在目标象限上时间的百分比(计算为花在目标象限区域的时间与花在水池其他区域的时间的比例)。图9C呈现了采用特异性针对HMW低聚Aβ肽的抗体在斑点杂交分析中评估Tg2576小鼠脑中可溶胞外HMW可溶的Aβ含量。图9C中显示了HMW可溶Aβ含量的代表性斑点杂交分析。值代表组平均值±SEM，n＝每组7-9个小鼠；在图9B中，***p＜0.0001；在图9C中，*p＜0.01，采用学生双尾t检验。
11月龄的Tg2576小鼠表现出明显的空间参照记忆功能障碍，表现为在莫里斯水迷宫测试中，他们不能在学习测试中学会使用空间参照线索来定位隐藏的逃生平台(图9A)。与此相反，用MNG-AZ GSE治疗的Tg2576小鼠在空间记忆行为功能测试上明显表现得更好，并且能够学会使用空间参照线索来定位逃生平台，表现为随着学习测试的进行，逃生等待时间显著减少(双因素重复测量的方差分析；GSPE相对于对照组：F1，11＝4.90；GSPE治疗的p＝0.049，F7，77＝4.25；时间的p＝0.0005且F7，77＝1.63；相互作用的p＝0.140)(图9A)。在Tg2576小鼠中MNG-AZ诱导的认知功能障碍减轻被空间觅向测试中的空间记忆保留分析证实，表现为MNG-AZ治疗的小鼠在目标象限区域中所花的时间要显著多于用水治疗的对照小鼠(图9B)。这种认识功能改善，与MNG-AZ治疗的Tg2576小鼠比对照小鼠的脑中HMW低聚Aβ物质的显著降低相一致(图5C)。
在对照研究中，MNG-AZ GSE治疗没有影响品系、年龄和性别匹配的野生型小鼠的认知功能(图10A和10B)。上述结果表明通过减弱脑中的AD型Aβ介导的应答，MNG-AZ GSE选择性地有助于Tg2576小鼠中的空间记忆参照缺陷。
实施例4在体外MNG-AZ对于tau蛋白聚集的影响
本实施例显示了如本发明的一个实施方式所述的组合物对于tau肽聚集、解离预先形成的tau聚集物、以及从AD脑标本中获得的天然tau纤维的稳定性的影响。
材料与方法
评估MNG-AZ在体外抗tau聚集的生物活力。6氨基酸的N-乙酰化肽(Ac-306VQIVYK311)tau肽，对应于tau的306-311残基，是购买获得的。这个合成的tau肽是在tau蛋白的微管结合区发现的短肽片段。证据表明这种短肽片段是tau多聚化所必需的(Goux等，J.Biol.Chem.2004；279：26868-26875)。在体外生理观察中发现在盐存在下短Ac-306VQIVYK311肽自发聚集成纤丝结构，也支持了这一观点(Goux等，2004，见上)。如Goux等，2004，见上文中所述，Ac-306VQIVYK311肽的低聚化是非常重要的。简要地说，合成的tau肽溶解在20mM MOPS，pH 7.2中。Tau肽的多聚化在75μl含有2.2μM肽和10μM硫磺素S(ThS)的20mM MOPS(pH 7.2)溶液中进行。反应通过加入盐到终浓度为0.15M来起始。在存在或不存在不同浓度的MNG-AZ下评估tau肽聚集的动力学1小时，通过跟踪ThS结合到聚集的肽物质上后ThS荧光升高；在436nm诱导荧光激发并且在470nm检测荧光发射。
此外，PICUP、圆二色谱(CD)和电子显微镜方法也用于研究MNG-AZ对于形成tau肽聚集物所需的蛋白-蛋白相互作用的影响。
对于PICUP测试，在存在或不存在等摩尔浓度(25μM)MNG-AZ，的情况下，交联25μM tau肽，并且多体的tau肽用SDS-PAGE重新分开，并且用银染显色。
对于CD光谱，在10mM磷酸盐，pH 7.4存在下，tau肽在37℃孵育1-3天，并且在孵育开始时(第0天)以及后面三天的每一天获取CD光谱。
对于电子显微镜，在存在或不存在与tau肽的摩尔比为1∶1的GSE下，tau肽在10mM磷酸钠，pH 7.4中37℃孵育3天。孵育后，溶液16,000Xg离心5分钟，然后用尺寸排阻柱来分离200μl上清液。通过在254nm的紫外吸收在洗脱～12分钟时检测并且回收Tau纤维。
评估MNG-AZ在体外解离预先形成的tau聚集物的能力。在不存在MNG-AZGSE时，合成的Ac-306VQIVYK311tau肽聚集。在形成tau聚集物后，向反应中加入不同浓度的MNG-AZ，并且通过跟踪ThS荧光来监测随着GSE加入tau聚集物量的变化。
评估MNG-AZ破坏AD脑样本中获得的天然tau纤维稳定性的能力。PHF是从AD患者死后的脑标本中分离和纯化的，并且一些PHF样品使用MNG-AZ(100μM)处理5秒或1小时。这些结果是用电子显微镜观察到的(日立H700，Hitachi)。
评估MNG-AZ GSE对于tau纤丝的胰酶消化的影响。PHF是从AD脑样本中分离出来的。一些PHF样品用100μM MNG-AZ处理10分钟。一些PHF样品(无论是否预先用MNG-AZ处理)还与1μg胰酶孵育10分钟。结果是用‘电子显微镜观察到的(日立H700，Hitachi)。
结果与讨论
MNG-AZ抑制tau的聚集。图11中显示了MNG-AZ GSE抑制tau聚集的结果(注意在图11中MNG-AZ表示为MegN)。在盐存在下，合成的Ac-306VQIVYK311tau肽容易随时间形成聚集物。表现为Ths荧光随着反应时间而升高(图11A，其中聚集的tau的积累与时间的关系用ThS荧光进行评估；GSE浓度0.22μM、2.2μM和22μM，分别对应于GSE与tau肽的摩尔比为1∶10、1∶1和10∶1。
加入0.22-22μM的MegaNatural-AZ GSE以剂量依赖的方式显著干预了tau肽的聚集(单向方差分析，p＜0.0001)；在缺乏GSE时，计算的平均最大荧光发射为122.9±1.3单位，与存在0.22、2.2和22μM MegaNatural
Figure BPA00001293415500242
-AZ GSE下的计算平均荧光发射分别为114.2±1.1、109.6±0.6和100.6±0.3单位相比较(如图11B中所示，其中tau蛋白聚集物的最大积累计算为6-10分钟的平均荧光单位)。此外，每次MNG-AZ GSE量的逐步升高导致ThS荧光的显著增幅下降(Tukey事后配对分析，非MNG-AZ对比0.22μM MNG-AZ、0.22对比2.2μM MNG-AZ，以及2.2对比22μM MNG-AZ，p＜0.001)。有趣地是，在低量的0.22μM MNG-AZ GSE下，可以检测到tau肽聚集物的积累减少，其对应于GSE与tau肽的摩尔比为1∶10。在22μMGSE下，完全抑制Tau肽聚集，其对应于GSE与tau肽的摩尔比过量为10∶1(图11A和11B)。
在存在MNG-AZ时tau聚集物显著减少，如PICUP测试结果所示(图16，其中试剂的浓度如下。对照：没有Ru(Bpy)且没有APS；第1、2道：1μl 1mM Ru(Bpy)和1μl 20mM APS；第3、4道：2μl 1mM Ru(Bpy)和2μl 20mM APS；第5、6道：3μl 1mM Ru(Bpy)和3μl 20mM APS；第7、8道：4μl 1mM Ru(Bpy)和4μl 20mM APS)。这表明MNG-AZ可抑制tau肽聚集，部分通过干预tau肽自我连接的起始阶段。
如圆二色谱结果(图17A和17B)所示，在tau肽的孵育过程(1-3天)中，tau肽构象也表明MNG-AZ影响了tau肽的组装。在缺乏GSE时，在孵育2-3天后随机结合的tau肽逐渐转化成有序的β-折叠异构体，如集中在～198nm的光谱部分的幅度升高(图17A)所示。相反地，在GSE与tau肽摩尔比为1∶1时，tau肽与GSE共同孵育防止了tau肽转化成为有序的二级结构(图17B)。
如电子显微镜研究所得，在缺乏和存在MNG-AZ时，tau肽异构体的形态表现为tau肽自发聚集成螺旋原纤维(图18A)。相反地，GSE的存在完全抑制了tau肽原纤维的形成(图17B)。
总的来说，上述结果表明MNG-AZ干预了tau蛋白聚集形成低聚PHF。
MNG-AZ促进了预先形成的tau聚集物的解离。MNG-AZ能够解离预先形成的Ac-306VQIVYK311tau肽聚集物。特别是，加入1.1μM MNG-AZ，对应于MNG-AZ与tau肽摩尔比为1∶1，能够降低预先形成的tau肽聚集物的量，表现为ThS阳性tau聚集物的降低量升高与时间的关系(图12A作出了在不同MNG-AZ浓度下(0.55-4.4μM)，tau聚集物的ThS荧光的量的图)。如同预期，采用较高浓度的MNG-AZ(2.2μM和4.4μM MNG-AZ)的平行研究也促进了预先形成的tau肽聚集物的解离。在下面的图12A和12B中，MNG-AZ标注为MegN。通过用ThS荧光发射的线性回归分析来计算在不同浓度的MNG-AZ GSE浓度下tau聚集物的解离速度，研究MNG-AZ对预先形成的tau聚集物解离的剂量依赖功效(图12B)。加入浓度从1.1增加到4.4μM的MNG-AZ表现为以剂量依赖的方式促进预先形成的tau肽聚集物的解离。换而言之，聚集的tau肽的解离速度与MNG-AZ GSE的浓度直接相关(皮尔逊相关系数R＝0.96654，p＜0.05).
MNG-AZ影响了tau纤维的稳定性。图19显示了用电子显微镜观察到的MNG-AZ对于tau纤维稳定性的影响。图19A显示了来自AD的PHF，其表现为平均宽度为18.9+3.4nm且平均螺旋扭矩为81.3+10.8nm的典型的有组织的纤维结构，并且用免疫金标记，采用PHF1抗体，定位接近PHF核心的磷酸化丝氨酸396/404表位。有趣地是，分离的PHF与GSE孵育，随着接触GSE的持续时间增加，诱导了PHF逐步展开(图19B-19D)；与GSE孵育1小时导致纤维宽度增加67％(达到31.6+3.8nm)而不影响平均螺旋扭矩(GSE-处理的PHF的平均宽度和螺旋扭矩分别为31.6+3.8和77.4+10.8nm)(图19C，19D)。而且，发现GSE处理掩盖了分离的tau纤维对于PHF1抗体的免疫反应性(图19B和19C，与图19A相比)。
发现用GSE处理分离的tau纤维，也能够促进tau纤维的胰酶消化(图20)。从AD脑中分离的PHF在有(图20C和20D)或没有(图20A，20B)1μg/ml胰酶的条件下孵育10分钟。图20B和20D中的样品也用GSE预处理(100μM GSE，1小时)。在用胰酶处理后，PHF保持了他们的纤维样外观(参见图20C中的插图)。在胰酶消化前用GSE预处理，使得PHF解离成对AH-1抗tau抗体有免疫反应性的无定形的tau片段(参见图20D中的箭头和插图)。这些结果表明GSE介导的对tau纤丝构象的调控可以促进细胞蛋白酶对tau的降解。
总的来说，MNG-AZ GSE抑制合成的tau肽聚集成纤丝，并且使预先形成的tau聚集物解离。这表明MNG-AZ与tau的相互作用可以减少tau聚集物沉积的聚集，这是多种tau相关的神经退行性疾病的一个关键神经病理学特征。而且，MNG-AZGSE也可通过干预神经毒性的tau原纤维的形成和/或稳定性，来缓和tau介导的表型。因此，上述结果提供了强有力的证据表明MNG-AZ或它的组成化合物可以用作预防性手段来减少tau蛋白病的发生，或是作为治疗方法来治疗tau相关的神经退行性疾病。
实施例5葡萄籽提取物对于tau和htt肽的多聚谷氨酰胺延伸形式的体内效果
采用诱导型Gal4/UAS系统(Brand，等Development，1993；118：401-415)的转基因过表达疾病相关聚集倾向的蛋白的果蝇模型，已经成功地通过过表达R406W突变的tau建立了tau蛋白病模型和过表达Q93httexon1建立了亨廷顿病模型(参见如Sang等，NeuroRx.2005；2：438-446.；Berger等，Hum Mol Genet 2006；15：433-442)。特别是，在形成眼的细胞中过表达R406W(ey＞R406W)，导致眼的严重减少或完全缺失；形成的眼表现出形态异常。而且，在含有UAS-Q93httexon1的转基因品系中以泛神经的方式表达Gal4(elav-Gal4)，导致成年时发生神经退化并且寿命缩短。
本实施例显示了葡萄籽提取物对于带有突变tau(R406W)或多聚谷氨酰胺延伸形式的htt(Q93httexon1)的果蝇表型具有有益的体内效果，所述果蝇模型分别有某些形式的tau蛋白病和亨廷顿病。
材料与方法
ey＞R406W果蝇的眼表型检测。ey＞R406W产卵并且用对照食物(即食苍蝇培养配方4-24蓝色)或补充有2.8μg/ml MNG-AZ GSE(或GSPE，图13和14中)的食物进行饲养。在显微镜下观察果蝇的眼睛。
elav＞httQ3果蝇的寿命监测。过表达Q93httexon1的雄性果蝇以泛神经的方式表达elav-Gal4(elav＞Q93httexon1)，在羽化后1天内收集，并且每管10个放置，加入对照食物或补充有2.8μg/ml MNG-AZ GSE的食物。每天计数存活的果蝇，并且每隔几天转移到新管仲。
结果与讨论
GSE抑制果蝇眼中的R406W tau过表达。在眼睛发育早期R406W的过表达导致小眼或无眼(图13A)，但是GSE治疗抑制了眼睛尺寸的减小(图13B)(显示了雄性的眼睛)。ey＞R406W表型的范围在试验和试验之间有差异，所以试验单独进行分析。在一个代表性实验中，在羽化后3天内收集对于雄性眼睛的视觉评分(0＝无眼，4＝几乎正常眼)(图13C)。在同一试验中，一旦接受GSE治疗(右)，缺失眼睛的数量下降(图13D)。
GSE治疗延长了elav＞httQ3果蝇的寿命。发现GSE治疗的elav＞Q93httexonl果蝇的特征在于，与未治疗的对照相比，整体寿命显著延长(图14)。平均而言，对照食物组在第20天有50％的elav＞Q93httexon1雄性果蝇死亡，相比之下，GSE组中只有20％死亡。
上述结果表明，GSE治疗在体内抑制了两种不同果蝇模型中涉及蛋白聚集的神经退行性疾病。这些发现表明GSE对于预防和/或治疗蛋白聚集倾向的神经退行性疾病具有治疗价值。
实施例6葡萄籽提取物对于Aβ自我组装和细胞毒性的影响
本实施例提供了如本发明的一个实施方式所述的组合物对于降低Aβ的自我组装和细胞毒性的影响的证据。
材料与方法
化学品和试剂。化学品从西格玛奥德里奇公司(圣路易斯，密苏里州)(Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO))获得，并且为可以获得的最高纯度。Medysin#1(“Medl”)购自奥地利格拉茨的极光精细化工有限公司(Aurora Fine Chemicals Ltd.，Graz，Austria)。MegaNatural-AZ(MNG-AZ)购自普利芬尼公司(马德拉，加利福尼亚州，Polyphenolics(Madera，CA))。(当提到它们与Aβ的混合物时，有时候MNG-AZ和Med1称为“化合物”)。水是用Milli-Q系统双蒸且去离子的(密理博公司，贝德福德，马萨诸塞州)(Millipore Corp.，Bedford，MA)。
肽和蛋白。Aβ肽是如前所述进行合成、纯化和鉴定的(Walsh等，J Biol Chem1997；272：22364-22372)。简要地说，合成在自动化肽合成仪(型号433A，应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州(Applied Biosystems，Foster City，CA))上采用基于9-芴甲氧羰酰的方法在预先装载的王树脂上进行。肽采用反相高效液相层析(RP-HPLC)进行纯化。针对每一个肽，定量氨基酸分析和质谱分别产生预期的组成和分子量。纯化的肽以冷冻干粉的形式储存在-20℃。谷胱甘肽巯基转移酶(GST；西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))的储液是通过将冷冻干粉在60mM NaOH中溶解成250μM溶液配成的。在使用前，等分试样在10mM磷酸钠pH 7.4.中稀释10倍。
配制Aβ的储液。不含聚集物的Aβ储夜是采用尺寸排阻层析(SEC)来制备的。名义上的单体馏分被称为低分子量(LMW)Aβ，因为在实验的肽浓度下，该馏分包含快速平衡的单体和低分子量低聚体的混合物。为了制备Aβ，200μl 2mg/ml(名义浓度)的肽二甲亚砜溶液在超声水浴中超声1分钟(必能信超声公司，丹伯里，(Branson Ultrasonics，Danbury，CT))，然后在16,000×g离心10分钟。所得的上清在Superdex 75HR柱上用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4以流速0.5ml/分钟进行分离。在Aβ峰的中部收集50秒，并且立即用于所有实验。10μl等分试样用于氨基酸分析，来定量确定每一个制剂中的肽浓度。通常Aβ1-40和Aβ1-42的浓度分别为30-40μM和10-20μM。
Aβ孵育。Aβ样品如上所述进行制备，然后将0.5ml等分试样放入1ml微量离心管中。测试化合物在乙醇中溶解到终浓度为2.5mM，然后用10mM磷酸盐溶液pH 7.4稀释，以产生10和50μM的浓度。然后将0.5ml每种化合物加入到独立管的Aβ中，产生肽终浓度为～20μM(Aβ1-40)和～10μM(Aβ1-42)且抑制剂终浓度为5和25μM。因此，在化合物浓度较低时化合物∶肽的比例为～1∶4(Aβ1-40)和～1∶2(Aβ1-42)，且在化合物浓度较高时为5∶4(Aβ1-40)和5∶2(Aβ1-42)。只有肽的对照管接受0.5ml缓冲液。管子在37℃静置孵育0-7天。
化学交联和低聚体的频率分布。在制备后，样品立即采用PICUP技术进行交联。简单地说，向18μl蛋白溶液中加入1μl 1mM Ru(bpy)和1μl 20mM过硫酸铵(APS)。Aβ1-40和Aβ1-42的蛋白∶Ru(bpy)∶APS的最终摩尔比分别为0.29∶1∶20和0.16∶1∶20。混合物用可见光照射1秒钟，然后反应用10μl含有5％巯基乙醇的Tricine样品缓冲液(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Invitrogen，Carlsbad，CA))淬灭。单体和低聚体的频率分布采用SDS-PAGE和银染来确定。简单地说，20μl每种交联的样品采用10-20％梯度tricine凝胶电泳，并且用银染显色(SilverXpress，英杰公司Invitrogen)。在每个实验中未交联的样品用作对照。为了得到强度分布谱和计算每种低聚体类型的相对量，进行光密度分析，并且用One-Dscan软件(v.2.2.2；BD生命科学生物成像公司，罗克韦尔，马里兰州(BD Biosciences Bioimaging，Rockville，MD))来确定基线校正值的峰面积。在一些实验中，相对于肽，提高Ru(bpy)和APS的摩尔量，系数为2，5，10和20。
CD光谱。在样品刚制备后或孵育2、3、6、7天后获取Aβ溶液的CD光谱。CD检测通过从反应混合物中取出200μL等分试样，将等分试样加到1mm光径长度的CD比色皿(豪玛公司，森林小丘，纽约(Hellma，Forest Hills，NY))中，并用J-810分光偏振仪(JASCO公司，东京，日本)来获取光谱。在插入分光光度计前，CD比色皿保存在冰上。在温度平衡后，在22℃从～190-260nm 0.2nm分辨率以扫描速度为100nm/分钟记录CD光谱。进行10次扫描，并且针对每个样品对数据进行平均。根据制造商的说明，通过平滑和减去缓冲液光谱对原始数据进行处理。
硫磺素T(ThT)结合测试。10μL样品加到190μL溶解在10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的ThT中，混合物用漩涡震荡器短暂震荡。采用日立F-4500荧光光度计以10秒间隔三次测定荧光。激发和发射波长分别为450和482nm。将三次读数平均并且减去ThT空白的荧光，来确定样品的荧光。
电子显微镜(EM)。每种样品的10μl等分试样点到辉光放电的、碳涂层的Formvar网格上(电子显微镜科学公司，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA))并且孵育20分钟。然后液滴用等体积的2.5％(体积/体积)戊二醛水溶液置换掉，并且再孵育5分钟。最后，肽用8μl 1％(体积/体积)(0.2μm)过滤的醋酸铀水溶液(电子显微镜科学公司，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA))染色。吸走溶液并且空气干燥网格。样品用JEOL CX100透射电子显微镜来观测。
3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)代谢。大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞培养在75cm2细胞培养瓶中(#430641，康宁有限公司，康宁，纽约州(Corning Inc.，Corning，NY))，采用含有15％(体积/体积)马血清、2.5％(体积/体积)胎牛血清、100单位/毫升青霉素、0.1mg/ml链霉素、和25μg/ml两性霉素B的F-12K培养基，37℃且空气中含有5％(体积/体积)CO2。为了准备测试用的细胞，去掉培养基，细胞用含有0.5％(体积/体积)胎牛血清、100单位/毫升青霉素、0.1mg/ml链霉素、和25μg/ml两性霉素B的F-12K培养基轻轻洗一次。然后细胞悬液制备通过加入后一种培养基，但含有100微克/毫升的神经生长因子(英杰公司，加利福尼亚州(Invitrogen，CA))，接着振荡细胞培养瓶。采用台盼蓝细胞计数后，细胞以30,000细胞/孔(90μl总体积/孔)的密度铺到96孔测试板中(Costar#3610，康宁有限公司，康宁，纽约州(Corning Inc.，Corning，NY))。允许神经生长因子诱导的细胞分化进行48小时，在这个时间点进行毒性测试。
用两种方式来评估Aβ细胞毒性。肽预先与0或25μM MNG-AZ的10mM磷酸钠溶液pH 7.4，预先在37℃孵育0、2、3或7天，再向孔中加入10μl肽溶液。任选地，Aβ如上所述进行孵育，但是没有MNG-AZ。在这种情况下，在加入到细胞中前，肽溶液即时与0或25μM MNG-AZ混合。细胞用终浓度为只含0或～2μM Aβ或是包含2.5μM MNG-AZ的MNG-AZ处理的Aβ处理24小时。对于Aβ1-40和Aβ1- 42肽，肽/化合物分别比例为0.72和0.39。在实践中，对于每个可选实验方式，“零时刻”样品是等价的，因为所有组分都在同样的时刻与细胞混合。
为了确定毒性，向每孔中加入15μl MTT溶液(普洛梅格公司，麦迪逊，威斯康星州(Promega，Madison，WI))并且板子在CO2培养箱中再放3.5小时。然后通过加入100μl增溶溶液(普洛梅格公司，麦迪逊，威斯康星州(Promega，Madison，WI))裂解细胞，接着过夜孵育。采用佛蒙特州宝特仪器公司的宝特Synergy HT酶标仪(BioTek Synergy HT microplate reader(Bio-Tek Instruments，Winooski，Vermont))，通过检测570nm的吸光度来评估MTT减少(对630nm的背景吸光度进行校正)。对照包括含有磷酸钠的培养基(“阴性”)、纤维(“阳性”)和1μM星形孢菌素(“最大阳性”)。纤维状Aβ1-40和Aβ1-42加入到细胞中，终浓度分别为10μM和5μM。同样的纤维制剂用于所有的实验并且用于控制批次之间的变化率。为了能够进行批次之间的比较，首先确定每个实验内的毒性。每个处理组做6个重复样品，并且将来自三个独立实验的数据结合起来用平均值±标准差表示。
毒性百分比T＝((AAβ-A培养基)/(A星形孢菌素-A培养基))×100；
其中AAβ、A培养基、A星形孢菌素为来自含有Aβ的样品、只有培养基、或只有星形孢菌素的吸光度。
统计学分析。单向分数方差分析和多重比较检验用于进行统计学分析，采用GraphPad Prism(版本4.0a，GraphPad软件有限公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，San Diego，CA)的统计学程序进行。p-值＜0.05被认为有显著性差异。
结果与讨论
Aβ低聚化。在没有PICUP交联时，只观察到Aβ1-40单体(图15A，第2道)和Aβ1-42单体和三聚体(图15B，第2道)。Aβ1-42三聚体条带已经被证明是一种SDS-诱导的人工产物。在交联后，Aβ1-40以单体和2-4数量级的低聚体的混合物存在(图15A，第3道)，而Aβ1-42包含单体和2-6数量级的低聚体(图15B，第3道)。
当MNG-AZ与Aβ1-40按照化合物∶肽比例为～5∶4混合时，低聚化几乎完全被抑制(图15A，第6道)。三聚体条带刚好能被看见并且二聚体的强度也是最低的。提高化合物∶肽的比例10倍，产生了相似程度的抑制(图15A，第7道)。MNG-AZ对于Aβ1-42低聚化的影响同样显著(图15B)。在化合物∶肽比例为～5∶2，MNG-AZ产生的低聚体分布几乎与未处理的Aβ1-42相同，与基本完全抑制低聚化一致(比较图15的第6道(处理的)和第2道(未处理的))。提高化合物∶肽的比例10倍，产生了相似程度的抑制(图15A，第7道)。这些数据表明，基本完全抑制Aβ低聚化可以在化合物∶肽比例为～5∶2或更低时实现。
采用一种结构与MNG不同的无活性的多环分子Med1作为化合物对照。如图15A和15B所示，第4道，在Med1存在下Aβ1-40和Aβ1-42产生的低聚体分布与只有每种肽的低聚体分布是无法区分的。提高化合物∶肽比例10倍表现出相似的低聚体分布(图15A和15B，第5道)。
以前认为，强力抑制Aβ低聚化可能是对抑制剂对PICUP反应本身的影响造成的。为了评估这种可能性，交联反应也可在谷胱甘肽巯基转移酶(GST；～26kDa)上进行，一种交联反应的阳性对照。没有交联的GST表现为一条强的单体条带和一条相对弱的二聚体条带(图15C，第2道)。交联产生了一条强的二聚体条带，除了因为GST正常表现为一个同源二聚体，以及更高阶的交联物类型。在测试的两种化合物∶肽比例的Med1存在下，分别为1∶1(图15C，第4道)或10∶1(第15C，第5道)，GST交联没有变化。在MNG-AZ为1∶1比例时，也观察到了质量上相似的分布(图15C，第6道)。只在10∶1的比例，观察到了MNG-AZ对GST低聚化的显著影响，这比在用Aβ的实验中所用的最高浓度要高4-8倍。这种效果可能是由于直接的化合物：GST效果或是化学效应。然而，化学效应不能解释对Aβ1-40和Aβ1-42低聚化的强烈抑制，以及缺乏对GST低聚化的强力抑制，参见图15中的第6道(在其他测试中没有抑制活力)。这提供了强有力的证据，证明MNG-AZ强力抑制Aβ1-40和Aβ1-42的低聚化。
圆二色光谱。用CD光谱研究MNG-AZ对于Aβ及其低聚体的二级结构的影响(图3)。当单独孵育时，Aβ1-40和Aβ1-42表现出特征为极度无序的构象异构体的初始光谱(图3A和3C)。这些光谱的主要特征为集中在～198nm的大幅最小值。在后续的3天孵育中，发生大的构象改变，最终产生混合的α-螺旋和β-折叠特征的群体(参见在～195，～210和～220nm弯曲)。相反地，在存在MNG-AZ时没有观察到转变(图3B和3D)。MNG-AZ处理的Aβ1-40和Aβ1-42的所有光谱显示了极度无序的构象异构体的群体，表明MNG-AZ成功地阻碍了Aβ二级结构的形成，尤其是β-折叠，其涉及Aβ的异常聚集。
ThT结合。采用ThT结合来确定Aβ1-40和Aβ1-42制剂中的β-折叠结构的水平。在缺乏化合物时，Aβ1-40表现准S形结合曲线，特征为2天滞后期，和约3天的ThT结合持续增长期(与纤维形成相关)，以及约5天后的结合平台(图4)。当Aβ1-40与Med1孵育时，化合物∶肽比例为1∶4或5∶4，结合曲线与未处理的肽的结合曲线相同，在实验误差范围内(图4A)。相反，MNG-AZ产生了显著差异(图4B)。这些包括MNG-AZ浓度依赖性的滞后时间增加，β-折叠产生速率的减慢，以及最终β-折叠水平降低(表1)。采用较高浓度(25μM)MNG-AZ时，观察到Aβ1-40组装几乎完全抑制。
表1.Aβ组装的动力学
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未处理的Aβ1-42和Med1-处理的样品与Aβ1-40的组装相似(图4C)。在测试的时间分辨率内，观察到荧光发生很少或没有滞后时间，其以准线性的方式增加4天并且然后保持恒定。MNG-AZ对于Aβ1-42组装的影响甚至比对Aβ1-40组装的影响更大。当Aβ1-42与MNG-AZ按照化合物∶肽比例为1∶2孵育时，观察到1天滞后，并且最大ThT结合要比未处理的肽低6倍，最大ThT结合发生在仅1天后(图4D；表1)。然而，在化合物∶肽比例为5∶2时，没有观察到β-折叠形成。因此，MNG-AZ以剂量依赖的方式抑制Aβ1-40和Aβ1-42的β-折叠形成，并且抑制要比对Aβ1-42明显有效得多。
EM结果。二级结构参数与Aβ组装状态相关，但是他们本身没有建立组装体的四级结构，这用电子能谱术观察更佳(图5)。在未处理的Aβ1-40和Aβ1-42样品中观察到经典的淀粉样蛋白纤维(分别为图5A和5B)。Aβ1-40纤维是没有分支的螺旋纤丝，直径为～7nm，其表现为螺旋周期为～220nm。Aβ1-42形成了宽度为～8nm且螺旋程度不一的无分支纤丝。此外，在Aβ42组装中，也观察到了宽度为～12nm的粗、直、无分支的纤丝。在较低浓度(5μM)的MNG-AZ时，纤维比未处理的Aβ形成的纤维更细(4和8nm)(图5C)。另外，观察到了大量小的、相对无定形的聚集物。用25μMMNG-AZ处理Aβ1-40使得纤维数量明显减少，并且短纤维和无定形聚集物的相对数量增加(图5E)。MNG-AZ对于Aβ1-42组装的影响相似，其中纤维数量减少并且无定形聚集物的频率增高(图5D和5F)。
MTT代谢(毒性测试)。图6中显示了Aβ的毒性测试结果。在图6A-6D中，左侧的组代表在0天孵育后的毒性结果(对于Aβ1-40和Aβ1-42肽)；在中间的组代表Aβ1- 40孵育3天后毒性结果(图6A和6B)或Aβ1-42孵育2天后的毒性结果(图6C和6D)；右侧的组代表孵育7天后的毒性结果(对于两种肽)。在一套实验中(图6A和6C)，肽与Med1或MNG-AZ一起孵育。在第二套实验中(图6B和6D)，在孵育后以及混合物刚要加入到分化的PC12细胞中之前，加入Med1和MNG-AZ。
Aβ1-40表现出对细胞有毒性并且毒性为纤维的～20％(图6A)。Aβ1-40和Med1的混合物也为～20％毒性。相反地，MNG-AZ使得Aβ1-40没有毒性。Aβ1-40孵育3天，在此期间形成了低聚体、原纤维和纤维，产生了明显毒性更强的组合物(～60％，图6A的中间组)。用MNG-AZ处理Aβ1-40将这种毒性降低到＜10％(p＜0.005)。在7天孵育后，三个实验组之间观察到了相同的质量关系(图6A的右侧组)：未处理的和Med1-处理的Aβ1-40都为～35-40％毒性，而MNG-AZ处理的Aβ1-40为＜10％毒性。在用Aβ1-42进行的实验中得到的相似的结果(图6C)。在所有时间点，Aβ1-42要比Aβ1-40毒性更大。
图6B中显示了在肽组装进程后MNG-AZ对于Aβ1-40诱导的毒性的影响。在所有孵育时间，未处理的和Med1-处理的肽产生了相似的毒性水平。相反地，MNG-AZ处理的肽是无毒的(0天)或明显毒性更低(3或7天)。在Aβ1-42的研究中获得了质量相似的结果(图6D)。MNG-AZ对Aβ1-42的效果要比对Aβ1-40效果更为明显。
上述结果一致表明MNG-AZ有效抑制在脑中的Aβ的低聚化及其毒性。这些发现证明MNG-AZ能预防或治疗与Aβ错误折叠、积累、聚集或沉积相关的疾病。
实施例7葡萄籽提取物对于tau蛋白病的转基因果蝇和小鼠模型的体内效果
本实施例显示了如本发明一个实施方式所述的组合物在带有突变的tau(R406W)蛋白的果蝇表型和tau蛋白病的转基因JNPL3小鼠模型的体内有益效果，所述果蝇模型具有一定形式的tau蛋白病。
材料与方法
检查ey＞R406W果蝇的眼睛表型。本研究是实施例5中介绍的研究的延续。简要地说，ey＞R406W卵产下并且用补充有2.8μg/ml MNG-AZ GSE(或GSPE，图21)的4-24即食苍蝇培养配方或加有等体积水(GSE溶剂，赋形剂对照)的对照食物进行饲养。果蝇用GSE(或赋形剂)连续治疗到成年。在显微镜下观察果蝇的眼睛。
评估JNPL3小鼠的运动机能障碍和死亡率。JNPL3小鼠模型被工程化改造成表达人家族性的P301L突变的tau蛋白，其导致年龄相关的神经退化，表现为运动功能障碍。从约7月龄开始，JNPL3小鼠用150毫克/公斤体重/天的MNG-AZ GSE治疗，这是在通常在12月龄发生的突变tau-介导的运动障碍开始之前。后腿伸展测试(图22中所示)根据4分制评分系统用于评估运动机能障碍。
结果与讨论
GSE治疗抑制了R406W突变的tau果蝇中的眼睛异常表型。与野生型成年果蝇相比(图21A和21D)，成年R406W突变的tau果蝇的眼表型的特征在于尺寸减小并且形态异常(图21B和21E)。相反地，GSE-治疗的突变的tau果蝇眼睛尺寸的异常要大大减少(图21C和21F)。
在采用对眼形态学的变化的4分制评分系统的成年眼形态学的定量分析中，0表示没有眼，且4代表正常眼，在3次独立测试中，GSE治疗表现为在成年雄性和雌性R406W突变的tau果蝇眼睛表型显著改善(图21G)(方差分析：P＜0.0005，F＝57.29；DF＝1,531；*P＜0.05，在独立测试中比较GSE-处理和未处理果蝇)。
GSE治疗减轻了JNPL3小鼠中的tau蛋白病临床前表型。持续的GSE治疗在JNPL3小鼠中没有产生可检测的副作用，包括体重或水消耗的变化(结果未显示)。JNPL3小鼠的GSE治疗减轻了在这个小鼠模型中随着衰老正常会发生的运动障碍的严重程度(图23A)。在减轻运动障碍的同时，与未治疗的JNPL3对照组相比，GSE治疗还显著降低了JNPL3小鼠的死亡率(图23显示了在13月，JNPL3小鼠的死亡率降低～30％)(对数秩统计，p＝0.05；死亡率：未治疗小鼠＝27％，GSE治疗小鼠＝0％)。
总的来说，实施例4、5和7中的体外和体内证据表明MNG-AZ GSE能够通过干预tau错误折叠形成tau聚集物，有益调节tau介导的神经病理学表型，这支持了潜在应用GSE来预防和/或治疗tau相关的神经退行性疾病，包括AD，进行性核上性麻痹，皮质基底变性，嗜银颗粒病，皮克病，FTDP-17等。此外，GSE干预Aβ-介导的(如实施例1-3和6中所示)和tau-介导的神经病理学机制的证据强有力地支持了MNG-AZ在预防和/或治疗AD上的潜在应用。
实施例8葡萄籽提取物对于多聚谷氨酰胺的htt介导的HD神经退行性表型的体外效果
本发明显示了如本发明的一个实施方式所述的组合物对于含有多聚谷氨酰胺的htt蛋白物质的聚集的体外效果。
材料与方法
获得htt蛋白物质，采用含有蜕皮甾酮诱导的带多聚谷氨酰胺Htt融合蛋白的PC12细胞系，该融合蛋白包含htt蛋白的前17个氨基酸加上103谷氨酰胺与增强的GFP融合(Htt103Q-EGFP)，一旦有蜕皮甾酮类似物米乐甾酮A诱导，它就表达htt融合蛋白，并且形成荧光的htt聚集物(Apostol等，Proc Nat Acad Sci 2003；100：5950-5955)。GFP-Htt融合蛋白被0.2μM米乐甾酮A诱导，并且用荧光显微镜和蛋白免疫印迹分析来评估在存在或不存在MNG-AZ GSE(12.5μM和25μM)处理下GFP-Htt融合蛋白的聚集。在存在或不存在GSE时，htt聚集物的积累表现为在GFP-Htt融合蛋白形成聚合物后的荧光发射。
结果与讨论
GSE处理以剂量依赖的方式显著降低了荧光htt聚集物的积累：较高剂量的GSE处理导致了高分子量的Htt聚集物更为明显的减少(图24A)。这一结果也被一个独立的蛋白免疫印迹分析证实(图24B)。
上述结果提供了体外证据，证明MNG-AZ可以干预多聚谷氨酰胺htt介导的HD神经病理学表型。
实施例9葡萄籽提取物对于亨廷顿病的转基因果蝇和小鼠模型的体内效果
本实施例显示了如本发明的一个实施方式所述的组合物对于elav＞Q93httexon1果蝇HD模型和R6/2转基因JNPL3小鼠HD模型的体内有益效果。
材料与方法
评估HD果蝇的运动机能和死亡率。在这些研究中采用Elav＞Q93httexon1果蝇HD模型。这一HD模型涉及elav-Gal4/UAS调控系统来实现选择性、泛神经过表达由人htt基因的第一个外显子编码的截短的人突变htt蛋白，其带有一个93-多聚谷氨酰残基(Sang等，NeuroRx，2005；2：438-446)。这导致成年发生神经退化，包括眼睛的感光细胞破坏，爬行能力障碍和寿命缩短(Sang等，2005，见上文)。
在评估运动障碍中，在羽化(成年果蝇从其蛹中出来)后一天内收集成年elav＞Q93httexon1果蝇并且每管10个放置，给予对照食物或加有MNG-AZ GSE的食物(每组n＝30)。分别在第9和16天，通过将果蝇轻拍到管子底部并且监测8秒内成功爬到管子上达到或超过预先确定的高度(例如在第9天达到7cm标记或第16天达到2cm标记)的果蝇的百分比。在评估死亡率中，在羽化后一天内收集成年elav＞Q93httexon1果蝇并且每管10个放置，给予标准(对照)食物或加有MNG-AZ GSE的食物。每天计数存活的果蝇。
评估HD小鼠的运动机能和死亡率。这些研究采用最初由Bates博士及其同事生产的R6/2小鼠HD模型进行(Mangiarini等Cell，1996；87：493-506)，这是最常用的转基因小鼠HD模型。R6/2小鼠表达带有148-153多聚谷氨酰胺重复的htt第1外显子片段。突变的htt的调控是由人htt启动子控制的。R6/2小鼠表现出非常严重的神经表型并且提供了明确的实验终点，这对于临床前可行性研究是理想的(Ramaswamy等ILAR J，2007；48：356-73).
从杰克逊实验室(Jackson’s Laboratories)获得的植入卵巢的雌性小鼠随机分为2组(100毫克/公斤/天MNG-AZ GSE-治疗和水-治疗对照组)并且与野生型雄性小鼠交配。断奶的幼鼠继续用同样的GSE或对照治疗方案喂养。
旋转杆测试用于评估在年龄相关的HD表型的发生和发展中，GSE治疗对于R6/2小鼠运动协调改变的影响。在6周龄，训练HD转基因小鼠停在一个加速旋转杆装置的细杆上(4转/分-40转/分，10分钟)，从8周龄开始，每周一次监测旋转杆表现。在给定的每次测试进行三次尝试，并且记录三次尝试的平均值。运动机能丧失表现为动物从装置上跌落的等待时间缩短。在评估R6/2小鼠的死亡率中，小鼠用100毫克/公斤/天MNG-AZ GSE，或H2O(对照组)治疗，并且每天记录存活率。
结果与讨论
果蝇HD模型的运动机能和死亡率。但在果蝇表现出轻度HD表型的第9天评估elav＞Q93httexon1果蝇的运动表现时，发现GSE治疗改善了在第9天攀登测试中的运动表现(～40％的对照未治疗果蝇和～50％的GSE-治疗果蝇成功完成了攀登任务)(图25A)。然而，这一结果没有达到统计学显著性。当在elav＞Q93httexon1果蝇发生更为严重的运动障碍的第16天进行评估时，与对照果蝇相比，明显更多百分比的GSE-治疗果蝇成功完成了攀登任务(～15％的未治疗果蝇和～47％的GSE-治疗果蝇成功完成了攀登任务)(图25B)。这些结果表明，在这个果蝇HD模型中，GSE在体内发挥了生物活性并且减轻了运动障碍。
除了运动障碍，在这个果蝇HD模型中表达突变的htt蛋白导致了寿命缩短。(从实施例5中所讨论的)继续评估GSE治疗对于在这个果蝇模型中改善寿命的影响。与前面发现GSE治疗显著减少了突变的Htt-介导的运动障碍(图25)相一致，GSE治疗还明显延长了elav＞Q93httexon1果蝇的寿命(从所有四次测试中果蝇存活的卡普兰-迈尔分析表明GSE-治疗显著延长了elav＞Q93httexon1果蝇的寿命：χ2＝21.73，df＝1，p＝0.0001)(图26)。
HD小鼠的运动机能和死亡率。在R6/2小鼠的运动机能研究中，6周龄时没有发现对照组和GSE-治疗组之间存在行为差异，此时的动物大部分在症状发生前。在运动障碍开始期的9周龄，以及在HD症状进行到中度运动障碍的11周龄，继续检查小鼠的运动机能。在临床疾病起始(9周龄)和进行(11周龄)时，GSE治疗都显著改善了R6/2HD小鼠的运动机能，如图27所示(柱状图代表动物能够留在旋转杆上的时间(秒)的平均值+SEM)。采用学生t检验的统计分析*p＜0.05比较GSE-治疗与对照未治疗组)。
在R6/2小鼠的死亡率研究中，发现GSE治疗显著延长了R6/2HD小鼠的存活。未治疗R6/2小鼠的中值寿命为90天，而GSE治疗显著延长了HD小鼠的中值寿命到100天(卡普兰-迈尔分析表明GSE治疗显著延长了HD小鼠的寿命：X2＝4.018，df＝1，p＝0.045)(图28)。
因此，上述采用独立的、系统发生远的果蝇和小鼠的HD模型的体内研究表明，MNG-AZ GSE具有减轻突变的HTT-介导的病理表型的功效。结合来自体外研究的证据(实施例5和8中讨论)，这些发现支持了采用GSE预防和/或治疗HD的潜在价值。
                               ***
本说明书引用的所有专利、专利申请、文献、产品说明和方法在此整体引用作为参考。万一术语上有冲突，以本说明书为准。
虽然很明显，本说明书所述的发明经过了很好的计算来达到上述的效益和优势，本发明的范围不受本说明书所述的特定实施方式的限制。应当理解，可以对本发明进行修改、变更和变化，而不超出本发明的主旨。

Claims (18)

1.一种治疗对象神经退行性疾病的方法，该方法包括给予有需要的对象有效量的含有葡萄籽提取物的药物组合物，所述葡萄籽提取物中没食子酰原花色素占原花色素的总重量的重量比低于约12％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病为帕金森病。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病为亨廷顿病。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病为tau蛋白病。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述tau蛋白病选自下组：阿尔茨海默病，进行性核上性麻痹，皮质基底变性，嗜银颗粒病，皮克病以及家族性额颞痴呆症。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物组合物是通过口服给药的。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述口服剂型选自下组：粉末、片剂、胶囊、口腔分散片、软胶囊、水性药物、糖浆、酏剂和药囊。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物组合物是经皮给药的。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物组合物是经鼻给药的。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象为人类对象。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物组合物还包含选自下组的活性成分：抗氧化剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、以及上述物质的组合。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效量为每天约100-1000毫克的剂量。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述剂量为每天约200-600毫克。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述给药频率为每月、每两周、每周或每天。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述给药频率为每天。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述给药为单剂给药。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述给药为分多剂给药。
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