JP2018524994A - 細胞透過性が改善された(iCP)パーキン組換えタンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の別の態様は、
以下の特徴:
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:GRAVY:2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)を有するアミノ酸配列からなる、aMTDに関する。
[一般式]
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:GRAVY:2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
G.二次構造:α−へリックス
からなる。
[一般式]
を有するaMTDのプラットフォームを設計するステップと、設計されたアミノ酸配列が、以下に示す6つの重要因子:
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:GRAVY:2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
ことを満たすかどうかを確認するステップとを含む。
a.アミノ酸配列:12
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:GRAVY:2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
からなる。
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(grand average of hydropathy)(GRAVY)を有する
を有する、iCPパーキン組換えタンパク質を提供する。
[一般式]
により示すことができる。
A-B-C及びA-C-B-C
[式中、Aは、細胞又は組織の改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)であり、Bは、パーキンタンパク質であり、Cは、可溶化ドメイン(SD)であり、
aMTDが、9〜13個のアミノ酸配列で構成されており、以下の特徴:
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される3種以上のアミノ酸で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有し、
(d)α-へリックス構造を有する
を有する]
により示される、iCPパーキン組換えタンパク質を提供する。
(a)好ましくは、Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に;好ましくは、そのアミノ酸配列の5位〜8位のうちの1つ以上、及び12位に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparam(http://web.expasy.org/protparam/を参照されたい)により測定する場合に、好ましくは、40〜60、より好ましくは、41〜58の不安定指数;好ましくは、180〜220、より好ましくは、185〜225の脂肪族指数;及び好ましくは、2.1〜2.6、より好ましくは、2.2〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有する
を有する、iCPパーキン組換えタンパク質を提供する。
[一般式]
により示すことができる。
[式中、Aは、細胞又は組織の改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)であり、Bは、パーキンタンパク質であり、Cは、可溶化ドメイン(SD)であり、
aMTDが、9〜13個、好ましくは、10〜12個のアミノ酸配列で構成されており、以下の特徴:
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に;好ましくは、そのアミノ酸配列の5位〜8位のうちの1つ以上、及び12位に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparam(http://web.expasy.org/protparam/を参照されたい)により測定する場合に、好ましくは、40〜60、より好ましくは、41〜58の不安定指数;好ましくは、180〜220、より好ましくは、185〜225の脂肪族指数;及び好ましくは、2.1〜2.6、より好ましくは、2.2〜2.6の疎水性親水性指標の全平均(GRAVY)を有し、
(d)好ましくは、α-へリックス構造を有する、
を有する]
により示される、iCPパーキン組換えタンパク質を提供する。
以前に報告されたMTDは、1,500種超のシグナルペプチド配列のスクリーニングから選択された。開発されたMTDは、共通配列又は配列モチーフを有しなかったが、それらは全て、それらの疎水性、及びアルファ-らせん形構造に適合する傾向を除き、共通配列又はモチーフも欠く、シグナル配列の疎水性(H)領域(HRSS)に由来するものであった。H-領域配列における広範なバリエーションは、膜転位活性及びSRP/Sec61機構への続く適合を有するタンパク質についての先行する革新を反映し得、それは、SRPにおけるメチオニンに富むシグナルペプチド結合ポケットを利用して、広範なシグナルペプチド配列を適応させる。
1995〜2014年(表2)に公開された17種の異なる疎水性CPP(表1)が、選択された。選択された疎水性CPPの生理学的及び化学的特性が分析された後、細胞透過性と関連し得る11種の異なる特徴が、さらなる分析のため選ばれた。これらの11種の特徴は以下の通りである:配列、アミノ酸長、分子量、pI値、変角ポテンシャル、硬性/柔軟性、構造特性、ヒドロパシー、残基構造、アミノ酸組成、及び配列の二次構造(表3)。
分析されたペプチドの平均の長さ、分子量、及びpI値は、それぞれ、10.8±2.4、1,011±189.6、及び5.6±0.1であった(表4)。
変角ポテンシャル(bending potential)(変角又は非変角)は、プロリン(P)が存在するかどうかの事実、及び/又は組換えタンパク質中のペプチドに変角ポテンシャルをもたらすアミノ酸が位置する場所に基づき、決定された。プロリンは、その側鎖が、骨格窒素原子並びにアルファ-炭素原子に結合する点で、他の共通のアミノ酸と異なる。得られた環状構造は、折り畳まれたペプチド/タンパク質鎖の変角においてしばしば見られる、タンパク質構造に顕著に影響する。
任意のペプチドの決定的な構造特性の1つは、モチーフが、硬いか、又は柔軟であるかどうかの事実に基づき、それは、ペプチド配列のインタクトな物理化学的特徴であるので、配列の不安定指数(II)が決定された。ペプチドの硬性/柔軟性を表す指標の値は、極端に変動した(8.9〜79.1)が、平均値は、ペプチドが、いくぶん柔軟であるべきだが、硬く又は柔軟過ぎないことを示唆する、40.1±21.9であった(表3)。
アラニン(V)、バリン(V)、ロイシン(L)、及びイソロイシン(I)は、脂肪族側鎖を含有し、疎水性であり、すなわち、それらは、水などを嫌って、クラスター形成する。疎水性、及び脂肪族残基を有する、これらのアミノ酸により、それらが、一体となって、ほとんど穴を有しないコンパクトな構造を形成することが可能になる。分析されたペプチド配列は、全ての構成アミノ酸が、17種のうち1種(MTD10-表3)のみにおけるグリシン(G)を除き、疎水性(A、V、L、及びI)であり、脂肪族(A、V、L、I、及びP)であったことを示した。それらのヒドロパシー指数(ヒドロパシーの全平均:GRAVY)、及び脂肪族指数(AI)は、それぞれ、2.5±0.4、及び217.9±43.6であった。それらのアミノ酸組成はまた、表3においても示される。
上で説明された通り、CPP配列は、α-らせん形構造を有する疎水性配列と「屈曲」配置において膜に挿入された後、細胞膜に直接浸透すると考えられ得る。加えて、本発明者らの分析は、変角ポテンシャルが、膜浸透に決定的であったことを強く示した。それ故、ペプチドの構造分析は、配列が、ヘリックスを形成したかどうかを決定するため行った。9種のペプチドがヘリックスであり、8種がヘリックスでなかった(表3)。これは、ヘリックス構造が必要ではないかもしれないことを示唆しているように思われる。
分析された11個の特徴において、以下の6個が、新規疎水性CPP-進化型MTDの開発のために選択され、すなわち、「重大な因子」である:アミノ酸長、変角ポテンシャル(プロリンの存在及び位置)、硬性/柔軟性(不安定指数:II)、構造特性(脂肪族指数:AI)、ヒドロパシー(GRAVY)、及びアミノ酸組成/残基構造(疎水性及び脂肪族A/a)(表3及び表4)。
過去20年間に既に開発された、17種の異なる疎水性CPPの分析されたデータ(分析A、表3及び4)は、高いバリエーションを示し、共通又はコンセンサス特性を成すのが困難であったので、分析B(表5及び6)、及びC(表7及び8)がまた、改善されたCPP-aMTDのより良好なデザインのための重大な因子を最適化するために行われた。それ故、17種の疎水性CPPは、2つのグループにグループ分けされ、細胞透過特性と関連するそれらの特徴についてグループを分析した。重大な因子は、グループの分析データを比較及び対比し、細胞透過特性について重大であり得る、共通の相同特性を決定することにより、最適化された。
分析Bにおいて、8種のCPPが、インビボでそれぞれの生物学的に活性なカーゴと共に使用された。長さは11±3.2であったが、8種のうち3種のCPPは、ほとんど変角ポテンシャルを有しなかった。硬性/柔軟性(不安定指数:II)は41±15であったが、ペプチドの1つ[MTD85:最小(II:9.1)を伴い、硬い]を取り除くことにより、全体的な不安定指数が45.6±9.3まで増大した。これは、柔軟性が高い(40以上のII)ほど、潜在的に良好であることを示唆していた。8種のCPPの全ての他の特徴が、構造特性及びヒドロパシーを含む、分析Aと同様であった(表5及び6)。
分析A、B、及びCにおいて決定された「重大な因子」が、疎水性CPPの現在の問題-タンパク質凝集、低い溶解性/収量、及びMTS/MTM又はMTDに融合した組換えタンパク質の乏しい細胞/組織透過性、並びにペプチドの非共通配列及び非相同な構造を改善するために妥当であったことを証明する、aMTD及びランダムペプチド(rP又はrペプチド)の実際のデザインのための「重大な因子の共通範囲及び/又はコンセンサス特性」を最適化するために、経験的に選択されたペプチドが、それらの構造特性、及び物理化学的因子指数について分析された。
3-1.共通配列及び/又は共通の相同な構造の決定
上で述べられた通り、シグナル配列のH領域(HRSS)に由来するCPP(MTS/MTM、及びMTD)は、共通配列、配列モチーフ、及び/又は共通の構造上相同な特性を有しない。この発明において、目的は、「共通機能」を有するように、すなわち、分析された参照CPPと同様のメカニズムで膜を超えてタンパク質転位を促進するように、新たに決定された「重大な因子」を満たす、共通配列モチーフ及び構造モチーフに形式化された、改善された疎水性CPPを開発することである。分析A、B、及びCに基づき、共通の相同な特性を分析して、細胞透過性に影響する、重大な因子が決定された。それぞれの重大な因子の範囲値は、新規aMTDをデザインするための分析A、B、及びCからそれぞれの重大な因子の分析された指数を含むことが決定された(表9)。これらの特性は、それらの細胞透過性において新規にデザインされたaMTDで実験的に確認された。
タンパク質を含む治療上活性なカーゴ分子を生きた細胞に送達するため疎水性CPPに融合された組換え細胞透過性タンパク質が、以前に報告されたが、細菌システムにおいて発現された融合タンパク質は、それらの低い溶解性及び収量に起因して、可溶型として精製することが困難であった。タンパク質ベースの生物学的治療としての細胞透過性タンパク質のさらなる臨床上の開発に関する極めて重大な脆弱性に対処するために、進化型MTD(aMTD)と名付けられた、疎水性CPPの多いに改善された形態が、重大な因子ベースのペプチド分析を介して新たに開発された。aMTDの本発明のため使用された重大な因子が、本明細書にある(表9)。
:プロリンは配列の中央(5'〜8'アミノ酸)、及び末端に存在する
疎水性CPPの固有の特性の分析から得られた、6個の重大な因子を注意深く考慮した後、進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)が、分析から決定されたアミノ酸長(9〜13)を含む、重大な因子を満たす、共通の12個のアミノ酸プラットフォームに基づき、デザインされ、開発された。
上で記載された全ての重大な因子を満たす、新規疎水性CPP-aMTDの本発明は妥当であり、合理的にデザインされることを実証するために、少なくとも1個の重大な因子を満たさないペプチドもデザインされた。計31種のrペプチド(rP)がデザインされ、開発され、以下の通りカテゴリー分けされた:非変角ペプチド、中央並びに末端においてプロリンがないか、及び/又は中央のプロリンがないのいずれか、硬いペプチド(II<40)、過度に柔軟なペプチド、芳香族ペプチド(芳香環の存在)、A、V、L、I、P以外のアミノ酸又は他のプロリン残基を有するが、非芳香ペプチドを有する疎水性ペプチド、親水性だが非脂肪族ペプチド。
表16は、配列の中央において(5'、6'、7'又は8'において)、及び末端において任意のプロリンを有しない、ペプチドを示す。加えて、表16は、配列の中央においてプロリンを有しない、ペプチドを記載する。全てのこれらのペプチドは、非変角ポテンシャルを有すると考えられる。
配列の硬性/柔軟性が、決定的に重大な因子であることを証明するために、硬い(平均II:21.8±6.6)及びずっと高く柔軟な配列(平均II:82.3±21.0)もデザインされた。不安定指数が、新規aMTDのものよりずっと低い(II:41.3〜57.3、平均II:53.3±5.7)、硬いペプチドが、表17において示される。IIが新規aMTDのものよりずっと高い、変角だが、ずっと高く柔軟なペプチドも、表18において提供される。
新規疎水性CPP-aMTDは、指数AIの平均範囲:180〜220、及びGRAVYの平均範囲:2.1〜2.6を有する、疎水性及び脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)のみと一致する(表9)。構造指標に基づき、芳香族残基(W、F、又はY)を含有するペプチドが、表19において示され、A、V、L、I、P以外のアミノ酸又は他のプロリン残基を有するが、非芳香族配列を有する疎水性ペプチドがデザインされる(表20)。最後に、非脂肪族アミノ酸と一致する、親水性及び/又は変角ペプチドが、表21において示される。
重大な因子に基づき、計457種の配列がデザインされた。重大な因子の全ての範囲/特性を満たす、デザインされた潜在的に最善なaMTD(疎水性、柔軟な、変角、脂肪族、及び12個のA/a長のペプチド)は、316種である。重大な因子の少なくとも1つを満たさない、デザインされたrペプチドは、141種であり、変角ペプチドがない配列が26種であり、硬いペプチド(II<40)配列が23種であり、過度に柔軟なペプチドが24種であり、芳香族ペプチド(芳香環の存在)が27種であり、疎水性だが、非芳香族ペプチドが23種であり、親水性だが、非脂肪族ペプチドが18種である。
aMTD及び他のもの[rペプチド、参照疎水性CPP配列(MTM及びMTD)]に融合された組換えタンパク質が、細菌システムにおいて発現され、シングルステップのアフィニティークロマトグラフィーで精製され、生理学的条件において溶解性のタンパク質として調製された。これらの組換えタンパク質は、フローサイトメトリー及びレーザー走査型共焦点顕微鏡を利用することにより、それらの細胞透過性の能力について試験された。
臨床上/非臨床上の適用のため、aMTDに融合されたカーゴ材料は、以下の:酵素、転写因子、毒性、抗原性ペプチド、抗体、及び抗体フラグメントの1つであり得る、生物学的に活性な分子であろう。さらに、生物学的に活性な分子は、これらの以下の巨大分子:酵素、ホルモン、担体、免疫グロブリン、膜結合タンパク質、膜貫通型タンパク質、内部タンパク質、外部タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、未変性のタンパク質、糖タンパク質、断片化タンパク質、ジスルフィド結合されたタンパク質、組換えタンパク質、化学的に修飾されたタンパク質、及びプリオンの1つであり得る。加えて、これらの生物学的に活性な分子は、以下の:核酸、コード核酸配列、mRNA、アンチセンスRNA分子、炭水化物、脂質、及び糖脂質の1つであり得る。
それぞれのaMTDに融合された組換えタンパク質についてのコード配列は、pET-28a(+)(Novagen、Darmstadt、ドイツ)中のNdel(5')及びSalI(3')にPCR増幅されたDNAセグメントからクローニングされた。aMTD及びrペプチドに融合された組換えタンパク質についてのPCRプライマーは、配列番号481〜797で表される。組換えタンパク質の構造は、図1において提示される。
本発明はまた、細胞透過性を有するaMTD配列の開発方法に関する。標準化された6個の重大な因子を使用して、316種のaMTD配列がデザインされた。加えて、これらの重大な因子の1つを欠く、141種のrペプチドも開発される:非変角ペプチド:i)配列の中央及び末端の両方においてのプロリンの不存在、又はii) 配列の中央若しくは末端のいずれかにおいてのプロリンの不存在、硬いペプチド、過度に柔軟なペプチド、芳香族ペプチド(芳香環の存在)、疎水性だが、非芳香族ペプチド、並びに親水性だが、非脂肪族ペプチド(表22)。
aMTD及びrペプチドは、蛍光的に標識され、フローサイトメトリー及び共焦点レーザー走査顕微鏡を使用することにより、細胞透過性について重大な因子に基づき比較された(図5〜8)。ペプチド融合非機能的カーゴ組換えタンパク質の細胞の取り込みは、フローサイトメトリーにおいて定量的に評価され得る一方、共焦点レーザー走査顕微鏡により、細胞内取り込みを視覚的に評価することが可能になる。分析は、aMTD(疎水性及び脂肪族配列)と逆の特徴(親水性及び芳香族配列:YYNQSTCGGQCY)を有する、陰性対照[rP38]に融合された組換えタンパク質を含んでいた。aMTDの陰性対照に対する相対的細胞透過性(相対的倍数)も分析された(表23及び図9)。
aMTDに融合された組換えタンパク質を試験して、陰性対照(rP38)、及び陽性対照参照として以前に公開されたCPP(MTM12及びMTD85)を用いたレーザー走査型共焦点顕微鏡により、それらの細胞内送達並びに局在性が決定された。NIH3T3細胞を、10μMのFITC標識タンパク質に1時間37℃において曝露し、核を、DAPIで対比染色した。次に、細胞を、共焦点レーザー走査顕微鏡により調べた(図7)。aMTDに融合された組換えタンパク質は、典型的には、参照CPP(MTM12及びMTD85)より高い、細胞内送達及び細胞質局在性を明確に提示する(図7)。rP38融合組換えタンパク質は、内部移行された蛍光シグナルを示さなかった(図7a)。加えて、図8において見られる通り、rペプチド(hisタグ付けされた、それぞれのrペプチドに融合されたCRA組換えタンパク質)は、より低い又は非細胞透過性を提示する。
ヒスチジンタグ付けされたaMTD融合カーゴ組換えタンパク質は、それらの溶解性及び収量において大いに増強された。従って、FITCコンジュゲート組換えタンパク質をまた試験して、タンパク質の細胞内局在性が定量され、視覚化され、参照CPPと比較してより高い細胞透過性が実証された。
新規aMTDの細胞透過性を決定した後、構造/配列活性関係(SAR)が、新規aMTDの選択されたいくつか、及び全てにおいてそれぞれの重大な因子について分析された(図13〜16、及び表34)。
実験及びSAR分析を行う前に、最初に提案された重大な因子の指数範囲並びに特性に含まれる、6個のうち5個の重大な因子の範囲及び特性が、経験的かつ実験的に決定された。新たに開発された240種のaMTDの重大な因子の指数範囲及び特性に関して、変角ポテンシャル(プロリン位置:PP)、硬性/柔軟性(不安定指数:II)、構造特性(脂肪族指数:AI)、ヒドロパシー(GRAVY)、アミノ酸長及び組成は、全て、参照疎水性CPPの分析から得られる重大な因子の特徴内にある。
この発明について、240種のaMTD配列が、重大な因子に基づき、デザインされ、開発された。240種のaMTDの定量的及び視覚的細胞透過性(疎水性、柔軟な、変角、脂肪族、及び12個のa/a長のペプチド)が、全て実際に決定される。
8-1.細胞透過性についてのaMTDの選択
240個のaMTDから、12個のaMTDを選択し、使用して、iCPパーキン組換えタンパク質を構築した。使用した12個のaMTDを、以下の表36に示す。
疎水性CPPに融合させた組換えカーゴ(パーキン)タンパク質は、細菌系中で発現させ、単一ステップの親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができたが、生理的緩衝液(例えば、PBS、DMEM又はRPMI1640等)中に溶解させたタンパク質は、極めて不溶性であり、溶解性の形態として極めて低い収率を示した。したがって、溶解性、収率、並びに最終的には、細胞及び組織に対する透過性を改善するために、追加の非機能性タンパク質ドメイン(可溶化ドメイン:SD)を適用し、組換えタンパク質と融合させた。。
我々は、パーキンタンパク質について、aMTD及び可溶化ドメインを有する又は有しない、5つの異なるタイプの組換えタンパク質を設計した。タンパク質の構造を、以下に従って標識した:(1)ヒスチジンタグのみを有するカーゴタンパク質、(2)ヒスチジンタグ及びaMTDと融合させたカーゴタンパク質、(3)ヒスチジンタグ、aMTD及び可溶化ドメインA(SDA)と融合させたカーゴタンパク質、(4)ヒスチジンタグ、aMTD及び可溶化ドメインB(SDB)と融合させたカーゴタンパク質、(4C)ヒスチジンタグ及び可溶化ドメインB(SDB)と融合させたカーゴタンパク質、(5)aMTD及び可溶化ドメインB(SDB)と融合させたカーゴタンパク質、並びに(5C)可溶化ドメインB(SDB)と融合させたカーゴタンパク質(図17)。それらのうち、(4)及び(5)の構造を、iCP-パーキン組換えタンパク質の生物学的効能を有する候補タンパク質として使用し、(4C)及び(5C)を、(4)及び(5)に比した対照群(非CPパーキン)としてとして使用した。
それぞれのパーキン組換えタンパク質を、IPTGを添加することによって首尾よく誘発し、精製した(図19)。我々は、SDAと融合させたパーキン(HM321PSA)又はSDBと融合させたパーキン(HM321PSB、HM524PSB、M524PSB)のいずれについても、カーゴタンパク質のみ(HP)又はaMTDのみと融合させたカーゴタンパク質(HM321P)と比較して、溶解性の顕著な増加を観察した。結果から、SDと融合させたパーキン組換えタンパク質は、溶解性及び収率の顕著な改善を示すことが示唆された(図19及び図21a)。
aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質は、aMTD321配列又はaMTD524配列を欠くパーキン組換えタンパク質(HP、HPSB及びその他のaMTD)と比較して顕著により高い細胞透過性、組織透過性を示す。まとめると、これらのaMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質(HM321PSA及びHM321PSB)は、類似の溶解性及び収率を示すにもかかわらず、aMTD321/SDB融合パーキン組換えタンパク質の細胞及び全身への送達活性は、aMTD321配列を欠くパーキン組換えタンパク質よりも高かった。したがって、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質が、組換えタンパク質の最も安定な構造であることが決定された。
我々は、開発したパーキン組換えタンパク質の細胞/組織透過性及び生物学的活性について検討した。パーキン組換えタンパク質の細胞透過性を、RAW264.7細胞において、タンパク質処置の1時間後に評価した。aMTDを欠くFITC標識化パーキン組換えタンパク質(HP及びHPSB)は、RAW細胞中で検出することができなかった。対照的に、aMTDを担持するパーキン組換えタンパク質HM321P、HM321PSA、HM321PSB及びM524PSBは、高い細胞透過性を示した(図26)。蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、タンパク質の細胞内局在化をモニターすると、NIH3T3細胞中でも、類似の結果が得られた(図24)。特に、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質(HM321PSA、HM321PSB及びM524PSB)が、最も高い細胞透過性を示した。これらの結果から、aMTDは、タンパク質が短時間(1時間)の間に細胞内に浸透するのを首尾よく可能にし、細胞透過性に積極的に影響を及ぼす、タンパク質の溶解性を改善することが示された。
次に、我々は、in vivoで、FITC標識化タンパク質の腹腔内注射の15分及び30分後に、パーキン組換えタンパク質の組織透過性を決定した(図25)。FITC標識化HPSB又は非コンジュゲート化FITCを投与された対照動物と比較した場合、FACS(蛍光標識細胞分取)により分析したPBMC(末梢血単核球)が、蛍光のゲインを示し、このことは、FITC標識化タンパク質の存在を指し示した。FACS分析のために、CellQues Pro細胞数測定用分析ソフトウエア(FACS Calibur、Beckton-Dickinson、San Diego、CA、米国)を使用して、細胞(1×104個)を分析した。
血液脳関門に対する透過性を、免疫組織化学的標識化(免疫組織化学的検査)を使用することによって決定するために、抗パーキンモノクローナル抗体(1:200、Santa Cruz Biotechnology)を使用して、組織を免疫組織化学的に処理した。パーキン陽性の免疫反応性が、HM321PSB処置マウスの脳において観察されたが、HPSB処置マウスの脳においては観察されなかった(図29)。ウエスタンブロットの結果では、パーキン抗体陽性のバンドが、HM321PSB組換えタンパク質を投与した群においてのみ観察された(図28a)。さらに、図28b及び図28cに示すように、本発明のHM524PSBを用いて処置したマウスの脳において、HPSBを用いて処置したマウスと比較してより多い量のパーキンタンパク質が検出されることも確認した。
11-1.iCP-パーキン組換えタンパク質のE3リガーゼ活性
パーキン組換えタンパク質のE3リガーゼ活性を決定するために、製造元の使用説明に従って実施する自己ユビキチン化アッセイ(Boston Biochem)を使用することによって、パーキンE3リガーゼ活性を測定した。図30に示すように、本発明のiCP-パーキン組換えタンパク質は、(自己)ユビキチン化活性を示し、このことは、それらがE3リガーゼ活性を有することを示した。
神経毒が引き起こすニューロン死に対するパーキン組換えタンパク質の保護作用を決定するために、CATH.a細胞及びSH-SY5Y細胞を、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)を用いて処置した。6-OHDA処置の後に、これらの細胞を、パーキン組換えタンパク質を用いて処置し、TUNELアッセイを実施した。6-OHDAのみで処置した群において、多数の細胞死が観察された。6-OHDA処置群に類似して、aMTDを欠くHPも、アゴニストのみの群に類似するパーセントのアポトーシス細胞死を示すに至った。対照的に、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質(HM321PSA及びHM321PSB)は、アポトーシスを、CATH.a細胞及びSH-SY5Y細胞においてそれぞれ、19.7%及び14.2%まで抑制するに至った(*p<0.05)。類似の結果を、CATH.a細胞及びSH-SY5Y細胞の両方において得た。aMTD524パーキンタンパク質を処置した場合も、類似の結果を得た。これらの結果から、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質が、培養神経細胞において神経保護作用を示すことが示されている。さらに、ニューロンの細胞死を阻害するこれらの作用は、用量依存性の様式で観察された(図31、図32a及び図32b)。
パーキン組換えタンパク質のin vivoでの作用を決定するために、我々は、パーキンソン病の生理学的及び精神的な症状を、神経毒素を使用することによって模倣する多様なパーキンソン病(PD)の動物モデルを開発した。パーキンソン病様症状を誘発するために、神経毒素であるMPTP(1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン)を使用した。このMPTPは、ミトコンドリア内膜において、モノアミンオキシダーゼ(MAO-B)により、毒性物質であるMPP+に変換され、これが、ドーパミン作動性ニューロンを選択的に標的にして、パーキンソン病を誘発する(図34)。
13-1.水泳試験
パーキン組換えタンパク質が運動機能を回復させる作用を評価するために、水泳試験を実施した。各群(希釈剤、MPTPのみ、MPTP+HPSB、及びMPTP+HM321PSB)の水泳活動(四つ足)を測定し、無病変の希釈剤対照のパーセントとして表した。MPTPのみの群は、希釈剤の群と比較して、水泳活動の顕著な減少を示した。同様に、HPSB処置群も、MPTPのみの群に類似する結果を示した。対照的に、HM321PSB処置群は、運動活動の改善を示した。したがって、我々は、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質が、急性MPTP誘発パーキンソン病のマウスモデルにおいて、運動機能を回復させたことを決定した(図37)。
パーキン組換えタンパク質が運動機能を回復させる作用を評価するために、歩行運動試験を実施した(図38)。この実験では、歩幅の距離及びふらつきの距離を測定した。MPTPのみ及びHPSB処置群において、希釈剤の群と比較して、歩幅の距離は顕著に低下し、一方、ふらつきの距離は増加した。しかし、HM321PSB処置マウスは、正常群に類似するレベルの歩幅の距離を示し(図39)、MPTPのみ及びHPSB処置群と比較して、ふらつきの距離の顕著な低下を示した(図40)。したがって、我々は、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質が、急性MPTP誘発パーキンソン病のマウスモデルにおいて、歩行運動機能を改善させることを決定した。
ロータロッド試験を、亜慢性MPTPモデルにおいて実施し、その結果、aMTD524/SD融合パーキンタンパク質処置群は、ロータロッド上で長時間歩行し、このことは、希釈剤対照に類似した。すなわち、aMTD524/SD融合パーキンタンパク質による運動機能の回復が確認された(図41)。
14-1.尿中のドーパミン
尿中のドーパミンレベルを測定するために、パーキン組換えタンパク質による最初の処置の10時間後に、全ての群のマウスから尿を収集した。これらの尿試料を、ELISAにより測定した。10時間後の結果において、MPTPのみとHM321PSB処置群との間で、統計学的に有意な差が存在し。希釈剤の群と比較した場合、MPTPのみ群は、尿中レベルの減少を示した一方、HM321PSB処置群は、類似の尿中レベルを示すに至った。結果から、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質は、尿中のドーパミンレベルを高めることが示されている。(図35)。
脳中のドーパミンレベルを測定するために、全ての群において、線条体領域のドーパミンレベルを、ELISAにより測定するに至った。線条体のドーパミンレベルは、HM321PSB処置群において、MPTPのみ及びHPSB処置群と比較して2倍超であった。したがって、我々は、線条体のドーパミンレベルを、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質は増加させ、MPTP処置は減少させることを決定するに至った(図36)。
15-1.急性MPTP-PDモデル
パーキン組換えタンパク質がドーパミン作動性ニューロンを保護する効能を決定するために、免疫組織化学的検査を、ドーパミンニューロン中のマーカー酵素であるチロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を使用して実施した。aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質を用いて処置したマウスの黒質及び線条体領域中のドーパミン作動性ニューロンの数を観察し、MPTPのみを投与した群及びHPSBを投与した群と比較した。したがって、我々は、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質は、神経保護機能を有し得るであろうことを決定した。さらに、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質の、神経細胞の回復作用も、用量依存性の様式で観察された。(図42a及び図42b)。
亜急性MPTPモデルの脳において、TH発現の変化を、ウエスタンブロッティングにより調べ、その結果、aMTD/SD融合パーキンタンパク質による、TH発現の回復が観察された。さらに、内因性パーキンタンパク質の発現は変化しなかった(図43)。
本発明では、aMTDを用いて、細胞透過性パーキン組換えタンパク質を設計及び開発した。aMTDと融合させたパーキン組換えタンパク質及びaMTDを欠く対照の組換えタンパク質を全て、それらの細胞/組織透過性及びBBB透過性について、定量的、視覚的に確認した。我々は、細胞透過性のaMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質及びaMTD524/SD融合パーキン組換えタンパク質が、比較的高い細胞/組織透過性を示すこと(図24〜27)、及びBBBを通って浸透することによって、脳組織へ効率的に送達されること(図28a〜図28c、及び図29)を確認することができた。細胞透過性パーキン組換えタンパク質の生物学的活性を決定するために、我々は、多様な機能試験を実施した。我々は、細胞透過性パーキン組換えタンパク質が、神経毒(6-OHDA及びMPP+)が引き起こすニューロンの細胞死に対する抗アポトーシス作用を有すること(図31、図32a及び図32b)、並びに神経毒(MPTP)が誘発する動きの機能不全を示すPDのマウスモデルにおいて、回復作用を示すこと(図35〜図43)を確認した。
新規進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)の開発
シグナル配列のH領域(HRSP)に由来するCPP(MTS/MTM、及びMTD)は、共通配列、配列モチーフ、及び/又は共通の構造上相同な特性を有しない。この発明において、目的は、「共通の機能」を有するよう、分析したCPPと類似のメカニズムで細胞膜を超えてタンパク質が移行することを促進するよう、新たにデザインした「重大な因子」を満たす、共通配列及び構造モチーフにおいて形式化した、改善した疎水性CPPを開発することである。
aMTDに融合した組換えタンパク質のための発現ベクターの構築
本発明者らの新たに開発した技術により、本発明者らは、細胞透過性組換えタンパク質を作成する方法を拡大することが可能になった。aMTD又はrペプチドと融合したヒスチジンタグ付けしたCRAタンパク質のため、発現ベクターをデザインした。組換えタンパク質のための発現ベクターを構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を考案して、それぞれのデザインした、CRAに融合したaMTD又はrペプチドを増幅させた。
aMTD及びrペプチドに融合した組換えタンパク質の誘導可能な発現、精製、並びに調製
組換えタンパク質を発現させるために、陰性対照[rペプチド38(rP38)]、参照疎水性CPP(MTM12及びMTD85)、及びaMTDに融合したCRAタンパク質の発現のためのpET-28a(+)ベクターを、大腸菌BL21(DE3)株に形質転換した。細胞を、37℃にてカナマイシン(50μg/ml)を含有するLB培地において、勢いよく振盪しながら、成長させ、0.7mM IPTG(Biopure)を加えることにより、OD600=0.6にて、2時間37℃で誘導した。誘導した組換えタンパク質を15%SDS-PAGEゲルに添加し、Coomassie Brilliant Blue(InstantBlue、Expedeon、Novexin、英国)で染色した(図3)。
組換えタンパク質の定量的細胞透過性の決定
定量的細胞透過性のため、aMTD-又はrペプチド融合組換えタンパク質を、製造元(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、米国)の指示に従い、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)にコンジュゲートした。RAW264.7細胞を、10μM FITC標識組換えタンパク質で1時間37℃にて処理し、3回冷PBSで洗浄し、0.25%トリプシン/EDTA(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、米国)で20分間37℃にて処理して、細胞表面に結合したタンパク質を取り除いた。これらの組換えタンパク質の細胞透過性を、FlowJoサイトメトリー分析ソフトウエアを使用してフローサイトメトリー(Guava、Millipore、Darmstadt、ドイツ)により、分析した(図5〜6)。aMTDの相対的細胞透過性を測定し、陰性対照(rP38)及び参照疎水性CPP(MTM12及びMTD85)と比較した(表31)。
組換えタンパク質の細胞透過性及び細胞内局在性の決定
細胞透過性の視覚的参照のため、24ウェルチャンバースライドにおけるカバーガラス上で24時間、NIH3T3細胞を培養し、10μMのFITCコンジュゲート組換えタンパク質で1時間37℃にて処理し、3回冷PBSで洗浄した。処理した細胞を、4%パラホルムアルデヒド(PFA、Junsei、Tokyo、日本)にて10分間室温で固定し、3回PBSで洗浄し、VECTASHIELD Mounting Medium(Vector laboratories、Burlingame、CA、米国)でマウントし、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)で対比染色した。蛍光シグナルの細胞内局在性を、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM700、Zeiss、ドイツ;図7及び8)により決定した。
組換えタンパク質のための発現ベクターの構築
我々の新たに開発した技術、すなわち、aMTDに基づくMITTにより、細胞透過性組換えタンパク質を開発するための方法を改善するのが可能となった。発現ベクターを設計して、aMTD及び可溶化ドメインA(SDA)又は可溶化ドメインB(SDB)と融合しているパーキンタンパク質又は融合していないパーキンタンパク質を得た。組換えタンパク質のための発現ベクターを獲得するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を考案して、これらの組換えタンパク質を増幅した。
ヒスチジンタグ付きパーキン組換えタンパク質の発現及び精製
変性させた組換えタンパク質を、変性溶解緩衝液(8Mの尿素、10mMのトリス、100mMのNaH2PO4)を使用して溶解させ、Ni-NTA樹脂を添加することによって精製した。タンパク質に結合している樹脂を、30mLの変性洗浄緩衝液(8Mの尿素、10mMのトリス、20mのイミダゾール、100mMのNaH2PO4)を用いて3回洗浄した。タンパク質を、30mLの変性溶出緩衝液(8Mの尿素、10mMのトリス、250mMのイミダゾール)を用いて3回溶出した。精製の後、タンパク質を、リフォールディング緩衝液(550mMのグアニジン-HCl、440mMのL-アルギニン、50mMのトリス、100mMのNDSB、150mMのNaCl、2mMの還元型グルタチオン及び0.2mMの酸化型グルタチオン)に対して2回透析した。最後に、タンパク質を、生理的緩衝液、例えばDMEMに対して、透析量が300×105倍超に達するまで、4℃で透析した。精製したタンパク質の濃度を、ブラッドフォードアッセイを使用して、製造元の使用説明に従って定量化した。上記に示したように、タンパク質は、精製の後に、DMEMに対して透析された。最後に、IPTGによる誘発の前(-)及び後(+)の細胞可溶化液のSDS-PAGE分析を;Ni2+親和性により精製したタンパク質(P)の一定分量;並びに分子量標準物質(M)について実施して、標的タンパク質の存在を確認した(図19及び図20)。
パーキン組換えタンパク質の溶解性/収率の決定
SDA又はSDBを含有するaMTD融合パーキンタンパク質を、クローニングし、発現させ、精製し、変性条件下にある溶解性の形態として調製した。aMTD及び/又はSDに融合させたそれぞれの組換えタンパク質のそれらのサイズ(アミノ酸の数)、収率(mg/L)及び溶解性を、10%のSDS-PAGEゲル上で決定し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色した。溶解性を、それらの濁度(A450)を測定することによって、高度に溶解性のタンパク質であり、沈殿する傾向はほとんどない(+++++)から、概して不溶性のタンパク質(+)までの範囲に及ぶ5点評価によりスコア化した。また、それぞれの組換えタンパク質の収率(mg/L)も、生理的緩衝液の条件下において決定した。細胞透過性パーキン組換えタンパク質は、単一のバンドとして観察され、この場合、タンパク質を精製するこの手順で最終的に精製されたタンパク質の量は、最大46mg/Lであった(図19及び図20)。
ヒスチジンタグを含有しないパーキン融合タンパク質の発現及び精製
大腸菌に対してコドンが最適化され、ヒスチジンタグを含有しない、aMTDに融合している組換えパーキンタンパク質の配列もまた、特定のプライマー(表39)を用いて合成し、次いで最終的に、pET28a及びpET22b中にクローニングした。0.5〜0.7のA600まで成長させ、0.7mMのIPTGを用いて3時間誘発した大腸菌のBL21-CodonPlus(DE3)細胞中で、タンパク質を発現させた。細胞を収集し、緩衝液A(50mMのトリス-HCl;pH8.0、100mMのNaCl、0.1%のTriton X-100)中で30分間超音波処理すること(20秒間のオン/40秒間のオフ)によって破壊した。封入体を、遠心分離(5,000rpm、4Cにて30分間)により単離し、緩衝液B(50mMのトリス-HCl;pH10.0、8Mの尿素)中に溶解させて、一晩かけて変性させた。変性させた封入体を、緩衝液C(30mMのリン酸ナトリウム;pH8.0、0.02%のTween-20)に対して4℃で48時間透析して、リフォールディングさせた。不溶性の粒子を、遠心分離(9,000rpm、4μCにて30分間)により除去した。精製を、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、AKTA Purifier FPLCシステム(GE HealthCare、Pittsburgh、PA、米国)を用いて実施した。手短に述べると、Q-Sepharoseアニオン性カラムに、緩衝液C中のタンパク質溶液を流して、タンパク質を結合させ、緩衝液D(30mMのリン酸ナトリウム;pH8.0、30mMのNaCl)を用いて洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。タンパク質を、溶出緩衝液E(30mMのリン酸ナトリウム;pH8.0)の塩勾配(30mM〜1MのNaCl)を用いて溶出した。全ての組換えタンパク質が、大きな単一のピークとして溶出された。タンパク質を、精製の後に、生理的緩衝液に対して透析した。
パーキン組換えタンパク質の細胞内送達
細胞透過性を定量化するために、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に、製造元(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、米国)の使用説明に従ってコンジュゲートさせた。RAW264.7細胞(ATCC、米国)を、10μMのFITC標識化組換えタンパク質を用いて37℃で1時間処置し、冷PBSを用いて3回洗浄し、プロテイナーゼK(5μg/ml)を用いて37℃で10分間処置して、細胞表面に結合しているタンパク質を除去した。これらの組換えタンパク質の細胞透過性を、フローサイトメトリー(FACS Calibur;BD、Franklin Lakes、NJ、米国)により、FlowJo分析ソフトウエアを使用して分析した(図23)。図23に、陰性対照(rPeptide38)並びにこれまでに開発した疎水性CPP(MTM12及びMTD85)の細胞透過の効力を、参照として示し、aMTD321の細胞透過の効力を、SDAのみ(HSA)の効力と視覚的に比較した。aMTD321は、陰性対照(rPeptide38)並びにこれまでに開発した疎水性CPP(MTM12及びMTD85)と比較して、細胞透過性の目覚しい改善を示すことが確認された。
iCP-パーキン組換えタンパク質の細胞内局在化の決定
細胞透過性を視覚的に参照するために、NIH3T3細胞(ATCC、米国)を、24ウエルチャンバーのスライド中のカバーガラス上で24時間培養し;10μMのビヒクル(培地、DMEM)、FITCのみ、FITCコンジュゲート化された陰性対照(rP38)、FITCコンジュゲート化された、これまでに開発したCPP(MTM12及びMTD85)、FITCコンジュゲート化された組換えタンパク質(FITC-HP、FITC-HPSB、FITC-HM321P、FITC-HM321PSA、FITC-HM321PSB及びFITC-M524PSB)を用いて37℃で1時間処置し;冷PBSを用いて3回洗浄した。処置した細胞を、4%のパラホルムアルデヒド(PFA、Junsei、東京、日本)中で室温にて10分間固定し、PBSを用いて3回洗浄し、核染色のための標本を、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)を有するVECTASHIELD Mounting培地(Vector laboratories、Burlingame、CA、米国)を用いて処置した。蛍光シグナルの細胞内局在化を、同じ細胞について、共焦点レーザー走査顕微鏡法(上)及びNomarski干渉顕微鏡画像(LSM700、Zeiss、ドイツ)(下)により決定した(図24)。図24に示すように、aMTD321及びaMTD524が、これまでに開発したCPP(MTM12及びMTD85)と比較して優れた細胞透過性を示し、それらをSDと融合させると、透過性はさらに改善されることを確認した。
パーキン組換えタンパク質のin vivoにおける送達のPBMC中での決定
in vivoにおける送達を決定するために、ICRマウス(5週齢、雌)に、FITCのみ又はFITCコンジュゲート化タンパク質(FITC-HPSB及びFITC-HM321PSB)の腹腔内注射(IP、600μg/頭部)を行った。15分及び30分後に、末梢血単核球(PBMC)を、マウスの全血から単離し、フローサイトメトリー(BD、GUABA)により分析した(図25)。図25に示すように、aMTD/SD融合組換えタンパク質は、in vivoにおける優れた細胞透過性を示した。
パーキン組換えタンパク質のin vitroにおける送達のRAW264.7細胞及びNIH3T3細胞中での決定
in vitroにおける送達を決定するために、RAW264.7細胞を、FITCコンジュゲート化されたパーキン組換えタンパク質(FITC-HP、FITC-HM321P、FITC-HM321PSA、FITC-HM321PSB、及びFITC-M524PSB)10μMと共に、37℃で1時間インキュベートし(図26)、NIH3T3細胞を、FITCコンジュゲート化され、aMTD321配列を有するパーキン組換えタンパク質、又はFITCコンジュゲート化され、aMTD321配列を欠くパーキン組換えタンパク質(FITC-HPSB、及びFITC-HM321PSB)10μMと共に、37℃で1時間インキュベートした(図26)。
in vivoにおけるパーキン組換えタンパク質の組織透過性の決定
組織透過性を視覚的に参照するために、希釈剤、FITCのみ、並びに30mg/kgのFITC標識化パーキン組換えタンパク質(FITC-HP、FITC-HPSB、FITC-HM321P、FITC-HM321PSA、FITC-HM321PSB、及びFITC-M524PSB)を、ICRマウス(5週齢、雌)に腹腔内注射した。2時間後に、マウスを屠殺し、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓及び脳を単離し、OCT化合物(Sakura、Alphen anden Rijn、オランダ)を用いて包埋し、凍結し、次いで、20μmの厚さに切片化した。ガラス上に組織の標本を固定し、蛍光顕微鏡法(Nikon、東京、日本)により観察した(図27)。図27に示すように、aMTD/SD融合組換えパーキンタンパク質は、組織内に効率的に送達されることが確認された。
脳におけるパーキン組換えタンパク質の検出
免疫組織化学的検査のために、6週齢の雌のICRマウスに、希釈剤(PBS)又は600μgのヒスチジンタグ付きパーキン組換えタンパク質を腹腔内注射した。2時間後、マウスを、0.9%のNaClを用いて灌流し、4%の冷パラホルムアルデヒドを用いて固定した。脳を取り出した後、4%のパラホルムアルデヒドを用いて後固定し、30%のスクロースに移した。凍結しているミクロトームを使用して、脳を30μmの冠状切片に切断した。脳の凍結切片(30μm)を、抗パーキンモノクローナル抗体(1:100、Santa Cruz Biotechnology)、続いて、ビオチンコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体(Vector Laboratories)を用いて免疫染色し、Avidin-Biotin Complexキット(Vectastainキット、Vector Laboratories)を用いて発色させた。ウエスタンブロット分析のために、タンパク質を用いて処置したマウスを、0.9%のNaClを用いて灌流した。脳を単離し、線条体領域を解体し、溶解緩衝液(Intron、Seongnam、韓国)中でホモジナイズした。遠心分離(13,000rpm、4℃にて10分間)から得られた上清を、パーキン(1:200)及びβ-アクチン(1:2,000)に対する抗体を用いて探索するウエスタンブロットにより分析する。二次抗体は、ヤギ抗マウスIgG-HRPである(抗体は全て、Santa Cruz Biotechnology製であった)(図28a)。
E3リガーゼ活性の評価
製造元の使用説明に従って実施する自己ユビキチン化アッセイ(Boston Biochem)を使用することによって、パーキンE3リガーゼ活性を測定した。手短に述べると、1μgの精製したパーキンタンパク質を、0.1μMのE1、1μMのE2、50μMのユビキチン、及び10μMのMg-ATPと37℃で1時間反応させ、続いて、ウエスタンブロットを、抗ユビキチン抗体(1:1,000、Enzo Life Science)用いて行った。図30に示すように、本発明のiCP-パーキン組換えタンパク質は、(自己)ユビキチン化活性を示し、このことは、それらがE3リガーゼ活性を有することを示した。
神経細胞中のパーキン組換えタンパク質の抗アポトーシス作用
末端dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイを、製造元(Roche)の使用説明に従って実施する。マウスドーパミン作動性ニューロン(CATH.a)細胞(ATCC:American Type Culture Collection)を、(3×104個/ウエルで)播種し、70%のコンフルエンスのCATH.a細胞を、50μMの6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA、アゴニスト)を用いて、37℃で1時間前処置し、続いて、2.5μMのHP、パーキン組換えタンパク質(HM321P、HM321PSA、又はHM321PSB)を用いて、37℃で2.5時間処置し、アポトーシスについて、TUNEL染色により評価する。また、ヒト脳腫瘍(SH-SY5Y)細胞(Korea Cell Line Bank)も培養し、(3×104個/ウエルで)播種し、70%のコンフルエンスのSH-SY5Y細胞を、100μMの6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA、アゴニスト)を用いて、6時間前処置し、続いて、2.5μMのHP、パーキン組換えタンパク質(HM321P、HM321PSA、又はHM321PSB)を用いて、37℃で2.5時間処置し、アポトーシスについて、TUNEL染色により評価した。多くのaMTDsを、生物学的活性試験に同じ様式で付し、細胞死を、TUNEL染色及びアネキシンV染色により調べた。
α-シヌクレイン凝集体の分解の評価
静置インキュベーター中で、1mg/mlのα-シヌクレイン(ATGEN番号:SNA2001)を37℃で5週間凝集させることによって、α-シヌクレインオリゴマーを生成した。ヒト脳腫瘍(SH-SY5Y)細胞(Korea Cell Line Bank)を培養し、(3×105個/ウエルで)播種し、アポトーシスを誘発するために、1μMの凝集させたα-シヌクレインオリゴマーを用いて2時間前処置し、続いて、10μMのパーキン組換えタンパク質により、37℃で24時間同時処置し、トリパンブルー染色した後、変化を、細胞計数により分析した。
MPTP誘発パーキンソン病マウスモデル及び治療プロトコール
8週齢のC57BL/6マウス、雄及び雌を、温度及び湿度を制御した室内のプラスチックケージ中で、12時間の明所/12時間の暗所のサイクルにて飼育した。4つの実験の群(希釈剤、MPTPのみ、MPTP+HPSB、及びMPTP+HM321PSB又はMPTP+M524PSB)のうちの1つに、マウスを無作為に割り当てた。急性MPTP誘発PDモードについては、希釈剤の群を除く3つの群のマウスに、MPTPの腹腔内注射(15mg/kg、×3回/日、2時間間隔)を連続して3日間投与した。神経毒の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を、0.9%のNaCl中に溶解させた。対照は、0.9%のNaClを用いて、同じ期間にわたり処置した。3日後に、MPTP+HPSB群及びMPTP+HM321PSB群のマウスにそれぞれ、HPSB、HM321PSB組換えタンパク質の腹腔内注射(600μg /頭部、1回/日)を連続して5日間投与した。亜急性MPTP誘発PDモードについては、MPTP(30mg/kg/日)を、5日間腹腔内注射し、タンパク質(HPSB、HM321PSB)の注射を、9日目に開始し、5日間続けた。亜慢性MPTP誘発PDモードについては、MPTP(20mg/kg、×4回/日、2時間間隔)を1日腹腔内注射し、タンパク質(HPSB、M524PSB)の注射を、36日目に開始し、5日間続けた。尿及び脳のドーパミンレベル、全体的な運動機能、及び脳の病変(TH免疫染色)を、図34に示す後の日に分析した。我々は、動物実験が、Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って実施されることを確認している。(図34〜図42b)。
パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP-PD動物モデルの尿中のドーパミンの測定
合成されたドーパミンを尿中で測定するために、我々は、パーキン組換えタンパク質の処置の第1日目の10時間後に、全ての群のマウスの尿を収集した。尿中で合成されたドーパミンを、製造元(GenWay、San Diego、CA、米国)が提供する使用説明に従って市販のELISAキットを使用することによって測定した。手短に述べると、ウサギ抗ドーパミン抗体を、尿又は組織抽出物に添加し、免疫複合体を、ヤギ抗ウサギ抗体を用いてコートしたウエル中に回収した。異なるエピトープに対する、第2の、酵素コンジュゲート化抗ドーパミン抗体により、検量線に対して比較した場合の抗原の量に比例する反応産物が生じる。
パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP-PD動物モデルの、脳中のドーパミンの測定
脳中で合成されたドーパミンを測定するために、我々は、パーキン組換えタンパク質の処置の8日目の10時間後に、全ての群のマウスの脳を収集した。
パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP-PD動物モデルの、運動活動の水泳試験を用いる評価
MPTPによる病変を有するマウスの全体的な運動機能を、水泳試験を使用することによって評価する。MPTPによる最後の処置から9時間後にマウスを、600μgのタンパク質(IP、HPSB又はHM321PSB)を用いて3時間処置し、タンパク質処置の24時間後に、運動能力を、マウスを37℃の水浴中に入れ、その後の動きを映像により記録することによって評価した。各処置群中のマウスが四つ足運動に従事した時間のパーセントを、平均±S.D.として示す。各群中のマウスの数を、以下に示す:希釈剤、12匹;MPTPのみ、7匹;MPTP+HPSB、14匹;MPTP+HM321PSB、12匹。
パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP-PD動物モデルの、歩行運動試験及びロータロッド試験を用いる運動活動の評価
19-1.歩行運動試験
マウスを、10cmの高い壁を有する、長さ50cm、幅10cmの通路に沿って、閉鎖型のボックス内に歩行させた。足跡の分析において歩行の進行の方向(DoP)を示す点線を用いて測定したパラメータを示す。MPTPによる病変を有するマウスの足跡を、歩幅の長さ(cm)及びふらつきの長さ(cm)について評価した(図38)。歩幅の長さ及びふらつきの長さを、歩幅間及びふらつき間それぞれの前方への動きの平均距離として測定した。ヒストグラムは、差を示し、ここでは、4匹のマウスの群における歩幅の長さ及びふらつきの長さを、平均±S.D.として示す。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p<0.05)(図39及び図40)。
この実験のために、マウスを、MPTP注射の前に、15rpmのスピードで10分間3回トレーニングした。この実験では、MPTP注射の後に、マウスを、ロータロッド上に10分間置き、この間に、スピードを4rpmから30rpmまで加速させ、マウスが転倒するまでロータロッド上に留まる時間を測定した。この手順を、3回繰り返した。全て試験を、ビデオカメラを用いて記録した。
チロシンヒドロキシラーゼの発現の回復
図34に示すように、MPTMによる病変を有するマウスを、パーキン組換えタンパク質(IP、30mg/kg)を用いて5日間処置した。パーキン組換えタンパク質処置の最後の日に、マウスを、0.9%のNaClを用いて灌流し、4%の冷パラホルムアルデヒドを用いて固定した。次いで、脳を取り出し、4%のパラホルムアルデヒドを用いて後固定し、30%のスクロースに移した。凍結しているミクロトームを使用して、脳を30μmの冠状切片に切断した。脳内のドーパミン作動性神経細胞のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を、抗THモノクローナル抗体(1:50、Thermo Scientific、Rockford、米国)、続いて、ビオチン-コンジュゲート化ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:100、Santa Cruz Biotechnology、Santa cruz、CA)を用いて免疫染色し、ABCキット(Vectastainキット、Vector laboratories、Burlingame、CA)を用いて発色させた(図42a)。各処置群のTH陽性細胞のパーセントを計算した。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p<0.05)(図42b)。
統計学的分析
培養細胞を使用した実験データは全て、少なくとも3回の独立した実験についての平均±S.D.として表す。スチューデントの両側t検定又は分散分析法を使用して、統計学的有意性を評価する。スチューデントの対応のあるt検定を使用して、群間の実験の差を評価する。動物実験については、分散分析を使用し、群間及び群内で比較して、有意性を決定する。p<0.05を有する差を、統計学的に有意であるとみなす。
本発明に含まれる様々な態様を以下に示す。
1.パーキンタンパク質、及び9〜13個のアミノ酸配列で構成され、細胞又は組織に対する改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)を含む、iCP(細胞透過性が改善された)パーキン組換えタンパク質であって、
aMTDが、パーキンタンパク質の一方の末端又は両方の末端に融合しており、以下の特徴:
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有する
を有する、
iCPパーキン組換えタンパク質。
2.1つ以上の可溶化ドメイン(SD)が、パーキンタンパク質及びaMTDのうちの1つ以上の末端にさらに融合している、上記1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
3.aMTDがα-へリックス構造を有する、上記1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
4.aMTDが、12個のアミノ酸配列で構成されており、以下の一般式:
[一般式]
により示される、
上記1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
5.以下の構造式のいずれか1つ:
A-B-C及びA-C-B-C
[式中、Aは、細胞又は組織に対する改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)であり、Bは、パーキンタンパク質であり、Cは、可溶化ドメイン(SD)であり、
aMTDが、9〜13個のアミノ酸配列で構成されており、以下の特徴:
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有し、
(d)α-へリックス構造を有する
を有する]
により示される、iCPパーキン組換えタンパク質。
6.パーキンタンパク質が、配列番号814のアミノ酸配列を有する、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
7.パーキンタンパク質が、配列番号815のポリヌクレオチド配列によりコードされる、上記6に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
8.パーキンタンパク質が、細胞、組織又は臓器の受容体に選択的に結合するリガンドをさらに含む、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
9.aMTDが、配列番号1〜240からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
10.aMTDが、配列番号241〜480からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、上記9に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
11.SDが、配列番号798、799、800、801、802、803及び804からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する、上記2又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
12.SDが、配列番号805、806、807、808、809、810及び811からなる群から独立に選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、上記11に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
13.その一方の末端に融合したヒスチジンタグ親和性ドメインをさらに有する、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
14.ヒスチジンタグ親和性ドメインが、配列番号812のアミノ酸配列を有する、上記13に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
15.ヒスチジンタグ親和性ドメインが、配列番号813のポリヌクレオチド配列によりコードされる、上記14に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
16.融合が、ペプチド結合又は化学的な結合を介して形成される、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
17.パーキンソン関連疾患の治療又は予防のために使用される、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
18.上記1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
19.配列番号816又は配列番号822により示される、上記18に記載のポリヌクレオチド配列。
20.上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
21.配列番号818、824、828、830及び832からなる群から選択される、上記20に記載のポリヌクレオチド配列。
22.上記18又は上記20に記載のポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
23.上記22に記載の組換え発現ベクターを用いて形質転換された形質転換体。
24.上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の調製方法であって、
上記22に記載の組換え発現ベクターを調製するステップと、
組換え発現ベクターを使用して、形質転換体を調製するステップと、
形質転換体を培養するステップと、
培養のステップにより発現した組換えタンパク質を回収するステップと
を含む調製方法。
25.上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を活性成分として含む組成物。
26.パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、活性成分としての、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
27.パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品としての、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の使用。
28.上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を含む医薬品。
29.パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品の調製ための、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の使用。
30.対象においてパーキンソン関連疾患を治療又は予防する方法であって、
パーキンソン関連疾患の治療又は予防を必要とする対象を同定するステップと、
治療有効量の上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を対象に投与するステップと
を含む方法。
Claims (30)
- パーキンタンパク質、及び9〜13個のアミノ酸配列で構成され、細胞又は組織に対する改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)を含む、iCP(細胞透過性が改善された)パーキン組換えタンパク質であって、
aMTDが、パーキンタンパク質の一方の末端又は両方の末端に融合しており、以下の特徴:
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有する
を有する、
iCPパーキン組換えタンパク質。 - 1つ以上の可溶化ドメイン(SD)が、パーキンタンパク質及びaMTDのうちの1つ以上の末端にさらに融合している、請求項1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- aMTDがα-へリックス構造を有する、請求項1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- aMTDが、12個のアミノ酸配列で構成されており、以下の一般式:
[一般式]
により示される、
請求項1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。 - 以下の構造式のいずれか1つ:
A-B-C及びA-C-B-C
[式中、Aは、細胞又は組織に対する改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)であり、Bは、パーキンタンパク質であり、Cは、可溶化ドメイン(SD)であり、
aMTDが、9〜13個のアミノ酸配列で構成されており、以下の特徴:
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有し、
(d)α-へリックス構造を有する
を有する]
により示される、iCPパーキン組換えタンパク質。 - パーキンタンパク質が、配列番号814のアミノ酸配列を有する、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- パーキンタンパク質が、配列番号815のポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項6に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- パーキンタンパク質が、細胞、組織又は臓器の受容体に選択的に結合するリガンドをさらに含む、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- aMTDが、配列番号1〜240からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- aMTDが、配列番号241〜480からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項9に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- SDが、配列番号798、799、800、801、802、803及び804からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する、請求項2又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- SDが、配列番号805、806、807、808、809、810及び811からなる群から独立に選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項11に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- その一方の末端に融合したヒスチジンタグ親和性ドメインをさらに有する、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- ヒスチジンタグ親和性ドメインが、配列番号812のアミノ酸配列を有する、請求項13に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- ヒスチジンタグ親和性ドメインが、配列番号813のポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項14に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- 融合が、ペプチド結合又は化学的な結合を介して形成される、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- パーキンソン関連疾患の治療又は予防のために使用される、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
- 請求項1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
- 配列番号816又は配列番号822により示される、請求項18に記載のポリヌクレオチド配列。
- 請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
- 配列番号818、824、828、830及び832からなる群から選択される、請求項20に記載のポリヌクレオチド配列。
- 請求項18又は請求項20に記載のポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
- 請求項22に記載の組換え発現ベクターを用いて形質転換された形質転換体。
- 請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の調製方法であって、
請求項22に記載の組換え発現ベクターを調製するステップと、
組換え発現ベクターを使用して、形質転換体を調製するステップと、
形質転換体を培養するステップと、
培養のステップにより発現した組換えタンパク質を回収するステップと
を含む調製方法。 - 請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を活性成分として含む組成物。
- パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、活性成分としての、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品としての、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の使用。
- 請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を含む医薬品。
- パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品の調製ための、請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の使用。
- 対象においてパーキンソン関連疾患を治療又は予防する方法であって、
パーキンソン関連疾患の治療又は予防を必要とする対象を同定するステップと、
治療有効量の請求項1又は請求項5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を対象に投与するステップと
を含む方法。
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