KR102132311B1 - 향상된 세포 투과성(icp) 파킨 재조합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
향상된 세포 투과성(icp) 파킨 재조합 단백질 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102132311B1 KR102132311B1 KR1020187005889A KR20187005889A KR102132311B1 KR 102132311 B1 KR102132311 B1 KR 102132311B1 KR 1020187005889 A KR1020187005889 A KR 1020187005889A KR 20187005889 A KR20187005889 A KR 20187005889A KR 102132311 B1 KR102132311 B1 KR 102132311B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ala
- val
- sequence
- parkin
- amino acid
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/53—Ligases (6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
- C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
- C12Y603/02019—Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/9015—Ligases (6)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Abstract
본 발명의 iCP-파킨 재조합 단백질은 도파민성 신경 세포를 보호하고 도파민의 분비를 조절함으로써 파킨슨병을 치료하기 위한 단백질 기반 항신경퇴행성 제제로서 임상 연구에 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 시험관내 및 생체내에서 거대분자의 세포 투과성을 제공하는 새롭게 향상된 소수성 CPP(세포 투과성 펩타이드)-향상된 거대분자 전달 도메인(advanced macromolecule transduction domain; aMTD)으로 가능하게 된 거대분자 세포내 전달 기술(MITT)에 기초하여 특히 신경퇴행성 장애를 표적화하는 새로운 단백질 기반 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질은 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성, 조직 투과성, 및 생체전달 기능을 해결할 수 있다는 점에서 파킨슨병의 치료를 위한 세포내 단백질 요법으로서 새로운 기술적 이점을 갖는다.
파킨슨병은 도파민의 불안정한 생성과 분비에 의해 발생하는 주요한 신경퇴행성 질환 중 하나이다(16). 파킨슨병 환자에서는, 중뇌에서 도파민성 신경세포의 손상; 루이소체 형성과 같은 병리학적 특징; 운동완만증(bradykinesia), 휴식진전(rest tremor), 경직과 같은 이동성 결함; 우울증, 치매, 및 불면증과 같은 비운동 증상이 있었다(17-19).
파킨슨병은 주로 나이든 세대에서 발견되는 신경퇴행성 질환이다. 통계적으로, 55세가 넘는 사람들의 약 1%와 75세가 넘는 사람들의 3%가 상기 질환으로 진단받았다(20). 노령 인구가 증가함에 따라 파킨슨병으로 진단받은 환자의 수가 계속 증가하고 있다. 전 세계적으로 이 질환을 갖는 환자의 인구는 2005년에 410만 명에서 2030년에는 870만 명으로 증가할 것으로 예상된다(21, 22).
파킨슨병의 원인은 불분명하지만, 이전의 연구들은 그것이 유전적 요인과 환경적 요인의 조합에 의해 유발된다고 보고하였으며, 특히 파킨슨병을 유발하는 다양한 유전적 요인 중에서 파킨 유전자의 돌연변이가 가장 많다. 파킨 유전자는 상 염색체 열성 유년기 파킨슨병(ARJP)을 갖는 일본 혈통에서 처음 발견되었다(23). 파킨 유전자 돌연변이는 조기에 발생하는 유전성 파킨슨병의 약 50%와 50세 미만의 산발성 환자의 18%에서 발견될 수 있다(24).
파킨은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에서 E3-라이게이즈로서 기능하는 465개 아미노산 서열로 구성된다. 파킨 단백질은 세포 내부에 있는 손상되고, 산화되고/되거나 불규칙하게 구조화된 단백질을 제거하여 세포에서 산화 스트레스를 감소시키는 기능을 한다.
파킨 돌연변이가 발생하면 그것은 E3-라이게이즈로서의 특성을 상실하며; 봉입체 및/또는 불규칙 단백질이 세포 내부에 축적되어 도파민의 분비 감소 및 도파민성 신경세포의 세포자멸사를 유도한다(25). 초파리를 사용한 파킨슨병에 관한 최근 연구가 있었으며, 이는 도파민 분비의 감소에 의한 운동 기능의 감소를 보였다. 도파민 분비는 파킨과 PINK1(PTEN 유도 추정 키나아제 1)의 기능이 밝혀진 도파민성 신경세포의 불활성화로 인해 감소하였다(26). 또한 PINK1을 발현하지 않은 초파리에서 파킨이 과발현되었을 때, 미토콘드리아 기능 장애 및 도파민성 신경세포의 분해와 같은 PINK1에 의해 유발되는 파킨슨병 관련 증상은 회복된 것으로 확인되었다(26-28). 이러한 요인을 바탕으로, 파킨 단백질은 파킨슨 관련 질환을 치료하기 위한 표적 단백질 기반 제제로서 성공적으로 작용할 수 있다. 그것은 산화 스트레스로부터 미토콘드리아의 기능을 유지함으로써 봉입체를 파괴하고 도파민성 신경세포의 세포자멸사를 억제하는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에서 주요 효소로서 기능한다.
[참고문헌]
1. Fischer PM., Cellular uptake mechanisms and potential therapeutic utility of peptidic cell delivery vectors: progress 2001-2006, Med Res Rev. 2007;27:755-95.
2. Heitz F, Morris MC, Divita G., Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics, Br J Pharmacol. 2009;157:195-206.
3. Lapenna S, Giordano A., Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer, Nat Rev Drug Discov. 2009;8:547-66.
4. Lim J, Kim J, Duong T, Lee G, Kim J, Yoon J. et al., Antitumor activity of cell-permeable p18(INK4c) with enhanced membrane and tissue penetration, Mol Ther. 2012;20:1540-9.
5. Jo D, Liu D, Yao S, Collins RD, Hawiger J., Intracellular protein therapy with SOCS3 inhibits inflammation and apoptosis, Nat Med. 2005;11:892-8.
6. Jo D, Nashabi A, Doxsee C, Lin Q, Unutmaz D, Chen J. et al., Epigenetic regulation of gene structure and function with a cell-permeable Cre recombinase, Nat Biotechnol. 2001;19:929-33.
7. Liu D, Li C, Chen Y, Burnett C, Liu XY, Downs S. et al., Nuclear import of proinflammatory transcription factors is required for massive liver apoptosis induced by bacterial lipopolysaccharide, J Biol Chem. 2004;279:48434-42.
8. Liu D, Liu XY, Robinson D, Burnett C, Jackson C, Seele L. et al., Suppression of Staphylococcal Enterotoxin B-induced Toxicity by a Nuclear Import Inhibitor, J Biol Chem. 2004;279:19239-46.
9. Liu D, Zienkiewicz J, DiGiandomenico A, Hawiger J., Suppression of acute lung inflammation by intracellular peptide delivery of a nuclear import inhibitor, Mol Ther. 2009;17:796-802.
10. Moore DJ, Zienkiewicz J, Kendall PL, Liu D, Liu X, Veach RA. et al., In vivo islet protection by a nuclear import inhibitor in a mouse model of type 1 diabetes, PLoS One. 2010;5:e13235.
11. Lim J, Jang G, Kang S, Lee G, Nga do TT, Phuong do TL. et al., Cell-.permeable NM23 blocks the maintenance and progression of established pulmonary metastasis, Cancer Res. 2011;71:7216-25.
12. Duong T, Kim J, Ruley HE, Jo D., Cell-permeable parkin proteins suppress Parkinson disease-associated phenotypes in cultured cells and animals, PLoS One. 2014;9:e102517.
13. Lim J, Duong T, Do N, Do P, Kim J, Kim H. et al., Antitumor activity of cell-permeable RUNX3 protein in gastric cancer cells. Clin Cancer Res. 2013;19:680-90.
14. Lim J, Duong T, Lee G, Seong BL, El-Rifai W, Ruley HE et al. The effect of intracellular protein delivery on the anti-tumor activity of recombinant human endostatin, Biomaterials. 2013;34:6261-71.
15. Lim J, Kim J, Kang J, Jo D., Partial somatic to stem cell transformations induced by cell-permeable reprogramming factors, Scientific Reports. 2014;4:4361.
16. Braak H, Del Tredici K, Rub U, de Vos RA, Jansen Steur EN, Braak E., Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease, Neurobiology of aging 2003;24(2):197-211.
17. Wakabayashi K, Tanji K, Mori F, Takahashi H., The Lewy body in Parkinson's disease: molecules implicated in the formation and degradation of alpha-synuclein aggregates, Neuropathology : Official Journal of the Japanese Society of Neuropathology 2007;27(5):494-506.
18. Rampello L, Chiechio S, Raffaele R, Vecchio I, Nicoletti F., The SSRI, citalopram, improves bradykinesia in patients with Parkinson's disease treated with L-dopa., Clinical neuropharmacology 2002;25(1):21-4.
19. Rana AQ, Ahmed US, Chaudry ZM, Vasan S., Parkinson's disease: a review of non-motor symptoms, Expert Review of Neurotherapeutics 2015;15(5):549-62.
20. de Rijk MC, Tzourio C, Breteler MM, Dartigues JF, Amaducci L, Lopez-Pousa S, et al., Prevalence of parkinsonism and Parkinson's disease in Europe: the EUROPARKINSON Collaborative Study. European Community Concerted Action on the Epidemiology of Parkinson's disease, J Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry 1997;62(1):10-5.
21. Dorsey ER, Constantinescu R, Thompson JP, Biglan KM, Holloway RG, Kieburtz K, et al., Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations 2005 through 2030., Neurology 2007;68(5):384-6.
22. Koziorowski D, Hoffman-Zacharska D, Slawek J, Szirkowiec W, Janik P, Bal J, et al., Low frequency of the PARK2 gene mutations in Polish patients with the early-onset form of Parkinson disease, Parkinsonism & related disorders 2010;16(2):136-8.
23. Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, Minoshima S, et al., Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism, Nature 1998;392(6676):605-8.
24. Lucking CB, Durr A, Bonifati V, Vaughan J, De Michele G, Gasser T, et al. Association between early-onset Parkinson's disease and mutations in the parkin gene. The New England journal of medicine 2000;342(21):1560-7.
25. Lam YA, Pickart CM, Alban A, Landon M, Jamieson C, Ramage R, et al., Inhibition of the ubiquitin-proteasome system in Alzheimer's disease, PNAS 2000;97(18):9902-6.
26. Park J, Lee SB, Lee S, Kim Y, Song S, Kim S, et al., Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin, Nature 2006;441(7097):1157-61.
27. Yang Y, Gehrke S, Imai Y, Huang Z, Ouyang Y, Wang JW, et al., Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin, PNAS 2006;103(28):10793-8.
28. Clark IE, Dodson MW, Jiang C, Cao JH, Huh JR, Seol JH, et al., Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin, Nature 2006;441(7097):1162-6.
파킨 단백질과 같은 거대분자는 세포막을 가로질러 이동할 수 없으며, 게다가 그것은 혈액-뇌-장벽을 통해 뇌로 수송될 수 없다. 따라서, 거대분자를 세포/조직으로 이동시킬 수 있는 거대분자 세포내 전달 기술(MITT)을 개발할 필요가 있었다.
이전 연구에서, 섬유아세포 성장 인자 4(FGF4)의 소수성 신호 펩타이드에서 유래된, 막 전좌 서열(MTS) 및 막 전좌 모티프(MTM)로 명명된 MITT 기반의 소수성 CPP가 보고되었으며, 동물에서 전신으로 파킨 단백질과 같은 생물학적 활성 펩타이드 및 단백질을 전달하는데 사용되었다.
그러나, 이들은 생체내에서 파킨 단백질을 효과적으로 전달할 수 없었고, 이들의 생체내 전달 효율은 또한 단백질 응집, 낮은 용해도/수율 및 좋지 못한 세포/조직 투과성 때문에 충분하지 못하였다.
한계를 극복하고 시험관내 및 생체내에서 거대 분자의 세포 투과성을 제공하는 CPP를 향상시키기 위해, CPP의 세포내 전달 잠재성을 향상시키는 이론적 결정 인자(critical factor; CF)가 본 발명에서 확인되고 검증된다. 결정된 CF에 기초하여, 신규한 소수성 CPP 서열이 새롭게 생성되고, 세포 투과성이 정량적으로 평가되며, 살아있는 세포에서 이들의 세포내 전달 잠재성에서 레퍼런스 CPP 서열과 상호 비교된다. 본 발명에서, 새롭게 개발된 소수성 CPP가 제시된다. '개선된 거대분자 전달 도메인'(aMTD)으로 불리는 신규 펩타이드 서열은 다양한 상이한 치료용 단백질에 융합되어 aMTD 융합된 재조합 단백질을 살아있는 세포 및 동물 조직으로 전신적으로 전달할 수 있다. 이들 단백질은 단백질 요법과 관련하여 다양한 인간 질환을 치료하기 위한 단백질 기반의 바이오치료제의 임상 개발 및 적용에 큰 영향을 미칠 것이다.
파킨슨병은 흑색질 내의 도파민성 신경세포의 소실로 인한 도파민의 불안정한 분비에서 비롯되는 운동을 결함시키는 진행성 신경퇴행성 장애이다. 따라서, 손상된 도파민성 신경세포의 회복을 통한 도파민 분비의 조절은 파킨슨병의 치료에 필수적일 것이다.
향상된 세포 투과성(improved Cell-Permeable) 파킨 재조합 단백질(iCP-Parkin)에 기반한 거대분자 세포내 전달 기술은 재조합 단백질을 뇌에 효과적으로 전달하는 효율적인 BBB 침투를 위한 단백질 기반 항신경퇴행성 제제로서 개발되었다.
도파민성 신경세포 사멸 억제제인 파킨 단백질은 재조합 단백질의 용해도/수율 및 세포/조직 투과성을 증가시키기 위해 새롭게 개발된 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 및 바람직하게는 가용화 도메인(solubilization domain; SD)과 융합되어 왔다. 또한, 새롭게 개발된 aMTD/SD 융합된 재조합 iCP-파킨 단백질은 BBB 투과성을 나타내었다. 시험관내 및 생체내 모두에서, iCP-파킨 재조합 단백질은 도파민성 신경 세포의 세포자멸사를 억제하여 뇌의 도파민 수준을 증가시킴으로써 파킨슨병의 전형적인 표현형인 운동 기능을 개선하였다.
본 발명은 단백질, 펩타이드, 핵산, 화학 물질 등을 포함하는 생물학적 활성 거대분자가 세포 내의 원형질 막을 가로지르는 것을 용이하게 하는, 생의학, 전임상 및 임상 연구에 적용가능한 세포 투과성을 갖는, 무제한의 디자인에 적용될 수 있는 베이스라인 플랫폼에 관한 것이다.
본 발명은 aMTD 서열의 세포 투과성을 용이하게 하는 이들 결정 인자를 분석, 확인 및 결정한다. 이러한 aMTD 서열은 이전에 공개된 소수성 CPP의 심층 분석으로부터 결정된 결정 인자(CF)를 기초하여 인위적으로 조립된다.
본 발명의 일 양태는 신규한 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열에 관한 것이다.
본 발명의 aMTD 서열은 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 도메인 또는 전장 단백질을 포함하는 생물학적 활성 거대분자의 세포의 원형질 막을 통한 전달을 매개할 수 있는 최초의 인위적으로 개발된 세포 투과성 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 aMTD 서열을 생물학적 활성 카고 분자에 융합시킴으로써 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 aMTD가 생물학적 활성 카고 분자에 부착된, 세포 투과성 재조합 단백질을 포함하는 생물학적 활성 분자의 세포로의 전달을 위한 그의 치료적 적용에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 활성 거대분자에 융합된 aMTD 서열로 구성된 세포 투과성 재조합 단백질의 구조물로서, 생물학적 활성 거대분자가 살아있는 세포 내로 진입할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 분자 전달, 약물 전달, 단백질 요법, 세포내 단백질 요법, 단백질 대체 요법, 펩타이드 요법, 유전자 전달 등을 위한 aMTD 서열의 효율적인 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 240개의 새로운 소수성 CPP 서열 - aMTD, 재조합 단백질의 aMTD 매개된 세포내 전달 활성의 결정, 및 FGF4 유래의 MTS/MTM 및 HRSS 유래의 MTD 서열보다 크거나 같은 수준에서 살아있는 세포에 의한 증강된 단백질 흡수의 비교에 관한 것이다. 새롭게 발명된 aMTD의 이러한 장점은 임상 개발 및 적용을 위한 레퍼런스 소수성 CPP의 어려움을 해결할 수 있다.
본 발명은 생물학적 활성 거대분자를 원형질 막 내로 전달하는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기 특성(characteristic)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 aMTD에 관한 것이다:
a. 아미노산 길이: 9 - 13
b. 굽힘 잠재성(Bending Potential): 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단(12')에 위치한 프롤린(P)
c. 강성(Rigidity)/유연성(Flexibility): 불안정성 지수(II): 40 - 60
d. 구조적 특징(feature): 지방족 지수(AI): 180 - 220
e. 소수성 지수(Hydropathy): GRAVY(grand average of hydropathy): 2.1 - 2.6
f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
일 구현예에 따르면, 아미노산 서열은 하기 기재된 바와 같이 12개의 아미노산 서열로 구성된 일반식을 갖는다.
[일반식]
상기 식에서, X(들)는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하고; 프롤린(P)이 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8')에 위치할 수 있다. 나머지 U(들)는 A, V, L 또는 I로 구성된다. 12'에 있는 P는 프롤린이다.
일 구현예에 따르면, 상기 일반식을 갖는 아미노산 서열은 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에 따르면, aMTD의 이차 구조는 α-나선이다.
본 발명은 전술한 aMTD 서열을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 241 내지 서열번호: 480으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 aMTD의 결정 인자를 확인하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 종래 공개된 레퍼런스 소수성 CPP로부터 우수한 소수성 CPP를 선택하는 단계; 상기 선택된 소수성 CPP의 생리학적 및 화학적 특성을 분석하는 단계; 이러한 생리학적 및 화학적 특성 중에서 세포 투과성과 연관되어 있는 특징을 확인하는 단계; 종래 공개된 레퍼런스 소수성 CPP를 적어도 2개의 그룹으로 분류하고 세포 투과성 및 상대적 특성에 따른 CPP의 각 그룹의 심층 분석에 의해 독특한 특징(unique feature)을 결정하는 단계; 상기 결정된 독특한 특징의 분석을 통해 확인된 결정 인자(critical factor)를 구성하는 단계; 실험적 연구를 통해 상기 결정 인자가 유효한지 확인하는 단계; 및 상기 확인된 실험적 연구에 기초하여 결정 인자를 결정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 확인된 독특한 특징은 아미노산 길이, 분자량, pI 값, 굽힘 잠재성, 강성, 유연성, 구조적 특징, 소수성 지수, 잔기 구조, 아미노산 조성 및 이차 구조이다.
일 구현예에 따르면, 상기 결정된 6개의 결정 인자는 하기 특성으로 이루어진다:
a. 아미노산 길이: 9 - 13
b. 굽힘 잠재성: 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 위치한 프롤린(P)
c. 강성/유연성: 불안정성 지수(II): 40 - 60
d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 180 - 220
e. 소수성 지수: GRAVY: 2.1 - 2.6
f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
G. 이차 구조: α-나선
본 발명은 aMTD 서열을 개발하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 하기 기재된 하기 일반식을 갖는 aMTD의 플랫폼을 디자인하는 단계;
[일반식]
여기서, 서열의 말단(12')의 (P)는 프롤린이고, U 부위 중 하나는 프롤린이며, 프롤린이 아닌 X(들) 및 U(들)는 A, V, L 및/또는 I이고; 디자인된 아미노산 서열이 하기와 같이 6개 결정 인자를 만족하는지 확인하는 단계를 포함한다:
a. 아미노산 서열: 9 - 13
b. 굽힘 잠재성: 프롤린(P)이 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단(12')에 위치함
c. 강성/유연성: 불안정성 지수(II): 40 - 60
d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 180 - 220
e. 소수성 지수: GRAVY: 2.1 - 2.6
f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
일 구현예에 따르면, aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법에 의해 얻은 6개의 결정 인자는 하기 인자로 이루어진다:
a. 아미노산 서열: 12
b. 굽힘 잠재성: 프롤린(P)이 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단(12')에 위치함
c. 강성/유연성: 불안정성 지수(II): 41.3 - 57.3
d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 187.5 - 220
e. 소수성 지수: GRAVY: 2.2 - 2.6
f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
일 구현예에 따르면, aMTD의 이차 구조는 α-나선이다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 카고 단백질에 융합된 aMTD 서열의 발현 벡터를 개발하는 단계; 유도성 발현을 위한 적절한 박테리아 균주를 선택하는 단계; 카고 단백질에 융합된 aMTD를 가용성 형태로 정제하고 제조하는 단계; 및 이들의 세포 투과성을 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 세포 투과성을 갖는 단리된 재조합 단백질을 추가로 제공한다. 상기 단리된 재조합 단백질은 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열; 및 생물학적 활성 분자를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 생물학적 활성 분자는 성장 인자, 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
일 구현예에 따르면, 생물학적 활성 분자는 효소, 호르몬, 담체, 면역글로불린, 항체, 구조 단백질, 운동 기능 펩타이드, 수용체, 신호전달 펩타이드, 저장 펩타이드, 막 펩타이드, 막관통 펩타이드, 내부 펩타이드, 외부 펩타이드, 분비성 펩타이드, 바이러스 펩타이드, 천연(native) 펩타이드, 당화된 단백질, 단편화된 단백질, 디설파이드 결합 단백질, 재조합 단백질, 화학적으로 변형된 단백질 및 프리온으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이다.
일 구현예에 따르면, 생물학적 활성 분자는 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNA, 안티센스 RNA 분자, 탄수화물, 지질 및 당지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
일 구현예에 따르면, 생물학적 활성 분자는 바이오치료용 화학물질 및 독성 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.
본 발명은 생물학적 활성 분자를 세포 투과성을 갖도록 유전적으로 또는 후생유전적으로 조작 및/또는 변형하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 최적화되고 효과적인 조건 하에 aMTD를 생물학적 활성 분자에 융합시켜 세포 투과성일 수 있는 생물학적 활성 분자를 생성하는 것을 포함하며, 상기 aMTD는 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진다.
본 발명은 또한 생물학적 활성 거대분자를 살아있는 세포 내로 전달하는 것을 매개할 수 있는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열에 기반한 파킨슨병의 치료를 위한 세포 투과성 재조합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 약물 전달, 단백질 요법, 세포내 단백질 요법, 단백질 대체 요법 및 펩타이드 요법을 위한 aMTD 서열의 효율적인 용도에 기반한 파킨슨병을 위한 세포-/조직-/BBB-투과성 단백질 기반 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 파킨 단백질 및 9~13개 아미노산 서열로 구성되고 향상된 세포 또는 조직 투과성을 갖는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)을 포함하는 iCP(향상된 세포 투과성) 파킨 재조합 단백질을 제공하며, aMTD는 파킨 단백질의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 융합되고 하기 특징을 갖는다:
(a) Ala, Val, Ile, Leu 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열로 구성됨;
(b) 그 아미노산 서열의 위치 5 내지 8 및 12 중 어느 하나 이상에 상응하는 아미노산 서열로서 프롤린을 가짐; 및
(c) 프로트파람(Protparam)으로 측정시, 40-60의 불안정성 지수; 180-220의 지방족 지수; 및 2.1-2.6의 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)을 가짐.
일 구현예에 따르면, 하나 이상의 가용화 도메인(SD)(들)은 파킨 단백질 및 aMTD 중 하나 이상의 말단에 추가로 융합된다.
또 다른 구현예에 따르면, aMTD는 α-나선 구조를 가질 수 있다. 또 다른 실시 양태에 따르면, aMTD는 12개의 아미노산 서열로 구성되고 하기 일반식으로 표시될 수 있다:
[일반식]
여기서, X(들)는 독립적으로 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하며; 프롤린(P)은 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8' 중 하나)에 위치할 수 있다. 나머지 U(들)는 독립적으로 A, V, L 또는 I로 구성되며, 12'에서의 P는 프롤린이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 iCP 파킨 재조합 단백질을 제공한다:
A-B-C 및 A-C-B-C
여기서, A는 향상된 세포 또는 조직 투과성을 갖는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)이고, B는 파킨 단백질이며, C는 가용화 도메인(SD)이고;
aMTD는 9~13개의 아미노산 서열로 구성되고 하기 특징을 갖는다:
(a) Ala, Val, Ile, Leu 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열로 구성됨;
(b) 그 아미노산 서열의 위치 5 내지 8 및 12 중 어느 하나 이상에 상응하는 아미노산 서열로서 프롤린을 가짐; 및
(c) 프로트파람으로 측정시, 40-60의 불안정성 지수; 180-220의 지방족 지수; 및 2.1-2.6의 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)을 가짐;
(d) α-나선 구조를 가짐.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 파킨 단백질은 서열번호: 814의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 파킨 단백질은 서열번호: 815의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 파킨 단백질은 세포, 조직 또는 기관의 수용체에 선택적으로 결합하는 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, aMTD는 서열번호: 1~240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, aMTD는 서열번호: 241~480으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, SD(들)는 서열번호: 798, 799, 800, 801, 802, 803 및 804로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, SD(들)는 서열번호: 805, 806, 807, 808, 809, 810 및 811로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, iCP 파킨 재조합 단백질은 그의 한쪽 말단에 추가로 융합된 히스티딘-태그 친화성 도메인을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 히스티딘-태그 친화성 도메인은 서열번호: 812의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 히스티딘-태그 친화성 도메인은 서열번호: 813의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 융합은 펩타이드 결합 또는 화학 결합을 통해 형성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, iCP 파킨 재조합 단백질은 파킨슨 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 iCP 파킨 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 816 또는 서열번호: 822로 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 818, 824, 828, 830 및 832로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 재조합 발현 벡터를 사용하여 형질전환체를 제조하는 단계; 형질전환체를 배양하는 단계; 및 배양에 의해 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 iCP 파킨 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 iCP 파킨 재조합 단백질을 활성 성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 활성 성분으로서 iCP 파킨 재조합 단백질; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 파킨슨병을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 파킨슨 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제로서 iCP 파킨 재조합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 iCP 파킨 재조합 단백질을 포함하는 약제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 파킨슨 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 iCP 파킨 재조합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 파킨슨 관련 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계; 및 상기 대상에게 치료적 유효량의 iCP 파킨 재조합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 파킨슨 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 대상은 포유동물일 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 특정 방법 및 물질이 본원에 기재되었지만, 이에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 이들과 임의의 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 다르게 명확히 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
본 발명의 "펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기에 의해 형성된 사슬형 중합체를 지칭하며, "폴리펩타이드"와 상호교환적으로 사용된다. 또한, "폴리펩타이드"는 펩타이드 및 단백질을 포함한다.
또한, 용어 "펩타이드"는 본원에 구체적으로 예시된 펩타이드의 보존적 변이인 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "보존적 변이"는 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 잔기로 대체되는 것을 의미한다. 보존적 변이의 예는 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 또 다른 잔기로 치환하거나, 하나의 극성 잔기를 또 다른 잔기로 치환하는 것, 예를 들어, 리신에 대한 아르기닌의 치환, 아스파르트산에 대한 글루탐산의 치환 또는 아스파라긴에 대한 글루타민의 치환 등을 포함한다. 서로 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌을 포함한다.
용어 "보존적 변이"는 치환된 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체가 치환되지 않은 폴리 펩타이드와도 면역 반응하는 한, 치환되지 않은 모(parent) 아미노산 대신에 치환된 아미노산을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 보존적 치환은 본 발명의 펩타이드 부류의 정의에 속한다.
본 기술분야에서 숙련된 기술을 가진 자는 세포 투과성이 높고 숙주 범위가 넓은 펩타이드를 수득하기 위해 유사한 치환을 할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드의 세포 투과성이 유지되는 한, 본 발명은 본원에 제공된 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호: 1 내지 240)에 상응하는 펩타이드뿐만 아니라 그의 유사체, 동족체, 이성질체, 유도체, 아미드화된 변이체 및 보존적 변이체를 제공한다.
본 발명의 펩타이드의 1차 아미노산 서열에 대한 약간의 변형은 본원에 기재된 특정 펩타이드와 비교하여 실질적으로 동등하거나 증강된 세포 투과성을 갖는 펩타이드를 생성할 수 있다. 그러한 변형은 부위 지정 돌연변이 유발에 의해서와 같이 의도적일 수 있거나 자연적일 수 있다.
모든 펩타이드는 L-아미노산을 사용하여 합성될 수 있지만, 모든 펩타이드의 D형은 합성으로 생산될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 세포 투과성을 증가시키기 위해, C 말단 메틸 에스테르 및 C 말단 아미데이트와 같은 C 말단 유도체가 생성될 수 있다.
펩타이드의 아미드화된 형태의 경우, 원래의 펩타이드의 세포 투과성이 변화되거나 증강되어 아미드화된 펩타이드가 치료적으로 유용한 한, 이들 변형에 의해 생성된 모든 펩타이드가 본원에 포함된다. 이러한 변형은 특정 펩타이드의 세포 투과성을 변화시키거나 증강시키는데 유용할 것으로 예상된다.
또한, 하나 이상의 아미노산의 결실은 세포 투과성을 현저히 변화시키지 않고 생성된 분자의 구조를 변형시킬 수도 있다. 이것은 또한 유용할 수 있는 더 작은 활성 분자의 개발로 이어질 수 있다. 예를 들어, 특정 펩타이드의 세포 투과성에 필요하지 않을 수 있는 아미노- 또는 카복실-말단 아미노산은 제거될 수 있다.
용어 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사, 또는 다른 유전자 발현의 조절에 기능적 역할을 하는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부분을 의미한다. 유전자는 기능성 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 상기 단백질을 코딩하거나 발현하는 핵산의 일부로 구성될 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종결 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 독특한 서열에서의 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다.
용어 "프라이머"는 상보적인 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하고, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응에서 발생하는 것과 같은 뉴클레오티딜전이효소의 작용에 의해 모노뉴클레오타이드로부터 폴리뉴클레오타이드를 단계적으로 합성하기 위한 출발점으로서의 역할을 하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
용어 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 정상적인 염기쌍 및 코돈 용법 관계에 따라, 발현을 원하는 특정 유전자 산물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 보체 또는 이의 일부를 지칭한다. 코딩 서열은 성숙한 mRNA를 제공하기 위해 세포 생화학 기계에 의해 결합된 게놈 DNA 내의 엑손 또는 미성숙한 1차 RNA 전사체를 포함한다. 안티센스 가닥은 핵산의 보체이고, 코딩 서열은 이로부터 추론될 수 있다.
본 발명은 파킨 단백질 및 9~13개의 아미노산 서열, 바람직하게는 10~12개의 아미노산 서열로 구성되고 향상된 세포 또는 조직 투과성을 갖는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)을 포함하는 iCP 파킨 재조합 단백질을 제공하며, aMTD는 파킨 단백질의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 융합되고 하기 특징을 갖는다:
(a) 바람직하게는 Ala, Val, Ile, Leu 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열로 구성됨;
(b) 그 아미노산 서열의 위치 5 내지 8 및 12 중 어느 하나 이상, 및 바람직하게는 그 아미노산 서열의 위치 5 내지 8 중 하나 이상 및 위치 12에 상응하는 아미노산 서열로서 프롤린을 가짐, 및
(c) 프로트파람(http://web.expasy.org/protparam/ 참고)으로 측정시, 바람직하게는 40-60 및 보다 바람직하게는 41-58의 불안정성 지수; 바람직하게는 180-220 및 보다 바람직하게는 185-225의 지방족 지수; 및 바람직하게는 2.1-2.6 및 보다 바람직하게는 2.2-2.6의 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)을 가짐.
일 구현예에 따르면, 하나 이상의 가용화 도메인(SD)(들)은 파킨 단백질 및 aMTD 중 하나 이상, 바람직하게는 파킨 단백질의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단, 및 보다 바람직하게는 파킨 단백질의 C 말단에 추가로 융합된다.
또 다른 구현예에 따르면, aMTD는 α-나선 구조를 가질 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, aMTD는 바람직하게는 12개의 아미노산 서열로 구성되고 하기 일반식으로 표시될 수 있다:
[일반식]
여기서, X(들)는 독립적으로 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하며; 프롤린(P)은 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8' 중 하나)에 위치할 수 있다. 나머지 U(들)는 독립적으로 A, V, L 또는 I로 구성되며, 12'에서의 P는 프롤린이다.
본 발명의 또 다른 양태는 구조식 A-B-C 및 A-C-B-C 중 어느 하나, 및 바람직하게는 A-B-C로 표시되는 iCP 파킨 재조합 단백질을 제공하며:
여기서, A는 향상된 세포 또는 조직 투과성을 갖는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)이고, B는 파킨 단백질이며, C는 가용화 도메인(SD)이고;
aMTD는 9~13개, 바람직하게는 10~12개의 아미노산 서열로 구성되고 하기 특징을 갖는다:
(a) Ala, Val, Ile, Leu 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 서열로 구성됨;
(b) 그 아미노산 서열의 위치 5 내지 8 및 12 중 어느 하나 이상, 및 바람직하게는 그 아미노산 서열의 위치 5 내지 8 중 하나 이상 및 위치 12에 상응하는 아미노산 서열로서 프롤린을 가짐, 및
(c) 프로트파람(http://web.expasy.org/protparam/ 참고)으로 측정시, 바람직하게는 40-60 및 보다 바람직하게는 41-58의 불안정성 지수; 바람직하게는 180-220 및 보다 바람직하게는 185-225의 지방족 지수; 및 바람직하게는 2.1-2.6 및 보다 바람직하게는 2.2-2.6의 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)을 가짐; 및
(d) 바람직하게는 α-나선 구조를 가짐.
본 발명의 일 구현예에서, 파킨 단백질은 서열번호: 814의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 파킨 단백질은 서열번호: 815의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
iCP 파킨 재조합 단백질이 특정 세포, 조직 또는 기관에 전달되도록 의도될 때, 파킨 단백질은 특정 세포, 조직 또는 기관에서 특이적으로 발현되는 수용체에 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포외 도메인과 함께, 또는 수용체 또는 리간드 및 이의 변형된 형태에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체(mAb)와 함께, 융합 생성물을 형성할 수 있다.
펩타이드와 생물학적 활성 물질의 결합은 뉴클레오타이드 수준에서 발현 벡터를 사용하는 클로닝 기술에 의한 간접적인 연결에 의해 또는 펩타이드와 생물학적 활성 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합을 통한 직접적인 연결에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 파킨 단백질은 바람직하게는 세포, 조직 또는 기관의 수용체에 선택적으로 결합하는 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, aMTD는 서열번호: 1~240으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. aMTD는 바람직하게는 서열번호: 74의 aMTD321 또는 서열번호: 122의 aMTD524, 및 보다 바람직하게는 서열번호: 122의 aMTD524일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, aMTD는 서열번호: 241 내지 480으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다. aMTD는 바람직하게는 서열번호: 314의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 aMTD321 또는 서열번호: 362의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 aMTD524, 및 보다 바람직하게는 서열번호: 362의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 aMTD524일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, SD(들)는 서열번호: 798, 799, 800, 801, 802, 803 및 804로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. SD는 바람직하게는 서열번호: 798의 SDA, 서열번호: 799의 SDB 또는 서열번호: 804의 SDB', 및 보다 바람직하게는 우수한 구조 안정성을 갖는 서열번호: 799의 SDB 또는 생체내 적용시 면역 반응을 피하기 위해 SDB의 변형된 아미노산 서열을 갖는 서열번호: 804의 SDB'일 수 있다. SDB에서의 아미노산 서열의 변형은 SDB(서열번호: 799)의 아미노산 서열의 위치 28에 상응하는 아미노산 잔기인 발린을 루신으로 대체하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, SD(들)는 서열번호: 805, 806, 807, 808, 809, 810, 및 811로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다. SD는 바람직하게는 서열번호: 805의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 SDA, 서열번호: 806의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 SDB 또는 서열번호: 811의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 탈면역화를 위한 SDB', 및 보다 바람직하게는 서열번호: 806의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 우수한 구조 안정성을 갖는 SDB, 또는 서열번호: 811의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는, 생체내 적용시 면역 반응을 피하기 위해 SDB의 변형된 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 SDB'일 수 있다.
파킨 단백질은 세포내 또는 생체내 전달에 의해 생리학적 현상 관련 활성 또는 치료 목적 관련 활성을 나타낼 수 있다. 재조합 발현 벡터는 재조합 단백질의 정제를 쉽게 하기 위한 태그 서열, 예를 들어 연속적인 히스티딘 코돈, 말토스 결합 단백질 코돈, Myc 코돈 등을 포함할 수 있으며, 재조합 단백질의 용해도를 증강시키기 위한 융합 파트너 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 재조합 단백질의 전체 구조적 및 기능적 안정성 또는 각 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 유연성을 위해, 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 글리신, 프롤린 및 스페이서 아미노산 또는 AAY 아미노산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 재조합 단백질의 불필요한 부위를 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 소화되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포내 전달을 확인하기 위한 마커 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, iCP 파킨 재조합 단백질은 바람직하게는 그의 한쪽 말단에 추가로 융합된 히스티딘-태그 친화성 도메인을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 히스티딘-태그 친화성 도메인은 서열번호: 812의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 히스티딘-태그 친화성 도메인은 서열번호: 813의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 융합은 펩타이드 결합 또는 화학 결합을 통해 형성될 수 있다.
화학 결합은 바람직하게는 디설파이드 결합, 디아민 결합, 설파이드-아민 결합, 카르복실-아민 결합, 에스테르 결합 및 공유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, iCP 파킨 재조합 단백질은 파킨슨 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 iCP 파킨을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 816 또는 서열번호: 822로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 SD와 추가로 융합될 수 있으며, 서열번호: 818, 824, 828, 830 및 832로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 히스티딘-태그 친화성 도메인과 융합될 수 있으며, 서열번호: 820 또는 서열번호: 826의 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 iCP 파킨 재조합 단백질은 서열번호 817, 819, 821, 823, 825, 827, 829 및 831로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
바람직하게는, 벡터는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합될 수 있거나, 또는 에피솜으로 자발적으로 복제할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 지칭한다. 이러한 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함 할 수 있다.
바람직하게는, 관심있는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 도메인 또는 전장 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 대해 N-말단 및/또는 C-말단의 배향으로, 및 aMTD, 파킨 단백질 및 바람직하게는 SD가 발현될 수 있도록 정확한 판독 프레임으로, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하도록 벡터는 유전적으로 조작될 수 있다. 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 사용하는데 용이하게 이용될 수 있는 것으로부터 선택될 수 있다.
표준 재조합 핵산 방법이 유전적으로 조작된 재조합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 적절한 신호 및 가공 서열 및 전사 및 번역을 위한 조절 서열을 갖는 핵산 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있으며, 단백질은 자동화된 유기 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 단백질을 생산하는 합성 방법은, 예를 들어 문헌[Methods in Enzymology, Volume 289 : Gregg B. Fields (Sidney P. Colowick), Melvin I. Simon (Editor), Academic Press (1997)]에 기재되어 있다.
클로닝된 유전자 또는 핵산, 예를 들어 본 발명의 재조합 단백질을 코딩하는 cDNA를 높은 수준으로 발현시키기 위해, 재조합 단백질 서열은 전형적으로 전사를 유도하기 위한 강한 프로모터, 전사/번역 종결자, 단백질을 코딩하는 핵산의 경우 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위를 포함하는 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 적합한 박테리아 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); 및 Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 및 Wiley Interscience, N. Y. (1989)]에 기재되어 있다. 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어 대장균, 바실러스 종 및 살모넬라(Palva et al., Gene 22 : 229-235 (1983); Mosbach et al. Nature 302 : 543-545 (1983))에서 이용가능하다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포를 위한 진핵 세포 발현 시스템은 당업계에 널리 공지되어 있으며 또한 상업적으로 이용 가능하다. 진핵 발현 벡터는 바람직하게는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 벡터 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
일반적으로 카고 단백질, 즉 파킨 단백질이 aMTD의 N-말단, C-말단 또는 양쪽 말단에 부착된 본 발명의 세포 침투성 재조합 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터는, 예를 들어, 개선된 거대분자 전달 도메인을 코딩하는 서열에 작동가능하게 부착된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 유도성 프로모터의 비제한적인 예는 스테로이드-호르몬 반응성 프로모터(예를 들어, 엑디손 반응성, 에스트로겐 반응성 및 글루코코르티코이드 반응성 프로모터), 테트라사이클린 "Tet-On" 및 "Tet-Off" 시스템 및 금속 반응성 프로모터를 포함한다.
재조합 단백질은 적절한 숙주 세포, 예컨대 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 조직 배양 세포 내로 도입될 수 있다. 재조합 단백질은 또한 형질전환 생물을 생성하기 위해 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 많은 수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있고 본 발명의 재조합 단백질을 생성하는데 상업적으로 이용가능하다.
공지된 방법이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 적절한 전사/번역 제어 신호를 포함하는 벡터를 제작하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, 이러한 기술은 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001)] 및 문헌[Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
형질전환은 형질감염을 포함하며, 외래(세포외) DNA가 동반 물질과 함께 또는 동반 물질 없이 숙주 세포에 들어가는 과정을 지칭한다. "형질감염된 세포"는 외래 DNA가 세포 내로 도입된 세포를 지칭하며, 따라서 세포는 외래 DNA를 갖는다. DNA는 세포 내로 도입되어 이의 핵산이 염색체에 통합되거나 염색체외 요소로서 복제될 수 있다. 외래 DNA 등이 도입된 세포는 형질전환체로 불린다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질, 펩타이드, 유기 화합물의 세포로의 '도입'은 '보유', '침투', '수송', '전달', '투과' 또는 '통과'의 표현과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
숙주 세포는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입된 진핵 세포 또는 원핵 세포를 지칭하고, 특정 대상 세포뿐만 아니라 그의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에 이러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지는 않지만 본원에 사용된 용어의 범위에 여전히 포함된다.
숙주 세포는 바람직하게는 박테리아 세포일 수 있고, 박테리아 세포로서 원칙적으로 제한이 없다. 이들이 관심있는 유전자의 삽입을 위한, 바람직하게는 부위 특이적 통합을 위한, 유전적 조작을 허용하는 한, 이들은 진정세균(그람 양성 또는 그람 음성) 또는 고세균일 수 있으며, 이들은 제조 규모로 배양될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 높은 세포 밀도로의 배양을 가능하게 하는 특성을 가질 수 있다.
재조합 단백질의 제조에 사용될 수 있는 박테리아 숙주 세포의 예는 대장균(Lee, 1996; Hannig and Makrides, 1998), 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 플루오레센스(Squires et al., 2004; Retallack et al. 2006)뿐만 아니라 다양한 코리네박테리움(US 2006/0003404 A1) 및 락토코커스 락티스(Mierau et al., 2005) 균주를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 대장균이다.
보다 바람직하게는, 숙주 세포는 관심 유전자를 조절하는 프로모터에 결합할 수 있는 RNA 중합효소를 포함할 수 있다. RNA 중합 효소는 숙주 세포에 대해 내인성이거나 외인성일 수 있다.
바람직하게는, 외래의 강한 RNA 중합효소를 갖는 숙주 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 그들의 게놈에 통합된 외래 RNA 중합효소(예컨대, T7 프로모터를 사용하는 경우와 같이 소위 "T7 균주"에서 T7 유사 RNA 중합효소)를 갖도록 조작된 대장균 균주가 사용될 수 있다. T7 균주의 예, 예컨대, BL21 (DE3), HMS174 (DE3) 및 이들의 유도체 또는 관계물(Novagen, pET 시스템 매뉴얼, 11판 참조)이 널리 사용되고 상업적으로 이용가능할 수 있다. 바람직하게는, BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 또는 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Agilent Technologies)이 사용될 수 있다. 이러한 균주는 lacUV5 프로모터의 제어하에 T7 RNA 중합효소 유전자를 함유하는 DE3 리소겐(lysogeny)이다. IPTG 유도는 T7 RNA 중합효소를 생성하여 T7 프로모터의 제어하에 관심있는 유전자의 발현을 유도한다.
파아지 DE3를 통해 그들의 게놈 기반의 T7 RNA 중합효소를 받은 숙주 세포 균주인 대장균 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)는 리소겐성이다. 리소겐성 균주는 잠재적으로 용해성을 나타내어 바람직하지 않은 파아지 방출 및 세포 용해를 야기하는 단점을 가지므로, 숙주 세포에 함유된 T7 RNA 중합효소는 숙주 세포 게놈에서 잔류 파아지 서열의 삽입을 피하거나 바람직하게는 배제하는 방법에 의해 통합된 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 재조합 발현 벡터를 사용하여 형질전환체를 제조하는 단계; 형질전환체를 배양하는 단계; 및 배양에 의해 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 iCP 파킨 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
배양은 바람직하게는 유가(fed-batch) 방식, 반 연속 방식 또는 연속 방식으로부터 선택되는, 공급 배지의 첨가를 사용하는 방식일 수 있으며, 박테리아 발현 숙주 세포는 상기 단백질의 발현을 가능하게 하는 프로모터의 제어하에 관심있는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 보유하는, 이들의 게놈 내에 통합된 DNA 작제물을 포함할 수 있다.
배양 배지의 종류는 제한이 없다. 배양 배지는 반한정(semi-defined)일 수 있거나, 즉 복합 배지 화합물(예컨대, 효모 추출물, 대두 펩톤, 카사미노산)을 함유할 수 있거나, 그것은 임의의 복합 화합물 없이 화학적으로 한정될 수 있다. 바람직하게는, 한정 배지가 사용될 수 있다. 한정 배지(최소 또는 합성 배지라고도 함)는 화학적으로 한정된 물질, 즉 글루코스나 글리세롤과 같은 탄소원, 염, 비타민, 및 가능한 균주 영양 요구를 고려하여, 특정 아미노산 또는 티아민과 같은 다른 물질로만 구성된다. 가장 바람직하게는, 글루코스가 탄소원으로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 공급 배지의 탄소원은 특정 성장 속도를 제어하는 성장 제한 성분으로서 작용한다.
숙주 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파쇄 또는 세포 용해제 사용을 포함하는, 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다. 문헌[Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, New York : Springer-Verlag (1994)]은 재조합(및 비재조합) 단백질을 정제하기 위한 많은 일반적인 방법을 기술한다. 상기 방법은, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 선택적 침전, 투석 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 이들 방법은 세포 투과성 재조합 단백질에 대한 정제 전략을 고안하도록 조정될 수 있다. 세포 투과성 재조합 단백질이 에피토프 태그 또는 금속 킬레이트화 서열과 같은 정제 핸들을 포함하는 경우, 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 쉽게 정제할 수 있다.
생산된 단백질의 양은 개선된 거대분자 전달 도메인을 직접적으로(예컨대, 웨스턴 분석을 사용하여) 또는 간접적으로(예컨대, 세포로부터 유래된 물질을 특이적 DNA 결합 활성에 대해 분석함으로써, 예컨대, 전기영동 이동성 이동도 분석에 의해) 검출함으로써 평가될 수 있다. 단백질은 정제 전에, 정제의 어느 단계 중에 또는 정제 후에 검출될 수 있다. 일부 구현에서, 정제 또는 완전한 정제가 필요하지 않을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 유전적으로 조작된 재조합 단백질은 세포 투과성 단백질이며, 특히 사멸되거나 약독화된 전체 유기체 백신이 비실용적인 경우, 단백질 기반 백신으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 투과성 재조합 단백질은 바람직하게는 파킨슨 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 세포 투과성 재조합 단백질은 세포의 내부로 전달되어, 세포를 재조합 벡터로 형질감염시키거나 형질전환시킬 필요가 없다. 본 발명의 세포 투과성 재조합 단백질은 단백질 기능을 조사하기 위해 시험관내에서 사용될 수 있거나 세포를 원하는 상태로 유지하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 iCP 파킨 재조합 단백질을 활성 성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 활성 성분으로서 iCP 파킨 재조합 단백질; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 파킨슨병을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 조성물은 주사용(예컨대, 복강내, 정맥내 및 동맥내 등)일 수 있고, 인간에게 0.01 mg/kg 내지 30 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 6 mg/kg의 양으로 활성 성분을 포함할 수 있다.
예를 들어, 1일당 투여량은 일반적으로 약 0.01 내지 약 30 mg/kg 체중의 범위에 속한다. 성인 인간의 치료에서, 단일 또는 분할 용량으로, 약 0.1 내지 약 6 mg/kg/일의 범위가 특히 바람직하다. 그러나, 실제로 투여되는 iCP-파킨 재조합 단백질의 농도는 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 개별 환자의 연령, 체중, 및 반응, 및 환자의 증상의 중증도를 포함하는 관련 상황에 비추어 의사에 의해 결정될 것이며, 따라서 상기 투여 범위는 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 일부 경우, 전술한 범위의 하한 아래의 투여량 수준이 충분할 수 있지만, 다른 경우에는, 더 큰 용량이 어떤 유해한 부작용을 일으키지 않으면서 사용될 수 있는데, 단, 하루 동안 투여를 위해 더 큰 용량이 먼저 몇 개의 더 작은 용량으로 분할된다.
본 발명의 또 다른 양태는 파킨슨 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제로서 향상된 세포 투과성(iCP) 파킨 재조합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 iCP 파킨 재조합 단백질을 포함하는 약제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 파킨슨 관련 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 iCP 파킨 재조합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 파킨슨 관련 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계; 및 대상에게 치료적 유효량의 iCP 파킨 재조합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 파킨슨 관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 대상은 바람직하게는 포유동물일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 활성 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용가능한 첨가제를 사용하여 제조될 수 있으며, 첨가제는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 코팅제, 발포제, 윤활제, 활택제, 풍미제 등을 포함할 수 있다.
투여를 위해, 약제학적 조성물은 바람직하게는 상기 기재된 활성 성분 이외에 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함함으로써 제제화될 수 있다.
약제학적 조성물의 투여 형태는 과립, 분말, 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 좌제, 액체 제제, 시럽, 쥬스, 현탁액, 유화액, 점적제, 주사가능한 액체 제제 등을 포함할 수 있다. 조성물을 정제 또는 캡슐로 제제화하기 위해, 예를 들어, 활성 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 임의의 경구용 비독성 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 배합될 수 있다. 원하는 경우 또는 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제가 혼합물로서 추가로 포함될 수 있다.
적합한 결합제의 예는 전분, 젤라틴, 천연 당류, 예컨대 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미료, 천연 및 합성 검류, 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 올레산 나트륨, 스테아르산 나트륨, 스테아르산 마그네슘, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화 나트륨 등을 들 수 있다. 붕해제의 예는 비제한적으로 전분, 메틸 셀룰로오스, 한천, 벤토나이트, 잔탄검 등을 포함할 수 있다. 조성물을 액체 제제로 제제화하기 위해, 멸균이며 생체적합성인 약제학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주입 용액, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤 및 에탄올이 사용될 수 있고, 이들 물질은 단독으로 또는 이들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다. 필요하다면, 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 다른 일반적인 첨가제가 첨가될 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 추가로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유화액과 같은 주사가능한 제제, 또는 환제, 캡슐제, 과립제 또는 정제를 제조할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 바람직하게는 문헌[Remington 's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시된 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 질환 및 성분에 따라 제제화될 수 있다.
바람직하게는, 치료 또는 치료하는 것은 환자의 병태 또는 질환을 향상 또는 안정화시키거나; 대상의 병태 또는 질병과 관련된 증상의 발달 또는 악화를 예방 또는 완화시키는 것을 의미한다.
파킨슨병(PD)을 가지고 있거나 가질 위험성이 있는 것으로 환자를 진단하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 파킨슨병을 진단하기 위해 조합해서 사용되는 다양한 증상 및 진단 시험이 있다. 신경과 전문의가 PD 진단에 고려하기 위해서는 4개의 주요 증상 중 적어도 2개가 일정 기간 동안 나타나야 한다. PD의 4개의 주요 운동 증상은 흔들림 또는 떨림; 운동완만증(bradykinesia)으로 불리는 움직임의 속도 저하; 팔, 다리 또는 몸통의 뻣뻣함 또는 강성; 자세 불안정으로도 불리는 균형 문제와 가능한 낙상이다. 증상, 활동, 약물, 현재의 의학적 문제, 또는 대상의 가능한 독성 노출의 검토가 또한 PD를 진단하는데 유용할 수 있다.
예방 및 예방 치료는 본원에서 동의어로 사용된다. 파킨슨병의 운동 증상 및/또는 특히 흑색질에서 추가로 도파민성 신경세포의 손실의 발생 또는 유의한 정도를 지연시키기 위해, 이들은 특히 상기 기재된 바와 같이 파킨슨병의 4개의 기본적인 증상 중 적어도 2개가 기본적으로 또한 부분적으로 존재하는 개체에게 약물을 투여하는 것을 포함한다.
대상 및 환자는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들은 질환이나 장애(예컨대, PD)에 걸릴 수 있거나 걸리기 쉬우나 질환 또는 장애가 있거나 없을 수 있는 인간 또는 또 다른 포유동물(예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 지칭한다. 특정 구현예에서, 대상은 인간이다.
바람직하게는, 유효량은 질환을 치료하기 위해 대상에게 투여될 때 질환의 치료를 가져오기에 충분한 본원에 개시된 활성 성분 또는 약제학적 조성물의 양이다. 환자에서의 임의의 향상은 치료를 달성하기에 충분한 것으로 여겨진다. 파킨슨병 치료에 사용되는 본원에 개시된 활성 성분 또는 약제학적 조성물의 유효량은 투여 방식, 환자의 연령, 체중 및 일반적인 건강에 따라 달라질 수 있다. 궁극적으로, 처방자나 연구자가 적절한 양과 투여 요법을 결정할 것이다.
본 발명의 치료 또는 예방 방법에서, iCP 파킨 재조합 단백질을 활성 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 구강, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안내 또는 피하 경로를 통해, 바람직하게는 복강내, 정맥내 또는 동맥내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명은 결정 인자(CF)에 기초하여 인공적으로 제작된 aMTD 서열을 제공하며, 이는 제한된 다양성 및 예측불가능한 세포 투과성과 같은 선행 기술(MTM/MTS/MTD)의 한계를 극복한다. 세포 투과성을 보장하는 CF에 기초하여, aMTD는 이들 서열이 생물학적 활성 거대분자를 살아있는 세포 내로 전달하기 위해 이의 선행 기술과 비교하여 최대 109.9 상대적 배수로 향상된 능력을 나타낸다는 것을 제시한다. 따라서, 본 발명은 분자 전달, 약물 전달, 단백질 요법, 세포내 단백질 요법, 단백질 대체 요법, 펩타이드 요법, 유전자 전달 등에서 이들의 실제적 효과적인 적용을 가능하게 할 것이다.
향상된 용해도 및 수율로, aMTD/SD 융합된 파킨 재조합 단백질은 다량으로 생산될 수 있다. 또한, 상기 재조합 단백질의 효과적인 BBB 투과성은 이전에 개발된 항-신경퇴행성 치료의 한계를 극복한다. 따라서, 본 발명의 재조합 iCP-파킨 단백질은 파킨슨 관련 질환을 효과적으로 치료하는 실질적인 적용을 가능하게 할 것이다.
그러나, 본 발명의 효과는 상술한 효과에 한정되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과가 하기 설명으로부터 당업자에 의해 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 구조를 나타낸다. 히스-태그된 CRA 재조합 단백질의 개략도가 도시되어 있고 이는 본 발명에 따라 제작된다. 친화성 정제를 위한 히스-태그(흰색), aMTD 또는 r펩타이드(회색) 및 카고 A(CRA, 검정색)가 나타나 있다.
도 2a 내지 2c는 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질을 위한 발현 벡터의 제작을 나타낸다. 이들 도면은 본 발명에 따라 pET28a(+) 벡터 내로 클로닝된 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 CRA를 코딩하는 645bp 삽입에 있는 플라스미드 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 3a 내지 3d는 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 유도성 발현을 나타낸다. 발현된 재조합 aMTD 또는 무작위 펩타이드 융합된 CRA 재조합 단백질을 E. coli BL21(DE3) 균주에서 형질전환하였다. IPTG로 유도하기 전(-)과 후(+)에 E.coli에서 재조합 단백질의 발현을 SDS-PAGE에 의해 모니터링하고, 쿠마시 블루로 염색하였다.
도 4a 및 4b는 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 정제를 나타낸다. 발현된 재조합 단백질을 자연 조건 하에 Ni2 + 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 재조합 단백질의 정제를 SDS-PAGE 분석을 통해 표시하였다.
도 5a 내지 5u는 aMTD 매개 세포 투과성의 결정을 나타낸다. 음성 대조군(A: rP38) 및 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)의 세포 투과성이 나타나 있다. 각각의 aMTD 및/또는 r펩타이드의 세포 투과성을 카고 단백질 결여 펩타이드 서열(HCA)과 시각적으로 비교한다. 회색 음영 부분은 처리되지 않은 RAW 264.7 세포(비히클)를 나타내고; 얇은 옅은 회색선은 동등한 몰 농도의 FITC(FITC 단독)로 처리된 세포를 나타내며; 진한 두꺼운 선은 FITC 히스-태그된 CRA 단백질(HCA)로 처리된 세포를 나타내고; 음성 대조군(rP38), 레퍼런스 CPP(MTM12 또는 MTD85) 또는 새로운 소수성 CPP(aMTD)에 융합된 FITC 단백질(HMCA)로 처리된 세포는 옅은 두꺼운 선으로 나타나 있고 화살표로 표시되어 있다.
도 6a 내지 6c는 r펩타이드 매개 세포 투과성의 결정을 나타낸다. 각각의 aMTD 및/또는 r펩타이드의 세포 투과성을 카고 단백질 결여 펩타이드 서열(HCA)과 시각적으로 비교하였다. 회색 음영 부분은 처리되지 않은 RAW 264.7 세포(비히클)를 나타내고; 얇은 연회색선은 동등한 몰 농도의 FITC(FITC 단독)로 처리된 세포를 나타내며; 진한 두꺼운 선은 FITC 히스-태그된 CRA 단백질(HCA)로 처리된 세포를 나타내고; r펩타이드에 융합된 FITC 단백질로 처리된 세포는 옅은 두꺼운 선으로 나타나 있고 화살표로 표시되어 있다.
도 7a 내지 7k는 aMTD 융합된 재조합 단백질의 시각화된 세포 투과성을 나타낸다. NIH3T3 세포를 37℃에서 1시간 동안 aMTD에 융합된 FITC 표지된 단백질(10 μM)로 처리하였다. 상기 단백질의 세포 투과성을 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사(LSM700 version)에 의해 시각화하였다.
도 8a 내지 8b는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 시각화된 세포 투과성을 나타낸다. r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사(LSM700 version)에 의해 시각화하였다.
도 9a 내지 9c는 음성 대조군(rP38) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성을 나타낸다. 상기 도면은 aMTD 및 음성 대조군(A: rP38)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 10a 내지 10c는 레퍼런스 CPP(MTM12) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성을 나타낸다. 상기 도면은 aMTD 및 레퍼런스 CPP(MTM12)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 11a 내지 11c는 레퍼런스 CPP(MTD85) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성을 나타낸다. 상기 도면은 aMTD 및 레퍼런스 CPP(MTD85)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 12는 aMTD의 평균 세포 투과성 대비 r펩타이드 매개 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성을 나타낸다. 상기 도면은 r펩타이드에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성 및 aMTD에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성(평균값: aMTD AVE)을 비교한 그래프를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 세포 투과성과 aMTD 서열 내 아미노산 조성과의 연관성을 나타낸다. 이들 그래프는 아미노산 조성(A, I, V 및 L)으로 영향을 받은 aMTD의 전달 잠재성(기하 평균)을 나타낸다.
도 14a 및 14b는 aMTD에서 세포 투과성과 결정 인자와의 연관성을 나타낸다. 이들 그래프는 세포 투과성과 결정 인자[굽힘 잠재성: 프롤린 위치(PP), 강성/유연성: 불안정성 지수(II), 구조적 특징: 지방족 지수(AI) 및 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)]와의 연관성을 나타낸다.
도 15a 및 15b는 aMTD 매개 세포 투과성과 결정 인자와의 상대적 관련성을 나타낸다. 전달 잠재성에서 10개의 높은 순위 및 10개의 낮은 순위의 aMTD의 세포 투과성을 결정 인자[굽힘 잠재성: 프롤린 위치(PP), 강성/유연성: 불안정성 지수(II), 구조적 특징: 지방족 지수(AI) 및 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)]와의 연관성에 대해 조사하였다.
도 16은 r펩타이드 매개 세포 투과성과 소수성 지수 범위(GRAVY)와의 상대적 관련성을 나타낸다. 이 그래프와 차트는 r펩타이드 매개 세포 투과성과 그의 소수성 지수 범위(GRAVY)의 상대적 관련성을 도시한다.
도 17은 히스-aMTD/SD-융합된 파킨 재조합 단백질의 개략도를 나타낸다. 세포 투과성을 갖는 히스-aMTD-SD-파킨 재조합 단백질의 개략도가 도시되어 있으며 본 발명에 따라 제작된다. 재조합 파킨 융합 단백질의 디자인은 친화성 정제를 위한 히스티딘 태그(MGSSHHHHHHSSGLVPRGS(서열번호: 2), 흰색), 카고(파킨, 회색), aMTD(검정), SDA(점) 및 SDB(교차선)를 함유하였다.
도 18은 실시예 6에 따른 pET28a(+) 벡터 내로 클로닝된 aMTD-SD-융합된 파킨을 코딩하는 플라스미드 DNA 단편 삽입물을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 19 및 20은 실시예 7-1에 따른 대장균에서의 iCP-파킨 재조합 단백질의 발현, 정제 및 용해도/수율 및 실시예 7-2에 따른 파킨 재조합 단백질의 용해도/수율을 나타낸다.
도 21a 및 도 21b는 실시예 7-2에 따른, 음성 대조군(HP)과 비교한 aMTD-SD-융합된 파킨 재조합 단백질(HM321PSA 및 HM321PSB)의 상대적 수율(도 21a) 및 음성 대조군(HP)과 비교한 SDB-융합된 파킨 재조합 단백질(HPSB)의 상대적 수율(도 21b)을 나타낸다.
도 22는 실시예 7-2에 따른 다양한 aMTD에 의해 제조된 aMTD-SD-융합된 파킨 재조합 단백질의 용해도/수율, 투과성 및 생물학적 활성을 나타낸다.
도 23은 실시예 9에 따라 음성 대조군(rP38) 및 이전에 개발된 CPP(MTM12 및 MTD85)과 비교한 aMTD321-매개된 세포 투과성을 나타낸다. 회색 음영 영역은 처리되지 않은 RAW 264.7 세포(비히클)를 나타내고; 각 줄은 왼쪽부터 FITC-융합된 세포(FITC 단독); FTIC 표지를 갖는 SDA와 융합된 히스티딘(HSA); His-태그된 CPP(MTM12, MTM85 및 aMTD321)-재조합 단백질(HMSA)을 나타낸다.
도 24는 실시예 10에 따른 MTD-매개된 세포내 국소화를 나타낸다.
도 25는 실시예 11-1에 따른 PBMC에서 HM321PSB의 생체내 세포 흡수를 나타낸다(상부: IP 후 15분, 하부: IP 후 30분).
도 26은 실시예 11-2에 따른 파킨 재조합 단백질의 aMTD-매개된 세포 투과성의 결정을 나타낸다.
도 27은 실시예 12에 따른 생체내에서 파킨 재조합 단백질의 조직 분포를 나타낸다.
도 28a 내지 28c 및 29는 실시예 13에 따른 웨스턴 블롯(도 28a) 및 면역블롯(도 29) 분석에 의해 결정된 aMTD-매개된 파킨 재조합 단백질의 뇌로의 전달을 나타낸다.
도 30은 실시예 14-1에 따른 aMTD-매개된 파킨 재조합 단백질의 유비퀴틴화 및 자가-유비퀴틴화 활성을 나타낸다.
도 31 및 32는 실시예 14-2에 따른 도파민성 CATH.a 세포(도 31) 및 SH-SY5Y 세포(도 32a 및 32b)에서 세포자멸사의 억제를 나타낸다. 현미경 사진은 3개의 독립적인 실험을 대표하며, 평균±S.D로서 플롯되었다(하부). 그룹 간의 실험적 차이는 스튜던트 이쌍(two-paired) t-검정(*p, 0.05)에 의해 평가되었다.
도 33은 실시예 14-3에 따른 파킨 재조합 단백질에 의한 α-시누클레인 응집체의 분해를 나타낸다.
도 34는 실시예 15에 따른 MPTP 유도 PD 마우스 모델의 프로토콜을 나타낸다.
도 35는 실시예 16에 따른 파킨 재조합 단백질로 처리된 MPTP 유도 PD 마우스에서 소변의 도파민을 나타낸다.
도 36은 실시예 17에 따른 재조합 단백질로 처리된 MPTP 유도 PD 마우스에서의 뇌의 도파민을 나타낸다.
도 37은 실시예 18에 따른 파킨 재조합 단백질로 처리된 MPTP-병변 마우스에서의 총 운동 기능의 보존을 나타낸다.
도 38 내지 도 40은 실시예 19-1에 따른 보행 시험에서 풋프린트 패턴(도 38), 보폭(도 39) 및 동요거리(도 40)의 결정을 나타낸다.
도 41은 실시예 19-2에 따른 로타-로드(Rota-rod) 시험에 의한 파킨 재조합 단백질로 처리된 MPTP-병변 마우스에서의 운동 활성 회복을 나타낸다.
도 42a는 실시예 20에 따른 파킨 재조합 단백질에 의한 흑색질(Substantia Nigra) 및 선조체(Striatum)에서의 도파민성 신경세포를 나타낸다.
도 42b는 실시예 20에 따른 파킨 재조합 단백질에 의한 흑색질에서의 도파민성 신경세포의 회복 효과를 나타낸다.
도 43은 실시예 20에 따른 아급성 MPTP 유도 PD 모델에서 iCP-파킨 재조합 단백질에 의한 TH 발현의 회복을 나타낸다.
도 2a 내지 2c는 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질을 위한 발현 벡터의 제작을 나타낸다. 이들 도면은 본 발명에 따라 pET28a(+) 벡터 내로 클로닝된 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 CRA를 코딩하는 645bp 삽입에 있는 플라스미드 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 3a 내지 3d는 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 유도성 발현을 나타낸다. 발현된 재조합 aMTD 또는 무작위 펩타이드 융합된 CRA 재조합 단백질을 E. coli BL21(DE3) 균주에서 형질전환하였다. IPTG로 유도하기 전(-)과 후(+)에 E.coli에서 재조합 단백질의 발현을 SDS-PAGE에 의해 모니터링하고, 쿠마시 블루로 염색하였다.
도 4a 및 4b는 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 정제를 나타낸다. 발현된 재조합 단백질을 자연 조건 하에 Ni2 + 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 재조합 단백질의 정제를 SDS-PAGE 분석을 통해 표시하였다.
도 5a 내지 5u는 aMTD 매개 세포 투과성의 결정을 나타낸다. 음성 대조군(A: rP38) 및 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)의 세포 투과성이 나타나 있다. 각각의 aMTD 및/또는 r펩타이드의 세포 투과성을 카고 단백질 결여 펩타이드 서열(HCA)과 시각적으로 비교한다. 회색 음영 부분은 처리되지 않은 RAW 264.7 세포(비히클)를 나타내고; 얇은 옅은 회색선은 동등한 몰 농도의 FITC(FITC 단독)로 처리된 세포를 나타내며; 진한 두꺼운 선은 FITC 히스-태그된 CRA 단백질(HCA)로 처리된 세포를 나타내고; 음성 대조군(rP38), 레퍼런스 CPP(MTM12 또는 MTD85) 또는 새로운 소수성 CPP(aMTD)에 융합된 FITC 단백질(HMCA)로 처리된 세포는 옅은 두꺼운 선으로 나타나 있고 화살표로 표시되어 있다.
도 6a 내지 6c는 r펩타이드 매개 세포 투과성의 결정을 나타낸다. 각각의 aMTD 및/또는 r펩타이드의 세포 투과성을 카고 단백질 결여 펩타이드 서열(HCA)과 시각적으로 비교하였다. 회색 음영 부분은 처리되지 않은 RAW 264.7 세포(비히클)를 나타내고; 얇은 연회색선은 동등한 몰 농도의 FITC(FITC 단독)로 처리된 세포를 나타내며; 진한 두꺼운 선은 FITC 히스-태그된 CRA 단백질(HCA)로 처리된 세포를 나타내고; r펩타이드에 융합된 FITC 단백질로 처리된 세포는 옅은 두꺼운 선으로 나타나 있고 화살표로 표시되어 있다.
도 7a 내지 7k는 aMTD 융합된 재조합 단백질의 시각화된 세포 투과성을 나타낸다. NIH3T3 세포를 37℃에서 1시간 동안 aMTD에 융합된 FITC 표지된 단백질(10 μM)로 처리하였다. 상기 단백질의 세포 투과성을 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사(LSM700 version)에 의해 시각화하였다.
도 8a 내지 8b는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 시각화된 세포 투과성을 나타낸다. r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사(LSM700 version)에 의해 시각화하였다.
도 9a 내지 9c는 음성 대조군(rP38) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성을 나타낸다. 상기 도면은 aMTD 및 음성 대조군(A: rP38)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 10a 내지 10c는 레퍼런스 CPP(MTM12) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성을 나타낸다. 상기 도면은 aMTD 및 레퍼런스 CPP(MTM12)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 11a 내지 11c는 레퍼런스 CPP(MTD85) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성을 나타낸다. 상기 도면은 aMTD 및 레퍼런스 CPP(MTD85)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 12는 aMTD의 평균 세포 투과성 대비 r펩타이드 매개 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성을 나타낸다. 상기 도면은 r펩타이드에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성 및 aMTD에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성(평균값: aMTD AVE)을 비교한 그래프를 나타낸다.
도 13a 및 13b는 세포 투과성과 aMTD 서열 내 아미노산 조성과의 연관성을 나타낸다. 이들 그래프는 아미노산 조성(A, I, V 및 L)으로 영향을 받은 aMTD의 전달 잠재성(기하 평균)을 나타낸다.
도 14a 및 14b는 aMTD에서 세포 투과성과 결정 인자와의 연관성을 나타낸다. 이들 그래프는 세포 투과성과 결정 인자[굽힘 잠재성: 프롤린 위치(PP), 강성/유연성: 불안정성 지수(II), 구조적 특징: 지방족 지수(AI) 및 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)]와의 연관성을 나타낸다.
도 15a 및 15b는 aMTD 매개 세포 투과성과 결정 인자와의 상대적 관련성을 나타낸다. 전달 잠재성에서 10개의 높은 순위 및 10개의 낮은 순위의 aMTD의 세포 투과성을 결정 인자[굽힘 잠재성: 프롤린 위치(PP), 강성/유연성: 불안정성 지수(II), 구조적 특징: 지방족 지수(AI) 및 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)]와의 연관성에 대해 조사하였다.
도 16은 r펩타이드 매개 세포 투과성과 소수성 지수 범위(GRAVY)와의 상대적 관련성을 나타낸다. 이 그래프와 차트는 r펩타이드 매개 세포 투과성과 그의 소수성 지수 범위(GRAVY)의 상대적 관련성을 도시한다.
도 17은 히스-aMTD/SD-융합된 파킨 재조합 단백질의 개략도를 나타낸다. 세포 투과성을 갖는 히스-aMTD-SD-파킨 재조합 단백질의 개략도가 도시되어 있으며 본 발명에 따라 제작된다. 재조합 파킨 융합 단백질의 디자인은 친화성 정제를 위한 히스티딘 태그(MGSSHHHHHHSSGLVPRGS(서열번호: 2), 흰색), 카고(파킨, 회색), aMTD(검정), SDA(점) 및 SDB(교차선)를 함유하였다.
도 18은 실시예 6에 따른 pET28a(+) 벡터 내로 클로닝된 aMTD-SD-융합된 파킨을 코딩하는 플라스미드 DNA 단편 삽입물을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 19 및 20은 실시예 7-1에 따른 대장균에서의 iCP-파킨 재조합 단백질의 발현, 정제 및 용해도/수율 및 실시예 7-2에 따른 파킨 재조합 단백질의 용해도/수율을 나타낸다.
도 21a 및 도 21b는 실시예 7-2에 따른, 음성 대조군(HP)과 비교한 aMTD-SD-융합된 파킨 재조합 단백질(HM321PSA 및 HM321PSB)의 상대적 수율(도 21a) 및 음성 대조군(HP)과 비교한 SDB-융합된 파킨 재조합 단백질(HPSB)의 상대적 수율(도 21b)을 나타낸다.
도 22는 실시예 7-2에 따른 다양한 aMTD에 의해 제조된 aMTD-SD-융합된 파킨 재조합 단백질의 용해도/수율, 투과성 및 생물학적 활성을 나타낸다.
도 23은 실시예 9에 따라 음성 대조군(rP38) 및 이전에 개발된 CPP(MTM12 및 MTD85)과 비교한 aMTD321-매개된 세포 투과성을 나타낸다. 회색 음영 영역은 처리되지 않은 RAW 264.7 세포(비히클)를 나타내고; 각 줄은 왼쪽부터 FITC-융합된 세포(FITC 단독); FTIC 표지를 갖는 SDA와 융합된 히스티딘(HSA); His-태그된 CPP(MTM12, MTM85 및 aMTD321)-재조합 단백질(HMSA)을 나타낸다.
도 24는 실시예 10에 따른 MTD-매개된 세포내 국소화를 나타낸다.
도 25는 실시예 11-1에 따른 PBMC에서 HM321PSB의 생체내 세포 흡수를 나타낸다(상부: IP 후 15분, 하부: IP 후 30분).
도 26은 실시예 11-2에 따른 파킨 재조합 단백질의 aMTD-매개된 세포 투과성의 결정을 나타낸다.
도 27은 실시예 12에 따른 생체내에서 파킨 재조합 단백질의 조직 분포를 나타낸다.
도 28a 내지 28c 및 29는 실시예 13에 따른 웨스턴 블롯(도 28a) 및 면역블롯(도 29) 분석에 의해 결정된 aMTD-매개된 파킨 재조합 단백질의 뇌로의 전달을 나타낸다.
도 30은 실시예 14-1에 따른 aMTD-매개된 파킨 재조합 단백질의 유비퀴틴화 및 자가-유비퀴틴화 활성을 나타낸다.
도 31 및 32는 실시예 14-2에 따른 도파민성 CATH.a 세포(도 31) 및 SH-SY5Y 세포(도 32a 및 32b)에서 세포자멸사의 억제를 나타낸다. 현미경 사진은 3개의 독립적인 실험을 대표하며, 평균±S.D로서 플롯되었다(하부). 그룹 간의 실험적 차이는 스튜던트 이쌍(two-paired) t-검정(*p, 0.05)에 의해 평가되었다.
도 33은 실시예 14-3에 따른 파킨 재조합 단백질에 의한 α-시누클레인 응집체의 분해를 나타낸다.
도 34는 실시예 15에 따른 MPTP 유도 PD 마우스 모델의 프로토콜을 나타낸다.
도 35는 실시예 16에 따른 파킨 재조합 단백질로 처리된 MPTP 유도 PD 마우스에서 소변의 도파민을 나타낸다.
도 36은 실시예 17에 따른 재조합 단백질로 처리된 MPTP 유도 PD 마우스에서의 뇌의 도파민을 나타낸다.
도 37은 실시예 18에 따른 파킨 재조합 단백질로 처리된 MPTP-병변 마우스에서의 총 운동 기능의 보존을 나타낸다.
도 38 내지 도 40은 실시예 19-1에 따른 보행 시험에서 풋프린트 패턴(도 38), 보폭(도 39) 및 동요거리(도 40)의 결정을 나타낸다.
도 41은 실시예 19-2에 따른 로타-로드(Rota-rod) 시험에 의한 파킨 재조합 단백질로 처리된 MPTP-병변 마우스에서의 운동 활성 회복을 나타낸다.
도 42a는 실시예 20에 따른 파킨 재조합 단백질에 의한 흑색질(Substantia Nigra) 및 선조체(Striatum)에서의 도파민성 신경세포를 나타낸다.
도 42b는 실시예 20에 따른 파킨 재조합 단백질에 의한 흑색질에서의 도파민성 신경세포의 회복 효과를 나타낸다.
도 43은 실시예 20에 따른 아급성 MPTP 유도 PD 모델에서 iCP-파킨 재조합 단백질에 의한 TH 발현의 회복을 나타낸다.
1. 개선된
MTD의
개발을 위한 '결정 인자'를 확인하기 위한
레퍼런스
소수성 CPP의 분석
종래 보고된 MTD는 1,500개가 넘는 신호 펩타이드 서열의 선별(screen)로부터 선택되었다. 개발된 MTD는 공통 서열 또는 서열 모티프를 가지지 않았지만, 이들은 모두 소수성 및 알파-나선 형태를 채택하는 경향을 제외하고 공통 서열 또는 모티프가 결여된 신호 서열의 소수성(H) 영역(HRSS)으로부터 유래되었다. H-영역 서열의 광범위한 변이는 막 전좌 활성을 갖는 단백질에 대한 이전의 진화 및 SRP/Sec61 기계에 대한 후속 적응을 반영할 수 있으며, 상기 SRP/Sec61 기계는 매우 다양한 신호 펩타이드 서열을 수용하기 위해 SRP 내의 메티오닌-풍부 신호 펩타이드 결합 포켓을 이용한다.
종래 기술된 소수성 CPP(예컨대, MTS/MTM 및 MTD)는 분비된 단백질 및 세포 표면 단백질의 신호 펩타이드에 존재하는 소수성 영역으로부터 유래되었다. 선행 기술은 첫째로, H-영역 서열(MTS/MTM)의 임시 사용(ad hoc use), 및 둘째로, 1,500개 신호 서열의 선별로부터 선택된 가장 높은 CPP 활성을 갖는 H-영역 서열(변형이 있거나 없음)(MTM)로 이루어진다. 두 번째 선행 기술인 변형된 H-영역 유래의 소수성 CPP 서열은 섬유아세포 성장인자(FGF) 4로부터 유래된 MTS/MTM을 제외하고 다수의 이용가능한 서열을 갖는 다양성에 있어서 개선되었다. 그러나, 자연적으로 존재하는 분비된 단백질로부터 변형될 수 있는 MTD의 수는 다소 제한적이다. 이들의 세포 투과성을 결정하는데 규칙이 없기 때문에, 변형된 MTD 서열의 세포 투과성은 이들을 시험하기 전까지 예측할 수 없다.
상기 소수성 CPP는, 이들이 유래된 신호 펩타이드와 마찬가지로, 공통 서열을 따르지 않았고, 단백질 카고 내로 혼입될 때 단백질 용해도에 악영향을 미쳤다. 따라서, 본 발명자들은 단백질 용해도를 유지하면서 단백질을 포함하는 거대 분자 카고를 세포 및 조직 내로 전달하는 향상된 능력을 갖는 새로운 소수성 CPP를 디자인하기 위해, 최적 서열 및 구조적 결정인자, 즉 결정 인자(CF)를 확인하고자 하였다. 이러한 새롭게 개발된 CPP인 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)은 상기 결정 인자에 기초하여 디자인되고 개발될 수 있는 거의 무한한 가능한 디자인을 가능하게 하였다. 또한, 이들의 세포 투과성은 어떤 시험관내 및/또는 생체내 실험을 수행하기 전에 이들의 특성 분석에 의해 예측될 수 있다. 하기의 이러한 결정 인자는 모든 공개된 레퍼런스 소수성 CPP를 분석함으로써 개발되었다.
1-1. 소수성
CPP의
분석
1995년부터 2014년까지 공개된(표 2) 17개의 상이한 소수성 CPP(표 1)를 선택하였다. 선택된 소수성 CPP의 생리학적 및 화학적 특성을 분석한 후, 세포 투과성과 연관될 수 있는 11개의 상이한 특성을 추가 분석을 위해 선택하였다. 이러한 11개의 특성은 다음과 같다: 서열, 아미노산 길이, 분자량, pI 값, 굽힘 잠재성, 강성/유연성, 구조적 특징, 소수성 지수, 잔기 구조, 아미노산 조성 및 서열의 이차 구조(표 3).
하기 표 1은 선택된 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드의 요약을 나타낸다.
하기 표 2는 참조 정보를 요약한다.
하기 표 3은 분석된 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(A)의 특성을 나타낸다.
두 가지 펩타이드/단백질 분석 프로그램을 사용하여(ExPasy: SoSui: http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html) 펩타이드 서열의 다양한 지수 및 구조적 특징을 결정하고, 새로운 서열을 디자인하였다. 하기는 분석된 중요한 인자이다.
1-2. 분석된
펩타이드의
특성: 길이, 분자량 및
pl
값
분석된 펩타이드의 평균 길이, 분자량 및 pl 값은 각각 10.8±2.4, 1,011±189.6 및 5.6±0.1이었다(표 4).
하기 표 4는 분석된 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(A)의 결정 인자(CF)를 요약한다.
1-3. 분석된
펩타이드의
특성: 굽힘 잠재성 - 프롤린 위치(PP)
프롤린(P)이 존재하는지 및/또는 재조합 단백질에서 펩타이드에 굽힘 잠재성을 제공하는 아미노산(들)이 어디에 위치하는지에 관한 사실에 기초하여 굽힘 잠재성(굽힘 또는 비굽힘)을 결정하였다. 프롤린은 그의 측쇄가 알파-탄소 원자뿐만 아니라 백본 질소 원자에 결합된다는 점에서 다른 일반적인 아미노산과 상이하다. 생성된 사이클릭 구조는 폴딩된 펩타이드/단백질 사슬의 굽어진 곳(bend)에서 종종 발견되는 단백질 구조(architecture)에 현저한 영향을 미친다.
17개 중 11개가 '굽힘' 펩타이드로서 결정되었는데, 이는 프롤린이 펩타이드 굽힘을 위해 서열의 중간에 존재하고/하거나 단백질 굽힘을 위해 펩타이드의 말단에 위치한다는 것을 의미한다. 상기에 나타난 바와 같이, 펩타이드 서열은 "굽은" 형태로 원형질 막을 투과할 수 있다. 그러므로, 굽힘 또는 비굽힘 잠재성은 현 소수성 CPP의 향상을 위한 결정 인자 중 하나로서 간주된다.
1-4. 분석된
펩타이드의
특성: 강성/유연성 - 불안정성 지수(Instability Index; II)
임의의 펩타이드의 결정적인 구조적 특징 중 하나는 펩타이드 서열의 온전한 물리화학적 특성인 모티프가 강성인지 또는 유연한지에 관한 사실에 기초하므로, 상기 서열의 불안정성 지수(II)를 결정하였다. 펩타이드의 강성/유연성을 나타내는 지수 값은 매우 다양했지만(8.9 - 79.1), 평균 값은 40.1±21.9였고, 이는 상기 펩타이드가 다소 유연하지만 너무 강성이거나 유연하지 않다는 것을 시사하였다(표 3).
1-5. 분석된
펩타이드의
특성: 구조적 특징 - 구조적 특징(지방족 지수: AI) 및 소수성 지수(소수성 지수의 전체 평균: GRAVY)
알라닌(V), 발린(V), 류신(L) 및 이소류신(I)은 지방족 측쇄를 함유하고, 소수성, 즉 물에 대한 혐오감을 가지며 응집되는 것을 좋아한다. 소수성 및 지방족 잔기를 갖는 이러한 아미노산들은 상기 아미노산들이 꽉 채워져 구멍이 거의 없는 치밀한 구조를 형성하게 한다. 분석된 펩타이드 서열은 17개 중 하나(MTD10 - 표 3)에서만 글리신(G)을 제외하고 모든 구성 아미노산이 소수성(A, V, L 및 I)이었으며, 지방족(A, V, L, I, 및 P)이었음을 나타내었다. 이들의 소수성 지수(hydropathic index)(소수성 지수의 전체 평균: GRAVY) 및 지방족 지수(AI)는 각각 2.5±0.4 및 217.9±43.6이었다. 이들의 아미노산 조성이 또한 표 3에 나타나 있다.
1-6. 분석된
펩타이드의
특성: 이차 구조(나선도(
Helicity
))
상기에 설명한 바와 같이, CPP 서열은 α-나선 형태를 갖는 소수성 서열을 갖는 "굽은" 배열로 막 내로 삽입된 후 곧바로 원형질 막을 투과하는 것으로 가정될 수 있다. 또한, 본 발명자들의 분석은 굽힘 잠재성이 막 투과에 매우 중요하다는 것을 강하게 나타내었다. 그러므로, 상기 서열이 나선을 형성하는지 여부를 결정하기 위해 상기 펩타이드의 구조 분석을 수행하였다. 9개의 펩타이드는 나선이었고, 8개는 그렇지 않았다(표 3). 나선 구조가 필요하지 않을 수 있다는 것을 시사하는 것으로 보인다.
1-7. 결정 인자(CF)의 결정
분석된 11개의 특성에서, 하기 6개, 즉 새로운 소수성 CPP인 개선된 MTD의 개발을 위한 "결정 인자"가 선택된다: 아미노산 길이, 굽힘 잠재성(프롤린 존재 및 위치), 강성/유연성(불안정성 지수: II), 구조적 특징(지방족 지수: AI), 소수성 지수(GRAVY) 및 아미노산 조성/잔기 구조(소수성 및 지방족 A/a)(표 3 및 표 4).
2. '결정 인자'를 최적화하기 위한 선택된 소수성
CPP
의 분석
지난 20년간 종래 개발된 17개의 상이한 소수성 CPP의 분석 데이터(분석 A, 표 3 및 4)가 높은 편차를 나타내어 공통 특징을 만들기 어려웠으므로, 향상된 CPP-aMTD의 더 나은 디자인을 위한 결정 인자를 최적화하기 위해 분석 B(표 5 및 6) 및 C(표 7 및 8)를 또한 수행하였다. 따라서, 17개의 소수성 CPP를 2개의 그룹으로 나누고, 상기 그룹을 세포 투과성 특성과 관련된 특성에 대해 분석하였다. 상기 그룹의 분석 데이터를 비교 및 대조하고 세포 투과 특성에 결정적일 수 있는 공통된 상동성 특징을 결정함으로써 결정 인자를 최적화하였다.
2-1.
생체내에서
생물학적 활성
카고
단백질에 사용된
펩타이드의
선택적 분석(B)
분석 B에서, 8개의 CPP를 생체내에서 각각의 생물학적 활성 카고와 함께 사용하였다. 길이는 11±3.2였지만, 8개 CPP 중 3개는 굽힘 잠재성이 거의 없었다. 강성/유연성(불안정성 지수: II)은 41±15였지만, 상기 펩타이드 중 하나[MTD85: 강성임, 최소 II (9.1)]를 제거하면 전체 불안정성 지수가 45.6±9.3으로 증가하였다. 이것은 더 높은 유연성(40 또는 이상 II)이 잠재적으로 더 좋다는 것을 시사하였다. 8개 CPP의 다른 모든 특성은 구조적 특징 및 소수성 지수를 포함하는 분석 A와 유사하였다(표 5 및 6).
하기 표 5는 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(B)의 특성을 나타낸다: 생체내에서 각각의 카고에 사용된 선택된 CPP.
하기 표 6은 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(B)의 요약된 결정 인자를 나타낸다.
2-2. 굽힘 잠재성 및 더 높은 유연성을 제공한
펩타이드의
선택적 분석(C)
분석 A, B 및 C에서 결정된 '결정 인자'가 소수성 CPP의 현재의 문제(MTS/MTM 또는 MTD에 융합된 재조합 단백질의 단백질 응집, 낮은 용해도/수율, 및 불량한 세포/조직 투과성, 및 상기 펩타이드의 비공통 서열 및 비상동 구조)를 향상시키는데 정확하였다는 것을 입증한 aMTD 및 무작위 펩타이드(rP 또는 r펩타이드)의 실제 디자인을 위해 '결정 인자의 공통 범위 및/또는 공통 특징'을 최적화하고자, 경험적으로 선택된 펩타이드를 대상으로 이들의 구조적 특징 및 물리화학적 인자 지수에 대해 분석하였다.
굽힘 잠재성이 없는 소수성 CPP, 강성이거나 너무 유연한 서열(너무 낮거나 너무 높은 불안정성 지수), 또는 너무 낮거나 너무 높은 소수성 CPP는 선택하지 않았고, 서열의 나선 구조가 필요하지 않았기 때문에 이차 구조는 고려하지 않았다.
분석 C에서, 굽힘 잠재성 및 더 높은 유연성을 제공할 수 있는 8개의 선택된 CPP 서열을 최종 분석하였다(표 7 및 8). 일반적인 아미노산 길이는 12개(11.6±3.0)이다. 프롤린은 서열의 중간 및/또는 말단에 존재한다. 강성/유연성(II)은 45.5 - 57.3(평균: 50.1±3.6)이다. 펩타이드의 구조적 특징 및 소수성을 나타내는 AI 및 GRAVY는 각각 204.7±37.5 및 2.4±0.3이다. 모든 펩타이드는 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I, 및 P)으로 구성된다. 따라서, 분석 C를 새로운 소수성 CPP-aMTD의 새로운 디자인을 위한 표준으로서 선택하였다.
하기 표 7은 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(C)의 특성을 나타낸다: 굽힘 잠재성 및 더 높은 유연성을 제공한 선택된 CPP.
하기 표 8은 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(C)의 요약된 결정 인자를 나타낸다.
3. 최적화된 결정 인자에 기초하여 향상된 소수성
CPP
-
aMTD
의 새로운 디자인
3-1. 공통 서열 및/또는 공통 상동 구조의 결정
전술한 바와 같이, 신호 서열(HRSS) 유래의 CPP(MTS/MTM 및 MTD)의 H-영역은 공통 서열, 서열 모티프, 및/또는 공통 구조적 상동성 특징을 갖지 않는다. 본 발명에서, 목적은 '공통 기능'을 갖도록, 즉 분석된 레퍼런스 CPP와 유사한 기전으로 막을 통과하는 단백질 전좌를 용이하게 하도록, 새롭게 결정된 '결정 인자'를 만족하는 공통 서열 및 구조적 모티프로 형식화된 향상된 소수성 CPP를 개발하는 것이다. 분석 A, B 및 C에 기초하여, 공통된 상동성 특징을 분석하여 세포 투과성에 영향을 미치는 결정 인자를 결정하였다. 각 결정 인자의 범위 값은 신규 aMTD를 디자인하는 분석 A, B 및 C로부터 각 결정 인자의 분석된 지수를 포함하는 것으로 결정되었다(표 9). 이러한 특징은 이들의 세포 투과성에서 새롭게 디자인된 aMTD를 이용하여 실험적으로 확인되었다.
하기 표 9는 분석된 CPP의 값과 신규 aMTD 서열의 새로운 디자인에 대해 결정된 값 사이의 각각의 결정 인자의 범위/특징의 비교를 나타낸다.
상기 표 9에, 보편적인 공통 특징 및 서열/구조적 모티프가 제공되어 있다. 길이는 9-13개 아미노산이며, 굽힘 잠재성은 펩타이드 굽힘을 위해 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8' 아미노산에) 및 재조합 단백질 굽힘을 위해 펩타이드의 말단에 프롤린의 존재로 제공되어 있고, II>40인 aMTD의 강성/유연성이 표 9에 기재되어 있다.
3-2. 개선된
MTD
의 개발을 위한 결정 인자
단백질을 포함하는 치료 활성 카고 분자를 살아있는 세포 내로 전달하는 소수성 CPP에 융합된 재조합 세포 투과성 단백질이 종래에 보고되었지만, 박테리아 시스템에서 발현된 융합 단백질은 낮은 용해도 및 수율 때문에 가용성 형태로 정제되기 어려웠다. 단백질 기반 바이오치료제로서 세포 투과성 단백질의 추가적인 임상 개발을 위해 상기 결정적인 약점을 해결하고자, 결정 인자 기반의 펩타이드 분석을 통해 개선된 MTD(aMTD)로 명명된 매우 향상된 형태의 소수성 CPP가 새롭게 개발되었다. aMTD의 현 발명을 위해 사용된 결정 인자가 본원에 제시되어 있다(표 9).
1. 아미노산 길이: 9 - 13
2. 굽힘 잠재성(프롤린 위치: PP)
: 서열의 중간(5' 내지 8' 아미노산) 및 말단에 프롤린 존재
3. 강성/유연성(불안정성 지수: II): 40 - 60
4. 구조적 특징(지방족 지수: AI): 180 - 220
5. 소수성 지수(GRAVY): 2.1 - 2.6
6. 아미노산 조성: 소수성 및 지방족 아미노산 - A, V, L, I 및 P
3-3. 모든 결정 인자가 고려되고
만족되는
잠재적인 최선의
aMTD
의 디자인
소수성 CPP의 독특한 특징의 분석으로부터 비롯된 6개의 결정 인자를 면밀히 고려한 후, 상기 분석으로부터 결정된 아미노산 길이(9 - 13)를 포함하는 결정 인자를 만족하는 공통적인 12개 아미노산 플랫폼에 기초하여 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)을 디자인하고 개발하였다.
[일반식]
이들의 세포 투과성을 결정하기 위해 많은 실험을 필요로 하는 종래 공개된 소수성 CPP와 달리, 새롭게 개발된 aMTD 서열은 각 결정 인자의 결정된 범위 값/특징을 따르는 상기 언급된 플랫폼을 이용하여 하기와 같이 단지 몇 가지 단계를 수행함으로써 디자인될 수 있었다.
첫째, aMTD를 위한 12개 아미노산 서열 플랫폼을 준비한다. 둘째, 서열의 말단(12')에 프롤린(P)을 위치시키고 5', 6', 7', 및 8의 4개의 U 중 하나에 프롤린을 위치시킬 장소를 결정한다. 셋째, 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 X(들) 및/또는 U(들)에 위치시키고, 여기에 프롤린은 위치시키지 않는다. 마지막으로, 상기 플랫폼에 기초하여 디자인된 아미노산 서열이 aMTD 서열의 세포 투과 특성을 보장하는 6개의 결정 인자의 값 또는 특징을 만족시키는지를 결정한다. 이러한 과정을 통해, 많은 신규 aMTD 서열이 제작되었다. 각 aMTD에 융합된 비기능적 카고 재조합 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터를 제작하였고 박테리아 세포에서 강제 발현시켰다. 이러한 aMTD 융합된 재조합 단백질을 가용성 형태로 정제하고 이들의 세포 투과성을 정량적으로 결정하였다. 표 10 - 15에 나타난 바와 같이, 1부터 240까지 번호가 매겨진 aMTD 서열이 새롭게 디자인되었다. 표 10 - 15에서, 서열번호는 참조용 서열 목록이고, aMTD 번호는 실험에서 실제 사용된 아미노산 목록 번호를 지칭한다. 추가 실험을 위해, aMTD 번호가 사용되었다. 또한, 상기 서열 목록에 나타난 폴리뉴클레오타이드 서열을 서열번호: 241부터 서열번호: 480까지 번호를 매겼다.
하기 표 10 내지 15는 모든 결정 인자를 만족하도록 개발된 240개의 새로운 소수성 aMTD 서열을 나타낸다.
3-4. 적어도 하나의 결정 인자를 만족하지 않은
펩타이드의
디자인
전술한 모든 결정 인자를 만족하는 새로운 소수성 CPP-aMTD의 본 발명이 정확하고 합리적으로 디자인된다는 것을 입증하기 위해, 적어도 하나의 결정 인자를 만족하지 않는 펩타이드를 또한 디자인하였다. 총 31개의 r펩타이드(rP)를 디자인하고, 개발하며, 하기와 같이 분류한다: 비굽힘(no bending) 펩타이드, 중간 뿐만 아니라 말단에 프롤린이 없고/없거나 중앙 프롤린이 없음; 강성인 펩타이드(II < 40); 너무 유연한 펩타이드; 방향족 펩타이드(방향족 고리 존재); 소수성, 비방향족인 펩타이드를 갖지만 A, V, L, I, P 또는 추가의 프롤린 잔기 이외의 아미노산을 가짐; 친수성이지만 비지방족인 펩타이드.
3-4-1. 굽힘 잠재성을 만족하지 않는
펩타이드
표 16은 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 어떠한 프롤린도 갖지 않는 펩타이드를 나타낸다. 또한, 표 16은 서열의 중간에 프롤린을 갖지 않는 펩타이드를 기술한다. 이러한 모든 펩타이드는 굽힘 잠재성을 갖지 않는 것으로 가정된다.
3-4-2. 강성/유연성을 만족하지 않는
펩타이드
서열의 강성/유연성이 결정적인 결정 인자임을 입증하기 위해, 강성인 서열(Avg. II: 21.8±6.6) 및 너무 유연성이 높은 서열(Avg. II: 82.3±21.0)을 또한 디자인하였다. 불안정성 지수가 새로운 aMTD(II: 41.3 - 57.3, Avg. II: 53.3±5.7)보다 훨씬 더 낮은 강성인 펩타이드가 표 17에 나타나 있다. II가 새로운 aMTD보다 훨씬 더 높은, 굽어지지만 너무 유연성이 높은 펩타이드 또한 표 18에 제공되어 있다.
3-4-3. 구조적 특징을 만족하지 않는
펩타이드
새로운 소수성 CPP-aMTD는 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)만으로 구성되며, 지수의 평균 범위는 AI: 180 - 220이고 GRAVY: 2.1 - 2.6이다(표 9). 구조적 지수에 기초하여, 방향족 잔기(W, F 또는 Y)를 함유하는 펩타이드가 표 19에 나타나 있으며, 소수성이며, 비방향족 서열을 가지나 A, V, L, I, P 또는 추가의 프롤린 잔기 이외의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 디자인한다(표 20). 최종적으로, 비지방족 아미노산으로 구성된 친수성 및/또는 굽힘 펩타이드가 표 21에 나타나 있다.
3-5. 새롭게 디자인된
펩타이드의
요약
총 457개의 서열이 결정 인자에 기초하여 디자인되었다. 결정 인자의 모든 범위/특징을 만족하는 디자인된 잠재적으로 최선인 aMTD(소수성, 유연성, 굽힘, 지방족 및 12-A/a 길이 펩타이드)는 316개이다. 결정 인자 중 적어도 하나를 만족하지 않는 디자인된 r펩타이드는 141개이며, 이 중에서 비굽힘 펩타이드 서열은 26개이고; 강성인 펩타이드(II<40) 서열은 23개이며; 너무 유연한 펩타이드는 24개이고; 방향족 펩타이드(방향족 고리 존재)는 27개이며; 소수성이지만 비방향족인 펩타이드는 23개이고; 친수성이지만 비지방족인 펩타이드는 18개이다.
4.
aMTD
및 r
펩타이드에
융합된 재조합 리포트 단백질의 제조
aMTD 및 다른 것[r펩타이드, 레퍼런스 소수성 CPP 서열(MTM 및 MTD)]에 융합된 재조합 단백질을 박테리아 시스템에서 발현시키고, 단일 단계 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 생리학적 조건에서 가용성 단백질로서 제조하였다. 이러한 재조합 단백질을 유세포분석법 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사를 이용하여 세포 투과 능력에 대해 시험하였다.
4-1.
펩타이드
서열에 융합된 재조합 단백질에 대한 카고 단백질의 선택
임상/비임상 적용을 위해, aMTD 융합된 카고 물질은 생물학적 활성 분자일 것이며, 이는 하기 중 하나일 수 있다: 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편. 더욱이, 생물학적 활성 분자는 이러한 하기 거대분자 중 하나일 수 있다: 효소, 호르몬, 담체, 면역글로불린, 막 결합 단백질, 막관통 단백질, 내부 단백질, 외부 단백질, 분비된 단백질, 바이러스 단백질, 천연(native) 단백질, 당단백질, 단편화된 단백질, 디설파이드 결합 단백질, 재조합 단백질, 화학적으로 변형된 단백질 및 프리온. 또한, 이러한 생물학적 활성 분자는 하기 중 하나일 수 있다: 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNA, 안티센스 RNA 분자, 탄수화물, 지질 및 당지질.
이러한 사전요구된 조건에 따르면, aMTD 매개 단백질 흡수를 평가하는 비기능성 카고가 선택되었고 카고 A(CRA)로 불리며, 이는 가용성이며 비기능적일 것이다. 상기 도메인(A/a 289 - 840; 184 A/a 길이)은 단백질 S(Genbank ID: CP000113.1)로부터 유래된다.
4-2. 발현 벡터의 제작 및 재조합 단백질의 제조
각각의 aMTD에 융합된 재조합 단백질에 대한 코딩 서열을 PCR 증폭된 DNA 절편으로부터 pET-28a(+)(Novagen, Darmstadt, Germany) 내의 Ndel(5') 및 SalI(3') 내로 클로닝한다. aMTD 및 r펩타이드에 융합된 재조합 단백질에 대한 PCR 프라이머가 서열번호: 481~797로 표시되어 있다. 재조합 단백질의 구조가 도 1에 나타나 있다.
상기 재조합 단백질을 0.6의 OD600까지 성장한 E. coli BL21(DE3) 세포에서 강제적으로 발현시키고 0.7 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 2시간 동안 유도하였다. 상기 단백질을 자연 조건에서 제조사(Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 지시된 바와 같이 Ni2+ 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제 후, 정제된 단백질을 DMEM 배지와 같은 생리학적 버퍼에 용해시켰다.
4-3.
aMTD
또는 무작위
펩타이드
(rP) 융합된 재조합 단백질의 발현
본 발명은 또한 세포 투과성을 갖는 aMTD 서열의 개발 방법에 관한 것이다. 표준화된 6개의 결정 인자를 이용하여, 316개의 aMTD 서열이 디자인되었다. 또한, 이러한 결정 인자 중 하나가 결여된 141개의 r펩타이드를 또한 개발한다: 비굽힘 펩타이드: i) 서열의 중간 및 말단 모두에서의 프롤린의 부재 또는 ii) 서열의 중간 또는 말단에서의 프롤린의 부재, 강성인 펩타이드, 너무 유연한 펩타이드, 방향족 펩타이드(방향족 고리 존재), 소수성이지만 비방향족인 펩타이드, 및 친수성이지만 비지방족인 펩타이드(표 22).
이러한 r펩타이드는 펩타이드의 세포내 전달 잠재성에 관한 각 결정 인자의 구조/서열 활성 관계(SAR)를 분석하기 위해 aMTD와 비교 및 대조되도록 고안된다. 모든 펩타이드(aMTD 또는 r펩타이드) 함유 재조합 단백질은 발현될 재조합 단백질의 용해도를 향상시키기 위해 CRA에 융합되고, 정제되며, 제조되고, 분석되었다.
CRA에 융합된 이들 디자인된 316개의 aMTD 및 141개의 r펩타이드를 모두 클로닝하고(도 2) E. coli에서 유도성 발현에 대해 시험하였다(도 3). 이러한 펩타이드 중에서, 240개의 aMTD가 유도성으로 발현되었고, 정제되었으며, 가용성 형태로 제조되었다(도 4). 또한, 31개의 r펩타이드가 또한 가용성 형태로서 제조되었다(도 4).
r펩타이드에 융합된 단백질을 제조하기 위해, 60개의 단백질이 발현되었고, 26개 r펩타이드 중 10개는 비굽힘 펩타이드의 카테고리에 속하였고(표 16); 23개 중 15개는 강성인 펩타이드[불안정성 지수(II) < 40]의 카테고리에 속하였으며(표 17); 24개 중 19개는 너무 유연한 펩타이드의 카테고리에 속하였고(표 18); 27개 중 6개는 방향족 펩타이드의 카테고리에 속하였으며(표 19); 23개 중 8개는 소수성이지만 비방향족인 펩타이드의 카테고리에 속하였고(표 20); 18개 중 12개는 친수성이지만 비지방족인 펩타이드의 카테고리에 속하였다(표 21).
4-4.
aMTD
융합된 재조합 단백질의 정량적 세포 투과성
aMTD 및 r펩타이드를 형광 표지하고 유세포분석법 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사를 이용하여 세포 투과성에 대한 결정 인자에 기초하여 비교하였다(도 5 내지 8). 펩타이드 융합된 비기능성 카고 재조합 단백질의 세포 흡수는 유세포분석법에서 정량적으로 평가될 수 있는 반면, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사는 세포내 흡수가 시각적으로 평가될 수 있게 한다. 상기 분석은 aMTD(소수성 및 지방족 서열)와 반대 특성(친수성 및 방향족 서열: YYNQSTCGGQCY)을 갖는 음성 대조군[rP38]에 융합된 재조합 단백질을 포함하였다. 음성 대조군에 대한 aMTD의 상대적 세포 투과성(상대적 배수)을 또한 분석하였다(표 23 및 도 9).
하기 표 23은 음성 대조군(A: rP38)과 aMTD의 세포 투과성의 비교 분석을 나타낸다.
레퍼런스 CPP[B: MTM12(AAVLLPVLLAAP), C: MTD85(AVALLILAV)]에 대한 aMTD의 상대적 세포 투과성(상대적 배수)을 또한 분석하였다(표 24 및 25).
하기 표 24는 레퍼런스 CPP(B: MTM12)와 aMTD의 세포 투과성의 비교 분석을 나타낸다.
하기 표 25는 레퍼런스 CPP(C: MTD85)와 aMTD의 세포 투과성의 비교 분석을 나타낸다.
임의의 펩타이드(rP38 또는 aMTD)가 결여된 비융합(naked) 단백질(히스티딘-태그된 CRA 단백질)에 의해 차감된 음성 대조군(히스티딘-태그된 rP38 융합된 CRA 재조합 단백질)의 기하 평균을 상대적 배수 1로서 표준화하였다. 음성 대조군(A 유형)에 대한 240개 aMTD의 상대적 세포 투과성은 164배까지 유의하게 증가하였고, 평균 증가는 19.6±1.6이었다(표 26 - 31).
더욱이, 레퍼런스 CPP(B 유형: MTM12 및 C 유형: MTD85)와 비교하여, 신규 240개 aMTD는 각각 평균 13±1.1(최대 109.9) 및 6.6±0.5(최대 55.5)배 더 높은 세포 투과성이었다(표 26 - 31).
또한, 31개 r펩타이드의 세포 투과성을 240개 aMTD와 비교하였다(0.3±0.04; 표 32 및 33).
요약하면, aMTD의 상대적 세포 투과성은 각각 rP38, MTM12 및 MTD85보다 최대 164.0, 109.9 및 55.5배 더 높았다. 총 240개 aMTD 서열의 평균에서, 각각 19.6±1.6, 13.1±1.1 및 6.6±0.5배 더 높은 세포 투과성이 rP38, MTM12 및 MTD85에 대해 나타난다(표 26-31). 240개 aMTD에 대한 음성 대조군(rP38)의 상대적 세포 투과성은 단지 0.3±0.04배이다.
4-5.
aMTD
융합된 재조합 단백질의
세포내
전달 및
국소화
aMTD에 융합된 재조합 단백질을 음성 대조군(rP38) 및 양성 대조군 참조로서 종래 공개된 CPP(MTM12 및 MTD85)를 이용한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사에 의해 시험하여 이들의 세포내 전달 및 국소화를 결정하였다. NIH3T3 세포를 37℃에서 1시간 동안 10 μM의 FITC 표지된 단백질에 노출시키고, 핵을 DAPI로 반대염색하였다. 그리고 나서, 세포를 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에 의해 조사하였다(도 7). aMTD에 융합된 재조합 단백질은 세포내 전달 및 세포질 국소화를 명확하게 나타내며(도 7), 이는 전형적으로 레퍼런스 CPP(MTM12 및 MTD85)보다 더 높다. rP38 융합된 재조합 단백질은 국소화된 형광 신호를 나타내지 않았다(도 7a). 또한, 도 8에서 나타난 바와 같이, r펩타이드(각 r펩타이드에 융합된 히스-태그된 CRA 재조합 단백질)는 더 낮은 세포 투과성 또는 비세포 투과성을 나타낸다.
4-6. 새롭게 개발된
aMTD
의 정량적 및 시각적 세포 투과성의 요약
히스티딘-태그된 aMTD 융합된 카고 재조합 단백질은 용해도 및 수율이 크게 향상되었다. 따라서, FITC 접합된 재조합 단백질을 또한 단백질의 세포내 국소화를 정량화하고 시각화하기 위해 시험하였고 레퍼런스 CPP 대비 더 높은 세포 투과성을 입증하였다.
소수성 신호 서열 유래의 CPP-MTS/MTM 또는 MTD를 이용한 종래 연구에서, 17개의 공개된 서열이 확인되었고 길이, 분자량, pI 값, 굽힘 잠재성, 강성, 유연성, 구조적 특징, 소수성 지수, 아미노산 잔기 및 조성, 및 펩타이드의 이차 구조와 같은 다양한 특성이 분석되었다. 상기 서열의 이러한 분석 데이터에 기초하여, 개선된 MTD(aMTD)로서 지정된 신규 인공 및 비천연 펩타이드 서열을 발명하였고, aMTD 융합된 재조합 단백질을 이용하여 세포내 전달 잠재성에서의 이들의 기능적 활성을 결정하였다.
aMTD 융합된 재조합 단백질은 r펩타이드 및/또는 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)를 함유하는 재조합 단백질과 비교하여 세포 내로의 단백질 전달 능력을 촉진하였다. 상기 결과에 따르면, 세포 투과성 펩타이드 서열의 결정 인자가 원형질 막 통과에 의한 펩타이드 매개 세포내 전달을 결정하는 주요 역할을 한다는 것이 입증되었다. 또한, 세포 투과성은 결정 인자를 모두 만족하는 근거를 따름으로써 상당히 향상될 수 있다.
5. 전달 잠재성에 대한
aMTD
의 구조/서열 활성 관계(
SAR
)
신규 aMTD의 세포 투과성을 결정한 후, 신규 aMTD의 선택된 일부 및 모두에서 각 결정 인자에 대해 구조/서열 활성 관계(SAR)를 분석하였다(도 13 내지 16 및 표 34).
5-1. 프롤린 위치: 굽힘 잠재성(프롤린 위치: PP)과 관련하여, 서열 내 7' 또는 8' 아미노산에 프롤린을 갖는 aMTD는 프롤린 위치가 5' 또는 6'인 서열과 비교하여 훨씬 더 높은 세포 투과성을 갖는다(도 14a 및 15a).
5-2. 소수성 지수: 또한, aMTD가 2.1 - 2.2 범위의 GRAVY(소수성 지수의 전체 평균)를 가질 때, 이들 서열은 상대적으로 더 낮은 세포 투과성을 나타내는 반면, 2.3 - 2.6 GRAVY를 갖는 aMTD는 유의하게 더 높은 세포 투과성을 나타낸다(도 14b 및 15b).
5-3. r펩타이드 SAR: aMTD의 SAR에 대해, r펩타이드는 그들의 프롤린 위치(PP) 및 소수성 지수(GRAVY)과 관련된 세포 투과성에서 유사한 SAR 상관관계를 나타내었다. 이러한 결과는 높은 GRAVY(2.4 ~ 2.6)를 갖는 r펩타이드가 더 우수한 세포 투과성을 갖는다는 것을 확인시켜준다(도 16).
5-4. 아미노산 조성의 분석: 프롤린 위치 및 소수성 지수 외에도, 아미노산 조성의 차이를 또한 분석한다. aMTD는 결정 인자에 기초하여 디자인되므로, 각각의 aMTD 융합된 재조합 단백질은 조성 내에 동일하게 2개의 프롤린 서열을 갖는다. 다른 소수성 및 지방족 아미노산인 알라닌, 이소류신, 류신 및 발린은 조합되어 aMTD 펩타이드 서열의 나머지를 형성한다.
알라닌: 아미노산의 조성에서, 상기 결과는 aMTD의 전달 잠재성 측면에서 알라닌의 수에 의해 유의한 차이를 나타내지 않는데, aMTD 모두가 3개 내지 5개의 알라닌을 가지기 때문이다. 그러나, 상기 서열에서, 4개의 알라닌 조성이 가장 효과적인 전달 잠재성(기하 평균)을 나타낸다(도 13a).
류신 및 이소류신: 또한, aMTD 서열에서 이소류신 및 류신의 조성은 aMTD의 아미노산(I 및 L)의 수 및 전달 잠재성 사이에 역관계를 나타낸다. 서열에서 이소류신 및 류신의 수가 더 적을수록 더 높은 전달 잠재성(기하 평균)을 가지는 경향이 있다(도 13a 및 13b).
발린: 반대로, aMTD 서열의 발린의 조성은 이들의 세포 투과성과 양의 상관관계를 나타낸다. 서열에서 발린의 수가 적은 경우, aMTD의 전달 잠재성 역시 상대적으로 낮다(도 13b).
가장 높은 세포 투과성을 갖는 10개의 aMTD를 선택한다(평균 기하 평균: 2584±126). 서열에서 이들의 발린의 평균 수는 3.5이며; 상대적으로 낮은 세포 투과성(평균 기하 평균: 80±4)을 갖는 10개의 aMTD는 평균 1.9개의 발린 아미노산을 가지고 있었다. 서열에서 발린의 평균 수는 도 13b에 나타난 바와 같이 이들의 세포 투과성이 낮아짐에 따라 낮아진다. 더 높은 세포 투과성 aMTD 그룹과 비교하여, 더 낮은 서열은 그들의 발린 조성에서 평균 1.9를 가지고 있었다. 따라서, 높은 세포 투과성 서열을 얻기 위해, 평균 2-4개의 발린이 서열에 구성되어야 한다.
5-5. SAR 분석의 결론: 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 240개의 모든 aMTD를 세포 투과성 및 결정 인자(굽힘 잠재성(PP), 강성/유연성(II), 구조 특징(AI), 및 소수성 지수(GRAVY), 아미노산 길이 및 조성)의 연관성에 대해 조사하였다. 이 분석을 통해, aMTD의 세포 투과성은 이들의 중심 프롤린 위치가 5' 또는 6'이고 GRAVY가 2.1 이하일 때 더 낮은 경향이 있다(도 15). 더욱이, 10개의 더 높은 세포 투과성 aMTD 및 10개의 더 낮은 세포 투과성 aMTD를 조사한 후, 이러한 경향은 세포 투과성의 중심 프롤린 위치 및 소수성 지수와의 연관성을 확인시켜 주는 것으로 명확히 나타난다.
6. 결정 인자의 지수 범위/특징의 실험적 확인
6개의 결정 인자 중 5개의 범위 및 특징은 또한 실험 및 SAR 분석을 수행하기 전에 처음에 제안된 결정 인자의 지수 범위 및 특징에 포함되는 것으로 경험적 및 실험적으로 결정되었다. 새롭게 개발된 240개의 aMTD의 결정 인자의 지수 범위 및 특징의 측면에서, 굽힘 잠재성(프롤린 위치: PP), 강성/유연성(불안정성 지수: II), 구조적 특징(지방족 지수: AI), 소수성 지수(GRAVY), 아미노산 길이 및 조성 모두는 레퍼런스 소수성 CPP의 분석으로부터 유래된 결정 인자의 특성에 속한다.
따라서, 개선된 MTD로서 새로운 소수성 CPP 서열을 디자인하고 개발하는 본 발명자들의 가설은 경험적 및 실험적으로 입증되고, 결정 인자 기반의 새로운 aMTD 합리적 디자인이 정확하다는 것을 입증하였다.
7. 단백질 요법을 위해 aMTD에 의해 가능하게 된 MITT를 이용한 단백질 기반의 새로운 바이오치료제의 발견 및 개발
aMTD 서열이 결정 인자에 기초하여 디자인되고 개발되었다. 240개의 aMTD(소수성, 유연한, 굽힘, 지방족 및 12 a/a 길이 펩타이드)의 정량적 및 시각적 세포 투과성은 모두 실질적으로 결정된다.
aMTD의 세포 투과성을 결정하기 위해, r펩타이드를 또한 디자인하고 시험하였다. 도 13 내지 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 펩타이드의 세포 투과성 및 결정 인자는 분명한 연관성이 있다. 이들 결정 인자 중에서, 본 발명자들은 가장 효과적인 세포 투과성 aMTD가 12개의 아미노산 길이; A, V, L, I 및 P의 조성; 7' 또는 8' 중 어느 하나 및 말단(12')에 위치한 다수의 프롤린; 41.3 - 57.3 범위의 불안정성 지수; 187.5 - 220.0 범위의 지방족 지수; 및 2.2-2.6 범위의 소수성 지수(GRAVY)를 갖는 것으로 설정할 수 있다.
이러한 조사된 결정 인자는 본 발명자들이 결정 인자에 대해 설정한 범위에 속하며; 따라서, 본 발명자들은 이러한 결정 인자를 만족하는 aMTD가 지난 20년 동안 보고된 레퍼런스 소수성 CPP와 비교하여 상대적으로 높은 세포 투과성 및 훨씬 더 높은 세포내 전달 잠재성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
많은 인간 질환이 기능 획득 또는 기능 손실과 같은 돌연변이를 유발하는 결핍 또는 과발현을 가진 단백질에 의해 유발된다는 것이 명확해졌다. 만약 생물학적 활성 단백질이 정량적 방식으로 비정상적인 단백질을 짧은 시간 내에, 아마도 1 또는 2시간 내에 대체하기 위해 전달될 수 있다면, 단백질이 필요한 때와 방법에 따라 복용량이 조절될 수 있다. 본 발명에서 신규 aMTD의 용해도 및 수율을 현저히 향상시킴으로써(표 31), 단백질, 펩타이드, 핵산, 및 다른 화학적 화합물과 같은 치료 거대분자를 살아있는 세포뿐만 아니라 인간을 포함하는 살아있는 포유동물 내로 효과적으로 전달하는 제제로서 그의 실제적인 잠재성을 기대할 수 있다. 따라서, 신규 aMTD의 집단을 이용하는 새롭게 개발된 MITT(240)는 최적의 카고-aMTD 관계를 결정한 후 세포내 단백질을 이해하기 위해 단백질 기반의 바이오치료제의 발견 및 개발을 위한 플랫폼 기술로서 사용될 수 있다.
8. iCP-
파킨의
개발을 위한
신규한
소수성
CPP
-
aMTD
8-1. 세포 투과성을 위한 aMT의 선택
240 aMTD로부터, iCP 파킨 재조합 단백질을 제작을 위해 12개의 aMTD를 선택하고 사용하였다. 사용된 12개의 aMTD가 하기 표 36에 나타나 있다.
다양한 소수성 CPP가 단백질 카고의 포유동물 세포 및 조직으로의 전달을 향상시키는데 사용되어 왔다. 유사하게, aMTD321 및 aMTD524는 유세포 측정법에 의해 평가된 바와 같이 RAW264.7 세포에서 가용화 도메인 A(SDA)의 His-태그된 코딩 서열의 흡수를 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 단백질 흡수의 상대적 수준은 1세대 CPP(막 전좌 모티브)를 함유한 레퍼런스 MTM12보다 7배 높았고, 2세대 CPP(거대 분자 전달 영역)을 함유한 MTD85 레퍼런스 단백질보다 2.9배 높았다. 또한, aMTD와 반대의 성질을 갖는 펩타이드 서열인 SDA와 융합된 무작위 펩타이드 재조합 단백질(rP38)에서 8.1배 더 높은 단백질 흡수가 관찰되었다(도 23). 단백질 흡수를 모니터링하기 위해 형광 현미경을 사용하여 NIH3T3 세포에서 유사한 결과가 얻어졌다. 이러한 세포 내로의 aMTD321 매개 세포내 전달을 도 24에 나타내었고 aMTD321의 정보를 표 37에 나타내었다.
표 37: aMTD321의 특징
8-2. 구조 안정성을 위한
가용화
도메인(SD)의 선택
소수성 CPP에 융합된 재조합 카고(파킨) 단백질은 박테리아 시스템에서 발현되고, 단일 단계 친화성 크로마토그래피로 정제될 수 있었지만, 생리학적 완충액(예컨대, PBS, DMEM 또는 RPMI1640 등)에 용해된 단백질은 고도로 불용성이며 가용성 형태로서 극히 낮은 수율을 가지고 있었다. 따라서, 용해도, 수율 및 최종적으로 세포 및 조직 투과성을 향상시키기 위해, 부가적인 비기능성 단백질 도메인(가용화 도메인: SD)을 적용하여 재조합 단백질과 융합하였다.
구체적인 목적에 따라, 선택된 영역은 SDA ~ SDF이다(표 38). aMTD/SD 융합된 재조합 단백질의 안정성이 결정되었다.
가용화 도메인(SD) 및 aMTD는 단백질의 용해도/수율 및 세포/조직 투과성을 증가시키는데 크게 영향을 미쳤다. 따라서, 본 발명자들은 임상 적용을 위해 SD(SDA와 SDB) 및 aMTD와 융합된 매우 가용성이며 매우 안정한 파킨 재조합 단백질을 개발하였다.
표 38: 가용화 도메인의 특성
8-3. 발현 벡터의 제작
파킨 단백질을 위한 aMTD 및 가용화 도메인을 갖거나 갖지 않는 5개의 상이한 유형의 재조합 단백질을 설계하였다. 단백질 구조를 하기와 같이 표시하였다: (1) His 태그만을 갖는 카고 단백질, (2) His 태그 및 aMTD와 융합된 카고 단백질, (3) His 태그, aMTD 및 가용화 도메인 A(SDA)와 융합된 카고 단백질, (4) His 태그, aMTD 및 가용화 도메인 B(SDB)와 융합된 카고 단백질, (4C) His 태그 및 가용화 도메인 B(SDB)와 융합된 카고 단백질, (5) aMTD 및 가용화 도메인 B(SDB)와 융합된 카고 단백질, 및 (5C) 가용화 도메인 B(SDB)와 융합된 카고 단백질(도 17). 그 중에서 (4) 및 (5) 구조를 iCP-파킨 재조합 단백질의 생물학적 효능을 갖는 후보 단백질로서 사용하였고, (4C) 및 (5C)를 (4) 및 (5)에 대해 대조군(비-CP 파킨)으로서 사용하였다.
8-4.
파킨
재조합 단백질의 제조
각각의 파킨 재조합 단백질은 IPTG를 첨가함으로써 성공적으로 유도되었고 정제되었다(도 19). 본 발명자들은, 카고 단백질 단독(HP) 또는 aMTD와만 융합된 카고 단백질(HM321P)과 비교하여, SDA(HM321PSA) 또는 SDB(HM321PSB, HM524PSB, M524PSB)와 융합된 파킨의 용해도의 유의한 증가를 관찰하였다. 상기 결과는 SD와 융합된 파킨 재조합 단백질이 용해도 및 수율의 유의한 개선을 나타내었음을 시사하였다(도 19 및 21a).
9. 각 재조합 단백질의 세포 투과성, 조직 투과성의 결정
aMTD321/SD 융합된 파킨 재조합 단백질은 aMTD321 또는 aMTD524 서열이 결여된 파킨 재조합 단백질(HP, HPSB 및 기타 aMTD)과 비교하여 유의하게 높은 세포 투과성, 조직 투과성을 갖는다. 종합하면, 이들 aMTD321/SD 융합 파킨 재조합 단백질(HM321PSA 및 HM321PSB)은 유사한 용해도 및 수율을 갖지만, aMTD321/SDB 융합된 파킨 재조합 단백질의 세포 및 전신 전달 활성은 MTD321 서열이 결여된 파킨 재조합 단백질보다 높았다. 따라서, aMTD321/SD 융합된 파킨 재조합 단백질은 재조합 단백질 중 가장 안정한 구조로서 결정되었다.
또한, MTD321 이외에, 추가로 선택된 10가지 유형의 aMTD의 용해도/수율, 투과성 및 생물학적 활성을 측정하여 도 22에 나타내었다.
9-1.
파킨
재조합 단백질의 세포 투과성
개발된 파킨 재조합 단백질의 세포/조직 투과성 및 생물학적 활성을 조사하였다. 파킨 재조합 단백질의 세포 투과성을 단백질 처리 1시간 후 RAW 264.7 세포에서 평가하였다. aMTD가 결여된 FITC 표지된 파킨 재조합 단백질(HP 및 HPSB)은 RAW 세포에서 검출되지 않았다. 대조적으로, aMTD를 갖는 파킨 재조합 단백질인 HM321P, HM321PSA, HM321PSB 및 M524PSB는 높은 세포 투과성을 나타내었다(도 26). 유사한 결과가 단백질 세포내 국소화를 모니터링하는 형광 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 NIH3T3 세포에서 얻어졌다(도 24). 특히, aMTD/SD 융합된 파킨 재조합 단백질(HM321PSA, HM321PSB 및 M524PSB)은 가장 높은 세포 투과성을 나타내었다. 이러한 결과는 aMTD가 단시간(1시간) 내에 단백질을 세포 내로 성공적으로 침투시키고 세포 투과성에 긍정적인 영향을 미치는 단백질의 용해도를 개선하였음을 보여주었다.
9-2.
파킨
재조합 단백질의 조직 투과성
다음으로, FITC 표지된 단백질의 15분 및 30분 복강내 주사 후 파킨 재조합 단백질의 생체내 조직 투과성을 결정하였다(도 25). FACS(형광-활성 세포 분류법)에 의해 분석된 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)는 FITC 표지된 HPSB 또는 비접합된 FITC를 투여받은 대조 동물과 비교하여 FITC 표지된 단백질의 존재를 나타내는 형광의 증가를 나타내었다. FACS 분석을 위해, 세포(1X104)를 CellQues Pro 세포측정 분석 소프트웨어(FACS Calibur, Beckton-Dickinson, San Diego CA, USA)를 사용하여 분석하였다.
2개의 파킨 재조합 단백질 중 하나인 HM321PSB는 PBMC에서 더 높은 세포내 신호를 나타내었다. 동결절편의 상이한 장기에서 FITC 표지된 단백질의 분포를 형광 현미경으로 분석하였다(도 25 및 27). 유사한 결과로서, aMTD가 결여된 파킨 재조합 단백질(HP 및 HPSB)은 다양한 장기(뇌, 심장, 폐, 간, 비장 및 신장)에서 제한적인 조직 투과성을 나타내었다. 대조적으로, aMTD321 및 aMTD524는 조직(뇌, 심장, 폐, 간, 비장 및 신장)에서 파킨 재조합 단백질의 전신 전달을 향상시켰다.
10. 뇌 조직에서
파킨
재조합 단백질의 면역검출
면역조직화학적 표지화(면역조직화학)를 사용하여 혈액-뇌-장벽 투과성을 결정하기 위해, 조직을 항-파킨(1:200, Santa Cruz Biotechnology) 단클론 항체를 사용하여 면역조직화학적으로 처리하였다. 파킨 양성 면역 반응성이 HM321PSB 처리된 마우스의 뇌에서 관찰되었지만, HPSB 처리된 마우스의 뇌에서는 관찰되지 않았다(도 29). 웨스턴 블롯의 결과에서, 파킨 항체-양성 밴드는 HM321PSB 재조합 단백질을 투여한 그룹에서만 관찰되었다(도 28a). 또한, 도 28b 및 28c에 나타낸 바와 같이, HPSB로 처리된 마우스와 비교하여, 본 발명의 HM524PSB로 처리된 마우스의 뇌에서 더 많은 양의 파킨 단백질이 검출되었음을 확인되었다.
상기 결과는 aMTD/SD 융합된 파킨 재조합 단백질이 혈액-뇌 장벽을 투과하여 뇌의 신경 세포로 효율적으로 전달될 수 있음을 입증하였다.
11. iCP-
파킨
재조합 단백질의 생물학적 활성의 결정
11-1. iCP-
파킨
재조합 단백질의 E3 라이게이즈 활성
파킨 재조합 단백질의 E3 라이게이즈 활성을 결정하기 위해, 제조사의 지침에 따라 수행된 자가-유비퀴틴화 분석(Boston Biochem)을 사용하여 파킨 E3 라이게이즈 활성을 측정하였다. 도 30에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 iCP-파킨 재조합 단백질은 (자가-) 유비퀴틴화 활성을 나타내었으며, 이는 이들이 E3 라이게이즈 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
11-2. iCP-
파킨
재조합 단백질의 항-
세포자멸
효과
파킨 재조합 단백질이 신경독소에 의해 유발되는 신경세포 사멸에 미치는 보호 효과를 결정하기 위해, CATH.a 및 SH-SY5Y 세포를 6-하이드록시도파민(6-OHDA)으로 처리하였다. 6-OHDA의 처리 후, 이들 세포를 파킨 재조합 단백질로 처리하고 TUNEL 분석을 수행하였다. 많은 수의 세포 사멸이 6-OHDA 단독 처리 그룹에서 관찰되었다. 6-OHDA 처리 그룹과 유사하게, aMTD가 결여된 HP는 작용제 단독 그룹과 유사한 세포자멸 세포 사멸의 비율을 나타내었다. 대조적으로, aMD321/SD 융합된 파킨 재조합 단백질(HM321PSA 및 HM321PSB)은 CATH.a 및 SH-SY5Y 세포에서 각각 19.7 및 14.2%까지 세포자멸사를 억제하였다(*p <0.05). 유사한 결과가 CATH.a 세포 및 SH-SY5Y 세포 모두에서 얻어졌다. aMDD524 파킨 단백질이 처리되었을 때, 유사한 결과가 얻어졌다. 이러한 결과는 aMTD/SD 융합된 파킨 재조합 단백질이 배양된 신경 세포에서 신경보호 효과를 갖는다는 것을 입증하였다. 또한, 이러한 신경 세포 사멸 억제 효과는 용량 의존적 방식으로 관찰되었다(도 31, 32a 및 32b).
또한, 트립판 블루 염색 후 세포 계수에 의해 α-시누클레인 응집체의 분해를 측정하였다. 도 33에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 iCP-파킨 재조합 단백질이 우수한 신경 세포 보호 효과 및 α-시누클레인 분해 효과를 나타내었음이 확인되었다.
12.
MPTP
-PD 동물 모델의 개발
생체내에서 파킨 재조합 단백질의 효과를 결정하기 위해, 신경독소를 사용하여 파킨슨병의 생리학적 및 정신적 증상을 모방하는 다양한 파킨슨병(PD) 동물 모델을 개발하였다. 파킨슨병과 유사한 증상을 유발하기 위해, 신경독소인 MPTP(1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘)를 사용하였다. 이 MPTP는 내부 미토콘드리아 막 내의 모노아민 산화효소(MAO-B)에 의해 독성 물질 MPP+로 전환되고, 이는 도파민성 신경세포를 선택적으로 표적화하여 파킨슨을 유도한다(도 34).
13.
파킨
재조합 단백질에 의해 영향을 받는 운동 활성의 평가
13-1. 수영 시험
파킨 재조합 단백질의 운동 기능 회복 효과를 평가하기 위해, 수영 시험을 수행하였다. 각 그룹(희석제, MPTP 단독, MPTP+HPSB 및 MPTP+HM321PSB)의 수영 활성(4족)을 측정하여 비병변 희석제 대조군의 백분율로 나타내었다. MPTP 단독 그룹은 희석제 그룹과 비교하여 수영 활성의 유의한 감소를 나타내었다. 유사하게, HPSB 처리 그룹은 MPTP 단독 그룹과 유사한 결과를 나타내었다. 대조적으로, HM321PSB 처리 그룹은 개선된 운동 활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 aMTD321/SD 융합된 파킨 재조합 단백질이 급성 MPTP 유도 파킨슨병 마우스 모델에서 운동 기능을 회복하였음을 결정하였다(도 37).
13-2. 보행 시험
파킨 재조합 단백질의 운동 기능 회복 효과를 평가하기 위해, 보행 시험을 수행하였다(도 38). 이 실험에서, 보폭과 동요(sway) 거리를 측정하였다. 보폭은 MPTP 단독 및 HPSB 처리 그룹에서 유의하게 감소한 반면, 동요 거리는 희석제 그룹과 비교하여 증가하였다. 그러나, HM321PSB 처리된 마우스는 정상 그룹과 유사한 수준의 보폭을 나타내었고(도 39), MPTP 단독 및 HPSB 처리된 그룹과 비교하여 유의하게 감소된 동요 거리를 나타내었다(도 40). 따라서, 본 발명자들은 aMTD321/SD 융합된 파킨 재조합 단백질이 급성 MPTP 유도 파킨슨병 마우스 모델에서 보행 기능을 개선한다는 것을 결정하였다.
13-3.
아만성
MPTP
-PD 모델
로타-로드 시험을 아만성 MPTP 모델에서 수행하였고, 그 결과 MTD524/SD 융합된 파킨 단백질 처리 그룹은 희석제 대조군과 유사하게 장시간 로타-로드 상에서 걸었다. 즉, MDD524/SD 융합된 파킨 단백질에 의한 운동 기능 회복이 확인되었다(도 41).
14.
파킨
재조합 단백질에 의한
MPTP
-PD 마우스 모델에서의 도파민 방출의 활성화
14-1. 소변 내의 도파민
소변 내의 도파민 수준을 측정하기 위해, 파킨 재조합 단백질을 처음 처리한 후 10시간에 모든 그룹의 마우스로부터 소변을 수집하였다. 이러한 소변 샘플을 ELISA에 의해 측정하였다. 10시간 후 결과에서 MPTP 단독 및 HM321PSB 처리 그룹 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있었다. MPTP 단독 그룹은 감소된 소변 수준을 나타낸 반면, HM321PSB 처리 그룹은 희석제 그룹과 비교하여 유사한 소변 수준을 나타내었다. 상기 결과는 aMTD321/SD 융합된 파킨 재조합 단백질이 소변 내의 도파민 수준을 자극한다는 것을 입증하였다(도 35).
14-2. 뇌 내의 도파민
뇌 내의 도파민 수준을 측정하기 위해, 모든 그룹의 선조체 부위의 도파민 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. HM321PSB 처리 그룹에서의 선조체 도파민 수준은 MPTP 단독 및 HPSB 처리 그룹과 비교하여 두 배 초과였다. 따라서, 본 발명자들은 aMTD321/SD 융합된 파킨 재조합 단백질이 MPTP 처리에 의해 감소된 선조체 도파민 수준의 증가를 일으킨다는 것을 결정하였다(도 36).
15.
MPTP
-PD 모델에서
파킨
재조합 단백질에 의한 티로신
하이드록실라제의
발현 회복
15-1. 급성
MPTP
-PD 모델
파킨 재조합 단백질에 의한 도파민성 신경세포의 보호 효능을 결정하기 위해, 도파민 신경세포에서 마커 효소인 티로신 하이드록실라제에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학을 수행하였다. aMTD/SD 융합된 파킨 재조합 단백질로 처리된 마우스의 흑질 및 선조체 부위에서의 도파민성 신경세포의 수를 관찰하고 MPTP 단독 및 HPSB 투여 그룹과 비교하였다. 따라서, 본 발명자들은 aMTD/SD 융합된 파킨 재조합 단백질이 신경보호 기능을 가질 수 있음을 결정하였다. 또한, aMTD/SD 융합된 파킨 재조합 단백질의 신경 세포 회복 효과는 용량 의존적 방식으로 관찰되었다(도 42a 및 42b).
15-2. 아급성
MPTP
-PD 모델
아급성 MPTP 모델의 뇌에서의 TH 발현의 변화를 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였고, 그 결과 aMTD/SD 융합된 파킨 단백질에 의한 TH 발현의 회복이 관찰되었다. 또한, 내인성 파킨 단백질 발현에는 변화가 없었다(도 43).
16. 본 발명의 요약
본 발명을 위해, 세포 투과성 파킨 재조합 단백질을 설계하고 aMTD를 사용하여 개발하였다. aMTD와 융합된 모든 파킨 재조합 단백질 및 aMTD가 결여된 대조군 재조합 단백질을 정량적, 시각적 세포/조직 투과성 및 BBB 투과성에 대해 확인하였다. 본 발명자들은 세포 투과성 aMTD321/SD 융합된 파킨 재조합 단백질 및 aMTD524/SD 융합된 파킨 재조합 단백질이 비교적 높은 세포/조직 투과성을 가질 뿐만 아니라(도 24-27), BBB를 관통하여 뇌 조직 전달에 효율적임을 확인하였다(도 28a 내지 28c 및 29). 세포 투과성 파킨 재조합 단백질의 생물학적 활성을 결정하기 위해, 다양한 기능 시험을 수행하였다. 본 발명자들은 세포 투과성 파킨 재조합 단백질이 신경독소(6-OHDA 및 MPP+)에 의해 유발되는 신경 세포 사멸에 항-세포자멸 효과를 가지며(도 31, 32a 및 32b), 신경독소(MPTP)에 의해 유도된 운동 장애를 나타낸 PD 마우스 모델에서 회복 효과를 가짐을 확인하였다(도 35 내지 43).
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실시자를 돕기 위해, 본 발명에 대한 실험적 뒷받침을 제공하기 위해, 그리고 모델 프로토콜을 제공하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
실시예 1. 신규 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)의 개발
신호 서열의 H-영역(HRSP) 유래의 CPP(MTS/MTM 및 MTD)는 공통 서열, 서열 모티프, 및/또는 공통 구조적 상동성 특징을 갖지 않는다. 본 발명에서, 목적은 '공통 기능'을 갖도록, 분석된 CPP와 유사한 기전으로 원형질 막을 통과하는 단백질 전좌를 용이하도록, 새롭게 결정된 '결정 인자'를 만족하는 공통 서열 및 구조적 모티프로 형식화된 향상된 소수성 CPP를 개발하는 것이다.
상기 구조적 모티프는 하기와 같다:
표 9에서, 보편적인 공통 서열/구조적 모티프가 하기와 같이 제공되어 있다. 본 발명에서 펩타이드의 아미노산 길이는 9 내지 13개 아미노산, 주로 12개 아미노산의 범위이고, 이들의 굽힘 잠재성은 재조합 단백질의 굽힘을 위해 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8' 아미노산) 및 펩타이드의 말단(12')에서의 프롤린의 존재 및 위치에 의존적이다. aMTD의 강성/유연성에 대한 불안정성 지수(II)는 II<40이고, 소수성 지수에 대한 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)은 약 2.2이며, 구조적 특징에 대한 지방족 지수(AI)는 약 200이다(표 9). 이러한 표준화된 결정 인자에 기초하여, 본 발명에서 새로운 소수성 펩타이드 서열, 즉 개선된 거대분자 전달 도메인 펩타이드(aMTD)가 개발되었고, 이는 표 10 내지 15에 요약되어 있다.
실시예
2.
aMTD
에 융합된 재조합 단백질을 위한 발현 벡터의 제작
본 발명자들이 새롭게 개발한 기술은 세포 투과성 재조합 단백질의 제조방법을 확장시키는 것을 가능하게 하였다. aMTD 또는 r펩타이드에 융합된 히스티딘-태그된 CRA 단백질을 위한 발현 벡터를 디자인하였다. 재조합 단백질용 발현 벡터를 제작하기 위해, 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 각각 디자인된 CRA에 융합된 aMTD 또는 r펩타이드를 증폭하도록 고안되었다.
PCR 반응(100 ng 게놈 DNA, 10 pmol 각각의 프라이머, 각각의 0.2 mM dNTP 혼합물, 1X 반응 버퍼 및 2.5 U Pfu(+) DNA 중합효소(Doctor protein, Korea))을 각 30초 동안 변성(95℃), 어닐링(62℃), 및 연장(72℃)의 35 사이클을 수반하여, Nde I(5') 및 Sal I(3') 사이의 제한효소 부위 상에서 절단하였다. 마지막 연장 사이클 동안, PCR 반응을 72℃에서 5분간 유지시켰다. 그리고 나서, 이들을 pET-28a(+) 벡터(Novagen, Madison, WI, USA)의 부위 내로 클로닝하였다. DNA 라이게이션을 4℃에서 밤새 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 수행하였다. 이러한 플라스미드를 얼음 상에서 10분간 E. coli DH5-알파 균주의 컴피턴트 세포와 혼합하였다. 이 혼합물을 42℃에서 90초 동안 수조에서 열 충격을 가한 후 2분 동안 얼음에 두었다. 그리고 나서, LB 브로쓰 배지가 첨가된 상기 혼합물을 1시간 동안 37℃ 교반 배양기에서 회복시켰다. 형질전환체를 카나마이신(50 μg/mL)(Biopure, Johnson city, TN, USA)을 갖는 LB 브로쓰 아가 플레이트 상에 도말한 후, 37℃에서 밤새 배양하였다. 단일 콜로니로부터, 플라스미드 DNA를 추출하고, Nde I 및 Sal I 제한 효소의 절단 후, 절단된 DNA를 1.2% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 645 bp에서 확인하였다(도 2). aMTD 및 무작위 펩타이드(r펩타이드)에 융합된 CRA 재조합 단백질에 대한 PCR 프라이머가 표 23 내지 30에 요약되어 있다. aMTD 및 r펩타이드 프라이머의 아미노산 서열이 표 31 내지 38에 나타나 있다.
실시예
3.
aMTDs
및
r펩타이드에
융합된 재조합 단백질의 유도성 발현, 정제 및 제조
재조합 단백질을 발현하기 위해, 음성 대조군[r펩타이드 38(rP38)], 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85) 및 aMTD에 융합된 CRA 단백질의 발현을 위한 pET-28a(+) 벡터를 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 세포를 카나마이신(50 μg/ml)을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 강하게 진탕하면서 성장시키고 37℃에서 2시간 동안 0.7 mM IPTG(Biopure)를 첨가하여 OD600=0.6로 유도하였다. 유도된 재조합 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에 로딩하고 쿠마시 브릴리언트 블루(InstantBlue, Expedeon, Novexin, UK)로 염색하였다(도 3).
E. coli 배양물을 10분 동안 5,000x rpm에서 원심분리에 의해 채취하고, 상층액을 버렸다. 펠렛을 용해 버퍼(50 mM NaH2PO4, 10 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, pH 8.0)에 재현탁하였다. 상기 세포 용해물을 탐침이 장착된 초음파분쇄기(Sonics and Materials, Inc., Newtowen, CT, USA)를 이용하여 얼음 상에서 초음파분쇄하였다. 세포 용해물을 5,000 x rpm에서 10분간 원심분리하여 세포 잔해를 펠렛화한 후, 상층액을 개방 컬럼 시스템(Bio-rad, Hercules, CA, USA)에 의해 부드럽게 용해 버퍼 평형화된 Ni-NTA 수지(Qiagen, Hilden, Germany)와 함께 배양하였다. 단백질 결합된 수지를 200 ml 세척 버퍼(50 mM NaH2PO4, 20 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, pH 8.0)로 세척한 후, 결합된 단백질을 용출 버퍼(50 mM NaH2PO4, 250 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, pH 8.0)로 용출시켰다.
자연 조건 하에 정제된 재조합 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다(도 4). 재조합 단백질 모두를 세포 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA) 및 둘베코 인산 완충 염수(DPBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)의 1:1 혼합물인 생리학적 버퍼에 대해 8시간 동안 그리고 밤새 투석하였다. 클로닝된 316개의 aMTD 및 141개의 r펩타이드로부터, 240개의 aMTD 및 31개의 r펩타이드 융합된 재조합 단백질을 유도, 정제 및 제조하여 세포 투과성에 대해 분석하였다.
실시예
4. 재조합 단백질의 정량적 세포 투과성의 결정
정량적 세포 투과성을 위해, aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질을 제조사(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 지침에 따라 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)에 접합시켰다. RAW 264.7 세포를 37℃에서 1시간 동안 10 μM FITC 표지된 재조합 단백질로 처리하고, 차가운 PBS로 3회 세척하고, 37℃에서 20분간 0.25% 트립신/EDTA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 처리하여 세포 표면 결합된 단백질을 제거하였다. 이들 재조합 단백질의 세포 투과성을 FlowJo 세포계측 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포분석법(Guava, Millipore, Darmstadt, Germany)에 의해 분석하였다(도 5 내지 6). aMTD의 상대적 세포 투과성을 측정하고 음성 대조군(rP38) 및 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)와 비교하였다(표 31).
실시예
5. 재조합 단백질의 세포 투과성 및
세포내
국소화의 결정
세포 투과성의 시각적 참조를 위해, NIH3T3 세포를 24-웰 챔버 슬라이드에서 커버슬립 상에서 24시간 동안 배양하고, 37℃에서 1시간 동안 10 μM FITC 접합된 재조합 단백질로 처리하고, 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 처리된 세포를 실온에서 10분간 4% 파라포름알데하이드(PFA, Junsei, Tokyo, Japan)에서 고정하고, PBS로 3회 세척하고, VECTASHIELD 마운팅 배지(Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)로 올려놓고, DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로 반대염색하였다. 형광 신호의 세포내 국소화를 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(LSM700, Zeiss, Germany; 도 7 및 8)에 의해 결정하였다.
실시예
6. 재조합 단백질을 위한 발현 벡터의 제작
새로 개발된 기술인 aMTD 기반 MITT는 세포 투과성 재조합 단백질을 개발하는 방법을 개선할 수 있게 해주었다. aMTD와 융합되거나 aMTD와 융합되지 않은 파킨 단백질 및 가용화 도메인 A(SDA) 또는 가용화 도메인 B(SDB)에 대한 발현 벡터를 디자인하였다. 재조합 단백질을 위한 발현 벡터를 얻기 위해, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 고안하여 이러한 재조합 단백질을 증폭하였다.
각각 변성(95℃) 30초, 어닐링(60℃) 30초, 연장(72℃)을 2분의 35 사이클을 포함하는 PCR(100 ng 게놈 DNA, 10 pmol 각 프라이머, 각각 0.2 mM dNTP 혼합물, 1X 반응 완충액 및 2.5 U Pfu(+) DNA 중합효소(Doctor protein, Korea))을 수행하고 생성물을 BamHI(5') 및 HindIII(3') 사이의 제한 효소 부위에서 소화시켰다. 마지막 연장 사이클 동안, PCR 생성물을 72℃에서 5분간 유지시켰다. 그리고 나서, 이들을 pET-28a(+) 벡터(Novagen, Madison, WI, USA)의 부위에 클로닝하였다. 4℃에서 밤새 T4 DNA 라이게이즈(NEB, USA)를 사용하여 DNA 라이게이션을 수행하였다. 이들 플라스미드를 10분간 얼음 위에서 대장균 DH5α와 대장균(BL21(DE3) 코돈 플러스 RIL) 균주(ATCC, USA)의 컴피턴트 세포와 혼합하였다. 42℃의 수조에서 90초간 열 충격시킨 후, 상기 혼합물을 2분간 얼음 위에 두었다. 그리고 나서, LB 브로쓰 배지(ELPIS, Korea)가 첨가된 혼합물을 1시간 동안 37℃의 진탕 인큐베이터에서 회복시켰다. 형질전환체를 격렬하게 흔들어 주면서 카나마이신(50㎍/ml)과 함께 LB 브로쓰 아가 플레이트에 도말하고 OD600 = 0.6에서 0.7 mM IPTG(Biopure, Johnson city, TN, USA)로 유도한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 단일 콜로니로부터, 플라스미드 DNA를 추출하고, BamHI 및 HindIII 제한 효소(NEB, USA)로 소화시킨 후, 소화된 DNA를 1.2% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 확인하였다(도 18). aMTD 및 SD에 융합된 히스-태그된(또는 히스-태그되지 않은) 파킨 재조합 단백질에 대한 PCR 프라이머가 표 39 및 표 40에 요약되어 있다.
표 39 및 40: 히스-태그된 파킨 단백질에 대한 PCR 프라이머
실시예
7-1. 히스티딘
태그된
파킨
재조합 단백질의 발현 및 정제
변성된 재조합 단백질을 변성 용해 완충액(8 M 우레아, 10 mM 트리스, 100 mM NaH2PO4)을 사용하여 용해시키고 Ni-NTA 수지를 첨가하여 정제하였다. 단백질에 결합된 수지를 30 mL의 변성 세척 완충액(8 M 우레아, 10 mM 트리스, 20 m 이미다졸, 100 mM NaH2PO4)으로 3회 세척하였다. 단백질을 30 mL의 변성 용리 완충액(8 M 우레아, 10 mM 트리스, 250 mM 이미다졸)으로 3회 용출시켰다. 정제 후, 이들을 리폴딩 완충액(550 mM 구아니딘-HCl, 440 mM L-아르기닌, 50 mM 트리스, 100 mM NDSB, 150 mM NaCl, 2 mM 환원 글루타티온 및 0.2 mM 산화 글루타티온)으로 2회 투석하였다. 마지막으로, 이들을 투석이 300 x 105회 이상이 될 때까지 4℃에서 DMEM과 같은 생리학적 완충액으로 투석하였다. 정제된 단백질의 농도를 제조사의 지침에 따라 브래드포드 분석을 사용하여 정량화하였다. 정제 후, 이들을 상기 나타낸 바와 같이 DMEM으로 투석하였다. 마지막으로, IPTG 유도 전(-)과 후(+)에 세포 용해물; Ni2+ 친화성 정제된 단백질(P)의 분취량; 및 분자량 표준(M)의 SDS-PAGE 분석을 수행하여 표적 단백질의 존재를 확인하였다(도 19 및 20).
실시예
7-2.
파킨
재조합 단백질의 용해도/수율 결정
SDA 또는 SDB를 함유하는 aMTD 융합된 파킨 단백질을 클로닝하고, 발현시키고, 정제하고, 변성 조건하에서 가용성 형태로 제조한다. aMTD 및/또는 SD에 융합된 각 재조합 단백질의 크기(아미노산 수), 수율(mg/L) 및 용해도를 10% SDS-PAGE 겔 상에서 결정하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 탁도(A450)를 측정하여 용해도를 침전하는 경향이 거의 없는 높은 가용성 단백질(+++++)부터 매우 불용성 단백질(+)까지 5점 척도로 채점하였다. 각 재조합 단백질의 생리적 완충 조건에서의 수율(mg/L)을 또한 측정하였다. 세포 투과성 파킨 재조합 단백질은 단일 밴드로서 관찰되었고, 이 단백질 정제 과정에서 최종 정제된 단백질의 양은 최대 46 mg/L였다(도 19 및 20).
또한, aMTD321 이외에 추가로 선택된 10개의 유형의 aMTD의 용해도/수율, 투과성 및 생물학적 활성을 측정하여 도 22에 나타내었다. 도 22에 나타낸 바와 같이, aMTD524를 사용한 iCP 파킨 재조합 단백질이 가장 우수한 생물학적 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
음성 대조군(HP) 대비 aMTD-SD-융합된 파킨 재조합 단백질의 상대적 수율 및 음성 대조군(HP) 대비 SDB-융합된 파킨 재조합 단백질(HPSB)의 상대적 수율을 도 21a 및 21b에 나타내었다. 상기 결과는 가용화 도메인(SDA 및 SDB)이 HP와 비교하여 단백질의 상대적 수율을 성공적으로 개선시켰음을 밝혀내었고(도 21b), HM321PSA 및 HM321PSB는 카고 단백질 단독(HP)과 비교하여 4배의 용해도 증가를 나타내었다(도 21a).
실시예
8. 히스티딘-태그가 없는
파킨
융합 단백질의 발현 및 정제
aMTD에 융합된 대장균 코돈-최적화되고 히스티딘-태그가 없는 재조합 파킨 단백질의 서열을 또한 특정 프라이머(표 39)로 합성한 다음, 최종적으로 pET 28a 및 pET 22b 내로 클로닝하였다. 상기 단백질을 0.5-0.7의 A600까지 성장하고 0.7 mM IPTG로 3시간 동안 유도된 대장균 BL21-CodonPlus(DE3) 세포에서 발현시켰다. 세포를 채취하고 완충액 A(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100)에서 30분 동안 초음파 처리(20초-on/40초-off)하여 파쇄하였다. 봉입체를 원심분리(4℃에서 30분 동안 5,000rpm)하여 단리하고 변성을 위해 완충액 B(50 mM Tris-HCl, pH 10.0, 8 M 우레아)에서 밤새 용해시켰다. 변성된 봉입체를 재폴딩을 위해 완충액 C(30 mM 인산나트륨, pH 8.0, 0.02% Tween-20)로 4℃에서 48시간 동안 투석하였다. 불용성 입자를 원심분리(4℃에서 30분 동안 9,000 rpm)에 의해 제거하였다. AKTA 퓨리파이어 FPLC 시스템(GE HealthCare, Pittsburgh, PA, USA)을 갖는 이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제를 수행하였다. 요약하면, 단백질 결합을 위해 Q-세파로스 음이온 컬럼을 완충액 C 중의 단백질 용액으로 유동시키고, 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 완충액 D(30 mM 인산나트륨, pH 8.0, 30 mM NaCl)로 세척하였다. 단백질을 용출 완충액 E(30 mM 인산나트륨, pH 8.0)의 염 구배(30 mM부터 1M NaCl)로 용출시켰다. 모든 재조합 단백질은 주요 단일 피크에서 용출되었다. 정제 후, 단백질을 생리적 완충액에서 투석하였다.
실시예
9.
파킨
재조합 단백질의
세포내
전달
정량적 세포 투과성을 위해 aMTD/SD 융합된 파킨 재조합 단백질을 제조사의 지침(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 따라 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)에 접합시켰다. RAW 264.7 세포(ATCC, USA)를 10 μM FITC-표지된 재조합 단백질로 37℃에서 1시간 동안 처리하고, 차가운 PBS로 3회 세척하고, 프로테이나제 K(5 μg/ml)를 37℃에서 10분 동안 처리하여 세포 표면 결합 단백질을 제거하였다. 이러한 재조합 단백질의 세포 투과성을 FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 유세포측정법(FACS Calibur, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 의해 분석하였다(도 23). 도 23에서, 음성 대조군(r펩타이드 38) 및 이전에 개발된 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)의 세포 투과능이 레퍼런스로 나타나 있으며, aMTD321의 세포 투과능이 SDA 단독(HSA)과 시각적으로 비교되었다. aMTD321은 음성 대조군(r펩타이드 38) 및 이전에 개발된 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)와 비교하여 현저하게 향상된 세포 투과성을 나타내었음이 확인되었다.
실시예
10. iCP-
파킨
재조합 단백질의
세포내
국소화
결정
세포 투과성의 시각적 참조를 위해, NIH3T3 세포(ATCC, USA)를 24-웰 챔버 슬라이드 내의 커버 슬립 상에서 24시간 동안 배양하고, 10 μM 비히클(배양 배지, DMEM), FITC 단독, FITC-접합된 음성 대조군(rP38), FITC-접합된 이전에 개발된 CPP(MTM12 및 MTD85), FITC-접합된 재조합 단백질(FITC-HP, FITC-HPSB, FITC-HM321P, FITC-HM321PSA, FITC-HM321PSB 및 FITC-M524PSB)을 37℃에서 1시간 동안 처리하고, 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 처리된 세포를 실온에서 10분간 4% 파라포름알데하이드(PFA, Junsei, Tokyo, Japan)에서 고정시키고, PBS로 3회 세척하고, 핵 염색을 위한 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)을 갖는 VECTASHIELD 마운팅 배지(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 마운팅하였다. 형광 신호의 세포내 국소화를 공초점 레이저 스캐닝 현미경(상부) 및 동일한 세포의 노마스키 간섭 현미경 이미지(LSM700, Zeiss, Germany)(하부)에 의해 결정하였다(도 24). 도 24에 나타난 바와 같이, aMTD321 및 aMTD524는 이전에 개발된 CPP(MTM12 및 MTD85)와 비교하여 우수한 세포 투과성을 나타내었으며, SD와 융합되었을 때 투과성이 더욱 개선되었음을 확인하였다.
실시예
11-1.
PBMC에서
파킨
재조합 단백질의
생체내
전달의 결정
생체내 전달의 결정을 위해, ICR 마우스(5주령, 암컷)에게 FITC 단독 또는 FITC-접합된 단백질(FITC-HPSB 및 FITC-HM321PSB)을 복강내로 주사(IP, 600 ug/머리)하였다. 15분 및 30분 후, 마우스의 전혈로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하고, 유세포측정법(BD, GUABA)에 의해 분석하였다(도 25). 도 25에 나타낸 바와 같이, aMTD/SD-융합된 재조합 단백질은 생체내에서 우수한 세포 투과성을 나타내었다.
실시예
11-2.
RAW264
.7 세포 및
NIH3T3
세포에서
파킨
재조합 단백질의
시험관내
전달의 결정
시험관내 전달의 결정을 위해, RAW264.7 세포를 10 μM FITC-접합된 파킨 재조합 단백질(FITC-HP, FITC-HM321P, FITC-HM321PSA, FITC-HM321PSB 및 FITC-M524PSB)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였고(도 26), NIH3T3 세포를 aMTD321 서열을 갖거나 결여된 10 μM FITC-접합된 파킨 재조합 단백질(FITC-HPSB 및 FITC-HM321PSB)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다(도 26).
동일한 몰 농도의 접합되지 않은 FITC(FITC 단독) 또는 비히클(배양 배지, DMEM)을 처리하여 세포와 관련되지만 내재화되지 않은 단백질을 제거하였고, 유세포측정법에 의해 분석하였다(도 26).
도 26에 나타낸 바와 같이, 파킨 단백질이 SD 단독과 융합되었을 때, 세포 투과성에는 큰 변화가 없었다. 대조적으로, 세포 투과성은 SD의 존재 또는 부존재에 관계없이 aMTD 단독의 융합에 의해 개선되는 것으로 나타났는데, 이는 세포 투과성 개선이 aMTD 서열의 첨가에 의해 제공되며, 재조합 단백질의 친수성이 SD 서열의 첨가에 의해 극대화되어 세포 투과성이 현저히 향상되었음을 가리킨다.
실시예
12.
생체내에서
파킨
재조합 단백질의 조직 투과성의 결정
조직 투과성의 시각적 참조를 위해, 희석제, FITC 단독 및 30 mg/kg의 FITC-표지된 파킨 재조합 단백질(FITC-HP, FITC-HPSB, FITC-HM321P, FITC-HM321PSA, FITC-HM321PSB, 및 FITC-M524PSB)을 ICR 마우스(5주령, 암컷)에게 복강내 주사하였다. 2시간 후, 마우스를 희생시키고 간, 신장, 비장, 폐, 심장 및 뇌를 단리하고, OCT 화합물(Sakura, Alphen anden Rijn, Neetherlands)로 포매시키고, 동결시킨 다음, 20 ㎛ 두께로 절개하였다. 상기 조직 표본을 유리에 올리고 형광 현미경(Nikon, Tokyo, Japen)으로 관찰한다(도 27). 도 27에 나타낸 바와 같이, aMTD/SD-융합된 재조합 파킨 단백질은 조직 내로 효율적으로 전달되었음이 확인되었다.
실시예
13. 뇌에서
파킨
재조합 단백질의 검출
면역조직화학 검사를 위해, 6주령의 ICR 암컷 마우스에게 희석액(PBS) 또는 600 μg 히스-태그된 파킨 재조합 단백질을 복강내로 주사하였다. 2시간 후, 마우스를 0.9% NaCl로 관류시키고 차가운 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 뇌를 제거한 후, 이를 4% 파라포름알데하이드로 후고정시키고 30% 수크로스로 옮겼다. 뇌를 동결 마이크로톰을 사용하여 30 μm의 관상 절편(coronal section)으로 절단하였다. 뇌 동결절편(30 μm)을 항-파킨(1:100, Santa Cruz Biotechnology) 단클론 항체로 면역염색한 다음, 바이오틴-접합된 염소 항-마우스 이차 항체(Vector Laboratories)를 첨가하여 아비딘-바이오틴 복합 키트(Vectastain kit, Vector Laboratories)로 현상하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 단백질을 처리한 마우스를 0.9% NaCl로 관류시켰다. 뇌를 단리하고, 선조체 부위를 해부하고 용해 완충액(Intron, Seongnam, Korea)에서 균질화시켰다. 원심분리(4℃에서 10분 동안 13,000rpm)로부터의 상층액을 파킨(1:200) 및 β-액틴(1:2,000)에 대한 항체로 탐침된 웨스턴 블롯에 의해 분석한다. 2차 항체는 염소 항-마우스 IgG-HRP(모든 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 유래됨)이다(도 28a).
구체적으로, iCP-파킨 재조합 단백질이 뇌의 신경 세포에 얼마나 많이 존재하는지 조사하기 위해, FITC-표지된 HPSB 및 HM524PSB의 정맥내 주사 후 10분, 1, 2, 4, 8, 12, 16 및 24시간에 마우스를 희생시켰다. 그리고 나서, 뇌의 신경 세포를 분리하고, 그 형광 강도를 유세포측정법에 의해 측정하여 도 28b에 나타내었다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, iCP-파킨 재조합 단백질의 주사 후 2시간에 최고치가 측정되었고, 이는 약 8시간까지 유지되었으며, 12시간에 감소하였고, 이후 24시간까지 일정하게 유지되었다.
또한, 상기 실험에 의해 얻어진 뇌 조직을 동결절개(20 ㎛)하여 조직 절편을 얻고, 형광 현미경 하에서 형광 분포를 관찰하여 도 28c에 나타내었다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, FITC 표지된 단백질은 aMTD의 존재시에만 신경 세포의 형태에서 관찰되었고, 이는 iCP-파킨이 BBB를 통과하여 뇌의 신경 세포를 투과함을 가리킨다.
또한, aMTD-매개된 파킨 재조합 단백질의 뇌로의 전달을 면역블롯팅에 의해 조사하여, 도 29에 나타내었다. 도 29는 소뇌에서 파킨 재조합 단백질의 면역블롯팅을 나타낸다. 600 ug의 희석제 단독 또는 aMTD가 없거나 aMTD 서열이 결여된 히스-태그된 파킨 재조합 단백질의 IP(복강내) 주사 후 2시간에 소뇌를 통한 시상 절편을 항-파킨 항체(1:100, Santa Cruz Biotechnology)로 면역염색하였다.
도 28a 내지 28c 및 29에 나타낸 바와 같이, HPSB가 주사된 마우스와 비교하여, 본 발명의 HM321PSB 및 HM524PSB가 주사된 마우스의 뇌에서 다량의 파킨 단백질이 검출되었으며, 이는 iCP-파킨 재조합 단백질이 BBB를 통과하였고 본 발명의 재조합 단백질이 생체내에서 우수한 혈액-뇌 장벽 투과성을 나타내었음을 가리킨다.
실시예
14-1. E3 라이게이즈 활성의 평가
파킨 E3 라이게이즈 활성을 제조사의 지침에 따라 수행된 자가 유비퀴틴화 분석(Boston Biochem)을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 정제된 파킨 단백질 1 μg을 0.1 μM E1, 1 μM E2, 50 μM 유비퀴틴 및 10 μM Mg-ATP와 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 항-유비퀴틴 항체(1:1,000, Enzo Life Science)를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 30에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 iCP-파킨 재조합 단백질은 (자가) 유비퀴틴화 활성을 나타내었으며, 이는 이들이 E3 라이게이즈 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예
14-2. 신경 세포에서
파킨
재조합 단백질의 항-
세포자멸사
효과
TUNEL(Terminal dUTP nick-end labeling) 분석을 제조사의 지침(Roche)에 따라 수행한다. 마우스 도파민성 신경(CATH.a) 세포(ATCC: American Type Culture Collection)를 도말(3x104/웰)하고 70% 컨플루언스의 CATH.a 세포를 50 μM 6-하이드록시도파민(6-OHDA, Agonist)으로 37℃에서 1시간 동안 전처리한 후, 2.5 μM HP, 파킨 재조합 단백질(HM321P, HM321PSA 또는 HM321PSB)로 37℃에서 2.5시간 동안 처리하고, TUNEL 염색에 의해 세포자멸사를 평가하였다. 인간 뇌종양(SH-SY5Y) 세포(한국 세포주 은행)를 또한 배양하고, 도말(3x104/웰)하고, 70% 컨플루언스의 SH-SY5Y 세포를 100 μM 6-하이드록시도파민(6-OHDA, 작용제)으로 6시간 동안 처리한 후, 2.5 μM HP, 파킨 재조합 단백질(HM321P, HM321PSA 또는 HM321PSB)로 37℃에서 2.5시간 동안 처리하고, TUNEL 염색에 의해 세포자멸사를 평가하였다. 많은 aMTD를 동일한 방식으로 생물학적 활성 시험하고, 세포 사멸을 TUNEL 염색과 아넥신 V 염색에 의해 조사하였다.
M524PSB의 용량 의존성을 시험하기 위해, 70% 컨플루언스의 SH-SY5Y 세포를 1 mM MPP + (1-메틸-4-페닐피리디늄) 및 상이한 농도의 M524PSB로 24시간 동안 공동처리하고, 세포 사멸을 항-Bcl2(Santa Cruz, sc-7382) 및 항-카스파제3(세포 신호전달, 9665) 항체를 이용한 TUNEL 분석 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다.
도 31 및 32에 나타낸 바와 같이, iCP-파킨 재조합 단백질 처리 그룹은 우수한 항-세포자멸사 효과를 나타내어 도파민성 신경 세포에 대해 보호 효과를 갖는 것으로 입증되었다. aMTD524/SD-융합된 파킨 재조합 단백질의 처리는 유사한 결과를 나타내었고(도 32a, 하부), 특히 도 32b에 나타낸 바와 같이, 신경독소 MPP + (1-메틸-4-페닐피리디늄)의 처리에 의해 SH-SY5Y 세포의 세포자멸사를 유도한 다음, M524PSB를 농도를 달리하여 처리하였을 때, 신경세포에 대한 항-세포자멸사 효과가 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. 분자 수준에서, 항-세포자멸사 바이오마커 Bcl2의 발현은 M524PSB에 의해 유지된 반면, 세포자멸사유발(pro-apoptotic) 바이오마커 카스파제3의 발현은 억제되었음이 확인되었다(도 32b).
실시예
14-3. α-
시누클레인
응집체의 분해의 평가
α-시누클레인(ATGEN # SNA2001) 1 mg/ml을 37℃에서 5주 동안 고정 인큐베이터에서 응집시켜 α-시누클레인 올리고머를 생성하였다. 인간 뇌종양(SH-SY5Y) 세포(Korea Cell Line Bank)를 배양하고, 도말(3x105/웰)하고, 1 μM의 응집된 α-시누클레인 올리고머로 2시간 동안 전처리하여 세포자멸사를 유도한 후, 10 μM 파킨 재조합 단백질로 37℃에서 24시간 동안 공동처리하고 트립판 블루 염색 후 세포 계수에 의해 변화를 분석하였다.
단백질을 브래드포드 분석법에 의해 정량한 다음, 1차 항-α-시누클레인 항체(1:200, Santa Cruz #sc-7011-R), 2차 항-토끼 IgG HRP-결합된 항체(1:5000, Cell signaling #7074S)를 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 화학발광 검출(Ez-Western Lumi Femto, DOGEN #DG-WF200)을 수행하였다(도 33). 도 33에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 iCP-파킨 재조합 단백질은 우수한 신경 세포 보호 효과 및 α-시누클레인 분해 효과를 나타내었음을 확인하였다.
실시예
15.
MPTP
-유도 파킨슨병 마우스 모델 및 치료 프로토콜
8주령 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스를 12시간 명/12시간 암 주기를 갖는 온도 및 습도가 제어된 방 안의 플라스틱 케이지에서 사육하였다. 마우스를 무작위로 4개의 실험군(희석제, MPTP 단독, MPTP+HPSB 및 MPTP+HM321PSB 또는 M524PSB) 중 하나에 할당하였다. 급성 MPTP-유도 PD 모드의 경우, 희석제를 제외한 세 그룹의 마우스에게 3일 연속 MPTP를 복강내로 주사(15 mg/kg x 3회/일, 2시간 간격)하였다. 신경독소 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 0.9% NaCl에 용해시켰다. 대조군은 동일한 기간 동안 0.9% NaCl로 처리한다. 3일 후, MPTP+HPSB 및 MPTP+HM321PSB 그룹의 마우스에게 각각 연속 5일 동안 HPSB, HM321PSB 재조합 단백질(600 ㎍/머리, 1회/일)을 복강내 주사하였다. 아급성 MPTP-유도 PD 모드의 경우, MPTP(30 mg/kg/일)를 5일간 복강내로 주사하고 단백질(HPSB, HM321PSB) 주사를 9일째에 5일 연속으로 시작하였다. 아만성 MPTP-유도 PD 모드의 경우, MPTP(20 ㎎/㎏ X 4회/일, 2시간 간격)를 1일 동안 복강내로 주사하였고, 단백질(HPSB, HM321PSB) 주사를 36일에 5일 연속으로 시작하였다. 소변 및 뇌 도파민 수준, 총 운동 기능 및 뇌 병변(TH 면역염색)을 도 34에 나타낸 바와 같이 다음 날에 분석하였다. 본 발명자들은 동물 실험이 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행됨을 확인한다(도 34-42b).
실시예
16.
파킨
재조합 단백질로 처리된
MPTP
-PD 동물 모델의 소변에서 도파민의 측정
소변에서 합성된 도파민의 측정을 위해, 파킨 재조합 단백질 처리 첫 날에 10 시간 후 모든 그룹에서 마우스의 소변을 수집하였다. 소변에서 합성된 도파민을 제조사(GenWay, San Diego, CA, USA)에 의해 제공된 지침에 따라 상업적 ELISA 키트를 사용하여 측정한다. 요약하면, 토끼 항-도파민 항체를 소변 또는 조직 추출물에 첨가하고, 면역 복합체를 염소 항 토끼 항체가 코팅된 웰에서 회수한다. 상이한 에피토프에 대한 2차 효소 접합된 항-도파민 항체는 표준 곡선과 비교하여 항원의 양에 비례하는 반응 생성물을 생성한다.
MPTP-병변 마우스에서의 소변 도파민 수준을 HPSB 및 HM321PSB 단백질 처리 후 10시간에 ELISA에 의해 측정하였다. 그룹 간의 실험적 차이를 스튜던트 이쌍 t-검정(* p <0.05)에 의해 평가하였다(도 35).
도 35에 나타낸 바와 같이, 도파민의 분비 저하는 도파민 신경세포의 세포자멸사에 의해 유발되었으나, 소변 도파민 수준은 iCP 파킨 재조합 단백질의 투여에 의해 증가되었으며, 이는 본 발명의 iCP 파킨 재조합 단백질이 도파민 분비를 개선한다는 것을 나타낸다.
실시예
17.
파킨
재조합 단백질로 처리된
MPTP
-PD 동물 모델의 뇌에서 도파민의 측정
뇌에서 합성된 도파민을 측정을 위해, 파킨 재조합 단백질 처리 8일째에 10시간 후 모든 그룹에서 마우스의 뇌를 수집하였다.
뇌 추출물에서 합성된 도파민을 제조사(GenWay, San Diego, CA)가 제공한 지침에 따라 상업적 ELISA 키트를 사용하여 측정한다. 간단히 말하면, 토끼 항-도파민 항체를 소변 또는 조직 추출물에 첨가하고, 면역 복합체를 염소 항-토끼 항체가 코팅된 웰에서 회수한다. 상이한 에피토프에 대한 2차 효소 접합된 항-도파민 항체는 표준 곡선과 비교하여 항원 양에 비례하는 반응 생성물을 생성한다.
선조체 생검에서의 도파민 수준을 도 34에 나타낸 바와 같이 단백질을 처리하지 않은 또는 매일 HM321PSB로 처리한 후 병변 마우스에서 ELISA에 의해 결정하였다. 4마리 마우스 그룹의 도파민 수준이 평균±SD로 나타나 있다. 그룹 간의 실험적 차이를 스튜던트 이쌍 t-검정(* p <0.05)에 의해 평가하였다(도 36).
도 36에 나타낸 바와 같이, 뇌에서의 도파민 수준은 iCP 파킨 재조합 단백질의 투여에 의해 증가하였고, 이는 본 발명의 iCP 파킨 재조합 단백질이 도파민 분비를 개선한다는 것을 나타낸다.
실시예
18.
파킨
재조합 단백질로 처리된
MPTP
-PD 동물 모델의 수영 시험을 이용한 운동 활성의 평가
MPTP 병변 마우스의 총 운동 기능을 수영 시험을 사용하여 평가한다. 마지막 MPTP 처리 후 9시간에 마우스에게 600 ug의 단백질(IP, HPSB 또는 HM321PSB)을 3시간 동안 처리하고, 단백질 처리 후 24시간에 마우스를 37℃의 수조 및 추후의 움직임을 기록하는 비디오에 두어 운동 기능을 평가하였다. 4족 이동(4 legged motion)에 관여한 각 처리 그룹의 마우스의 시간의 백분율이 평균±S.D로 나타나 있다. 각 군의 마우스 수는 다음과 같았다: 희석제, 12마리; MPTP 단독, 7마리; MPTP + HPSB, 14마리; MPTP + HM321PSB, 12마리.
비병변 마우스는 시간의 98%를 4개의 모든 다리를 사용하여 수영하였다. 수영(4족)에 시간을 보낸 각 그룹(MPTP 단독, MPTP + HPSB 또는 MPTP + HM321PSB)의 시간의 백분율을 측정하고, 비병변 희석제 대조군의 백분율로서 표시한다. 그룹 간의 실험적 차이를 스튜던트 이쌍 t-검정(* p <0.05)에 의해 평가하였다(도 37).
도 37에 나타낸 바와 같이, MPTP 처리에 의해 유발된 운동 장애가 iCP 파킨 재조합 단백질의 처리에 의해 회복되었음이 확인되었다.
실시예
19.
파킨
재조합 단백질로 처리된
MPTP
-PD 동물 모델의 보행 시험 및
로타
-로드 시험을 이용한 운동 활성의 평가
19-1. 보행 시험
마우스를 10 cm의 높은 벽이 있는 길이 50 cm, 폭 10 cm의 런어웨이를 따라 폐쇄된 박스 안으로 걷게 하였다. 걷기의 진행 방향(DoP)을 나타내는 점선을 사용한 풋 프린트 분석에서 측정된 매개 변수가 표시된다. MPTP 병변 마우스의 풋프린트를 보폭(cm)과 동요거리(cm)에 대해 평가하였다(도 38). 보폭과 동요거리를 각 보폭과 동요 사이의 전진 운동의 평균 거리로서 측정하였다. 히스토그램은 하기의 차이를 나타낸다: 4마리 마우스의 그룹의 보폭과 동요거리는 평균±S.D로 표시된다. 그룹 간의 실험적 차이를 스튜던트 이쌍 t-검정(* p <0.05)에 의해 평가하였다(도 39 및 40).
도 38 내지 40에 나타낸 바와 같이, 운동 활성은 MPTP 처리에 의해 소실되어 보행 패턴조차 관찰되지 않은 반면, iCP 파킨 재조합 단백질 처리 그룹은 운동 활성의 99% 회복을 나타내었고 정상적인 보행 패턴을 유지하였다.
19-2.
로타
-로드 시험
이 실험을 위해, 마우스를 MPTP 주사 전에 15 rpm의 속도로 10분 동안 3회 훈련시켰다. 이 실험에서, MPTP 주사 후, 마우스를 로타-로드에 10분간 올려놓고 속도를 4~30 rpm으로 가속시키고, 마우스가 떨어지기 전에 로타-로드에 유지된 시간을 측정하였다. 이 과정을 3회 반복하였다. 모든 시험을 비디오 카메라로 기록하였다.
도 41에 나타낸 바와 같이, MPTP 처리에 의해 운동 활성이 80% 이상 저하되었지만, iCP 파킨 재조합 단백질의 처리에 의해 운동 활성이 정상 수준에 거의 가깝게 회복되었음이 확인되었다.
실시예 20. 티로신 하이드록실라제의 발현 회복
MPTM 병변 마우스를 도 34에 나타낸 바와 같이 5일간 파킨 재조합 단백질로 처리하였다(IP, 30 mg/kg). 파킨 재조합 단백질의 처리 마지막 날에, 마우스를 0.9% NaCl로 관류시키고 차가운 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 그 다음, 뇌를 제거하고, 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, 30% 수크로스로 옮겼다. 뇌를 동결 마이크로톰을 이용하여 30 ㎛의 관상 절편으로 절단하였다. 뇌에서의 도파민성 신경 세포 마커인 티로신 하이드록실라제(TH)를 항-TH(1:50, Thermo Scientific, Rockford, USA) 단클론 항체로 염색한 후, 바이오틴-접합된 염소 항-토끼 이차 항체(1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 면역염색하고 ABC 키트(Vectastain kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 현상시켰다(도 42a). 각 처리 그룹에서의 TH-양성 세포의 백분율을 계산하였다. 그룹 간의 실험적 차이를 스튜던트 이쌍 t-검정(*p <0.05)에 의해 평가하였다(도 42b).
TH 발현을 도 34의 절차에 따라 제조된 아급성 MPTP PD 모델에서 웨스턴 블 롯팅에 의해 측정하였고, 그 결과, TH 수준이 iCP-파킨 재조합 단백질에 의해 회복된 것으로 확인되었다(도 43). 상세하게는, 뇌를 제거하고 Pro-Prep(iNtRon, 17081)을 이용하여 균질화하고, 4℃에서 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상층액 중의 단백질을 브래드포드 분석을 사용하여 정량하고, 단백질 10 ug을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다.
파킨(1:200, Santa cruz, Cat # 32282), 티로신 하이드록실라제(TH, 1:2000, Millipore, cat# AB152), β-액틴(1:5000, Cell signaling, cat# 4967S)을 1차 항체로서 사용하였고, 항-마우스 IgG-HRP-유사 항체(Cell signaling, cat# 7074s) 및 항-토끼 IgG-HRP-유사 항체(Cell signaling, cat# 7076s)를 2차 항체로 사용하였다. 5% BSA로 실온에서 1시간 동안 블로킹을 수행하고, 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 16시간 이상 또는 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. TBS-T(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.05 % tween-20)로 세척한 후, 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 처리한 다음, TBS-T로 세척하였다. 화학발광 검출을 위해 ECL(Enhanced Chemiluminescence)을 사용하여 관찰 및 분석을 수행하였다. 모든 실험 그룹에서 내인성 파킨 발현의 큰 변화가 에서 관찰되지 않았다.
도 42a 및 42b에 나타낸 바와 같이, MPTP 단독으로 처리된 마우스에서 활성화된 도파민 분비 세포의 수는 정상 대조군의 10%인 반면, MPTP 처리 후 iCP-파킨 재조합 단백질을 주사한 실험 그룹의 활성화된 도파민 분비 세포의 수는 정상 대조군의 60%였다. 또한, 본 발명의 재조합 단백질의 신경 세포 재생 효과가 용량 의존적으로 관찰되었다(도 42a, 하부). 따라서, 본 발명의 iCP-파킨 재조합 단백질은 뇌 조직의 혈액-뇌 장벽을 효과적으로 통과하여 도파민 분비 세포의 약 50%를 활성화시키고, 따라서 본 발명의 재조합 단백질은 MPTP 유도 뇌 세포 사멸에 대해 우수한 뇌 세포 보호 효과를 갖는다는 것이 확인되었다.
실시예 21. 통계학적 분석
배양된 세포를 사용한 모든 실험 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험에 대해 평균±S.D로 표시된다. 통계학적 유의성을 양측 스튜던트 t-검정 또는 ANOVA 방법을 사용하여 평가한다. 그룹 간의 실험적 차이를 쌍별 스튜던트 t-검정을 사용하여 평가한다. 동물 실험의 경우, ANOVA를 그룹 간 및 그룹 내 비교에 사용하여 유의성을 결정한다. p<0.05를 갖는 차이를 통계학적으로 유의한 것으로 간주한다.
본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그의 본질적인 특징을 벗어나지 않고 다른 형태로 구현될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 개시된 구현예들은 제한적인 것이 아니라 모든 양태에서 예시적인 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명보다는 첨부된 청구범위에 대한 것이며, 따라서 청구범위의 등가물의 범위에 속하는 모든 변형이 포함되는 것으로 의도된다.
<110> Cellivery Therapeutics, Inc.
<120> Improved Cell-Permeable (iCP) Parkin Recombinant Protein and Use
Thereof
<130> FPC160024-PCT
<150> US 14/809,279
<151> 2015-07-27
<160> 849
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD1
<400> 1
Ala Ala Ala Leu Ala Pro Val Val Leu Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD2
<400> 2
Ala Ala Ala Val Pro Leu Leu Ala Val Val Val Pro
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD3
<400> 3
Ala Ala Leu Leu Val Pro Ala Ala Val Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD4
<400> 4
Ala Leu Ala Leu Leu Pro Val Ala Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD5
<400> 5
Ala Ala Ala Leu Leu Pro Val Ala Leu Val Ala Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD11
<400> 6
Val Val Ala Leu Ala Pro Ala Leu Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD12
<400> 7
Leu Leu Ala Ala Val Pro Ala Val Leu Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD13
<400> 8
Ala Ala Ala Leu Val Pro Val Val Ala Leu Leu Pro
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD21
<400> 9
Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Leu Leu Ala Val Pro
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD22
<400> 10
Ala Val Val Leu Val Pro Val Leu Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD23
<400> 11
Val Val Leu Val Leu Pro Ala Ala Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD24
<400> 12
Ile Ala Leu Ala Ala Pro Ala Leu Ile Val Ala Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD25
<400> 13
Ile Val Ala Val Ala Pro Ala Leu Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD42
<400> 14
Val Ala Ala Leu Pro Val Val Ala Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD43
<400> 15
Leu Leu Ala Ala Pro Leu Val Val Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD44
<400> 16
Ala Leu Ala Val Pro Val Ala Leu Leu Val Ala Pro
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD61
<400> 17
Val Ala Ala Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD62
<400> 18
Val Ala Leu Leu Ala Pro Val Ala Leu Ala Val Pro
1 5 10
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD63
<400> 19
Ala Ala Leu Leu Val Pro Ala Leu Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD64
<400> 20
Ala Ile Val Ala Leu Pro Val Ala Val Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD65
<400> 21
Ile Ala Ile Val Ala Pro Val Val Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD81
<400> 22
Ala Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD82
<400> 23
Ala Val Val Leu Ala Pro Val Ala Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD83
<400> 24
Leu Ala Val Ala Ala Pro Leu Ala Leu Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD84
<400> 25
Ala Ala Val Ala Ala Pro Leu Leu Leu Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD85
<400> 26
Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD101
<400> 27
Leu Val Ala Leu Ala Pro Val Ala Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD102
<400> 28
Leu Ala Leu Ala Pro Ala Ala Leu Ala Leu Leu Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD103
<400> 29
Ala Leu Ile Ala Ala Pro Ile Leu Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD104
<400> 30
Ala Val Val Ala Ala Pro Leu Val Leu Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD105
<400> 31
Leu Leu Ala Leu Ala Pro Ala Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD121
<400> 32
Ala Ile Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD123
<400> 33
Ala Ala Ile Ile Val Pro Ala Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD124
<400> 34
Ile Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD141
<400> 35
Ala Val Ile Val Leu Pro Ala Leu Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD143
<400> 36
Ala Val Leu Ala Val Pro Ala Val Leu Val Ala Pro
1 5 10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD144
<400> 37
Val Leu Ala Ile Val Pro Ala Val Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD145
<400> 38
Leu Leu Ala Val Val Pro Ala Val Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD161
<400> 39
Ala Val Ile Ala Leu Pro Ala Leu Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD162
<400> 40
Ala Val Val Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ile Val Pro
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD163
<400> 41
Leu Ala Leu Val Leu Pro Ala Ala Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD164
<400> 42
Leu Ala Ala Val Leu Pro Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD165
<400> 43
Ala Leu Ala Val Pro Val Ala Leu Ala Ile Val Pro
1 5 10
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD182
<400> 44
Ala Leu Ile Ala Pro Val Val Ala Leu Val Ala Pro
1 5 10
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD183
<400> 45
Leu Leu Ala Ala Pro Val Val Ile Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD184
<400> 46
Leu Ala Ala Ile Val Pro Ala Ile Ile Ala Val Pro
1 5 10
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD185
<400> 47
Ala Ala Leu Val Leu Pro Leu Ile Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD201
<400> 48
Leu Ala Leu Ala Val Pro Ala Leu Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD204
<400> 49
Leu Ile Ala Ala Leu Pro Ala Val Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 50
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD205
<400> 50
Ala Leu Ala Leu Val Pro Ala Ile Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD221
<400> 51
Ala Ala Ile Leu Ala Pro Ile Val Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD222
<400> 52
Ala Leu Leu Ile Ala Pro Ala Ala Val Ile Ala Pro
1 5 10
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD223
<400> 53
Ala Ile Leu Ala Val Pro Ile Ala Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD224
<400> 54
Ile Leu Ala Ala Val Pro Ile Ala Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD225
<400> 55
Val Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD241
<400> 56
Ala Ala Ala Val Val Pro Val Leu Leu Val Ala Pro
1 5 10
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD242
<400> 57
Ala Ala Leu Leu Val Pro Ala Leu Val Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD243
<400> 58
Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Ala Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD245
<400> 59
Ala Ala Ala Leu Ala Pro Val Leu Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD261
<400> 60
Leu Val Leu Val Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD262
<400> 61
Ala Leu Ile Ala Val Pro Ala Ile Ile Val Ala Pro
1 5 10
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD263
<400> 62
Ala Leu Ala Val Ile Pro Ala Ala Ala Ile Leu Pro
1 5 10
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD264
<400> 63
Leu Ala Ala Ala Pro Val Val Ile Val Ile Ala Pro
1 5 10
<210> 64
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD265
<400> 64
Val Leu Ala Ile Ala Pro Leu Leu Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD281
<400> 65
Ala Leu Ile Val Leu Pro Ala Ala Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD282
<400> 66
Val Leu Ala Val Ala Pro Ala Leu Ile Val Ala Pro
1 5 10
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD283
<400> 67
Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Leu Ile Val Ala Pro
1 5 10
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD284
<400> 68
Ala Leu Ile Ala Pro Ala Val Ala Leu Ile Val Pro
1 5 10
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD285
<400> 69
Ala Ile Val Leu Leu Pro Ala Ala Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD301
<400> 70
Val Ile Ala Ala Pro Val Leu Ala Val Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD302
<400> 71
Leu Ala Leu Ala Pro Ala Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD304
<400> 72
Ala Ile Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ala Ile Ala Pro
1 5 10
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD305
<400> 73
Ile Ala Leu Ala Ala Pro Ile Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD321
<400> 74
Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Val Pro
1 5 10
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD322
<400> 75
Val Val Ala Ile Val Leu Pro Ala Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD323
<400> 76
Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Val Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD324
<400> 77
Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD325
<400> 78
Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD341
<400> 79
Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Val Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 80
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD342
<400> 80
Val Ile Val Ala Leu Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD343
<400> 81
Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Val Ala Pro
1 5 10
<210> 82
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD345
<400> 82
Ala Leu Leu Ile Val Ala Pro Val Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD361
<400> 83
Ala Val Val Ile Val Ala Pro Ala Val Ile Ala Pro
1 5 10
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD363
<400> 84
Ala Val Leu Ala Val Ala Pro Ala Leu Ile Val Pro
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD364
<400> 85
Leu Val Ala Ala Val Ala Pro Ala Leu Ile Val Pro
1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD365
<400> 86
Ala Val Ile Val Val Ala Pro Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD381
<400> 87
Val Val Ala Ile Val Leu Pro Ala Val Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD382
<400> 88
Ala Ala Ala Leu Val Ile Pro Ala Ile Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD383
<400> 89
Val Ile Val Ala Leu Ala Pro Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD384
<400> 90
Val Ile Val Ala Ile Ala Pro Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD385
<400> 91
Ile Val Ala Ile Ala Val Pro Ala Leu Val Ala Pro
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD401
<400> 92
Ala Ala Leu Ala Val Ile Pro Ala Ala Ile Leu Pro
1 5 10
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD402
<400> 93
Ala Leu Ala Ala Val Ile Pro Ala Ala Ile Leu Pro
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD403
<400> 94
Ala Ala Ala Leu Val Ile Pro Ala Ala Ile Leu Pro
1 5 10
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD404
<400> 95
Leu Ala Ala Ala Val Ile Pro Ala Ala Ile Leu Pro
1 5 10
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD405
<400> 96
Leu Ala Ala Ala Val Ile Pro Val Ala Ile Leu Pro
1 5 10
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD421
<400> 97
Ala Ala Ile Leu Ala Ala Pro Leu Ile Ala Val Pro
1 5 10
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD422
<400> 98
Val Val Ala Ile Leu Ala Pro Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD424
<400> 99
Ala Val Val Val Ala Ala Pro Val Leu Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD425
<400> 100
Ala Val Val Ala Ile Ala Pro Val Leu Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD442
<400> 101
Ala Leu Ala Ala Leu Val Pro Ala Val Leu Val Pro
1 5 10
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD443
<400> 102
Ala Leu Ala Ala Leu Val Pro Val Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD444
<400> 103
Leu Ala Ala Ala Leu Val Pro Val Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD445
<400> 104
Ala Leu Ala Ala Leu Val Pro Ala Leu Val Val Pro
1 5 10
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD461
<400> 105
Ile Ala Ala Val Ile Val Pro Ala Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD462
<400> 106
Ile Ala Ala Val Leu Val Pro Ala Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 107
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD463
<400> 107
Ala Val Ala Ile Leu Val Pro Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 108
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD464
<400> 108
Ala Val Val Ile Leu Val Pro Leu Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 109
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD465
<400> 109
Ile Ala Ala Val Ile Val Pro Val Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 110
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD481
<400> 110
Ala Ile Ala Ile Ala Ile Val Pro Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD482
<400> 111
Ile Leu Ala Val Ala Ala Ile Pro Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD483
<400> 112
Ile Leu Ala Ala Ala Ile Ile Pro Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 113
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD484
<400> 113
Leu Ala Val Val Leu Ala Ala Pro Ala Ile Val Pro
1 5 10
<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD485
<400> 114
Ala Ile Leu Ala Ala Ile Val Pro Leu Ala Val Pro
1 5 10
<210> 115
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD501
<400> 115
Val Ile Val Ala Leu Ala Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD502
<400> 116
Ala Ile Val Ala Leu Ala Val Pro Val Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 117
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD503
<400> 117
Ala Ala Ile Ile Ile Val Leu Pro Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 118
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD504
<400> 118
Leu Ile Val Ala Leu Ala Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 119
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD505
<400> 119
Ala Ile Ile Ile Val Ile Ala Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 120
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD521
<400> 120
Leu Ala Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD522
<400> 121
Ala Leu Leu Val Ile Ala Val Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 122
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD524
<400> 122
Ala Val Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 123
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD525
<400> 123
Ala Leu Ala Ile Val Val Ala Pro Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD541
<400> 124
Leu Leu Ala Leu Ile Ile Ala Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 125
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD542
<400> 125
Ala Leu Ala Leu Ile Ile Val Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 126
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD543
<400> 126
Leu Leu Ala Ala Leu Ile Ala Pro Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 127
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD544
<400> 127
Ile Val Ala Leu Ile Val Ala Pro Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD545
<400> 128
Val Val Leu Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 129
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD561
<400> 129
Ala Ala Val Ala Ile Val Leu Pro Ala Val Val Pro
1 5 10
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD562
<400> 130
Ala Leu Ile Ala Ala Ile Val Pro Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD563
<400> 131
Ala Leu Ala Val Ile Val Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD564
<400> 132
Val Ala Ile Ala Leu Ile Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 133
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD565
<400> 133
Val Ala Ile Val Leu Val Ala Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 134
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD582
<400> 134
Val Ala Val Ala Leu Ile Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD583
<400> 135
Ala Val Ile Leu Ala Leu Ala Pro Ile Val Ala Pro
1 5 10
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD585
<400> 136
Ala Leu Ile Val Ala Ile Ala Pro Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 137
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD601
<400> 137
Ala Ala Ile Leu Ile Ala Val Pro Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD602
<400> 138
Val Ile Val Ala Leu Ala Ala Pro Val Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD603
<400> 139
Val Leu Val Ala Leu Ala Ala Pro Val Ile Ala Pro
1 5 10
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD604
<400> 140
Val Ala Leu Ile Ala Val Ala Pro Ala Val Val Pro
1 5 10
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD605
<400> 141
Val Ile Ala Ala Val Leu Ala Pro Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD622
<400> 142
Ala Leu Ile Val Leu Ala Ala Pro Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 143
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD623
<400> 143
Val Ala Ala Ala Ile Ala Leu Pro Ala Ile Val Pro
1 5 10
<210> 144
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD625
<400> 144
Ile Leu Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ile Val Pro
1 5 10
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD643
<400> 145
Leu Ala Leu Val Leu Ala Ala Pro Ala Ile Val Pro
1 5 10
<210> 146
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD645
<400> 146
Ala Leu Ala Val Val Ala Leu Pro Ala Ile Val Pro
1 5 10
<210> 147
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD661
<400> 147
Ala Ala Ile Leu Ala Pro Ile Val Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 148
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD664
<400> 148
Ile Leu Ile Ala Ile Ala Ile Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 149
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD665
<400> 149
Leu Ala Ile Val Leu Ala Ala Pro Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 150
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD666
<400> 150
Ala Ala Ile Ala Ile Ile Ala Pro Ala Ile Val Pro
1 5 10
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD667
<400> 151
Leu Ala Val Ala Ile Val Ala Pro Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD683
<400> 152
Leu Ala Ile Val Leu Ala Ala Pro Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD684
<400> 153
Ala Ala Ile Val Leu Ala Leu Pro Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD685
<400> 154
Ala Leu Leu Val Ala Val Leu Pro Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD686
<400> 155
Ala Ala Leu Val Ala Val Leu Pro Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 156
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD687
<400> 156
Ala Ile Leu Ala Val Ala Leu Pro Leu Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 157
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD703
<400> 157
Ile Val Ala Val Ala Leu Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 158
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD705
<400> 158
Ile Val Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 159
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD706
<400> 159
Ile Val Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 160
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD707
<400> 160
Ile Val Ala Leu Ala Val Leu Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 161
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD724
<400> 161
Val Ala Val Leu Ala Val Leu Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD725
<400> 162
Ile Ala Val Leu Ala Val Ala Pro Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 163
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD726
<400> 163
Leu Ala Val Ala Ile Ile Ala Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD727
<400> 164
Val Ala Leu Ala Ile Ala Leu Pro Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 165
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD743
<400> 165
Ala Ile Ala Ile Ala Leu Val Pro Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 166
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD744
<400> 166
Ala Ala Val Val Ile Val Ala Pro Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 167
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD746
<400> 167
Val Ala Ile Ile Val Val Ala Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 168
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD747
<400> 168
Val Ala Leu Leu Ala Ile Ala Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 169
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD763
<400> 169
Val Ala Val Leu Ile Ala Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 170
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD764
<400> 170
Ala Val Ala Leu Ala Val Leu Pro Ala Val Val Pro
1 5 10
<210> 171
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD765
<400> 171
Ala Val Ala Leu Ala Val Val Pro Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 172
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD766
<400> 172
Ile Val Val Ile Ala Val Ala Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 173
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD767
<400> 173
Ile Val Val Ala Ala Val Val Pro Ala Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 174
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD783
<400> 174
Ile Val Ala Leu Val Pro Ala Val Ala Ile Ala Pro
1 5 10
<210> 175
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD784
<400> 175
Val Ala Ala Leu Pro Ala Val Ala Leu Val Val Pro
1 5 10
<210> 176
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD786
<400> 176
Leu Val Ala Ile Ala Pro Leu Ala Val Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 177
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD787
<400> 177
Ala Val Ala Leu Val Pro Val Ile Val Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 178
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD788
<400> 178
Ala Ile Ala Val Ala Ile Ala Pro Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 179
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD803
<400> 179
Ala Ile Ala Leu Ala Val Pro Val Leu Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 180
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD805
<400> 180
Leu Val Leu Ile Ala Ala Ala Pro Ile Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 181
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD806
<400> 181
Leu Val Ala Leu Ala Val Pro Ala Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 182
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD807
<400> 182
Ala Val Ala Leu Ala Val Pro Ala Leu Val Leu Pro
1 5 10
<210> 183
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD808
<400> 183
Leu Val Val Leu Ala Ala Ala Pro Leu Ala Val Pro
1 5 10
<210> 184
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD809
<400> 184
Leu Ile Val Leu Ala Ala Pro Ala Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 185
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD810
<400> 185
Val Ile Val Leu Ala Ala Pro Ala Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 186
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD811
<400> 186
Ala Val Val Leu Ala Val Pro Ala Leu Ala Val Pro
1 5 10
<210> 187
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD824
<400> 187
Leu Ile Ile Val Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 188
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD825
<400> 188
Ile Val Ala Val Ile Val Ala Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 189
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD826
<400> 189
Leu Val Ala Leu Ala Ala Pro Ile Ile Ala Val Pro
1 5 10
<210> 190
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD827
<400> 190
Ile Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD828
<400> 191
Ile Ala Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Ala Val Pro
1 5 10
<210> 192
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD829
<400> 192
Ala Ala Leu Ala Leu Val Ala Pro Val Ile Val Pro
1 5 10
<210> 193
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD830
<400> 193
Ile Ala Leu Val Ala Ala Pro Val Ala Leu Val Pro
1 5 10
<210> 194
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD831
<400> 194
Ile Ile Val Ala Val Ala Pro Ala Ala Ile Val Pro
1 5 10
<210> 195
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD832
<400> 195
Ala Val Ala Ala Ile Val Pro Val Ile Val Ala Pro
1 5 10
<210> 196
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD843
<400> 196
Ala Val Leu Val Leu Val Ala Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 197
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD844
<400> 197
Val Val Ala Leu Leu Ala Pro Leu Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 198
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD845
<400> 198
Ala Ala Val Val Ile Ala Pro Leu Leu Ala Val Pro
1 5 10
<210> 199
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD846
<400> 199
Ile Ala Val Ala Val Ala Ala Pro Leu Leu Val Pro
1 5 10
<210> 200
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD847
<400> 200
Leu Val Ala Ile Val Val Leu Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 201
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD848
<400> 201
Ala Val Ala Ile Val Val Leu Pro Ala Val Ala Pro
1 5 10
<210> 202
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD849
<400> 202
Ala Val Ile Leu Leu Ala Pro Leu Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 203
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD850
<400> 203
Leu Val Ile Ala Leu Ala Ala Pro Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 204
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD851
<400> 204
Val Leu Ala Val Val Leu Pro Ala Val Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 205
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD852
<400> 205
Val Leu Ala Val Ala Ala Pro Ala Val Leu Leu Pro
1 5 10
<210> 206
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD863
<400> 206
Ala Ala Val Val Leu Leu Pro Ile Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 207
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD864
<400> 207
Ala Leu Leu Val Ile Ala Pro Ala Ile Ala Val Pro
1 5 10
<210> 208
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD865
<400> 208
Ala Val Leu Val Ile Ala Val Pro Ala Ile Ala Pro
1 5 10
<210> 209
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD867
<400> 209
Ala Leu Leu Val Val Ile Ala Pro Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 210
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD868
<400> 210
Val Leu Val Ala Ala Ile Leu Pro Ala Ala Ile Pro
1 5 10
<210> 211
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD870
<400> 211
Val Leu Val Ala Ala Val Leu Pro Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 212
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD872
<400> 212
Val Leu Ala Ala Ala Val Leu Pro Leu Val Val Pro
1 5 10
<210> 213
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD875
<400> 213
Ala Ile Ala Ile Val Val Pro Ala Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 214
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD877
<400> 214
Val Ala Ile Ile Ala Val Pro Ala Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 215
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD878
<400> 215
Ile Val Ala Leu Val Ala Pro Ala Ala Val Val Pro
1 5 10
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD879
<400> 216
Ala Ala Ile Val Leu Leu Pro Ala Val Val Val Pro
1 5 10
<210> 217
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD881
<400> 217
Ala Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 218
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD882
<400> 218
Ala Ile Ala Leu Val Val Pro Ala Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 219
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD883
<400> 219
Leu Ala Ile Val Pro Ala Ala Ile Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 220
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD885
<400> 220
Leu Val Ala Ile Ala Pro Ala Val Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 221
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD887
<400> 221
Val Leu Ala Val Ala Pro Ala Val Ala Val Leu Pro
1 5 10
<210> 222
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD888
<400> 222
Ile Leu Ala Val Val Ala Ile Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 223
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD889
<400> 223
Ile Leu Val Ala Ala Ala Pro Ile Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 224
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD891
<400> 224
Ile Leu Ala Val Ala Ala Ile Pro Ala Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 225
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD893
<400> 225
Val Ile Ala Ile Pro Ala Ile Leu Ala Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 226
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD895
<400> 226
Ala Ile Ile Ile Val Val Pro Ala Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 227
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD896
<400> 227
Ala Ile Leu Ile Val Val Ala Pro Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 228
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD897
<400> 228
Ala Val Ile Val Pro Val Ala Ile Ile Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 229
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD899
<400> 229
Ala Val Val Ile Ala Leu Pro Ala Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 230
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD900
<400> 230
Ala Leu Val Ala Val Ile Ala Pro Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 231
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD901
<400> 231
Ala Leu Val Ala Val Leu Pro Ala Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 232
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD902
<400> 232
Ala Leu Val Ala Pro Leu Leu Ala Val Ala Val Pro
1 5 10
<210> 233
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD904
<400> 233
Ala Val Leu Ala Val Val Ala Pro Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 234
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD905
<400> 234
Ala Val Ile Ala Val Ala Pro Leu Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 235
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD906
<400> 235
Ala Val Ile Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 236
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD907
<400> 236
Val Ala Ile Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 237
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD908
<400> 237
Val Ala Leu Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 238
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD910
<400> 238
Val Ala Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 239
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD911
<400> 239
Val Ala Leu Ala Leu Pro Ala Val Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 240
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of aMTD912
<400> 240
Val Ala Leu Leu Ala Pro Ala Val Val Val Ala Pro
1 5 10
<210> 241
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD1
<400> 241
gcggcggcgc tggcgccggt ggtgctggcg ctgccg 36
<210> 242
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD2
<400> 242
gcggcggcgg tgccgctgct ggcggtggtg gtgccg 36
<210> 243
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD3
<400> 243
gcggcgctgc tggtgccggc ggcggtgctg gcgccg 36
<210> 244
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD4
<400> 244
gcgctggcgc tgctgccggt ggcggcgctg gcgccg 36
<210> 245
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD5
<400> 245
gcggcggcgc tgctgccggt ggcgctggtg gcgccg 36
<210> 246
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD11
<400> 246
gtggtggcgc tggcgccggc gctggcggcg ctgccg 36
<210> 247
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD12
<400> 247
ctgctggcgg cggtgccggc ggtgctgctg gcgccg 36
<210> 248
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD13
<400> 248
gcggcggcgc tggtgccggt ggtggcgctg ctgccg 36
<210> 249
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD21
<400> 249
gcggtggcgc tgctgccggc gctgctggcg gtgccg 36
<210> 250
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD22
<400> 250
gcggtggtgc tggtgccggt gctggcggcg gcgccg 36
<210> 251
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD23
<400> 251
gtggtgctgg tgctgccggc ggcggcggcg gtgccg 36
<210> 252
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD24
<400> 252
attgcgctgg cggcgccggc gctgattgtg gcgccg 36
<210> 253
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD25
<400> 253
attgtggcgg tggcgccggc gctggtggcg ctgccg 36
<210> 254
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD42
<400> 254
gtggcggcgc tgccggtggt ggcggtggtg gcgccg 36
<210> 255
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD43
<400> 255
ctgctggcgg cgccgctggt ggtggcggcg gtgccg 36
<210> 256
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD44
<400> 256
gcgctggcgg tgccggtggc gctgctggtg gcgccg 36
<210> 257
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD61
<400> 257
gtggcggcgc tgccggtgct gctggcggcg ctgccg 36
<210> 258
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD62
<400> 258
gtggcgctgc tggcgccggt ggcgctggcg gtgccg 36
<210> 259
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD63
<400> 259
gcggcgctgc tggtgccggc gctggtggcg gtgccg 36
<210> 260
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD64
<400> 260
gcgattgtgg cgctgccggt ggcggtgctg gcgccg 36
<210> 261
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD65
<400> 261
attgcgattg tggcgccggt ggtggcgctg gcgccg 36
<210> 262
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD81
<400> 262
gcggcgctgc tgccggcgct ggcggcgctg ctgccg 36
<210> 263
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD82
<400> 263
gcggtggtgc tggcgccggt ggcggcggtg ctgccg 36
<210> 264
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD83
<400> 264
ctggcggtgg cggcgccgct ggcgctggcg ctgccg 36
<210> 265
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD84
<400> 265
gcggcggtgg cggcgccgct gctgctggcg ctgccg 36
<210> 266
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD85
<400> 266
ctgctggtgc tgccggcggc ggcgctggcg gcgccg 36
<210> 267
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD101
<400> 267
ctggtggcgg tggcgccggt ggcggcggtg ctgccg 36
<210> 268
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD102
<400> 268
ctggcgctgg cgccggcggc gctggcgctg ctgccg 36
<210> 269
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD103
<400> 269
gcgctgattg cggcgccgat tctggcgctg gcgccg 36
<210> 270
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD104
<400> 270
gcggtggtgg cggcgccgct ggtgctggcg ctgccg 36
<210> 271
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD105
<400> 271
ctgctggcgc tggcgccggc ggcgctgctg gcgccg 36
<210> 272
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD121
<400> 272
gcgattgtgg cgctgccggc gctggcgctg gcgccg 36
<210> 273
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD123
<400> 273
gcggcgatta ttgtgccggc ggcgctgctg gcgccg 36
<210> 274
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD124
<400> 274
attgcggtgg cgctgccggc gctgattgcg gcgccg 36
<210> 275
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD141
<400> 275
gcggtgattg tgctgccggc gctggcggtg gcgccg 36
<210> 276
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD143
<400> 276
gcggtgctgg cggtgccggc ggtgctggtg gcgccg 36
<210> 277
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD144
<400> 277
gtgctggcga ttgtgccggc ggtggcgctg gcgccg 36
<210> 278
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD145
<400> 278
ctgctggcgg tggtgccggc ggtggcgctg gcgccg 36
<210> 279
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD161
<400> 279
gcggtgattg cgctgccggc gctgattgcg gcgccg 36
<210> 280
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD162
<400> 280
gcggtggtgg cgctgccggc ggcgctgatt gtgccg 36
<210> 281
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD163
<400> 281
ctggcgctgg tgctgccggc ggcgctggcg gcgccg 36
<210> 282
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD164
<400> 282
ctggcggcgg tgctgccggc gctgctggcg gcgccg 36
<210> 283
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD165
<400> 283
gcgctggcgg tgccggtggc gctggcgatt gtgccg 36
<210> 284
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD182
<400> 284
gcgctgattg cgccggtggt ggcgctggtg gcgccg 36
<210> 285
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD183
<400> 285
ctgctggcgg cgccggtggt gattgcgctg gcgccg 36
<210> 286
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD184
<400> 286
ctggcggcga ttgtgccggc gattattgcg gtgccg 36
<210> 287
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD185
<400> 287
gcggcgctgg tgctgccgct gattattgcg gcgccg 36
<210> 288
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD201
<400> 288
ctggcgctgg cggtgccggc gctggcggcg ctgccg 36
<210> 289
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD204
<400> 289
ctgattgcgg cgctgccggc ggtggcggcg ctgccg 36
<210> 290
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD205
<400> 290
gcgctggcgc tggtgccggc gattgcggcg ctgccg 36
<210> 291
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD221
<400> 291
gcggcgattc tggcgccgat tgtggcgctg gcgccg 36
<210> 292
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD222
<400> 292
gcgctgctga ttgcgccggc ggcggtgatt gcgccg 36
<210> 293
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD223
<400> 293
gcgattctgg cggtgccgat tgcggtggtg gcgccg 36
<210> 294
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD224
<400> 294
attctggcgg cggtgccgat tgcgctggcg gcgccg 36
<210> 295
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD225
<400> 295
gtggcggcgc tgctgccggc ggcggcggtg ctgccg 36
<210> 296
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD241
<400> 296
gcggcggcgg tggtgccggt gctgctggtg gcgccg 36
<210> 297
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD242
<400> 297
gcggcgctgc tggtgccggc gctggtggcg gcgccg 36
<210> 298
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD243
<400> 298
gcggcggtgc tgctgccggt ggcgctggcg gcgccg 36
<210> 299
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD245
<400> 299
gcggcggcgc tggcgccggt gctggcgctg gtgccg 36
<210> 300
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD261
<400> 300
ctggtgctgg tgccgctgct ggcggcggcg gcgccg 36
<210> 301
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD262
<400> 301
gcgctgattg cggtgccggc gattattgtg gcgccg 36
<210> 302
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD263
<400> 302
gcgctggcgg tgattccggc ggcggcgatt ctgccg 36
<210> 303
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD264
<400> 303
ctggcggcgg cgccggtggt gattgtgatt gcgccg 36
<210> 304
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD265
<400> 304
gtgctggcga ttgcgccgct gctggcggcg gtgccg 36
<210> 305
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD281
<400> 305
gcgctgattg tgctgccggc ggcggtggcg gtgccg 36
<210> 306
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD282
<400> 306
gtgctggcgg tggcgccggc gctgattgtg gcgccg 36
<210> 307
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD283
<400> 307
gcggcgctgc tggcgccggc gctgattgtg gcgccg 36
<210> 308
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD284
<400> 308
gcgctgattg cgccggcggt ggcgctgatt gtgccg 36
<210> 309
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD285
<400> 309
gcgattgtgc tgctgccggc ggcggtggtg gcgccg 36
<210> 310
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD301
<400> 310
gtgattgcgg cgccggtgct ggcggtgctg gcgccg 36
<210> 311
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD302
<400> 311
ctggcgctgg cgccggcgct ggcgctgctg gcgccg 36
<210> 312
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD304
<400> 312
gcgattattc tggcgccgat tgcggcgatt gcgccg 36
<210> 313
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD305
<400> 313
attgcgctgg cggcgccgat tctgctggcg gcgccg 36
<210> 314
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD321
<400> 314
attgtggcgg tggcgctgcc ggcgctggcg gtgccg 36
<210> 315
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD322
<400> 315
gtggtggcga ttgtgctgcc ggcgctggcg gcgccg 36
<210> 316
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD323
<400> 316
attgtggcgg tggcgctgcc ggtggcgctg gcgccg 36
<210> 317
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD324
<400> 317
attgtggcgg tggcgctgcc ggcggcgctg gtgccg 36
<210> 318
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD325
<400> 318
attgtggcgg tggcgctgcc ggcggtggcg ctgccg 36
<210> 319
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD341
<400> 319
attgtggcgg tggcgctgcc ggcggtgctg gcgccg 36
<210> 320
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD342
<400> 320
gtgattgtgg cgctggcgcc ggcggtgctg gcgccg 36
<210> 321
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD343
<400> 321
attgtggcgg tggcgctgcc ggcgctggtg gcgccg 36
<210> 322
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD345
<400> 322
gcgctgctga ttgtggcgcc ggtggcggtg gcgccg 36
<210> 323
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD361
<400> 323
gcggtggtga ttgtggcgcc ggcggtgatt gcgccg 36
<210> 324
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD363
<400> 324
gcggtgctgg cggtggcgcc ggcgctgatt gtgccg 36
<210> 325
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD364
<400> 325
ctggtggcgg cggtggcgcc ggcgctgatt gtgccg 36
<210> 326
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD365
<400> 326
gcggtgattg tggtggcgcc ggcgctgctg gcgccg 36
<210> 327
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD381
<400> 327
gtggtggcga ttgtgctgcc ggcggtggcg gcgccg 36
<210> 328
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD382
<400> 328
gcggcggcgc tggtgattcc ggcgattctg gcgccg 36
<210> 329
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD383
<400> 329
gtgattgtgg cgctggcgcc ggcgctgctg gcgccg 36
<210> 330
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD384
<400> 330
gtgattgtgg cgattgcgcc ggcgctgctg gcgccg 36
<210> 331
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD385
<400> 331
attgtggcga ttgcggtgcc ggcgctggtg gcgccg 36
<210> 332
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD401
<400> 332
gcggcgctgg cggtgattcc ggcggcgatt ctgccg 36
<210> 333
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD402
<400> 333
gcgctggcgg cggtgattcc ggcggcgatt ctgccg 36
<210> 334
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD403
<400> 334
gcggcggcgc tggtgattcc ggcggcgatt ctgccg 36
<210> 335
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD404
<400> 335
ctggcggcgg cggtgattcc ggcggcgatt ctgccg 36
<210> 336
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD405
<400> 336
ctggcggcgg cggtgattcc ggtggcgatt ctgccg 36
<210> 337
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD421
<400> 337
gcggcgattc tggcggcgcc gctgattgcg gtgccg 36
<210> 338
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD422
<400> 338
gtggtggcga ttctggcgcc gctgctggcg gcgccg 36
<210> 339
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD424
<400> 339
gcggtggtgg tggcggcgcc ggtgctggcg ctgccg 36
<210> 340
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD425
<400> 340
gcggtggtgg cgattgcgcc ggtgctggcg ctgccg 36
<210> 341
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD442
<400> 341
gcgctggcgg cgctggtgcc ggcggtgctg gtgccg 36
<210> 342
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD443
<400> 342
gcgctggcgg cgctggtgcc ggtggcgctg gtgccg 36
<210> 343
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD444
<400> 343
ctggcggcgg cgctggtgcc ggtggcgctg gtgccg 36
<210> 344
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD445
<400> 344
gcgctggcgg cgctggtgcc ggcgctggtg gtgccg 36
<210> 345
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD461
<400> 345
attgcggcgg tgattgtgcc ggcggtggcg ctgccg 36
<210> 346
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD462
<400> 346
attgcggcgg tgctggtgcc ggcggtggcg ctgccg 36
<210> 347
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD463
<400> 347
gcggtggcga ttctggtgcc gctgctggcg gcgccg 36
<210> 348
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD464
<400> 348
gcggtggtga ttctggtgcc gctggcggcg gcgccg 36
<210> 349
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD465
<400> 349
attgcggcgg tgattgtgcc ggtggcggcg ctgccg 36
<210> 350
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD481
<400> 350
gcgattgcga ttgcgattgt gccggtggcg ctgccg 36
<210> 351
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD482
<400> 351
attctggcgg tggcggcgat tccggtggcg gtgccg 36
<210> 352
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD483
<400> 352
attctggcgg cggcgattat tccggcggcg ctgccg 36
<210> 353
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD484
<400> 353
ctggcggtgg tgctggcggc gccggcgatt gtgccg 36
<210> 354
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD485
<400> 354
gcgattctgg cggcgattgt gccgctggcg gtgccg 36
<210> 355
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD501
<400> 355
gtgattgtgg cgctggcggt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 356
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD502
<400> 356
gcgattgtgg cgctggcggt gccggtgctg gcgccg 36
<210> 357
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD503
<400> 357
gcggcgatta ttattgtgct gccggcggcg ctgccg 36
<210> 358
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD504
<400> 358
ctgattgtgg cgctggcggt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 359
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD505
<400> 359
gcgattatta ttgtgattgc gccggcggcg gcgccg 36
<210> 360
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD521
<400> 360
ctggcggcgc tgattgtggt gccggcggtg gcgccg 36
<210> 361
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD522
<400> 361
gcgctgctgg tgattgcggt gccggcggtg gcgccg 36
<210> 362
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD524
<400> 362
gcggtggcgc tgattgtggt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 363
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD525
<400> 363
gcgctggcga ttgtggtggc gccggtggcg gtgccg 36
<210> 364
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD541
<400> 364
ctgctggcgc tgattattgc gccggcggcg gcgccg 36
<210> 365
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD542
<400> 365
gcgctggcgc tgattattgt gccggcggtg gcgccg 36
<210> 366
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD543
<400> 366
ctgctggcgg cgctgattgc gccggcggcg ctgccg 36
<210> 367
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD544
<400> 367
attgtggcgc tgattgtggc gccggcggcg gtgccg 36
<210> 368
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD545
<400> 368
gtggtgctgg tgctggcggc gccggcggcg gtgccg 36
<210> 369
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD561
<400> 369
gcggcggtgg cgattgtgct gccggcggtg gtgccg 36
<210> 370
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD562
<400> 370
gcgctgattg cggcgattgt gccggcgctg gtgccg 36
<210> 371
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD563
<400> 371
gcgctggcgg tgattgtggt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 372
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD564
<400> 372
gtggcgattg cgctgattgt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 373
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD565
<400> 373
gtggcgattg tgctggtggc gccggcggtg gcgccg 36
<210> 374
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD582
<400> 374
gtggcggtgg cgctgattgt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 375
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD583
<400> 375
gcggtgattc tggcgctggc gccgattgtg gcgccg 36
<210> 376
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD585
<400> 376
gcgctgattg tggcgattgc gccggcgctg gtgccg 36
<210> 377
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD601
<400> 377
gcggcgattc tgattgcggt gccgattgcg gcgccg 36
<210> 378
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD602
<400> 378
gtgattgtgg cgctggcggc gccggtgctg gcgccg 36
<210> 379
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD603
<400> 379
gtgctggtgg cgctggcggc gccggtgatt gcgccg 36
<210> 380
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD604
<400> 380
gtggcgctga ttgcggtggc gccggcggtg gtgccg 36
<210> 381
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD605
<400> 381
gtgattgcgg cggtgctggc gccggtggcg gtgccg 36
<210> 382
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD622
<400> 382
gcgctgattg tgctggcggc gccggtggcg gtgccg 36
<210> 383
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD623
<400> 383
gtggcggcgg cgattgcgct gccggcgatt gtgccg 36
<210> 384
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD625
<400> 384
attctggcgg cggcggcggc gccgctgatt gtgccg 36
<210> 385
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD643
<400> 385
ctggcgctgg tgctggcggc gccggcgatt gtgccg 36
<210> 386
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD645
<400> 386
gcgctggcgg tggtggcgct gccggcgatt gtgccg 36
<210> 387
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD661
<400> 387
gcggcgattc tggcgccgat tgtggcggcg ctgccg 36
<210> 388
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD664
<400> 388
attctgattg cgattgcgat tccggcggcg gcgccg 36
<210> 389
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD665
<400> 389
ctggcgattg tgctggcggc gccggtggcg gtgccg 36
<210> 390
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD666
<400> 390
gcggcgattg cgattattgc gccggcgatt gtgccg 36
<210> 391
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD667
<400> 391
ctggcggtgg cgattgtggc gccggcgctg gtgccg 36
<210> 392
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD683
<400> 392
ctggcgattg tgctggcggc gccggcggtg ctgccg 36
<210> 393
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD684
<400> 393
gcggcgattg tgctggcgct gccggcggtg ctgccg 36
<210> 394
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD685
<400> 394
gcgctgctgg tggcggtgct gccggcggcg ctgccg 36
<210> 395
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD686
<400> 395
gcggcgctgg tggcggtgct gccggtggcg ctgccg 36
<210> 396
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD687
<400> 396
attgtggcgg tggcgctggt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 397
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD703
<400> 397
attgtggcgg tggcgctggt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 398
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD705
<400> 398
attgtggcgg tggcgctgct gccggcgctg gcgccg 36
<210> 399
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD706
<400> 399
attgtggcgg tggcgctgct gccggcggtg gcgccg 36
<210> 400
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD707
<400> 400
attgtggcgc tggcggtgct gccggcggtg gcgccg 36
<210> 401
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD724
<400> 401
gtggcggtgc tggcggtgct gccggcgctg gcgccg 36
<210> 402
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD725
<400> 402
attgcggtgc tggcggtggc gccggcggtg ctgccg 36
<210> 403
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD726
<400> 403
ctggcggtgg cgattattgc gccggcggtg gcgccg 36
<210> 404
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD727
<400> 404
gtggcgctgg cgattgcgct gccggcggtg ctgccg 36
<210> 405
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD743
<400> 405
gcgattgcga ttgcgctggt gccggtggcg ctgccg 36
<210> 406
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD744
<400> 406
gcggcggtgg tgattgtggc gccggtggcg ctgccg 36
<210> 407
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD746
<400> 407
gcggcgattc tggcgattgt ggcgccgctg gcgccg 36
<210> 408
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD747
<400> 408
gtggcgctgc tggcgattgc gccggcgctg gcgccg 36
<210> 409
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD763
<400> 409
gtggcggtgc tgattgcggt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 410
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD764
<400> 410
gcggtggcgc tggcggtgct gccggcggtg gtgccg 36
<210> 411
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD765
<400> 411
gcggtggcgc tggcggtggt gccggcggtg ctgccg 36
<210> 412
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD766
<400> 412
attgtggtga ttgcggtggc gccggcggtg gcgccg 36
<210> 413
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD767
<400> 413
attgtggtgg cggcggtggt gccggcgctg gcgccg 36
<210> 414
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD783
<400> 414
attgtggcgc tggtgccggc ggtggcgatt gcgccg 36
<210> 415
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD784
<400> 415
gtggcggcgc tgccggcggt ggcgctggtg gtgccg 36
<210> 416
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD786
<400> 416
ctggtggcga ttgcgccgct ggcggtgctg gcgccg 36
<210> 417
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD787
<400> 417
gcggtggcgc tggtgccggt gattgtggcg gcgccg 36
<210> 418
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD788
<400> 418
gcgattgcgg tggcgattgc gccggtggcg ctgccg 36
<210> 419
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD803
<400> 419
gcgattgcgc tggcggtgcc ggtgctggcg ctgccg 36
<210> 420
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD805
<400> 420
ctggtgctga ttgcggcggc gccgattgcg ctgccg 36
<210> 421
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD806
<400> 421
ctggtggcgc tggcggtgcc ggcggcggtg ctgccg 36
<210> 422
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD807
<400> 422
gcggtggcgc tggcggtgcc ggcgctggtg ctgccg 36
<210> 423
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD808
<400> 423
ctggtggtgc tggcggcggc gccgctggcg gtgccg 36
<210> 424
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD809
<400> 424
ctgattgtgc tggcggcgcc ggcgctggcg gcgccg 36
<210> 425
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD810
<400> 425
gtgattgtgc tggcggcgcc ggcgctggcg gcgccg 36
<210> 426
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD811
<400> 426
gcggtggtgc tggcggtgcc ggcgctggcg gtgccg 36
<210> 427
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD824
<400> 427
ctgattattg tggcggcggc gccggcggtg gcgccg 36
<210> 428
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD825
<400> 428
attgtggcgg tgattgtggc gccggcggtg gcgccg 36
<210> 429
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD826
<400> 429
ctggtggcgc tggcggcgcc gattattgcg gtgccg 36
<210> 430
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD827
<400> 430
attgcggcgg tgctggcggc gccggcgctg gtgccg 36
<210> 431
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD828
<400> 431
attgcgctgc tggcggcgcc gattattgcg gtgccg 36
<210> 432
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD829
<400> 432
gcggcgctgg cgctggtggc gccggtgatt gtgccg 36
<210> 433
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD830
<400> 433
attgcgctgg tggcggcgcc ggtggcgctg gtgccg 36
<210> 434
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD831
<400> 434
attattgtgg cggtggcgcc ggcggcgatt gtgccg 36
<210> 435
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD832
<400> 435
gcggtggcgg cgattgtgcc ggtgattgtg gcgccg 36
<210> 436
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD843
<400> 436
gcggtgctgg tgctggtggc gccggcggcg gcgccg 36
<210> 437
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD844
<400> 437
gtggtggcgc tgctggcgcc gctgattgcg gcgccg 36
<210> 438
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD845
<400> 438
gcggcggtgg tgattgcgcc gctgctggcg gtgccg 36
<210> 439
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD846
<400> 439
attgcggtgg cggtggcggc gccgctgctg gtgccg 36
<210> 440
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD847
<400> 440
ctggtggcga ttgtggtgct gccggcggtg gcgccg 36
<210> 441
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD848
<400> 441
gcggtggcga ttgtggtgct gccggcggtg gcgccg 36
<210> 442
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD849
<400> 442
gcggtgattc tgctggcgcc gctgattgcg gcgccg 36
<210> 443
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD850
<400> 443
ctggtgattg cgctggcggc gccggtggcg ctgccg 36
<210> 444
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD851
<400> 444
gtgctggcgg tggtgctgcc ggcggtggcg ctgccg 36
<210> 445
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD852
<400> 445
gtgctggcgg tggcggcgcc ggcggtgctg ctgccg 36
<210> 446
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD863
<400> 446
gcggcggtgg tgctgctgcc gattattgcg gcgccg 36
<210> 447
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD864
<400> 447
gcgctgctgg tgattgcgcc ggcgattgcg gtgccg 36
<210> 448
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD865
<400> 448
gcggtgctgg tgattgcggt gccggcgatt gcgccg 36
<210> 449
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD867
<400> 449
gcgctgctgg tggtgattgc gccgctggcg gcgccg 36
<210> 450
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD868
<400> 450
gtgctggtgg cggcgattct gccggcggcg attccg 36
<210> 451
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD870
<400> 451
gtgctggtgg cggcggtgct gccgattgcg gcgccg 36
<210> 452
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD872
<400> 452
gtgctggcgg cggcggtgct gccgctggtg gtgccg 36
<210> 453
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD875
<400> 453
gcgattgcga ttgtggtgcc ggcggtggcg gtgccg 36
<210> 454
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD877
<400> 454
gtggcgatta ttgcggtgcc ggcggtggtg gcgccg 36
<210> 455
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD878
<400> 455
attgtggcgc tggtggcgcc ggcggcggtg gtgccg 36
<210> 456
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD879
<400> 456
gcggcgattg tgctgctgcc ggcggtggtg gtgccg 36
<210> 457
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD881
<400> 457
gcggcgctga ttgtggtgcc ggcggtggcg gtgccg 36
<210> 458
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD882
<400> 458
gcgattgcgc tggtggtgcc ggcggtggcg gtgccg 36
<210> 459
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD883
<400> 459
ctggcgattg tgccggcggc gattgcggcg ctgccg 36
<210> 460
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD885
<400> 460
ctggtggcga ttgcgccggc ggtggcggtg ctgccg 36
<210> 461
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD887
<400> 461
gtgctggcgg tggcgccggc ggtggcggtg ctgccg 36
<210> 462
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD888
<400> 462
attctggcgg tggtggcgat tccggcggcg gcgccg 36
<210> 463
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD889
<400> 463
attctggtgg cggcggcgcc gattgcggcg ctgccg 36
<210> 464
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD891
<400> 464
attctggcgg tggcggcgat tccggcggcg ctgccg 36
<210> 465
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD893
<400> 465
gtgattgcga ttccggcgat tctggcggcg gcgccg 36
<210> 466
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD895
<400> 466
gcgattatta ttgtggtgcc ggcgattgcg gcgccg 36
<210> 467
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD896
<400> 467
gcgattctga ttgtggtggc gccgattgcg gcgccg 36
<210> 468
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD897
<400> 468
gcggtgattg tgccggtggc gattattgcg gcgccg 36
<210> 469
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD899
<400> 469
gcggtggtga ttgcgctgcc ggcggtggtg gcgccg 36
<210> 470
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD900
<400> 470
gcgctggtgg cggtgattgc gccggtggtg gcgccg 36
<210> 471
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD901
<400> 471
gcgctggtgg cggtgctgcc ggcggtggcg gtgccg 36
<210> 472
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD902
<400> 472
gcgctggtgg cgccgctgct ggcggtggcg gtgccg 36
<210> 473
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD904
<400> 473
gcggtgctgg cggtggtggc gccggtggtg gcgccg 36
<210> 474
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD905
<400> 474
gcggtgattg cggtggcgcc gctggtggtg gcgccg 36
<210> 475
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD906
<400> 475
gcggtgattg cgctggcgcc ggtggtggtg gcgccg 36
<210> 476
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD907
<400> 476
gtggcgattg cgctggcgcc ggtggtggtg gcgccg 36
<210> 477
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD908
<400> 477
gtggcgctgg cgctggcgcc ggtggtggtg gcgccg 36
<210> 478
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD910
<400> 478
gtggcggcgc tgctgccggc ggtggtggtg gcgccg 36
<210> 479
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD911
<400> 479
gtggcgctgg cgctgccggc ggtggtggtg gcgccg 36
<210> 480
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD912
<400> 480
gtggcgctgc tggcgccggc ggtggtggtg gcgccg 36
<210> 481
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD1 5'-primer
<400> 481
gggtttcata tggcggcggc gctggcgccg gtggtgctgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 482
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD2 5'-primer
<400> 482
gggtttcata tggcggcggc ggtgccgctg ctggcggtgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 483
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD3 5'-primer
<400> 483
gggtttcata tggcggcgct gctggtgccg gcggcggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 484
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD4 5'-primer
<400> 484
gggtttcata tggcgctggc gctgctgccg gtggcggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 485
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD5 5'-primer
<400> 485
gggtttcata tggcggcggc gctgctgccg gtggcgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 486
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD6 5'-primer
<400> 486
gggtttcata tggtgattgc gatgattccg gcggcgtttt gggtggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 487
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD9 5'-primer
<400> 487
gggtttcata tggtggcgct ggtgccggcg gcgctgattc tgccgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 488
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD11 5'-primer
<400> 488
gggtttcata tggtggtggc gctggcgccg gcgctggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 489
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD12 5'-primer
<400> 489
gggtttcata tgctgctggc ggcggtgccg gcggtgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 490
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD13 5'-primer
<400> 490
gggtttcata tggcggcggc gctggtgccg gtggtggcgc tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 491
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD16 5'-primer
<400> 491
gggtttcata tgaacaacag ctgcaccacc tataccaacg gcagccaggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 492
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD17 5'-primer
<400> 492
gggtttcata tgggcggctg cagcgcgccg cagaccacct gcagcaacgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 493
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD18 5'-primer
<400> 493
gggtttcata tgaactattg ctgcaccccg accaccaacg gccagagcgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 494
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD19 5'-primer
<400> 494
gggtttcata tgtatgtgag ctgctgcacc tataccaacg gcagccaggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 495
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD20 5'-primer
<400> 495
gggtttcata tgaactattg caacacctgc ccgacctatg gccagagcgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 496
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD21 5'-primer
<400> 496
gggtttcata tggcggtggc gctgctgccg gcgctgctgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 497
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD22 5'-primer
<400> 497
gggtttcata tggcggtggt gctggtgccg gtgctggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 498
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD23 5'-primer
<400> 498
gggtttcata tggtggtgct ggtgctgccg gcggcggcgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 499
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD24 5'-primer
<400> 499
gggtttcata tgattgcgct ggcggcgccg gcgctgattg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 500
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD25 5'-primer
<400> 500
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgccg gcgctggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 501
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD26 5'-primer
<400> 501
gggtttcata tggcggcgat tgcgctggcg gcgccgctgg cgattgtggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 502
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD27 5'-primer
<400> 502
gggtttcata tgctggcgat tgtggcggcg gcggcggcgc tggtggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 503
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD28 5'-primer
<400> 503
gggtttcata tggcggtgcc gctgctgccg ctggtgccgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 504
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD29 5'-primer
<400> 504
gggtttcata tggtgctgcc gccgctgccg gtgctgccgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 505
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD30 5'-primer
<400> 505
gggtttcata tggcgatggc gctgctgccg gcggcggtgg cggtggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 506
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD33 5'-primer
<400> 506
gggtttcata tggcggcggc gattctggcg ccggcgtttc tggcggtggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 507
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD37 5'-primer
<400> 507
gggtttcata tgtattataa ccagagcacc tgcggcggcc agtgctatgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 508
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD38 5'-primer
<400> 508
gggtttcata tgaccacctg cagccagcag cagtattgca ccaacggcgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 509
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD39 5'-primer
<400> 509
gggtttcata tgtgctataa caccagcccg tgcaccggct gctgctatgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 510
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD40 5'-primer
<400> 510
gggtttcata tgacctataa caccagctgc accccgggca cctgctatgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 511
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD42 5'-primer
<400> 511
gggtttcata tggtggcggc gctgccggtg gtggcggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 512
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD43 5'-primer
<400> 512
gggtttcata tgctgctggc ggcgccgctg gtggtggcgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 513
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD44 5'-primer
<400> 513
gggtttcata tggcgctggc ggtgccggtg gcgctgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 514
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD49 5'-primer
<400> 514
gggtttcata tggtggtgcc ggcggcgccg gcggtgccgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 515
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD54 5'-primer
<400> 515
gggtttcata tgctggcggt ggcggcgccg ccggtggtgg cgctgctggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 516
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD57 5'-primer
<400> 516
gggtttcata tgcagaacaa ctgcaacacc agcagccagg gcggcggcgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 517
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD59 5'-primer
<400> 517
gggtttcata tggcggtgct ggcggcgccg gtggtggcgg cgctggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 518
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD61 5'-primer
<400> 518
gggtttcata tggtggcggc gctgccggtg ctgctggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 519
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD62 5'-primer
<400> 519
gggtttcata tggtggcgct gctggcgccg gtggcgctgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 520
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD63 5'-primer
<400> 520
gggtttcata tggcggcgct gctggtgccg gcgctggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 521
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD64 5'-primer
<400> 521
gggtttcata tggcgattgt ggcgctgccg gtggcggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 522
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD65 5'-primer
<400> 522
gggtttcata tgattgcgat tgtggcgccg gtggtggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 523
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD66 5'-primer
<400> 523
gggtttcata tggcgggcgt gctgggcggc ccgattatgg gcgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 524
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD67 5'-primer
<400> 524
gggtttcata tgctggatgc ggaagtgccg ctggcggatg atgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 525
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD68 5'-primer
<400> 525
gggtttcata tggtggcgcc ggtgctgccg gcggcgccgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 526
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD69 5'-primer
<400> 526
gggtttcata tgccggtggc ggtgctgccg ccggcggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 527
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD71 5'-primer
<400> 527
gggtttcata tgtttatgtg gatgtggttt ccgtttatgt ggtatccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 528
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD77 5'-primer
<400> 528
gggtttcata tggcgatgct gctgatgccg attgtgctga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 529
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD81 5'-primer
<400> 529
gggtttcata tggcggcgct gctgccggcg ctggcggcgc tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 530
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD82 5'-primer
<400> 530
gggtttcata tggcggtggt gctggcgccg gtggcggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 531
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD83 5'-primer
<400> 531
gggtttcata tgctggcggt ggcggcgccg ctggcgctgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 532
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD84 5'-primer
<400> 532
gggtttcata tggcggcggt ggcggcgccg ctgctgctgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 533
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD85 5'-primer
<400> 533
gggtttcata tgctgctggt gctgccggcg gcggcgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 534
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD97 5'-primer
<400> 534
gggtttcata tggcgctgct ggcggcgccg ccggcgctgc tggcgctggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 535
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD101 5'-primer
<400> 535
gggtttcata tgctggtggc ggtggcgccg gtggcggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 536
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD102 5'-primer
<400> 536
gggtttcata tgctggcgct ggcgccggcg gcgctggcgc tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 537
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD103 5'-primer
<400> 537
gggtttcata tggcgctgat tgcggcgccg attctggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 538
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD104 5'-primer
<400> 538
gggtttcata tggcggtggt ggcggcgccg ctggtgctgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 539
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD105 5'-primer
<400> 539
gggtttcata tgctgctggc gctggcgccg gcggcgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 540
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD113 5'-primer
<400> 540
gggtttcata tgccggtggc ggtggcgctg ctgattgcgg tgccgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 541
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD121 5'-primer
<400> 541
gggtttcata tggcgattgt ggcgctgccg gcgctggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 542
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD123 5'-primer
<400> 542
gggtttcata tggcggcgat tattgtgccg gcggcgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 543
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD124 5'-primer
<400> 543
gggtttcata tgattgcggt ggcgctgccg gcgctgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 544
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD131 5'-primer
<400> 544
gggtttcata tgtggattat tgcgccggtg tggctggcgt ggattgcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 545
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD138 5'-primer
<400> 545
gggtttcata tgccgccggc ggcgctgctg gcgattctgg cggtggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 546
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD139 5'-primer
<400> 546
gggtttcata tgaccggcag caccaacagc ccgacctgca ccagcaccgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 547
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD141 5'-primer
<400> 547
gggtttcata tggcggtgat tgtgctgccg gcgctggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 548
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD142 5'-primer
<400> 548
gggtttcata tgctgctggc ggcggtgccg gtggcgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 549
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD143 5'-primer
<400> 549
gggtttcata tggcggtgct ggcggtgccg gcggtgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 550
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD144 5'-primer
<400> 550
gggtttcata tggcggtgct ggcggtgccg gcggtgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 551
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD145 5'-primer
<400> 551
gggtttcata tgctgctggc ggtggtgccg gcggtggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 552
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD152 5'-primer
<400> 552
gggtttcata tgctggcggc ggcggtggcg gcggtggcgg cgctgctggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 553
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD159 5'-primer
<400> 553
gggtttcata tgtgctatag cggcagcacc agccagaacc agccgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 554
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD161 5'-primer
<400> 554
gggtttcata tggcggtgat tgcgctgccg gcgctgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 555
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD162 5'-primer
<400> 555
gggtttcata tggcggtggt ggcgctgccg gcggcgctga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 556
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD163 5'-primer
<400> 556
gggtttcata tgctggcgct ggtgctgccg gcggcgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 557
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD164 5'-primer
<400> 557
gggtttcata tgctggcggc ggtgctgccg gcgctgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 558
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD165 5'-primer
<400> 558
gggtttcata tggcgctggc ggtgccggtg gcgctggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 559
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD167 5'-primer
<400> 559
gggtttcata tggtggcgat tgcgattccg gcggcgctgg cgattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 560
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD169 5'-primer
<400> 560
gggtttcata tggtggcgct ggtggcgccg gcgctgattc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 561
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD182 5'-primer
<400> 561
gggtttcata tggcgctgat tgcgccggtg gtggcgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 562
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD183 5'-primer
<400> 562
gggtttcata tgctgctggc ggcgccggtg gtgattgcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 563
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD184 5'-primer
<400> 563
gggtttcata tgctggcggc gattgtgccg gcgattattg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 564
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD185 5'-primer
<400> 564
gggtttcata tggcggcgct ggtgctgccg ctgattattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 565
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD189 5'-primer
<400> 565
gggtttcata tggtgattct ggtggcgccg gcggtgattg cgccgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 566
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD190 5'-primer
<400> 566
gggtttcata tggcggcgat tctggcgccg gcggtgattg cgccgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 567
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD201 5'-primer
<400> 567
gggtttcata tgctggcgct ggcggtgccg gcgctggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 568
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD204 5'-primer
<400> 568
gggtttcata tgctgattgc ggcgctgccg gcggtggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 569
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD205 5'-primer
<400> 569
gggtttcata tggcgctggc gctggtgccg gcgattgcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 570
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD210 5'-primer
<400> 570
gggtttcata tggcgctgat tgcgctgccg gcgctgccgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 571
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD214 5'-primer
<400> 571
gggtttcata tggcgctgat tgtggcgccg gcgctgatgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 572
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD221 5'-primer
<400> 572
gggtttcata tggcggcgat tctggcgccg attgtggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 573
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD222 5'-primer
<400> 573
gggtttcata tggcgctgct gattgcgccg gcggcggtga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 574
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD223 5'-primer
<400> 574
gggtttcata tggcgattct ggcggtgccg attgcggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 575
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD224 5'-primer
<400> 575
gggtttcata tgattctggc ggcggtgccg attgcgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 576
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD225 5'-primer
<400> 576
gggtttcata tggtggcggc gctgctgccg gcggcggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 577
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD226 5'-primer
<400> 577
gggtttcata tggcgctggt ggcggcgatt ccggcgctgg cgattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 578
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD227 5'-primer
<400> 578
gggtttcata tgctggcggc gattgtgccg attgcggcgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 579
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD241 5'-primer
<400> 579
gggtttcata tggcggcggc ggtggtgccg gtgctgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 580
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD242 5'-primer
<400> 580
gggtttcata tggcggcgct gctggtgccg gcgctggtgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 581
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD243 5'-primer
<400> 581
gggtttcata tggcggcggt gctgctgccg gtggcgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 582
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD245 5'-primer
<400> 582
gggtttcata tggcggcggc gctggcgccg gtgctggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 583
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD246 5'-primer
<400> 583
gggtttcata tggtggtggc ggtgccgctg ctggtggcgt ttgcggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 584
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD248 5'-primer
<400> 584
gggtttcata tggtggcggc gattgtgccg attgcggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 585
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD261 5'-primer
<400> 585
gggtttcata tgctggtgct ggtgccgctg ctggcggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 586
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD262 5'-primer
<400> 586
gggtttcata tggcgctgat tgcggtgccg gcgattattg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 587
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD263 5'-primer
<400> 587
gggtttcata tggcgctggc ggtgattccg gcggcggcga ttctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 588
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD264 5'-primer
<400> 588
gggtttcata tgctggcggc ggcgccggtg gtgattgtga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 589
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD265 5'-primer
<400> 589
gggtttcata tggtgctggc gattgcgccg ctgctggcgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 590
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD281 5'-primer
<400> 590
gggtttcata tggcgctgat tgtgctgccg gcggcggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 591
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD282 5'-primer
<400> 591
gggtttcata tggtgctggc ggtggcgccg gcgctgattg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 592
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD283 5'-primer
<400> 592
gggtttcata tggcggcgct gctggcgccg gcgctgattg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 593
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD284 5'-primer
<400> 593
gggtttcata tggcgctgat tgcgccggcg gtggcgctga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 594
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD285 5'-primer
<400> 594
gggtttcata tggcgattgt gctgctgccg gcggcggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 595
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD301 5'-primer
<400> 595
gggtttcata tggtgattgc ggcgccggtg ctggcggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 596
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD302 5'-primer
<400> 596
gggtttcata tgctggcgct ggcgccggcg ctggcgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 597
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD304 5'-primer
<400> 597
gggtttcata tggcgattat tctggcgccg attgcggcga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 598
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD305 5'-primer
<400> 598
gggtttcata tgattgcgct ggcggcgccg attctgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 599
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD321 5'-primer
<400> 599
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg ccggcgctgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 600
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD322 5'-primer
<400> 600
gggtttcata tggtggtggc gattgtgctg ccggcgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 601
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD323 5'-primer
<400> 601
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg ccggtggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 602
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD324 5'-primer
<400> 602
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg ccggcggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 603
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD325 5'-primer
<400> 603
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg ccggcggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 604
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD329 5'-primer
<400> 604
gggtttcata tgctgccggt gctggtgccg gtggtgccgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 605
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD331 5'-primer
<400> 605
gggtttcata tggtgccggt gctggtgccg ctggtgccgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 606
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD341 5'-primer
<400> 606
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg ccggcggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 607
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD342 5'-primer
<400> 607
gggtttcata tggtgattgt ggcgctggcg ccggcggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 608
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD343 5'-primer
<400> 608
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg ccggcgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 609
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD345 5'-primer
<400> 609
gggtttcata tggcgctgct gattgtggcg ccggtggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 610
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD349 5'-primer
<400> 610
gggtttcata tggtgccggt gctggtgccg gtggtgccgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 611
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD350 5'-primer
<400> 611
gggtttcata tggtgccgat tctggtgccg gtggtgccgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 612
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD361 5'-primer
<400> 612
gggtttcata tggcggtggt gattgtggcg ccggcggtga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 613
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD363 5'-primer
<400> 613
gggtttcata tggcggtgct ggcggtggcg ccggcgctga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 614
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD364 5'-primer
<400> 614
gggtttcata tgctggtggc ggcggtggcg ccggcgctga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 615
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD365 5'-primer
<400> 615
gggtttcata tggcggtgat tgtggtggcg ccggcgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 616
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD381 5'-primer
<400> 616
gggtttcata tggtggtggc gattgtgctg ccggcggtgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 617
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD382 5'-primer
<400> 617
gggtttcata tggcggcggc gctggtgatt ccggcgattc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 618
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD383 5'-primer
<400> 618
gggtttcata tggtgattgt ggcgctggcg ccggcgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 619
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD384 5'-primer
<400> 619
gggtttcata tggtgattgt ggcgattgcg ccggcgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 620
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD385 5'-primer
<400> 620
gggtttcata tgattgtggc gattgcggtg ccggcgctgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 621
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD390 5'-primer
<400> 621
gggtttcata tggtgccgct gctggtgccg gtggtgccgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 622
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD401 5'-primer
<400> 622
gggtttcata tggcggcgct ggcggtgatt ccggcggcga ttctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 623
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD402 5'-primer
<400> 623
gggtttcata tggcgctggc ggcggtgatt ccggcggcga ttctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 624
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD403 5'-primer
<400> 624
gggtttcata tggcggcggc gctggtgatt ccggcggcga ttctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 625
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD404 5'-primer
<400> 625
gggtttcata tgctggcggc ggcggtgatt ccggcggcga ttctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 626
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD405 5'-primer
<400> 626
gggtttcata tgctggcggc ggcggtgatt ccggtggcga ttctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 627
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD421 5'-primer
<400> 627
gggtttcata tggcggcgat tctggcggcg ccgctgattg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 628
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD422 5'-primer
<400> 628
gggtttcata tggtggtggc gattctggcg ccgctgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 629
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD424 5'-primer
<400> 629
gggtttcata tggcggtggt ggtggcggcg ccggtgctgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 630
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD425 5'-primer
<400> 630
gggtttcata tggcggtggt ggcgattgcg ccggtgctgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 631
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD426 5'-primer
<400> 631
gggtttcata tggcggcggc gctggcgatt ccgctggcga ttattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 632
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD436 5'-primer
<400> 632
gggtttcata tggcggtggt gctggtgatt atgccggcgg cgattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 633
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD442 5'-primer
<400> 633
gggtttcata tggcgctggc ggcgctggtg ccggcggtgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 634
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD443 5'-primer
<400> 634
gggtttcata tggcgctggc ggcgctggtg ccggtggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 635
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD444 5'-primer
<400> 635
gggtttcata tgctggcggc ggcgctggtg ccggtggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 636
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD445 5'-primer
<400> 636
gggtttcata tggcgctggc ggcgctggtg ccggcgctgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 637
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD461 5'-primer
<400> 637
gggtttcata tgattgcggc ggtgattgtg ccggcggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 638
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD462 5'-primer
<400> 638
gggtttcata tgattgcggc ggtgctggtg ccggcggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 639
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD463 5'-primer
<400> 639
gggtttcata tggcggtggc gattctggtg ccgctgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 640
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD464 5'-primer
<400> 640
gggtttcata tggcggtggt gattctggtg ccgctggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 641
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD465 5'-primer
<400> 641
gggtttcata tgattgcggc ggtgattgtg ccggtggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 642
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD466 5'-primer
<400> 642
gggtttcata tgattattgc ggcggcggcg ccgctggcga ttattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 643
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD481 5'-primer
<400> 643
gggtttcata tggcgattgc gattgcgatt gtgccggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 644
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD482 5'-primer
<400> 644
gggtttcata tgattctggc ggtggcggcg attccggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 645
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD483 5'-primer
<400> 645
gggtttcata tgattctggc ggcggcgatt attccggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 646
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD484 5'-primer
<400> 646
gggtttcata tgctggcggt ggtgctggcg gcgccggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 647
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD485 5'-primer
<400> 647
gggtttcata tggcgattct ggcggcgatt gtgccgctgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 648
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD501 5'-primer
<400> 648
gggtttcata tggtgattgt ggcgctggcg gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 649
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD502 5'-primer
<400> 649
gggtttcata tggcgattgt ggcgctggcg gtgccggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 650
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD503 5'-primer
<400> 650
gggtttcata tggcggcgat tattattgtg ctgccggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 651
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD504 5'-primer
<400> 651
gggtttcata tgctgattgt ggcgctggcg gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 652
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD505 5'-primer
<400> 652
gggtttcata tggcgattat tattgtgatt gcgccggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 653
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD521 5'-primer
<400> 653
gggtttcata tgctggcggc gctgattgtg gtgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 654
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD522 5'-primer
<400> 654
gggtttcata tggcgctgct ggtgattgcg gtgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 655
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD524 5'-primer
<400> 655
gggtttcata tggcggtggc gctgattgtg gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 656
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD525 5'-primer
<400> 656
gggtttcata tggcgctggc gattgtggtg gcgccggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 657
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD527 5'-primer
<400> 657
gggtttcata tgctggtgct ggcggcggtg gcgccgattg cgattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 658
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD541 5'-primer
<400> 658
gggtttcata tgctgctggc gctgattatt gcgccggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 659
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD542 5'-primer
<400> 659
gggtttcata tggcgctggc gctgattatt gtgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 660
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD543 5'-primer
<400> 660
gggtttcata tgctgctggc ggcgctgatt gcgccggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 661
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD544 5'-primer
<400> 661
gggtttcata tgattgtggc gctgattgtg gcgccggcgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 662
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD545 5'-primer
<400> 662
gggtttcata tggtggtgct ggtgctggcg gcgccggcgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 663
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD561 5'-primer
<400> 663
gggtttcata tggcggcggt ggcgattgtg ctgccggcgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 664
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD562 5'-primer
<400> 664
gggtttcata tggcgctgat tgcggcgatt gtgccggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 665
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD563 5'-primer
<400> 665
gggtttcata tggcgctggc ggtgattgtg gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 666
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD564 5'-primer
<400> 666
gggtttcata tggtggcgat tgcgctgatt gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 667
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD565 5'-primer
<400> 667
gggtttcata tggtggcgat tgtgctggtg gcgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 668
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD577 5'-primer
<400> 668
gggtttcata tggcggcggt gctgattgtg ccgattatgg tgatgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 669
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD582 5'-primer
<400> 669
gggtttcata tggtggcggt ggcgctgatt gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 670
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD583 5'-primer
<400> 670
gggtttcata tggcggtgat tctggcgctg gcgccgattg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 671
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD585 5'-primer
<400> 671
gggtttcata tggcgctgat tgtggcgatt gcgccggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 672
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD601 5'-primer
<400> 672
gggtttcata tggcggcgat tctgattgcg gtgccgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 673
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD602 5'-primer
<400> 673
gggtttcata tggtgattgt ggcgctggcg gcgccggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 674
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD603 5'-primer
<400> 674
gggtttcata tggtgctggt ggcgctggcg gcgccggtga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 675
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD604 5'-primer
<400> 675
gggtttcata tggtggcgct gattgcggtg gcgccggcgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 676
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD605 5'-primer
<400> 676
gggtttcata tggtgattgc ggcggtgctg gcgccggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 677
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD606 5'-primer
<400> 677
gggtttcata tggcggcggc gattgcggcg attccgatta ttattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 678
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD622 5'-primer
<400> 678
gggtttcata tggcggcggc gattgcggcg attccgatta ttattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 679
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD623 5'-primer
<400> 679
gggtttcata tggtggcggc ggcgattgcg ctgccggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 680
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD625 5'-primer
<400> 680
gggtttcata tgattctggc ggcggcggcg gcgccgctga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 681
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD635 5'-primer
<400> 681
gggtttcata tgggcagcac cggcggcagc cagcagaaca accagtatgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 682
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD643 5'-primer
<400> 682
gggtttcata tgctggcgct ggtgctggcg gcgccggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 683
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD645 5'-primer
<400> 683
gggtttcata tggcgctggc ggtggtggcg ctgccggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 684
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD661 5'-primer
<400> 684
gggtttcata tggcggcgat tctggcgccg attgtggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 685
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD664 5'-primer
<400> 685
gggtttcata tgattctgat tgcgattgcg attccggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 686
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD665 5'-primer
<400> 686
gggtttcata tgctggcgat tgtgctggcg gcgccggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 687
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD666 5'-primer
<400> 687
gggtttcata tggcggcgat tgcgattatt gcgccggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 688
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD667 5'-primer
<400> 688
gggtttcata tgctggcggt ggcgattgtg gcgccggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 689
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD676 5'-primer
<400> 689
gggtttcata tggtgccgct gctggtgccg gtgccggtgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 690
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD683 5'-primer
<400> 690
gggtttcata tgctggcgat tgtgctggcg gcgccggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 691
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD684 5'-primer
<400> 691
gggtttcata tggcggcgat tgtgctggcg ctgccggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 692
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD685 5'-primer
<400> 692
gggtttcata tggcgctgct ggtggcggtg ctgccggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 693
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD686 5'-primer
<400> 693
gggtttcata tggcggcgct ggtggcggtg ctgccggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 694
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD687 5'-primer
<400> 694
gggtttcata tggcgattct ggcggtggcg ctgccgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 695
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD692 5'-primer
<400> 695
gggtttcata tgccggcgcc gctgccgccg gtggtgattc tggcggtggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 696
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD693 5'-primer
<400> 696
gggtttcata tggcggcgcc ggtgctgccg gtggcggtgc cgattgtggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 697
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD700 5'-primer
<400> 697
gggtttcata tgggcaccag caacacctgc cagagcaacc agaacagcgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 698
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD703 5'-primer
<400> 698
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 699
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD705 5'-primer
<400> 699
gggtttcata tattgtggcg gtggcgctgc tgccggcgct ggcgccggca aatattaccg 60
ttttctat 68
<210> 700
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD706 5'-primer
<400> 700
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg ctgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 701
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD707 5'-primer
<400> 701
gggtttcata tgattgtggc gctggcggtg ctgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 702
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD724 5'-primer
<400> 702
gggtttcata tggtggcggt gctggcggtg ctgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 703
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD725 5'-primer
<400> 703
gggtttcata tgattgcggt gctggcggtg gcgccggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 704
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD726 5'-primer
<400> 704
gggtttcata tgctggcggt ggcgattatt gcgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 705
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD727 5'-primer
<400> 705
gggtttcata tggtggcgct ggcgattgcg ctgccggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 706
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD743 5'-primer
<400> 706
gggtttcata tggcgattgc gattgcgctg gtgccggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 707
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD744 5'-primer
<400> 707
gggtttcata tggcggcggt ggtgattgtg gcgccggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 708
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD745 5'-primer
<400> 708
gggtttcata tggcggcgat tctggcgatt gtggcgccgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 709
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD746 5'-primer
<400> 709
gggtttcata tggtggcgat tattgtggtg gcgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 710
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD747 5'-primer
<400> 710
gggtttcata tggtggcgct gctggcgatt gcgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 711
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD750 5'-primer
<400> 711
gggtttcata tgctggcgat tgcggcgatt gcgccgctgg cgattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 712
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD763 5'-primer
<400> 712
gggtttcata tggtggcggt gctgattgcg gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 713
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD764 5'-primer
<400> 713
gggtttcata tggcggtggc gctggcggtg ctgccggcgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 714
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD765 5'-primer
<400> 714
gggtttcata tggcggtggc gctggcggtg gtgccggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 715
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD766 5'-primer
<400> 715
gggtttcata tgattgtggt gattgcggtg gcgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 716
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD767 5'-primer
<400> 716
gggtttcata tgattgtggt ggcggcggtg gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 717
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD772 5'-primer
<400> 717
gggtttcata tgctgccggt ggcgccggtg attccgatta ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 718
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD783 5'-primer
<400> 718
gggtttcata tgattgtggc gctggtgccg gcggtggcga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 719
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD784 5'-primer
<400> 719
gggtttcata tggtggcggc gctgccggcg gtggcgctgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 720
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD786 5'-primer
<400> 720
gggtttcata tgctggtggc gattgcgccg ctggcggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 721
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD787 5'-primer
<400> 721
gggtttcata tggcggtggc gctggtgccg gtgattgtgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 722
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD788 5'-primer
<400> 722
gggtttcata tggcgattgc ggtggcgatt gcgccggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 723
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD803 5'-primer
<400> 723
gggtttcata tggcgattgc gctggcggtg ccggtgctgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 724
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD805 5'-primer
<400> 724
gggtttcata tgctggtgct gattgcggcg gcgccgattg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 725
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD806 5'-primer
<400> 725
gggtttcata tgctggtggc gctggcggtg ccggcggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 726
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD807 5'-primer
<400> 726
gggtttcata tggcggtggc gctggcggtg ccggcgctgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 727
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD808 5'-primer
<400> 727
gggtttcata tgctggtggt gctggcggcg gcgccgctgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 728
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD809 5'-primer
<400> 728
gggtttcata tgctgattgt gctggcggcg ccggcgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 729
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD810 5'-primer
<400> 729
gggtttcata tggtgattgt gctggcggcg ccggcgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 730
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD811 5'-primer
<400> 730
gggtttcata tggcggtggt gctggcggtg ccggcgctgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 731
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD824 5'-primer
<400> 731
gggtttcata tgctgattat tgtggcggcg gcgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 732
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD825 5'-primer
<400> 732
gggtttcata tgattgtggc ggtgattgtg gcgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 733
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD826 5'-primer
<400> 733
gggtttcata tgctggtggc gctggcggcg ccgattattg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 734
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD827 5'-primer
<400> 734
gggtttcata tgattgcggc ggtgctggcg gcgccggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 735
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD828 5'-primer
<400> 735
gggtttcata tgattgcgct gctggcggcg ccgattattg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 736
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD829 5'-primer
<400> 736
gggtttcata tggcggcgct ggcgctggtg gcgccggtga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 737
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD830 5'-primer
<400> 737
gggtttcata tgattgcgct ggtggcggcg ccggtggcgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 738
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD831 5'-primer
<400> 738
gggtttcata tgattattgt ggcggtggcg ccggcggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 739
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD832 5'-primer
<400> 739
gggtttcata tggcggtggc ggcgattgtg ccggtgattg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 740
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD843 5'-primer
<400> 740
gggtttcata tggcggtgct ggtgctggtg gcgccggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 741
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD844 5'-primer
<400> 741
gggtttcata tggtggtggc gctgctggcg ccgctgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 742
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD845 5'-primer
<400> 742
gggtttcata tggcggcggt ggtgattgcg ccgctgctgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 743
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD846 5'-primer
<400> 743
gggtttcata tgattgcggt ggcggtggcg gcgccgctgc tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 744
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD847 5'-primer
<400> 744
gggtttcata tgctggtggc gattgtggtg ctgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 745
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD848 5'-primer
<400> 745
gggtttcata tggcggtggc gattgtggtg ctgccggcgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 746
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD849 5'-primer
<400> 746
gggtttcata tggcggtgat tctgctggcg ccgctgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 747
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD850 5'-primer
<400> 747
gggtttcata tgctggtgat tgcgctggcg gcgccggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 748
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD851 5'-primer
<400> 748
gggtttcata tggtgctggc ggtggtgctg ccggcggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 749
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD852 5'-primer
<400> 749
gggtttcata tggtgctggc ggtggcggcg ccggcggtgc tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 750
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD863 5'-primer
<400> 750
gggtttcata tggcggcggt ggtgctgctg ccgattattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 751
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD864 5'-primer
<400> 751
gggtttcata tggcgctgct ggtgattgcg ccggcgattg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 752
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD865 5'-primer
<400> 752
gggtttcata tggcggtgct ggtgattgcg gtgccggcga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 753
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD867 5'-primer
<400> 753
gggtttcata tggcgctgct ggtggtgatt gcgccgctgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 754
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD868 5'-primer
<400> 754
gggtttcata tggtgctggt ggcggcgatt ctgccggcgg cgattccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 755
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD870 5'-primer
<400> 755
gggtttcata tggtgctggt ggcggcggtg ctgccgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 756
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD872 5'-primer
<400> 756
gggtttcata tggtgctggc ggcggcggtg ctgccgctgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 757
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD875 5'-primer
<400> 757
gggtttcata tggcgattgc gattgtggtg ccggcggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 758
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD877 5'-primer
<400> 758
gggtttcata tggtggcgat tattgcggtg ccggcggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 759
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD878 5'-primer
<400> 759
gggtttcata tgattgtggc gctggtggcg ccggcggcgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 760
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD879 5'-primer
<400> 760
gggtttcata tggcggcgat tgtgctgctg ccggcggtgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 761
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD881 5'-primer
<400> 761
gggtttcata tggcggcgct gattgtggtg ccggcggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 762
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD882 5'-primer
<400> 762
gggtttcata tggcgattgc gctggtggtg ccggcggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 763
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD883 5'-primer
<400> 763
gggtttcata tgctggcgat tgtgccggcg gcgattgcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 764
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD884 5'-primer
<400> 764
gggtttcata tggtgctgat tgtgccggcg gcgattgcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 765
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD885 5'-primer
<400> 765
gggtttcata tgctggtggc gattgcgccg gcggtggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 766
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD886 5'-primer
<400> 766
gggtttcata tggtgctggc ggtgccggcg gcgattgcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 767
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD887 5'-primer
<400> 767
gggtttcata tggtgctggc ggtggcgccg gcggtggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 768
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD888 5'-primer
<400> 768
gggtttcata tgattctggc ggtggtggcg attccggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 769
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD889 5'-primer
<400> 769
gggtttcata tgattctggt ggcggcggcg ccgattgcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 770
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD891 5'-primer
<400> 770
gggtttcata tgattctggc ggtggcggcg attccggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 771
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD893 5'-primer
<400> 771
gggtttcata tggtgattgc gattccggcg attctggcgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 772
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD895 5'-primer
<400> 772
gggtttcata tggcgattat tattgtggtg ccggcgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 773
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD896 5'-primer
<400> 773
gggtttcata tggcgattct gattgtggtg gcgccgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 774
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD897 5'-primer
<400> 774
gggtttcata tggcggtgat tgtgccggtg gcgattattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 775
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD899 5'-primer
<400> 775
gggtttcata tggcggtggt gattgcgctg ccggcggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 776
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD900 5'-primer
<400> 776
gggtttcata tggcgctggt ggcggtgatt gcgccggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 777
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD901 5'-primer
<400> 777
gggtttcata tggcgctggt ggcggtgctg ccggcggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 778
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD902 5'-primer
<400> 778
gggtttcata tggcgctggt ggcgccgctg ctggcggtgg cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 779
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD904 5'-primer
<400> 779
gggtttcata tggcggtgct ggcggtggtg gcgccggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 780
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD905 5'-primer
<400> 780
gggtttcata tggcggtgat tgcggtggcg ccgctggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 781
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD906 5'-primer
<400> 781
gggtttcata tggcggtgat tgcgctggcg ccggtggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 782
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD907 5'-primer
<400> 782
gggtttcata tggtggcgat tgcgctggcg ccggtggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 783
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD908 5'-primer
<400> 783
gggtttcata tggtggcgct ggcgctggcg ccggtggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 784
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD910 5'-primer
<400> 784
gggtttcata tggtggcggc gctgctgccg gcggtggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 785
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD911 5'-primer
<400> 785
gggtttcata tggtggcgct ggcgctgccg gcggtggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 786
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD912 5'-primer
<400> 786
gggtttcata tggtggcgct gctggcgccg gcggtggtgg tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 787
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD921 5'-primer
<400> 787
gggtttcata tgatttggtg gtttgtggtg ctgccgctgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 788
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD922 5'-primer
<400> 788
gggtttcata tgtggtatgt gatttttgtg ctgccgctgg tggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 789
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD931 5'-primer
<400> 789
gggtttcata tggcggtgct gattgcgccg gcgattctgg cggcggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 790
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD934 5'-primer
<400> 790
gggtttcata tgctgattct ggcgccggcg gcggtggtgg cggcggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 791
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD935 5'-primer
<400> 791
gggtttcata tggcgctgct gattctgccg gcggcggcgg tggcggcggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 792
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD936 5'-primer
<400> 792
gggtttcata tggcgctgct gattctggcg gcggcggtgg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 793
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD937 5'-primer
<400> 793
gggtttcata tggtgccggt gctggtgccg ctgccggtgc cggtggtggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 794
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD938 5'-primer
<400> 794
gggtttcata tggtgccggt gctgctgccg gtggtggtgc cggtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 795
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD947 5'-primer
<400> 795
gggtttcata tgtgctatta taatcagcag tccaataata ataatcaggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 796
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD949 5'-primer
<400> 796
gggtttcata tgtccggcaa ttcctgccag cagtgcggca attcctccgc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 797
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of aMTD 3'-primer
<400> 797
cgcgtcgact tacctcggct gcaccggcac ggagatgac 39
<210> 798
<211> 184
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of SDA
<400> 798
Met Ala Asn Ile Thr Val Phe Tyr Asn Glu Asp Phe Gln Gly Lys Gln
1 5 10 15
Val Asp Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Ala Ala Leu
20 25 30
Gly Ile Glu Asn Asn Thr Ile Ser Ser Val Lys Val Pro Pro Gly Val
35 40 45
Lys Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Phe Ala Gly Asp Gln Ile Glu
50 55 60
Val Val Ala Asn Ala Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asn Asn Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile Arg Val Ile Ser Val Pro Val Gln Pro Arg Met Ala Asn Ile
85 90 95
Thr Val Phe Tyr Asn Glu Asp Phe Gln Gly Lys Gln Val Asp Leu Pro
100 105 110
Pro Gly Asn Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Ala Ala Leu Gly Ile Glu Asn
115 120 125
Asn Thr Ile Ser Ser Val Lys Val Pro Pro Gly Val Lys Ala Ile Leu
130 135 140
Tyr Gln Asn Asp Gly Phe Ala Gly Asp Gln Ile Glu Val Val Ala Asn
145 150 155 160
Ala Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asn Asn Asn Val Ser Ser Ile Arg Val
165 170 175
Ile Ser Val Pro Val Gln Pro Arg
180
<210> 799
<211> 99
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of SDB
<400> 799
Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Val Ile Leu His His
20 25 30
Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly Glu
35 40 45
Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe Glu
50 55 60
Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro Ser
85 90 95
Glu Thr Leu
<210> 800
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of SDC
<400> 800
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala
100 105
<210> 801
<211> 208
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of SDD
<400> 801
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu
20 25 30
Lys Pro Val Ala Gly Ala Pro Gln Val Leu Glu Phe Phe Ser Phe Phe
35 40 45
Cys Pro His Cys Tyr Gln Phe Glu Glu Val Leu His Ile Ser Asp Asn
50 55 60
Val Lys Lys Lys Leu Pro Glu Gly Val Lys Met Thr Lys Tyr His Val
65 70 75 80
Asn Phe Met Gly Gly Asp Leu Gly Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Ala
85 90 95
Val Ala Met Ala Leu Gly Val Glu Asp Lys Val Thr Val Pro Leu Phe
100 105 110
Glu Gly Val Gln Lys Thr Gln Thr Ile Arg Ser Ala Ser Asp Ile Arg
115 120 125
Asp Val Phe Ile Asn Ala Gly Ile Lys Gly Glu Glu Tyr Asp Ala Ala
130 135 140
Trp Asn Ser Phe Val Val Lys Ser Leu Val Ala Gln Gln Glu Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Asp Val Gln Leu Arg Gly Val Pro Ala Met Phe Val Asn Gly
165 170 175
Lys Tyr Gln Leu Asn Pro Gln Gly Met Asp Thr Ser Asn Met Asp Val
180 185 190
Phe Val Gln Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Tyr Leu Ser Glu Lys Lys
195 200 205
<210> 802
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of SDE
<400> 802
Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val
1 5 10 15
Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp
20 25 30
Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg
35 40 45
Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser
50 55 60
Leu Thr Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu
85 90 95
Gln Ile Gly Gly
100
<210> 803
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of SDF
<400> 803
Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu
1 5 10 15
Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly
20 25 30
Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp
35 40 45
Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro
50 55 60
Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe
65 70 75 80
Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly
85 90 95
Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly
100 105 110
Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe
115 120 125
Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe
130 135 140
Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys
145 150 155 160
Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly
165 170 175
Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro
180 185 190
Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu
195 200 205
Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu
210 215 220
Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp
225 230 235 240
Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala
245 250 255
Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn
260 265 270
Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg
275 280 285
Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly
290 295
<210> 804
<211> 99
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of SDB' for deimunization
<400> 804
Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Leu Ile Leu His His
20 25 30
Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly Glu
35 40 45
Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe Glu
50 55 60
Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro Ser
85 90 95
Glu Thr Leu
<210> 805
<211> 552
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of SDA
<400> 805
atggcaaata ttaccgtttt ctataacgaa gacttccagg gtaagcaggt cgatctgccg 60
cctggcaact atacccgcgc ccagttggcg gcgctgggca tcgagaataa taccatcagc 120
tcggtgaagg tgccgcctgg cgtgaaggct atcctgtacc agaacgatgg tttcgccggc 180
gaccagatcg aagtggtggc caatgccgag gagttgggcc cgctgaataa taacgtctcc 240
agcatccgcg tcatctccgt gcccgtgcag ccgcgcatgg caaatattac cgttttctat 300
aacgaagact tccagggtaa gcaggtcgat ctgccgcctg gcaactatac ccgcgcccag 360
ttggcggcgc tgggcatcga gaataatacc atcagctcgg tgaaggtgcc gcctggcgtg 420
aaggctatcc tctaccagaa cgatggtttc gccggcgacc agatcgaagt ggtggccaat 480
gccgaggagc tgggtccgct gaataataac gtctccagca tccgcgtcat ctccgtgccg 540
gtgcagccga gg 552
<210> 806
<211> 297
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of SDB
<400> 806
atggcagaac aaagcgacaa ggatgtgaag tactacactc tggaggagat tcagaagcac 60
aaagacagca agagcacctg ggtgatccta catcataagg tgtacgatct gaccaagttt 120
ctcgaagagc atcctggtgg ggaagaagtc ctgggcgagc aagctggggg tgatgctact 180
gagaactttg aggacgtcgg gcactctacg gatgcacgag aactgtccaa aacatacatc 240
atcggggagc tccatccaga tgacagatca aagatagcca agccttcgga aaccctt 297
<210> 807
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of SDC
<400> 807
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggcc 327
<210> 808
<211> 624
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of SDD
<400> 808
atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60
cagtatgaag atggtaaaca gtacactacc ctggaaaaac cggtagctgg cgcgccgcaa 120
gtgctggagt ttttctcttt cttctgcccg cactgctatc agtttgaaga agttctgcat 180
atttctgata atgtgaagaa aaaactgccg gaaggcgtga agatgactaa ataccacgtc 240
aacttcatgg gtggtgacct gggcaaagat ctgactcagg catgggctgt ggcgatggcg 300
ctgggcgtgg aagacaaagt gactgttccg ctgtttgaag gcgtacagaa aacccagacc 360
attcgttctg cttctgatat ccgcgatgta tttatcaacg caggtattaa aggtgaagag 420
tacgacgcgg cgtggaacag cttcgtggtg aaatctctgg tcgctcagca ggaaaaagct 480
gcagctgacg tgcaattgcg tggcgttccg gcgatgtttg ttaacggtaa atatcagctg 540
aatccgcagg gtatggatac cagcaatatg gatgtttttg ttcagcagta tgctgataca 600
gtgaaatatc tgtccgagaa aaaa 624
<210> 809
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of SDE
<400> 809
gggtccctgc aggactcaga agtcaatcaa gaagctaagc cagaggtcaa gccagaagtc 60
aagcctgaga ctcacatcaa tttaaaggtg tccgatggat cttcagagat cttcttcaag 120
atcaaaaaga ccactccttt aagaaggctg atggaagcgt tcgctaaaag acagggtaag 180
gaaatggact ccttaacgtt cttgtacgac ggtattgaaa ttcaagctga tcagacccct 240
gaagatttgg acatggagga taacgatatt attgaggctc accgcgaaca gattggaggt 300
300
<210> 810
<211> 891
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of SDF
<400> 810
ggatccgaaa tcggtactgg ctttccattc gacccccatt atgtggaagt cctgggcgag 60
cgcatgcact acgtcgatgt tggtccgcgc gatggcaccc ctgtgctgtt cctgcacggt 120
aacccgacct cctcctacgt gtggcgcaac atcatcccgc atgttgcacc gacccatcgc 180
tgcattgctc cagacctgat cggtatgggc aaatccgaca aaccagacct gggttatttc 240
ttcgacgacc acgtccgctt catggatgcc ttcatcgaag ccctgggtct ggaagaggtc 300
gtcctggtca ttcacgactg gggctccgct ctgggtttcc actgggccaa gcgcaatcca 360
gagcgcgtca aaggtattgc atttatggag ttcatccgcc ctatcccgac ctgggacgaa 420
tggccagaat ttgcccgcga gaccttccag gccttccgca ccaccgacgt cggccgcaag 480
ctgatcatcg atcagaacgt ttttatcgag ggtacgctgc cgatgggtgt cgtccgcccg 540
ctgactgaag tcgagatgga ccattaccgc gagccgttcc tgaatcctgt tgaccgcgag 600
ccactgtggc gcttcccaaa cgagctgcca atcgccggtg agccagcgaa catcgtcgcg 660
ctggtcgaag aatacatgga ctggctgcac cagtcccctg tcccgaagct gctgttctgg 720
ggcaccccag gcgttctgat cccaccggcc gaagccgctc gcctggccaa aagcctgcct 780
aactgcaagg ctgtggacat cggcccgggt ctgaatctgc tgcaagaaga caacccggac 840
ctgatcggca gcgagatcgc gcgctggctg tctactctgg agatttccgg t 891
<210> 811
<211> 297
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of SDB' for deimunization
<400> 811
atggcagaac aaagcgacaa ggatgtgaag tactacactc tggaggagat tcagaagcac 60
aaagacagca agagcacctg gctgatccta catcataagg tgtacgatct gaccaagttt 120
ctcgaagagc atcctggtgg ggaagaagtc ctgggcgagc aagctggggg tgatgctact 180
gagaactttg aggacgtcgg gcactctacg gatgcacgag aactgtccaa aacatacatc 240
atcggggagc tccatccaga tgacagatca aagatagcca agccttcgga aaccctt 297
<210> 812
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of Histidine Tag
<400> 812
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser
<210> 813
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of Histidine Tag
<400> 813
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagc 57
<210> 814
<211> 465
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of human Parkin
<400> 814
Met Ile Val Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu
1 5 10 15
Val Asp Ser Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys
20 25 30
Arg Gln Gly Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Glu Leu Arg Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln
50 55 60
Ser Ile Val His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met
65 70 75 80
Asn Ala Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu
85 90 95
Arg Glu Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu
100 105 110
Pro Gly Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg
115 120 125
Lys Asp Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn
130 135 140
Ser Phe Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Lys Leu Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu
165 170 175
Thr Gln Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met
180 185 190
Ser Gly Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe
195 200 205
Phe Phe Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val
210 215 220
Ala Leu His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr
225 230 235 240
Cys Thr Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg
245 250 255
His Val Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu
260 265 270
Asn Asp Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro
275 280 285
Cys Val Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe
290 295 300
Arg Ile Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Glu Glu Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly
325 330 335
Cys Gly Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys
340 345 350
Glu Gly Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys
355 360 365
Lys Glu Ala Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser
370 375 380
Gly Thr Thr Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln
385 390 395 400
Ala Arg Trp Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys
405 410 415
Pro Cys Pro Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met
420 425 430
His Met Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn
435 440 445
Cys Gly Cys Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp
450 455 460
Val
465
<210> 815
<211> 1398
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of human Parkin
<400> 815
atgatagtgt ttgtcaggtt caactccagc catggtttcc cagtggaggt cgattctgac 60
accagcatct tccagctcaa ggaggtggtt gctaagcgac agggggttcc ggctgaccag 120
ttgcgtgtga ttttcgcagg gaaggagctg aggaatgact ggactgtgca gaattgtgac 180
ctggatcagc agagcattgt tcacattgtg cagagaccgt ggagaaaagg tcaagaaatg 240
aatgcaactg gaggcgacga ccccagaaac gcggcgggag gctgtgagcg ggagccccag 300
agcttgactc gggtggacct cagcagctca gtcctcccag gagactctgt ggggctggct 360
gtcattctgc acactgacag caggaaggac tcaccaccag ctggaagtcc agcaggtaga 420
tcaatctaca acagctttta tgtgtattgc aaaggcccct gtcaaagagt gcagccggga 480
aaactcaggg tacagtgcag cacctgcagg caggcaacgc tcaccttgac ccagggtcca 540
tcttgctggg atgatgtttt aattccaaac cggatgagtg gtgaatgcca atccccacac 600
tgccctggga ctagtgcaga atttttcttt aaatgtggag cacaccccac ctctgacaag 660
gaaacatcag tagctttgca cctgatcgca acaaatagtc ggaacatcac ttgcattacg 720
tgcacagacg tcaggagccc cgtcctggtt ttccagtgca actcccgcca cgtgatttgc 780
ttagactgtt tccacttata ctgtgtgaca agactcaatg atcggcagtt tgttcacgac 840
cctcaacttg gctactccct gccttgtgtg gctggctgtc ccaactcctt gattaaagag 900
ctccatcact tcaggattct gggagaagag cagtacaacc ggtaccagca gtatggtgca 960
gaggagtgtg tcctgcagat ggggggcgtg ttatgccccc gccctggctg tggagcgggg 1020
ctgctgccgg agcctgacca gaggaaagtc acctgcgaag ggggcaatgg cctgggctgt 1080
gggtttgcct tctgccggga atgtaaagaa gcgtaccatg aaggggagtg cagtgccgta 1140
tttgaagcct caggaacaac tactcaggcc tacagagtcg atgaaagagc cgccgagcag 1200
gctcgttggg aagcagcctc caaagaaacc atcaagaaaa ccaccaagcc ctgtccccgc 1260
tgccatgtac cagtggaaaa aaatggaggc tgcatgcaca tgaagtgtcc gcagccccag 1320
tgcaggctcg agtggtgctg gaactgtggc tgcgagtgga accgcgtctg catgggggac 1380
cactggttcg acgtgtag 1398
<210> 816
<211> 1434
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of M321P
<400> 816
atgattgtgg cggtggcgct gccggcgctg gcggtgccga tgatagtgtt tgtcaggttc 60
aactccagcc atggtttccc agtggaggtc gattctgaca ccagcatctt ccagctcaag 120
gaggtggttg ctaagcgaca gggggttccg gctgaccagt tgcgtgtgat tttcgcaggg 180
aaggagctga ggaatgactg gactgtgcag aattgtgacc tggatcagca gagcattgtt 240
cacattgtgc agagaccgtg gagaaaaggt caagaaatga atgcaactgg aggcgacgac 300
cccagaaacg cggcgggagg ctgtgagcgg gagccccaga gcttgactcg ggtggacctc 360
agcagctcag tcctcccagg agactctgtg gggctggctg tcattctgca cactgacagc 420
aggaaggact caccaccagc tggaagtcca gcaggtagat caatctacaa cagcttttat 480
gtgtattgca aaggcccctg tcaaagagtg cagccgggaa aactcagggt acagtgcagc 540
acctgcaggc aggcaacgct caccttgacc cagggtccat cttgctggga tgatgtttta 600
attccaaacc ggatgagtgg tgaatgccaa tccccacact gccctgggac tagtgcagaa 660
tttttcttta aatgtggagc acaccccacc tctgacaagg aaacatcagt agctttgcac 720
ctgatcgcaa caaatagtcg gaacatcact tgcattacgt gcacagacgt caggagcccc 780
gtcctggttt tccagtgcaa ctcccgccac gtgatttgct tagactgttt ccacttatac 840
tgtgtgacaa gactcaatga tcggcagttt gttcacgacc ctcaacttgg ctactccctg 900
ccttgtgtgg ctggctgtcc caactccttg attaaagagc tccatcactt caggattctg 960
ggagaagagc agtacaaccg gtaccagcag tatggtgcag aggagtgtgt cctgcagatg 1020
gggggcgtgt tatgcccccg ccctggctgt ggagcggggc tgctgccgga gcctgaccag 1080
aggaaagtca cctgcgaagg gggcaatggc ctgggctgtg ggtttgcctt ctgccgggaa 1140
tgtaaagaag cgtaccatga aggggagtgc agtgccgtat ttgaagcctc aggaacaact 1200
actcaggcct acagagtcga tgaaagagcc gccgagcagg ctcgttggga agcagcctcc 1260
aaagaaacca tcaagaaaac caccaagccc tgtccccgct gccatgtacc agtggaaaaa 1320
aatggaggct gcatgcacat gaagtgtccg cagccccagt gcaggctcga gtggtgctgg 1380
aactgtggct gcgagtggaa ccgcgtctgc atgggggacc actggttcga cgtg 1434
<210> 817
<211> 478
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of M321P
<400> 817
Met Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Val Pro Met Ile Val
1 5 10 15
Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu Val Asp Ser
20 25 30
Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys Arg Gln Gly
35 40 45
Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys Glu Leu Arg
50 55 60
Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln Ser Ile Val
65 70 75 80
His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met Asn Ala Thr
85 90 95
Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg Glu Pro
100 105 110
Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Gly Asp
115 120 125
Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys Asp Ser
130 135 140
Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu Arg
165 170 175
Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Gly
180 185 190
Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe Phe Lys
210 215 220
Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala Leu His
225 230 235 240
Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys Thr Asp
245 250 255
Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His Val Ile
260 265 270
Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp Arg
275 280 285
Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys Val Ala
290 295 300
Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg Ile Leu
305 310 315 320
Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu Glu Cys
325 330 335
Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys Gly Ala
340 345 350
Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu Gly Gly
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys Glu Ala
370 375 380
Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly Thr Thr
385 390 395 400
Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala Arg Trp
405 410 415
Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro Cys Pro
420 425 430
Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His Met Lys
435 440 445
Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys Gly Cys
450 455 460
Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val
465 470 475
<210> 818
<211> 1743
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of M321PSB
<400> 818
atgattgtgg cggtggcgct gccggcgctg gcggtgccga tgatagtgtt tgtcaggttc 60
aactccagcc atggtttccc agtggaggtc gattctgaca ccagcatctt ccagctcaag 120
gaggtggttg ctaagcgaca gggggttccg gctgaccagt tgcgtgtgat tttcgcaggg 180
aaggagctga ggaatgactg gactgtgcag aattgtgacc tggatcagca gagcattgtt 240
cacattgtgc agagaccgtg gagaaaaggt caagaaatga atgcaactgg aggcgacgac 300
cccagaaacg cggcgggagg ctgtgagcgg gagccccaga gcttgactcg ggtggacctc 360
agcagctcag tcctcccagg agactctgtg gggctggctg tcattctgca cactgacagc 420
aggaaggact caccaccagc tggaagtcca gcaggtagat caatctacaa cagcttttat 480
gtgtattgca aaggcccctg tcaaagagtg cagccgggaa aactcagggt acagtgcagc 540
acctgcaggc aggcaacgct caccttgacc cagggtccat cttgctggga tgatgtttta 600
attccaaacc ggatgagtgg tgaatgccaa tccccacact gccctgggac tagtgcagaa 660
tttttcttta aatgtggagc acaccccacc tctgacaagg aaacatcagt agctttgcac 720
ctgatcgcaa caaatagtcg gaacatcact tgcattacgt gcacagacgt caggagcccc 780
gtcctggttt tccagtgcaa ctcccgccac gtgatttgct tagactgttt ccacttatac 840
tgtgtgacaa gactcaatga tcggcagttt gttcacgacc ctcaacttgg ctactccctg 900
ccttgtgtgg ctggctgtcc caactccttg attaaagagc tccatcactt caggattctg 960
ggagaagagc agtacaaccg gtaccagcag tatggtgcag aggagtgtgt cctgcagatg 1020
gggggcgtgt tatgcccccg ccctggctgt ggagcggggc tgctgccgga gcctgaccag 1080
aggaaagtca cctgcgaagg gggcaatggc ctgggctgtg ggtttgcctt ctgccgggaa 1140
tgtaaagaag cgtaccatga aggggagtgc agtgccgtat ttgaagcctc aggaacaact 1200
actcaggcct acagagtcga tgaaagagcc gccgagcagg ctcgttggga agcagcctcc 1260
aaagaaacca tcaagaaaac caccaagccc tgtccccgct gccatgtacc agtggaaaaa 1320
aatggaggct gcatgcacat gaagtgtccg cagccccagt gcaggctcga gtggtgctgg 1380
aactgtggct gcgagtggaa ccgcgtctgc atgggggacc actggttcga cgtgcaagct 1440
tcaatggcag aacaaagcga caaggatgtg aagtactaca ctctggagga gattcagaag 1500
cacaaagaca gcaagagcac ctgggtgatc ctacatcata aggtgtacga tctgaccaag 1560
tttctcgaag agcatcctgg tggggaagaa gtcctgggcg agcaagctgg gggtgatgct 1620
actgagaact ttgaggacgt cgggcactct acggatgcac gagaactgtc caaaacatac 1680
atcatcgggg agctccatcc agatgacaga tcaaagatag ccaagccttc ggaaaccctt 1740
taa 1743
<210> 819
<211> 580
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of M321PSB
<400> 819
Met Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Val Pro Met Ile Val
1 5 10 15
Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu Val Asp Ser
20 25 30
Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys Arg Gln Gly
35 40 45
Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys Glu Leu Arg
50 55 60
Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln Ser Ile Val
65 70 75 80
His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met Asn Ala Thr
85 90 95
Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg Glu Pro
100 105 110
Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Gly Asp
115 120 125
Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys Asp Ser
130 135 140
Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu Arg
165 170 175
Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Gly
180 185 190
Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe Phe Lys
210 215 220
Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala Leu His
225 230 235 240
Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys Thr Asp
245 250 255
Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His Val Ile
260 265 270
Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp Arg
275 280 285
Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys Val Ala
290 295 300
Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg Ile Leu
305 310 315 320
Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu Glu Cys
325 330 335
Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys Gly Ala
340 345 350
Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu Gly Gly
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys Glu Ala
370 375 380
Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly Thr Thr
385 390 395 400
Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala Arg Trp
405 410 415
Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro Cys Pro
420 425 430
Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His Met Lys
435 440 445
Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys Gly Cys
450 455 460
Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val Gln Ala
465 470 475 480
Ser Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu
485 490 495
Glu Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Val Ile Leu His
500 505 510
His Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly
515 520 525
Glu Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe
530 535 540
Glu Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr
545 550 555 560
Ile Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro
565 570 575
Ser Glu Thr Leu
580
<210> 820
<211> 1842
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of HM321PSB
<400> 820
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccattgtggc ggtggcgctg 120
ccggcgctgg cggtgccgat gatagtgttt gtcaggttca actccagcca tggtttccca 180
gtggaggtcg attctgacac cagcatcttc cagctcaagg aggtggttgc taagcgacag 240
ggggttccgg ctgaccagtt gcgtgtgatt ttcgcaggga aggagctgag gaatgactgg 300
actgtgcaga attgtgacct ggatcagcag agcattgttc acattgtgca gagaccgtgg 360
agaaaaggtc aagaaatgaa tgcaactgga ggcgacgacc ccagaaacgc ggcgggaggc 420
tgtgagcggg agccccagag cttgactcgg gtggacctca gcagctcagt cctcccagga 480
gactctgtgg ggctggctgt cattctgcac actgacagca ggaaggactc accaccagct 540
ggaagtccag caggtagatc aatctacaac agcttttatg tgtattgcaa aggcccctgt 600
caaagagtgc agccgggaaa actcagggta cagtgcagca cctgcaggca ggcaacgctc 660
accttgaccc agggtccatc ttgctgggat gatgttttaa ttccaaaccg gatgagtggt 720
gaatgccaat ccccacactg ccctgggact agtgcagaat ttttctttaa atgtggagca 780
caccccacct ctgacaagga aacatcagta gctttgcacc tgatcgcaac aaatagtcgg 840
aacatcactt gcattacgtg cacagacgtc aggagccccg tcctggtttt ccagtgcaac 900
tcccgccacg tgatttgctt agactgtttc cacttatact gtgtgacaag actcaatgat 960
cggcagtttg ttcacgaccc tcaacttggc tactccctgc cttgtgtggc tggctgtccc 1020
aactccttga ttaaagagct ccatcacttc aggattctgg gagaagagca gtacaaccgg 1080
taccagcagt atggtgcaga ggagtgtgtc ctgcagatgg ggggcgtgtt atgcccccgc 1140
cctggctgtg gagcggggct gctgccggag cctgaccaga ggaaagtcac ctgcgaaggg 1200
ggcaatggcc tgggctgtgg gtttgccttc tgccgggaat gtaaagaagc gtaccatgaa 1260
ggggagtgca gtgccgtatt tgaagcctca ggaacaacta ctcaggccta cagagtcgat 1320
gaaagagccg ccgagcaggc tcgttgggaa gcagcctcca aagaaaccat caagaaaacc 1380
accaagccct gtccccgctg ccatgtacca gtggaaaaaa atggaggctg catgcacatg 1440
aagtgtccgc agccccagtg caggctcgag tggtgctgga actgtggctg cgagtggaac 1500
cgcgtctgca tgggggacca ctggttcgac gtgcaagctt caatggcaga acaaagcgac 1560
aaggatgtga agtactacac tctggaggag attcagaagc acaaagacag caagagcacc 1620
tgggtgatcc tacatcataa ggtgtacgat ctgaccaagt ttctcgaaga gcatcctggt 1680
ggggaagaag tcctgggcga gcaagctggg ggtgatgcta ctgagaactt tgaggacgtc 1740
gggcactcta cggatgcacg agaactgtcc aaaacataca tcatcgggga gctccatcca 1800
gatgacagat caaagatagc caagccttcg gaaacccttt aa 1842
<210> 821
<211> 613
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of HM321PSB
<400> 821
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Val Pro Met Ile
35 40 45
Val Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu Val Asp
50 55 60
Ser Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys Arg Gln
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys Glu Leu
85 90 95
Arg Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln Ser Ile
100 105 110
Val His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met Asn Ala
115 120 125
Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg Glu
130 135 140
Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Gly
145 150 155 160
Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys Asp
165 170 175
Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser Phe
180 185 190
Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu
195 200 205
Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln
210 215 220
Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser Gly
225 230 235 240
Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe Phe
245 250 255
Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala Leu
260 265 270
His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys Thr
275 280 285
Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His Val
290 295 300
Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp
305 310 315 320
Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys Val
325 330 335
Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg Ile
340 345 350
Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu Glu
355 360 365
Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys Gly
370 375 380
Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu Gly
385 390 395 400
Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys Glu
405 410 415
Ala Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly Thr
420 425 430
Thr Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala Arg
435 440 445
Trp Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro Cys
450 455 460
Pro Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His Met
465 470 475 480
Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys Gly
485 490 495
Cys Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val Gln
500 505 510
Ala Ser Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu
515 520 525
Glu Glu Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Val Ile Leu
530 535 540
His His Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly
545 550 555 560
Gly Glu Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn
565 570 575
Phe Glu Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr
580 585 590
Tyr Ile Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys
595 600 605
Pro Ser Glu Thr Leu
610
<210> 822
<211> 1434
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of M524P
<400> 822
atggcggtgg cgctgattgt ggtgccggcg ctggcgccga tgatagtgtt tgtcaggttc 60
aactccagcc atggtttccc agtggaggtc gattctgaca ccagcatctt ccagctcaag 120
gaggtggttg ctaagcgaca gggggttccg gctgaccagt tgcgtgtgat tttcgcaggg 180
aaggagctga ggaatgactg gactgtgcag aattgtgacc tggatcagca gagcattgtt 240
cacattgtgc agagaccgtg gagaaaaggt caagaaatga atgcaactgg aggcgacgac 300
cccagaaacg cggcgggagg ctgtgagcgg gagccccaga gcttgactcg ggtggacctc 360
agcagctcag tcctcccagg agactctgtg gggctggctg tcattctgca cactgacagc 420
aggaaggact caccaccagc tggaagtcca gcaggtagat caatctacaa cagcttttat 480
gtgtattgca aaggcccctg tcaaagagtg cagccgggaa aactcagggt acagtgcagc 540
acctgcaggc aggcaacgct caccttgacc cagggtccat cttgctggga tgatgtttta 600
attccaaacc ggatgagtgg tgaatgccaa tccccacact gccctgggac tagtgcagaa 660
tttttcttta aatgtggagc acaccccacc tctgacaagg aaacatcagt agctttgcac 720
ctgatcgcaa caaatagtcg gaacatcact tgcattacgt gcacagacgt caggagcccc 780
gtcctggttt tccagtgcaa ctcccgccac gtgatttgct tagactgttt ccacttatac 840
tgtgtgacaa gactcaatga tcggcagttt gttcacgacc ctcaacttgg ctactccctg 900
ccttgtgtgg ctggctgtcc caactccttg attaaagagc tccatcactt caggattctg 960
ggagaagagc agtacaaccg gtaccagcag tatggtgcag aggagtgtgt cctgcagatg 1020
gggggcgtgt tatgcccccg ccctggctgt ggagcggggc tgctgccgga gcctgaccag 1080
aggaaagtca cctgcgaagg gggcaatggc ctgggctgtg ggtttgcctt ctgccgggaa 1140
tgtaaagaag cgtaccatga aggggagtgc agtgccgtat ttgaagcctc aggaacaact 1200
actcaggcct acagagtcga tgaaagagcc gccgagcagg ctcgttggga agcagcctcc 1260
aaagaaacca tcaagaaaac caccaagccc tgtccccgct gccatgtacc agtggaaaaa 1320
aatggaggct gcatgcacat gaagtgtccg cagccccagt gcaggctcga gtggtgctgg 1380
aactgtggct gcgagtggaa ccgcgtctgc atgggggacc actggttcga cgtg 1434
<210> 823
<211> 478
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of M524P
<400> 823
Met Ala Val Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Leu Ala Pro Met Ile Val
1 5 10 15
Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu Val Asp Ser
20 25 30
Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys Arg Gln Gly
35 40 45
Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys Glu Leu Arg
50 55 60
Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln Ser Ile Val
65 70 75 80
His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met Asn Ala Thr
85 90 95
Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg Glu Pro
100 105 110
Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Gly Asp
115 120 125
Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys Asp Ser
130 135 140
Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu Arg
165 170 175
Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Gly
180 185 190
Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe Phe Lys
210 215 220
Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala Leu His
225 230 235 240
Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys Thr Asp
245 250 255
Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His Val Ile
260 265 270
Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp Arg
275 280 285
Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys Val Ala
290 295 300
Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg Ile Leu
305 310 315 320
Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu Glu Cys
325 330 335
Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys Gly Ala
340 345 350
Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu Gly Gly
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys Glu Ala
370 375 380
Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly Thr Thr
385 390 395 400
Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala Arg Trp
405 410 415
Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro Cys Pro
420 425 430
Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His Met Lys
435 440 445
Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys Gly Cys
450 455 460
Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val
465 470 475
<210> 824
<211> 1743
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of M524PSB
<400> 824
atggcggtgg cgctgattgt ggtgccggcg ctggcgccga tgatagtgtt tgtcaggttc 60
aactccagcc atggtttccc agtggaggtc gattctgaca ccagcatctt ccagctcaag 120
gaggtggttg ctaagcgaca gggggttccg gctgaccagt tgcgtgtgat tttcgcaggg 180
aaggagctga ggaatgactg gactgtgcag aattgtgacc tggatcagca gagcattgtt 240
cacattgtgc agagaccgtg gagaaaaggt caagaaatga atgcaactgg aggcgacgac 300
cccagaaacg cggcgggagg ctgtgagcgg gagccccaga gcttgactcg ggtggacctc 360
agcagctcag tcctcccagg agactctgtg gggctggctg tcattctgca cactgacagc 420
aggaaggact caccaccagc tggaagtcca gcaggtagat caatctacaa cagcttttat 480
gtgtattgca aaggcccctg tcaaagagtg cagccgggaa aactcagggt acagtgcagc 540
acctgcaggc aggcaacgct caccttgacc cagggtccat cttgctggga tgatgtttta 600
attccaaacc ggatgagtgg tgaatgccaa tccccacact gccctgggac tagtgcagaa 660
tttttcttta aatgtggagc acaccccacc tctgacaagg aaacatcagt agctttgcac 720
ctgatcgcaa caaatagtcg gaacatcact tgcattacgt gcacagacgt caggagcccc 780
gtcctggttt tccagtgcaa ctcccgccac gtgatttgct tagactgttt ccacttatac 840
tgtgtgacaa gactcaatga tcggcagttt gttcacgacc ctcaacttgg ctactccctg 900
ccttgtgtgg ctggctgtcc caactccttg attaaagagc tccatcactt caggattctg 960
ggagaagagc agtacaaccg gtaccagcag tatggtgcag aggagtgtgt cctgcagatg 1020
gggggcgtgt tatgcccccg ccctggctgt ggagcggggc tgctgccgga gcctgaccag 1080
aggaaagtca cctgcgaagg gggcaatggc ctgggctgtg ggtttgcctt ctgccgggaa 1140
tgtaaagaag cgtaccatga aggggagtgc agtgccgtat ttgaagcctc aggaacaact 1200
actcaggcct acagagtcga tgaaagagcc gccgagcagg ctcgttggga agcagcctcc 1260
aaagaaacca tcaagaaaac caccaagccc tgtccccgct gccatgtacc agtggaaaaa 1320
aatggaggct gcatgcacat gaagtgtccg cagccccagt gcaggctcga gtggtgctgg 1380
aactgtggct gcgagtggaa ccgcgtctgc atgggggacc actggttcga cgtgcaagct 1440
tcaatggcag aacaaagcga caaggatgtg aagtactaca ctctggagga gattcagaag 1500
cacaaagaca gcaagagcac ctgggtgatc ctacatcata aggtgtacga tctgaccaag 1560
tttctcgaag agcatcctgg tggggaagaa gtcctgggcg agcaagctgg gggtgatgct 1620
actgagaact ttgaggacgt cgggcactct acggatgcac gagaactgtc caaaacatac 1680
atcatcgggg agctccatcc agatgacaga tcaaagatag ccaagccttc ggaaaccctt 1740
taa 1743
<210> 825
<211> 580
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of M524PSB
<400> 825
Met Ala Val Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Leu Ala Pro Met Ile Val
1 5 10 15
Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu Val Asp Ser
20 25 30
Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys Arg Gln Gly
35 40 45
Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys Glu Leu Arg
50 55 60
Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln Ser Ile Val
65 70 75 80
His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met Asn Ala Thr
85 90 95
Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg Glu Pro
100 105 110
Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Gly Asp
115 120 125
Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys Asp Ser
130 135 140
Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu Arg
165 170 175
Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Gly
180 185 190
Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe Phe Lys
210 215 220
Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala Leu His
225 230 235 240
Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys Thr Asp
245 250 255
Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His Val Ile
260 265 270
Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp Arg
275 280 285
Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys Val Ala
290 295 300
Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg Ile Leu
305 310 315 320
Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu Glu Cys
325 330 335
Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys Gly Ala
340 345 350
Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu Gly Gly
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys Glu Ala
370 375 380
Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly Thr Thr
385 390 395 400
Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala Arg Trp
405 410 415
Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro Cys Pro
420 425 430
Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His Met Lys
435 440 445
Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys Gly Cys
450 455 460
Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val Gln Ala
465 470 475 480
Ser Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu
485 490 495
Glu Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Val Ile Leu His
500 505 510
His Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly
515 520 525
Glu Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe
530 535 540
Glu Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr
545 550 555 560
Ile Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro
565 570 575
Ser Glu Thr Leu
580
<210> 826
<211> 1842
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of HM524PSB
<400> 826
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgcggtggc gctgattgtg 120
gtgccggcgc tggcgccgat gatagtgttt gtcaggttca actccagcca tggtttccca 180
gtggaggtcg attctgacac cagcatcttc cagctcaagg aggtggttgc taagcgacag 240
ggggttccgg ctgaccagtt gcgtgtgatt ttcgcaggga aggagctgag gaatgactgg 300
actgtgcaga attgtgacct ggatcagcag agcattgttc acattgtgca gagaccgtgg 360
agaaaaggtc aagaaatgaa tgcaactgga ggcgacgacc ccagaaacgc ggcgggaggc 420
tgtgagcggg agccccagag cttgactcgg gtggacctca gcagctcagt cctcccagga 480
gactctgtgg ggctggctgt cattctgcac actgacagca ggaaggactc accaccagct 540
ggaagtccag caggtagatc aatctacaac agcttttatg tgtattgcaa aggcccctgt 600
caaagagtgc agccgggaaa actcagggta cagtgcagca cctgcaggca ggcaacgctc 660
accttgaccc agggtccatc ttgctgggat gatgttttaa ttccaaaccg gatgagtggt 720
gaatgccaat ccccacactg ccctgggact agtgcagaat ttttctttaa atgtggagca 780
caccccacct ctgacaagga aacatcagta gctttgcacc tgatcgcaac aaatagtcgg 840
aacatcactt gcattacgtg cacagacgtc aggagccccg tcctggtttt ccagtgcaac 900
tcccgccacg tgatttgctt agactgtttc cacttatact gtgtgacaag actcaatgat 960
cggcagtttg ttcacgaccc tcaacttggc tactccctgc cttgtgtggc tggctgtccc 1020
aactccttga ttaaagagct ccatcacttc aggattctgg gagaagagca gtacaaccgg 1080
taccagcagt atggtgcaga ggagtgtgtc ctgcagatgg ggggcgtgtt atgcccccgc 1140
cctggctgtg gagcggggct gctgccggag cctgaccaga ggaaagtcac ctgcgaaggg 1200
ggcaatggcc tgggctgtgg gtttgccttc tgccgggaat gtaaagaagc gtaccatgaa 1260
ggggagtgca gtgccgtatt tgaagcctca ggaacaacta ctcaggccta cagagtcgat 1320
gaaagagccg ccgagcaggc tcgttgggaa gcagcctcca aagaaaccat caagaaaacc 1380
accaagccct gtccccgctg ccatgtacca gtggaaaaaa atggaggctg catgcacatg 1440
aagtgtccgc agccccagtg caggctcgag tggtgctgga actgtggctg cgagtggaac 1500
cgcgtctgca tgggggacca ctggttcgac gtgcaagctt caatggcaga acaaagcgac 1560
aaggatgtga agtactacac tctggaggag attcagaagc acaaagacag caagagcacc 1620
tgggtgatcc tacatcataa ggtgtacgat ctgaccaagt ttctcgaaga gcatcctggt 1680
ggggaagaag tcctgggcga gcaagctggg ggtgatgcta ctgagaactt tgaggacgtc 1740
gggcactcta cggatgcacg agaactgtcc aaaacataca tcatcgggga gctccatcca 1800
gatgacagat caaagatagc caagccttcg gaaacccttt aa 1842
<210> 827
<211> 613
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of HM524PSB
<400> 827
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Ala Val Ala Leu Ile Val Val Pro Ala Leu Ala Pro Met Ile
35 40 45
Val Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu Val Asp
50 55 60
Ser Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys Arg Gln
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys Glu Leu
85 90 95
Arg Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln Ser Ile
100 105 110
Val His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met Asn Ala
115 120 125
Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg Glu
130 135 140
Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Gly
145 150 155 160
Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys Asp
165 170 175
Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser Phe
180 185 190
Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu
195 200 205
Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln
210 215 220
Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser Gly
225 230 235 240
Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe Phe
245 250 255
Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala Leu
260 265 270
His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys Thr
275 280 285
Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His Val
290 295 300
Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp
305 310 315 320
Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys Val
325 330 335
Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg Ile
340 345 350
Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu Glu
355 360 365
Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys Gly
370 375 380
Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu Gly
385 390 395 400
Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys Glu
405 410 415
Ala Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly Thr
420 425 430
Thr Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala Arg
435 440 445
Trp Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro Cys
450 455 460
Pro Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His Met
465 470 475 480
Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys Gly
485 490 495
Cys Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val Gln
500 505 510
Ala Ser Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu
515 520 525
Glu Glu Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Val Ile Leu
530 535 540
His His Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly
545 550 555 560
Gly Glu Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn
565 570 575
Phe Glu Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr
580 585 590
Tyr Ile Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys
595 600 605
Pro Ser Glu Thr Leu
610
<210> 828
<211> 1734
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of M524PSB_Deimmunization in SB domain
<400> 828
atggcggtgg cgctgattgt ggtgccggcg ctggcgccga tgatagtgtt tgtcaggttc 60
aactccagcc atggtttccc agtggaggtc gattctgaca ccagcatctt ccagctcaag 120
gaggtggttg ctaagcgaca gggggttccg gctgaccagt tgcgtgtgat tttcgcaggg 180
aaggagctga ggaatgactg gactgtgcag aattgtgacc tggatcagca gagcattgtt 240
cacattgtgc agagaccgtg gagaaaaggt caagaaatga atgcaactgg aggcgacgac 300
cccagaaacg cggcgggagg ctgtgagcgg gagccccaga gcttgactcg ggtggacctc 360
agcagctcag tcctcccagg agactctgtg gggctggctg tcattctgca cactgacagc 420
aggaaggact caccaccagc tggaagtcca gcaggtagat caatctacaa cagcttttat 480
gtgtattgca aaggcccctg tcaaagagtg cagccgggaa aactcagggt acagtgcagc 540
acctgcaggc aggcaacgct caccttgacc cagggtccat cttgctggga tgatgtttta 600
attccaaacc ggatgagtgg tgaatgccaa tccccacact gccctgggac tagtgcagaa 660
tttttcttta aatgtggagc acaccccacc tctgacaagg aaacatcagt agctttgcac 720
ctgatcgcaa caaatagtcg gaacatcact tgcattacgt gcacagacgt caggagcccc 780
gtcctggttt tccagtgcaa ctcccgccac gtgatttgct tagactgttt ccacttatac 840
tgtgtgacaa gactcaatga tcggcagttt gttcacgacc ctcaacttgg ctactccctg 900
ccttgtgtgg ctggctgtcc caactccttg attaaagagc tccatcactt caggattctg 960
ggagaagagc agtacaaccg gtaccagcag tatggtgcag aggagtgtgt cctgcagatg 1020
gggggcgtgt tatgcccccg ccctggctgt ggagcggggc tgctgccgga gcctgaccag 1080
aggaaagtca cctgcgaagg gggcaatggc ctgggctgtg ggtttgcctt ctgccgggaa 1140
tgtaaagaag cgtaccatga aggggagtgc agtgccgtat ttgaagcctc aggaacaact 1200
actcaggcct acagagtcga tgaaagagcc gccgagcagg ctcgttggga agcagcctcc 1260
aaagaaacca tcaagaaaac caccaagccc tgtccccgct gccatgtacc agtggaaaaa 1320
aatggaggct gcatgcacat gaagtgtccg cagccccagt gcaggctcga gtggtgctgg 1380
aactgtggct gcgagtggaa ccgcgtctgc atgggggacc actggttcga cgtgatggca 1440
gaacaaagcg acaaggatgt gaagtactac actctggagg agattcagaa gcacaaagac 1500
agcaagagca cctggctgat cctacatcat aaggtgtacg atctgaccaa gtttctcgaa 1560
gagcatcctg gtggggaaga agtcctgggc gagcaagctg ggggtgatgc tactgagaac 1620
tttgaggacg tcgggcactc tacggatgca cgagaactgt ccaaaacata catcatcggg 1680
gagctccatc cagatgacag atcaaagata gccaagcctt cggaaaccct ttaa 1734
<210> 829
<211> 577
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of M524PSB_Deimmunization in SB domain
<400> 829
Met Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Val Pro Met Ile Val
1 5 10 15
Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu Val Asp Ser
20 25 30
Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys Arg Gln Gly
35 40 45
Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys Glu Leu Arg
50 55 60
Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln Ser Ile Val
65 70 75 80
His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met Asn Ala Thr
85 90 95
Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg Glu Pro
100 105 110
Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Gly Asp
115 120 125
Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys Asp Ser
130 135 140
Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu Arg
165 170 175
Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Gly
180 185 190
Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe Phe Lys
210 215 220
Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala Leu His
225 230 235 240
Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys Thr Asp
245 250 255
Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His Val Ile
260 265 270
Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp Arg
275 280 285
Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys Val Ala
290 295 300
Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg Ile Leu
305 310 315 320
Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu Glu Cys
325 330 335
Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys Gly Ala
340 345 350
Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu Gly Gly
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys Glu Ala
370 375 380
Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly Thr Thr
385 390 395 400
Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala Arg Trp
405 410 415
Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro Cys Pro
420 425 430
Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His Met Lys
435 440 445
Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys Gly Cys
450 455 460
Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val Met Ala
465 470 475 480
Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu Ile Gln
485 490 495
Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Leu Ile Leu His His Lys Val
500 505 510
Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly Glu Glu Val
515 520 525
Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe Glu Asp Val
530 535 540
Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr Ile Ile Gly
545 550 555 560
Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro Ser Glu Thr
565 570 575
Leu
<210> 830
<211> 1734
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of M321PSB_Deimmunization in SB domain
<400> 830
atgattgtgg cggtggcgct gccggcgctg gcggtgccga tgatagtgtt tgtcaggttc 60
aactccagcc atggtttccc agtggaggtc gattctgaca ccagcatctt ccagctcaag 120
gaggtggttg ctaagcgaca gggggttccg gctgaccagt tgcgtgtgat tttcgcaggg 180
aaggagctga ggaatgactg gactgtgcag aattgtgacc tggatcagca gagcattgtt 240
cacattgtgc agagaccgtg gagaaaaggt caagaaatga atgcaactgg aggcgacgac 300
cccagaaacg cggcgggagg ctgtgagcgg gagccccaga gcttgactcg ggtggacctc 360
agcagctcag tcctcccagg agactctgtg gggctggctg tcattctgca cactgacagc 420
aggaaggact caccaccagc tggaagtcca gcaggtagat caatctacaa cagcttttat 480
gtgtattgca aaggcccctg tcaaagagtg cagccgggaa aactcagggt acagtgcagc 540
acctgcaggc aggcaacgct caccttgacc cagggtccat cttgctggga tgatgtttta 600
attccaaacc ggatgagtgg tgaatgccaa tccccacact gccctgggac tagtgcagaa 660
tttttcttta aatgtggagc acaccccacc tctgacaagg aaacatcagt agctttgcac 720
ctgatcgcaa caaatagtcg gaacatcact tgcattacgt gcacagacgt caggagcccc 780
gtcctggttt tccagtgcaa ctcccgccac gtgatttgct tagactgttt ccacttatac 840
tgtgtgacaa gactcaatga tcggcagttt gttcacgacc ctcaacttgg ctactccctg 900
ccttgtgtgg ctggctgtcc caactccttg attaaagagc tccatcactt caggattctg 960
ggagaagagc agtacaaccg gtaccagcag tatggtgcag aggagtgtgt cctgcagatg 1020
gggggcgtgt tatgcccccg ccctggctgt ggagcggggc tgctgccgga gcctgaccag 1080
aggaaagtca cctgcgaagg gggcaatggc ctgggctgtg ggtttgcctt ctgccgggaa 1140
tgtaaagaag cgtaccatga aggggagtgc agtgccgtat ttgaagcctc aggaacaact 1200
actcaggcct acagagtcga tgaaagagcc gccgagcagg ctcgttggga agcagcctcc 1260
aaagaaacca tcaagaaaac caccaagccc tgtccccgct gccatgtacc agtggaaaaa 1320
aatggaggct gcatgcacat gaagtgtccg cagccccagt gcaggctcga gtggtgctgg 1380
aactgtggct gcgagtggaa ccgcgtctgc atgggggacc actggttcga cgtgatggca 1440
gaacaaagcg acaaggatgt gaagtactac actctggagg agattcagaa gcacaaagac 1500
agcaagagca cctggctgat cctacatcat aaggtgtacg atctgaccaa gtttctcgaa 1560
gagcatcctg gtggggaaga agtcctgggc gagcaagctg ggggtgatgc tactgagaac 1620
tttgaggacg tcgggcactc tacggatgca cgagaactgt ccaaaacata catcatcggg 1680
gagctccatc cagatgacag atcaaagata gccaagcctt cggaaaccct ttaa 1734
<210> 831
<211> 577
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid Sequence of M321PSB_Deimmunization in SB domain
<400> 831
Met Ile Val Ala Val Ala Leu Pro Ala Leu Ala Val Pro Met Ile Val
1 5 10 15
Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu Val Asp Ser
20 25 30
Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys Arg Gln Gly
35 40 45
Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys Glu Leu Arg
50 55 60
Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln Ser Ile Val
65 70 75 80
His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met Asn Ala Thr
85 90 95
Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu Arg Glu Pro
100 105 110
Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Gly Asp
115 120 125
Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg Lys Asp Ser
130 135 140
Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly Lys Leu Arg
165 170 175
Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Gly
180 185 190
Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Phe Phe Lys
210 215 220
Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val Ala Leu His
225 230 235 240
Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr Cys Thr Asp
245 250 255
Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg His Val Ile
260 265 270
Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu Asn Asp Arg
275 280 285
Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro Cys Val Ala
290 295 300
Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe Arg Ile Leu
305 310 315 320
Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala Glu Glu Cys
325 330 335
Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly Cys Gly Ala
340 345 350
Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys Glu Gly Gly
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys Lys Glu Ala
370 375 380
Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser Gly Thr Thr
385 390 395 400
Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln Ala Arg Trp
405 410 415
Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys Pro Cys Pro
420 425 430
Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met His Met Lys
435 440 445
Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn Cys Gly Cys
450 455 460
Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp Val Met Ala
465 470 475 480
Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu Ile Gln
485 490 495
Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Leu Ile Leu His His Lys Val
500 505 510
Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly Glu Glu Val
515 520 525
Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe Glu Asp Val
530 535 540
Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr Ile Ile Gly
545 550 555 560
Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro Ser Glu Thr
565 570 575
Leu
<210> 832
<211> 1734
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA sequence of Deimmunized M524PSB_Codon Optimized
<400> 832
atggcggttg cgctgattgt ggttccggcg ctggcgccga tgattgtgtt tgttcgtttc 60
aacagcagcc acggttttcc ggttgaggtg gacagcgata ccagcatctt ccagctgaag 120
gaagtggttg cgaaacgtca gggtgtgccg gcggaccaac tgcgtgttat tttcgcgggc 180
aaggagctgc gtaacgattg gaccgtgcaa aactgcgacc tggatcagca aagcatcgtt 240
cacattgttc agcgtccgtg gcgtaaaggt caagaaatga acgcgaccgg tggcgacgat 300
ccgcgtaacg cggcgggtgg ctgcgagcgt gaaccgcaga gcctgacccg tgtggacctg 360
agcagcagcg tgctgccggg tgatagcgtg ggcctggcgg ttatcctgca caccgacagc 420
cgtaaggata gcccgccggc gggtagcccg gcgggccgta gcatttataa cagcttttac 480
gtgtattgca agggtccgtg ccagcgtgtg caaccgggta aactgcgtgt tcagtgcagc 540
acctgccgtc aagcgaccct gaccctgacc cagggtccga gctgctggga cgatgttctg 600
atcccgaacc gtatgagcgg cgagtgccaa agcccgcact gtccgggcac cagcgcggag 660
ttcttcttca agtgcggtgc gcacccgacc agcgacaaag aaaccagcgt ggcgctgcac 720
ctgatcgcga ccaacagccg taacatcacc tgcattacct gcaccgacgt tcgtagcccg 780
gtgctggttt ttcagtgcaa cagccgtcac gtgatttgcc tggattgctt ccacctgtat 840
tgcgtgaccc gtctgaacga ccgtcagttt gttcacgatc cgcaactggg ttatagcctg 900
ccgtgcgttg cgggttgccc gaacagcctg atcaaagaac tgcaccactt ccgtattctg 960
ggcgaggaac agtacaaccg ttatcagcaa tacggcgcgg aggaatgcgt gctgcaaatg 1020
ggtggcgttc tgtgcccgcg tccgggttgc ggtgcgggtc tgctgccgga gccggaccag 1080
cgtaaggtga cctgcgaagg tggcaacggc ctgggttgcg gctttgcgtt ctgccgtgag 1140
tgcaaagaag cgtatcacga gggtgaatgc agcgcggttt ttgaggcgag cggcaccacc 1200
acccaggcgt accgtgtgga tgagcgtgcg gcggaacaag cgcgttggga ggcggcgagc 1260
aaggaaacca tcaagaaaac caccaagccg tgcccgcgtt gccatgtgcc ggttgagaag 1320
aacggtggct gcatgcacat gaaatgcccg cagccgcaat gccgtctgga gtggtgctgg 1380
aactgcggtt gcgaatggaa ccgtgtgtgc atgggcgacc actggttcga tgttatggcg 1440
gaacagagcg acaaggatgt gaaatactat accctggagg aaatccaaaa gcacaaagac 1500
agcaagagca cctggctgat tctgcaccac aaggtttatg atctgaccaa attcctggag 1560
gaacatccgg gtggtgagga agtgctgggt gaacaagcgg gtggcgacgc gaccgagaac 1620
tttgaagacg ttggccacag caccgatgcg cgtgagctga gcaaaaccta catcattggt 1680
gaactgcacc cggacgatcg tagcaagatt gcgaaaccga gcgaaaccct gtaa 1734
<210> 833
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HP
<400> 833
ataggatcca tgatagtttt g 21
<210> 834
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM321P, HM321PSA, and HM321PSB
<400> 834
gggtttggat ccattgtggc ggtggcgctg ccggcgctgg cggtgccgat gatagtgttt 60
g 61
<210> 835
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for M524
<400> 835
ggaattccat atggcggtgg cgctgattgt ggtgccggcg ctggcgccga tgatagtgtt 60
tgtcaggttc aactccagcc a 81
<210> 836
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HPSB/PSB
<400> 836
ataggatcca tgatagtgtt tg 22
<210> 837
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM124PSB
<400> 837
gggtttcata tgattgcggt ggcgctgccg gcgctgattg cggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 838
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM165PSB
<400> 838
gggtttcata tggcgctggc ggtgccggtg gcgctggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 839
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM325PSB
<400> 839
gggtttcata tgattgtggc ggtggcgctg ccggcggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 840
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM342PSB
<400> 840
gggtttcata tggtgattgt ggcgctggcg ccggcggtgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 841
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM361PSB
<400> 841
gggtttcata tggcggtggt gattgtggcg ccggcggtga ttgcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 842
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM524PSB
<400> 842
gggtttcata tggcggtggc gctgattgtg gtgccggcgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 843
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM623PSB
<400> 843
gggtttcata tggtggcggc ggcgattgcg ctgccggcga ttgtgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 844
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM683PSB
<400> 844
gggtttcata tgctggcgat tgtgctggcg gcgccggcgg tgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 845
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM685PSB
<400> 845
gggtttcata tggcgctgct ggtggcggtg ctgccggcgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 846
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM686PSB
<400> 846
gggtttcata tggcggcgct ggtggcggtg ctgccggtgg cgctgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 847
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 5'-primer for HM687PSB
<400> 847
gggtttcata tggcgattct ggcggtggcg ctgccgctgc tggcgccggc aaatattacc 60
gttttctat 69
<210> 848
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 3'-primer for HP and HM321P
<400> 848
tataagcttc ctacacgtcg a 21
<210> 849
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA Sequence of 3'-primer for HM321PSA, HM321PSB, HM524PSB/M524,
HPSB/PSB, HM124PSB, HM165PSB, HM325PSB, HM342PSB, HM361PSB,
HM524PSB, HM623PSB, HM683PSB, HM685PSB, HM686PSB and HM687PSB
<400> 849
tataagcttg cacgtcgaac c 21
Claims (30)
- 파킨 단백질 및 12개의 아미노산 잔기로 구성되고 향상된 세포 또는 조직 투과성을 갖는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)을 포함하는 iCP(향상된 세포 투과성) 파킨 재조합 단백질로서,
aMTD가 서열번호: 74-87, 89-91, 96, 98-111, 113-123, 125, 127-143, 145, 146, 148-162, 164-167, 169-173, 178-183, 186-189, 191-218, 222, 226, 227, 229-231 및 233-237로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이고, 또한 파킨 단백질의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 융합되는 것인, iCP 파킨 재조합 단백질. - 제1항에 있어서, 하나 이상의 가용화 도메인(SD)(들)이 파킨 단백질 및 aMTD 중 하나 이상의 말단(들)에 추가로 융합되는 것인 iCP 파킨 재조합 단백질.
- 삭제
- 제2항에 있어서, 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 iCP 파킨 재조합 단백질:
A-B-C 및 A-C-B-C
상기 식에서, A는 향상된 세포 또는 조직 투과성을 갖는 aMTD이고, B는 파킨 단백질이며, C는 SD(들)이다. - 제1항 또는 제4항에 있어서, 파킨 단백질이 서열번호: 814의 아미노산 서열을 갖는 것인 iCP 파킨 재조합 단백질.
- 제5항에 있어서, 파킨 단백질이 서열번호: 815의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 iCP 파킨 재조합 단백질.
- 삭제
- 제1항 또는 제4항에 있어서, aMTD가 서열번호: 314-327, 329-331, 336, 338-351, 353-363, 365, 367-383, 385, 386, 388-402, 404-407, 409-413, 418-423, 426-429, 431-458, 462, 466, 467, 469-471 및 473-477로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 iCP 파킨 재조합 단백질.
- 제2항 또는 제4항에 있어서, SD(들)가 서열번호: 798, 799, 800, 801, 802, 803 및 804로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 iCP 파킨 재조합 단백질.
- 제9항에 있어서, SD(들)가 서열번호: 805, 806, 807, 808, 809, 810 및 811로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 iCP 파킨 재조합 단백질.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제4항에 있어서, 융합이 펩타이드 결합 또는 화학 결합을 통해 형성되는 것인 iCP 파킨 재조합 단백질.
- 삭제
- 제1항의 iCP 파킨 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제16항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드의 서열이 서열번호: 816 또는 서열번호: 822로 표시되는 것인 폴리뉴클레오타이드.
- 제4항의 iCP 파킨 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제18항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드의 서열이 서열번호: 818, 824, 828, 830 및 832로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오타이드.
- 제16항 또는 제18항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제20항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
- iCP 파킨 재조합 단백질의 제조 방법으로서,
제20항의 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
재조합 발현 벡터를 사용하여 형질전환체를 제조하는 단계;
형질전환체를 배양하는 단계; 및
배양에 의해 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는, iCP 파킨 재조합 단백질의 제조 방법. - 삭제
- 활성 성분으로서 제1항 또는 제4항의 iCP 파킨 재조합 단백질; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 파킨슨 관련 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제1항 또는 제4항의 iCP 파킨 재조합 단백질을 포함하는 파킨슨 관련 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14/809,279 US20170029798A1 (en) | 2015-07-27 | 2015-07-27 | Development of Improved Cell-Permeable (iCP) Parkin Recombinant Protein as a Protein-Based Anti-Neurodegenerative Agent for the Treatment of Parkinson's Disease-Associated Phenotypes by Utilizing BBB-Penetrating Protein Delivery System MITT, Enabled by Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) |
| US14/809,279 | 2015-07-27 | ||
| PCT/KR2016/008174 WO2017018787A1 (en) | 2015-07-27 | 2016-07-26 | Improved cell-permeable (icp) parkin recombinant protein and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180026565A KR20180026565A (ko) | 2018-03-12 |
| KR102132311B1 true KR102132311B1 (ko) | 2020-07-13 |
Family
ID=57884839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020187005889A KR102132311B1 (ko) | 2015-07-27 | 2016-07-26 | 향상된 세포 투과성(icp) 파킨 재조합 단백질 및 이의 용도 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20170029798A1 (ko) |
| EP (1) | EP3328996B1 (ko) |
| JP (1) | JP6664464B2 (ko) |
| KR (1) | KR102132311B1 (ko) |
| CN (1) | CN108138150B (ko) |
| AU (1) | AU2016299468B2 (ko) |
| CA (1) | CA2993778C (ko) |
| WO (1) | WO2017018787A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024019489A1 (ko) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | 주식회사 셀리버리 | Aav 벡터와 세포투과성 펩티드 융합 플랫폼 및 이를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160060312A1 (en) * | 2014-08-27 | 2016-03-03 | Cellivery Therapeutics, Inc. | Development of Protein-Based Biotherapeutics That Penetrates Cell-Membrane and Induces Anti-Pancreatic Cancer Effect - Improved Cell-Permeable Suppressor of Cytokine Signaling (iCP-SOCS3) Proteins, Polynucleotides Encoding the Same, and Anti-Pancreatic Cancer Compositions Comprising the Same |
| US20170029798A1 (en) * | 2015-07-27 | 2017-02-02 | Cellivery Therapeutics, Inc. | Development of Improved Cell-Permeable (iCP) Parkin Recombinant Protein as a Protein-Based Anti-Neurodegenerative Agent for the Treatment of Parkinson's Disease-Associated Phenotypes by Utilizing BBB-Penetrating Protein Delivery System MITT, Enabled by Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) |
| EP3334755B1 (en) * | 2015-08-10 | 2020-04-08 | Cellivery Therapeutics, Inc. | Improved cell-permeable reprogramming factor (icp-rf) recombinant protein and use thereof |
| KR102138153B1 (ko) * | 2018-10-11 | 2020-07-27 | 주식회사 프롬바이오 | 세포 투과성 펩타이드 및 이의 고속 대량 스크리닝 방법 |
| BR112022011744A2 (pt) * | 2020-02-18 | 2022-09-20 | Cellivery Therapeutics Inc | Peptídeo sintético inibidor de importação nuclear permeável à célula melhorado para inibição de tempestade de citocina ou doença inflamatória e uso do mesmo |
| CN111983058B (zh) * | 2020-07-30 | 2023-06-23 | 云南中医药大学 | 中药抗非酒精性脂肪肝活性物质的筛选方法 |
| WO2022050778A1 (en) * | 2020-09-04 | 2022-03-10 | Cellivery Therapeutics, Inc. | Improved cell-permeable modified parkin recombinant protein for treatment of neurodegenerative diseases and use thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012050402A2 (ko) * | 2010-10-14 | 2012-04-19 | 주식회사 프로셀제약 | 세포투과성 parkin 재조합 단백질 및 이를 함유하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학적 조성물 |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030104622A1 (en) | 1999-09-01 | 2003-06-05 | Robbins Paul D. | Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses |
| EP1230267B1 (en) * | 1999-09-27 | 2006-03-29 | Elan Corporation | Membrane translocating peptide drug delivery system |
| WO2003066801A2 (en) | 2002-02-05 | 2003-08-14 | Indian Institute Of Technology | Method for specific integration of t7 rna polymerase gene in the chromosome of corynebacterial and the resultant corynebacteria-t7 promoter based shuttle vector system. |
| WO2003097671A1 (en) | 2002-03-29 | 2003-11-27 | Creagene Inc. | Cytoplasmic transduction peptides and uses thereof |
| US6835810B2 (en) | 2002-05-13 | 2004-12-28 | Geneshuttle Biopharma, Inc. | Fusion protein for use as vector |
| WO2007056083A2 (en) * | 2005-11-02 | 2007-05-18 | Ambrx, Inc. | Biosynthetic polypeptide fusion inhibitors |
| US20090215120A1 (en) * | 2006-03-20 | 2009-08-27 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | The Use of Protein S Fusion for Protein Solubilization |
| CN101616928B (zh) * | 2007-01-29 | 2015-04-15 | 株式会社普罗赛尔制药 | 新型大分子转导域及其识别方法和用途 |
| WO2009032148A1 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Tufts University | Methods of making and using a cell penetrating peptide for enhanced delivery of nucleic acids, proteins, drugs, and adenovirus to tissues and cells, and compositions and kits |
| WO2009139599A2 (ko) | 2008-05-16 | 2009-11-19 | 주식회사 프로셀제약 | 세포투과성 p27 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 |
| CA2817102C (en) * | 2010-11-02 | 2020-07-28 | Promega Corporation | Oplophorus-derived luciferases, novel coelenterazine substrates, and methods of use |
| NZ611176A (en) | 2010-12-02 | 2015-07-31 | Bionor Immuno As | Peptide scaffold design |
| CA2834577A1 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | Phylogica Limited | Method of determining, identifying or isolating cell-penetrating peptides |
| KR101258279B1 (ko) * | 2011-11-23 | 2013-04-25 | 주식회사 프로셀제약 | 세포 투과능을 개선한 개량형 신규 거대 분자 전달 도메인 개발 및 이의 이용방법 |
| CN104039811B (zh) | 2011-11-23 | 2018-02-23 | 株式会社普罗赛尔制药 | 具有改善的细胞渗透性的新的大分子转导结构域的研发及其使用方法 |
| DK2986731T3 (da) * | 2013-04-19 | 2022-08-01 | Sutro Biopharma Inc | Ekspression af biologisk aktive proteiner i et bakteriecellefrit syntesesystem ved hjælp af celleekstrakter med forhøjede niveauer af exogene chaperoner |
| KR20190041551A (ko) * | 2014-08-17 | 2019-04-22 | (주)셀리버리 | 세포 투과성의 향상을 위한 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법, 이를 포함하는 aMTD 서열을 개발하는 방법 |
| US20160060312A1 (en) * | 2014-08-27 | 2016-03-03 | Cellivery Therapeutics, Inc. | Development of Protein-Based Biotherapeutics That Penetrates Cell-Membrane and Induces Anti-Pancreatic Cancer Effect - Improved Cell-Permeable Suppressor of Cytokine Signaling (iCP-SOCS3) Proteins, Polynucleotides Encoding the Same, and Anti-Pancreatic Cancer Compositions Comprising the Same |
| CN104372021A (zh) * | 2014-11-05 | 2015-02-25 | 太仓思源生物医药有限公司 | 人白细胞介素-2蛋白质的制备方法 |
| CN104673823B (zh) * | 2015-03-11 | 2017-11-03 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法 |
| US20170029798A1 (en) * | 2015-07-27 | 2017-02-02 | Cellivery Therapeutics, Inc. | Development of Improved Cell-Permeable (iCP) Parkin Recombinant Protein as a Protein-Based Anti-Neurodegenerative Agent for the Treatment of Parkinson's Disease-Associated Phenotypes by Utilizing BBB-Penetrating Protein Delivery System MITT, Enabled by Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) |
| WO2017026779A1 (en) * | 2015-08-10 | 2017-02-16 | Cellivery Therapeutics, Inc. | Improved cell-permeable cre (icp-cre) recombinant protein and use thereof |
| WO2017030323A1 (en) * | 2015-08-18 | 2017-02-23 | Cellivery Therapeutics, Inc. | Cell-permeable (cp)-δsocs3 recombinant protein and uses thereof |
-
2015
- 2015-07-27 US US14/809,279 patent/US20170029798A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-07-26 JP JP2018503759A patent/JP6664464B2/ja active Active
- 2016-07-26 CN CN201680044600.5A patent/CN108138150B/zh active Active
- 2016-07-26 CA CA2993778A patent/CA2993778C/en active Active
- 2016-07-26 KR KR1020187005889A patent/KR102132311B1/ko active IP Right Grant
- 2016-07-26 WO PCT/KR2016/008174 patent/WO2017018787A1/en active Search and Examination
- 2016-07-26 EP EP16830820.3A patent/EP3328996B1/en active Active
- 2016-07-26 AU AU2016299468A patent/AU2016299468B2/en active Active
-
2018
- 2018-01-25 US US15/879,664 patent/US10662419B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012050402A2 (ko) * | 2010-10-14 | 2012-04-19 | 주식회사 프로셀제약 | 세포투과성 parkin 재조합 단백질 및 이를 함유하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학적 조성물 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Journal of Neurochemistry.,89:1490-1497(2004.6.) |
| PLoS One.,9(7):e102517(2014.7.14.)* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024019489A1 (ko) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | 주식회사 셀리버리 | Aav 벡터와 세포투과성 펩티드 융합 플랫폼 및 이를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20180171322A1 (en) | 2018-06-21 |
| EP3328996A1 (en) | 2018-06-06 |
| KR20180026565A (ko) | 2018-03-12 |
| CA2993778A1 (en) | 2017-02-02 |
| US20170029798A1 (en) | 2017-02-02 |
| CN108138150B (zh) | 2022-07-26 |
| AU2016299468B2 (en) | 2019-07-25 |
| EP3328996B1 (en) | 2020-04-01 |
| CN108138150A (zh) | 2018-06-08 |
| CA2993778C (en) | 2020-09-22 |
| AU2016299468A1 (en) | 2018-02-08 |
| EP3328996A4 (en) | 2018-08-01 |
| JP6664464B2 (ja) | 2020-03-13 |
| US10662419B2 (en) | 2020-05-26 |
| WO2017018787A1 (en) | 2017-02-02 |
| JP2018524994A (ja) | 2018-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102132311B1 (ko) | 향상된 세포 투과성(icp) 파킨 재조합 단백질 및 이의 용도 | |
| EP3341396B1 (en) | Improved cell-permeable (icp)-socs3 recombinant protein and uses thereof | |
| US11319546B2 (en) | Cell-permeable (CP)-Cas9 recombinant protein and uses thereof | |
| JP6346159B2 (ja) | 所定の標的に対して親和性を有するヒトリポカリン２（Ｌｃｎ２、ｈＮＧＡＬ）の突然変異タンパク質 | |
| AU2006341726B2 (en) | Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy | |
| EP3334756B1 (en) | Improved cell-permeable cre (icp-cre) recombinant protein and use thereof | |
| EP3337815B1 (en) | Cell-permeable (cp)- socs3 recombinant protein and uses thereof | |
| JP5709012B2 (ja) | 神経分化誘導ペプチド及びその利用 | |
| EP1221480B1 (en) | Polypeptide humanin inhibiting nerve cell death | |
| EP3334755B1 (en) | Improved cell-permeable reprogramming factor (icp-rf) recombinant protein and use thereof | |
| RU2432359C2 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ СЛИТОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО БЕЛОК MeCP2 И ДОМЕН ТРАНСДУКЦИИ БЕЛКА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ТАКОЙ БЕЛОК, И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ СВЯЗАННОГО С РАЗВИТИЕМ НЕРВНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ | |
| KR20230028132A (ko) | 신규한 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 그람음성균에 대한 항생제 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) |