CN108138150A - 细胞透性改善的(iCP)帕金重组蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的iCP帕金重组蛋白可以在临床研究中应用为基于蛋白的抗神经退行性剂以通过保护多巴胺能神经元细胞和调节多巴胺分泌来治疗帕金森病。

Description

细胞透性改善的(iCP)帕金重组蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及基于大分子胞内转导技术(MITT)特异性地靶向神经退行性疾病的新的基于蛋白的治疗剂,所述大分子胞内转导技术(MITT)使用在体外和体内提供大分子的细胞透性的新发展的疏水性CPP(细胞穿透肽),即高级大分子转导域(aMTD)启动。作为治疗帕金森病的胞内蛋白疗法,本发明的重组蛋白具有的新技术优势在于,该重组蛋白可以解决血脑屏障(BBB)透性、组织透性和生物传递功能。
背景技术
帕金森病是主要的神经退行性疾病之一,该疾病由于多巴胺的不稳定产生和分泌而发生(16)。在患有帕金森病的患者中,存在中脑中的多巴胺能神经元的损伤;病理特征,例如路易氏小体的形成;运动缺陷,例如运动迟缓、静止性震颤和僵硬;以及非运动症状,例如抑郁、痴呆和失眠(17-19)。
帕金森病是通常在老一代人中发现的神经退行性疾病。统计上,约1%的大于55岁的人以及约3%的大于75岁的人被诊断出患有该疾病(20)。随着老年人人口增加,被诊断患有帕金森病的患者的数量在不断增加。在全球,患有该疾病的患者人口预计从2005年时的410万人增加到2030年时的870万人 (21,22)。
帕金森病的原因尚不清楚;然而,之前的研究报道了帕金森病是由遗传因素和环境因素两者的组合导致的;尤其地,在导致帕金森病的各种遗传因素中,帕金基因的突变具有最高的普遍性。帕金基因在患有常染色体隐性青少年帕金森病(ARJP)的日本人中首次被发现(23)。可以从早发性遗传性帕金森病患者的约50%中和低于50岁的散发性患者的18%中发现帕金基因突变(24)。
帕金蛋白由在泛素蛋白酶体系统中起E3连接酶作用的465个氨基酸序列组成。帕金蛋白通过去除细胞内的受损的、氧化的和/或不规则结构的蛋白质而起到减少细胞内氧化应激的作用。
当帕金蛋白突变发生时,帕金蛋白失去了作为E3连接酶的性质;包涵体和/或不规则蛋白在细胞内积累,导致多巴胺分泌减少和多巴胺能神经元细胞凋亡(25)。最近使用果蝇对帕金森病的研究已经显示通过减少多巴胺的分泌而使运动功能降低。由于多巴胺能神经元的失活,所以多巴胺分泌减少,这显示了帕金蛋白和PINK1(PTEN诱导的推定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1))的功能(26)。此外,当在不表达PINK1的果蝇中过表达帕金蛋白时,证实PINK1导致的帕金森病相关症状如线粒体功能障碍和多巴胺能神经元的降解得到恢复(26-28)。基于这些因素,帕金蛋白可以成功地起到基于靶蛋白的药剂的作用来治疗帕金森相关疾病。帕金蛋白在泛素蛋白酶体系统中作为主要的酶通过维持线粒体对氧化应激的功能来破坏包涵体和抑制多巴胺能神经元凋亡。
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发明内容
技术问题
大分子如帕金蛋白不能转位穿过细胞膜;此外,大分子不能通过血脑屏障被运输至脑内。因此,存在对开发能够使大分子转位至细胞/组织内的大分子胞内转导技术(MITT)的需求。
在之前的研究中,来自成纤维细胞生长因子4(FGF4)的疏水性信号肽的被称为膜转位序列(MTS)和膜转位基序(MTM)的基于MITT的疏水性CPP 已经被报道并用于在动物体内全身地递送生物活性肽和蛋白质,例如帕金蛋白。
然而,由于蛋白聚集、溶解度/产量低以及细胞/组织透性不佳,基于MITT 的疏水性CPP不能有效地在体内递送帕金蛋白,并且其体外递送效率也不充分。
解决技术问题的技术方案
为了克服局限性和改进在体外和体内提供大分子的细胞透性的CPP,在本发明中鉴定和证实了用于改善CPP的胞内递送潜力的理论关键因素(CF)。基于确定的CF,新生成了新的疏水CPP序列,定量地评价了所述疏水CPP序列的细胞透性,并相互比较了所述疏水CPP序列与参比CPP序列在活细胞中的胞内递送潜力。在本发明中,提供了新开发的疏水CPP。被称为‘高级大分子转导域(aMTD)’的新的肽序列可以与各种不同的治疗性蛋白融合并且将融合aMTD的重组蛋白全身地递送至活细胞和动物组织。这些蛋白将在临床开发和用于治疗各种有关蛋白治疗的人类疾病的基于蛋白的生物治疗剂的应用中具有巨大影响。
帕金森病是进行性神经退行性疾病,其由于黑质中多巴胺能神经元的损失而导致多巴胺不稳定分泌的运动缺陷。因此,通过恢复受损的多巴胺能神经元来调节多巴胺分泌对帕金森病的治疗是必要的。
已经开发了基于细胞透性改善的帕金重组蛋白(iCP-Parkin)作为用于有效BBB穿透以有效递送重组蛋白至脑的基于蛋白的抗神经退行性剂的大分子胞内转导技术。
帕金蛋白是一种多巴胺能神经元细胞死亡抑制剂,其与新开发的高级大分子转导域(aMTD)融合,并优选与增溶域(SD)融合以提高重组蛋白的溶解度/产量和细胞/组织透性。另外,我们新开发的aMTD/SD融合的重组iCP帕金蛋白显示BBB透性。在体外和体内,我们的iCP帕金重组蛋白通过抑制多巴胺能神经元细胞凋亡提高脑中的多巴胺水平,改善了帕金森病的典型表型- 运动能力。
本发明涉及可以应用于无限数目的设计的基线平台,所述基线平台具有适用于生物医学科学、临床前研究和临床研究的细胞通透性,促进生物活性大分子(包括蛋白质、肽、核酸、化学物质等)穿过细胞的质膜。
本发明分析、鉴定和确定这些促进aMTD序列的细胞透性能力的关键因素。这些aMTD序列是基于由之前公布的疏水CPP的深入分析确定的关键因素(CF)人工装配的。
本发明的一个方面涉及新的高级大分子转导域(aMTD)序列。
本发明的aMTD序列是首次人工开发的、能够介导转导生物活性大分子通过细胞质膜的细胞透性多肽,所述生物活性大分子包括肽、多肽、蛋白域或全长蛋白。
本发明的另一方面涉及通过使aMTD序列与生物活性货物分子融合来基因工程化具有细胞透性的生物活性分子的方法。
本发明还涉及用于将生物活性分子递送至细胞(包括细胞透性重组蛋白) 的aMTD序列的治疗性应用,其中aMTD连接于生物活性货物分子。
本发明的另一方面涉及生物活性大分子作为细胞透性重组蛋白的构建体能够进入活细胞的方法,所述细胞透性重组蛋白包括与生物活性大分子融合的 aMTD序列。
本发明的另一方面涉及aMTD序列用于分子递送、药物递送、蛋白治疗、胞内蛋白治疗、蛋白替代治疗、肽治疗、基因递送等的有效使用。
本发明的另一方面涉及240种新的疏水CPP序列即aMTD,aMTD介导的重组蛋白的胞内递送活性的确定,以及通过活细胞在大于或等于来源于 FGF4的MTS/MTM和来源于HRSS的MTD序列的水平对提高的蛋白摄取的比较。新发明的aMTD的这些优势可以解决用于临床开发和应用的参比疏水 CPP的缺点。
本发明涉及将生物活性大分子转导至质膜的高级大分子转导域(aMTD) 序列。
本发明的另一方面涉及由具有如下特性的氨基酸序列组成的aMTD:
a.氨基酸长度:9~13
b.弯曲潜力:位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端(12′)的脯氨酸 (P)
c.刚性/柔性:不稳定指数(Instability Index,II):40~60
d.结构特征:脂肪族指数(Aliphatic Index,AI):180~220
e.亲水性:GRAVY:2.1~2.6
f.氨基酸组成:所有组成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(A、V、L、 I和P)。
根据一种实施方式,氨基酸序列具有如下所述的由12个氨基酸的序列组成的通式。
[通式]
在这里,X是指丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I);脯氨酸(P)可以位于U中的一个(5′、6′、7′或8′)中。剩余的U由A、V、 L或I组成,在12′位置处的P是脯氨酸。
根据一种实施方式,具有通式的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:240组成的组。
根据一种实施方式,aMTD的二级结构是α-螺旋。
本发明进一步提供了编码上文描述的aMTD序列的经分离的多核苷酸。
根据一种实施方式,所述经分离的多核苷酸选自由SEQ ID NO:241至 SEQ ID NO:480组成的组
本发明进一步提供了鉴定aMTD的关键因素的方法。6种方法包括从之前公布的参比疏水CPP中选择优秀的疏水CPP;分析选择的疏水CPP的生理和化学特性;从这些生理和化学特性中鉴定出与细胞透性相关的特征;将之前公布的参比疏水CPP分类为至少2组,并且通过根据CPP的细胞透性和相关特性对每组CPP进行深入分析来确定独特特征;通过分析所确定的独特特征形成所鉴定的关键因素;通过实验性研究证实关键因素是有效的;以及确定基于证实的实验性研究的关键因素。
根据一种实施方式,鉴定的独特特征是氨基酸长度、分子量、pI值、弯曲潜力、刚性、柔性、结构特性、亲水性、残基结构、氨基酸组成和二级结构。
根据一种实施方式,确定的六种关键因素由以下特性组成:
a.氨基酸长度:9~13
b.弯曲潜力:位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端的脯氨酸
c.刚性/柔性:不稳定指数(II):40~60
d.结构特征:脂肪族指数(AI):180~220
e.亲水性:GRAVY:2.1~2.6
f.氨基酸组成:所有组成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(A、V、L、 I和P)。
G二级结构:α-螺旋
本发明进一步提供了形成aMTD序列的方法。该方法包括设计具有如下所述的通式的aMTD的平台;
[通式]
其中序列的末端(12′)的(P)是脯氨酸,U位点之一是脯氨酸,不是脯氨酸的X和U是A、V、L和/或I;以及证实设计的氨基酸序列是否满足如下六种关键因素:
a.氨基酸长度:9~13
b.弯曲潜力:位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端的脯氨酸(P)
c.刚性/柔性:不稳定指数(II):40~60
d.结构特征:脂肪族指数(AI):180~220
e.亲水性:GRAVY:2.1~2.6
f.氨基酸组成:所有组成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(A、V、L、 I和P)。
根据一种实施方式,通过鉴定aMTD的独特特征的方法获得的六种关键因素由如下因素组成:
a.氨基酸序列:12
b.弯曲潜力:脯氨酸(P)位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端(12′)
c.刚性/柔性:不稳定指数(II):41.3~57.3
d.结构特征:脂肪族指数(AI):187.5~220
e.亲水性:GRAVY:2.2~2.6
f.氨基酸组成:所有组成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(A、V、L、 I和P)
根据一种实施方式,aMTD的二级结构是α-螺旋。
根据一种实施方式,所述方法进一步包括形成与货物蛋白融合的aMTD 序列的表达载体;选择用于诱导型表达的适当的细菌菌株;纯化并且制备可溶形式的、与货物蛋白融合的aMTD;以及证实它们的细胞透性。
本发明进一步提供了具有细胞透性的经分离的重组蛋白。该经分离的重组蛋白包括具有选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:240组成的组中的氨基酸序列的高级大分子转导域(aMTD)序列;以及生物活性分子。
根据一种实施方式,生物活性分子是选自由生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片段组成的组中的任意一种。
根据一种实施方式,生物活性分子是选自由以下组成的组中的任意一种:酶、激素、载体、免疫球蛋白、抗体、结构蛋白、马达功能肽(motor functioning peptide)、受体、信号传导肽、存储肽(storing peptide)、膜肽、跨膜肽、内肽 (internal peptide)、外肽(external peptide)、分泌肽、病毒肽、天然肽、糖化蛋白、片段化蛋白、二硫键结合的蛋白(disulphide bonded protein)、重组蛋白、化学修饰蛋白和朊病毒。
根据一种实施方式,生物活性分子是选自由核酸、编码核酸的序列、 mRNA、反义RNA分子、碳水化合物、脂质和糖脂组成的组中的任意一种。
根据一种实施方式,生物活性分子是选自由生物治疗性化学物质和毒性化学物质组成的组中的至少一种。
本发明进一步提供了基因工程化或表观遗传工程化和/或修饰生物活性分子以具有细胞透性的方法。该方法包括在最佳和有效的条件下,将aMTD融合于生物活性分子以产生可以是细胞透性的生物活性分子,其中aMTD由选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:240组成的组中的氨基酸序列中的任意一个组成。
本发明还涉及基于能够介导生物活性大分子向活细胞转导的高级大分子转导域(aMTD)序列的用于治疗帕金森病的细胞透性重组蛋白。
本发明的其他方面涉及细胞/组织/BBB透性的用于帕金森病的基于蛋白的治疗剂,所述治疗剂基于用于药物递送、蛋白治疗、胞内蛋白治疗、蛋白替代治疗和肽治疗的aMTD序列的有效使用。
本发明的其他方面提供了iCP(细胞透性改善的)帕金重组蛋白,该iCP 帕金重组蛋白包括帕金蛋白和由9~13个氨基酸的序列组成并具有改善的细胞或组织透性的高级大分子转导域(aMTD),其中aMTD与帕金蛋白的一个末端或两个末端融合,并且具有以下特征:
(a)由选自由Ala、Val、Ile、Leu和Pro组成的组中的3个或更多个氨基酸的序列组成;
(b)氨基酸序列中具有对应于aMTD氨基酸序列的第5至8位和第12位的任意一个或多个位置的脯氨酸;以及
(c)如通过Protparam所测量的,不稳定指数为40~60;脂肪族指数为180 ~220;亲水性总平均值(GRAVY)为2.1~2.6。
根据一种实施方式,一个或多个增溶域(solubilization domain,SD)进一步融合于帕金蛋白和aMTD中的一个或多个的末端。
根据另一种实施方式,aMTD可以具有α-螺旋结构。根据又另一种实施方式,aMTD可以由12个氨基酸的序列组成并且由以下通式表示:
[通式]
其中,X独立地指丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I);并且脯氨酸(P)可以位于U中的一个(5’、6’、7’或8’)中。剩余的U由A、 V、L或I组成,在12’位置处的P是脯氨酸。
本发明的另一方面提供了iCP帕金重组蛋白,其由以下结构式中的任一个来表示:
A-B-C和A-C-B-C
其中A是具有改善的细胞或组织透性的高级大分子转导域(aMTD),B 是帕金蛋白,C是增溶域(SD);并且
aMTD由9~13个氨基酸的序列组成,并且具有以下特征:
(a)由选自由Ala、Val、Ile、Leu和Pro组成的组中的3个或更多个氨基酸组成;
(b)氨基酸序列中具有对应于aMTD氨基酸序列的第5至8位和第12位中的任意一个或多个位置的脯氨酸;
(c)如通过Protparam所测量的,不稳定指数为40~60;脂肪族指数为180 ~220;亲水性总平均值(GRAVY)为2.1~2.6;以及
(d)具有α-螺旋结构。
根据本发明的一种实施方式,帕金蛋白可以具有SEQ ID NO:814的氨基酸序列。
根据本发明的另一种实施方式,帕金蛋白可以由SEQ ID NO:815的多核苷酸序列编码。
根据本发明的又另一种实施方式,帕金蛋白可以进一步包括选择性地结合于细胞、组织或器官的受体的配体。
根据本发明的又另一种实施方式,aMTD可以具有选自由SEQ ID NO: 1~240组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的又另一种实施方式,aMTD可以由选自由SEQ ID NO: 241~480组成的组中的多核苷酸序列编码。
根据本发明的又另一种实施方式,SD可以具有独立地选自由SEQ ID NO: 798、799、800、801、802、803和804组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的又另一种实施方式,SD可以由独立地选自由SEQ ID NO: 805、806、807、808、809、810和811组成的组中的多核苷酸序列编码。
根据本发明的又另一种实施方式,iCP帕金重组蛋白可以具有另外与其一个末端融合的组氨酸标记的亲和域。
根据本发明的又另一种实施方式,组氨酸标记的亲和域可以具有SEQ ID NO:812的氨基酸序列。
根据本发明的又另一种实施方式,组氨酸标记的亲和域可以由SEQ ID NO: 813的多核苷酸序列编码。
根据本发明的又另一种实施方式,融合可以通过肽键或化学键来形成。
根据本发明的又另一种实施方式,iCP帕金重组蛋白可以用于治疗或预防帕金森相关疾病。
本发明的再另一种实施方式提供了编码iCP帕金重组蛋白的多核苷酸序列。
根据本发明的一种实施方式,多核苷酸序列可以是由SEQ ID NO:816或 SEQ IDNO:822表示的多核苷酸序列。
根据本发明的另一种实施方式,多核苷酸序列可以选自由SEQ ID NO: 818、824、828、830和832组成的组。
本发明的再另一种实施方式提供了包括多核苷酸序列的重组表达载体。
本发明的再另一种实施方式提供了用重组表达载体转化的转化体。
本发明的再另一种实施方式提供了iCP帕金重组蛋白的制备方法,包括:制备重组表达载体;使用重组表达载体制备转化体;培养转化体;以及回收通过培养表达的重组蛋白。
本发明的再另一种实施方式提供了包含iCP帕金重组蛋白作为活性成分的组合物。
本发明的再另一种实施方式提供了用于治疗或预防帕金森病的药物组合物,所述药物组合物包含:作为活性成分的iCP帕金重组蛋白;以及药学上可接受的载体。
本发明的再另一种实施方式提供了iCP帕金重组蛋白作为治疗或预防帕金森相关疾病的药物的用途。
本发明的再另一种实施方式提供了包含iCP帕金重组蛋白的药物。
本发明的再另一种实施方式提供了iCP帕金重组蛋白在制备治疗或预防帕金森相关疾病的药物中的用途。
本发明的再另一种实施方式提供了治疗或预防受试者的帕金森相关疾病的方法,该方法包括鉴定需要治疗或预防帕金森相关疾病的受试者;以及将治疗有效量的iCP帕金重组蛋白施用于该受试者。
根据本发明的一种实施方式,受试者可以是哺乳动物。
除非另有定义,本文使用的所有术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管本文中描述了某些方法和材料,但不应将其解释为限于此,在本发明的实践或测试中也可以使用任何与其类似或等同的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用全文并入本文,以结合所引用的出版物公开和描述方法和/或材料。必须注意的是,除非上下文另外清楚地指出,否则如本文和所附权利要求中所使用的,单数形式“一个/一种(a)”,“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。
本发明的“肽”是指由通过肽键彼此连接的氨基酸残基形成的链型聚合物,并且“肽”与“多肽”互换地使用。此外,“多肽”包括肽和蛋白。
进一步地,术语“肽”包括本文中具体例示的那些肽的保守性变异的氨基酸序列。如本文使用的,术语“保守性变异”表示氨基酸残基被另一种生物学上相似的残基置换。保守变异的实例包括:一个疏水残基取代另一个疏水残基,所述疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸;或一个极性残基取代另一个极性残基,例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。可相互取代的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。
术语“保守性变异”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸,条件是引起取代的多肽的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。这样的保守性取代在本发明的肽类别的定义范围内。
本领域普通技术人员可以进行类似的取代以获得具有更高的细胞透性和更宽的宿主范围的肽。例如,本发明提供了对应于本文提供的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1至240)的肽,以及其类似物、同系物、异构体、衍生物、酰胺化变体和保守变体,只要肽的细胞渗透性保持不变。
对本发明的肽的一级氨基酸序列的较小修饰可以产生与本文所述的特定肽相比具有基本相等或增强的细胞透性的肽。这种修饰可以是人为的如通过定点诱变,或可以是自发的。
所有的肽都可以使用L-氨基酸来合成,但是可以合成产生D形式的所有肽。此外,为了增加本发明的肽的细胞透性,可以生产诸如C端甲基酯和C 端酰胺化物的C端衍生物。
本文包括通过这些修饰产生的所有肽,只要在酰胺化形式的肽的情况下,改变或增强原始肽的细胞透性而使酰胺化肽在治疗上有用。预期这种修饰对于改变或增强特定肽的细胞透性是有用的。
此外,一个或多个氨基酸的缺失也可导致所得分子的结构的修饰,而其细胞透性没有任何显著改变。这可以导致对可能也具有实用性的较小的活性分子的开发。例如,可以去除对于特定肽的细胞透性可能不需要的氨基或羧基末端的氨基酸。
术语“基因”是指在蛋白质编码或转录或其他基因表达的调节中具有功能作用的任意核酸序列或其部分。基因可以由编码功能性蛋白质的全部核酸或编码或表达蛋白质的核酸的一部分组成。核酸序列可以包括外显子、内含子、起始区或终止区、启动子序列、其他调节序列或与基因相邻的独特序列中的基因突变。
术语“引物”是指与互补RNA或DNA靶多核苷酸杂交,并且充当通过核苷酸转移酶的作用(例如在聚合酶链式反应中发生的)由单核苷酸逐步合成多核苷酸的起始点的寡核苷酸序列。
术语“编码区”或“编码序列”是指根据正常的碱基配对和密码子使用关系编码期望表达的特定基因产物或其片段的核酸序列、其互补序列或其部分。编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录物中的外显子,通过细胞生化机制将外显子连接在一起以提供成熟的mRNA。反义链是核酸的互补物,可以从其中推导出编码序列。
本发明提供了iCP帕金重组蛋白,其包括帕金蛋白和高级大分子转导域(aMTD),所述高级大分子转导域(aMTD)由9~13个氨基酸的序列组成,优选由10~12个氨基酸的序列组成,并且具有改善的细胞或组织透性,其中 aMTD与帕金蛋白的一个末端或两个末端融合,并且具有以下特征:
(a)优选由选自由Ala、Val、Ile、Leu和Pro组成的组中的3个或更多个氨基酸的序列组成;
(b)氨基酸序列中具有对应于aMTD氨基酸序列的第5至8位和第12位中的任意一个或多个位置,优选第5至8位和第12位中的一个或多个位置的脯氨酸;以及
(c)如通过Protparam所测量的(参见http://web.expasy.org/protparam/),不稳定指数优选为40~60,更优选为41~58;脂肪族指数为180~220,更优选为185~225;亲水性总平均值(GRAVY)为2.1~2.6,更优选为2.2~2.6。
根据一种实施方式,一个或多个增溶域(SD)进一步融合于帕金蛋白和 aMTD中的一个或多个,优选地融合于帕金蛋白的一个或两个末端,更优选地融合于帕金蛋白的C端。
根据另一种实施方式,aMTD可以具有α-螺旋结构。
根据又另一种实施方式,aMTD优选可以由12个氨基酸的序列组成,并且由以下通式表示:
[通式]
在此,X独立地指丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I);并且脯氨酸(P)可以位于U中的一个(5’、6’、7’或8’)中。剩余的U独立地由A、V、L或I组成,在12’位置处的P是脯氨酸。
本发明的再另一种实施方式提供了iCP帕金重组蛋白,所述iCP帕金重组蛋白由结构式A-B-C和A-C-B-C中的任一个表示,优选由A-B-C表示:
其中A是具有改善的细胞或组织透性的高级大分子转导域(aMTD),B 是帕金蛋白,C是增溶域(SD);并且
aMTD由9~13个氨基酸的序列组成,优选由10~12个氨基酸的序列组成,并且具有以下特征:
(a)由选自由Ala、Val、Ile、Leu和Pro组成的组中的3个或更多个氨基酸的序列组成;
(b)氨基酸序列中具有对应于aMTD氨基酸序列的第5至8位和第12位中的任意一个或多个位置,优选第5至8位和第12位中的一个或多个位置的脯氨酸;
(c)如通过Protparam所测量的(参见http://web.expasy.org/protparam/),不稳定指数优选为40~60,更优选为41~58;脂肪族指数为180~220,更优选为185~225;亲水性总平均值(GRAVY)优选为2.1~2.6,更优选为2.2~ 2.6;以及
(d)优选具有α-螺旋结构。
在本发明的一种实施方式中,帕金蛋白可以具有SEQ ID NO:814的氨基酸序列。
在本发明的另一种实施方式中,帕金蛋白可以由SEQ ID NO:815的多核苷酸序列编码。
当要将iCP帕金重组蛋白递送至特定细胞、组织或器官时,帕金蛋白可以与能够与特异地表达于特定细胞、组织或器官上的受体选择性地结合的配体的胞外域,或能够特异地结合于受体或配体及其修饰形式的单克隆抗体(mAb),一起形成融合产物。
通过在核苷酸水平上使用表达载体的克隆技术间接连接,或通过肽和生物活性物质的化学或物理共价键或非共价键的直接连接,可以形成肽和生物活性物质的结合。
在本发明的又一种实施方式中,帕金蛋白可以优选进一步包括选择性结合于细胞、组织或器官的受体的配体。
在本发明的一种实施方式中,aMTD可以具有选自由SEQ ID NO:1至240 组成的组中的氨基酸序列。aMTD可以优选为SEQ ID NO:74的aMTD321或 SEQ ID NO:122的aMTD524,更优选为SEQ ID NO:122的aMTD524
在本发明的又一种实施方式中,aMTD可以由选自由SEQ ID NO:241至480组成的组中的多核苷酸序列编码。aMTD可以优选为由SEQ ID NO:314 的多核苷酸序列编码的aMTD321或由SEQ ID NO:362的多核苷酸序列编码的 aMTD524,更优选为由SEQ ID NO:362的多核苷酸序列编码的aMTD524
在本发明的又一种实施方式中,SD可以具有独立地选自由SEQ ID NO: 798、799、800、801、802、803和804组成的组中的氨基酸序列。SD可以优选为SEQ ID NO:798的SDA、SEQID NO:799的SDB或SEQ ID NO:804的 SDB′,更优选为具有优秀的结构稳定性的SEQ ID NO:799的SDB或具有SDB 的修饰的氨基酸序列以避免体内应用时的免疫应答的SEQ ID NO:804的 SDB′。SDB中氨基酸序列的修饰可以是用亮氨酸替换对应于SDB氨基酸序列 (SEQ IDNO:799)的第28位的氨基酸残基缬氨酸。
在本发明的又一种实施方式中,SD可以由独立地选自由SEQ ID NO:805、 806、807、808、809、810和811组成的组中的多核苷酸序列编码。SD可以优选为由SEQ ID NO:805的多核苷酸序列编码的SDA、由SEQ ID NO:806 的多核苷酸序列编码的SDB或由SEQ ID NO:811的多核苷酸序列编码的用于去免疫化的SDB′,更优选为由SEQ ID NO:806的多核苷酸序列编码的具有优秀的结构稳定性的SDB或由SEQ ID NO:811的多核苷酸序列编码的具有SDB的修饰的多核苷酸序列以避免体内应用时的免疫应答的SDB′。
帕金蛋白可以通过细胞内或体内递送表现出与生理现象有关的活性或与治疗目的有关的活性。重组表达载体可以包括使得重组蛋白容易纯化的标记序列,例如连续的组氨酸密码子、麦芽糖结合蛋白密码子、Myc密码子等,并进一步包括提高重组蛋白溶解度的融合配偶体等。进一步地,为了重组蛋白质的总体结构和功能稳定性或各基因编码的蛋白质的柔性,重组表达载体可进一步包括一个或多个甘氨酸、脯氨酸和间隔区氨基酸或包括AAY氨基酸的多核苷酸序列。此外,重组表达载体可以包括为了去除重组蛋白的不必要区域而由酶特异地消化的序列、表达调节序列、验证胞内递送的标记序列或报告基因序列,但不限于此。
在本发明的又一种实施方式中,iCP帕金重组蛋白可以优选地具有另外与其一个末端融合的组氨酸标记的亲和域。
在本发明的又一种实施方式中,组氨酸标记的亲和域可以具有SEQ ID NO:812的氨基酸序列。
在本发明的又一种实施方式中,组氨酸标记的亲和域可以由SEQ ID NO: 813的多核苷酸序列编码。
在本发明的又一种实施方式中,融合可以通过肽键或化学键来形成。
化学键可以优选地选自由二硫键、二胺键、硫化物-胺键、羧基-胺键、酯键和共价键组成的组。
在本发明的又一种实施方式中,iCP帕金重组蛋白可以用于治疗或预防帕金森相关疾病。
本发明的再另一个方面提供了编码iCP帕金蛋白的多核苷酸序列。
根据本发明的一种实施方式,多核苷酸序列可以是由SEQ ID NO:816或 SEQ IDNO:822表示的多核苷酸序列。
根据本发明的另一种实施方式,多核苷酸序列可以进一步与SD融合,并且可以由选自由SEQ ID NO:818、824、828、830和832组成的组中的多核苷酸序列表示。
根据本发明的又另一种实施方式,多核苷酸序列可以与组氨酸标记的亲和域融合,并且可以是SEQ ID NO:820或SEQ ID NO:826的多核苷酸序列。
优选地,本发明的iCP帕金重组蛋白可以由选自由SEQ ID NO:817、819、 821、823、825、827、829和831组成的组中的氨基酸序列组成。
本发明的再另一种实施方式提供了包括多核苷酸序列的重组表达载体。
优选地,载体可以插入宿主细胞并与宿主细胞基因组重组,或是指包括能够作为附加体自发复制的核苷酸序列的任何核酸。这样的载体可以包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒、RNA载体、病毒载体等。
优选地,可以基因工程化载体以便将以N端和/或C端取向的编码重组蛋白的核酸序列并入编码感兴趣的肽、多肽、蛋白域或全长蛋白的核酸序列,并且在正确的读码框中使得可以表达由aMTD、帕金蛋白、优选还有SD组成的重组蛋白。表达载体可以选自容易用于原核或真核表达系统的表达载体。
标准重组核酸方法可以用于表达基因工程化的重组蛋白。编码本发明的重组蛋白的核酸序列可以例如使用适当的信号和加工序列以及用于转录和翻译的调节序列克隆至核酸表达载体内,并且可以使用自动有机合成方法合成蛋白质。例如文献[酶学中的方法(Methods in Enzymology),第289卷:固相肽合成(Solid-Phase PeptideSynthesis),Gregg B.Fields(编者),Sidney P.Colowick, Melvin I.Simon(编者),学术出版社(Academic Press)(1997)]中描述了生产蛋白的合成方法。
为了获得克隆的基因或核酸(例如编码本发明的重组蛋白的cDNA)的高水平表达,通常可以将重组蛋白序列亚克隆至表达载体中,所述表达载体包括用于指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及在编码蛋白的核酸的情况下用于翻译起始的核糖体结合位点。适当的细菌启动子是本领域熟知的并且在例如在文献[Sambrook&Russell,分子克隆:实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第三版,冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory), N.Y.(2001);和Ausubel等人,分子生物学通用方案(CurrentProtocols in Molecular Biology),格林尼出版公司和威利国际科学(GreenePublishing Associates and Wiley Interscience),N.Y.(1989)]中被描述。用于表达本发明的重组蛋白的细菌表达系统在例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌中可用(Palva等人,基因22:229-235(1983);Mosbach等人,自然 302:543-545(1983))。用于这样的表达系统的试剂盒是商业上可获得的。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域中是众所周知的,也是商业上可获得的。真核表达载体可以优选为腺病毒载体、腺相关载体或逆转录病毒载体。
通常,用于表达本发明的细胞透性重组蛋白的表达载体可以包括包含例如可操作地连接于编码高级大分子转导域的序列的启动子的调节序列,所述细胞透性重组蛋白中的货物蛋白(即帕金蛋白)与aMTD的N端、C端或两端连接。可以使用的诱导型启动子的非限制性实例包括类固醇激素响应性启动子 (例如蜕皮激素响应性启动子、雌激素响应性启动子和谷胱甘肽响应性启动子),四环素“Tet-On”和“Tet-Off”系统以及金属响应性启动子。
重组蛋白可以引入适当的宿主细胞,例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或组织培养细胞。还可以将重组蛋白引入胚胎干细胞以产生转基因生物体。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的,并且对于产生本发明的重组蛋白是商业上可获得的。
已知的方法可以用于构建包括本发明的多核苷酸序列和适当的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/ 基因重组。例如,文献中描述了这些技术[Sambrook&Russell,分子克隆:实验指南(Molecular Cloning:ALaboratory Manual),第三版,冷泉港实验室 (Cold Spring Harbor Laboratory),N.Y.(2001);和Ausubel等人,分子生物学通用方案(Current Protocols in MolecularBiology),格林尼出版公司和威利国际科学(Greene Publishing Associates and WileyInterscience),N.Y.(1989)]。
本发明的再另一种实施方式提供了用重组表达载体转化的转化体。
转化包括转染,并且是指通过转染,外来(胞外)DNA在有或没有随附物质的情况下进入宿主细胞的过程。“转染的细胞”是指将外来DNA引入细胞的细胞,因此该细胞中含有外来DNA。可以将DNA引入细胞,使得DNA 的核酸可以整合到染色体中或作为染色体外元件可复制。引入了外来DNA等的细胞被称为转化体。
如本文使用的,蛋白、肽、有机化合物“引入”细胞可以与“携带”、“穿透”、“运输”、“递送”、“透入”或“穿过”的表达相互交换地使用。
应该理解,宿主细胞是指其中引入了一种或多种DNA的真核细胞或原核细胞,并且不仅是指具体的受试细胞,而且也指其后代或其潜在的后代。因为突变或环境影响可能在后代中发生某些改变,所以这样的后代实际上可能不与亲本细胞相同,但仍被包括在本文所述的范围内。
宿主细胞可以优选为细菌细胞,作为细菌细胞原则上没有限制。该细菌细胞可以是真细菌(革兰氏阳性或革兰氏阴性的)或古细菌,只要它们允许基因操作以进行感兴趣的基因的插入,优选进行位点特异性整合,而且可以以生产规模培养。优选地,宿主细胞可以具有允许培养到高密度的性质。
可以用于制备重组蛋白的细菌宿主细胞的实例是大肠杆菌(Lee,1996; Hannig和Makrides,1998)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescens)(Squires等人,2004;Retallack等人,2006)以及各种棒状杆菌(Corynebacterium)(US 2006/0003404 A1)和乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)(Mierau等人,2005)菌株。优选地,宿主细胞是大肠杆菌细胞。
更优选地,宿主细胞可以包括能够结合于调节感兴趣的基因的启动子的 RNA聚合酶。RNA聚合酶对宿主细胞可以是内源的或外源的。
优选地,可以使用具有外来强RNA聚合酶的宿主细胞。例如,可以使用工程化以携带整合到大肠杆菌菌株基因组中的外来RNA聚合酶(例如,在使用T7启动子的情况下,被称为“T7菌株”中的T7样RNA聚合酶)的大肠杆菌菌株。T7菌株的实例例如BL21(DE3)、HMS174(DE3)及其衍生株或亲缘株(relatives)(见Novagen,pET系统手册(pET System manual),第11版) 可以广泛地使用并且是商业上可获得的。优选地,可以使用BL21-CodonPlus(DE3)-RIL或BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(安捷伦科技(Agilent Technologies))。这些菌株是含有在lacUV5启动子控制下的T7RNA聚合酶基因的DE3溶原菌。用IPTG诱导使得产生T7RNA聚合酶,然后该T7 RNA聚合酶在T7启动子的控制下指导感兴趣的基因的表达。
已经通过噬菌体DE3获得基于其基因组的T7 RNA聚合酶的宿主细胞菌株大肠杆菌BL21(DE3)或HMS174(DE3)是溶源性的。优选的是,已经通过避免或优选排除在宿主细胞基因组中插入剩余噬菌体序列的方法,整合了宿主细胞中所含的T7 RNA聚合酶,这是由于溶原菌株具有潜在表现出裂解特性的缺点,导致不希望的噬菌体释放和细胞裂解。
本发明的再另一种实施方式提供了iCP帕金重组蛋白的制备方法,包括:制备重组表达载体;使用重组表达载体制备转化体;培养转化体;以及回收通过培养表达的重组蛋白。
培养可以优选地以采用添加进给培养基(feed medium)的模式进行,该模式选自进给分批模式、半连续模式或连续模式,细菌表达宿主细胞可以包括在该宿主细胞基因组中整合的DNA构建体,所述DNA构建体携带在启动子的控制下的编码感兴趣的蛋白的DNA序列,所述启动子能够使所述蛋白表达。
细胞培养基的类型没有限制。细胞培养基可以是半确定的,即包含复合培养基化合物(例如酵母提取物、大豆蛋白胨、酪蛋白氨基酸),或者细胞培养基可以是化学上确定的而没有复合化合物。优选地,可以使用确定的培养基。确定的培养基(也称为最低限度或合成培养基)排他地由化学确定的物质组成,所述化学确定的物质即碳源(如葡萄糖或甘油)、盐、维生素,以及考虑到营养缺陷型的可能菌株的情况下的特定的氨基酸或其他物质如硫胺素。最优选地,葡萄糖可以用作碳源。通常,进给培养基的碳源作为控制特定生长速率的生长限制成分。
宿主细胞可以通过任何方便的方法破坏,包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。文献[视野,蛋白纯化:原理与实践(Scopes,Protein Purification:Principles and Practice)纽约:斯普林格出版社(Springer-Verlag) (1994)]描述了许多纯化重组(和非重组)蛋白质的一般方法。该方法可以包括例如离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、选择性沉淀、透析和疏水相互作用色谱。这些方法可以适于设计对细胞透性重组蛋白的纯化策略。如果细胞透性重组蛋白包括纯化柄(purification handle)如表位标记或金属螯合序列,则亲和色谱可用于容易地纯化蛋白质。
产生的蛋白的量可以通过直接(例如使用蛋白印迹分析)或间接(例如通过测定来自细胞的物质的特定DNA结合活性,如通过电泳迁移率变动分析) 检测高级大分子转导域来评价。蛋白质可以在纯化前、纯化的任何阶段或纯化后检测到。在一些实施方式中,纯化或完全纯化可能是不必要的。
通过本发明的方法制备的基因工程化的重组蛋白是细胞透性蛋白,并且可以用作基于蛋白的疫苗,尤其是在杀死或减毒的全生物体疫苗不能实践的情况下。
通过本发明的方法制备的细胞透性重组蛋白可以优选用于预防或治疗帕金森相关疾病。可以将细胞透性重组蛋白递送至细胞内部,消除了用重组载体转染或转化细胞的需要。本发明的细胞透性重组蛋白质可用于体外研究蛋白质功能,或可用于将细胞维持在希望的状态。
本发明的再另一种实施方式提供了包含作为活性成分的iCP帕金重组蛋白的组合物。
本发明的再另一种实施方式提供了用于治疗或预防帕金森病的药物组合物,所述药物组合物包含:作为活性成分的iCP帕金重组蛋白;以及药学上可接受的载体。
优选地,该组合物可以是可注射的(例如腹腔内、静脉内和动脉内等),对人来说,可以包括0.01mg/kg~30mg/kg,优选0.1mg/kg~10mg/kg,更优选0.1mg/kg~6mg/kg的量的活性成分。
例如,每日剂量通常落在约0.01~约30mg/kg体重的范围内。在成年人的治疗中,特别优选的是以单次剂量或分开剂量的方式为约0.1~约6mg/kg/ 天。然而,将理解的是,实际施用的iCP帕金重组蛋白的浓度由医师根据相关情况来确定,包括要治疗的病症,选择的施用途径,个体患者的年龄、体重和响应以及患者症状的严重程度,因此,上述剂量范围并不旨在以任何方式限制本发明的范围。在某些情况下,低于上述范围的下限的剂量水平可能是足够多的,而在其他情况下,仍可以使用更大的剂量而不引起任何有害的副作用,只要这种较大的剂量首先分成几个较小的剂量用于全天给药。
本发明的再另一种实施方式提供了细胞透性改善的(iCP)帕金重组蛋白作为治疗或预防帕金森相关疾病的药物的用途。
本发明的再另一种实施方式提供了包含iCP帕金重组蛋白的药物。
本发明的再另一种实施方式提供了iCP帕金重组蛋白在制备用于治疗或预防帕金森相关疾病的药物中的用途。
本发明的再另一种实施方式提供了治疗或预防受试者的帕金森相关疾病的方法,该方法包括鉴定需要治疗或预防帕金森相关疾病的受试者;以及将治疗有效量的iCP帕金重组蛋白施用于该受试者。
在本发明的一种实施方式中,受试者可以优选是哺乳动物。
除了活性成分以外,可以通过使用药学上合适的并且生理学上可接受的添加剂制备本发明的药物组合物,添加剂可以包括赋形剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、包衣剂、发泡剂、润滑剂、助流剂、调味剂等。
对于施用,除了上述活性成分之外,药物组合物可以优选地通过进一步包含一种或多种药学上可接受的载体来配制。
药物组合物的剂型可以包括颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、胶囊剂、栓剂、液体制剂、糖浆剂、汁液、混悬剂、乳剂、滴剂、注射用液体制剂等。为了将组合物配制成片剂或胶囊剂,例如,活性成分可以与任何口服且无毒的药学上可接受的惰性载体诸如乙醇、甘油、水等组合。如果需要或必要的话,可以另外包含合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂作为混合物。
合适的粘合剂的实例可以包括但不限于淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β- 乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶例如阿拉伯树胶、黄蓍胶或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂的实例可以包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。为了将组合物配制成液体制剂,可以使用无菌且生物相容的药学上可接受的载体,如盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、白蛋白输注溶液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇,并且这些物质可以单独使用或以其任意组合使用。如果必要,可以加入其它常用添加剂如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。进一步地,可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂来制备可注射制剂,如水溶液、悬浮液和乳液、或丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。此外,可以根据疾病和成分,使用本领域已知的任何适合的方法,优选地配置该组合物,所述方法如雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Science),麦克出版公司(Mack Publishing Company),Easton PA所公开。
优选地,治疗(treatment/treating)是指改善或稳定化受试者的病症或疾病;或预防或减轻与受试者的病症或疾病相关的症状的发展或恶化。
诊断患有帕金森病(PD)或处于帕金森病(PD)风险中的患者的方法是本领域中熟知的。存在联合使用的各种症状和诊断测试来诊断帕金森病。应该在一段时间内呈现出四种主要症状中的至少两种以使神经科医师考虑PD诊断。PD的四种主要运动症状是:颤动或震颤;运动缓慢,被称为运动迟缓;臂、腿或躯干的僵硬或僵化;以及平衡问题和可能跌倒,也被称为姿势不稳定。对受试者的症状、活动、药物、同时发生的医疗问题或可能的毒性暴露的回顾也可以用于诊断PD。
预防、防止和预防治疗在本文中用作同义词。它们特别包括:为了预防或延迟帕金森病的发生或显著程度的运动症状和/或进一步的多巴胺能神经元损失,尤其是黑质中的多巴胺能神经元损失,向不仅基本上存在,而且部分存在上述的帕金森病的四种主要症状中的至少两种的个体施用药物。
受试者和患者在本文中可互换使用。它们是指可能患有或易患疾病或病症 (例如PD),但可能有或可能没有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在某些实施方式中,受试者是人类。
优选地,有效的量(amount effective)或有效量(effective amount)是当施用于受试者以治疗疾病时,本文公开的活性成分或药物组合物足以实现这样的疾病治疗的量。患者的任何改善都被认为足以实现治疗。用于治疗帕金森病的本文公开的活性成分或药物组合物的有效量可以根据施用的方式、患者的年龄、体重和总体健康来变化。最终,开处方者或研究者将决定适当的用量和剂量方案。
在本发明的治疗和预防方案中,包括iCP帕金重组蛋白作为活性成分的组合物可以以常见方式经口、颊、直肠、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、经皮、局部、眼内或皮下途径施用,优选经腹膜内、静脉内或动脉内注射途径施用。
有益效果
本发明提供了基于关键因素(CF)人工构建的aMTD序列,所述关键因素克服了现有技术(MTM/MTS/MTD)的局限性,如有限的多样性和不可预测的细胞透性。基于确保细胞透性的CF,aMTD展示了与其现有技术相比,这些序列显示将生物活性大分子递送至活细胞的能力高达109.9相对倍数的提高。因此,本发明会允许它们实际有效地应用于分子递送、药物递送、蛋白治疗、胞内蛋白治疗、蛋白替代治疗、肽治疗、基因递送等。
随着溶解度和产量的提高,可以大量生产融合aMTD/SD的帕金重组蛋白。此外,重组蛋白的有效BBB透性克服了之前开发的抗神经退行性治疗的局限性。因此,本发明的重组iCP-Parkin蛋白将允许实际应用有效地治疗帕金森相关疾病。
然而,本发明的效果不限于上述效果,从以下描述本领域技术人员将清楚地理解未提及的其他效果。
附图说明
图1显示了融合aMTD的重组蛋白或融合r肽的重组蛋白的结构。根据本发明说明并构建了His标记的CRA重组蛋白的示意图。显示了用于亲和纯化 (白色)、用于aMTD或r肽(灰色)和用于货物A(CRA,黑色)的His标记。
图2a至图2c显示了用于与融合aMTD的重组蛋白或与融合r肽的重组蛋白的表达载体的构建。这些图显示了琼脂糖凝胶电泳分析,所述琼脂糖凝胶电泳分析显示了根据本发明,在645bp插入物处编码aMTDs或融合r肽的CRA 并克隆至pET28a(+)载体中的质粒DNA片段。
图3a至图3d显示了融合aMTD的重组蛋白或融合r肽的重组蛋白的诱导型表达。在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)菌株中转化表达的重组融合aMTD 的CRA重组蛋白或融合随机肽的CRA重组蛋白。通过SDS-PAGE监测用IPTG 诱导前(-)和诱导后(+)的大肠杆菌中的重组蛋白的表达,并用考马斯亮蓝染色。
图4a和图4b显示了融合aMTD的重组蛋白或融合r肽的重组蛋白的纯化。通过在自然条件下的Ni2+亲和色谱法纯化表达的重组蛋白。通过SDS-PAGE 分析显示重组蛋白的纯化。
图5a至图5u显示了aMTD介导的细胞透性的确定。显示了阴性对照(A: rP38)和参比疏水CPP(MTM12和MTD85)的细胞透性。将每种aMTD和/ 或r肽的细胞透性与缺少肽序列的货物蛋白(HCA)的细胞透性进行视觉上的比较。灰色阴影区表示未处理的RAW 264.7细胞(溶媒);细的浅灰色线表示用等摩尔浓度的FITC(仅FITC)处理的细胞;深粗线表示用FITC-his标记的 CRA蛋白(HCA)处理的细胞;以及,用与阴性对照(rP38)、参比CPP(MTM12 或MTD85)或新疏水CPP(aMTD)融合的FITC-蛋白(HMCA)处理的细胞以浅粗线显示,并且通过箭头指示。
图6a至图6c显示了r肽介导的细胞透性的测定。将每种aMTD和/或r 肽的细胞透性与缺少肽序列的货物蛋白(HCA)的细胞透性进行视觉上的比较。灰色阴影区表示未处理的RAW 264.7细胞(溶媒);细的浅灰色线表示用等摩尔浓度的FITC(仅FITC)处理的细胞;深粗线表示用FITC-his标记的 CRA蛋白(HCA)处理的细胞;以及,用与r肽融合的FITC-蛋白处理的细胞以浅粗线显示,并且通过箭头指示。
图7a至图7k显示了融合aMTD的重组蛋白的可视化细胞透性。在37℃下,用与aMTD融合的FITC标记的蛋白(10μM)处理NIH3T3细胞1小时。通过激光扫描共聚焦显微镜(LSM700版本)使蛋白的细胞透性可视化。
图8a至图8b显示了融合r肽的重组蛋白的可视化细胞透性。通过激光扫描共聚焦显微镜(LSM700版本)使融合r肽的重组蛋白的细胞透性可视化。
图9a至图9c显示了与阴性对照(rP38)相比,融合aMTD的重组蛋白的相对细胞透性。图显示了比较与aMTD融合的重组蛋白和阴性对照(A:rP38) 的细胞透性的图。
图10a至图10c显示了与参比CPP(MTM12)相比融合aMTD的重组蛋白的相对细胞透性。图显示了比较与aMTD融合的重组蛋白和参比CPP (MTM12)的细胞透性的图。
图11a至图11c显示了与参比CPP(MTD85)相比融合aMTD的重组蛋白的相对细胞透性。图显示了比较与aMTD融合的重组蛋白和参比CPP (MTD85)的细胞透性的图。
图12显示了与aMTD的平均细胞透性相比,r肽介导的重组蛋白的相对细胞透性。图显示了比较与r肽融合的重组蛋白的细胞透性和aMTD的细胞透性(平均值:aMTD AVE)的图。
图13a和图13b显示了aMTD序列中细胞透性与氨基酸组成的关联性。这些图显示氨基酸组成(A、I、V和L)所影响的aMTD的递送潜力(几何平均数)。
图14a和图14b显示了aMTD中细胞透性与关键因素的关联性。这些图显示了细胞透性与关键因素[弯曲潜力:脯氨酸位置(PP),刚性/柔性:不稳定指数(II),结构特征:脂肪族指数(AI)和亲水性:亲水性总平均值(Grand Average of Hydropathy,GRAVY)]的关联性。
图15a和图15b显示了aMTD介导的细胞透性与关键因素的相对相关性。检测在aMTD的递送潜力中10种等级高的aMTD和10种等级低的aMTD的细胞透性与关键因素[弯曲潜力:脯氨酸位置(PP),刚性/柔性:不稳定指数 (II),结构特征:脂肪族指数(AI)和亲水性:亲水性总平均值(GRAVY)] 的关联性。
图16显示了r肽介导的细胞透性与亲水性范围(GRAVY)的相对相关性。该图和表说明了r肽介导的细胞透性与其亲水性范围(GRAVY)的相对相关性。
图17显示了融合His-aMTD/SD的帕金重组蛋白的示意图。说明并根据本发明构建了具有细胞透性的His-aMTD-SD-帕金重组蛋白的示意图。重组帕金融合蛋白的设计包括用于亲和纯化的组氨酸标记 (MGSSHHHHHHSSGLVPRGS(SEQ ID NO:2),白色)、货物(帕金蛋白,灰色)、aMTD(黑色)、SDA(点)和SDB(阴影部分)。
图18显示了琼脂糖凝胶电泳分析,该琼脂糖凝胶电泳分析显示了根据实施例6的克隆至pET28a(+)载体的编码融合aMTD-SD-的帕金蛋白的质粒DNA 片段插入物。
图19和图20显示了根据实施例7-1在大肠杆菌中的iCP-帕金重组蛋白的表达、纯化和溶解度/产量,以及根据实施例7-2的帕金重组蛋白的溶解度/产量。
图21a和图21b显示了根据实施例7-2,与阴性对照(HP)相比,融合 aMTD-SD的帕金重组蛋白(HM321PSA和HM321PSB)的相对产量(图21a),以及与阴性对照(HP)相比,融合SDB的帕金重组蛋白(HPSB)的相对产量(图21b)。
图22显示了通过根据实施例7-2的各种aMTD制备的融合aMTD-SD的帕金重组蛋白的溶解度/产量、透性和生物活性。
图23显示了根据实施例9的与阴性对照(rP38)相比以及与之前开发的 CPP(MTM12和MTD85)相比aMTD321-介导的细胞透性。灰色阴影区域表示未处理的RAW264.7细胞(溶媒);每条线从左开始表示:FITC-融合的细胞(仅 FITC);与具有FITC标记的SDA融合的组氨酸(HSA);组氨酸标记的CPP (MTM12、MTM85和aMTD321)重组蛋白(HMSA)。
图24显示了根据实施例10的aMTD介导的胞内定位。
图25显示了根据实施例11-1的PBMC中的HM321PSB的体内细胞摄取(上图:IP后15分钟;下图:IP后30分钟)。
图26显示了根据实施例11-2的帕金重组蛋白的aMTD介导的细胞透性的确定。
图27显示了根据实施例12的体内帕金重组蛋白的组织分布。
图28a至图28c和图29显示了通过根据实施例13的蛋白印迹(图28a) 和免疫印迹(图29)分析确定的aMTD-介导的帕金重组蛋白向脑的递送。
图30显示了根据实施例14-1的aMTD介导的帕金重组蛋白的泛素化和自泛素化(auto-ubiquitination)活性。
图31和图32显示了根据实施例14-2的多巴胺能的CATH.a细胞(图31) 和SH-SY5Y细胞(图32a和图32b)凋亡的抑制。显微照片代表3次独立的实验,按照平均值±S.D.绘制(下图)。组间的实验差异通过学生两配对t检验来评估(*p,0.05)。
图33显示了通过根据实施例14-3的帕金重组蛋白降解α-突触核蛋白聚集体。
图34显示了根据实施例15的MPTP诱导的PD小鼠模型的方案。
图35显示了用根据实施例16的帕金重组蛋白处理的MPTP诱导的PD小鼠的尿中的多巴胺。
图36显示了用根据实施例17的重组蛋白处理的MPTP诱导的PD小鼠的脑中的多巴胺。
图37显示了用根据实施例18的帕金重组蛋白处理的MPTP损伤的小鼠的粗大运动功能的保留。
图38至图40显示了根据实施例19-1的步态测试中的足迹图案(图38)、步幅长度(图39)和摇摆长度(图40)的确定。
图41显示了通过根据实施例19-2的旋棒试验(Rota-rod test)用帕金重组蛋白处理的用MPTP损伤的小鼠的运动活动的恢复。
图42a显示了通过根据实施例20的帕金重组蛋白的黑质和纹状体中的多巴胺能神经元。
图42b显示了通过根据实施例20的帕金重组蛋白的黑质中的多巴胺能神经元的恢复作用。
图43显示了在根据实施例20的亚急性MPTP诱导的PD模型中通过iCP 帕金重组蛋白对TH表达的恢复。
具体实施方式
1.分析参比疏水CPP以鉴定用于开发高级MTD的‘关键因素’
之前报道的MTD选自对多于1,500种信号肽序列的筛选。虽然已开发的 MTD不具有共同序列或序列基序,但是它们均来源于除了其疏水性和采用α螺旋构型的趋势以外也缺少共同序列或基序的信号序列(HRSS)的疏水(H) 区。H区序列的广泛变异可能反映具有膜易位活性和随后适应SRP/Sec61机制的蛋白的现有进化,所述膜易位活性和随后适应SRP/Sec61机制利用SRP中富含甲硫氨酸的信号肽结合袋,以适应各种各样的信号肽序列。
之前描述的疏水CPP(例如MTS/MTM和MTD)来源于存在于分泌蛋白和细胞表面蛋白的信号肽中的疏水区。现有技术由以下组成:第一,H区序列 (MTS/MTM)的特别使用,以及第二,具有选自对1,500种信号序列(MTM) 的筛选的最高CPP活性的H区序列(具有和没有修饰)的特别使用。第二种现有技术,来源于修饰的H区的疏水CPP序列在多样性上具有进步,具有除了来源于成纤维细胞生长因子(FGF)4的MTS/MTM之外的很多可用序列。然而,可以由天然存在的分泌蛋白修饰的MTD的数目是有些局限的。因为不存在确定它们的细胞透性的规则集,所以在测试它们之前不能进行对修饰的 MTD序列的细胞透性的预测。
疏水CPP如疏水CPP所来源的信号肽,不符合共有序列,并且当它们与蛋白货物合并时,对蛋白溶解性具有不良作用。因此,我们着手鉴定最佳序列和结构决定因素(即关键因素(CF)),以设计新的疏水CPP,所述新的疏水 CPP具有将包括蛋白的大分子货物递送至细胞和组织同时保持蛋白的溶解性的提高的能力。这些新开发的CPP,高级大分子转导域(aMTD)允许几乎无限数目的可以基于关键因素设计和开发的可能设计。另外,在进行任何体外和 /或体内实验之前,通过对这些新开发的CPP的特征分析可以预测它们的细胞透性。通过分析所有公布的参比疏水CPP,已经开发了下面这些关键因素。
1-1.疏水CPP的分析
选择了从1995年至2014年公布(表2)的17种不同的疏水CPP(表1)。在分析了选择的疏水CPP的生理特性和化学特性后,选择了可能与细胞透性相关的11种不同的特性用于进一步分析。这11种特性如下:序列、氨基酸长度、分子量、pI值、弯曲潜力、刚性/柔性、结构特征、亲水性、残基结构、氨基酸组成和序列的二级结构(表3)。
表1显示了所选择的公布的疏水性细胞穿透肽的总结。
[表1]
表2总结了参考文献信息
[表2]
表3显示了所分析的公布的疏水性细胞穿透肽(A)的特性。
[表3]
使用两个肽/蛋白质分析程序(ExPasy:SoSui: http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html),以确定肽序列的各种指数和结构特征以及设计新序列。下面是所分析的重要因素:
1-2.分析的肽的特性:长度、分子量和pI值
分析的肽的平均长度、平均分子量和平均pI值分别是10.8±2.4、1011±189.6 和5.6±0.1(表4)。
表4总结了所分析的公布的疏水性细胞穿透肽(A)的关键因素(CF)。
[表4]
1-3.分析的肽的特性:弯曲潜力-脯氨酸的位置(PP)
基于脯氨酸(P)是否存在和/或在重组蛋白中向肽提供弯曲潜力的氨基酸所在的位置,确定弯曲潜力(弯曲或无弯曲)。脯氨酸与其他常见氨基酸的区别在于它的侧链与骨架氮原子以及α-碳原子键合。所得的环状结构显著影响通常在折叠肽/蛋白链的弯曲中发现的蛋白的结构。
17种中的11种被确定为“弯曲”肽,这表示脯氨酸存在于序列中部,用于使肽弯曲和/或位于肽的末端,用于使蛋白弯曲。如上所述,肽序列可以以“弯曲”的构型穿透质膜。因此,弯曲潜力或无弯曲潜力被认为是用于改进目前的疏水CPP的关键因素之一。
1-4.分析的肽的特性:刚性/柔性-不稳定指数(II)
因为任何肽的关键结构特征之一是基于基序是刚性或柔性的(其是肽序列的完整物理化学特性),所以确定了序列的不稳定指数(II)。虽然表示肽的刚性/柔性的指数值是极其不同的(8.9~79.1),但是平均值是40.1±21.9,这说明肽应该在一定程度上是柔性的,但是不能过于刚性或柔性的(表3)。
1-5.分析的肽的特性:结构特征-结构特征(脂肪族指数:AI)和亲水性(亲水性总平均值:GRAVY)
丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)含有脂肪族侧链,并且是疏水的-即,它们具有对水的厌恶(aversion),并喜欢聚集。具有疏水性和脂肪族残基的这些氨基酸使它们包装在一起以形成几乎没有孔的致密结构。分析的肽序列显示,所有组成氨基酸都是疏水的(A、V、L和I)(除了17种肽中仅一种肽(MTD10-表3)中的甘氨酸(G)以外),并且是脂肪族的(A、V、L、I和P)。它们的亲水指数(亲水性总平均值:GRAVY)和脂肪族指数(AI)分别是2.5±0.4和217.9±43.6。表3中还表明了它们的氨基酸组成。
1-6.分析的肽的特性:二级结构(螺旋性)
如上文所解释的,在以疏水序列具有α-螺旋构象的“弯曲”构型插入膜后,可以假定CPP序列直接穿透质膜。另外,我们的分析强有力地表明了弯曲潜力对膜穿透是关键的。因此,进行肽的结构分析以确定序列是否会形成螺旋。九种肽是螺旋,八种肽不是螺旋(表3)。这似乎说明螺旋结构可能是不需要的。
1-7.关键因素(CF)的确定
在分析的11种特性中,选择了下面6种,即用于开发新的疏水CPP-高级 MTD的‘关键因素’:氨基酸长度、弯曲潜力(脯氨酸的存在和位置)、刚性/ 柔性(不稳定指数:II)、结构特征(脂肪族指数:AI)、亲水性(GRAVY) 和氨基酸组成/残基结构(疏水性脂肪族A/a)(表3和表4)。
2.分析选择的疏水CPP以优化‘关键因素’
因为之前在过去20年间开发的17种不同的疏水CPP的分析数据(分析 A,表3和表4)显示了高变异性,并且难以产生共同或共有特征,也进行了分析B(表5和表6)和分析C(表7和表8)以优化用于更好地设计改进的 CPP-aMTD的关键因素。因此,将17种疏水CPP分为两组,并且分析各组的与细胞透性性质相关的特性。通过比较和对比各组的分析数据以及确定可能对细胞透性性质关键的共同的同源特征,优化了关键因素。
2-1.用于在体内生物活性货物蛋白的肽的选择性分析(B)
在分析B中,在体内与每种生物活性货物一起使用8种CPP。长度为11±3.2,但8种CPP中有3种具有小的弯曲潜力。刚性/柔性(不稳定指数: II)是41±15,但是移除一种肽[MTD85:刚性的,具有最小的II(9.1)]使总不稳定指数提高至45.6±9.3。这说明柔性越高(40或更高的II)可能越好。8 种CPP的所有其他特性与分析A相似,包括结构特征和亲水性(表5和6)。
表5显示了公布的疏水性细胞穿透肽(B):在体内用于每种货物的选择的CPP的特性。
[表5]
*移除MTD85使II提高至45.6±9.3
表6显示了公布的疏水性细胞穿透肽(B)的关键因素总结
[表6]
2-2.提供弯曲潜力和更高柔性的肽的选择性分析(C)
为了优化‘关键因素的共同范围和/或共有特征’用于aMTD和随机肽(rP 或r肽)的实际设计(旨在证明分析A、分析B和分析C中确定的‘关键因素’对改进疏水CPP目前的问题-即与MTS/MTM或MTD融合的重组蛋白的蛋白聚集、低溶解度/产量和细胞/组织透性差,以及肽的非共同序列和非同源结构),分析了经验选择的肽的结构特征和生理化学因素指数。
未选择不具有弯曲潜力、刚性或太过柔性的序列(太低或太高的不稳定指数),或太低或太高的疏水性的CPP,但是没有考虑二级结构,因为序列的螺旋结构是不需要的。
在分析C中,最后分析了可提供弯曲潜力和更高柔性的8种选择的CPP 序列(表7和表8)。共同氨基酸长度是12(11.6±3.0)。脯氨酸存在于序列的中部和/或末端。刚性/柔性(II)是45.5~57.3(平均数:50.1±3.6)。表示肽的结构特征和疏水性的AI和GRAVY分别是204.7±37.5和2.4±0.3。所有肽与疏水性脂肪族氨基酸(A、V、L、I和P)一致。因此,分析C被选择为用于新的疏水CPP-aMTD的新设计的标准。
表7显示了公布的疏水性细胞穿透肽(C):提供弯曲潜力和更高的柔性的选择的CPP的特征。
[表7]
表8显示了公布的疏水性细胞穿透肽(C)的关键因素的总结。
[表8]
3.基于优化的关键因素的改进的疏水CPP-aMTD的新设计
3-1.共同序列和/或共同同源结构的确定
如上文提及的,来源于信号序列的CPP(MTS/MTM和MTD)的H区 (HRSS)不具有共同序列、序列基序和/或共同结构同源特征。在本发明中,目的是开发共同序列基序和结构基序形式的改进的疏水CPP,所述共同序列基序和结构基序满足新确定的‘关键因素’而具有“共同功能”,即促进蛋白以与分析的参比CPP相似的机制穿过膜而转运。基于分析A、B和C,分析了共同的同源特征以确定影响细胞透性的关键因素。每个关键因素的范围值确定为包括来自分析A、B和C的每个关键因素的分析指数以设计新的aMTD(表9)。实验性地用新设计的aMTD的细胞透性确认了这些特征。
表9显示了分析的CPP的值和针对新的aMTD序列的新设计确定的值之间的每个关键因素的范围/特征的比较。
[表9]
在表9中,提供了通用的共同特征和序列/结构基序。长度为9~13个氨基酸,提供了弯曲潜力,其中脯氨酸存在于用于肽弯曲的序列中部(在5′、6′、 7′或8′氨基酸处)和存在于用于重组蛋白弯曲的肽的末端,并且表9中描述了 aMTD的刚性/柔性为II>40。
3-2.开发高级MTD的关键因素
之前报道了与疏水CPP融合的、用于将包括蛋白的治疗活性货物分子递送至活细胞的重组细胞透性蛋白,但是表达于细菌系统中的融合蛋白由于它们的低溶解度和低产量而难以被纯化为可溶形式。为了处理将细胞透性蛋白作为蛋白基生物治疗剂进行进一步临床开发的关键弱点,最近通过基于关键因素的肽的分析,开发了极大改进形式的疏水CPP,被称为高级MTD(aMTD)。用于aMTD的本发明的关键因素在此处(表9)。
1.氨基酸长度:9-13
2.弯曲潜力(脯氨酸位置:PP):脯氨酸存在于序列的中部(从5′至8′氨基酸)和末端
3.刚性/柔性(不稳定指数:II):40-60
4.结构特征(脂肪族指数:AI):180-220
5.亲水性(GRAVY):2.1-2.6
6.氨基酸组成:疏水性脂肪族氨基酸-A、V、L、I和P
3-3.考虑且满足所有关键因素的潜在最佳的aMTD的设计
在仔细考虑来源于对疏水CPP的独特特征的分析的六种关键因素后,基于满足由所述分析确定的包括氨基酸长度(9-13)的关键因素的共同的12个氨基酸平台,设计并开发了高级大分子转导域(aMTD)。
[通式]
与之前公布的需要很多实验以确定它们的细胞透性的疏水CPP不同,使用上述平台以遵循每个关键因素的确定的范围值/特征,通过进行如下很少的几个步骤,可以设计新开发的aMTD序列。
第一,制备用于aMTD的12个氨基酸的序列平台。第二,将脯氨酸(P) 置于序列的末端(12′),并且确定在5′、6′、7′和8′中的4个U中的1个放置脯氨酸。第三,将丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I) 置于未放置脯氨酸的X和/或U处。最后,确定基于平台设计的氨基酸序列是否满足6种关键因素的值或特征,以确保aMTD序列的细胞透性性质。通过这些过程,构建了许多新的aMTD序列。用于制备融合于每个aMTD的无功能货物重组蛋白的表达载体,构建了表达载体,并且迫使表达载体在细菌细胞中表达。以可溶形式纯化这些融合aMTD的重组蛋白,并且定量地确定其细胞透性。新设计了aMTD序列并且从1至240编号,如表10-15所示。在表 10-15中,序列ID号是用于参考的序列表,aMTD号是指实际上在实验中使用的氨基酸列表编号。对于进一步的实验,使用了aMTD号。另外,将序列表中显示的多核苷酸序列从SEQ ID NO:241至SEQ ID NO:480编号。
表10至表15显示了开发以满足所有关键因素的240种新的疏水aMTD 序列。
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
[表14]
[表15]
3-4.不满足至少一个关键因素的肽的设计
为了证明满足所有上文描述的关键因素的本发明的新疏水CPP-aMTD是正确的并且是合理设计的,还设计了不满足至少一个关键因素的肽。总共设计和开发了31种r肽(rP),并将这31种r肽(rP)如下分类:无弯曲肽,在中部以及末端没有脯氨酸和/或没有中部脯氨酸;刚性肽(II<40);过于柔性的肽;芳香族肽(存在芳香环);疏水且非芳香族肽,但具有除A,V,L,I,P 或另外的脯氨酸残基以外的氨基酸;亲水的但非脂肪族肽。
3-4-1.不满足弯曲潜力的肽
表16显示了在序列的中部(在5′、6′、7′或8′处)和末端不具有任何脯氨酸的肽。此外,表16描述了在序列的中部不具有脯氨酸的肽。所有这些肽被假定不具有弯曲潜力。
[表16]
3-4-2.不满足刚性/柔性的肽
为了证明序列的刚性/柔性是重要的关键因素,还设计了刚性(平均II: 21.8±6.6)序列和柔性过高的序列(平均II:82.3±21.0)。表17中显示了不稳定指数远远低于新aMTD的不稳定指数的刚性肽(II:41.3-57.3,平均II: 53.3±5.7)。表18还提供了II远远高于新aMTD的II的弯曲但柔性过高的肽。
[表17]
[表18]
3-4-3.不满足结构特征的肽
新的疏水CPP-aMTD仅与疏水性脂肪族氨基酸(A、V、L、I和P)一致,指数的平均范围:AI:180~220和GRAVY:2.1~2.6(表9)。基于结构指数,表19中显示了含有芳香族残基(W、F或Y)的肽,以及设计了疏水,不具有芳香族序列的疏水但具有除A,V,L,I,P或另外的脯氨酸残基以外的氨基酸序列的肽(表20)。最后,表21显示了与非脂肪族氨基酸一致的亲水和/ 或弯曲肽。
[表19]
[表20]
[表21]
3-5.新设计的肽的总结
基于关键因素,设计了总共457种序列。满足关键因素的所有范围/特征的所设计的可能最好的aMTD(疏水的、柔性的、弯曲的、脂肪族的和12个氨基酸(A/a)长度的肽)为316种。不满足关键因素中的至少一种的设计的 r肽为141种,其中非弯曲肽序列为26种;刚性肽(II<40)序列为23种;过于柔性的肽为24种;芳香族肽(存在芳香环):27种;疏水但非芳香族肽为 23种;以及亲水但非脂肪族肽为18种。
4.与aMTD和r肽融合的重组报告蛋白的制备
将与aMTD和其他[r肽、参比疏水CPP序列(MTM和MTD)]融合的重组蛋白在细菌系统中表达,用一步亲和色谱法纯化,以及制备为生理条件下的可溶性蛋白。通过利用流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜技术测试这些重组蛋白的细胞透性的能力。
4-1.选择货物蛋白用于与肽序列融合的重组蛋白
对于临床/非临床应用,融合aMTD的货物物质会是可以是以下中的一种的生物活性分子:酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片段。此外,生物活性分子可以是以下大分子中的一种:酶、激素、载体、免疫球蛋白、膜结合蛋白、跨膜蛋白、内在蛋白(internalprotein)、外在蛋白(external protein)、分泌蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、片段化蛋白、二硫键结合的蛋白 (disulphide bonded proteins)、重组蛋白、化学修饰蛋白和朊病毒。此外,这些生物活性分子可以是以下中的一种:核酸、编码核酸序列、mRNA、反义 RNA分子、碳水化合物、脂质和糖脂。
根据这些预先要求的条件,选择了用于评价aMTD介导的蛋白摄取的无功能货物,并将其称为货物A(CRA),所述货物A是可溶的和无功能的。域 (氨基酸(A/a)289~840;184个氨基酸(A/a)长度)来源于蛋白S(基因库 (Genbank)ID:CP000113.1)。
4-2.表达载体的构建和重组蛋白的制备
由PCR扩增的DNA片段,将与每种aMTD融合的重组蛋白的编码序列克隆在pET-28a(+)(Novagen,Darmstadt,Germany)中的Ndel(5′)和SalI(3′)。由SEQ ID NO:481~797表示用于与aMTD和r肽融合的重组蛋白的PCR引物。图1显示了重组蛋白的结构。
迫使重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达,所述大肠杆菌BL21 (DE3)细胞生长至OD600为0.6并且以0.7mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导2小时。通过Ni2+亲和色谱法如供应商(Qiagen,Hilden,Germany) 所指示的在自然条件下纯化蛋白。纯化后,将纯化的蛋白溶于生理缓冲液如 DMEM培养基中。
[表22]
4-3.与aMTD或随机肽(rP)融合的重组蛋白的表达
本发明还涉及具有细胞透性的aMTD序列的开发方法。使用标准化的6 种关键因素,设计了316个aMTD序列。此外,还开发了缺少这些关键因素中的一种的141种r肽:非弯曲肽:i)在序列的中部和末端均缺少脯氨酸或 ii)在序列的中部或末端缺少脯氨酸;刚性肽;过于柔性的肽;芳香族肽(存在芳香环);疏水但非芳香族肽;亲水但非脂肪族肽(表22)。
设计这些r肽为与aMTD比较和对比,以分析关于肽的胞内递送潜力的每种关键因素的结构/序列活性关系(SAR)。含有所有肽(aMTD或r肽)的重组蛋白与CRA融合以提高将要表达、纯化、制备和分析的重组蛋白的溶解度。
将与CRA融合的这些设计的316种aMTD和141种r肽全部克隆(图2) 并测试它们在大肠杆菌中的诱导型表达(图3)。在这些肽中,诱导型表达、纯化并且以可溶性形式制备240种aMTD(图4)。此外,还将31种r肽制备为可溶性形式(图4)。
为了制备与r肽融合的蛋白,表达了以下60种蛋白,其是:非弯曲肽类别中的26种r肽中的10种(表16);刚性肽[不稳定指数(II)<40]类别中的 23种r肽中的15种(表17);过于柔性的肽类别中的24种r肽中的19种(表 18);芳香族肽类别中的27种r肽中的6种(表19);疏水但非芳香族肽类别中的23种r肽中的8种(表20);以及亲水但非脂肪族肽类别中的18种r肽中的12种(表21)。
4-4.与aMTD融合的重组蛋白的定量细胞透性
将aMTD和r肽荧光标记,并且基于细胞透性的关键因素,通过使用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜技术进行比较(图5至图8)。在共聚焦激光扫描显微镜技术允许视觉地评价胞内摄取的同时,可以用流式细胞术定量评价融合肽的无功能货物重组蛋白的细胞摄取。分析包括与阴性对照[rP38]融合的重组蛋白,所述阴性对照[rP38]具有与aMTD(疏水性脂肪族序列)相反的特性(亲水性芳香族序列:YYNQSTCGGQCY)。还分析了aMTD与阴性对照的相对细胞透性(相对倍数)(表23和图9)。
表23显示了aMTD与阴性对照(A:rP38)的细胞透性的比较分析。
[表23]
*相对倍数(aMTD的几何平均数与rP38的对比)
还分析了aMTD与参比CPP[B:MTM12(AAVLLPVLLAAP),C:MTD85 (AVALLILAV)]的相对细胞透性(相对倍数)(表40和表41)。
表24显示了aMTD与参比CPP(B:MTM12)的细胞透性的对比分析。
[表24]
*相对倍数(aMTD的几何平均数与MTM12的对比)
表25显示了aMTD与参比CPP(C:MTD85)的细胞透性的对比分析。
[表25]
*相对倍数(aMTD的几何平均数与MTD85的对比)
将从缺少任何肽(rP38或aMTD)的裸蛋白(组氨酸标记的CRA蛋白) 的几何平均数中减去的阴性对照(组氨酸标记的融合rP38的CRA重组蛋白) 的几何平均数标准化为相对倍数为1。240种aMTD与阴性对照(A类)的相对细胞透性显著增加高达164倍,平均增加19.6±1.6(表26至表31)。
[表26]
[表27]
[表28]
[表29]
[表30]
此外,与参比CPP(B类:MTM12和C类:MTD85)相比,新的240种 aMTD的细胞透性平均分别高13±1.1倍(最大为109.9)和6.6±0.5倍(最大为55.5)(表26至表31)。
[表31]
*相对倍数(aMTD的几何平均数与rP38、MTM12或MTD85的对比)
此外,将31种r肽的细胞透性与240种aMTD的细胞透性进行了比较 (0.3±0.04;表32和表33)。
[表32]
[表33]
*240种aMTD中,与A类(rP38)相比aMTD的平均相对倍数是19.6倍。
总之,aMTD的相对细胞透性的最大值显示分别比rP38、MTM12和MTD85的细胞透性高164.0、109.9和55.5倍。总共240个aMTD序列的平均值中,显示细胞透性分别比rP38、MTM12和MTD85的细胞透性高19.6±1.6、13.1±1.1和6.6±0.5倍(表26至表31)。阴性对照(rP38)相对于240种aMTD 的细胞透性仅为0.3±0.04倍。
4-5.与aMTD融合的重组蛋白的胞内递送和定位
通过激光扫描共聚焦显微镜技术,用阴性对照(rP38)和用之前公布的 CPP作为阳性对照参比,测试与aMTD融合的重组蛋白以确定其胞内递送和定位。在37℃下,将NIH3T3细胞暴露于10μM的FITC标记的蛋白中1小时,并用DAPI复染细胞核。然后,通过共聚焦扫描显微镜技术检测细胞(图7)。与aMTD融合的重组蛋白清楚地显示了显著高于参比CPP(MTM12和MTD85)的胞内递送和胞浆定位(图7)。融合rP38的重组蛋白不显示内化的荧光信号(图7a)。此外,如图8所示,r肽(融合于每种r肽的组蛋白(his) 标记的CRA重组蛋白)显示更低的或没有细胞透性。
4-6.定量和可视化新开发的aMTD的细胞透性的总结
融合组氨酸标记的aMTD的货物重组蛋白在它们的溶解度和产量方法大大提高。因此,还测试了FITC缀合的重组蛋白以定量和可视化蛋白的胞内定位,并且证实了与参比CPP相比更高的细胞透性。
在之前使用来源于疏水信号序列的CPP(即MTS/MTM或MTD)的研究中,鉴定并且分析了17种公布的序列的各种特性,如长度、分子量、pI值、弯曲潜力、刚性、柔性、结构特征、亲水性、氨基酸残基和组成,以及肽的二级结构。基于序列的这些分析数据,发明了指定为高级MTD(aMTD)的新的人工肽序列和非天然肽序列,并且用融合aMTD的重组蛋白确定了它们在胞内递送潜力中的功能活性。
与含有r肽和/或参比疏水CPP(MTM12和MTD85)的重组蛋白相比,融合aMTD的重组蛋白促进了蛋白转导入细胞的能力。根据结果,证明了细胞穿透肽序列的关键因素起到了确定肽通过穿透质膜介导的胞内递送的主要作用。此外,通过遵循所有满足关键因素的原理,可以大大改进细胞透性。
5.aMTD在递送潜力上的结构/序列活性关系(SAR)
在确定新aMTD的细胞透性之后,针对在选择的某些新aMTD和所有新 aMTD的每种关进因素分析了结构/序列活性关系(SAR)(图13至图16和表 34)。
[表34]
5-1.脯氨酸位置:关于弯曲潜力(脯氨酸位置:PP),与脯氨酸位置在序列的5′或6′的序列相比,脯氨酸位于aMTD序列中的7′或8′氨基酸的aMTD具有高得多的细胞透性(图14a和图15a)。
5-2.亲水性:此外,当aMTD具有2.1~2.2的GRAVY(亲水性总平均值) 时,这些序列显示相对更低的细胞透性,而具有2.3~2.6的GRAVY的aMTD 显显示显著更高的细胞透性(图14b和图15b)。
5-3.r肽SAR:对于aMTD的SAR,r肽显示了在细胞透性方面相似的 SAR相关性,与它们的脯氨酸位置(PP)和亲水性(GRAVY)相关。这些结果证实了具有高GRAVY的r肽具有更好的细胞透性(图16)。
5-4.氨基酸组成的分析:除了脯氨酸位置和亲水性以外,还分析了氨基酸组成的不同。因为aMTD是基于关键因素设计的,因此每种融合aMTD的重组蛋白在组成上具有相同的两种脯氨酸序列。其他疏水性脂肪族氨基酸(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)结合以形成aMTD肽序列的剩余部分。
丙氨酸:在氨基酸的组成中,结果没有显示丙氨酸的数目在aMTD递送潜力方面的显著不同,因为所有aMTD具有3~5个丙氨酸。然而在序列中, 4个丙氨酸组成显示最有效的递送潜力(几何平均数)(图13a)。
亮氨酸和异亮氨酸:而且,在aMTD序列中的异亮氨酸和亮氨酸的组成显示氨基酸(I和L)数目和aMTD递送潜力的反比关系。序列中更低数目的异亮氨酸和亮氨酸倾向于具有更高的递送潜力(几何平均数)(图13a和图 13b)。
缬氨酸:相反地,aMTD序列的缬氨酸组成显示与它们的细胞透性呈正相关。当序列中的缬氨酸数目低时,aMTD的递送潜力也相对地低(图13b)。
选择了具有最高的细胞透性的10种aMTD(平均几何平均数:2584±126)。各序列中的缬氨酸的平均数目是3.5;具有相对低的细胞透性(平均几何平均数:80±4)的10种aMTD平均具有1.9个缬氨酸氨基酸。各序列中的缬氨酸的平均数目降低,同时它们的细胞透性也降低,如图13b所示。与更高细胞透性的aMTD组相比,更低细胞透性的序列中的缬氨酸组成平均为1.9。因此,为了获得高细胞透性的序列,序列中应该由平均2~4个缬氨酸组成。
5-5.SAR分析的结论:如图15所见,检测了所有240种aMTD的细胞透性与关键因素:弯曲潜力(PP)、刚性/柔性(II)、结构特征(AI)和亲水性 (GRAVY)、氨基酸长度和组成的这些相关性。通过该分析,当aMTD的中部脯氨酸位置在5′或6′处,以及GRAVY为2.1或更低时,aMTD的细胞透性倾向于更低(图15)。此外,在研究10种更高细胞透性的aMTD和10种更低细胞透性的aMTD后,这些趋势清晰地显示为证实细胞透性与中部脯氨酸位置和亲水性的相关性。
6.关键因素的指数范围/特征的实验性证实
在进行实验和SAR分析之前,经验性地和实验性地确定6种关键因素中的5种的范围和特征也被包括在最初提出的关键因素的指数范围和特征中。在新开发的240种aMTD的关键因素的指数范围和特征方面,弯曲潜力(脯氨酸位置:PP)、刚性/柔性(不稳定指数:II)、结构特征(脂肪族指数:AI)、亲水性(GRAVY)、氨基酸长度和组成均在来源于对参比疏水CPP分析的关键因素的特性中。
因此,经验性和实验性地证实了我们对设计和开发新疏水CPP序列为高级MTD的假设,并证明了基于关键因素的新aMTD的原理设计是正确的。
[表35]
7.用通过aMTD实现的MITT发现与开发基于蛋白的新生物治疗剂用于蛋白治疗
基于关键因素,设计和开发了aMTD序列。实际地确定了所有240种aMTD (疏水性、柔性、弯曲、脂肪族和12个a/a长度的肽)的定量和可视化的细胞透性。
为了测量aMTD的细胞透性,还设计并测试了r肽。如图13至图15所见,存在肽的细胞透性和关键因素的显著相关性。从这些关键因素中,我们能够设置最有效的细胞透性aMTD具有12个氨基酸的长度;A、V、L、I和P的组成;位于7′或8′和末端(12′)的多个脯氨酸;41.3~57.3的不稳定指数;187.5 ~220.0的脂肪族指数;以及2.2~2.6的亲水性(GRAVY)。
这些检测的关键因素在我们为我们的关键因素设置的范围内,因此我们能够证实,与在过去的20年间报道的参比疏水CPP相比,满足这些关键因素的 aMTD具有相对高的细胞透性和高得多的胞内递送潜力。
广泛明显的是许多人类疾病是由导致突变如功能获得或功能缺失的缺乏或过表达的蛋白导致的。如果在短时间内(可能在1或2小时内)可以以定量方式递送生物活性蛋白以替换异常蛋白,那么根据可能需要蛋白的时间和方式可以调节剂量。本发明中通过显著改进新aMTD的溶解度和产量(表31),可以预期aMTD作为将治疗性大分子(如蛋白、肽、核酸和其他化合物)有效递送至活细胞以及活哺乳动物(包括人)的试剂的实际潜力。因此,可以在确定最佳的货物-aMTD关系之后,利用新aMTD组合(240种)的新开发的MITT 可以用作平台技术,用于发现与开发基于蛋白的生物治疗剂,以获得胞内蛋白治疗。
8.用于开发iCP-帕金蛋白的新的疏水性CPP-aMTD
8-1.针对细胞透性选择aMTD
从240种aMTD中,选择12种aMTD,并将其用于构建iCP帕金重组蛋白。下表36中显示了12种aMTD。
各种疏水性CPP已经用于增强蛋白货物至哺乳动物细胞和组织的递送。相似地,如通过流式细胞术评估的,已经发现aMTD321和aMTD524增强 RAW264.7细胞中的His标记的增溶域A的编码序列的摄取。蛋白摄取的相对水平是含有第1代CPP(膜转位基序)的参比MTM12蛋白的蛋白摄取的7倍,是含有第2代CPP(大分子转导域)的MTD85参比蛋白的蛋白摄取的2.9倍。另外,用与SDA融合的随机肽重组蛋白(rP38)观察到的相对8.1倍高的蛋白摄取,所述SDA是具有与aMTD相反的特性的肽序列(图23)。使用荧光显微镜在NIH3T3细胞中监测蛋白摄取获得了相似的结果。图24中显示了这些aMTD321介导的胞内递送至细胞,表37中显示了aMTD321的信息。
[表36]
SEQ ID NO aMTD ID 氨基酸序列
34 124 IAVALPALIAAP
43 165 ALAVPVALAIVP
74 321 IVAVALPALAVP
78 325 IVAVALPAVALP
80 342 VIVALAPAVLAP
83 361 AVVIVAPAVIAP
122 524 AVALIVVPALAP
143 623 VAAAIALPAIVP
152 633 LAIVLAAPAVLP
154 685 ALLVAVLPAALP
155 686 AALVAVLPVALP
156 687 AILAVALPLLAP
表37:aMTD321的特征
[表37]
8-2.针对结构稳定性选择增溶域(SD)
融合于疏水性CPP的重组货物(帕金蛋白)蛋白可以在细菌系统中表达,用一步亲和色谱法纯化,但是溶解于生理缓冲液(例如PBS、DMEM或 RPMI1640)的蛋白是高度不可溶的,并且作为可溶性形式的产量极其低。因此,已经应用另外的非功能性蛋白域(增溶域:SD)以与重组蛋白融合来改善溶解度、产量,并且最终改善细胞和组织透性。
根据具体目标,所选择的域是SDA~SDF(表38)。已经确定了与aMTD/SD 融合的重组蛋白的稳定性。
增溶域(SD)和aMTD在增加蛋白的溶解度/产量和细胞/组织透性方面具有很大影响。因此,我们开发了用于临床应用的高度可溶的和高度稳定的与 SD(SDA和SDB)和aMTD融合的帕金重组蛋白。
表38:增溶域的特征
[表38]
8-3.表达载体的构建
我们设计了5种不同类型的具有或不具有用于帕金蛋白的aMTD和增溶域的重组蛋白。蛋白结构如下标记:(1)仅具有His标记的货物蛋白,(2)与His标记和aMTD融合的货物蛋白,(3)与His标记、aMTD和增溶域A(SDA) 融合的货物蛋白,(4)与His标记、aMTD和增溶域B(SDB)融合的货物蛋白,(4C)与His标记和增溶域B(SDB)融合的货物蛋白,(5)与aMTD和增溶域B(SDB)融合的货物蛋白,以及(5C)与增溶域B(SDB)融合的货物蛋白(图17)。其中,使用(4)和(5)结构作为具有iCP-帕金重组蛋白的生物功效的候选蛋白,使用(4C)和(5C)作为相对于(4)和(5)的对照组(非CP帕金蛋白)。
8-4.帕金重组蛋白的制备
通过添加IPTG来成功诱导每种帕金重组蛋白以及纯化每种帕金重组蛋白 (图19)。与仅货物蛋白(HP)或仅与aMTD融合的货物蛋白(HM321P)相比,我们观察到与SDA(HM321PSA)或SDB(HM321PSB、HM524PSB、M524PSB) 融合的帕金蛋白的溶解度显著增加。结果表明与SD融合的帕金重组蛋白显示了溶解度和产量的显著改善(图19和图21a)。
9.每种重组蛋白的细胞和组织透性的确定
与缺少aMTD321或aMTD524序列的帕金重组蛋白(HP、HPSB和其他 aMTD)相比,与aMTD321/SD融合的帕金重组蛋白具有显著更高的细胞、组织透性。共同地,即使这些aMTD321/SD融合帕金重组蛋白(HM321PSA和 HM321PSB)具有相似的溶解度和产量,与aMTD321/SDB融合的帕金重组蛋白的细胞递送和全身递送活性仍高于缺少aMTD321序列的帕金重组蛋白。因此,与aMTD321/SD融合的帕金重组蛋白被确定为重组蛋白的最稳定结构。
此外,测定了aMTD321以及另外选择的10类aMTD的溶解度/产量、透性和生物活性,并在图22中显示。
9-1.帕金重组蛋白的细胞透性
我们研究了开发的帕金重组蛋白的细胞/组织透性和生物活性。蛋白处理1 小时后,评价RAW 264.7细胞中帕金重组蛋白的细胞透性。RAW细胞中不能检测到缺少aMTD的FITC标记的帕金重组蛋白(HP和HPSB)。相比之下,具有aMTD的帕金重组蛋白HM321P、HM321PSA、HM321PSB和M524PSB显示了高细胞透性(图26)。使用荧光共聚焦激光扫描显微镜来监测蛋白质的细胞内定位,在NIH3T3细胞中获得了类似的结果(图24)。特别地,与aMTD/SD融合的帕金重组蛋白(HM321PSA、HM321PSB和M524PSB)显示了最高的细胞透性。这些结果显示了aMTD成功地使蛋白在短时间内(1小时)穿透进入了细胞并且改善了正面影响细胞透性的蛋白的溶解度。
9-2.帕金重组蛋白的组织透性
接下来,我们在腹腔内注射FITC标记的蛋白15分钟和30分钟后确定了帕金重组蛋白的体内组织透性(图25)。通过FACS(荧光活化的细胞分选) 分析的PBMC(外周血单核细胞)显示了,与接受了FITC标记的HPSB或未缀合的FITC的对照动物相比荧光增加,这表明存在FITC标记的蛋白。对于 FACS分析,使用CellQues Pro细胞计数分析软件(FACS Calibur,Beckton-Dickinson,San Diego CA,USA)分析细胞(1×104)。
两种帕金重组蛋白之一HM321PSB显示了在PBMC中更强的胞内信号。通过荧光显微镜分析FITC标记的蛋白在不同器官的冷冻切片中的分布(图25 和图27)。类似的结果,缺少aMTD的帕金重组蛋白(HP和HPSB)显示了各种器官(脑、心、肺、肝、脾、肾)中有限的组织透性。相比之下,aMTD321和aMTD524增强了帕金重组蛋白在组织(脑、心、肺、肝、脾、肾)中的全身递送。
10.脑组织中帕金重组蛋白的免疫检测
为了通过使用免疫组化标记(免疫组化法)确定血脑屏障的透性,使用抗帕金蛋白(1∶200,Santa Cruz Biotechnology)单克隆抗体免疫组化地处理组织。在HM321PSB处理的小鼠的脑中观察到帕金蛋白阳性免疫反应,但是在HPSB 处理的小鼠的脑中没有观察到帕金蛋白阳性免疫反应(图29)。在蛋白印迹结果中,仅在施用了HM321PSB重组蛋白的组中观察到帕金蛋白抗体阳性带(图 28a)。此外,如图28b和图28c中所示,证实了与用HPSB处理的小鼠相比,在用本发明的HM524PSB处理的小鼠的脑中检测到大量的帕金蛋白。
结果说明了与aMTD/SD融合的帕金重组蛋白可以有效地通过穿过血脑屏障被递送至脑中的神经元细胞。
11.iCP-帕金重组蛋白的生物活性的确定
11-1.iCP-帕金重组蛋白的E3连接酶活性
为了确定帕金重组蛋白的E3连接酶活性,使用根据制造商的说明进行的自泛素化测定(Boston Biochem),测定帕金蛋白E3连接酶的活性。如图30 所示,本发明的iCP帕金重组蛋白显示了(自)泛素化活性,表明它们具有 E3连接酶活性。
11-2.iCP-帕金重组蛋白的抗凋亡作用
为了确定帕金重组蛋白对由神经毒素导致的神经元死亡的保护作用,用 6-羟多巴胺(6-OHDA)处理CATH.a和SH-SY5Y细胞。用6-OHDA处理后,用帕金重组蛋白处理这些细胞,并进行TUNEL测定。在仅用6-OHDA处理的组中观察到大量的细胞死亡。与6-OHDA处理的组相似,缺少aMTD的HP 显示了与仅激动剂组相似的凋亡细胞死亡的百分比。相比而言,与aMTD321/SD融合的帕金重组蛋白(HM321PSA和HM321PSB)在CATH.a和 SH-SY5Y细胞中分别将凋亡抑制到19.7和14.2%(*p<0.05)。在CATH.a细胞和SH-SY5Y细胞中获得了相似结果。当处理aMTD524帕金蛋白时,获得了相似的结果。这些结果证明了与aMTD/SD融合的帕金重组蛋白在培养的神经元细胞中具有神经保护作用。进一步地,观察到这些神经细胞死亡抑制作用呈剂量依赖性形式(图31、图32a和图32b)。
进一步地,台盼蓝染色后,通过细胞计数测定α-突触核蛋白聚集体的降解。如图33所示,证实了本发明的iCP-帕金重组蛋白显示了优越的神经细胞保护作用和α-突触核蛋白降解作用。
12.MPTP-PD动物模型的开发
为了确定帕金重组蛋白在体内的作用,我们开发了通过使用神经毒素模拟帕金森病的生理和精神症状的各种帕金森病(PD-)动物模型。为了诱发帕金森病样症状,使用神经毒素MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)。这种 MPTP通过内部线粒体膜中的单胺氧化酶(MAO-B)转化为毒性剂MPP+,并且这选择性地使多巴胺能神经元靶向于诱导帕金森病(图34)。
13.帕金重组蛋白影响运动活动的评价
13-1.游泳测试
为了评价帕金重组蛋白的运动功能恢复作用,进行游泳测试。测定每组(稀释剂、仅MPTP、MPTP+HPSB和MPTP+HM321PSB)的游泳活动(四肢的) 并表示为未损害的稀释剂对照的百分比。与稀释剂组相比,仅MPTP组显示了游泳活动的显著减少。相似地,HPSB处理组显示与仅MPTP组的相似结果。相比而言,HM321PSB处理组显示改善的运动活动。因此,我们确定了与 aMTD321/SD融合的帕金重组蛋白恢复了急性MPTP诱导的帕金森病小鼠模型的运动功能(图37)。
13-2.步态试验
为了评价帕金重组蛋白的运动功能恢复作用,进行步态试验(图38)。在该实验中,测量步幅长度和摇摆距离。与稀释剂组相比,仅MPTP组和HPSB 处理组中步幅长度显著降低,而摇摆距离增加。然而,HM321PSB处理的小鼠显示与正常组相似水平的步幅长度(图39),并且它们显示与仅MPTP处理组和HPSB处理组相比显著降低的摇摆距离(图40)。因此,我们确定了与 aMTD321/SD融合的帕金重组蛋白在急性MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中改善了步态功能。
13-3.亚慢性MPTP-PD模型
在亚慢性MPTP模型中进行旋棒试验,结果是,与稀释剂对照相似,与 aMTD524/SD融合的帕金蛋白处理组能在旋棒上长时间行走。也就是说,证实了通过与aMTD524/SD融合的帕金蛋白恢复了运动功能(图41)。
14.通过帕金重组蛋白激活MPTP-PD小鼠中多巴胺的释放
14-1.尿液中的多巴胺
为了测定尿液中的多巴胺水平,在帕金重组蛋白的第一次处理之后10小时,从所有组中的小鼠采集尿液。通过ELISA测定这些尿液样品。10小时后的结果中,仅MPTP组和HM321PSB处理组之间存在统计学上显著的差异。虽然仅MPTP组显示了降低的尿液水平,但与稀释剂组相比,HM321PSB处理组显示了相似的尿液水平。结果说明与aMTD321/SD融合的帕金重组蛋白刺激尿液中的多巴胺水平(图35)。
14-2.脑中的多巴胺
为了测定脑中的多巴胺水平,通过ELISA测定所有组中的纹状体区域的多巴胺水平。HM321PSB处理组中纹状体多巴胺水平是仅MPTP组和HPSB处理组的两倍。因此,我们确定与aMTD321/SD融合的帕金重组蛋白引起纹状体多巴胺水平的增加,而MPTP处理导致纹状体多巴胺水平的减少(图36)。
15.在MPTP-PD模型中通过帕金重组蛋白恢复酪氨酸羟化酶的表达
15-1.急性MPTP-PD模型
为了确定帕金重组蛋白对多巴胺能神经元的保护效果,使用抗酪氨酸羟化酶的抗体进行免疫组化,所述酪氨酸羟化酶是多巴胺神经元中的标记酶。观察用融合aMTD/SD的帕金重组蛋白处理的小鼠的黑质和纹状体区中多巴胺能神经元的数目并与仅施用MPTP组和施用HPSB组比较。因此,我们确定了融合aMTD/SD的帕金重组蛋白可以具有神经元保护功能。此外,观察到融合 aMTD/SD的帕金重组蛋白的神经元细胞恢复作用呈剂量依赖性方式(图42a 和图42b)。
15-2.亚急性MPTP-PD模型
通过蛋白印迹检测亚急性MPTP模型的脑中TH表达的改变,结果是,观察到融合aMTD/SD的帕金重组蛋白恢复了TH表达。另外,内源帕金蛋白表达没有改变(图43)。
16.本发明的总结
对于本发明,用aMTD设计并开发了细胞透性帕金重组蛋白。证实了所有与aMTD融合的帕金重组蛋白和缺少aMTD的对照重组蛋白的定量的、可视的细胞/组织透性和BBB透性。我们能确认,细胞透性的融合aMTD321/SD 的帕金重组蛋白和融合aMTD524/SD的重组蛋白具有相对高的细胞/组织透性 (图24至图27),以及在脑组织递送中通过穿透BBB而起作用(图28a至图 28c和图29)。为了确定细胞透性帕金重组蛋白的生物活性,我们进行各种功能测试。我们确认了细胞透性帕金重组蛋白具有对由神经毒素(6-OHDA和 MPP+)引起的神经元细胞死亡的抗凋亡作用(图31、图32a和图32b),并且细胞透性帕金重组蛋白在显示由神经毒素(MPTP)诱导的运动功能障碍的PD 小鼠模型中具有恢复作用(图35~图43)。
提供以下实施例来帮助本发明的实践者,以提供对本发明的实验性支持,以及提供模型方案。决不能将这些实施例理解为限制本发明。
实施例1.新的高级大分子转导域(aMTD)的开发
来源于信号序列的H区(HRSP)的CPP(MTS/MTM和MTD)不具有共同序列、序列基序和/或共同结构的同源特征。在本发明中,目标是开发改进的疏水CPP,所述疏水CPP以满足新确定的‘关键因素’的共同序列和结构基序格式化为具有‘共同功能’,以促进蛋白以与分析的CPP相似的机制转移穿过质膜。
在表9中,如下提供了通用的共同序列/结构基序。本发明中的肽的氨基酸长度为9~13个氨基酸,大多数是12个氨基酸,并且它们的弯曲潜力依赖于用于重组蛋白弯曲的脯氨酸在序列的中部(5′、6′、7′或8′氨基酸)和肽的末端(12′)的存在和定位。针对aMTD的刚性/柔性的不稳定指数(II)为II<40,针对亲水性的亲水性总平均值(GRAVY)为约2.2,针对结构特征的脂肪族指数(AI)为约200(表9)。基于这些标准化的关键因素,开发了本发明中的新的疏水肽序列(称为高级大分子转导域肽(aMTD)),并总结于表10至表15 中。
实施例2.用于与aMTD融合的重组蛋白的表达载体的构建
我们新开发的技术使我们能够扩展用于制备细胞透性重组蛋白的方法。设计表达载体用于与aMTD或r肽融合的组氨酸标记的CRA蛋白。为了构建用于重组蛋白的表达载体,设计了聚合酶链式反应(PCR)以扩增每种设计的与 CRA融合的aMTD或r肽。
将PCR反应物(100ng基因组DNA、10pmol每种引物、0.2mM dNTP 混合物、1×反应缓冲液和2.5U Pfu(+)DNA聚合酶(Doctor protein,Korea)) 在Nde I(5′)和Sal I(3′)之间的限制性酶切位点消化,该PCR反应包括变性(95℃)、退火(62℃)和延伸(72℃)各30秒,共35个循环。对于最后一个延伸循环,PCR反应物在72℃下保持5分钟。然后,将它们克隆在pET-28a(+)载体(Novagen,Madison,WI,USA)的位点上。使用T4DNA连接酶在4℃下过夜进行DNA连接。将这些质粒与大肠杆菌DH5α株的感受态细胞于冰上混合10分钟。在42℃的水浴中热激混合物90秒后,将该混合物置于冰上2分钟。然后将添加了LB肉汤培养基的混合物在37℃振荡培养箱中复苏1小时。将转化体铺于含卡那霉素(50μg/mL)(Biopure,Johnson city,TN, USA)的LB肉汤琼脂平板上之后,在37℃下温育过夜。从单个菌落中,提取质粒DNA,在用Nde I和Sal I限制性酶消化后,通过使用1.2%琼脂糖凝胶电泳在645bp处证实消化的DNA(图2)。表23至表30中总结了与aMTD和随机肽(r肽)融合的CRA重组蛋白的PCR引物。表31至表38中显示了aMTD 和r肽引物的氨基酸序列。
实施例3.与aMTD和r肽融合的重组蛋白的诱导型表达、纯化和制备
为了表达重组蛋白,在大肠杆菌BL21(DE3)株中转化用于表达与阴性对照 [r肽38(rP38)]、参比疏水CPP(MTM12和MTD85)和aMTD融合的CRA 蛋白的pET-28a(+)载体。细胞在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中于 37℃下,在强烈振荡下生长,在OD600=0.6时通过添加0.7mM IPTG(Biopure) 在37℃下诱导该细胞2小时。将诱导的重组蛋白加样于15%SDS-PAGE凝胶上并且用考马斯亮兰(InstantBlue,Expedeon,Novexin,UK)染色(图3)。
通过在5000×rpm下离心10分钟收获大肠杆菌培养物,并且丢弃上清。将沉淀物重悬于裂解缓冲液(50mM NaH2PO4,10mM咪唑,300mM NaCl, pH 8.0)中。使用配备有探头的超声波仪(Sonics and Materials,Inc.,Newtowen, CT,USA)在冰上对细胞裂解物进行超声处理。在5000×rpm下将细胞裂解物离心10分钟以沉淀细胞碎片后,用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA树脂(Qiagen, Hilden,Germany)轻柔地通过空心柱系统(Bio-rad,Hercules,CA,USA)温育上清液。在用200mL洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4,20mM咪唑,300mM NaCl,pH 8.0)洗涤结合蛋白的树脂之后,用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4, 250mM咪唑,300mM NaCl,pH 8.0)洗脱结合的蛋白。
在15%SDS-PAGE凝胶上分析在自然条件下纯化的重组蛋白,并且用考马斯亮兰将所述重组蛋白染色(图4)。将所有重组蛋白对生理缓冲液透析8小时以及过夜,所述生理缓冲液是细胞培养基(杜氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium):DMEM,Hyclone,Logan,UT,USA)和杜氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco′s phosphate bufferedsaline)(DPBS,Gibco,Grand Island,NY,USA)的1∶1混合物。由克隆的316种aMTD和141种r肽,诱导、纯化和制备了240种融合aMTD的重组蛋白和31种融合r肽的重组蛋白,并且分析了这些重组蛋白的细胞透性。
实施例4.重组蛋白的定量细胞透性的确定
为了定量细胞透性,根据制造商说明书(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),使融合aMTD的重组蛋白或融合r肽的重组蛋白缀合于异硫氰酸荧光素 (FITC)。将RAW 264.7细胞用10μM FITC标记的重组蛋白在37℃下处理1 小时,用冷PBS洗涤三次,用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)在37℃下处理20分钟以移除细胞表面结合蛋白。通过流式细胞术 (Guava,Millipore,Darmstadt,Germany)使用FlowJo细胞计数分析软件分析这些重组蛋白的细胞透性(图5至图6)。测量aMTD的相对细胞透性,并且与阴性对照(rP38)和参比疏水CPP(MTM12和MTD85)比较(表31)。
实施例5.重组蛋白的细胞透性和胞内定位的确定
对于细胞透性的可视化参比,在24孔室载玻片中盖上盖玻片培养NIH3T3 细胞24小时,用10μM FITC缀合的重组蛋白在37℃下处理1小时,并且用冷PBS洗涤三次。将处理过的细胞用4%多聚甲醛(PFA,Junsei,Tokyo,Japan) 在室温下固定10分钟,用PBS洗涤三次,并且用VECTASHIELD封固介质 (Vector laboratories,Burlingame,CA,USA)封固,并且用DAPI(4′,6-二脒基 -2-苯基吲哚)复染。通过共聚焦激光扫描显微镜技术确定荧光信号的胞内定位(LSM700,Zeiss,Germany;图7和图8)。
实施例6.重组蛋白的表达载体的构建
我们新开发的技术,即基于aMTD的MITT,能够使我们改进开发细胞透性重组蛋白的方法。针对与或不与aMTD和增溶域A(SDA)或增溶域B(SDB) 融合的帕金蛋白,设计表达载体。为了获得用于重组蛋白的表达载体,设计聚合酶链式反应(PCR)来扩增这些重组蛋白。
进行PCR(100ng基因组DNA、10pmol每种引物、各0.2mM dNTP混合物、1×反应缓冲液和2.5U Pfu(+)DNA聚合酶(Doctor protein,Korea)),并在BamHI(5′)和HindIII(3′)之间的限制性酶切位点消化产物,其中PCR包括 35个循环:每个循环中变性(95℃)30秒,退火(60℃)30秒以及延伸(72℃) 2分钟。对于最后一个延伸循环,使PCR产物在72℃下保持5分钟。然后将它们克隆在pET-28a(+)载体(Novagen,Madison,WI,USA)的位点上。使用 T4DNA连接酶(NEB,USA)在4℃下过夜进行DNA连接。将这些质粒与大肠杆菌DH5α和大肠杆菌(BL21(DE3)CodonPlus RIL)菌株(ATCC,USA) 的感受态细胞在冰上混合10分钟。在42℃水浴中热激混合物90秒后,将该混合物置于冰上2分钟。然后将添加了LB肉汤培养基(ELPIS,Korea)的混合物在37℃振荡培养箱中复苏1小时。在剧烈震荡下在具有卡那霉素(50 μg/mL)的LB肉汤琼脂平板上铺转化体,以及在OD600=0.6时,用0.7mM IPTG (Biopure,Johnson city,TN,USA)诱导转化体,然后在37℃下过夜温育。从单个菌落中提取质粒DNA,在BamHI和HindIII限制性酶(NEB,USA)消化之后,使用1.2%琼脂糖凝胶电泳确认消化的DNA(图18)。表39和表40中总结了用于His标记(或无His标记的)融合于aMTD和SD的帕金重组蛋白的PCR引物。
表39和表40:用于His标记的帕金蛋白的PCR引物
[表39]
[表40]
实施例7-1.组氨酸标记的帕金重组蛋白的表达和纯化
使用变性裂解缓冲液(8M尿素、10mM Tris、100mM NaH2PO4)裂解变性的重组蛋白,并通过添加Ni-NTA树脂来纯化。用30mL变性洗涤缓冲液(8 M尿素、10mM Tris、20m咪唑、100mM NaH2PO4)洗涤结合于蛋白的树脂 3次。用30mL变性洗脱缓冲液(8M尿素、10mM Tris、50mM咪唑)洗脱蛋白3次。纯化后,将蛋白对重折叠缓冲液透析两次(550mM胍-HCl、440mM L-精氨酸,50mM Tris、100mM NDSB、150mM NaCl、2mM还原型谷胱甘肽和0.2mM氧化型谷胱甘肽)。最后,将其对生理缓冲液液如DMEM在4℃下透析直到透析进行超过300×105次。根据制造商的说明使用Bradford测定来定量纯化的蛋白的浓度。纯化后,如上将蛋白对DMEM透析。最终,进行 IPTG诱导之前(-)和之后(+)的细胞裂解液的SDS-PAGE分析;Ni2+亲和纯化蛋白的等分部分;以及分子量标准(M),以证实靶蛋白的存在(图19和图20)。
实施例7-2.帕金重组蛋白的溶解度/产量的确定
将包含SDA或SDB的融合aMTD的帕金蛋白克隆、表达、纯化并在变性条件下以可溶形式制备。在10%SDS-PAGE凝胶上确定融合于aMTD和/或 SD的每种重组蛋白的大小(氨基酸数目)、产量(mg/L)和溶解度并将所述重组蛋白用考马斯亮蓝染色。通过测量蛋白浊度(A450)以5分尺度从具有小的沉淀倾向的高度可溶性蛋白(+++++)到大量不可溶性蛋白(+)来为溶解度评分。还确定了每种重组蛋白的生理缓冲液条件下的产量(mg/L)。观察到细胞透性帕金重组蛋白是单条带,其中,在该蛋白纯化步骤中最终纯化的蛋白的量高达46mg/L(图19和图20)。
此外,测定了aMTD321以及另外选择的10类aMTD的溶解度/产量、透性和生物活性,并在图22中显示。如图22中所示,可以证实使用aMTD524的iCP 帕金重组蛋白显示了最优异的生物活性。
图21a和图21b显示了,与阴性对照(HP)相比,融合aMTD-SD的帕金重组蛋白的相对产量,以及与阴性对照(HP)相比,与SDB-融合的帕金重组蛋白(HPSB)的相对产量。结果揭示了,增溶域(SDA和SDB)成功地改善了与HP相比的蛋白的相对产量(图21b),并且HM321PSA和HM321PSB显示了溶解度与仅货物蛋白(HP)相比是其4倍(图21a)。
实施例8.无组氨酸标记的帕金融合蛋白的表达和纯化
还用特异性引物(表39)合成了大肠杆菌密码子优化并且无组氨酸标记的融合于aMTD的重组帕金蛋白的序列,然后将所述序列克隆到pET 28a和 pET 22b。在生长至A600为0.5~0.7的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)细胞中表达蛋白并用0.7mM IPTG诱导蛋白3小时。收获细胞并在缓冲液A(50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100mM NaCl、0.1%Triton X-100)中通过声裂法破坏细胞30分钟(20秒开/40秒关)。通过离心分离包涵体(4℃下以5,000rpm进行30分钟),并在缓冲液B(50mM Tris-HCl,pH 10.0,8M尿素)中溶解过夜以变性。将变性的包涵体对缓冲液C(30mM磷酸钠、pH 8.0、0.02%吐温-20) 在4℃下透析48小时,进行重折叠。通过离心(4℃下以9,000rpm进行30分钟)移除不可溶颗粒。通过具有AKTA净化器FPLC系统(GE HealthCare, Pittsburgh,PA,USA)的离子交换柱色谱进行纯化。简单来说,将Q-Sepharose 阴离子柱与缓冲液C中的蛋白溶液一起流动以使蛋白结合并用缓冲液D(30 mM磷酸钠,pH 8.0,30mM NaCl)洗涤以移除未结合的蛋白。用洗脱缓冲液 E(30mM磷酸钠,pH8.0)的盐梯度(30mM至1M NaCl)洗脱蛋白。在主要单峰处洗脱所有重组蛋白。纯化后,将蛋白对生理缓冲液透析。
实施例9.帕金重组蛋白的胞内递送
为了定量细胞透性,融合aMTD/SD的帕金重组蛋白根据制造商的说明缀合于异硫氰酸荧光素(FITC)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)。RAW 264.7 (ATCC,USA)用10MmFITC标记的重组蛋白在37℃下处理1小时,用冷 PBS洗涤3次,用蛋白酶K(5μg/ml)在37℃下处理10分钟以移除细胞表面结合的蛋白。通过流式细胞术(FACS Calibur;BD,FranklinLakes,NJ,USA) 使用FlowJo分析软件分析这些重组蛋白的细胞透性(图23)。在图23中,阴性对照(rPeptide 38)和之前开发的疏水性CPP(MTM12和MTD85)的细胞透性效力作为参考而显示,并且将MTD321的细胞透性效力与仅SDA(HSA)的细胞透性效力进行视觉对比。与阴性对照(r肽38)和之前开发的疏水性CPP (MTM12和MTD85)相比,证实了aMTD321显示显著改善的细胞透性。
实施例10.iCP帕金重组蛋白的胞内定位的确定
对于细胞透性的可视参照,在24孔室玻片中在盖玻片上培养NIH3T3细胞(ATCC,USA)24小时,在37℃下用10μM溶媒(培养基,DMEM)、仅 FITC、FITC缀合的阴性对照(rP38)、FITC缀合的之前开发的CPP(MTM12和MTD85)、FITC缀合的重组蛋白(FITC-HP,FITC-HPSB,FITC-HM321P, FITC-HM321PSA,FITC-HM321PSB和FITC-M524PSB)处理细胞1小时,以及用冷PBS洗涤3次。将处理的细胞在室温下在4%多聚甲醛(PFA,Junsei,Tokyo, Japan)中固定10分钟,用PBS洗涤3次,用具有DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基) 的VECTASHIELD封片介质(Vectorlaboratories,Burlingame,CA,USA)封片用于核染色。对相同细胞通过共聚焦激光扫描显微镜(上图)和通过诺马斯基 (Nomarski)干涉显微镜成像(LSM700,Zeiss,Germany)(下图)确定荧光信号的胞内定位(图24)。如图24所示,证实了与之前开发的CPP(MTM12和 MTD85)相比,aMTD321和aMTD524显示了更优异的细胞透性,当它们融合于 SD时,进一步地改善了透性。
实施例11-1.PBMC中帕金重组蛋白的体内递送的确定
为了确定体内递送,用仅FITC或FITC缀合的蛋白(FITC-HPSB和 FITC-HM321PSB)腹腔内注射ICR小鼠(5周龄,雌性)。15分钟和30分钟后,从小鼠全血分离外周血单核细胞(PBMC),并且通过流式细胞术(BD, GUABA)分析外周血单核细胞(图25)。如图25中所示,融合aMTD/SD的重组蛋白显示优异的体内细胞透性。
实施例11-2.RAW264.7细胞和NIH3T3细胞中帕金重组蛋白的体内递送的确定
为了确定体内递送,在37℃下用10μM FITC缀合的帕金重组蛋白 (FITC-HP,FITC-HM321P、FITC-HM321PSA、FITC-HM321PSB和FITC-M524PSB) 温育RAW264.7细胞1小时(图26),用10μM具有或缺少aMTD321序列的 FITC缀合的帕金重组蛋白(FITC-HPSB和FITC-HM321PSB)在37℃下温育 NIH3T3细胞1小时(图26)。
将等摩尔浓度的非缀合FITC(仅FITC)或溶媒(培养基,DMEM)处理以移除细胞相关的但非内化的蛋白,并通过流式细胞术分析(图26)。
如图26所示,当帕金蛋白仅与SD融合时,细胞透性没有大的改变。相比而言,通过仅与aMTD融合,不论SD是否存在,都发现细胞透性的改善,说明细胞透性改善是由添加aMTD序列而提供的,通过添加SD序列使重组蛋白的亲水性最大化,导致细胞透性显著提高。
实施例12.体内帕金重组蛋白的组织透性的确定
为了可视地参考组织透性,将稀释剂、仅FITC和30mg/kg的FITC标记的帕金重组蛋白(FITC-HP、FITC-HPSB、FITC-HM321P、FITC-HM321PSA、 FITC-HM321PSB和FITC-M524PSB)腹腔内注射至ICR小鼠(5周龄,雌性)。 2小时后,处死小鼠,分离肝、肾、脾、肺、心脏和脑,并用OCT化合物(Sakura, Alphen anden Rijn,Neetherlands)包埋,冷冻,然后切片成20μm的厚度。将组织标本置于玻璃上,并通过荧光显微镜(Nikon,Tokyo,Japen)观察。如图 27中所示,证实了与aMTD/SD融合的重组帕金蛋白有效地递送至组织。
实施例13.脑中帕金重组蛋白的检测
对于免疫组化,用稀释液(PBS)或600μg His标记的帕金重组蛋白腹腔内注射6周龄ICR雌性小鼠。2小时后,将小鼠用0.9%NaCl灌注,并用冷的 4%多聚甲醛固定。移出脑之后,将脑用4%多聚甲醛后固定(post-fixed),并转移至30%蔗糖。用冷冻切片机将脑切成30μm的冠状切片(coronal sections)。用抗帕金蛋白(1∶100,Santa Cruz Biotechnology)单克隆抗体免疫染色脑冷冻切片,然后用生物素缀合的山羊抗小鼠二抗(VectorLaboratories)免疫染色脑冷冻切片(30μm),并用亲和素-生物素复合物试剂盒(Vectastain kit,Vector Laboratories)显色。对于蛋白印迹分析,用0.9%NaCl灌注蛋白处理的小鼠。分离脑,解剖纹状体区域并在裂解缓冲液(Intron,Seongnam,Korea)中匀浆。通过蛋白印迹分析来自离心(4℃下以13,000rpm进行10分钟)的上清液,将所述上清液用抗帕金蛋白(1∶200)和β-肌动蛋白(1∶2000)的抗体探测。二抗是山羊抗小鼠IgG-HRP(所有抗体均来自Santa Cruz Biotechnology)(图 28a)。
详细地,为了检验在脑的神经元细胞中存在多少iCP-帕金重组蛋白,在腹腔内注射FITC标记的HPSB和HM524PSB后10分钟、1、2、4、8、12、16 和24小时处死小鼠。然后分离脑的神经元细胞,通过流式细胞术测定其荧光强度并示于图28b。如该图中所示,在注射iCP帕金重组蛋白后2小时测得最高值,最高值保持至约8小时,在12小时时降低,此后保持恒定直到24小时。
进一步地,将通过实验获得的脑组织冷冻切片(20μm)以获得组织切片,在荧光显微镜下检测荧光分布,荧光分布示于图28c中。如该图所示,仅在存在aMTD的情况下才能观察到神经元细胞形状中的FITC标记的蛋白,说明 iCP-帕金蛋白穿过了BBB渗透进脑的神经元细胞。
进一步地,通过免疫印迹来检验aMTD介导的帕金重组蛋白至脑的递送,并示于图29。图29显示了小脑中帕金重组蛋白的免疫印迹。在IP(腹腔内) 注射600μg的单独稀释剂或His标记的具有aMTD或缺少aMTD序列的帕金重组蛋白2小时后,用抗帕金抗体(1∶100,Santa Cruz Biotechnology)免疫染色穿过小脑的矢状切片(Sagittal sections)。
如图28a至图28c和图29所示,与用HPSB注射的小鼠相比,用本发明的HM321PSB和HM524PSB注射的小鼠的脑中检测到大量的帕金蛋白,表明 iCP-Parkin重组蛋白穿过了BBB,本发明的重组蛋白在体内表现出优异的血脑屏障透性。
实施例14-1.E3连接酶活性的评价
通过使用根据制造商说明进行的自泛素化测定(Boston Biochem),测定帕金蛋白E3连接酶活性。简单来说,使1μg纯化的帕金蛋白与0.1μM E1、1 μM E2、50μM泛素和10μMMg-ATP在37℃下反应1小时,然后用抗泛素抗体(1∶1,000,Enzo Life Science)进行蛋白印迹。如图30所示,本发明的iCP 帕金蛋白重组蛋白显示了(自)泛素化活性,说明它们具有E3连接酶活性。
实施例14-2.神经元细胞中帕金重组蛋白的抗凋亡作用
根据制造商说明(Roche)进行末端dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定。铺板小鼠多巴胺能神经元(CATH.a)细胞(ATCC:美国典型培养物保藏所) (3×104/孔),在37℃下用50μM的6-羟多巴胺(6-OHDA,激动剂)预处理 70%丰度的CATH.a细胞1小时,然后在37℃下用2.5μM HP、帕金重组蛋白 (HM321P、HM321PSA或HM321PSB)处理2.5小时,并通过TUNEL染色评价凋亡。还培养并铺板(3×104/孔)了人脑肿瘤(SH-SY5Y)细胞(韩国细胞系库(Korea CellLine Bank)),用100μM的6-羟多巴胺(6-OHDA,激动剂) 预处理70%丰度的SH-SY5Y细胞6小时,然后在37℃下用2.5μMHP、帕金重组蛋白(HM321P、HM321PSA或HM321PSB)处理2.5小时,并通过TUNEL 染色评价凋亡。以相同的方式对许多aMTD进行生物活性测试,并通过TUNEL 染色和膜联蛋白V染色来检验细胞死亡。
为了测试M524PSB的剂量依赖性,用1mM MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶) 和不同浓度的M524PSB共处理70%丰度的SH-SY5Y细胞24小时,通过TUNEL 测定以及使用抗Bcl2(Santacruz,sc-7382)和抗半胱天冬酶3(Cell signaling, 9665)抗体的蛋白印迹测定来分析细胞死亡。
如图31和图32所示,证实了iCP帕金重组蛋白处理组显示了优异的抗凋亡作用而具有对多巴胺能神经元细胞的保护作用。融合aMTD524/SD的帕金重组蛋白的处理显示了相似的结果(图32a,下图),尤其如图32b所示,当通过神经毒MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶)处理诱导SH-SY5Y细胞的凋亡,然后通过改变其浓度处理M524PSB时,观察到对神经元细胞的抗凋亡作用呈剂量依赖性。在分子水平上,证实了M524PSB保持了抗凋亡生物标记物Bcl2的表达,而促凋亡生物标记物半胱天冬酶3的表达被抑制(图32b)。
实施例14-3.α-突触核蛋白聚集体降解的评价
通过聚集1mg/ml的α-突触核蛋白(ATGEN#SNA2001)在静置温育器中在37℃下产生α-突触核蛋白寡聚体5周。将人脑肿瘤(SH-SY5Y)细胞(韩国细胞系库)培养,铺板(3×105/孔),以及用1μM聚集的α-突触核蛋白寡聚体预处理2小时以诱导细胞凋亡,然后在37℃下用10μM帕金重组蛋白共处理24小时,在台盼蓝染色后通过细胞计数分析变化。
通过布拉福德测定定量蛋白,然后使用抗α-突触核蛋白一抗(1∶200,Santa Cruz#sc-7011-R)、抗兔IgG HRP连接抗体二抗(1∶5000,细胞信号传导(Cell signaling)#7074S)进行基于蛋白印迹的化学发光检测(Ez-Western Lumi Femto, DOGEN#DG-WF200)(图33)。如图33所示,证实了本发明的iCP帕金重组蛋白显示了优异的神经细胞保护作用和α-突触核蛋白降解作用。
实施例15.MPTP-诱导的帕金森病小鼠模型和治疗方案
8周龄的C57BL/6雄性和雌性小鼠圈养在12小时光照/12小时黑暗循环下的控温控湿室内的塑料笼子中。随机指定小鼠为四个实验组(稀释液、仅 MPTP、MPTP+HPSB和MPTP+HM321PSB或M524PSB)中的一组。对于急性 MPTP诱导PD模型,除了稀释剂组外的三组小鼠连续3天接受腹腔内注射 MPTP(15mg/kg×3次/天,2小时间隔)。神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶解于0.9%NaCl中。用0.9%NaCl 处理对照相同的时间。3天后,MPTP+HPSB和MPTP+HM321PSB组的小鼠分别连续5天接受腹腔内注射HPSB、HM321PSB重组蛋白(600μg/头部,1次/ 天)。对于亚急性MPTP诱导的PD模型,腹腔内注射MPTP(30mg/kg/天)5 天,在第9天开始连续5天注射蛋白(HPSB、HM321PSB)。对于亚慢性MPTP 诱导的PD模型,腹腔内注射MPTP(20mg/kg×4次/天,2小时间隔)1天,在第36天时开始注射蛋白(HPSB、M524PSB)连续5天。在随后的日子里分析尿液和脑的多巴胺水平、粗大运动功能和脑损伤(TH免疫染色),如图34 所示。我们确认动物实验是根据机构性动物保护及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的指南进行的(图34至图42b)。
实施例16.用帕金重组蛋白处理的MPTP-PD动物模型的尿液中的多巴胺的测定
对于尿液中合成的多巴胺的测,我们在处理帕金重组蛋白的第1天处理 10小时后收集了所有组中小鼠的尿液。通过使用商用ELISA试剂盒根据制造商(GenWay,San Diego,CA,USA)提供的说明来测定尿液中合成的多巴胺。简单来说,将兔抗多巴胺抗体添加至尿液或组织提取物中,在包被了山羊抗兔抗体的孔中回收免疫复合物。与标准曲线相比,直接抗不同表位的第二酶缀合的抗多巴胺抗体产生了与抗原量成正比的反应产物。
在HPSB和HM321PSB蛋白处理后10小时,通过ELISA测定MPTP损伤的小鼠的尿液多巴胺水平。通过学生两配对t检验来评价组间实验性差异(*p <0.05)(图35)。
如图35所示,多巴胺神经元凋亡导致多巴胺分泌不良,但是施用iCP帕金重组蛋提高了尿液多巴胺水平,表明本发明的iCP帕金重组蛋白改善多巴胺的分泌。
实施例17.用帕金重组蛋白处理的MPTP-PD动物模型的脑中的多巴胺的测定
对于脑中合成的多巴胺的测定,我们在处理帕金重组蛋白的第8天处理 10小时后收集了所有组中的小鼠的脑。
通过使用商用ELISA试剂盒根据制造商(GenWay,San Diego,CA)提供的说明来测定脑提取物中合成的多巴胺。简单来说,将兔抗多巴胺抗体添加至尿液或组织提取物中,在包被了山羊抗兔抗体的孔中回收免疫复合物。与标准曲线相比,直接抗不同表位的第二酶缀合的抗多巴胺抗体产生了与抗原量成正比的反应产物。
如图34所示,通过ELISA在未经蛋白处理或每天用HM321PSB处理的损伤小鼠中确定纹状体活组织中多巴胺的水平。4只小鼠的组中的多巴胺水平以平均值±S.D.表示。通过学生两配对t检验来评价组间实验性差异(*p<0.05) (图36)。
如图36所示,通过施用iCP帕金重组蛋提高了脑多巴胺水平,说明本发明的iCP帕金重组蛋白改善多巴胺的分泌。
实施例18.通过用帕金重组蛋白处理的MPTP-PD动物模型的游泳测试评价运动活动
通过使用游泳测试来评价MPTP损伤的小鼠的粗大运动功能。最后一次 MPTP处理小鼠后9小时,用600μg蛋白(IP、HPSB或HM321PSB)处理小鼠3小时,处理蛋白后24小时通过将小鼠放置在37℃水浴中并视频记录后续活动来评价运动活动。每个处理组中的小鼠使用四肢运动的时间的百分比以平均值±S.D.表示。每组中的小鼠的数目如下:稀释剂,12只;仅MPTP,7只;MPTP+HPSB,14只;MPTP+HM321PSB,12只。
未受损伤的小鼠在98%的时间里使用所有的四肢游泳。测量每组(仅 MPTP、MPTP+HPSB或MPTP+HM321PSB)游泳(四肢)花费的时间百分比,并用未受损伤的稀释剂对照的百分比表示。通过学生两配对t检验来评价组间实验性差异(*p<0.05)(图37)。
如图37中所示,证实了通过iCP帕金重组蛋白处理恢复了MPTP处理所导致的的运动功能障碍。
实施例19.用帕金重组蛋白处理的MPTP-PD动物模型的步态试验和旋棒试验评价运动活动
19-1.步态试验
使小鼠沿着具有10cm高的壁的长50cm,宽10cm的跑道行走到封闭盒子内。显示了在脚印分析中用表示行走的前进方向(DoP)的点线来测量的参数。评价MPTP损伤的小鼠的脚印的步幅长度(cm)和摇摆长度(cm)(图38)。步幅长度和摇摆长度被测量为每个步幅和摇摆之间的向前移动的平均距离。直方图表示以下差异:4只小鼠的组中步幅长度和摇摆长度以平均值±S.D.表示。通过学生两配对t检验来评价组间实验性差异(*p<0.05)(图39和图40)。
如图38至图40所示,证实了通过MPTP处理使运动活动丧失,因此甚至没有观察到步图案,而iCP帕金重组蛋白处理组显示运动活动的99%恢复,并保持了正常的步图案。
19-2.旋棒测试
对于该实验,在注射MPTP之前以15rpm的速度训练小鼠10分钟,共三次。在该实验中,注射MPTP之后,将小鼠置于旋棒上10分钟,同时速度加速到4~30rpm,然后测量小鼠在坠落前保持在旋棒上的时间。重复该过程三次。用摄像机记录所有测试。
如图41所示,证实了通过MPTP处理使运动活动降低了超过80%或更高,但是通过iCP帕金重组蛋白处理使得运动活动恢复到接近正常水平。
实施例20.酪氨酸羟化酶的表达恢复
如图34所示,用帕金重组蛋白处理MPTM损伤的小鼠5天(IP,30mg/kg)。在帕金重组蛋白处理的最后一天,将小鼠用0.9%NaCl灌注,并用冷的4%多聚甲醛固定。然后移出脑,将脑用4%多聚甲醛后固定,并转移至30%蔗糖。用冷冻切片机将脑切成30μm的冠状切片。将脑中的多巴胺能神经元细胞标记物-酪氨酸羟化酶(TH)用抗TH(1∶50,ThermoScientific,Rockford,USA)单克隆抗体免疫染色,然后用生物素缀合的山羊抗兔二抗(1∶100,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)免疫染色,并用ABC试剂盒(Vectastainkit, Vector Laboratories,Burlingame,CA)显色(图42a)。计算每个处理组中的TH 阳性细胞百分比。通过学生两配对t检验来评价组间实验性差异(*p<0.05) (图42b)。
通过蛋白印迹在根据图34的过程制备的亚急性MPTP PD模型中测定TH 表达,结果发现通过iCP帕金重组蛋白恢复了TH水平(图43)。详细地,将脑移出并用Pro-Prep(iNtRon,17081)匀浆化,通过在4℃下以13,000rpm离心10分钟获得上清液。使用布拉福德测定来定量由此获得的上清液中的蛋白,并使用10μg蛋白进行SDS-PAGE。
用帕金蛋白(1∶200,Santa cruz,Cat#32282)、酪氨酸羟化酶(TH,1∶2000,Millipore,cat#AB152)、β-肌动蛋白(1∶5000,细胞信号传导(Cell signaling), cat#4967S)作为一抗,用抗小鼠IgG-HRP样抗体(细胞信号传导(Cell signaling),cat#7074s)和抗兔IgG-HRP样抗体(细胞信号传导(Cell signaling), cat#7076s)作为二抗。在室温下用5%BSA封闭1小时,然后添加一抗并使其在4℃下反应16小时以上或在室温下反应3小时。用TBS-T(10mM Tris-HCl、pH 8.0、50mM NaCl、0.05%吐温-20)洗涤后,在室温下处理二抗1小时,然后用TBS-T洗涤。使用用于化学发光检测的ECL(增强化学发光) 进行观察和分析。在所有实验组中没有观察到内源帕金蛋白表达的大变化。
如图42a和图42b所示,仅MPTP处理的小鼠中激活的多巴胺分泌细胞的数目是正常对照组的10%,而在MPTP处理之后注射iCP帕金重组蛋白的实验组中多巴胺分泌细胞的数目是正常对照组的60%。此外,观察到本发明的重组蛋白的神经元细胞恢复作用呈剂量依赖性方式(图42a,下图)。因此,证实了本发明的iCP帕金重组蛋白有效穿过脑组织的血脑障碍以激活约50%的多巴胺分泌细胞,因此,本发明的重组蛋白具有优异的针对MPTP诱导的脑细胞死亡的脑细胞保护作用。
实施例21.统计学分析
使用培养细胞的所有实验数据以至少三次实验的平均值±S.D.表示。使用双尾学生t检验或ANOVA方法评价统计学显著性。使用配对学生t检验评价组间的实验性差异。对于动物实验,使用ANOVA比较组间和组内来确定显著性。p<0.05的差异被认为是统计学上显著的。
本发明所属领域的技术人员将理解,本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以不同形式来实施。因此,应该理解的是,所公开的实施方式不是限制性的,而是在所有方面都是说明性的。本发明的范围是根据所附权利要求而不是由前文的描述来进行的,并且因此在权利要求的等同范围内的所有变化都被包括在其中。

Claims (30)

1.一种iCP(细胞透性改善的)帕金重组蛋白,其包括:帕金蛋白和由9~13个氨基酸的序列组成并具有改善的细胞或组织透性的高级大分子转导域(aMTD),
其中,所述aMTD与所述帕金蛋白的一个末端或两个末端融合,并具有以下特征:
(a)由选自由Ala、Val、Ile、Leu和Pro组成的组中的3个或更多个氨基酸的序列组成;
(b)氨基酸序列中具有对应于aMTD氨基酸序列的第5至8位和第12位中的任意一个或多个位置的脯氨酸;以及
(c)如通过Protparam所测量的,不稳定指数为40~60;脂肪族指数为180~220;亲水性总平均值(GRAVY)为2.1~2.6。
2.根据权利要求1所述的iCP帕金重组蛋白,其中,一个或多个增溶域(SD)进一步融合于所述帕金蛋白和所述aMTD中的一个或多个的末端。
3.根据权利要求1所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述aMTD具有α-螺旋结构。
4.根据权利要求1所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述aMTD由12个氨基酸的序列组成并且由以下通式表示:
其中,X独立地指丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I);并且脯氨酸(P)可以位于U中的一个(5’、6’、7’或8’)中;并且剩余的U独立地由A、V、L或I组成,在12’位置处的P是脯氨酸。
5.一种iCP帕金重组蛋白,其由以下结构式中的任一个来表示:
A-B-C和A-C-B-C
其中,A是具有改善的细胞或组织透性的高级大分子转导域(aMTD),B是帕金蛋白,C是增溶域(SD);并且
所述aMTD由9~13个氨基酸的序列组成,并且具有以下特征:
(a)由选自由Ala、Val、Ile、Leu和Pro组成的组中的3个或更多个氨基酸的序列组成;
(b)氨基酸序列中具有对应于aMTD氨基酸序列的第5至8位和第12位的任意一个或多个位置的脯氨酸;
(c)如通过Protparam所测量的,不稳定指数为40~60;脂肪族指数为180~220;亲水性总平均值(GRAVY)为2.1~2.6;以及
(d)具有α-螺旋结构。
6.根据权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述帕金蛋白具有SEQ ID NO:814的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述帕金蛋白由SEQ ID NO:815的多核苷酸序列编码。
8.根据权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述帕金蛋白进一步包括选择性地结合于细胞、组织或器官的受体的配体。
9.根据权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述aMTD具有选自由SEQ ID NO:1~240组成的组中的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述aMTD由选自由SEQ ID NO:241~480组成的组中的多核苷酸序列编码。
11.根据权利要求2或5所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述SD具有独立地选自由SEQID NO:798、799、800、801、802、803和804组成的组中的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述SD由独立地选自由SEQ IDNO:805、806、807、808、809、810和811组成的组中的多核苷酸序列编码。
13.根据权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述iCP帕金重组蛋白具有另外与其一个末端融合的组氨酸标记的亲和域。
14.根据权利要求13所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述组氨酸标记的亲和域具有SEQID NO:812的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述组氨酸标记的亲和域由SEQID NO:813的多核苷酸序列编码。
16.根据权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白,其中,所述融合通过肽键或化学键形成。
17.根据权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白,其中所述iCP帕金重组蛋白用于治疗或预防帕金森相关疾病。
18.一种编码权利要求1所述的iCP帕金重组蛋白的多核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述的多核苷酸序列,其中,所述多核苷酸序列由SEQ ID NO:816或SEQ ID NO:822表示。
20.一种编码权利要求5所述的iCP帕金重组蛋白的多核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的多核苷酸序列,其中,所述多核苷酸序列选自由SEQ ID NO:818、824、828、830和832组成的组。
22.一种重组表达载体,包括权利要求18或20所述的多核苷酸序列。
23.一种用权利要求22所述的重组表达载体转化的转化体。
24.一种权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白的制备方法,包括:
制备权利要求22所述的重组表达载体;
使用所述重组表达载体制备转化体;
培养所述转化体;以及
回收通过所述培养表达的重组蛋白。
25.一种组合物,包含作为活性成分的权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白。
26.一种用于治疗或预防帕金森相关疾病的药物组合物,包含作为活性成分的权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白;以及药学上可接受的载体。
27.权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白作为治疗或预防帕金森相关疾病的药物的用途。
28.一种包含权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白的药物。
29.权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白在制备用于治疗或预防帕金森相关疾病的药物中的用途。
30.一种治疗或预防受试者的帕金森相关疾病的方法,包括:
鉴定需要治疗或预防帕金森相关疾病的受试者;以及
将治疗有效量的权利要求1或5所述的iCP帕金重组蛋白施用于该受试者。
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