CN101415726B - 用于蛋白替代疗法的合成的MeCP2序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及MeCP2蛋白及其在蛋白质替代疗法中的用途。更具体地，本发明涉及密码子优化的用于表达MeCP2蛋白的核酸序列、创建该核酸序列和表达该蛋白的方法、本发明的蛋白与转导结构域的融合蛋白以及含有本发明的蛋白的载体和宿主细胞。本发明还涉及本发明的核酸或蛋白在药物中的用途、含本发明的核酸序列和蛋白的药物组合物，以及用于神经变性疾病或神经发育疾病(包括Rett综合征)的处理、预防和/或治疗的方法。

Description

用于蛋白替代疗法的合成的MeCP2序列

发明范围

本发明涉及MeCP2蛋白及其在蛋白质替代疗法中的用途。更具体地说，本发明涉及密码子优化的用于表达MeCP2蛋白的核酸序列、创建该核酸序列和表达该蛋白的方法、本发明的蛋白与转导结构域的融合蛋白以及含有本发明的蛋白的载体和宿主细胞。本发明还涉及将本发明的核酸或蛋白在药物中的用途、含本发明的核酸序列和蛋白的药物组合物，以及用于神经变性疾病或神经发育疾病(包括Rett综合征)的处理、预防和/或治疗的方法。

背景技术

Rett综合征是一种进行性神经发育疾病。它几乎仅侵染女性(Rett，1966，Wien Med Wochenschr 116：723-6)，且是女性智力低下的最常见原因之一。RTT的特征在于具有四个连续阶段的动态病程。第一阶段(6-18个月)，女孩停止获得新技能；她们表现出头部发育减慢和孤独症的特征如感情冷淡和目光接触减少。第二阶段(1-4岁)，患病儿童丧失已学会的技能如讲话和有目的的运用手。他们发育出不规则的呼吸模式、躯干和步态运动失调/运动不能以及刻板手部动作。大约半数的女孩还会发生癫痫发作，此病到第三阶段(4-7岁)会在一定程度上稳定。癫痫在第四阶段(5-15岁和更大)发病较少，但运动退化继续。运动减退——尤其是对于不能行走的儿童——经常导致脊柱侧弯，这会使女孩不得不使用轮椅。Rett患者的神经病理特征包括脑皮质厚度下降和神经元大小减小。树突状分枝也被发现明显减少但没有进一步影响到大体的形态学特征(Armstrong，2002，Ment Retard Dev DisabilRes Rev 8：72-6)。RTT是X染色体连锁的疾病，其发病率估计在1：10,000到1：15,000之间。Amir等人(1999)(Nat Genet 23：185-8)已确定基因MECP2的突变是RTT的致病原因。MECP2基因遭受X染色体失活。因此，杂合突变型女性是MeCP2缺乏的嵌合体，这最可能是影响该疾病表型的调节因子之一。已确定符合Rett综合征临床标准的男性与47，XXY染色体组型有关，且由受精后的MECP2突变导致体细胞镶嵌。参考文献参见L.S.Weaving et al.：Journal of MedicalGenetics 2005；42：1-7和G.Miltenberger-Miltenyi，F.Laccone：Human Mutation 2003 Volume 22，Issue 2；107-115。

MECP2基因位于X染色体长臂的Xq28位置(Adler 1995，Mamm Genome6(8)：491-2)。该基因的跨度是76kb，且由4个外显子组成。MECP2基因编码一种名为甲基-CpG-结合蛋白2的蛋白(MeCP2)，所述蛋白被认为对沉默其他基因有重要的作用。MeCP2蛋白有两个异构体，MeCP2 e1和MeCP2e2，以前分别被称为MeCP2B和MeCP2A(Mnatzakanian et al.2004，NatGenet 36：339-41)。异构体e1由498个氨基酸构成，异构体e2长486个氨基酸。异构体e1在N末端含一个特征性的21个氨基酸的肽，其包括多聚丙氨酸和多聚甘氨酸区。MECP2e1变体的mRNA在大脑中的表达比MECP2e2多10倍，而且它是小鼠和人类大脑中含量最丰富的蛋白异构体。MeCP2是一种含量丰富的哺乳动物蛋白质，其选择性地与对称放置的二核苷酸中的5-甲基胞嘧啶残基结合。优选地，CpG二核苷酸位于基因的启动子区。它们代表了一种基因调控的元件，DNA甲基化之后作为转录沉默因子的靶标。

尚未知有成功的治疗能够改善Rett综合征患者的神经功能。根据人类MECP2的突变谱(Lam et al.2000，J Med Genet 37(12)：E41；Lee et al.2001，Brain Dev 23：S138-43)和来自RTT病小鼠的结果，认为RTT综合征是由于MeCP2的功能丧失所导致的已成为共识。旨在恢复MeCP2活性的有效方法应该能够补偿缺陷神经细胞中MeCP2功能的损失。参考文献参见L.S.Weaving et al.：Journal of Medical Genetics 2005；42：1-7和G.Miltenberger-Miltenyi，F.Laccone：Human Mutation 2003，Volume 22，Issue 2；107-115。

Schwarze等人(1999，Science 285：1569-1572)报道了可使用TAT结构域(人类免疫缺陷病毒1的转录反式激活因子蛋白)将生物学活性的大分子转运入活细胞。他们示出了制造TAT-β-半乳糖苷酶重组蛋白并将其注射入小鼠的腹腔内。他们发现该融合蛋白分布于包括大脑的所有组织中并具有生物学活性。

WO00/62067(Dowdy et al.)报道了蛋白质转导(PTD)分子的用途，包括用于将治疗分子靶向到神经系统中的TAT蛋白结构域。

在异种表达系统中表达蛋白质(即大肠杆菌中的人类蛋白)需要相应的表达载体和目的基因的cDNA序列。遗传密码的64种密码子(核苷酸三联体)编码20种氨基酸和3种翻译停止信号。因此遗传密码是冗余的，这表示某些氨基酸可由不止一种密码子编码。甲硫氨酸和色氨酸是仅有的由一种密码子(分别为ATG和TGG)编码的氨基酸，而精氨酸、亮氨酸和丝氨酸每种都由六个同义密码子编码。由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸序列可编码相同的蛋白。密码子使用频率在不同生物中有所变化。这些偏差可强烈地影响异种蛋白的表达(Kane，1995，Curr Opin Biotechnol 6(5)：494-500)。密码子的使用已被确定为原核基因表达中唯一最重要的因素(Lithwick，2003，Genome Res 13(12)：2665-2673)。

因此本发明的一个目标就是提供编码生物学活性的MeCP2蛋白的构建体，其可进入神经系统细胞并补偿患病神经细胞MeCP2功能的损失。

将TAT重组蛋白递送至大脑的治疗方法因为可从动物模型快速应用到患者而具有极大的价值。其他优点可能是容易控制的应用剂量、非常高的递送效率、无潜在的插入突变的危险、以及无基因疗法中由抗病毒蛋白的免疫反应导致的临床副作用。PTD蛋白递送方法及其进一步发展可使神经遗传和破坏性疾病(如Rett综合征)的治疗成为可能。

以前使用人类cDNA序列表达足够用于治疗目的MeCP2蛋白构建的尝试都非常不成功，因此本发明的另一目标是提供一种MeCP2的表达构建体，以增加MeCP2重组蛋白的产量。

发明内容

因此，如权利要求中所定义，本发明涉及一种包含一个第一核酸序列的核酸分子，所述第一核酸序列编码MeCP2蛋白或其生物学活性片段或它们的衍生物。此外，如权利要求所定义，本发明还涉及一个由核酸分子编码的多肽、一个包含核酸分子的载体以及一种包含载体的宿主细胞。另外，本发明还提供一种用于制备权利要求中定义的核酸序列的方法，以及一种用于制备权利要求中定义的多肽的方法。本发明还提供一种如权利要求中所定义的含有核酸分子和/或多肽的药物组合物。本发明还涉及如权利要求中所说明的一种治疗方法和所述核酸分子和/或多肽在医疗中的用途，。

具体实施方式

本发明实现了长期探寻的目标：提供了制备可用于治疗神经变性疾病和神经发育疾病的MeCP2重组蛋白的方法和手段。发明者发现通过设计和创建优化的MeCP2核酸序列，首次使制备可用于哺乳动物蛋白取代疗法的MeCP2蛋白以及片段或者这类蛋白或片段的衍生物成为可能。

在第一方面中，本发明涉及一种包含一个第一核酸序列的核酸分子，所述第一核酸序列编码MeCP2蛋白或其生物学活性片段或者所述蛋白或片段的衍生物，其中所述核酸序列经过密码子优化以在异种细胞中表达。

本文中所提到的“MeCP2蛋白”，可以分别是NCBI蛋白序列数据库中编号(accession number)为AAS55455的人类异构体e1(别名异构体B)或编号为NP_004983的人类异构体e2(别名异构体A)。技术人员会懂得，如果其他人MeCP2异构体或从其他脊椎动物中获得的MeCP2蛋白或者它们的片段具有和已知的人MeCP2蛋白异构体相似的生物学活性，则这些蛋白或它们的片段也适合用作本发明的MeCP2蛋白。技术人员可以容易地从公开数据库中获得上述异构体及其对应的mRNA的序列。

本文中所用的术语“生物学活性片段”，是指具有至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150或、至少200个MeCP2蛋白的氨基酸的多肽。MeCP2蛋白的片段包含的氨基酸分别少于编号为AAS55455或NP_004983的全长的MeCP2蛋白。生物学活性片段仍然表现出作为其来源的天然蛋白的生物学活性，尽管未必具有相同的水平。

MeCP2A蛋白“衍生物”是多肽，所述多肽本身不是由天然存在的物种的基因组编码的。具体地说，衍生物不同于具有任一上述MeCP2异构体编号的多肽。因此衍生物包含对天然存在的MeCP2蛋白的修饰(例如氨基酸置换、缺失和加成)，但仍然表现出天然存在的蛋白的生物学活性，尽管未必具有相同的水平。当用本领域已知的计算机同源程序(例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上公开的“BLAST”程序)对衍生物分子的氨基酸序列与MeCP2蛋白进行比对时，所述衍生物分子应含有与MeCP2蛋白的相同大小的氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少95％或、至少99％同一性的同源区域。MeCP2衍生物的片段含有的氨基酸少于上面定义的MeCP2衍生物。

一种蛋白或片段的“生物学活性”片段或“生物学活性”衍生物表示该片段或衍生物具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的上面定义的MeCP2蛋白的生物学活性。MeCP2蛋白或片段或衍生物是否具有生物学活性可通过下面的测试确定：

1)假如一个MeCP2蛋白或片段或衍生物能与甲基化的胞嘧啶结合和/或能诱导HDAC的直接募集和/或能改变组蛋白H3和H4的乙酰化状态，则认为它具有生物学活性。通常的测试包括培养从Mecp2^y/-小鼠(从Jackson实验室获得名为B6.129P2(C)-Mecp2^tm11Bird/J)和野生型小鼠的后肢/尾尖取得的成纤维细胞，例如按下面实验部分的3.1所述的方法取得。

典型地，培养基会被更换然后将细胞在37℃、10％CO₂的条件下温育一周。为测试生物学活性，例如监测组蛋白H3和H4的乙酰化状态，用例如300pmol的融合有转导结构域(如TAT结构域或其他下文所述的转导结构域)的MeCP2蛋白或片段或它们的衍生物处理Mecp2^y/-小鼠的成纤维细胞，然后培养例如30小时。然后用抗例如组蛋白H3、乙酰化组蛋白H3或乙酰化H4K16的抗体对细胞溶解产物进行免疫印迹，如下文所述。用密度计量分析来量化处理的与未处理的成纤维细胞之间乙酰化状态的不同，如图5C所示，从而使技术人员能够确定组蛋白乙酰化状态的改变。下面的实施例5、6和8.1以及图3C-D和图5示出了进行和评估这种测试的方法。

2)另一种能够测试MeCP2蛋白或片段或它们的衍生物的生物学活性的方法是测量由用融合有下文所述的蛋白转导结构域的待测蛋白进行的转导实验所诱导的组蛋白H3的乙酰化水平。常用的细胞系如HeLa oder NIH 3T3即可用于此目的。当使细胞与所述融合蛋白接触时，与具有正常组蛋白乙酰化水平的对照细胞系相比组蛋白的乙酰化水平会有所下降。这种下降可用来量化所生产的蛋白的生物学活性。此测试的评估(例如通过蛋白质印迹方法)会在下面的实验部分进行说明。

3)可以利用MeCP2蛋白或片段或这类蛋白的衍生物与甲基化胞嘧啶结合的能力来确定其生物学活性，例如通过如Nan，X et al.，Cell 88：471-481(1997)、Yusufzai T.M.and Wolffe，A.P.，Nucl.Acids Res.28：4172-4179(2000)或Yu F.et al.，Nucl.Acids Res.29(21)：4493-501(2001)中所述的体外转录测定法。

本文中提到的术语“密码子优化的”核酸序列是指一段核酸序列，其包含的密码子经过设计以使用所需宿主细胞的偏爱密码子，优选的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。将一段核酸序列转变为具有相同的翻译后多肽序列的密码子优化的核酸序列，但是使用备选的密码子选择，特别是使用指定生物(例如大肠杆菌)中最常用的密码子。这样的过程被称为“回译”(backtranslation)。一种选择和制备密码子优化的核酸序列以及进行回译的方法包括例如采用Henaut and Danchin：Analysis and Predictions fromEscherichia coli sequences in：Escherichia coli and Salmonella，Vol.2，Ch.114：2047-2066，1996，Neidhardt FC ed.，ASM press，Washington，D.C.中的II类基因的数据。回译指定蛋白序列的指导可由http://www.prodoric.de/JCat上提供的工具给出(Grote A.et al.，Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，Web Server issuedoi：10.1093/nar/gki376，W526-W531)或从Vector NTI软件(Invitrogen)给出。一种创建密码子优化的MeCP2蛋白核酸序列的方法包括识别MeCP2基因的天然序列(通常与高表达大肠杆菌基因无关)中的密码子和将这些密码子替换为大肠杆菌基因表达中广泛使用的密码子。密码子优化的核酸序列在所需宿主细胞中可能比天然序列有更好的表达。技术人员可根据本发明公开内容检查密码子优化的核酸序列是否能诱导比未优化的序列更高的蛋白产量。一个如何设计和创建本发明的密码子优化的核酸序列的实例见下面的实验部分。

本文中提到的“异种”细胞是指可一种表达并非该细胞的天然基因的基因的细胞。

在一个优选的实施方案中，MeCP2蛋白或其生物学活性片段或它们的衍生物来源于人类。更具体地说，MeCP2蛋白或其生物学活性片段或它们的衍生物可能是人MeCP2异构体e1或人MeCP2异构体e2，或其生物学活性片段，或它们的衍生物。技术人员应该清楚，其他人源或非人源的MeCP2的生物学活性异构体或它们的生物学活性片段或它们的衍生物也可用作本发明的MeCP2蛋白。

在另一个实施方案中，权利要求中所定义的第一核酸序列与密码子优化的人类MeCP2异构体e1(SEQ ID NO.1)或e2(SEQ ID NO.2)的DNA序列具有至少60％、至少65％、特别是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。也包括100％的序列同一性。如果当将一个核酸序列序列与最匹配的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2序列进行比对时，上述两种被比对的序列之间的序列同一性为至少x％，则该核酸分子与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2有“至少x％的同一性”。这样的比对可通过公开的计算机同源程序完成，如NCBI主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上提供的“BLAST”程序。无功能的MeCP2多肽或片段或衍生物可用于诊断目的，而生物学活性功能的蛋白或片段或衍生物则可用于例如治疗目的。这类多肽的生物学活性可通过上述测试验确定。

在另一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子在原核细胞中表达，特别是革兰氏阴性和革兰氏阳性细胞中，例如大肠杆菌细胞或芽孢杆菌(Bacillus sp.)细胞。本领域已知多种适合于核酸分子表达的原核细胞，如各种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。技术人员还将会懂得其他公知的表达系统也可用于实现由本发明的核酸分子蛋白表达。这些适合的细胞可以是在动物体内或体外的非人类细胞，或者在人类体外的人类细胞。实例为哺乳动物细胞如HEK细胞、HELA细胞、CHO细胞等。非哺乳动物源甚至非脊椎动物源的细胞的实例为果蝇Schneider细胞、其他昆虫细胞如Sf9细胞、酵母细胞、其他真菌细胞等。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包含一个第二核酸序列的核酸分子，所述第二核酸序列编码一个含有蛋白质转导结构域的多肽，其中所述第二核酸序列和所述第一核酸序列有效连接。具体地说，所述包含本发明的第一和第二核酸序列的核酸分子选自序列SEQ ID NO.50或EQ ID NO.51。

蛋白质转导结构域是具有高正电荷密度的蛋白区域，并能通过非常规路线穿过生物膜。这些区域的长度通常少于30个氨基酸，其碱性性质和转导特性是因为富含精氨酸和——在很小程度上——富含赖氨酸；参考文献如MoI.Cell Proteomics.2004，3(8)：746-69。转导结构域可以获取自任何能够帮助其他融合有所述转导结构域的蛋白进入细胞的蛋白或其一部分。转导结构域转导蛋白进入细胞的能力可通过任何传统的用于监测细胞吸收蛋白的方法确定，典型方法有荧光素活化的细胞分拣术(FACS sorting)或多种显微镜技术如荧光显微镜。具有转导偶联多肽能力的蛋白质转导结构域可以衍生自例如人类免疫缺陷病毒1的转录反式激活因子蛋白(TAT蛋白，编号AAQ86751)、触足蛋白同源结构域(Derossi et al.，J.Biol.Chem.，269：10444(1994))和HSVVP22蛋白(Elliot and O′Hare，Cell，88：223(1997))，或其他蛋白转导结构域如聚精氨酸序列(polyarginine stretches)(8至10)(综述参见Jones S.W.et al.，Br.J.Pharmacol.(2005)145(8)：1093-1102)或合成肽PTD4(Ho A.et al.，Cancer Res.(2001)15；61(2)：474-477)。在一个优选的实施方案中，所述蛋白质转导结构域衍生自TAT蛋白。甚至更优选地，编码蛋白质转导结构域的核酸序列编码的氨基酸序列所述TAT蛋白转导结构域序列(YGRKKRRQRRR，SEQ ID NO.54)具有至少60％、至少65％、特别至少70％、至少75％、至少80％、至少85％，、至少90％、至少95％或100％的序列同一性。如果当一个氨基酸序列与最匹配的SEQ IDNO.54序列进行比对时，上述两种被比对的序列之间的序列同一性为至少x％，则该核酸序列与SEQ ID NO.54具有有“至少x％的同一性”。这样的线性比对可通过公开的计算机同源程序完成，如NCBI主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上提供的“blastp”程序。但是技术人员将会懂得更长的TAT蛋白片段也可用作蛋白转导结构域。

本文中所用的术语“处于有效连接”(in operative linkage)是指本发明的核酸序列的一个构型，其中一个序列被置于与另一个序列有关的位置上以使所述核酸序列——连接后——方向相同从而使被编码多肽的翻译框不被改变(即核酸分子相互“同框”连接)。这样产生的核酸分子编码一个同框融合蛋白。要达此目的，可通过数种方法组织本发明的核酸序列。一个核酸序列可被置于另一个核酸序列的N末端或C末端，两序列可直接相连或可通过另外的接头核酸相连，所述接头核酸也是与本发明的核酸序列同框的。还考虑到了只要被编码多肽的阅读框能够保持完整，可将一个核酸序列插入到另一个核酸序列之中。如果想让其中被插入片段的序列仍然编码有功能的多肽，可通过本文所述的测试评估所要研究的多肽的生物学活性。

本发明的核酸序列的连接可通过例如DNA操作中的标准连接方法完成，如本文实施例部分和例如Maniatis，T.，Fritsch，E.F.& Sambrook，J.(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY)中所述。也可考虑其他连接方法如化学连接法。

在另一个实施方案中，本发明提供了一个第三核酸序列，所述第三核酸序列与一个包含(i)所述第一核酸序列或(ii)所述第一和第二核酸序列的核酸序列有效连接，其中所述第三核酸序列编码一种或多种适用于蛋白纯化的多肽序列。具体地说，适用于蛋白纯化的多肽序列包括但不限于Strep标签和/或his标签和/或GST标签和/或intein标签。这些标签有助于通过亲和色谱法进行蛋白纯化并且是本领域中公知的标签(例如参见Terpe K.，Appl.Microbiol.Biotechnol.(2003)60(5)：523-533)。所述第三核酸序列与一个包含第一核酸序列或包含第一和第二核酸序列的核酸序列有效连接，即可被置于所述第一或第二核酸序列的N末端或C末端。如果(1)代表第一核酸序列，(2)代表第二核酸序列，(3)代表第三核酸序列，那么这些序列可能的位置排列的方法包括(1)-(2)-(3)、(1)-(3)-(2)、(2)-(1)-(3)、2)-(3)-(1)、(3)-(1)-(2)或(3)-(2)-(1)。这些核酸序列可直接相互连接或通过另外的接头核酸彼此间隔。有接头或无接头的连接均使所有三个核酸序列相互同框，所得的核酸分子编码一个融合蛋白。还应考虑到，只要被编码多肽的阅读框能够保持完整，可将一个核酸序列插入到另一个核酸序列之中。如果想让其中被插入片段的序列仍然编码有功能的多肽，可通过本文所述的测试评估所要研究的多肽的生物学活性。

在另一个实施方案中，本发明的核酸分子还包含一个第四核酸序列，所述第四核酸序列与一个包含(i)所述第一核酸序列或(ii)所述第一和第二核酸序列(iii)所述第一、第二和第三核酸序列的核酸序列有效连接，所述第四核酸序列编码一种或多种报告多肽。合适的报告多肽或报告分子可以显影和/或定位所述融合多肽，例如通过光学方法如荧光显微镜。合适的报告多肽的实例为荧光蛋白(如GFP、CFP和YFP)或能够在二次反应中形成可探测标签的酶(如辣根过氧化物酶、萤光素酶或β-半乳糖苷酶)。除报告多肽之外，技术人员还可考虑使用其他可探测标签或通过放射性标记来标记本发明的融合蛋白，如荧光或发光的有机分子(如荧光素、FITC或Cy5)。

所述第四核酸序列与一个包含所述第一核酸序列或包含所述第一和第二核酸序列或包含所述第一、第二和第三核酸序列的核酸序列有效连接，即可被置于所述第一或第二或第三核酸序列的N末端或C末端。如果(1)代表第一核酸序列，(2)代表第二核酸序列，(3)代表第三核酸序列，(4)代表第三四核酸序列，那么这些序列可能的位置排列的方法包括(1)-(2)-(3)-(4)、(1)-(2)-(4)-(3)、(1)-(3)-(2)-(4)、(1)-(3)-(4)-(2)、(1)-(4)-(2)-(3)、(1)-(4)-(3)-(2)、(2)-(1)-(3)-(4)、(2)-(1)-(4)-(3)、(2)-(3)-(1)-(4)、(2)-(3)-(4)-(1)、(2)-(4)-(1)-(3)、(2)-(4)-(3)-(1)、(3)-(1)-(2)-(4)、(3)-(1)-(4)-(2)、(3)-(2)-(1)-(4)、(3)-(2)-(4)-(1)、(3)-(4)-(1)-(2)、(3)-(4)-(2)-(1)、(4)-(1)-(2)-(3)、(4)-(1)-(3)-(2)、(4)-(2)-(1)-(3)、(4)-(2)-(3)-(1)、(4)-(3)-(1)-(2)或(4)-(3)-(2)-(1)。这些核酸序列可直接相互连接或通过另外的接头核酸彼此间隔。有接头或无接头的连接均使所有四个核酸序列相互同框，所得的核酸分子编码一个融合蛋白。还应考虑到，只要被编码多肽的阅读框能够保持完整，可将一个核酸序列插入到另一个核酸序列之中。如果想让其中被插入片段的序列仍然编码有功能的多肽，可通过本文所述的测试评估所要研究的多肽的生物学活性。

另一方面，本发明涉及由本发明的核酸所编码的多肽。从核酸分子获得多肽的方法在本领域内公知，并且在例如Maniatis et al(见上文)有所描述。

还应考虑到，通过将本发明的两个或多个多肽片段用化学方法连接起来形成融合多肽。化学连接方法通过化学交联在多肽之间产生共价连接。适合的交联剂为例如双功能交联剂如sulfo-MBS、sulfo-EMCS和sulfo-GMBS，以及其他可购自例如Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)的交联剂。

另一方面，本发明提供一个含有本发明核酸分子的载体。这样的载体可以是质粒、噬菌粒或粘粒。例如，可按照Maniatis等人(见上文)所述方法将本发明的核酸分子克隆到一个原核或真核表达载体中。优选地，这个载体可表达本发明的核酸分子所编码的多肽。这种表达载体通常含有至少一个启动子，并且还可含有一个翻译起始信号和一个翻译终止信号或多个转录终止和多腺苷酸化信号。如下面的实施例中所述，适合的表达载体有例如pET28a+载体、pUC18载体或pTRI-Ex-neol.1载体。

另一方面，本发明涉及包含本发明的载体的宿主细胞。这些宿主细胞可以是在动物体内或体外的非人类细胞，或者在人类体内或体外的人类细胞。其他适合的细胞包括原核细胞，特别是革兰氏阴性和革兰氏阳性细胞中。特别优选的是大肠杆菌细胞或芽孢杆菌细胞。可以通过本领域内多种公知的方法将载体转染入宿主细胞中。用于转染宿主细胞和培养这些被转染的宿主细胞的方法，以及由这些被转染的宿主细胞产生和获得本发明的多肽的条件，也都是本领域内公知的，并且在例如Maniatis et al.(见上文)有所描述。

在另一方面，本发明涉及一种制备本发明的核酸序列或核酸分子的方法，包括步骤(a)通过退火和延伸第一组寡聚核苷酸引物生成一个双链核酸分子，其中所述引物包含本发明的核酸序列；和(b)任选性地使用第二、第三或更多组合适的寡聚核苷酸引物重复步骤(a)。

设计本发明合适的寡聚核苷酸引物是将目标核酸序列分成有重叠部分的多个寡聚核苷酸，从而这些寡聚核苷酸包含本发明的核酸序列。典型地，这些寡聚核苷酸包含的重叠部分为3到100个核苷酸，特别是20到30个核苷酸。可设计第二、第三或更多组合适的寡聚核苷酸引物以使所述第二、第三或更多组的每条引物均覆盖所需的本发明的核酸序列的区域，并且这些引物还可能含有与一个或多个上述引物相重叠的部分。优选地，所述重叠部分为3到100个核苷酸，特别是20到30个核苷酸。

要使本发明的寡聚核苷酸引物与一种或多种其他寡聚核苷酸引物或本发明的核酸序列的部分发生退火，条件和步骤应该按照本领域公知的条件和步骤。技术人员将会懂得选择退火步骤的条件要取决于多种因素，如引物长度、重叠部分的长度、GC含量等。退火之后，引物的核苷酸序列可通过公知的PCR反应方法或其他可用于DNA合成的方法进行延伸。参考文献如XiongA.S.，et al.(2004)，Nucl.Acids Res.32(12)：e98。一种制备本发明的核酸序列的方法在下面的实施例1中阐明。

在另一方面，本发明涉及一种产生包含MeCP2蛋白或其生物学活性片段或它们的衍生物的多肽的方法，包含(a)用本发明的核酸分子转染宿主细胞；(b)在可以表达本发明核酸分子的条件下培养被转染的细胞以产生包含MeCP2蛋白或其生物学活性片段或它们的衍生物的多肽；和(c)任选地回收该多肽。

用核酸分子转染宿主细胞的方法在本领域内是公知的。宿主细胞可利用诸如磷酸钙转染、电穿孔、脂质体转染等方法转染。也可用机械方法如DNA显微注射或使用载体如逆转录病毒来转染宿主细胞。参考文献如Maniatiset al.(见上文)。优选地，所述宿主细胞是原核细胞，更优选的是大肠杆菌细胞。培养这些被转染细胞的条件以及可使本发明核酸分子表达以产生本发明多肽的条件是技术人员已知的，并且取决于例如宿主细胞类型和转化宿主细胞所用的载体类型。下面的实施例部分将给出培养宿主细胞和实现本发明的多肽表达的实例。从被转化的宿主细胞中回收多肽的方法在例如Roe，S.(ed.)，Protein Purification Applications：A Practical Approach.Oxford University Press(2001)，Oxfor中有所描述。

在一个优选的实施方案中，该方法的步骤(b)和(c)中不包括将多肽置于变性条件下。本文中提到的多肽的变性，是指因化学或物理作用导致的结构改变，所述结构变化会导致所述多肽失去全部或部分生物学活性。多肽的变性会使多肽的二级和三级结构或构象发生改变，但通常会保持一级结构。变性可因为例如温度、pH的改变、去污剂或盐类的添加、超声波等而发生。与例如为了纯化目的而在变性条件下培育和回收多肽的最常见的方法相比，在自然条件下提取多肽可能具有保持功能活性和减少因多肽错误折叠而导致的胞内分解的优点。这种自然提取的本发明的多肽可具有较高的转导效率。

在一个优选的实施方案中，在该方法的步骤(b)之后多肽的浓度是每升细菌培养物中大于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg。蛋白浓度可用考马斯(Bradford)蛋白浓度测定试剂盒(Pierce，Rockford，USA)根据厂商说明书测定。在一个实例中，蛋白浓度是将样品溶液从亲和柱上洗脱下来并脱盐之后测定的。典型的，蛋白浓度是通过跟一系列如白蛋白标准品的蛋白标准品相比测定的。标准品用于校正光度计如EppendorfBioPhotometer(测量例如595nm的吸光度)。在一个实例中，将100μl蛋白质洗脱液与5ml“考马斯蛋白浓度测定试剂”(Pierce)混合，在室温下平衡10分钟，然后用分光光度计测量。然后用综合算法(integrated algorithm)计算样品浓度。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，包含本发明的核酸分子和/或多肽，以及一种可药用载体。技术人员熟悉合适的可药用载体材料。

在另一方面，本发明提供一种治疗神经变性疾病或神经发育疾病的方法，包含将本发明的多肽或药物组合物给予哺乳动物。优选地，该哺乳动物为人类。可能的给药方式为静脉内、腹腔内、鞘内、皮下、直肠、舌下、鼻腔、口服或透皮给药。

通常，神经变性疾病疾病是由神经元细胞的退化和丧失导致的进行性疾病。神经发育疾病是由出生前和——某些情况下——出生后脑部发育障碍引起的疾病。具体地说，神经变性疾病或神经发育疾病是由于MeCP2表达的降低或MeCP2功能受损导致的。MeCP2功能受损可通过例如MECP2基因突变导致的功能影响来加以认识，如Yusufzai T.M.and Wolffe A.P.，Nucl.AcidsRes.(2000)，28(21)：4172-4179、Kudo S.et al.，Brain Dev.(2001)Suppl1：S165-73和Ballestar E.et al.，Hum.Genet.(2005)116(1-2)：91-104中所述。通常，MBD(甲基结合结构域)突变可改变MeCP2与DNA结合或从DNA被释放出来的能力，从而导致其失去功能。TRD(转录抑制结构域)中的突变通常改变或破坏该蛋白的转录抑制功能，导致MeCP2表达的降低。鉴于前述公开内容，主治医生可了解患者是否适合接受本文所述的处理和/或治疗方法，或是否能从中受益。

更具体地说，神经发育疾病指Rett综合征。Rett综合征是一种出生后神经发育疾病，特征为进行性地丧失智力、丧失精细和粗大运动能力和交流能力。Rett综合征的一般特征是头部发育的减缓以及不同模式的刻板手部运动的发生。诊断标准已被定义并有助于临床诊断(Hagberg B.et al.Eur.J.Paediatr.Neurol.(2002)6(5)：293-7)。诊断Rett综合征的手段包括筛选MECP2基因突变。

在另一个实施方案中，按照合适的剂量给予所述药物组合物。技术人员将了解用于确定合适的给药剂量的方法。合适的剂量可使因MeCP2表达降低或MeCP2功能受损而患神经变性疾病或神经发育疾病的哺乳动物的病情得到普遍改善。合适剂量的效果包括患者注意力的增加、癫痫发作的减少、运动技巧的提高和Rett综合征相关症状的改善。优选地，该药物组合物的给药剂量为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100μg的本发明的多肽或核酸序列/g哺乳动物体重。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物为至少每天，至少每2、3、4、5、6或7天给药一次。

在本发明的另一方面，提供了本发明的核酸分子用于制备一种包含MeCP2蛋白或其生物学活性片段或它们的衍生物的多肽的用途。下面的实施例部分提供了这种用途的实例。

在另一方面，本发明涉及将上述核酸分子或多肽用于医药或兽药。在另一方面，本发明涉及本发明的核酸分子或多肽用于制备一种用于防止和/或治疗神经变性疾病或神经发育疾病的药物组合物的用途，如上所述。更具体地说，神经发育疾病是由MeCP2表达的降低或MeCP2功能受损所导致的，如上所述。具体地说，该神经发育疾病为Rett综合征，如上所述。所述核酸分子、多肽或药物组合物为适合于给予哺乳动物的形式。优选地，该哺乳动物为人类。可能的给药方式为静脉内、腹腔内、鞘内、皮下、直肠、舌下、鼻腔、口服或透皮给药。

附图说明

图1.A.本图示出了用于制备SEQ ID NO：3的合成序列的方法。根据针对大肠杆菌进行过密码子优化的序列设计了十个寡聚核苷酸(以箭头表示)。在步骤1中，通过PCR反应进行合成，用两个长度为100bp的寡聚核苷酸(Mecp2_syn_5′_core_F和Mecp2_syn_5′_core_R)合成中心片段，所述寡聚核苷酸的3’末端有20个核苷酸互补。终产物的长度为180bp，在图中以延长的虚线表示。在步骤2中，使用一份第一次反应的产物作为模板，以两个长度为100bp侧翼寡核苷酸Mecp2syn_5′_F1和Mecp2syn_5′_R1作为引物进行第二次PCR反应。继续在步骤3、4和5中进行相似的反应。B.表示合成的终产物及其上的用于进行后继克隆步骤的三个限制性酶切位点。C.通过PCR生成的具有用于克隆的相关限制性酶切位点的合成DNA的图示。

图2.产生MECP2构建体的流程图。该流程示出了克隆过程的所有中间步骤，产生含有融合了TAT结构域的MeCP2e1和MeCP2e2的合成基因的最终表达载体。

图3.A.根据大肠杆菌的密码子选择优化序列后，MeCP2e2蛋白产生的增量。Strep标记的重组融合蛋白通过10％SDS-PAGE分离并用考马斯亮蓝染色。上样的蛋白浓度对应于等量的处理过的细菌液体培养物。泳道1，人类cDNA的TAT-MeCP2e2-EGFP；泳道2，根据大肠杆菌的密码子选择部分优化的MeCP2cDNA的TAT-hsMeCP2e2-EGFP；泳道3，根据大肠杆菌的密码子选择部分优化的MeCP2cDNA的His-TAT-hsMeCP2；泳道4，完全合成的MECP2基因所产生的His-TAT-sMeCP2。照片清楚地显示使用密码子优化的cDNA序列使蛋白产量大幅增加。

B.-D.MeCP2e2-EGFP在体外的表达与分布。B.上排：稳定表达TAT-MeCP2e2-EGFP融合蛋白的NIH3T3细胞系的显微照片。大约40％的细胞正在表达TAT-MeCP2e2-EGFP蛋白。箭头指出一个具有MeCP2e2蛋白的典型异染色质分布(DAPI)的细胞(在插图中以更高的放大倍数显示)。下排：几乎100％的HeLa细胞均正在表达MeCP2e2蛋白。蛋白全部位于细胞核内，细胞质中无任何着色。插图示出了MeCP2的异染色质分布。C.取从NHI3T3和HeLa未转染对照(wt)中提取以及从相应的稳定表达TAT-MeCP2e2-EGFP的细胞系(st)中提取的蛋白各100μg，用抗乙酰化组蛋白H3的抗体进行蛋白印迹反应，以多克隆的抗-MeCP2和抗-α微管蛋白作为上样对照。在两个稳定表达的细胞系中融合蛋白的表观分子量为1000kDa。D.蛋白印迹信号的密度定量显示与野生型细胞系相比过量表达TAT-MeCP2e2-EGFP的细胞系中的组蛋白H3的乙酰化下降了50到60％。

图4.A.TAT-MeCP2e2-EGFP在几种细胞类型中的转导动力学和分布模式。将NIH3T3细胞用50μg/ml的TAT-MeCP2e2-EGFP分别培育3(a、b)或12小时(c、d)。3小时之后，只有部分细胞被转导，重组蛋白大部分位于细胞质中，以粗点示出(a、b)。培育12小时之后，重组蛋白转导全部细胞，并大部分位于其生理定位——细胞核中。e.共聚焦成像证实该蛋白主要位于细胞核中。f.不含TAT的重组EGFP蛋白不管经过多长时间都不能穿透细胞，它只能被显影为胞外游离的点(培育12小时)。g和h.TAT-MeCP2e2-EGFP也被用于测试其在p.T158M Rett综合征患者的成纤维细胞中的转导效率。融合图示出了该蛋白已经有效地转导了所有成纤维细胞。其主要位于细胞核中，但仍有一些蛋白位于细胞质中(插图)。i和j.用TAT-MeCP2e2-EFGP融合蛋白培育野生型小鼠的原代海马神经元细胞。MeCP2e2很容易在细胞核中被检测到。B.和C.TAT-MeCP2e2蛋白在转导的NIH3T3细胞中的保留时间。NIH3T3细胞培养物分别用相同量的TAT-MeCP2e2蛋白培育。在不同的时间点从这些处理的细胞培养物中收集蛋白提取物。B.蛋白印迹分析显示在2，24，48，72，96(几乎不可见)小时有重组蛋白存在，但在培育后120小时已无重组蛋白存在(分别对应泳道1-6)。C.密度计量分析显示蛋白浓度随时间下降。在24和48小时之间观察到最大的下降-约77％。比值是将泳道1的绝对值设为100％而计算得出的。然后相应地改变不同时间点的比值。

图5.Mecp2影响组蛋白H3和H4K16的乙酰化。a.对取自表达野生(1)和突变MeCP2(2)(p.T158M突变体)的单等位基因细胞培养物的蛋白提取物进行组蛋白H3和H4K16的乙酰化状态分析。将表达突变等位基因的单等位基因细胞系的细胞培养物分别用300pmo1 TAT-MeCP2e2(3)、MeCP2e2(4)和TAT-EGFP(5)重组蛋白培育64小时。MeCP2蛋白仅在与TAT-MeCP2e2(3)一起培育的细胞系中可检测到，在与MeCP2e2一起培育的细胞系中检测不到。TAT-EGFP成功地转导了所述细胞，并且可用抗-GFP抗体(5)检测到它。b.使用微管蛋白作为蛋白上样对照时，蛋白印迹的标准化密度计量分析显示：与野生型(WT)相比，表达突变等位基因(Mut)的单等位基因细胞系中非乙酰化组蛋白H3轻微减少以及组蛋白H3和H4K16高度乙酰化(白色条与黑色条相比)。用TAT-MeCP2e2培育突变体细胞系诱导了H3和H4K16高度乙酰化减少，和非乙酰化形式H3(灰条)轻度增加。在分别使用等摩尔量不含TAT的MeCP2蛋白和TAT-EGFP蛋白培育的细胞培养物中，未观察到组蛋白乙酰化有明显的变化(斜纹和水平线条)。这些结果证明TAT-MeCP2e2具有生物学活性。c.用300pmol TAT-MeCP2e2(3)培育wt小鼠(1)、Mecp2^-/y小鼠(2)以及MECP2^-/y小鼠的成纤维细胞提取物，进行蛋白印迹。抗-MeCP2抗体显示重组蛋白可有效转导成纤维细胞。使用微管蛋白作为对照。d.对用微管蛋白作为对照蛋白的c.图中所示的蛋白印迹进行的标准化密度计量分析显示与野生型小鼠(wt)相比，Mecp2^-/y(ko)小鼠的非乙酰化形式的组蛋白H3减少，乙酰化形式的组蛋白H3没有增加，但是乙酰化形式的组蛋白H4K16有所增加(白色条与黑色条相比)。用TAT-MeCP2e2(ko+)培育Mecp2^-/y小鼠成纤维细胞培养物导致非乙酰化组蛋白H3(灰条)增加，H4K16高乙酰化水平降低。

图6.MeCP2可在体内被定向到CNS神经元。a.分别对三只野生型小鼠经腹腔注射TAT-MeCP2e2-EGFP(泳道1)、TAT-MeCP2e2(泳道2)或者不含TAT的MeCP2e2(泳道3)蛋白，20小时后处死，分别取50μg脑蛋白溶解产物用抗-MeCP2抗体进行免疫印迹。在泳道1中，TAT-MeCP2e2-EGFP的存在可通过其比内源Mecp2蛋白更高的分子量来识别。被注射TAT-MeCP2e2的小鼠的MeCP2e2蛋白信号(泳道2)比泳道1和3强很多，而内源Mecp2水平没有明显的差异。b.使用TAT-MeCP2e2-EGFP和不含TAT的EGFP蛋白注射的野生型小鼠脑部在注射20小时后的免疫荧光。GFP信号位于被注射TAT-MeCP2e2-EGFP小鼠的皮质、小脑颗粒细胞层和外脑膜中几乎所有细胞的细胞核中(1-6)。被注射EGFP的小鼠脑内没有检测出EGFP(7和8)。c.两只Mecp2^-/y小鼠每只均注射重组蛋白的一个异构体，然后用多克隆抗-MeCP2抗体检测免疫荧光。第一和第二排显示了Mecp2^-/y小鼠的皮质切片，该小鼠已用重组TAT-Mecp2e1(1，2，3)和e2(4，5，6)处理了20天。。主要存在于细胞核中的MeCP2在插图中清晰可见。一只未注射MeCP2+/y的小鼠(7，8，9)和一只MeCP2^-/y小鼠(10，11)的脑部切片作为对照。

图7.A.在TAT-MeCP2e1转导的Mecp2^-/y动物成纤维细胞培养物进行的共免疫沉淀实验示出了HDAC1的募集。上排是使用抗MeCP2多克隆抗体的免疫沉淀蛋白级分的蛋白印迹(＂+＂表示有抗体存在的沉淀级分，＂-＂表示没有抗体存在的沉淀级分)。下排是使用抗-HDAC1抗体对同样的免疫沉淀物的蛋白印迹分析。泳道1和2：野生型动物成纤维细胞的沉淀蛋白级分。泳道3、4和泳道5、6：分别使用TAT-MeCP2e1和TAT MeCP2e2转导的Mecp2^-/y小鼠成纤维细胞的沉淀蛋白级分。泳道7和8：Mecp2^-/y动物成纤维细胞的沉淀蛋白级分。在免疫共沉淀片段中，MeCP2以及HDAC在阳性对照级分(泳道1)以及使用两种TAT-MeCP2异构体转导的细胞级分(泳道3和5)中的存在都是可见的。在阴性对照的沉淀级分(泳道7)中未检测到Mecp2和HDAC1。在缺少抗-MeCP2的免疫沉淀中未显示MeCP2和HDAC1的存在。

B.和C.TAT-MeCP2异构体调节脑内H3和H4K16的高乙酰化。B.对Mecp2缺陷的小鼠分别经腹腔注射PBS(泳道2)、20μg/g的TAT-MeCP2e1(泳道3)或者30μg/g的TAT-MeCP2e1(泳道4)，持续14天。用抗组蛋白H3抗体(H3)、抗乙酰化组蛋白H3抗体、抗乙酰化组蛋白H4K16抗体和抗MeCP2抗体对分别取自所有被注射小鼠(2-4)和未被注射的野生型小鼠(1)的50μg脑蛋白提取物进行免疫印迹。使用抗α-微管蛋白抗体作为对照。Mecp2^-/y小鼠没有显示任何可检测的Mecp2或者重组蛋白(泳道2、3和4)。与野生型小鼠相比，在被注射PBS的MeCP2缺陷的小鼠中未检测出明显的H3和H4K16的高乙酰化。但是，注射重组蛋白减少了组蛋白H4K16的乙酰化。未观察到乙酰化和非乙酰化组蛋白H3有明显的差异。C.密度计量分析显示MeCP2蛋白具有剂量依赖性的生化活性。使用TAT-MeCP2e2蛋白进行类似物实验获得一致地相似结果。比值代表了密度计量值，密度计量值表示为占被定位为100％的wt动物值的百分比。

图8.转运到脑的MeCP2异构体延长了寿命，并治疗了MeCP2^-/y小鼠的神经元病状。a.Kaplan-Meier图分别描绘了未处理的(n＝11)、模拟处理的(n＝6)或者使用TAT-MeCP2e1(n＝5)或TAT-MeCP2e2(n＝5)处理的MeCP2^-/y小鼠的存活曲线。b.双尾t学生检验(two tailed t-Student′s test)显示未注射/模拟注射组比TAT-MeCP2e1组以及比TAT-MeCP2e2的p值<0.05(α＝0.05)。TAT-MeCP2e1/TAT-MeCP2e2之间(p>0.8)以及未注射/模拟注射组之间无统计学差异。c.CA2海马神经元的尼斯尔染色显示，相比于野生型小鼠(2)，MeCP2^-/y小鼠(1)有更小和更稠密的神经元。相反，TAT-MeCP2e1(3)处理使Mecp2^-/y小鼠的神经元破坏得到恢复。(4)是被TAT-MeCP2e2处理的小鼠的海马图，所述处理没有改变神经元大小。d.海马CA2神经元的细胞救援的定量(wt的n＝3、Mecp2^-/y的n＝3、TAT-MeCP2e1处理小鼠的n＝4并且TAT-MeCP2e2的n＝3)。

实施例部分

本发明由以下实施例来进一步阐述，但并不因此而受限制。实施例包含技术特征，并且应理解，本发明也涉及实施例部分中的多种技术特征的结合。

1.创建构建体

为了确定密码子优化的序列是否能促进蛋白产量提高，在设计密码子优化时使用了两步法。首先，通过选择在大肠杆菌中使用频率至少为8-10％的密码子使仅约一半的MECP2编码序列得以优化，如下所述。然后对改进后的表达进行评估。“半合成的”MeCP2使蛋白产量明显增加证实了本方法的有效性，在第二步中将全部序列进行密码子优化，如图3A所示。引物的重叠部分的长度通常为20个核苷酸，典型的熔解温度为至少50℃，但是在许多情况下，为了确保在PCR介导合成过程中有效退火，需要创建更长的重叠部分。图2是创建以下构建体的流程图。

1.设计两个在3′末端有20个碱基互补的寡聚核苷酸(TAT-core-F和TAT-core-R，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8)。然后使用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)使每种浓度为20pmol的寡聚核苷酸在下面条件下延伸：96℃下变性15min，然后在60℃下延伸30min。然后将产物克隆到pBluescript载体(Stratagene，La Jolla，USA)中并测序。然后再用两个另外的引物(TAT-new-F和TAT-new-R，SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10)扩增上述插入片段，生成一个分别在5′和3′基因组末端具有EcoRI和HindIII限制性位点的产物。然后将使用EcoRI和HindIII消化的该产物亚克隆到puc18载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中生成pTAT-Strep构建体。编码pTAT-Strep构建体中所含的TAT和Strep tag-II的cDNA在SEQ ID NO 5中给出(步骤1，图2)。

2.从pEGFP-C1载体(Clontech，CA，USA)上切下EGFP序列克隆到pTAT-Strep构建体中，称为puc18-TAT-EGFP-Strep(步骤2，图2)。

3.使用引物NotI-3G-MeCP2-F和R-MeCP2-3G-NcoI(SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12)和Pfu聚合酶从克隆pCR-hMeCP2(W.Stratling，Universitatsklmik Eppendorf，Hamburg，Germany)中扩增出MECP2基因的cDNA序列。剪切所述PCR产物的5′和3′基因组末端的Not1和Nco1限制位点序列并将其克隆到puc18-TAT-EGFP-Strep中。衍生出的构建体为pTAT-MeCP2e2-EGFP-Strep(步骤3，图2)。

4.使用引物BspHI-TAT-F(SEQ ID 38)和XhoI-EGFP-R(SEQ ID 39)和Pfu聚合酶从构建体pTAT-MeCP2e2-EGFP序列扩增出TAT-MeCP2e2-EGFP-Strep序列，得到pTri-EX-TAT-MeCP2e2-EGFP-Strep-His(step4，fig2)真核表达载体。将PCR产物用BsphI/XhoI消化并克隆到用NcoI/XhoI线性化的pTRI-Ex-Neo.1.1载体(Novagen，Darms tadt，Germany)中。

5.通过同构建体1相似的方法，生成pET28-PTD4-6his构建体，使用寡聚核苷酸PTD4_core_F(SEQ ID NO 40)、PTD4_core_R(SEQ ID NO 41)、PTD4_ampJF(SEQ ID NO 42)和PTD4_amp_R(SEQ ID NO 43)生成一个编码肽PTD4的序列(Ho A et al.Cancer Res.2001 Jan 15；61(2)：474-7.)。所得产物使用NcoI和XhoI消化并且克隆到被同样消化过的pET28a(+)载体(Novagen，Merck，Darmstadt，Germany)中，生成pET28-PP4-6His质粒(步骤5，图2)。pET28-PP4-6His质粒中的编码序列在SEQ ID 6中给出。

6.将从pTAT-MeCP2e2-EGFP-Strep上切下的Ndel/Bspel片段克隆到用NdeI和AgeI消化的pET28-PP4-6His中。产生的构建体称为pET28-TAT-MeCp2e2-EGFP-6His(步骤6，图2)。

7.将从pTri-EX-MECP2-EGFP-Strep-6His切下的Not1/Xho1片段克隆到用同样限制性内切酶消化的pET28-TAT-MeCP2e2-EGFP-6His中。产生的构建体为pET28-TAT-MeCP2e2-EGFP-Strep-6His。

8.使用引物Mecp2-His-F1(SEQ ID 44)和Mecp2_His_rev(SEQ ID 45)扩增一部分人类MeCP2序列。将该产物克隆到pBluescript中生成pBlue-6His质粒(步骤8，图2)。

9.从含有His-tag的pBlue片段中取得含有6His序列和一部分MeCP2编码序列的NdeI/DraI片段，并将其克隆到被同样消化过的pET28-TAT-MECP2e2-EGFP-Strep-6His中。生成的质粒称为pET28-6HisTAT-MeCp2e2-EGFP-Strep-6His(步骤9，图2)。

10.从pET28-6HisTAT-MeCp2e2-EGFP-Strep-6His载体上取得所述Xhol和DraIII片段。然后使用引物Mecp2_pet_XhoI(SEQ ID 46)和Mecp2_pet_DraIII(SEQ ID 47)来扩增同一片段(但不含6His编码序列)。然后使用该PCR产物将所述片段重构到pET28-6HisTAT-MECP2e2-EGFP-Strep-6His中。产生的质粒为pET28-6HisTAT-MECP2e2-EGFP-Strep(步骤10，图2)。

1.1得到合成基因：

使用含有人类MECP2cDNA的pET28-TAT-MECP2e2-EGFP-Strep-His载体生成重组蛋白的尝试难以令人满意。每升细菌培养物的蛋白产量大约为0.1mg。为了克服在大肠杆菌中蛋白表达量不足的问题，设计了针对该生物优化过的合成MeCP2来克服对密码子偏爱的限制。根据大肠杆菌的偏爱密码子选择，对两个人类MeCP2异构体e1和e2的氨基酸序列进行回译。cDNA序列的GC含量也被降低，这也可能是限制蛋白产量的另一个原因。然后用一系列重叠的核苷酸通过PCR介导的合成创建这种人工序列。我们使用PfuUltra高保真的DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla)和18个互补的寡聚核苷酸通过两个独立反应合成了MECP2e2编码序列。在第一步中，一组10个寡聚核苷酸(Seq ID NO 13-SEQ ID NO 22)生成810bp的SEQ ID NO.3序列，该序列还包含编码TAT结构域的序列和用于亚克隆的限制位点。合成的基本方法在图1中加以概括。在所述第一步中，有20bp互补的两个核心寡聚核苷酸被退火和延伸。然后以生成的PCR产物作为模板，用其他互补寡聚核苷酸使该合成基因进一步延长。

反应成分(50μl)：

引物：Tat_core_F/Tat_core_R(100pmol/μl)   每种1μl

dNTPs混合物(每种核苷酸2.5mM/μl)           8μl

10X DNA聚合酶缓冲液                       5μl

Ultra Pfu聚合酶(2.5单位/μl)               2μl

dd H20                                    33μl

生成第一个片段的热循环仪条件：

第一步：初始变性96℃30秒；然后循环10次：96℃20秒；55℃30秒；72℃1min；

第二步：20次循环：96℃30秒；72℃1min；最后延伸：72℃5min。

所得产物在Montage(Millipore)PCR纯化柱上纯化。

接下来的反应步骤使用1μl纯化的PCR产物和下文所述引物对(每条10pmol)，反应条件为：初始变性96℃2min；然后循环25次：96℃变性20秒；55℃变性30秒；72℃变性1min。后面的每个扩增步骤均以前面产生的片段作为模板，在同样条件下进行，但下一步扩增的延伸时间要增加10秒(图1)。

11.将生成的序列克隆入pBluescript并检查序列错误。选择一个没有错误的克隆并且命名为pBlue-MECP2e2-syn(步骤11，图2)。

12.从pBlue-MECP2e2-syn上取得EcoRI/XcmI片段，并将其克隆到事先用同样的限制酶消化过的pTAT-MECP2e2-EGFP-Strep中。将产生的质粒命名为pTAT-MECP2e2syn-EGFP-Strep(步骤12，图2)。

13.从pTAT-MECP2 e2 syn-EGFP-Strep上取得NotI/SacI片段并将其克隆到同样消化过的pET28-6His-TAT-MECP2-EGFP-Strep中。产生的质粒为pET28-His-TAT-MECP2 e2(half)syn-EGFP-Strep(步骤13，图2)。

14.通过用Sac II和BsrGI限制酶消化从pET28-His-TAT-MECP2e2(half)syn-EGFP-Strep载体上取得EGFP。通过使用反向引物Mecp2_BsrGI(SEQ ID NO 31)和正向引物Mecp2_1282_1306(SEQ ID NO 32)重新生成部分删除的MeCP2来生成PCR产物，并将其克隆到pET28-His-TAT-MECP2 e2(half)syn-EGFP-Strep的SacII/BsrgI限制位点中。所得载体被称为pET28-His-TAT-MECP2 e2(half)syn-Strep，其不编码EGFP(步骤16，图2)。通过使用与图1和上面类似的方法，用第二组8个寡聚核苷酸(SEQ ID NO 23-SEQ ID NO 30)生成序列SEQ ID NO 4。

15.将PCR产物克隆入pBluescript，并且命名为pBlue-MECP2 e2-syn_3part(步骤14，图2)。

16.从pBlue-MECP2 e2-syn_3part载体上取得Xcm1/BsrGI片段，并将其克隆到pTAT-MECP2 e2 syn-EGFP-Strep中生成pTAT-MECP2 e2 syn。此载体含有SEQ ID NO 2(步骤5，图2)所示的完全优化过的序列。

17.使用Not1/BsrGI从pTAT-MECP2 e2 syn上切下所述完全合成的MeCP2e2序列，并将其克隆到同样消化过的pET28-His-TAT-MECP2e2(half)syn-Strep中。产生的片段含有所述完全合成的MeCP2e2序列，称为pET28a-6His-TAT-MECP2 e2 syn-Strep，它是在用于大规模蛋白生产的构建体之一。

18.使用寡聚核苷酸cp2b_syn_F(SEQ ID NO 33)、Mecp2b_syn_core(SEQID34)和Mecp2b_syn_R(SEQ ID 35)产生含有MeCP2e1异构体序列的PCR产物。

反应成分(50μl)：

引物：Mecp2b_syn_core/Mecp2b_syn_R(100pmol/μl)   每条1μl

dNTPs混合物(每种核苷酸2.5mM/μl)                  8μl

10X DNA聚合酶缓冲液                   5μl

Ul tra Pfu聚合酶(2.5单位/μl)          2μl

dd H20                                33μl

生成第一个片段的热循环仪条件：

第一步：初始变性：96℃30秒；然后循环10次：96℃20秒；55℃30秒；72℃1min；

第二步：20次循环：96℃30秒；72℃1min；最后延伸72℃5min。

从生成的PCR片段中取1μl作为后续反应的输入DNA：

反应成分(50μl)：

引物：Mecp2b_syn_core/Mecp2b_syn_R(10pmol/μl)   每条1μl

第一次PCR生成的PCR产物                          1μl

dNTPs混合物(每种核苷酸2.5mM/μl)                 8μl

10X DNA聚合酶缓冲液                             5μl

Ultra Pfu聚合酶(2.5单位/μl)                     2μl

dd H20                                          32μl

初始变性：96℃1min

然后在下列条件下循环30次：96℃20秒；60℃30秒；72℃30秒

最后延伸步骤：72℃5min。

用此PCR片段替换pET28a-6His-TAT-MECP2e2syn中EagI到PstI位点之间的片段，生成pET28a-6His-TAT-MECP2elsyn Strep(步骤18，图2)。

19.通过使用引物Mecp2-syn-Nde I_F(SEQ ID 36)和Mecp2-syn-BsrGI_R(SEQ ID 37)扩增所述完全合成的但不含TAT结构域的MECP2序列，然后将生成的PCR产物克隆到同样消化过的pET28-His-TAT-MECP2e2(half)syn-Strep重。所得质粒被称为pET28a-6His-MECP2 e2syn-Strep(步骤19，图2)。

2.所述蛋白的表达和纯化

本研究中的关键步骤是有效产生重组蛋白。如上文所述，我们根据大肠杆菌的密码子选择创建了两个异构体e1和e2的MECP2-cDNA的合成序列以增加重组蛋白的产量(图3A)。下面示出的几个体外研究证实了TAT-MeCP2融合异构体的生物化学活性，不考虑有其他结构域的存在(也参见图5和图7)。与最常见的在变性条件下提取融合有转运结构域的蛋白的方法不同，我们决定在自然条件下提取重组蛋白以完整地保持蛋白的功能活性并且减少由于错重叠导致的细胞内降解。下文示出的体外实验指出在自然条件下提取的蛋白有很高的转导效率。

为了进行蛋白表达，用质粒载体通过电穿孔转导大肠杆菌株Rosette2(DE3)(Novagen)。将一个单菌落接种到10mL添加有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在37°℃下振荡生长过夜。按1:25比例稀释预培养物至250mL添加有50μg/ml卡那霉素的培养基中，在37℃生长5小时，然后40℃保持1小时。进一步按1:10比例稀释培养物至添加有50μg/ml卡那霉素的2.5L富培养基(rich media)(每升LB中含2.5g肉提取物)中，并用1mM IPTG在30℃下诱导大约12小时。在4℃下以7000g离心10min收集细胞。在含有100μg/ml PMSF、1μl/ml蛋白酶抑制剂混合物(CALBIOCHEM)、500μg/ml溶菌酶、1单位/ml Benzonase(Merck Biosciences)的细菌溶解缓冲液(每个培养物沉淀使用15ml)中重新悬浮沉淀并涡旋溶解。将溶解产物在室温下培育10min，然后置于冰上15min，接着进行超声波处理(50-60秒工作周期，5-6级输出)6次，每1min之间间隔2min以避免过热。将溶解产物以18,000g在4℃下离心25min，然后使用0.45μM过滤器(Millipore)过滤上层清液，并且按厂商说明书使用strep-tactin亲和层析柱(IBA，Goettingen，Germany)纯化。然后使用PD-IO脱盐柱(GE Hel thcare，Freiburg，Germany)对蛋白进行缓冲液置换。缓冲液组成为：20mM HEPES、300mM NaCl、0.1mM CaCl₂和10％丙三醇。使用前述缓冲液平衡EndoTrap柱(Profos，Regenburg，Germany)后，根据厂商说明书用所述EndoTrap柱除去细菌脂多糖。

3.细胞培养和融合蛋白的转导

3.1细胞系

用添加有10％胎牛血清(PAN Biotech)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(PAN Biotech)的Dulbecco’s改良Eagles培养基(PAN Biotech)在37℃、5％CO₂的条件下培养NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞，ATCC CCL 92)。

用添加有15％胎牛血清、100U/ml抗生素青霉素、100μg/ml链霉素以及100ng/ml L-谷氨酸的RPMI1640培养基在37℃、7％CO₂的条件下培养取自一名女性Rett综合征患者皮肤活检样品的成纤维细胞，该细胞携带最频繁发生的MECP2基因突变之一(T158M)。

从出生后7天(P7)的Mecp2^-/y小鼠的后肢/后尾梢取得成纤维细胞。使用DPBS冲洗所述组织并在层流下用无菌手术刀在含有培养基的35mm培养皿中将其切成小片。小心吸出培养基并更换成新培养基。将培养皿在37℃、10％CO₂的条件下培育一周而不更换培养基，然后用Dulbecco’s改良Eagles培养基在37℃、7％的CO₂条件下培养所述成纤维细胞，该培养基添加有20％的胎牛血清和抗生素青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)。

按照一种公开的方法(Ray，J.，et al.，1993，PNAS 90：3602-6)，使用在层流下切开出生后7天(P7)的小鼠(pup)大脑分离海马和大脑皮层用于神经元培养。

3.2建立表达TAT-MeCP2e2-EGFP蛋白的稳定细胞系

为了建立表达TAT-MeCP2e2-EGFP蛋白的稳定细胞系，我们使用NIH3T3(小鼠成纤维细胞)和HeLa细胞(人类宫颈癌)。将HeLa细胞在添加有10％的胎牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)以及L-谷氨酸(100ng/ml)的MEM-alpha(PAN Biotech，Aidenbach，Germany)中培养。将NIH3T3在添加有10％的胎牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)的DEME中培养。按照产商(Novagen)说明书利用gene juice转染剂使pTriEx-TAT-MeCP2e2-EGFP-Strep-His转染细胞。转染两天后，用含有500μg/ml的新霉素(GIBCO)的培养基对细胞筛选6周，之后用含有200μg/ml的新霉素的培养基培养。拍摄在两室培养载玻片(Falcon，BD bioscience，Heidelberg，Germany)上生长了一天的细胞的照片。冲洗细胞并使用含有DAPI(Vector laboratories，Burlingame，CA)的载体屏蔽固封剂(Vectorshield mounting medium)固定细胞，用SIS分析软件(Soft Imaging SystemGmbH，

)分析200X放大的奥林巴斯显微镜BX60(Olympus OpticalCo.LTD，Japan)的5个不同区域的荧光分布情况。

3.3建立Rett患者单等位基因原代细胞系

按照厂商(Qiagen，Hilden，Germany)说明书，利用SuperFect转录剂使用含有hTERT(Human Telomerase Reverse Transcriptase Subunit，人端粒酶逆转录酶)编码基因的pCI-neo-hTERT质粒(Counter，CM.et al.，1998，Oncogene 16：1217-22和Lundberg，A.S.et al.，2002，Oncogene21：4577-86)转染患者的成纤维细胞。用含G418(200μg/ml)(Calbiochem，San Diego，USA)的培养基对所述被转染的细胞筛选6周，之后用含有100μg/ml G418的培养基培养。为了建立一个单等位基因表达细胞系，用胰蛋白酶处理细胞并且用培养基稀释，在直接用显微镜目视的情况下微量吸取单细胞，将单独的细胞从添加有20ng/ml bFGF(基本的成纤维细胞生长因子)(Sigma，Deisenhofen，Germany)的指数增长的原代细胞中转移入含有经过滤的条件培养基的24孔板中。细胞汇合时，将所述细胞用胰蛋白酶处理并加以增殖。使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取总RNA并且用Superscript-II反转录酶和Oligo(dT)12-18引物(Invitrogen)合成cDNA。用侧翼引物(Rett_EX3-F和Rett_EX4-R，SEQ ID NO48和SEQ ID NO49)通过RT-PCR分析含有突变的区域。通过对RT-PCR产物进行序列分析以确认克隆形成能力。

4.融合蛋白的转导和转导细胞的分析

为了转导TAT-MeCP2-EGFP和EGFP蛋白，使细胞在两室培养载玻片(Falcon，BDBioscience，USA)上生长至融合。给培养物提供新鲜培养基，然后使用各种浓度的融合蛋白(500-1500pmol/ml)对培养物进行处理，持续不同的时间。按照产商的说明书(Pierce biotechnology，IL，USA)，在使用NHS-罗丹明标记后，使用TAT-MeCP2e1、TAT-MeCP2e2和MeCP2蛋白进行转导，然后通过在PD-10柱上进行凝胶过滤以去除未结合的罗丹明。为了使荧光分布情况可见，使用冷PBS轻轻冲洗所述细胞，并用新鲜配制的含4％多聚甲醛的PBS溶液在室温下固定5min。再次用PBS冲洗所述细胞，然后使用含有DAPI(Vector laboratories，Burlingame，CA)载体屏蔽封固剂固定细胞，用SIS分析软件(Soft Imaging System GmbH，

)分析200X放大的奥林巴斯显微镜BX60(Olympus Optical Co.LTD，Japan)的5个不同区域的荧光分布情况，并使用莱卡TCS SP2 AOBS激光扫描显微镜摄取共聚焦图像。

5.建立稳定过表达MeCP2e2蛋白的细胞系和成功转导原代细胞

我们通过使用pTri-Ex-MECP2-EGFP-Strep-His构建体建立了能稳定表达TAT-MeCP2e2-EGFP融合蛋白的HeLa和NIH3T3细胞系，所述融合蛋白在C末端被Strep-II和6-His亲和标记物所标记。使用这种构建体转导细胞后，蛋白主要集中在细胞核的异染色质区，这种情况小鼠的NIH3T3细胞系中特别明显(图3B)。特别是在NIH3T3细胞中，我们检测到组蛋白H3乙酰化急剧降低，已知组蛋白H3乙酰化是由MeCP2介导的(图3C和D)。这些结果指出TAT-MeCP2e2-EGFP蛋白是有功能活性的，不考虑其他引入的蛋白结构域。

我们创建了一系列构建体来表达C末端有和没有EGFP蛋白并且在N末端融合有TAT结构域的两个MeCP2异构体(图2)。其他构建体含有针对大肠杆菌进行过完全密码子优化的合成MECP2基因。使用合成MECP2cDNA序列使大肠杆菌中的蛋白表达最多增加200倍(图3A)。我们测试了TAT融合蛋白的递送情况并且发现重组蛋白浓度为500pmol时体外效率最高。在使用TAT-MeCP2e2-EGFP蛋白培育3小时后，大约40％的NIH3T3细胞显示出存在粗大囊泡样荧光点。蛋白大部分在细胞质中(图4A a，b)。12小时后，接近100％的细胞都有荧光(图4A c，d)且蛋白集中在细胞的细胞核中(图4Ae)。转导在被转导细胞内可稳定24小时(图4B和C)。利用不含TAT域的EGFP蛋白作为对照的实验不会使细胞产生任何吸收(图4A f)。所述TAT重组蛋白还能够转导人类原代成纤维细胞(图4A g和h)以及小鼠大脑的原代神经元细胞(图4A i和j)。

6.MeCP2可在取自RTT综合症患者的成纤维细胞，以及鼠源Mecp2＂/y成纤维细胞中被取代

我们研究MeCP2融合蛋白在递送进入MeCP2缺陷的细胞后的生物学活性。我们检测到与表达野生型等位基因的细胞系相比，表达突变MeCP2等位基因(T158M)的单克隆细胞系中的组蛋白H3和H4K16与出现过高乙酰化(图5a)。使用300pmol的TAT-MeCP2e1、TAT-MeCP2e2、MeCP2、或者TAT-EGFP蛋白处理表达所述突变等位基因的细胞系64小时。只有在使用两个TAT-MeCP2异构体处理后，可观察到组蛋白H3和H4K16的高乙酰化发生逆转(图5a和b)。我们在靶向Mecp2^-/y小鼠的成纤维细胞时得到了类似结果(图5c)。在使用TAT-MeCP2异构体转导的Mecp2^-/y小鼠成纤维细胞中进行的共免疫沉淀实验直接证明了组蛋白脱乙酰基酶1(HDAC1)的募集(图7A)。这些结果证明TAT-MeCP2异构体能够挽救内源MeCP2功能丧失导致的生化变化。

7.TAT-MeCP2蛋白的细胞内稳定性

为了检查细胞内转导蛋白的稳定性和持久性，使用1nmol的TAT-MeCP2e1和TAT-MeCP2e2分别培育细胞2小时。然后使用培养基冲洗，并在新的培养基中培育以进一步生长。以所示时间间隔收集细胞并且按照下述步骤来提取蛋白：使用200μl的细胞溶解缓冲液(125mM Tris-HCl pH6.8、2％SDS、50mM NaH2PO4、20％甘油、ImM DTT、ImM PMSF)悬浮10⁷个细胞，然后在冰上培育20分钟，用超声波温和降破碎DNA。将溶解产物在9000g、4℃下离心10分钟，使用Bradford法测量上清液的总蛋白浓度并且在-80℃下储藏备用。在75℃下加热100μg蛋白样品连同4XSDS加样缓冲液(1M Tris-HCl pH-6.8、2％SDS、0.02％溴酚南、5mMβ-2-巯基乙醇、5％甘油)，并用4-20％的预制蛋白凝胶(Pierce Biotechnology，USA)加以分辨。将蛋白转移到针对对蛋白转移进行过优化的硝酸纤维膜上(AmershamBiosciences，GE Healthcare)。按照厂商说明书用蛋白印迹信号强化剂(Pierce Biotechnol，USA)处理该膜。将所述膜在含有5％脱脂牛奶、0.05％Tween-20的PBS溶液(PBS-T)中封闭1小时。然后在4℃下，将所述膜在含有MeCP2抗体(Upstate，USA)的1：2,000稀释的封闭溶液中培育过夜。使用1：4,000比例稀释的小鼠单克隆抗α微管蛋白(Sigma，Taufkirchen，Germany)作为阳性对照。使用PBS-T冲洗膜3次，每次5min，然后使用含有不同以1：30,000稀释的二级抗体(Sigma)的相同缓冲液培育1小时，所述二级抗体缀合有碱性磷酸酶。使用PBS-T冲洗3次去掉多余的抗体，然后使用BCIP/NBT(Carl-Roth，Germany)处理。转导蛋白的胞内浓度在24小时内保持很高，之后在下一个24小时内该水平降低到不足初始浓度的四分之一(图4B和C)。

8.蛋白印迹分析

8.1细胞培养物蛋白提取：按照下述步骤提取所有细胞系和原代成纤维细胞培养物的总蛋白：在200μl细胞溶解缓冲液中悬浮10⁷个细胞，并在冰上培育20分钟，利用超声波温和破碎DNA。将溶解产物在9000g、4℃下离心10分钟。按上述方法进行蛋白印迹。在4℃下，将所述膜在封闭液中培育过夜，所述封闭液中分别含有1：4000稀释的兔抗组蛋白H3多克隆抗体、1：10000稀释的兔抗乙酰化组蛋白H3多克隆抗体和1：500稀释的兔抗乙酰化组蛋白H4K16多克隆抗体(Ups tate)。使用1：4,000比例稀释的小鼠单克隆抗α微管蛋白(Sigma)作为阳性对照。

8.2组织蛋白提取：给小鼠注射100μg/g(体重)TAT-MeCP2-EGFP、TAT-MeCP2和MeCP2。20小时后杀死小鼠。取出大脑并用冷PBS冲洗。然后将大脑在提取缓冲液(62mM Tris-C1 pH6.8、2％SDS、5mM巯基乙醇、0.15mMNaCl、5X胰蛋白酶抑制剂混合物(Sigma))中匀浆，并用超声波温和地处理。将溶解产物在15,000g、4℃下离心15分钟加以沉淀。取50μg沉淀用多克隆抗-MeCP2抗体(Upstate)进行上述蛋白印迹。在独立实验中，我们给小鼠注射100μg/g(体重)TAT-EGFP以及TAT-MeCP2e2-EGFP。用GFP抗体(Sigma)对从大脑、肝脏、肾脏以及心脏提取总蛋白进行免疫印迹。用奥林巴斯S-100图像密度仪测量蛋白印迹信号强度。使用α-微管蛋白信号作为内标测量条带强度比值。

9.免疫组织化学

在给小鼠腹腔内注射TAT-MeCP2e2-EGFP和EGFP20小时后，用4％的多聚甲醛(PFA)的冷PBS缓冲液对所述被注射的小鼠进行颈动脉灌注。取出大脑并用4％PFA固定4小时，使用30％的蔗糖在4℃下冷冻保护并且在-80℃下储藏。使用兔抗-GFP抗体(Sigma)对冷冻切片进行免疫组织化学研究。使用奥林巴斯显微镜BX60(Olympus Optical Co.LTD，Japan)摄取图像。在福尔马林固定的Mecp2^-/y小鼠切片上进行类似实验，所述Mecp2^-/y小鼠已经用TAT-MeCP2e1和e2(20μg/g体重，每两天)注射了20天。用一个多克隆兔抗-MeCP2e2抗体作为探针检测所述切片。该抗体是通过使用人类重组蛋白MeCP2e2对兔进行免疫而形成的。

10.体内和体外蛋白疗法

10.1体外蛋白疗法

我们已经测试了表达T158M MeCP2突变的单等位基因细胞系中的重组蛋白。这些细胞表现出H3和H4K16的高乙酰化。用TAT-MeCP2e1和e2异构体孵育可将病理性高乙酰化恢复到与野生型细胞系类似的水平(图5)。

10.2有效地将MeCP2蛋白递送到大脑中

我们提出了在NMRI野生型小鼠体内蛋白递送的问题，所述小鼠被单独在腹腔内注射了TAT-MeCP2e2-EGFP、TAT-EGFP或者EGFP蛋白(60μg/g体重，PBS/10％甘油或者20mM HEPES/10％甘油)。用TAT-EGFP和EGFP注射的小鼠没有出现任何明显副作用。但是，用TAT-MeCP2e2-EGFP异构体注射的小鼠后肢表现出短暂的运动能力下降，这种现象在注射1到2小时后消失。脑、肝脏和肾脏的蛋白印迹分析显示了在注射20小时后TAT-EGFP和TAT-MeCP2-EGFP蛋白的吸收(数据没有列出)。在模拟实验中，给小鼠以100μg/g体重的剂量分别注射TAT-MeCP2e2、TAT-MeCP2e2-EGFP和MeCP2e2蛋白。蛋白印迹分析显示在注射20小时后处死的小鼠脑提取物中存在TAT-重组蛋白(图6a)。使用抗-EGFP抗体对脑切片进行的免疫组织化学研究显示在大脑皮质的锥体神经元细胞、小脑颗粒细胞神经元以及脑膜中存在TAT-MeCP2e2-EGFP蛋白(图6b)。但是，将两种TAT-MeCP2异构体的剂量增加到130μg/g体重时，我们观察到产生严重的副作用，如在注射后10-20min内出现会导致四肢完全麻痹的类似癫痫发作的症状。因此，5只注射过的NMRI小鼠中有两只在2小时内死亡。相反，注射TAT-EGFP和MeCP2蛋白的小鼠在所有试验剂量(下表1)下均没有任何严重的副作用。这些数据表明MeCP2蛋白成功递送到脑中基本上是可行的，但是，剂量必须严格控制。

在接下来一系列实验中，我们测定了将MeCP2融合蛋白递送到Mecp2缺陷的小鼠脑中的情况，其中所述Mecp2缺陷型小鼠是A.Bird实验室制备的一种Rett小鼠模型(Chen等，2001，Nat Genet，27(3)：327-31)。所述动物从美国Jackson实验室(B6.129P2(C)-Mecp2tml.1Bird/J株)购买，在的人类遗传学研究所的动物房中进行了进一步繁殖。对照小鼠取自上面提到的动物房。分别给两个Mecp2^-/y小鼠经腹腔注射20μg/g体重的TAT-MeCP2e1和TAT-MeCP2e2，每两天注射一次，持续20天。与野生型小鼠类似，我们可以通过对Mecp2^-/y小鼠大脑切片进行免疫组织化学研究来检测TAT-MeCP2蛋白(图6c)。这些实验证明TAT融合蛋白穿过血脑屏障并到达大脑。在以20μg/g体重的剂量每两天注射一次的治疗方案中，我们没有观察到接受处理的Mecp2^-/y小鼠出现任何即时或者延时的神经症状或者突然死亡。腹膜内给药的缓冲液为20mM Hepes、100μM CaCl₂、300mM NaCl和10％甘油。

10.3体内蛋白疗法：重组TAT-MeCP2异构体在Rett综合症小鼠模型中的治疗效果

下面我们测试了体内递送的MeCP2蛋白在MeCP2缺陷型小鼠脑内是否具有功能活性。我们每天分别给Mecp2^-/y小鼠经腹腔注射20或者30μg/g体重的TAT-MeCP2e1或TAT-MeCP2e2。在这些剂量下，没有出现临床副作用。动物在治疗两周后被处死，并且使用蛋白印迹法分析大脑总蛋白提取物。注射20或30μg/g体重的蛋白明显降低了H4K16的乙酰化水平(图7B和C)。在已经证实递送到体内的蛋白具有生化活性后，我们想评估一下该疗法是否能恢复MeCP2缺陷小鼠的表型。我们分别给Mecp2^-/y小鼠经腹腔注射20μg/g体重的两种TAT-MeCP2异构体。5只Mecp2^-/y小鼠注射TAT-MeCp2e1，5只注射TAT-MeCP2e2。1只Mecp2^-/y小鼠注射PBS，一只小鼠注射MeCP2且4只小鼠注射TAT-EGFP蛋白，所有注射都是相同剂量。11只Mecp2^-/y小鼠未作处理，作为对照。在小鼠出生30天后开始治疗。注射MeCP2的Mecp2^-/y小鼠(n＝10)的平均存活率为88.7天(e1异构体存活92.6天，e2异构体存活84.8天)，未处理的Mecp2^-/y小鼠平均存活55.6天，模拟注射的Mecp2^-/y小鼠平均存活57.0天(下表2)。这表示与未处理组小鼠相比，治疗组小鼠的寿命分别增加了66％(TAT-MeCP2e1)和53％(TAT-MeCP2e2)。存活期延长具有高度的统计学显著性(图8a和b)。一只使用20μg/g MeCP2处理两个月的野生型雄性小鼠没有表现出任何临床副作用，在治疗300天时仍然很健康。

表1.高剂量重组蛋白对野生型小鼠的作用

 

	MeCP2e1n＝3	TAT-MeCP2e2n＝3	TAT-MeCP2e2-EGFPn＝3	TAT-EGFPan＝5	EGFPan＝3
						注射后1小时	正常	癫痫发作以及四肢麻痹	癫痫发作以及四肢麻痹	不明显的身体不适	正常
注射后24小时	正常	稍微恢复*	稍微恢复*	正常	正常

a.所有蛋白都以130μg/g体重的剂量注射。由于较低分子量，所含TAT-EGFP和EGFP蛋白的分子数约为TAT-MeCP2蛋白的两倍。

*在2个实验中小鼠均死亡。不管注射何种蛋白，30μg/g剂量的重组蛋白没有对小鼠产生特别作用。

表2.注射组以及对照组Mecp2^-/y小鼠存活的天数

 

未注射	模拟注射组	TAT-MeCP2e1	TAT-MeCP2e2
				45	52(a)	71	70
46	61(b)	76	80
				47	51(c)	80	83
52	56(c)	108(d)	85
				54	57(c)	128	106
56	65(c)
				56
59
				62
65
				69
平均值	平均值	平均值	平均值
				55.5	57	92.6	84.8

a.注射PBS

b.注射MeCP2

c.注射TAT-EGFP

d.动物仍然活动且活跃但是由于非常严重且不能治疗的皮肤感染引起自残行为而被处死。

11.TAT-MeCP2蛋白给药救援了体内的神经元损伤

已经说明了在出生后CNS神经元上去除MeCP2会导致严重的神经病理性变化，如树枝状突起以及神经元收缩改变(Armstrong DD.2002，.MentRetard Dev Disabil ResRev 8：72-6)。为了研究用TAT-MeCP2蛋白进行的治疗是否也会阻止神经元发生形态变化，对海马和小脑的神经元进行了组织学检测。定量测定海马CA2区的尼斯尔染色切片中(图8c)或者钙结合蛋白染色的小脑浦肯雅细胞上的神经元的大小。与野生型神经元相比，海马中突变神经元的尺寸比较小并且更稠密(图8c，1和2)。重要的是，MeCP2处理组动物显示出更大的神经元而没有任何外在形态变化(图8c3)。定量结果显示，相比于野生型，TAT-MeCP2e1处理的海马神经元的大小没有差异，而MeCP2e2异构体对神经元尺寸没有影响(图8c4)。50天龄的MeCP2缺陷型小鼠体内的V层锥形皮质神经元的测量结果与野生型没有差异。此外，MeCP2^-/y小鼠体内的小脑浦肯雅细胞，在经过TAT-MeCP2处理后没有表现明显的形态异常(数据没有列出)。总之，海马神经元尺寸的减小可以使用MeCP2e1来加以逆转。

Claims (15)

1.一种多肽，由(i)MeCP2蛋白，和(ii)一个来源自人类免疫缺陷病毒1的转录反式激活因子蛋白的蛋白转导结构域构成，其中所述MeCP2蛋白与所述蛋白转导结构域相融合，用于治疗神经变性疾病或神经发育疾病的方法中。

2.权利要求1的多肽，其中所述神经发育疾病为Rett综合征。

3.权利要求1的多肽，其中神经发育疾病是由于MeCP2表达的降低或MeCP2功能受损导致的。

4.权利要求1的多肽，其中所述MeCP2蛋白是人源的。

5.权利要求1的多肽，其中所述MeCP2蛋白是人类MeCP2异构体e1或人类MeCP2异构体e2。

6.权利要求1的多肽，其中所述治疗方法包括将所述多肽给予哺乳动物。

7.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含于一种药物组合物中。

8.权利要求7的多肽，其中所述药物组合物的给药剂量为每克哺乳动物体重给药0.1-200μg多肽。

9.权利要求7或8的多肽，其中所述药物组合物被至少每天或每两天给药一次。

10.权利要求1-9任一项的多肽用于制备一种用于预防和/或治疗神经变性疾病或神经发育疾病的药物组合物的用途。

11.权利要求10的用途，其中所述神经发育疾病是由于MeCP2表达的降低或MeCP2功能受损导致的。

12.权利要求11的用途，其中所述神经发育疾病为Rett综合征。

13.一种多肽用于制备治疗神经变性疾病或神经发育疾病的药剂的用途，其中所述多肽由(i)MeCP2蛋白，和(ii)一个来源自人类免疫缺陷病毒1的转录反式激活因子蛋白的蛋白转导结构域构成，其中所述MeCP2蛋白与所述蛋白转导结构域相融合。

14.权利要求13的用途，其中所述融合多肽包含于一种药物组合物中。

15.权利要求13或14的用途，其中所述神经发育疾病为Rett综合征。

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