JP2022530095A - レット症候群の治療に有用な組成物 - Google Patents

Abstract

ＡＡＶカプシドと、機能的ヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）をコードする核酸配列を含むベクターゲノムとを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。また、ｒＡＡＶを産生するのに有用な産生システム、ｒＡＡＶを含む薬学的組成物、および有効量のｒＡＡＶをそれを必要とする対象に投与することにより、レット症候群を有する対象を治療する方法、またはレット症候群の症状を緩和する方法、またはレット症候群の進行を遅延させる方法も提供される。【選択図】図１

Description

レット症候群（ＲＴＴ）は、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードするＸ連鎖遺伝子の機能損失変異に起因する重度の神経発達障害である（女児出生あたり約１：１０，０００）（Ａｍｉｒ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ＭＥＣＰ２，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３，１８５－１８８，ｄｏｉ：１０．１０３８／１３８１０）。明らかに典型的な早期の産後発達の後、ＲＴＴに罹患した少女は、２歳ごろには技術の退行を示し、重度のコミュニケーション欠陥（例えば、言語喪失）および運動障害（例えば、歩行能力の喪失）などの特徴的な症状に至る（Ｋａｔｚ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｒｅｔｔ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ３９，１００－１１３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｎｓ．２０１５．１２．００８）。患者はまた、生涯にわたって呼吸器障害、消化管機能障害、発作、不安、および整形外科的障害を示し、これらは、両親および介護者に大きな感情的および経済的負担をもたらす。

現在のＲＴＴ治療は効果的でなく、いずれもＭＥＣＰ２機能の原因喪失を克服していない（Ｋａｔｚ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、上で引用）。罹患した女性では、Ｘ染色体の対立遺伝子のうちの１つが疾患を引き起こすＭｅＣＰ２変異を有しているが、他方の対立遺伝子は野生型対立遺伝子を担持する。発生中のランダムなＸ染色体不活性化（ＸＣＩ）は、変異型ＭｅＣＰ２を発現する細胞が疾患となるモザイクＭＥＣＰ２タンパク質発現をもたらす。疾患細胞における不活性対立遺伝子（Ｘｉ）上のＭｅＣＰ２の野生型コピーの活性化は、ＭＥＣＰ２タンパク質発現を正規化し、結果として、ＲＴＴを治療するための実行可能なアプローチを提供すると考えられる。成体ＲＴＴモデルマウスにおけるＭｅＣＰ２の復元は、疾患症状を劇的に改善することが以前に示されている（Ｇｕｙ，Ｊ．，Ｇａｎ，Ｊ．，Ｓｅｌｆｒｉｄｇｅ，Ｊ．，Ｃｏｂｂ，Ｓ．＆Ｂｉｒｄ，Ａ．（２００７）．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５，１１４３－１１４７，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１３８３８９）。この観察は、ＲＴＴを有する個体におけるＭｅＣＰ２発現の回復が、形質転換的な治療を提供し得ることを示唆する。

極めて控えめなレベルのＭｅＣＰ２活性化は、小分子化合物またはＲＮＡｉ技術を利用することによって、増殖する非神経細胞において達成されている（Ｂｈａｔｎａｇａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１１，１２５９１－１２５９８，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１３６２０１１１、およびＳｒｉｐａｔｈｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｆｏｒ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｅＣＰ２ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ＢＭＰ／ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ＸＩＳＴ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６２１３５６１１４）。追加の未発表の小分子スクリーニングは、非神経細胞および神経細胞で実施されたが、ＭｅＣＰ２活性化のための検証済みリードは出現していない。

ＭＥＣＰ２遺伝子療法は、薬理療法の試みの代替的アプローチとして追求されている。ＡＡＶ９にパッケージ化され、新生児脳室内注射によって送達されたマウスＭｅｃｐ２遺伝子座からの内因性調節エレメントを有するＭＥＣＰ２発現カセットは、雄のレット症候群モデルの寿命および全般的な健康状態を有意に増加させた。しかしながら、野生型の同腹仔で見られたレベルまで行動ベンチマークを修正する有効性は限定的であった（Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＣＰ２ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ＭｅＣＰ２－Ｎｕｌｌ Ｍｉｃｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｐｐａｒｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ５，１０６－１１５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｍ．２０１７．０４．００６、およびＧａｄａｌｌａ，Ｋ．Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ ＡＡＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｒｅｔｔ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ５，１８０－１９０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｍ．２０１７．０４．００７）。代わりに、人工的に切断およびスプライシングされたＭＥＣＰ２導入遺伝子を使用した場合、マウスにおける治療効果が改善された（Ｔｉｌｌｏｔｓｏｎ，Ｒ，ｅｔ ａｌ，（２０１７），Ｒａｄｉｃａｌｌｙ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＭｅＣＰ２ ｒｅｓｃｕｅｓ Ｒｅｔｔ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｌｉｋｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０，１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４０５８）。

故に、治療上の利益のために、ニューロン内において十分なレベルのＭＥＣＰ２タンパク質を達成するための新しいアプローチを開発するという、緊急の医学的な満たされていないニーズが存在する。

レット症候群（ＲＴＴ）の治療を必要とする対象におけるレット症候群（ＲＴＴ）の治療に有用である、治療用の組換え複製欠陥アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が本明細書で提供される。ｒＡＡＶは、標的細胞中でｈＭＥＣＰ２発現を指示する調節配列の制御下で、逆位末端反復（ＩＴＲ）と、機能的ヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）をコードする核酸配列とを含むベクターゲノムを担持する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ベクターゲノムがパッケージ化されるＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶｈｕ６８カプシドまたはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂカプシドをさらに含む。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号３に約９５％～１００％同一である。追加的に、または代替的に、機能ｈＭＥＣＰ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号３である。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも２つのタンデムリピートをさらに含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）１～ｎｔ２７２８、または配列番号６のｎｔ１～ｎｔ２８０２の配列を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む組成物は、それを必要とする対象に投与して、レット症候群の症状を緩和する、および／またはレット症候群の進行を遅延させることができる。

別の態様では、ｒＡＡＶを産生するために有用な産生システムが提供される。このシステムでは、細胞を培養し、この細胞は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、本明細書に記載されるようなベクターゲノム、ならびにベクターゲノムをＡＡＶカプシドにパッケージングするのを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびヘルパー機能を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、クレードＦカプシド、例えば、ＡＡ
Ｖｈｕ６８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂである。

一態様では、レット症候群（ＲＴＴ）の治療を必要とする対象においてレット症候群（ＲＴＴ）を治療するために有用であるベクターが本明細書で提供される。ベクターは、標的細胞中でｈＭＥＣＰ２発現を指示する調節配列の制御下で、機能的ヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）をコードする核酸配列を担持する。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号３に約９５％～１００％同一である。追加的に、または代替的に、機能ｈＭＥＣＰ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号３である。特定の実施形態では、ベクターは、後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも２つのタンデムリピートをさらに担持する。特定の実施形態では、ベクターまたはベクターを含む組成物は、それを必要とする対象に投与して、レット症候群の症状を緩和すること、および／またはレット症候群の進行を遅延させることができる。

さらなる一態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶまたはベクターおよび水性懸濁媒体を含む組成物が本明細書で提供される。

別の態様では、レット症候群を有する対象を治療する方法、またはレット症候群の症状を緩和する方法、またはレット症候群の進行を遅延させる方法が提供される。本方法は、有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶまたはベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、ベクターまたはｒＡＡＶは、大槽内注射（ＩＣＭ）を介して患者に投与可能である。特定の実施形態では、ベクターまたは組成物が提供され、１８歳以下のレット症候群を有する患者に投与可能である。特定の実施形態では、１８歳以上のレット症候群を有する患者に投与されるベクターまたは組成物が提供される。

本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかなる。

ＡＡＶ．ｈＳｙｎ．ｈＭＥＣＰ２ｃｏ．ＳＶ４０ベクターゲノムを含むｒＡＡＶを産生するためのプラスミドの概略図を提供する。このプラスミドの完全な核酸配列は、配列番号１として示される。 ＡＡＶ．ｈＳｙｎ．ｈＭＥＣＰ２ｃｏ．ｍｉＲ１８３．ＳＶ４０ベクターゲノムを含むｒＡＡＶを産生するためのプラスミドの概略図を提供し、これは、ｈＭＥＣＰ２の成功した発現を示す。図２Ａは、配列番号６（発現ベクター配列番号１５）として示されるこのプラスミドの完全な核酸配列を有するプラスミドの概略図を提供する。図２Ｂは、ｒＡＡＶを、３週目でＭｅｃｐ２－ｋｏマウスの皮質に５×１０^１１ＧＣ／マウスのＩＶ注射で投与した場合、マウス脳におけるＭＥＣＰ２発現が、発現カセットにおけるｍｉＲ１８３の影響を受けないことを示すウェスタンブロットを提供する。 ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭＥＣＰ２．ｒＢＧベクターゲノムを含むｒＡＡＶを産生するためのプラスミドの概略図を提供する。このプラスミドの完全な核酸配列は、配列番号４として示される。 ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２ｃｏベクターを介したＭｅｃｐ２－ｋｏマウスにおけるｈＭＥＣＰ２の成功した発現を示す。図４Ａは、ＤＡＰＩ染色による、Ｍｅｃｐ２－ｋｏマウスの脳皮質内の細胞核を示す代表的な画像を提供する。図４Ｂは、図４Ａの同じ顕微鏡野において、ＭＥＣＰ２タンパク質が検出されなかったことを示す。図４Ｃは、図４Ａおよび図４Ｂの画像の重ね合わせである。図４Ｄは、野生型マウスの脳皮質におけるＭＥＣＰ２発現を示す代表的な画像である。図４Ｅは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２ｃｏベクターを介して処置されたＭｅｃｐ２－ｋｏマウスの脳皮質におけるＭＥＣＰ２発現を示す代表的な画像である。さらなる詳細については、実施例２を参照されたい。スケールバー、１００μｍ。 ３×１０^１０ＧＣ／マウス、１×１０^１１ＧＣ／マウス、２．５×１０^１１ＧＣ／マウス、および５×１０^１１ＧＣ／マウスのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２ｃｏベクターで処置したＭｅｃｐ２－ｋｏマウス（ＨＥＭＩまたはＫＯ）のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存プロット（図５Ａ）および体重（図５Ｂおよび図５Ｃ）を提供する。ＰＢＳのみを投与した野生型同腹仔およびＭｅｃｐ２－ｋｏマウスは、対照として役立った。さらなる詳細については、実施例２を参照されたい。 ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２ｃｏベクターで処置されたＭｅｃｐ２－ｋｏマウス（ＨＥＭＩ）における挙動の修正およびＭＥＣＰ２発現の定量化を示す。該当する場合、ＰＢＳのみを投与した野生型同腹仔およびＭｅｃｐ２－ｋｏマウスは、対照として役立った。図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ、オープンフィールドアッセイで試験した歩行活動レベルおよび後方歩行活動レベルを提供する。図６Ｃおよび図６Ｄは、それぞれ、高架式ゼロ迷路において試験した、オープンゾーンで費やされた時間およびオープンゾーンに入る頻度を提供する（ｒＡＡＶは、１×１０^１１ＧＣ／マウス、２．５×１０^１１ＧＣ／マウス、および５×１０^１１ＧＣ／マウスで投与された）。図６Ｅおよび図６Ｆは、それぞれ、三重染色免疫蛍光画像から半自動的に定量化され、異なる処置用量で％のＭＥＣＰ２＋／ＮｅｕＮ＋細胞としてプロットされたニューロンの代表的なパーセンテージを示す（図６Ｅ、大脳皮質；図６Ｆ、海馬）。さらなる詳細については、実施例２を参照されたい。 １×１０^１１ＧＣ／マウス、および２．５×１０^１１ＧＣ／マウスのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２ｃｏベクターで処置したＭｅｃｐ２－ｋｏマウス（ＨＥＭＩ）の挙動の修正を示す。該当する場合、ＰＢＳのみを投与した野生型同腹仔およびＭｅｃｐ２－ｋｏマウスは、対照として役立った。図７Ａは、ロータロッドを使用して試験された落下までの遅延を提供する。図７Ｂは、覆い隠されたガラス玉を示す。図７Ｃは、Ｙ迷路を使用して試験された自発的変化指数を示す。さらなる詳細については、実施例２を参照されたい。 処置後の幼生マウスの背側白質の代表的な画像およびＭＥＣＰ２の相対的な過剰発現でのブロットを提供する。図８Ａは、増大した用量のＡＡＶ．ｈＳｙｎ．ｈＭＥＣＰ２（１群、３×１０^９ＧＣ／マウス；２群、１×１０^１０ＧＣ／マウス；３群、５×１０^１０ＧＣ／マウス；４群、１×１０^１１ＧＣ／マウス；５群、５×１０^１１ＧＣ／マウス；６群、１×１０^１２ＧＣ／マウス；および７群、５×１０^１２ＧＣ／マウス）で処置した幼生ｗｔマウスの背側白質のＬｕｘｏｌ Ｆａｓｔ染色の代表的な画像を提供する。図８Ｂは、異なる用量でのＡＡＶベクター注射後のＷＴ脳におけるＭＥＣＰ２の相対的過剰発現のグラフを提供する（ウェスタンブロットから定量化される）。さらなる詳細については、実施例２を参照されたい。 ベクター処置の有無にかかわらず、野生型マウスの海馬の錐体層、脊髄の灰白質、および後根神経節細胞（ＤＲＧ）における細胞およびＭＥＣＰ２陽性細胞を示す。 １×１０^１２ＧＣ／マウスのＡＡＶ．ｈＳｙｎ．ｈＭＥＣＰ２またはＰＢＳのみで処置された成体ｗｔマウスについての、オープンフィールドアッセイで試験された歩行活動（図１０Ａ）、後方歩行活動（図１０Ｂ）、およびロータロッドを使用して試験した落下までの時間（図１０Ｃ）を提供する。さらなる詳細については、実施例２を参照されたい。 ＡＡＶｈｕ６８．ＭＥＣＰベクターで処置されたアカゲザルにおいて観察された背側白質路における軸索障害を示す代表的な画像を提供する。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。 試験群における脊髄白質路における軽度から中等度のミエリン喪失を示す。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。 様々な組織にわたるベクター生体分布を提供する。図１３Ａは、ＡＡＶｈｕ６８．ＭｅＰ４２６．ＭＥＣＰ２．ＲＤＨ１．Ｓｔｕｆｆｅｒベクターの生体分布を示す。図１３Ｂは、ＡＡＶｈｕ６８．ＭｅＰ４２６．ＭＥＣＰ２－ｍｙｃ．ＲＤＨ１．Ｓｔｕｆｆｅｒベクターの生体分布を示す。図１３Ｃは、ＡＡＶｈｕ６８ｓｃ．ｍＭｅＰ５４６．ＳＶＩ．ＭｅＣＰ２ｅ１．ＳｐＡベクターの生体分布を示す。図１３Ｄは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＭＥＣＰ２．ｒＢＧベクターの生体分布を示す。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。 抗ｍｙｃ抗体を用いた２群における脳皮質および脊髄の後根神経節の両方におけるｈＭＥＣＰ２の成功した発現を示す。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。 抗ＭＥＣＰ２抗体を用いた群２および４における脳皮質および脊髄の後根神経節の両方におけるｈＭＥＣＰ２の成功した発現を示す。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。 異なる用量で投与されるＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏ．ＳＶ４０ベクターの様々な組織にわたる生体分布を提供する（図１６Ａ、３×１０^１３ＧＣ／ＮＨＰ； 図１６Ｂ、１×１０^１３ＧＣ／ＮＨＰ；および図１６Ｃ、３×１０^１２ＧＣ／ＮＨＰ）。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。 ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏ．ＳＶ４０ベクターによって達成される様々な組織にわたるｈＭＥＣＰ２の相対的発現を提供する。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。 ｍｉＲ１８３を介したＤＲＧ脱標的化による、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における軸索障害の低減を示す。図１８Ａは、ＤＲＧ細胞におけるＭＥＣＰ２発現の代表的な画像（インサイチュハイブリダイゼーション、ＭＥＣＰ２は赤色で示され、核は青色で示される）を提供する。図１８Ｂ（脊髄）および図１８Ｃ（ＤＲＧ）は、ｍｉＲ１８３（Ｎ＝３／群、３ヶ月後に採取した組織）の有無にかかわらず、高用量のＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＹＮ．ＭＥＣＰ２ｃｏを注射したＮＨＰからの白質路およびＤＲＧの病理学的スコアを有するグラフを提供する。さらなる詳細については、実施例３を参照されたい。

レット症候群を治療するための組成物および方法が本明細書で提供される。ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｈｕ６８またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ）を有し、その中に機能的ヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）をコードするベクターゲノムをパッケージングした有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、必要な対象に送達される。

Ｉ．ヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）
メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２、ＭｅＣＰ２、またはＭｅＣｐ２）は、メチル化ＤＮＡに結合し、次いで、他のタンパク質（例えば、ヒストンデアセチラーゼ、コレプレッサーＳＩＮ３Ａ、または転写因子ＣＲＥＢ１）と相互作用して、遺伝子をオフにするか、または転写活性化因子として作用する複合体を形成する染色体タンパク質である。ヒトＭＥＣＰ２（ｈＭＥＣＰ２）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８、ＭＥＣＰ２＿ＨＵＭＡＮ）の２つのアイソフォーム：ｈＭＥＣＰ２ベータまたはｈＭＥＣＰ２－ｅ２としても知られている（Ｐ５１６０８－１、配列番号８）ｈＭＥＣＰ２アイソフォームＡ、およびｈＭＥＣＰ２アルファまたはｈＭＥＣＰ２－ｅ１としても知られている（Ｐ５１６０８－２、配列番号２）アイソフォームＢ、が特定されている。特定の実施形態では、ＭＥＣＰ２およびｈＭＥＣＰ２は、ヒトＭＥＣＰ２タンパク質を指す場合、互換的に使用され得る。

本明細書で使用される場合、機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質は、動物モデルまたは患者におけるレット症候群に関連しない、および／またはレット症候群の症状を緩和するか、もしくはその進行を遅延させ得る送達もしくは発現に関連する、ＭＥＣＰ２タンパク質のアイソフォーム、天然バリアント、バリアント、多形体、またはトランケーションを指す。ＯＭＩＭ ＃３１２７５０（ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／３１２７５０），ｇｅｎ
ｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＭＥＣＰ２、およびｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ５１６０８を参照されたい。各ウェブページは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有するか、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは約９９．９％）同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有するか、またはそれと少なくとも約７８％～少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を有するか、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは約９９．９％）同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列、ＮＰ＿００１３０３２６６．１（配列番号１９）、ＮＰ＿００４９８３．１（配列番号２０）、またはＮＰ＿００１１０４２６２．１（配列番号２１）のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＭＥＣＰ２は、配列を有するメチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）およびＮＣｏＲ／ＳＭＲＴ相互作用ドメイン（ＮＩＤ）を含む切断型のｈＭＥＣＰ２である。ＷＯ２０１８／１７２７９５Ａ１（参照により、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

特定の実施形態では、機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質は、ＲＴＴ動物モデルにおけるレット症候群の症状を緩和するか、または進行を遅延させる。例示されるＲＴＴ動物モデルの１つは、Ｍｅｃｐ２－ｋｏマウスである。一実施形態では、ＲＴＴ動物モデルは、雄の半接合性Ｍｅｃｐ２－ｋｏマウスである。ＲＴＴの症状または進行は、生存プロット（例えば、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存プロット）、体重のモニタリング、および挙動変化の観察（例えば、オープンフィールドアッセイ、高架式ゾーン迷路、Ｙ迷路、ガラス玉覆い隠しアッセイ、およびロータロッドアッセイ）を含むがこれらに限定されない、様々なアッセイ／方法を使用して評価され得る。特定の実施形態では、ＲＴＴ動物モデルにおける機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質の投与または発現は、対応する野生型動物で得られるものの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、または１００％超であるアッセイ結果によって示されるＲＴＴ症状の緩和またはＲＴＴ進行の遅延をもたらす。特定の実施形態では、ＲＴＴ動物モデルにおける機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質の投与または発現は、対応する未治療のＲＴＴ動物から得られるものの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、または１００％超である改善されたアッセイ結果によって示されるＲＴＴ症状の緩和またはＲＴＴ進行の遅延をもたらす。例示を実施例２において詳述する。

本明細書では、ｈＭＥＣＰ２コード配列またはＭＥＣＰ２コード配列と称される、機能的ｈＭＥＣＰ２タンパク質をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号３（ＭＥＣＰ２もしくはＭＥＣＰ２ｃｏと称される）、またはアミノ酸配列ＮＰ＿００１１０４２６２．１（配列番号２１）をコードするＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１０７９２．１（ＭＥＣＰ２もしくはＭＥＣＰ２ｅ１と称される；配列番号１８）、アミノ酸配列ＮＰ＿００１３０３２６６．１（配列番号１９）をコードするＮＭ＿００１３１６３３７．１（配列番号１６）、アミノ酸配列ＮＰ＿００４９８３．１（配列番号２０）をコードするＮＭ＿００４９９２．３（配列番号１７）、ＧＱ２０３２９５．１、ＨＱ１４１３７８．１、ＧＱ２０３２９３．１、ＨＭ１５６７３３．１、ＧＱ２０３２９４．１、ＧＱ８９６３８２．１、ＧＵ４７９９４３．１、ＨＭ１５６７３２．１、ＨＭ０２０４０２．１、ＡＦ１５８１８０．１、ＡＪ１３２９１７．１、ＡＢ２０９４６４．１、Ｘ８９４３０．１、ＡＫ２８９４４４．１、ＢＸ５３８０６０．１、ＢＣ０１１６１２．１、Ｌ３７２９８．１、Ｙ１２６４３．１、Ｘ９９６８６．１、
ＡＹ５４１２８０．１、ＧＵ８１２２８５．１、ＧＵ８１２２８６．１、ＨＱ１４１３７７．１、ＨＱ１２７３４５．１、ＤＱ６５６０４９．２、ＨＱ１５４６２９．１、ＤＱ６５６０５１．２、ＢＣ０３１８３３．１、ＢＩ７６７０１９．１、ＨＭ００５６６４．１、ＫＵ１７８１７４．１、ＫＵ１７８１７５．１、ＫＵ１７８１７６．１、ＫＵ１７８１７７．１、ＫＵ１７８１７８．１、ＫＵ１７８１７９．１、ＫＵ１７８１８０．１、またはそれらに少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％）同一の核酸配列から選択される。ＮＣＢＩ参照配列の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、修飾または操作された（ｈＭＥＣＰ２またはｈＭＥＣＰ２ｃｏ）である。修飾または操作された（ｈＭＥＣＰ２またはｈＭＥＣＰ２ｃｏ）は、ＮＣＢＩ参照配列に対して約７０％（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）未満の同一性を共有する。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号３であるか、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列である。特定の実施形態では、配列番号３に対して列挙された同一性を有するコード配列は、配列番号２のアミノ酸をコードする。特定の実施形態では、配列番号３に対して列挙される同一性を有するコード配列は、配列番号１６のタンパク質をコードしない。特定の実施形態では、配列番号３に対して列挙される同一性を有する核酸配列は、配列番号１７に対するタンパク質をコードしない。特定の実施形態では、配列番号３に対して列挙される同一性を有する核酸配列は、配列番号１８をコードしない。

特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号１８であるか、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列であり、配列番号２１のアミノ酸をコードする。

特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号１６であるか、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列であり、配列番号１９のアミノ酸をコードする。

特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号１７であるか、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列であり、配列番号２０のアミノ酸をコードする。

本明細書に記載される「核酸」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその修飾形であり得、一本鎖または二本鎖であり得、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補的ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）などを含む群から選択され得る。かかる核酸配列には、例
えば、タンパク質をコードする核酸配列、例えば、転写リプレッサー、アンチセンス分子、リボザイム、小阻害核酸配列、例えば、限定されないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれるが、これらに限定されない。

核酸の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「同一なパーセント」という用語は、対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、望ましくは、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。

同一性パーセントは、タンパク質の全長ポリペプチド、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、もしくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、または配列をコードする対応する核酸配列について容易に決定することができる。好適なアミノ酸断片は、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり得、最大で約７００個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列された」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損もしくは追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。

整列は、様々な公的または商業的に利用可能である多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。配列整列プログラムは、アミノ酸配列について利用可能であり、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「Ｃｌｕｓｔａｌオメガ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが挙げられる。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたは整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

多重配列整列プログラムもまた、核酸配列に対して利用可能である。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「Ｃｌｕｓｔａｌオメガ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および検索配列（ｓｅａｒｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメ
ータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）とともに使用して決定することができる。

ＩＩ．レット症候群
ＭＥＣＰ２遺伝子変異は、レット症候群のほとんどの症例の原因であり、進行性神経発達障害であり、女性の認知障害の最も一般的な原因の１つである。レット症候群を引き起こす遺伝子変異を有する男性は、壊滅的な影響を受ける。彼らのほとんどは出生前または乳児期初期に死亡する。例えば、ｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ／Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｃａｒｅｇｉｖｅｒ－Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／Ｆａｃｔ－Ｓｈｅｅｔｓ／Ｒｅｔｔ－Ｓｙｎｄｒｏｍｅ－Ｆａｃｔ－Ｓｈｅｅｔおよびｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／３１２７５０を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」は、互換的に、男性または女性の哺乳類動物を意味し、ヒト、獣医学用動物または農業用動物、家庭用動物または愛玩動物、ならびに通常臨床研究に使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、ヒト患者である。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、男性または女性のヒトである。特定の実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、レット症候群および／またはレット症候群の症状を有するものとして診断される。

本方法および組成物は、以下のレット症候群の４つのステージのうちのいずれかの治療のために使用することができる：早期発症と呼ばれるステージＩは、典型的には、６～１８ヶ月齢の間に始まり、ステージＩＩまたは急速破壊ステージは、通常、１～４歳の間に始まり、数週間または数ヶ月続く可能性があり、ステージＩＩＩまたはプラトーもしくは擬似静止ステージは、通常、２～１０歳の間に始まり、数年間続く可能性があり、ステージＩＶまたは後期運動劣化ステージは、数年間または数十年間続く可能性がある。特定の実施形態では、対象は、１８歳未満（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ヶ月未満、または約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８歳未満）のヒトである。追加的または代替的に、対象は、新生児であるか、または１ヶ月を超える（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ヶ月を超える、または約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８歳を超える）ヒトである。特定の実施形態では、患者は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ヶ月齢であるか、または約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８歳である。特定の実施形態では、患者は、幼児、例えば、１８ヶ月齢～３歳である。特定の実施形態では、患者は、３歳～６歳、３歳～１２歳、３歳～１８歳、３歳～３０歳である。特定の実施形態では、患者は、１８歳以上であるか、または１８歳よりも高齢である。

レット症候群の症状には、以下：正常な早期成長に続く発達の遅延、筋肉の緊張の喪失（筋緊張低下）、食事の困難、および四肢がピクピクする動き、目的をもった手の使用の喪失、特徴的な手の動き、腹ばいもしくは歩行の問題、視線を合わせることの減少、自閉症様の行動、つま先での歩行、睡眠障害、酩酊歩行、歯ぎしりおよび咀嚼困難、成長の遅延、発作、認知障害、および覚醒中の呼吸困難、例えば、過呼吸、無呼吸（呼吸）および空気嚥下、失行症（目の注視および発話を含む運動機能を実行することができない）、座る、這うなどの総合的運動能力の遅延、脳および頭部成長の遅延、書く、洗うなどの強制的な手の動き、歩行障害、発作、および知的障害が含まれ得るが、これらに限定されない
。

上に記載したとおり、「増加」「減少」「低下」「緩和」「改善」「遅延」、またはその任意の文法的変形、または任意の類似の用語は、別途指定されない限り、対応する参照と比較して、約５倍、約２倍、約１倍、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％の変動（例えば、未治療の対照、またはＲＴＴを有さない正常な状態の対象）を意味する。

特定の実施形態では、患者は、発作、筋肉のこわばり、または呼吸、睡眠、消化管もしくは心臓の問題など、ＲＴＴに関連するいくつかの兆候および症状を制御する薬剤を受け取る。

任意選択的に、必要とする対象において、免疫抑制性併用療法を使用してもよい。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、３、４、５、６、７日前もしくは後、またはそれ以前もしくはそれ以後に開始されてもよい。かかる免疫抑制療法は、１つ、２つ、またはそれ以上の薬物（例えば、グルココルチコイド、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の投与を伴い得る。かかる免疫抑制薬は、同じ用量または調整用量で、１回、２回、またはそれ以上、必要とする対象に投与され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬剤、（例えば、プレドネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を含み得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、同じ用量または調整された用量で、遺伝子療法投与後に継続されてもよい。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。

ＩＩＩ．発現カセット
本明細書において、標的細胞においてｈＭＥＣＰ２発現を指示する調節配列の制御下でｈＭＥＣＰ２コード配列を含む核酸配列が提供され、これは、発現カセットとも称される。本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列（例えば、ｈＭＥＣＰ２配列）、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得る。必要な調節配列は、標的細胞中でその転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式でｈＭＥＣＰ２コード配列と作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、ｈＭＥＣＰ２コード配列と隣接する発現制御配列、およびｈＭＥＣＰ２コード配列を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、およびＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、ＣＮＳ特異的またはニューロン特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトシナプシンプロモーター（本明細書ではｈＳｙｎまたはＳｙｎとも称される）である。特定の実施形態では、追加的または代替的なニューロン特異的プロモー
ター配列は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３ １５）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１ ５）、神経特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３ ８４）、および／または他のものから選択されてもよい。特定の実施形態では、ヒトシナスピンプロモーターは、（例えば、配列番号１のｎｔ２１３～ｎｔ６７８、または配列番号２２）の配列を有する。さらに、または代替的に、サイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７）プロモーターを有するニワトリベータアクチンプロモーターが選択されてもよい。かかるＣＢ７プロモーターは、例えば、配列番号４のｎｔ１９８～ｎｔ８６３、または配列番号１２の配列を有し得る。特定の実施形態では、ヒト伸長開始因子１アルファプロモーター（ＥＦ１ａ）プロモーターが選択されてもよい。かかるＥＦ１ａプロモーターは、例えば、配列番号１３の配列を有し得る。特定の実施形態では、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、またはＭｅＰ４２６プロモーター、またはｈＭＥＣＰ２の発現のためのＭＥＰ５４６プロモーター。しかしながら、特定の実施形態では、他のプロモーター、または追加のプロモーターが選択され得る。特定の実施形態では、調節配列は、中枢神経系細胞におけるｈＭＥＣＰ２発現を誘導する。

特定の実施形態では、標的細胞は、中枢神経系細胞であり得る。特定の実施形態では、標的細胞は、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、グリア細胞、皮質細胞、前頭皮質細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞のうちの１つ以上である。特定の実施形態では、標的細胞は、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、例えば、網膜細胞である。神経系由来の細胞以外の他の細胞、例えば、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、リンパ節細胞、扁桃細胞、骨髄間葉細胞、幹細胞、骨髄幹細胞、心臓細胞、上皮細胞、食道細胞、胃細胞、胎児切断細胞、結腸細胞、直腸細胞、肝臓細胞、腎細胞、肺細胞、唾液腺細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、乳房細胞、膵臓細胞、ランゲルハンス島細胞、胆嚢細胞、前立腺細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、子宮細胞、子宮頸部細胞、精巣細胞、またはＲＴＴを有さない対象における機能的ＭＥＣＰ２タンパク質を発現する任意の他の細胞なども、標的細胞として選択され得る。ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＭＥＣＰ２＆ｋｅｙｗｏｒｄｓ＝ｍｅｃｐ２＃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを参照されたい。

特定の実施形態では、発現制御配列（調節配列）の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する追加的または代替的なプロモーター配列が含まれ得る。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、または生理学的ヒントに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに利用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリベータアクチンプロモーターから選択され得る。

プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列（例えば、ＷＰＲＥ）、翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク
質の安定性を増強する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、調節配列は、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離される。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリβアクチンイントロンをさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン（ＣＩ）であり、ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロンである。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載される。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ウサギグロビンポリＡ、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい）。特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、存在しない。

ＩＶ．ｍｉＲＮＡ
特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列に加えて、別の非ＡＡＶコード配列、例えば、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物を含んでもよい。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡも含まれる。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通してそれらの活性を示す。これらの内因性発現ｍｉＲＮＡはヘアピン前駆体を形成し、その後、ｍｉＲＮＡ二本鎖に、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子に処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて、例えば、３′ＵＴＲ領域内の標的ｍＲＮＡの標的部位を特定する、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを誘導する。

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、ＤＮＡプラス鎖上に位置する配列（５’から３’）であり、ｍｉＲＮＡシード配列を含むｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡ標的配列は、コードされた導入遺伝子産物の非翻訳領域に対して外因性であり、導入遺伝子発現の抑制が所望される細胞で、ｍｉＲＮＡによって特異的に標的化されるように設計される。「ｍｉＲ１８３クラスター標的配列」という用語は、ｍｉＲ－１８３、－９６および－１８２（Ｄａｍｂａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３：７１７３－７１８８，２０１５によって記載されている、参照により本明細書に援用される）を含む、ｍｉＲ１８３クラスター（あるいはファミリーと称される）のうちの１つ以上のメンバーに応答する標的配列を指す。理論に束縛されることを意図するものではないが、導入遺伝子（遺伝子産物をコードする）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡを含有する発現カセットが送達される細胞型に存在し、その結果、３’ＵＴＲ ｍｉＲＮＡの標的配列に対するｍｉＲＮＡの特異的結合が、ｍＲＮＡのサイレンシングおよび切断をもたらし、それによって、ｍｉＲＮＡを発現する細胞においてのみ、導入遺伝子の発現が低減または排除される。

典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド
長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、約１２～約２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、または約２６ヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７または８ヌクレオチド）を含有する。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、またはｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。特定の実施形態では、標的配列は、シード配列と１００％相補的である配列を複数コピー（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、標的配列の残部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含む発現カセットでは、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補である。

特定の実施形態では、発現カセットｍＲＮＡまたはＤＮＡプラス鎖の少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列および／または少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列は、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号：７）、（ｉｉ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ－９６、配列番号９）、（ｉｉｉ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（ｍｉＲ１８２、配列番号１０）から選択される。他の実施形態では、ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号１１）が選択される。

特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８３の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８３標的配列を含み、

を含み、式中、ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的な配列を、２コピー以上（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的な領域を、少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号７に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号７に整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号７と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３標的配列を含み、切断された配列番号１（すなわち、配列番号１の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８３標的配列とを含む。さらに他の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。

特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号１０）を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列を、２コピー以上（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的な少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号１０に部分的に相補的な配列を含み、したがって、配列番号１０と整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１０と整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％も含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、切断された配列番号１０（すなわち、配列番号１０の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。さらに他の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

「タンデムリピート」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であってもよい。すなわち、ある配列の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端のすぐ上流にあるように、またはその逆でもよく、次々と直に位置している。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。

本明細書で使用される場合、「スペーサー」としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列であり、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、またはより長い値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧまたはＧＣＡＴＧＣである。

特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つ、３つ、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、または少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含む。特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つまたは３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、および異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。

特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデムリピートが存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子、ＵＴＲ配列のすぐ下流にタンデムリピート、およびＵＴＲの３’末端の近くに２つ以上のタンデムリピートを含み得る
。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。別の例では、３’は、タンデムリピートを含んでもよく、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよい。

特定の実施形態では、発現カセットは、２つ、３つ、４つ以上のタンデムリピートを含み、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内に開始する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドのｍｉＲＮＡタンデムリピートを含む。

参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１２月２１日に出願されたＵＳ米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号の優先権を主張する、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２を参照されたい。

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または好ましくは少なくとも４つの後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列のタンデムリピートをさらに含む。標的ｍｉＲＮＡ配列は、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、および／または配列番号１１から選択され得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１（もしくは配列番号２３）のヌクレオチド（ｎｔ）１～ｎｔ２７２８、配列番号６（もしくは配列番号１５）のｎｔ１～ｎｔ２８０２、および／または配列番号４（もしくは配列番号２４）のｎｔ１～ｎｔ３９４９の配列、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一の、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのｍｉＲＮＡ ｄｒｇ脱標的化配列をさらに含む核酸配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９～少なくとも１００％同一の配列を含み、これは少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、および少なくとも４つのｍｉＲＮＡ ｄｒｇ脱標的化配列をさらに含む。標的ｍｉＲＮＡ配列は、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、および／または配列番号１１から選択され得る。

Ｖ．ｒＡＡＶ
本明細書では、レット症候群を治療するのに有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、（ａ）ＡＡＶカプシドと、（ｂ）（ａ）のＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含む。好適には、選択されたＡＡＶカプシドは、治療される細胞を標的とする。特定の実施形態では、カプシドは、クレードＦ由来である。しかしながら、特定の実施形態では、別のＡＡＶカプシド供給源が選択され得る。ベクターゲノムは、ｈＭＥＣＰ２発現を指示する調節配列の制御下で、逆位末端反復（ＩＴＲ）と、機能的ヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）をコードする核酸配列とを含む。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、配列番号３に少なくとも約９５％同一である。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰコード配列は、ｈＭＥＣＰ転写バリアント１～３（ＮＭ＿００１３１６３３７．１（配列番号１６）、ＮＭ＿００４９９２．３（配列番号１７）、およびＮＭ＿００１１１０７９２．１（配列番号１８））のうちのいずれか１つと８０％未満同一である。特定の実施形態では、機能的ｈＭＥＣＰ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、調節配列は、中枢神経系細胞におけるｈＭＥＣＰ２発現を誘導する。特定の実施形態では、調節配列は、ＣＮＳ特異的プロモーター、例えば、ヒトシナスピンプロモーター（ｈＳｙｎ）、または構成的プロモーター、例えば、ＣＢ７を含む。特定の実施形態では、調節エレメントは、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、イントロン、エンハンサー、およびＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ２７２８、配列番号４のｎｔ１～ｎｔ３９４９、または配列番号６のｎｔ１～ｎ
ｔ２８０２、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一である核酸配列である。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、本明細書に記載の後根神経節（ｄｒｇ）脱標的化ｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含む。

特定の実施形態では、クレードＦ ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶｈｕ３２カプシド、またはＡＡＶｈｕ３１カプシドから選択される。好適なカプシドをコードする核酸配列は、ベクターゲノムを担持するＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生に利用され得る。ＡＡＶｈｕ６８に関連する追加の詳細は、ＷＯ２０１８／１６０５８２およびＵＳ２０１５／００７９０３８に提供され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のクレードＦベクターは、ｈＭＥＣＰ２コード配列含むベクターゲノムを、脳、海馬、運動皮質、小脳、および運動ニューロンを含む中枢神経系内の細胞に送達するのに非常に好適である。これらのベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）内の他の細胞、ならびにＣＮＳ外の特定の他の組織および細胞を標的にするために使用され得る。他の実施形態では、クレードＡカプシド（例えば、ＡＡＶ１）が選択され得る。さらに、他のＡＡＶまたは他のパルボウイルスカプシドが選択されてもよい。

特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法のためのＡＡＶカプシドは、標的細胞に基づいて選択される。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＣＮＳ細胞および／またはＰＮＳ細胞を形質導入する。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ｃｙ０２カプシド、ｒｈ４３カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ｒｈ０１カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ｒｈ８カプシド、ｒｈ１０カプシド、ｂｂ０１カプシド、ｈｕ３７カプシド、ｒｈ０２カプシド、ｒｈ２０カプシド、ｒｈ３９カプシド、ｒｈ６４カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ１カプシド、ｈｕ４４カプシド、ｈｕ４８カプシド、ｃｙ０５カプシド、ｈｕ１１カプシド、ｈｕ３２カプシド、ｐｉ２カプシド、またはそれらのバリエーションから選択される。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶｈｕ６８カプシド、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂカプシド、ｈｕ３１カプシド、ｈｕ３２カプシド、またはそれらのバリエーション等のクレードＦカプシドである。例えば、２０１５年４月１４日に公開されたＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２０１８／１６０５８２、およびＵＳ２０１５／００７９０３８を参照されたい（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、非クレードＦカプシド、例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥカプシドである。特定の実施形態では、非クレードＦカプシドは、ＡＡＶ１またはそのバリエーションである。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、神経系細胞以外の標的細胞を形質導入する。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、クレードＡカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６）、クレードＢカプシド（例えば、ＡＡＶ２）、クレードＣカプシド（例えば、ｈｕ５３）、クレードＤカプシド（例えば、ＡＡＶ７）、またはクレードＥカプシド（例えば、ｒｈ１０）である。にもかかわらず、他のＡＡＶカプシドが選択されてもよい。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指し、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列の整列に基づいて、少なくとも７５％のブートストラップ値（少なくとも１０００反復のうち）および０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合アルゴリズム（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するのに使用され得るコンピュータプログラムが利用可能であ
る。例えば、ＭＥＧＡｖ２．１プログラムは、修正Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定された系統群（クレード）のうちの１つに含まれるか、またはこれらの系統群以外の別の系統群に含まれるかを、容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０）：６３８１－６３８８（これは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦを同定し、かつ新規ＡＡＶの核酸配列、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９を提供する）を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

上に示されるように、所望の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、少なくとも、ベクターゲノムをカプシドにパッケージングするのに必要なＡＡＶ ＩＴＲ、ｈＭＥＣＰ２コード配列、およびそのための発現を指示する調節配列を含むベクターゲノムとを有するｒＡＡＶが提供される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、一本鎖ＡＡＶベクターゲノムである。特定の実施形態では、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクターが本発明に利用され得る。

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’および３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ “Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；ａｎｄ Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素が５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。Ｄ配列および末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。しかしながら、これらの要素の他の構成が好適であり得る。

特定の実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ｈＭＥＣＰ２コード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含むベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、エンハンサーは、ｈＭＥＣＰ２コード配列の下流に位置し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、本明細書に記載のｍｉＲ１８３またはｍｉＲ１８２などのｄｒｇ脱標的化配列をさらに含む。特定の実施形態では、そのようなｄｒｇ脱標的化配列の２つ、３つ、４つ以上のコピーは、本明細書に記載されるように、ベクターゲノムに（例えば、ｈＭＥＣＰ２終止コドン（複数可）とポリＡとの間の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に）存在し得る。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶである。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来ではない。特定の実施形態では、２つ以上のプロモーターが存在する。特定の実施形態では、プロモーターは、シナプシン（ｈＳｙｎ）である。特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＢ７である。特定の実施形態では、プロ
モーターは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーターである。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサーおよびイントロンが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン（ＣＩ）であり、ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロンである。特定の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０ポリＡ（すなわち、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリアデニル化（ＰｏｌｙＡ）シグナル）である。特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ｈＳｙｎプロモーター－ｈＭＥＣＰ２コード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＣＢ７プロモーター－ｈＭＥＣＰ２コード配列－ＲＢＧポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ｈＭＥＣＰ２コード配列の下流に位置し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、本明細書に記載のｍｉＲ１８３またはｍｉＲ１８２などのｄｒｇ脱標的化配列をさらに含む。特定の実施形態では、そのようなｄｒｇ脱標的化配列の２つ、３つ、４つ以上のコピーは、本明細書に記載されるように、ベクターゲノムに（例えば、ｈＭＥＣＰ２終止コドン（複数可）とポリＡとの間の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に）存在し得る。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、自己相補的なＡＡＶである。

本明細書で使用される場合、ベクターゲノムまたはベクターゲノムを含むｒＡＡＶは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ－プロモーター（任意選択的）－Ｋｏｚａｋ（任意選択的）－イントロン（任意選択的）－ＭＥＣＰ２コード配列（例えば、ｈＭＥＣＰ２、ｈＭＥＣＰ２ｃｏ、ＭＥＣＰ２、ＭＥＣＰ２ｃｏ）－ｍｉＲＮＡ（任意選択的０～４＋）－ポリＡ（任意選択的）－Ｓｔｕｆｆｅｒ（任意選択的）－ＡＡＶ ３’ ＩＴＲとして本明細書に例示される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ－プロモーター（任意選択的）－Ｋｏｚａｋ（任意選択的）－イントロン（任意選択的）－ＭＥＣＰ２コード配列－ｍｉＲＮＡ（任意選択的０～４＋）－ポリＡ（任意選択的）－Ｓｔｕｆｆｅｒ（任意選択的）－ＡＡＶ ３’ ＩＴＲとして本明細書に例示される。

さらに、本明細書では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを産生するために有用なｒＡＡＶ産生システムが提供される。産生システムは、（ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）ベクターゲノムと、（ｃ）ベクターゲノムをＡＡＶカプシドにパッケージングするのを可能にする十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびヘルパー機能とを含む、細胞培養を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ２７２８、または配列番号４のｎｔ１～ｎｔ３９４９、または配列番号６のｎｔ１～ｎｔ２８０２である。特定の実施形態では、細胞培養は、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞培養である。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、異なるＡＡＶ由来である。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、ＡＡＶ２由来である。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列およびｃａｐ遺伝子は、同じ核酸分子上にあり、任意選択的に、ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在する。特定の実施形態では、スペーサーは、ａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ（配列番号１４）である。

ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、ベクターゲノムは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミドに担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製およびパッケージングに適してい
るように操作され得る。好適なトランスフェクション技術およびパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ／または当業者によって容易に設計することができる。

ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成および単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、および以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、遺伝子を含む核酸分子と同じ構築物においてシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。

一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージ細胞も作製することができる。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

用語「ＡＡＶ中間体」または「ＡＡＶベクター中間体」は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含まないか、または遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、目的の遺伝子を宿主細胞に導入するために非機能的である。

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる発現カセット、ならびに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、およびｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

一実施形態では、組換えＡＡＶを産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシド中にパッケージするのに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノム、および宿主細胞中の遺伝子の発現を指示する調節配列と作動可能に連結される遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列、ならびに組換えＡＡＶカプシドへのベクターゲ
ノムのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳類細胞（例えば、とりわけヒト胎児由来腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞）で構成される。特定の実施形態では、バキュロウイルスは、組換えＡＡＶカプシド中にベクターゲノムをパッケージングするのに必要なヘルパー機能を提供する。

任意選択的に、ｒｅｐ機能は、カプシドを交差的に補完する（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ）ＡＡＶによって提供される。特定の実施形態では、ｒｅｐ機能の少なくとも一部は、ＡＡＶｈｕ６８Ｂ由来である。別の実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶｈｕ６８ｒｅｐ以外の異種ｒｅｐタンパク質であり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質、またはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、およびｒｅｐ４０／５２、またはそれらの断片、あるいは別の供給源であり得る。これらのＡＡＶｈｕ６８または変異ＡＡＶカプシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性制御性調節配列の調節下にあり得る。

一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物（例えば、ＨＥＫ２９３またはＳｆ９）または懸濁液で製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法には、遺伝子療法ベクターの生成のために使用されるプラスミドＤＮＡの作成、ベクターの生成、およびベクターの精製などの、当技術分野においてよく知られている方法が含まれる。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、産生されたプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノムおよび目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランス－プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ベクターを含む細胞および培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。回収したベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞採取物と称される。さらに別のシステムでは、遺伝子治療ベクターは、バキュロウイルスベースベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらおよび他のＡＡＶ生産システムの製造および使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、および７，４３９，０６５。

粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、および／またはバルクベクターを調製するための製剤化および濾過などの、方法ステップに供される。

２ステップの高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願されたＷＯ２０１７／１６０３６０、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号、およびその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特出願第許第６２／３２２，０７１号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」という名称の同第６２／２２６，３５７号により詳細に記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。

空のおよび完全粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配－精製された調製物、ここで（ＧＣ）＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、負荷した２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算することにより、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空のｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って、次いで１００を掛けることよって、空粒子のパーセンテージを得る。

一般に、空のカプシドおよびパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０； Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、方法は、例えば、緩衝液中３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含有する勾配ゲルなどの３つのカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供すること、次いで、試料材料が分離するまでゲルをランさせること、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレン、好ましくは、ナイロンにゲルをブロットすることを含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法が使用され、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、比色変化を検出することができる検出方法、または最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅＩ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定さ
れる。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。

一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテアーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。治療ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

追加的に、または代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ． Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５． ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

簡潔に言うと、パッケージされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８粒子をゲノム欠損ＡＡＶｈｕ６８中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８カプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィーに供することを含み、ＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８中間体は、約１０．２のｐＨで平衡化された強力なアニオン交換樹脂に結合され、約２６０ナノメートル（ｎｍ）および約２８０ｎｍで紫外吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｒＡＡＶｈｕ６８のためには最適未満であるが、ｐＨは、約１０．０～１０．４の範囲であってもよい。この方法では、ＡＡＶｈｕ６８完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、透析濾過された産物を、ＡＡＶ２／ｈｕ６８血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。

ｒＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２は、好適な生理学的に適合性の組成物（例えば、緩衝生理食塩水）中に懸濁される。この組成物は、保管のために凍結され、後に解凍され、任意選択的に、好適な希釈剤で希釈され得る。あるいは、ベクターは、凍結および解凍ステップを進めることなく患者への送達に好適な組成物として調製され得る。

本明細書で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）
がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ， Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているように測定され得る（参照により本明細書に組み込まれる）。

略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が担持するコーディング領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計される構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞介在合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的片割れが会合して、即時の複製および転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ
Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，「Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８， Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、および第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々が参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工ウイルス粒子を指し、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

多くの場合、ｒＡＡＶ粒子は、ＤＮａｓｅ耐性として参照される。しかしながら、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンド－およびエキソ－ヌクレアーゼが、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製ステップにおいて使用され得る。かかるヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを分解するために選択され得る。かかるステップは、単一ヌクレアーゼ、または異なる標的に指向されたヌクレアーゼの混合物を含み得、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。

「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周りで完全に構築されていることを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するように設計されたヌクレアーゼインキュベーションステップの間の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。

ＶＩ．その他のベクター
本明細書に記載される発現カセットを含むベクターが本明細書で提供される。特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＭＥＣＰ２発現を誘導する調節配列の制御下にある、機能的なヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）をコードする核酸配列を含
む。特定の実施形態では、ｈＭＥＣＰ２コード配列は、［配列番号２；ＭＡＡＡＡＡＡＡＰＳＧＧＧＧＧＧＥＥＥＲＬＥＥＫＳＥＤＱＤＬＱＧＬＫＤＫＰＬＫＦＫＫＶＫＫＤＫＫＥＥＫＥＧＫＨＥＰＶＱＰＳＡＨＨＳＡＥＰＡＥＡＧＫＡＥＴＳＥＧＳＧＳＡＰＡＶＰＥＡＳＡＳＰＫＱＲＲＳＩＩＲＤＲＧＰＭＹＤＤＰＴＬＰＥＧＷＴＲＫＬＫＱＲＫＳＧＲＳＡＧＫＹＤＶＹＬＩＮＰＱＧＫＡＦＲＳＫＶＥＬＩＡＹＦＥＫＶＧＤＴＳＬＤＰＮＤＦＤＦＴＶＴＧＲＧＳＰＳＲＲＥＱＫＰＰＫＫＰＫＳＰＫＡＰＧＴＧＲＧＲＧＲＰＫＧＳＧＴＴＲＰＫＡＡＴＳＥＧＶＱＶＫＲＶＬＥＫＳＰＧＫＬＬＶＫＭＰＦＱＴＳＰＧＧＫＡＥＧＧＧＡＴＴＳＴＱＶＭＶＩＫＲＰＧＲＫＲＫＡＥＡＤＰＱＡＩＰＫＫＲＧＲＫＰＧＳＶＶＡＡＡＡＡＥＡＫＫＫＡＶＫＥＳＳＩＲＳＶＱＥＴＶＬＰＩＫＫＲＫＴＲＥＴＶＳＩＥＶＫＥＶＶＫＰＬＬＶＳＴＬＧＥＫＳＧＫＧＬＫＴＣＫＳＰＧＲＫＳＫＥＳＳＰＫＧＲＳＳＳＡＳＳＰＰＫＫＥＨＨＨＨＨＨＨＳＥＳＰＫＡＰＶＰＬＬＰＰＬＰＰＰＰＰＥＰＥＳＳＥＤＰＴＳＰＰＥＰＱＤＬＳＳＳＶＣＫＥＥＫＭＰＲＧＧＳＬＥＳＤＧＣＰＫＥＰＡＫＴＱＰＡＶＡＴＡＡＴＡＡＥＫＹＫＨＲＧＥＧＥＲＫＤＩＶＳＳＳＭＰＲＰＮＲＥＥＰＶＤＳＲＴＰＶＴＥＲＶＳ］のｈＭＥＣＰ配列をコードし、配列番号３に少なくとも約９５％同一であり、タンパク質をコードする。

特定の実施形態では、ベクターは、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクター、または裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーに基づくベクター、もしくはキトサンに基づく製剤から選択される非ウイルスベクターである。選択されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工ウイルス粒子を指し、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。そのような複製欠損ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス（組み込みまたは非組み込み）、または別の適切なウイルス源であってもよい。

ＶＩＩ．組成物
本明細書に記載されるｒＡＡＶまたはベクターおよび水性懸濁媒体を含む組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、懸濁液は、静脈内送達、髄腔内投与、または脳室内投与のために製剤化される。

本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶストック、および任意選択的な担体、賦形剤および／または防腐剤を含む組成物が提供される。ｒＡＡＶストックは、同じである複数
のｒＡＡＶベクターを指し、例えば、濃度および用量単位の考察において以下に記載される量である。

本明細書で使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクター送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨおよび塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。

好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。一実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｗ／ｗ％、重量比に基づく）の量で存在し得る。別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｖ／ｖ％、体積比に基づく）の量で存在し得る。さらに別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し、ここで、ｎ％は、懸濁液１００ｍＬあたりのｎグラムを示す。

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤のうちから選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子
量８４００を有するポロキサマー１８８（商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８としても知られている）などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ－オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２を含有する組成物は、ｐＨが、６．８～８、または７．２～７．８、または７．５～８の範囲で送達される。髄腔内送達の場合、ｐＨが、７．５超、例えば、７．５～８、または７．８が望ましい可能性がある。

特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む。水溶液は、以前はＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていたＢＡＳＦから市販されているポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８をさらに含んでもよい。水溶液は、７．２のｐＨを有し得る。

別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＰＯ_４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、および０．００１％のポロキサマー（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標））１８８、ｐＨ７．２を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液は、ハーバード緩衝液でより良好なｐＨ安定性が観察されるため、好ましい。

特定の実施形態では、製剤緩衝液は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む人工ＣＳＦである。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の透過促進剤を含んでもよい。好適な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡを含み得る。

任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（複数可）に加えて、防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。

本発明による組成物は、上記に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載される組成物は、有効量の薬学的に好適な担体に懸濁された、および／または注射、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別のデバイスもしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された１つ以上のＡＡＶを含む。一実施例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化される。一実施例では、組成物は、髄腔内（ｉｖ）送達用に製剤化される。

ＶＩＩＩ．方法
本明細書では、有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶまたはベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、レット症候群の治療方法が提供される。

特定の実施形態では、本明細書の「有効量」は、ＲＴＴの症状の緩和および／またはＲＴＴの進行の遅延を達成する量である。

ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来のおよび薬学的に許容される投与経路には、限定されないが、所望の臓器（例えば、脳、ＣＳＦ，肝臓（任意選択的に、肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、実質内、髄腔内、ＩＣＭ、腰椎穿刺、および他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。

ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療有効なヒト投与量は、概して、約１×１０^９～１×１０^１６ベクターゲノムコピーの濃度を含有する約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの溶液の範囲である。特定の実施形態では、約１ｍＬ～約１５ｍＬ、または約２．５ｍＬ～約１０ｍＬ、または約５ｍＬ懸濁液の体積が送達される。特定の実施形態では、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ｍＬの懸濁液の体積が送達される。特定の実施形態では、約８．９×１０^１２～２．７×１０^１４ＧＣの合計用量が、この体積で投与される。特定の実施形態では、約１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量）の用量が、この体積で投与される。特定の実施形態では、脳質量１グラムあたり、約３．０×１０^９、約４．０×１０^９、約５．０×１０^９、約６．０×１０^９、約７．０×１０^９、約８．０×１０^９、約９．０×１０^９、約１．０×１０^１０、約１．１×１０^１０、約１．５×１０^１０、約２．０×１０^１０、約２．５×１０^１０、約３．０×１０^１０、約３．３×１０^１０、約３．５×１０^１０、約４．０×１０^１０、約４．５×１０^１０、約５．０×１０^１０、約５．５×１０^１０、約６．０×１０^１０、約６．５×１０^１０、約７．０×１０^１０、約７．５×１０^１０、約８．０×１０^１０、約８．５×１０^１０、約９．０×１０^１０、約９．５×１０^１０、約１．０×１０^１１、約１．１×１０^１１、約１．５×１０^１１、約２．０×１０^１１、約２．５×１０^１１、約３．０×１０^１１、約３．３×１０^１１、約３．５×１０^１１、約４．０×１０^１１、約４．５×１０^１１、約５．０×１０^１１、約５．５×１０^１１、約６．０×１０^１１、約６．５×１０^１１、約７．０×１０^１１、約７．５×１０^１１、約８．０×１０^１１、約８．５×１０^１１、約９．０×１０^１１ＧＣの用量がこの体積で投与される。

任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、かかる投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療用途に応じて変化し得る。導入遺
伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター（好ましくは、ミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクター）をもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されているものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫に利用され得る。

複製欠陥ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者については、（対象を治療するために）範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルスを含むことができる。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、または９×１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、または９×１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、または９×１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、または９×１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、または９×１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。

一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、体重１ｋｇあたり１×１０^１０～約１×１０^１５ＧＣの範囲であり得る。一実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数量を含む、体重１ｋｇあたり約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数量を含む、体重１ｋｇあたり約１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数を含む、体重１ｋｇあたり約１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、または９×１０^１１ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数を含む、体重１ｋｇあたり約１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、または９×１０^１２ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数量を含む、体重１ｋｇあたり約１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、または９×１０^１３ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数を含む、体重１ｋｇあたり約１×１０^１４、２×１０^１４、３
×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、または９×１０^１４ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数を含む、体重１ｋｇあたり約１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、または９×１０^１５ＧＣである。

一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、脳質量１グラム（ｇ）あたり１×１０^１０～約１×１０^１５ＧＣの範囲であり得る。一実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数量を含む、脳質量１グラム（ｇ）あたり約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数量を含む、脳質量１グラム（ｇ）あたり約１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数を含む、脳質量１グラム（ｇ）あたり約１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、または９×１０^１１ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数を含む、脳質量１グラム（ｇ）あたり約１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、または９×１０^１２ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数量を含む、脳質量１グラム（ｇ）あたり約１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、または９×１０^１３ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数を含む、脳質量１グラム（ｇ）あたり約１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、または９×１０^１４ＧＣである。別の実施形態では、有効量のベクターは、範囲内のすべての整数または分数を含む、脳質量１グラム（ｇ）あたり約１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、または９×１０^１５ＧＣである。

これらの上記用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の様々な容量の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤、またはその範囲内のすべての数を含むより高い容量で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、または緩衝液の容量は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３００μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００～１０００μＬである。

特定の実施形態では、用量は、約１×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約２．５×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。

一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約１×１０^９ＧＣ～約１×１０^１５、または約１×１０^１１～５×１０^１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量の送達に適切な容量および濃度は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人のために選択され得る。典型的に、新生児用に好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児用に、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択される。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの容量が選択され得る。プレティーンおよびティーン世代のために、最大約５０ｍＬの容量が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の適切な容量および投薬量が決定され得る。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。

上述の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳類患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性のある塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましく、静脈内送達のためには、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注射による、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注射による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注射は、大槽内であり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、または組成物は、髄腔内投与を介して必要な対象に投与される。特定の実施形態では、髄腔内投与は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１１月２９日に公開された米国特許公開第２０１８－０３３９０６５Ａ１号に記載されるように実施される。

本明細書で使用される場合、「大槽内送達」または「大槽内投与」という用語は、小脳延髄大槽の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺による、もしくは大槽内への直接注射による、または永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。

特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の治療は、感覚神経毒性および無症状性感覚ニューロン病変に関して良好な耐容される、動物および／またはヒト患者におけるＤＲＧ感覚ニューロンの最小～軽度の無症状変性を有する。

ＩＸ．脳脊髄液中への医薬組成物の送達のための装置および方法
一態様では、本明細書に提供されるベクターは、この節で提供され、かつＷＯ２０１８／１６０５８２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法および／またはデバイスを介して髄腔内投与され得る。代替的には、他のデバイスおよび方法が選択され得る。特定の実施形態では、本方法は、脊椎針を介する患者の大槽内へのＣＴガイドの後頭下注射のステップを含む。本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。特定の実施形態では、装置は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１１月２９日に公開された米国特許公開第２０１８－０３３９０６５Ａ１号に記載されている。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語句、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。

「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性または安定であり得る。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「エンハンサー（ａｎ
ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、１つ以上のエンハンサー（複数可）を表すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

上述のように、「約」という用語は、別段の指定がない限り、数値を修正するために使用される場合、±１０％の変動を意味する。

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって、および本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

原因遺伝子欠損として同定されたＭＥＣＰ２発現を回復させるための遺伝子治療が開発された。ＭＥＣＰ２発現カセットは、ＡＡＶ遺伝子療法技術を使用して脳ニューロンに移入される。治療品目の注射は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を介して、大槽をアクセスポイントとして使用して、または静脈内に送達される。ヒトにおける発現のために高度に最適化されたＭＥＣＰ２発現カセットを、高度に改善された中枢神経系（ＣＮＳ）形質導入を有するＡＡＶカプシドと組み合わせて使用した。

実施例１－ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２ｃｏベクター
プラスミドＭＥＣＰ２の主要なヒトアイソフォーム（Ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ結合タンパク質２、アイソフォームα、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ５１６０８－２）のアミノ酸配列をＤＮＡ配列に逆翻訳し、次いでさらに操作した。操作されたＭＥＣＰ２配列（配列番号３、すなわち、配列番号１のｎｔ６９６～ｎｔ２１９５、および配列番号６のｎｔ６９６～ｎｔ２１９５、これは本明細書で使用される場合、ｈＭＥＣＰ２ｃｏまたはＭＥＣＰ２ｃｏとも称される）を、ヒトシナプシンプロモーターの制御下で、ＡＡＶ発現プラスミドへクローニングした（Ｔｈｉｅｌ Ｇ．，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，Ｐ．＆Ｓｕｄｈｏｆ，Ｔ．Ｃ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ Ｉ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８８，３４３１－３４３５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８８．８．３４３１（１９９１））。ＭＥＣＰ２コード配列は、Ｋｏｚａｋ配列に先行され、その後には、ＳＶ４０ポリＡ配列が続いており、ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）によってフレーム化される（図１；配列番号１）。あるいは、いくつかの実験では、ウサギグロブリンポリＡ配列を使用した（図３；配列番号４）。後根神経節（ＤＲＧ）における発現を抑制するために、いくつかの実験では、上記のプラスミドを修飾して、ＭＣＥＰ２コード配列の直後、およびＳＶ４０ポリＡ配列の直前に、ｍｉＲ１８３結合部位（ａｇｔｇａａｔｔｃｔａｃｃａｇｔｇｃｃａｔａ、配列番号７）の４回リピートを含有させた（図２Ａ；配列番号６）。ＡＡＶ ＭＥＣＰ２ベクターを、カプシドＰＨＰ．Ｂ（Ｄｅｖｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４４０ （２０１６））、またはＡＡＶ９もしくはＡＡＶｈｕ６８ （Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｖｅｒｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＭＮ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２９，２８５－２９８，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１８．０１５ （２０１８））のいずれかを用いて、マウス研究または非ヒト霊長類での研究のために、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにおいて産生した。

実施例２－マウス研究。
１。材料および方法：
マウス研究．Ｍｅｃｐ２－ｋｏマウス（ｋｏマウス）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂ６．１２９Ｐ２（Ｃ）－Ｍｅｃｐ２ｔｍ１．１Ｂｉｒｄ／Ｊ、株番号００３８９０）から入手し、ヘテロ接合性の雌のｋｏマウスを野生型（ｗｔ）のＣ５７Ｂｌ６の雄と交配させて、雄のＭｅｃｐ２－ｋｏマウス（Ｈｅｍｉｚｙｇｏｔｅ、ＨＥＭＩ、ｋｏマウスとしても注記される）および雄のｗｔ型の同腹仔を得た。マウスは、マウス１匹あたり１００ｕｌの総容量で、１×１０^１１～５×１０^１１ゲノムコピー（ｇｃ）の後眼窩注射により、１８～２１日齢で、ＡＡＶ．ＭＥＣＰ２ベクターまたはビヒクル対照（滅菌リン緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）を受け取った。マウスを、遺伝子型および注射製品に関して混合して収容し、体重を測定し、週に少なくとも２回観察し、３ヶ月齢まで成長させた。ビヒクル対照を受けたほとんどのＭｅｃｐ２－ｋｏマウスは、３ヶ月の時点に到達する前に、死亡したか、または安楽死のための人道的エンドポイントに到達したが、一方で、ＡＡＶ ＭＥＣＰ２治療マウスおよびｗｔマウスは、生存し、一連の行動試験バッテリーを受けるのに適していた。

ウェスタンブロッティングおよび組織染色。安楽死の後、１つの皮質半球を急速冷凍し
、続いてＲＩＰＡ緩衝液を使用してタンパク質溶解物を生成した。ウェスタンブロッティングを、マウスおよびヒトＭＥＣＰ２（ＰＡ１－８８７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に対する抗体を用いて行った。同じ抗体を用いる免疫蛍光染色のために、もう一方の脳半分をホルマリン中で一晩固定し、パラフィン中に埋め込み、薄い切片を処理した。代替的には、病理学的レビューのために、Ｈ＆Ｅで組織を染色した。脱石灰化した脊髄断面はまた、Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ染色（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ）で染色した。

行動試験。マウスは１日に１回試験を行った。試験の日時、操作者、および環境を同じに保った（６０ｄＢのホワイトノイズバックグラウンド、および１０００ルーメンの白熱間接照明）。各試験の前に、マウスをホームケージ内で３０分間慣らした。オープンフィールドアッセイのために、最小量の床敷を有する新しいケージを、赤外線ビームアレイ（ＭｅｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）中に配置した。ケージの中央に一匹のマウスを追加し、次の３０分間にわたって、ビームブレーキの数を自動的に記録し、地面に近いビームブレーキ（一般的な活動）と地面から３インチ上のビームブレーキ（飼育活動）に分離した。高架式ゼロ迷路（ＥＺＭ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）については、２つの対向する閉じたアームと２つの開放されたアームを有する高架式円形プラットフォームを使用して、途切れない探索を可能にした。一匹のマウスを開放されたアームの中央に配置し、その動きを１５分間ビデオ記録した。Ｙ迷路（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）については、Ｙ形状の３つの同一のアームを含む密閉プラットフォームを使用した。操作者に最も近いアームに一匹のマウスを配置し、その動きを５分間ビデオ記録した。ガラス玉覆い隠しアッセイのために、新しいケージを３インチのＡｌｐｈａＤｒｉ床敷（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐａｐｅｒｓ）で満たし、穏やかに押して圧縮した。１２個の固形の青いガラス玉を床敷の上に等間隔で配置し、一匹のマウスをケージの中央に配置した。少なくとも半分は床敷で覆い隠されたガラス玉の数を、３０分後に記録した。ロータロッドアッセイのために、加速回転の梁を使用した（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ ＳＡ）。最初の日に、マウスは、それぞれ５分間の３回のセッションの間、その最低回転速度（４ｒｐｍ（毎分回転数））で、回転梁に慣れた。試験のために、マウスを、４ｒｐｍでゆっくりと回転する梁上に配置した。速度は５分かけて４０ｒｐｍの最終回転速度まで増加した。落下するまでの時間を各マウスについて記録した。１５分間の休息の後、同じ実験を２回繰り返した。いくつかの実験では、回転試験は３日間連続して行われ、１日に３回のセッションが行われた。

データ分析。データはグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓソフトウェアを使用して分析した。ビデオファイルを２０ｆｐｓでｍｐ４形式で記録し、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ ＸＴソフトウェア（バージョン１４、Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して分析した。

２．医薬品有効性
ＭＥＣＰ２遺伝子療法のためのＡＡＶベクター（ＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２ｃｏ）を開発した。配列番号２のアミノ酸配列のｈＭＥＣＰ２の発現のために、ＭＥＣＰ２のＤＮＡ配列を操作した。発現は、ＣＮＳニューロンにおいて選択的に発現するように広範囲に文書化されているヒトシナプシンプロモーターによって駆動される。結果は、配列番号３のＭＥＣＰコード配列を担持するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２ｃｏベクターが、非常に高い割合のマウスＣＮＳニューロンを形質導入し、堅牢かつ広範囲のＭＥＣＰ２タンパク質発現を促進したことを示す。また、このベクターによる静脈内（ＩＶ、またはｉｖ）注射による幼生Ｍｅｃｐ２－ｋｏマウスの治療は、早期死亡率を克服し、行動転帰測定値を有意に改善したことが示されている。用量最適化は、野生型パフォーマンスによく似た行動補正を達成することを可能にした。

マウス脳において、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクターを介したＭＥＣＰ２の成功した発現が観察された。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクターを、最大の脳形質導入のために、Ｍｅｃｐ２－ｋｏマウスに静脈内に（ｉｖ）注射した。次いで、材料および方法の欄に記載されるように、マウス脳を採取し、抗ＭＥＣＰ２抗体を使用して、免疫蛍光染色のために処理した。代表的な画像は、図４Ａ～図４Ｅに提供され、結果は、ｈＭＥＣＰ２の広範な発現が、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクター（図４Ｅ）によって処置されたＭｅｃｐ２－ｋｏマウスの皮質で達成されたが、陰性対照として機能した未治療ｋｏマウスでは達成されなかったことを示す（図４Ｂおよび図４Ｃ）。また、処置されたＭｅｃｐ２－ｋｏマウスにおけるｈＭＥＣＰ２発現レベルは、野生型皮質において観察されたものと同様であった（図４Ｄ、陽性対照）。さらに、マウス脳において、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏ．ｍｉＲ１８３を介したＭＥＣＰ２の成功した発現が観察された（図２Ｂ）。したがって、マウス脳におけるＭＥＣＰ２発現は、ｍｉＲ１８３標的配列を発現カセットに追加することによって影響を受けない。

さらに、幼生Ｍｅｃｐ２－ｋｏマウスにおける治療効果を検討した。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクターは、治療有効性を有する初回用量として確立された５×１０^１１ＧＣ／幼体雄マウスの用量と比較して、より低い用量で寿命の延長をもたらした。簡潔に述べると、材料および方法で記載されているように、図５Ａでは、雄のＭｅｃｐ２－ｋｏマウス（すなわち、ＨＥＭＩまたはＫＯまたはｋｏ）に、４回用量のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクター（３ｅ１０ ＡＡＶとして注記された３×１０^１０ＧＣ／マウス、１ｅ１１ ＡＡＶとして注記された１×１０^１１ＧＣ／マウス、および２．５ｅ１１ ＡＡＶとして注記された２．５×１０^１１ＧＣ／マウス、および５ｅ１１ ＡＡＶとして注記された５×１０^１１ＧＣ／マウス）をｉ．ｖ．注射した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射された雄の野生型同腹仔（図ではＰＢＳ、ＷＴ、またはＷＴ＋ＰＢＳとして注記される）は陽性対象として機能し、ＰＢＳで処置された雄のＭｅｃｐ２－ｋｏマウス（図ではＫＯ、ｋｏ＋ＰＢＳ、またはＫＯ＋ＰＢＳ、またはＨＥＭＩ＋ＰＢＳとして注記される）は陰性対照として機能した。試験群における生存マウスの割合を、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存プロットとして図５Ａにプロットし、これは、陰性対照と比較して、最高の３用量（１×１０^１１、２．５×１０^１１、および５×１０^１１ＧＣ／マウス）がＭｅｃｐ２－ｋｏマウスの全生存率を有意に改善し、１×１０^１１ＧＣのベクターで処置されたｋｏマウスのすべて、ならびに野生型（ｗｔ）の同腹仔が、観察期間の終わりに（図５Ａに示すように、少なくとも１６週齢まで）生存したことを示した。３×１０^１１ＧＣ／マウスの最低用量で処置されたＫＯマウスのすべては、観察期間の８０日目を過ぎて生存しなかった。試験したマウスの体重もモニタリングした（図５Ｂおよび図５Ｃ）。３用量（１×１０^１１、２．５×１０^１１、および５×１０^１１ＧＣ／マウス）のベクターで処置したｋｏマウスは、体重の安定した増加を示したが、６～９週齢からは、ＰＢＳ処置したｋｏマウスは、体重増加の代わりに徐々に体重を減少し始めた。ＰＢＳ処置の野生型マウスは、治療されたｋｏマウスと同様の体重曲線を示したが、わずかに重い体重であった。

さらに、新生児Ｍｅｃｐ２－ｋｏマウスにおける治療有効性を、ＩＣＶを介して投与される追加の用量範囲：６×１０^９ＧＣ／マウス～６×１０^１０ＧＣ／マウス（４回用量）を用いてさらに調査した。

ＤＲＧ脱標的化は、ＭＥＣＰ２発現カセットに組み込まれ、より高い用量で投与されるベクターを可能にする。ＤＲＧ脱標的化のためのｍｉＲ１８３配列の追加を含む、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏ．ｍｉＲ１８３の治療有効性を調べた。ベクターは、ＩＣＭ注射により、２．３×１０^１１ＧＣ／マウスの用量で幼生対象に送達された。

用量依存性の行動補正は、ＭＥＣＰ２遺伝子治療後に観察された。オープンフィールドアッセイ、高架式ゼロ迷路、Ｙ迷路、ガラス玉覆い隠しアッセイ、およびロータロッドアッセイを含む行動試験を、３つの異なる用量のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクター（ＨＥＭＩ＋ＡＡＶ（１ｅ１１ｇｃ）としても注記される１×１０^１１ＧＣ／マウス；ＨＥＭＩ＋ＡＡＶ（２．５ｅ１１ｇｃ）としても注記さえる２．５×１０^１１ＧＣ／マウス；およびＨＥＭＩ＋ＡＡＶ（２．５ｅ１１ｇｃ）としても注記される５×１０^１１ＧＣ／マウス）をｉｖ注射したＭｅｃｐ２－ｋｏマウス（すなわち、ＨＥＭＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処置した雄の野生型同腹仔（陽性対照、図中ではＰＢＳまたはＷＴ＋ＰＢＳとして標識される）、およびＰＢＳ治療ｋｏマウス（陰性対照、ＨＥＭＩ＋ＰＢＳとして注記される）で試験した。

オープンフィールドアッセイでは、ＰＢＳで処置したＷＴから取得した全歩行活動または後方歩行活動の平均パーセンテージを１００％として設定し、次いで、残りの群からの読み取り値をそれに応じて計算し、図６Ａおよび図６Ｂに示した。ＰＢＳで処置したｋｏマウスは、約４０％の歩行活動および１０％未満の後方歩行活動を示した。１×１０^１１ＧＣのベクターを介した治療は、歩行活動を約６７％に増加させ、２．５×１０^１１ＧＣのベクターはさらに、そのパーセンテージを約８５％に改善した。後方歩行活動は、１×１０^１１ＧＣまたは２．５×１０^１１ＧＣのベクターにより、それぞれ約８５％または約６０％まで増加した。しかしながら、試験した最高用量（５×１０^１１ＧＣ／マウス）は、約６０％の歩行活動および約３２％の後方歩行活動を示し、両方とも依然としてＰＢＳ治療ｋｏマウスよりも高い。

オープンゾーンで費やされた時間ならびに高架式ゼロ迷路内のオープンゾーンへのエントリの回数をモニタリングし、結果を図６Ｃおよび図６Ｄに示す。両方の図において、ｗｔマウスの平均読み取り値を１００％として設定し、残りの群の相対的なパーセンテージをそれに応じて計算した。実施した両方の評価について、１×１０^１１ＧＣまたは２．５×１０^１１ＧＣのベクターで処置したｋｏマウスは、ｗｔ対照に匹敵するパーセンテージを示した。オープンゾーンにおける時間の減少およびオープンゾーンへのエントリの減少は、５×１０^１１のＧＣベクターで処置されたｋｏマウスにおいて観察された。さらに、ＰＢＳのみを投与されたｋｏマウスは、ほとんど移動せず、初めに置かれたオープンゾーンを出なかったため、オープンゾーンまたはクローズドゾーンに対するそれらの好みを評価することは不可能であった。さらに、行動結果と、治療後のマウス脳内で形質導入されたニューロンの数との相関分析を行った。三重染色免疫蛍光画像（核の場合はＤＡＰＩ、ニューロンの場合はＭＥＣＰ２、およびＮｅｕＮ）を使用して、異なる用量で注射した後、Ｍｅｃｐ２－ｋｏ大脳皮質（図６Ｅ）および海馬（図６Ｆ）中のＭＥＣＰ２を発現するニューロンの数を半自動的に定量化した。得られたデータをＭＥＣＰ２＋／ＮｅｕＮ＋細胞の％としてグラフ化した。６×１０^１０ＧＣ／マウスまたはそれ未満の用量（３×１０^１０ＧＣ／マウス）で処置した動物は、十分に長くは生存せず、および／または行動試験を進めるのに十分な移動性を有さなかった。相関関係では、ＭＥＣＰ２（ＭＥＣＰ２＋）の発現について、少数のニューロンのみが陽性に染まることが観察された。大脳皮質において、それぞれ、３×１０^１０および６×１０^１０ＧＣ／マウスの用量では、５．７％および５．８％は、ＭＥＣＰ２＋ニューロンであった。海馬において、それぞれ、３×１０^１０および６×１０^１０ＧＣ／マウスの用量では、５．１％および１０．８％は、ＭＥＣＰ２＋ニューロンであった。大脳皮質において、それぞれ、１×１０^１１、２．５×１０^１１および５×１０^１１ＧＣ／マウスの用量では、１２．９％、４２．６％、および７５．３％は、ＭＥＣＰ２＋ニューロンであった。海馬において、それぞれ、１×１０^１１、２．５×１０^１１および５×１０^１１ＧＣ／マウスの用量では、１６．３％、４６．０％、および６５．４％は、ＭＥＣＰ２＋ニューロンであった。したがって、１×１０^１１ＧＣ／マウスが、最小有効用量と見なされた。

ロータロッド試験を介して、マウスの運動協調性も評価した。落下するまでの時間は、ロータロッド上に留まるマウスの秒によって測定され、図７Ａに示される。ＰＢＳで処置したｋｏマウスと比較して、１×１０^１１ＧＣまたは２．５×１０^１１ＧＣのベクターで処置したｋｏマウスは、ロータロッド上に留まり、落下を回避することにおいて有意な改善を示した。さらに、各マウスについて３回の試行を実施した。ＰＢＳ処理されたｋｏマウスでは、ロータロッド試験を繰り返しても改善は観察されなかった。しかしながら、ＰＢＳ処理したｗｔマウスならびにベクター処理したｋｏマウスからは、ロータロッド上での時間に増加が観察された。

マウスの行動形質を、ガラス玉覆い隠しアッセイを介してさらに試験した。１２個のガラス玉のうちの約７個は、ｗｔマウスによって少なくとも半分が床敷で覆い隠されたが、ＰＢＳ処置されたｋｏマウスは１個のみを覆い隠した。約２個、または約３個のガラス玉は、それぞれ１×１０^１１ＧＣまたは２．５×１０^１１ＧＣのベクターで処置したｋｏマウスによって覆い隠され、ｗｔ表現型に対する行動補正を実証した。

Ｙ迷路では、マウスは、典型的に、以前訪問したアームへ戻るよりも、迷路の新規アームを探索することを好む。したがって、Ｙ迷路の自発的変更指数は、新規環境を探索する意欲の指標として機能し得る。図７Ｃに示すように、５×１０^１１ＧＣのベクターでの処置により、指数は約３５％まで上昇したが、一方、１×１０^１１ＧＣまたは２．５×１０^１１ＧＣのベクターで処置したｋｏマウスの指数は約７０％であり、これはｗｔのもの（約５８％）よりも高くないとしても類似している。ＰＢＳのみを受けたＫｏマウスは、ほとんど動かず、５分間のインターバルあたり、少なくとも９つの決定閾値に達しなかったため、Ｙ迷路におけるそれらのパフォーマンスを評価することはできなかった。

以下の表は、１００日を超える生存または野生型（ｗｔ）対照との比較として示される、幼生ｋｏマウスにおけるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクターの薬学的有効性をさらに提供する。これらの結果は、行動補正結果がＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２ｃｏの用量に依存することを示す。

要約すると、幼生マウスにおける本治療有効性試験は、１×１０^１１、２．５×１０^１１および５×１０^１１ＧＣ／マウスのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ｈＭＥＣＰ２ｃｏでの治療が、マウスにおける寿命の延長をもたらし、典型的な症状の発症を防止し、治療
用量の減少が行動補正の結果を改善したことを示した。

ＮＨＰで実証された発現有効性を有するプロモーター（例えば、ＣＢＡまたはＵｂＣプロモーター）を利用する、同じｈＭＥＣＰ２ｃｏ核酸配列を有するＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２ｃｏベクターもまた、幼生マウスで試験され、薬学的有効性を示す。

用量依存性は、形質導入されたニューロンの数と行動補正の間で確立される。達成された細胞あたりの発現レベルも、ｗｔマウスおよびヒト脳のものと比較される。

３。安全性／毒性
幼生または成体の野生型Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ｈＭＥＣＰ２ｃｏベクターを様々な用量でｉ．ｖ．注射し、ベクターの安全性または毒性を評価した。

増大した用量のＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ｈＭＥＣＰ２での幼生ｗｔマウスの治療は、運動機能に悪影響を及ぼすだけでなく、非常に高い用量（最低治療用量、１×１０^１１ＧＣ／マウスの５０倍である５×１０^１２ＧＣ／マウス）では、軽度の脊髄軸索障害を引き起こした。幼生ｗｔマウスを、３×１０^９ＧＣ／マウス（１群）、１×１０^１０ＧＣ／マウス（２群）、５×１０^１０ＧＣ／マウス（３群）、１×１０^１１ＧＣ／マウス（４群）、５×１０^１１ＧＣ／マウス（５群）、１×１０^１２ＧＣ／マウス（６群）、および５×１０^１２ＧＣ／マウス（７群）の用量で、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ｈＳｙｎ－ｈＭＥＣＰ２ｃｏベクターｉ．ｖ．で処置した。ベクター処置された幼生ｗｔマウスでは、疾病率または死亡率は観察されなかった。ｈＭＥＣＰ２の発現は、５×１０^１１ＧＣ／マウス以下の用量では毒性効果を示さなかった（群１～５）。明らかな症状（例えば、後ろ足効果による移動能力の低下）は、最高治療群（７群）でのみ観察された。背側白質における軸索障害は、１×１０^１２ＧＣ／マウスおよび５×１０^１２ＧＣ／マウスのベクターで処置したマウスにおいて見出された。背側白質路および後根神経における軸索障害を調査した。ベクター治療の有無にかかわらず、野生型マウスの間で、海馬の錐体層、脊髄の灰白質、および後根神経節細胞（ＤＲＧ）における細胞およびＭＥＣＰ２陽性細胞を比較した（図９）。すべての試験群において、後根神経節細胞の損失は観察されなかった。しかしながら、Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ染色は、グレード１の軽度の脱髄が、１×１０^１２ＧＣベクターで処置されたマウスにおいて検出され、グレード２の中等度の脱髄が、５×１０^１２ＧＣ群において観察されたことを示した。低用量群（群１～５）では脱髄は見られなかった。図８Ａを参照されたい。さらに実施したウェスタンブロット分析は、用量５×１０^１１（５ｅ１１として注記される）および１×１０^１２（１ｅ１２として注記される）ＧＣ／マウスでのＡＡＶベクター注射後のＷＴ脳におけるＭＥＣＰ２の相対的過剰発現を示した。並行して実施された病理学的分析では、５×１０^１１ＧＣ／マウス用量でニューロン病理が正常であることが観察された（ＷＴレベルと比較して１．８倍のＭＥＣＰ２発現を有する）。しかしながら、グレード１の軸索障害は、１×１０^１２ＧＣ／マウス用量（ＷＴレベルと比較して２．４倍のＭＥＣＰ２）で明らかになった。

高用量のＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ｈＭＥＣＰ２を用いた成体ｗｔマウスの治療は、行動結果（活動の低下）に悪影響を及ぼしたが、明らかな運動欠陥を引き起こさなかった（最低治療用量の４倍で）。ＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２ｃｏベクターを、１×１０^１２ＧＣ／マウスの用量で成体マウスに静脈内投与した。成体マウス（約２５ｇ）の体重は、幼生マウス（約１０ｇ）の約２．５倍であるため、成体マウスにおけるこの用量は、４×１０^１１ＧＣ／幼生マウスに相当する。したがって、この試験用量（１×１０^１２ＧＣ／成体マウス）は、１×１０^１１ＧＣ／幼生マウスである最低治療用量の４倍であると考えられる。

オープンフィールドアッセイを実施して、成体マウスの行動レベルを評価した。１×１
０^１２ＧＣ／マウスのベクターによる処置により、ＰＢＳのみで処置された対照群と比較して、歩行／水平方向活動が２８％（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、図１０Ａ）減少し、後方歩行／垂直方向活動が６４％（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、図１０Ｂ）減少したことが示された。神経運動能力と協調性をロータロッドテストによって調べた。図１０Ｃに示されるように、ベクター治療マウスは、ＰＢＳ治療マウスと比較して、ロータロッドから落下する可能性が高かった（ｐ＜０．００１、２元ＡＮＯＶＡ）。しかしながら、この結果は、図１０Ａおよび図１０Ｂに示される低い活動性によって混同され得る。５×１０^１０、１×１０^１１、および５×１０^１１ＧＣ／マウスの用量でのＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２ｃｏベクターの成体ｗｔマウスへのｉｖ投与もまた実施される。次に、上述の行動アッセイを使用してマウスを試験する。

本明細書に記載されるように、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で実証された発現有効性を有するプロモーター（例えば、ＣＢＡまたはＵｂＣプロモーター）を利用する、同じｈＭＥＣＰ２ｃｏ核酸配列を有するＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２ｃｏベクターもまた、安全性および毒性について、幼生および成体マウスで試験された。

実施例３－非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究。
１。材料および方法：
非ヒト霊長類実験。Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）種の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）をＣｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．から入手し、遺伝子治療プログラムＳＯＰに従って検疫および動物の飼育を行った。ＡＡＶベクター投与の前月および研究を通じて、体重、体温、呼吸数および心拍数を定期的にモニタリングし、血液およびＣＳＦ試料を得た。全血を細胞数および鑑別に使用し、臨床血液化学パネルを使用した。ＣＳＦ試料は、血液細胞数および鑑別、ならびに全タンパク質定量に使用された。大槽穿刺によるＣＳＦへのＡＡＶベクター送達のために、麻酔されたサルを、側臥位で処置台上に配置し、頭部を前方に屈曲させた。無菌技法を用いて、２１～２７ゲージ、１～１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎ニードル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、ＣＳＦ流れが観察されるまで、後頭下空間へと前進させた。ニードルは、血液の汚染および潜在的な脳幹損傷を回避するために、より広範囲の大槽の上部空隙へ指向された。ニードル穿刺の正確な配置は、透視装置を用いる脊髄造影法により確認された。１ｍＬのＣＳＦを、投与前に、ベースライン分析のために収集した。ＣＳＦ収集の後、ルアーアクセス延長カテーテルは、脊椎ニードルに連結されて、１ｍｌのイオヘキサール（商標名：Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）コントラスト培地を促進する。ニードル配置を確認した後、試験品目を含有するシリンジ（１ｍＬに等価な容量ならびにシリンジおよびリンカーのデッドスペース容量）は、可撓性リンカーに連結されて、３０±５秒間にわたって注射された。ニードルは除去され、直接的圧力が穿刺部位に適用された。ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクターは、３×１０^１２、１×１０^１３、または３×１０^１３ＧＣ／ＮＨＰの用量で注射され、一方で、ＡＡＶｈｕ６８．ＭＥＣＰ２ベクターは、２×１０^１３ＧＣ／ＮＨＰの用量で注射された。研究０日目、１４日目、１８日目、４１日目、および最終試験日に、神経学的機能の詳細な評価のために、すべてのアカゲザルで神経学的評価を行った。簡潔に述べると、評価には、姿勢および歩行評価、脳神経評価、固有受容性評価、ならびに脊髄／神経反射が含まれた。５６日目の試験で、アカゲザルを安楽死させ、大規模解剖検査および剖検を行った。瞬間凍結またはホルマリン固定のいずれかのために、２５個の主要な組織を各アカゲザルから二重で回収した。ＤＮＡまたはＲＮＡを瞬間凍結した組織から精製し、それぞれ、ベクター生体内分布または導入遺伝子発現分析のために使用した。ベクター生体内分布については、導入遺伝子カセットのポリＡ領域を再び指向するプローブおよび内部標準を用いたＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイを用いて、全ＤＮＡ重量あたりのゲノムコピー（ｇｃ）を決定した。導入遺伝子発現を定量化するために、総ＲＮＡを使用して、ポリＴオリゴヌクレオチドによる第１の鎖合成を介してｃＤＮＡを
生成し、続いて、内因性アカゲザルＭＥＣＰ２配列と交差反応しない導入遺伝子に特異的なプローブを用いてＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを行った。組織病理学的分析のために、アカゲザル組織をパラフィンに埋め込み、これらの切片を、それぞれ、Ｈ＆Ｅ溶液、Ｍｙｃ－タグ、またはＭＥＣＰ２抗体で染色した。同じ脊髄切片をＬｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅとともにインキュベートし、ミエリンを染色した。すべての染色された組織切片は、委員会認定の獣医病理学者によって審査され、異常所見は査読によって検証された。

２。ＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２
配列番号３のＭＥＣＰコード配列（配列番号２のｈＭＥＣＰをコードする）を有するＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２を、非ヒト霊長類において試験した。アカゲザル（５～７歳）を、異なる用量で大槽アクセス（ＩＣＭ）を介してＣＳＦに注射した。５６日間の生体内フェーズでは有害な兆候は観察されず、血液化学的検査はすべて正常であった。剖検後、ベクター生物学的分布をｑＰＣＲによって決定し、用量依存的増加が、試験されるすべてのＣＮＳ組織において見出された。これは、同じＣＮＳ組織における導入遺伝子のｍＲＮＡの用量依存的な増加に反映された（ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって、我々の導入遺伝子を選択的に認識するアッセイによって決定された）。ベクターの生体内分布を、以前に公表されたベクターの同等の用量で、同じ投与経路（ＲＯＡ）を介して投与されたＮＨＰでの導入遺伝子ｍＲＮＡレベルと比較した（Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．およびＧａｄａｌｌａ，Ｋ．Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．、本明細書で引用）。ＡＡＶ－ｈｕ６８．ｈＳｙｎ－ＭＥＣＰ２ベクターは、他のベクターと比較して同様のベクター生体内分布を示したが、ベクターは、すべてのＣＮＳ組織においてはるかに高いｍＲＮＡ発現を達成することができ、これにより、ベクターは、効果的なレット症候群遺伝子治療により適している可能性がある。

研究１。以下のアカゲザル集団が研究された。

ＡＡＶ．ｈＭＥＣＰ２ベクターは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを使用して作製され、以下の表に列挙される。ベクター内の発現カセットは、異なるマウスＭｅｃｐ２プロモーター配列と、野生型ヒトＭＥＣＰ２コード配列（ＭＥＣＰ２またはＭＥＣＰ２ｅ１として注記される）とを組み合わせる。

示されるベクターを、大槽内（ＩＣＭ）注射を介して、２×１０^１３ＧＣ／ＮＨＰの用量で送達した。次いで、投与後５６日間、動物を観察した。剖検および病理学的レビューを実施した。

ミエロマクロファージおよび軸索断片化の有無にかかわらず、拡張したミエリン鞘を特徴とする背側白質路における軸索障害を、１～４群において調べた。図１１に示されるように、最小限～中等度の軸索障害は、１群および２群において観察され、最小限～軽度の軸索障害は、３群において観察され、中等度～重度の軸索障害は、４群において観察された。Ｌｕｘｏｌ Ｂｌｕｅ染色は、すべての試験群の脊髄白質路における軽度から中等度のミエリン喪失を示した。図１２を参照されたい。図１３Ａ～図１３Ｄは、組織にわたるベクターの生体内分布を明らかにした。

さらに、２群のｍｙｃ抗体（ＭｅＰ４２６－ＭＥＣＰ２＿ｍｙｃ）、または２群および４群のＭＥＣＰ２抗体を用いて、ＩＨＣにより、ＭＥＣＰ２発現にアクセスした。図１４および図１５を参照されたい。脳皮質および脊髄の後根神経節の両方で奏功した発現が検出された。ｈＭＥＣＰ２ ｍＲＮＡ発現を測定した。ｈＭＥＣＰ２を選択的に増幅するＲＴ－ｑＰＣＲプローブを用いた相対的定量化は、群および組織ごとに異なる発現レベルを示したが、ベクター分布は、群間で類似していた。以下の表を参照されたい。

４．研究２
ｈＳｙｎプロモーターによって駆動される操作されたｈＭＥＣＰ２コード配列を含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏ．ＳＶ４０ベクターを産生し、３×１０^１３ＧＣ／ＮＨＰ、１×１０^１３ＧＣ／ＮＨＰ、および３×１０^１２ＧＣ／ＮＨＰで、ＩＣＭ注射によりＮＨＰ対象に送達した。各用量を用いたベクター生体内分布を調べ、結果は、図
１６Ａ～図１６Ｃに示される。ｈＭＥＣＰ２を選択的に増幅するＲＴ－ｑＰＣＲプローブを用いた相対的定量化は、群および組織ごとに異なる発現レベルを示したが（図１７）、ベクター分布は、群間で類似していた。以下の表を参照されたい。

ｈＳｙｎプロモーターの発現プロファイルが構築され、次いで、ＧＦＰを読み出しとして使用してＣＢＡプロモーターと比較される。

ＤＲＧ脱標的化は、ＭＥＣＰ２発現カセットに組み込まれ、より高い用量で投与されるベクターを可能にする。ｈＳｙｎプロモーターによって駆動される操作されたｈＭＥＣＰ２コード配列を含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏベクター、またはＤＲＧ脱標的化のためのｍｉＲ１８３配列の追加を含むＡＡＶｈｕ６８．ｈＳｙｎ．ＭＥＣＰ２ｃｏ．ｍｉＲ１８３（配列番号１５）を、ＩＣＭ注射を介して、１×１０^１４ＧＣ／ＮＨＰの高用量でＮＨＰ対象に送達した。ＮＨＰ対象（Ｎ＝３）から、治療後３ヶ月で組織を回収した。ＭＥＣＰ２ｃｏに特異的なプローブによるインサイチュハイブリダイゼーションは、ｍｉＲ１８３カセットを含むことにより、ＭＥＣＰ２ｃｏを発現するＤＲＧ細胞の数および発現されるＲＮＡの量が劇的に減少することを示した（図１８Ａ）。さらに、白質路およびＤＲＧの病理学的スコアリングを実施した。すべての組織スコアに関して、ｍｉＲ１８３を伴うＡＡＶベクターを受けたＮＨＰでは、重症度に強い傾向があったか、または有意に減少した（図１８Ｂおよび図１８Ｃ）。回収した組織もインサイチュハイブリダイゼーションアッセイに供し、ＤＲＧ細胞数および強度について定量化した。

表（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下で、フリーテキストを含む配列について提供されている。

本明細書に引用されるすべての文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、先行出願、２０１９年４月２４日に出願された米国特許出願第６２／８３７，９４７号も同様である。同様に、「１９－９００７ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」とラベルされた本明細書に添付されている配列表、ならびにその中の配列およびテキストは、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (26)

1. レット症候群の治療に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、
   （ａ）ＡＡＶカプシドと、
   （ｂ）前記（ａ）のＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムであって、前記ベクターゲノムが、中枢神経系細胞中でｈＭＥＣＰ２発現を指示する調節配列の制御下で、逆位末端反復（ＩＴＲ）と、機能的ヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）をコードする核酸配列とを含み、前記ｈＭＥＣＰ２コード配列が、配列番号３であるか、または配列番号３と少なくとも約９５％同一の配列である、ベクターゲノムと、を含む、ｒＡＶＶ。
2. 前記ｈＭＥＣＰコード配列が、ｈＭＥＣＰ転写バリアント１～３（ＮＭ＿００１３１６３３７．１（配列番号１６）、ＮＭ＿００４９９２．３（配列番号１７）、およびＮＭ＿００１１１０７９２．１（配列番号１８））のうちのいずれか１つと８０％未満同一である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記機能的ｈＭＥＣＰ２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記調節配列が、ニューロン特異的プロモーターを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記調節配列が、構成的プロモーターを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記調節配列が、ヒトシナスピンプロモーターまたはＣＢ７プロモーターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
7. 前記調節エレメントが、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、イントロン、エンハンサー、ＴＡＴＡシグナル、およびポリＡ配列のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ベクターゲノムが、前記ｈＭＥＣＰについての３’非翻訳領域に、後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデムリピートをさらに含み、前記少なくとも２つのタンデムリピートが、同じまたは異なっていてもよく、かつ標的ｍｉＲ１８３またはｍｉＲ１８２であり得る、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
9. 発現カセットｍＲＮＡまたはＤＮＡプラス鎖の前記少なくとも第１のおよび／または少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列の前記ｍｉＲＮＡ標的配列が、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号７）、および（ｉｉ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号９）である、請求項８１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
10. 前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、スペーサーによって分離されており、各スペーサーは、独立して、（Ａ）ＧＧＡＴ、（Ｂ）ＣＡＣＧＴＧ、または（Ｃ）ＧＣＡＴＧＣのうちの１つ以上から選択される、請求項８または９に記載のｒＡＡＶ。
11. 前記ｍｉＲＮＡ標的配列間に位置する前記スペーサーが、前記第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’および／または前記最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置してもよい、請求項１１０に記載のｒＡＡＶ。
12. 前記ｍｉＲＮＡ標的配列間の前記スペーサーが、同じである、請求項１０または１１に記載のｒＡＡＶ。
13. 前記ベクターゲノムが、配列番号６の核酸１～２８０２を含む、請求項１～１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
14. 前記カプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
15. 請求項１～１４のいずれかに記載のｒＡＡＶのストックと、水性懸濁媒体とを含む、組成物。
16. 前記懸濁液が、静脈内送達、髄腔内投与、または脳室内投与のために製剤化される、請求項１５に記載の組成物。
17. 発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、機能的ヒトメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ｈＭＥＣＰ２）発現を指示する調節配列の制御下で、前記ｈＭＥＣＰ２をコードする核酸配列を含み、前記ｈＭＥＣＰ２コード配列が、配列番号３であるか、または配列番号３と少なくとも約９５％同一の配列である、ベクター。
18. 前記ベクターが、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクター、または裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーに基づくベクター、もしくはキトサンに基づく製剤から選択される非ウイルスベクターである、請求項１７に記載のベクター。
19. レット症候群を治療する方法であって、有効量の請求項１～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、または請求項２３もしくは２４に記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
20. 請求項１～１８のいずれかに記載のｒＡＡＶを産生するために有用なｒＡＡＶ産生システムであって、前記産生システムが、
    （ａ）クレードＦカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
    （ｂ）ベクターゲノムと、
    （ｃ）前記クレードＦカプシド中への前記ベクターゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびヘルパー機能と、を含む細胞培養を含む、ｒＡＡＶ産生システム。
21. 前記ベクターゲノムが、配列番号１のｎｔ１～ｎｔ２７２８、または配列番号４のｎｔ１～ｎｔ３９４９、または配列番号６のｎｔ１～ｎｔ２８０２である、請求項２０に記載のｒＡＡＶ産生システム。
22. 前記細胞培養が、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞培養である、請求項２０または２１に記載のｒＡＡＶ産生システム。
23. 前記ＡＡＶ ｒｅｐが、異なるＡＡＶ由来である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のシステム。
24. 前記ＡＡＶ ｒｅｐが、ＡＡＶ２由来である、請求項２３に記載のシステム。
25. 前記ＡＡＶ ｒｅｐコード配列およびｃａｐ遺伝子が、同じ核酸分子上にあり、任意選択的に、前記ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在する、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のシステム。
26. 前記スペーサーが、ａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ（配列番号１４）である、請求項２５に記載のシステム。

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