BR112019025732A2

BR112019025732A2 - vetores de aav auto-reguladores para expressão segura de mecp2 na síndrome de rett

Info

Publication number: BR112019025732A2
Application number: BR112019025732-2A
Authority: BR
Inventors: Miguel Sena ESTEVES; Guangping Gao; Michael R. Green; Dan Wang; Tessa Mercedes SIMONE
Original assignee: University Of Massachusetts
Priority date: 2017-06-06
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2020-06-30
Also published as: MX2019014760A; CL2019003582A1; AU2018281145A1; EP3635122A4; WO2018226785A1; CO2019014840A2; KR20200015701A; CA3066623A1; JP2023164447A; US20230416779A1; IL271170A; US20200181646A1; US11680275B2; SG11201911737PA; EP3635122A1; CN111065742A; EA201992882A1; JP2020522269A

Abstract

A presente invenção, em alguns aspectos, se refere a composições e métodos de manipulação de um transgene. A presente invenção, em algumas modalidades, também se refere a ácidos nucleicos recombinantes auto-reguladores, vetores virais e composições farmacêuticas compreendendo um transgene MeCP2. A presente invenção, em algumas modalidades, se refere a composições e métodos úteis para o tratamento de doenças e distúrbios associados com uma perda de mutação da função, por exemplo, síndrome de Rett.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETO- RES DE AAV AUTORREGULADORES PARA EXPRESSÃO SEGU- RA DE MECP2 NA SÍNDROME DE RETT".

REQUERIMENTOS RELACIONADOS

[0001] Este requerimento reivindica o benefício de acordo com 35 U.S.C. $ 119(e) da data de registro do Requerimento de Patente Pro- visória U.S. Serial No. 62/516.060, registrado em 6 de junho de 2017, cujo conteúdo integral é incorporado aqui, a este requerimento de pa- tente, por meio de referência.

ANTECEDENTES

[0002] A síndrome de Rett é uma doença neurológica causada por perda de mutações de função em MeCP2. Tem sido observado que a restauração pós-natal da expressão de MeCP?2 é eficaz na reversão de alguns dos fenótipos presentes em camundongos MeCP2, porém continuam a existir preocupações quanto à segurança. Adicionalmen- te, estudos examinando a eficácia terapêutica de alguns vetores de MeCP?2 codificando a isoforma e1 observaram somente um resgate parcial de fenótipos de Rett. Estes estudos tipicamente se focalizaram sobre a liberação neonatal intravascular (IV) ou intracerebroventricular (ICV), e em alguns casos encontraram toxicidade hepática letal e aper- to (clasping) dos membros posteriores.

SUMÁRIO

[0003] Aspectos da presente invenção se referem à descoberta de que algumas combinações de elementos reguladores de mIRNA (MREs), por exemplo, sítios de ligação ao miRNA associados com la- ços de retorno negativo de expressão genética e sítios de ligação ao MIRNA que de-target (N.T.: desdirecionam) a expressão do transgene de tecidos não alvo, permitem a expressão de transgene ajustável dentro de uma faixa estreita compatível com função de proteína nor- mal e evitação de toxicidade do transgene fora do alvo. Em algumas modalidades, as composições e os métodos descritos pela presente invenção são, portanto, úteis para tratar doenças e disúrbios associa- dos com perda de mutações de função, por exemplo, síndrome de Rett, a qual é associada com perda de mutações de função no gene MeCP?2.

[0004] Por conseguinte, em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um método de manipulação de um transgene, o método compreendendo: selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; selecionar um segundo gene codificando um segundo produto na célula; determinar que a expressão do segundo produto é regulada positivamente pelo primeiro produto na célula; se- lecionar um miRNA; determinar que a expressão do miRNA é regulada positivamente pelo segundo produto na célula; e, manipular um trans- gene para expressar na célula um transcripto tendo uma região codifi- cante codificando o primeiro produto e tendo um ou mais sítios de liga- ção para o miRNA.

[0005] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um método de manipulação de um transgene, o método compreendendo: selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; selecionar um miRNA, cuja expressão é regulada positivamente pelo primeiro produto na célula; e, manipular um transgene que ex- presse um transcripto tendo uma região codificante codificando o pri- meiro produto e uma região não codificante 3' compreendendo um ou mais sítios de ligação para o miRNA.

[0006] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um método de manipulação de um transgene, o método compreendendo: selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; selecionar um segundo gene codificando um segundo produto na célula; determinar que a expressão do segundo produto é regulada positivamente pelo primeiro produto na célula; selecionar um miRNA;

determinar que a expressão do miRNA é regulada positivamente pelo segundo produto na célula; e, manipular um transgene para expressar na célula um transcripto tendo uma região codificante codificando o primeiro produto e uma região não codificante 3' compreendendo um ou mais sítios de ligação para o miRNA.

[0007] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um ácido nucleico recombinante codificando um transcripto tendo i) uma região codificante codificando uma proteína e ii) dois ou mais sítios de ligação ao miRNA, em que os dois ou mais sítios de ligação ao miRNA compreendem: no mínimo um primeiro sítio de ligação ao miRNA es- pecífico para um primeiro miRNA que é regulado positivamente por expressão da proteína em uma célula de um tecido-alvo; e no mínimo um segundo sítio de ligação ao miRNA específico para um segundo MIRNA que é expresso, independente de expressão da proteína, em células de um tecido não alvo.

[0008] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um ácido nucleico recombinante codificando um transcripto tendo uma re- gião codificante codificando uma proteína MeCP2 humana ou um fra- gmento funcional da mesma e uma região não codificante 3' compre- endendo um ou mais sítios de ligação ao miRNA, em que o um ou mais sítios de ligação ao miRNA compreendem: no mínimo um sítio de ligação ao miRNA específico para um miRNA que regula negativamen- te a expressão do transcripto; e no mínimo um sítio de ligação ao MIRNA específico para um miRNA que inibe a expressão do transcrip- to em um tecido não alvo.

[0009] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um ácido nucleico recombinante codificando um transcripto tendo: uma região codificante codificando MeCP2 humana ou um fragmento funci- onal da mesma e, uma região não codificante 3' compreendendo um ou mais sítios de ligação ao miRNA, em que transcripto é flanqueado por repetições de terminal invertido (ITRs) de vírus adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, uma ITR de AAV é uma ITR de AAV2, AAV3, AAVA4, AAVS5, ou AAV6. Em algumas modalidades, ITRs de AAV são ITRs de AAV2. Em algumas modalidades, ITRs são se- quências artificiais que substituem a função da ITR, por exemplo, con- forme revelado em WO/2016/172008.

[00010] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um ve- tor viral compreendendo um ácido nucleico recombinante conforme descrito pela presente invenção. Em algumas modalidades, um vetor viral é um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de adenoví- rus, um vetor lentiviral, um vetor de vírus da herpes, ou um vetor de baculovírus.

[00011] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um ví- rus adenoassociado recombinante (rAAV) compreendendo: um ácido nucleico recombinante conforme descrito pela presente invenção; no mínimo uma repetição de terminal invertido (ITR) do vírus adenoasso- ciado (AAV); e uma proteína do capsídeo.

[00012] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um ve- tor de AAV recombinante (rAAV) para expressão auto-regulada de uma proteína, o vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico ma- nipulado para expressar em uma célula de um tecido-alvo um transcri- pto codificando a proteína, em que o transcripto compreende no míni- mo um primeiro sítio de ligação ao miRNA específico para um primeiro MIRNA, em que a expressão do primeiro miRNA é regulada positiva- mente por expressão da proteína na célula.

[00013] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se uma composição compreendendo um ácido nucleico recombinante confor- me descrito pela presente invenção, ou um rAAV conforme descrito pela presente invenção, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma composição é formulada para injeção,

por exemplo, injeção sistêmica (por exemplo, injeção intravenosa) ou injeção intratecal.

[00014] Em algumas modalidades, um primeiro produto é uma pro- teína. Em algumas modalidades, a proteína é MeCP2, por exemplo, MeCP?2 isoforma e1 ou MeCP2 isoforma e2. Em algumas modalida- des, um primeiro produto é um mMIRNA ou um RNA não codificante longo.

[00015] Em algumas modalidades, um segundo produto é uma pro- teína, ou um ácido nucleico. Em algumas modalidades, o segundo produto é fator neurotrófico derivado de osso (BDNF). Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um mIRNA (por exemplo, miR-132). Em algumas modalidades, o primeiro miRNA é miR-132.

[00016] Em algumas modalidades, no mínimo um sítio de ligação ao mIiRNA específico para um miRNA que regula negativamente a ex- pressão do transcripto compreende um sítio de ligação a miR-132, por exemplo, dois ou três sítios de ligação a miR-132.

[00017] Em algumas modalidades, no mínimo um sítio de ligação ao miRNA específico para um miRNA que inibe a expressão do trans- cripto em um tecido não alvo compreende um sítio de ligação a miR-1, um sítio de ligação a mir-122, ou um sítio de ligação a miR-1 e miR-

122. Em algumas modalidades, o no mínimo um sítio de ligação ao MIRNA específico para um miRNA que inibe a expressão do transcrip- to em um tecido não alvo compreende três sítios de ligação a miR-1 (por exemplo, 3x-miR-1) e três sítios de ligação a miR-122 (por exem- plo, 3Xx-miR-122).

[00018] Em algumas modalidades, os métodos descritos pela pre- sente invenção adicionalmente compreendem a etapa de manipulação da região não codificante 3' do transcripto para compreender um ou mais sítios de ligação para um ou mais miRNAs de de-targeting. Em algumas modalidades, um ou mais miRNAs de de-targeting inibem a expressão do transgene a partir do fígado, do coração, do pulmão, do músculo, do pâncreas, ou células imunes (por exemplo, apresentado- ras de antígeno). Em algumas modalidades, um ou mais miRNA de de- targeting é miR-122, miR-1, ou miR-122 e miR-1. Em algumas modali- dades, um ou mais miRNAs de de-targeting inibem a expressão do transgene em células imunes, tais como células apresentadoras de an- tígeno (por exemplo, células dendríticas, macrófagos, etc.). Em algu- mas modalidades, um ou mais miRNA de de-targeting é miR-15a, miR- 16-1, miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1, miR-21, miR- 29a, miR-29b, miR-29c, miR-30b, miR-31, miR-34a, miR-92a-1, miR- 106a, miR-125a, miR-125b, mIR-126, miR-142-3p, miR-146a, miR-150, MIiR-155, miR-181a, miR-223 ou miR-424.

[00019] Em algumas modalidades, um sítio de ligação ao miRNA ou sítios de ligação ao miRNA está localizado entre o último códon da re- gião codificante e a cauda poli-A do transcripto.

[00020] Em algumas modalidades dos métodos descritos pela pre- sente invenção, a etapa de manipulação do transgene compreende in- serir o transgene dentro de um vetor. Em algumas modalidades, um vetor é um vetor de clonagem, um vetor de expressão, um plasmídeo, ou um vetor viral.

[00021] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante adicionalmente compreende um promotor, por exemplo, um promotor de MeCP2 de camundongo. Em algumas modalidades, um promotor de MeCP2 de camundongo compreende a sequência estipulada na SEQ ID NO: 3.

[00022] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante está localizado sobre um plasmídeo.

[00023] Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo é uma proteína do capsídeo que facilita ao rAAV atravessar através da barreira hematoencefálica de um sujeito. Em algumas modalidades,

uma proteína do capsídeo tem um sorotipo selecionado entre o grupo que consiste em AAV-PHP.B, AAV1, AAV2, AAV2i8, AAV2.5, AAVS5, AAV6, AAV8, AAVrh8ê8, AAV9, AAVIrhiO, AAV-B1, AAV9.45A-String (por exemplo, AAV9.45-AS), AAV9.45Angiopep, AAV9.47-Angiopep, e AAV9.47-AS, AAV5, AAVrh39, AAVrh43, CAM130, e AAVOHR. Em al- gumas modalidades, uma proteína do capsídeo tem um sorotipo confor- me descrito em WO2015/127128. WO2016/054554, WO2016/054557, ou WOZ2016/065001. Em algumas modalidades, uma proteína do cap- sídeo compreende ou consiste em uma sequência estipulada na SEQ ID NO: 14 ou 15 (por exemplo, AAV-PHP.B ou AAV9).

[00024] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um método de tratamento da síndrome de Rett em um sujeito, o método compreendendo, administrar a um sujeito, tendo ou suspeito de ter síndrome de Rett, uma quantidade eficaz de: um ácido nucleico re- combinante conforme descrito pela presente invenção; um rAAV con- forme descrito pela presente invenção; ou, uma composição conforme descrito pela presente invenção.

[00025] Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito humano. Em algumas modalidades, um sujeito tem menos de um ano de idade. Em algumas modalidades, um sujeito é caracterizado por uma muta- ção em no mínimo uma cópia do gene MeCP2, por exemplo, uma per- da de mutação da função.

[00026] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante, um rAAV ou uma composição conforme descrita pela presente inven- ção é administrado por injeção, por exemplo, injeção sistêmica (por exemplo, injeção intravenosa) ou injeção intratecal. Em algumas mo- dalidades, a administração resulta em uma quantidade eficaz do ácido nucleico recombinante, do rAAV ou da composição cruzando a barrei- ra hematoencefálica de um sujeito. Em algumas modalidades, a admi- nistração resulta em um nível não tóxico de expressão de MeCP2 no cérebro do sujeito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00027] As FIGURAS 1A a 1B mostram a caracterização de novos AAV-MeCP?2 vetores para terapia genética segura e eficaz na síndro- me de Rett. A FIG. 1 A mostra uma representação esquemática de um mecanismo homeostático de autorregulação de MeCP2. A FIG. 1B mostra uma representação esquemática da estrutura de vetores AAV- MeCP?2 auto-regulados codificando MeCP2-e1 humana com um mar- cador de myc sob um promotor de MeCP2 de camundongo (-223 a +56) e diferentes elementos de reconhecimento de microRNA (por exemplo, miR-122/1T; miR-132T).

[00028] As FIGURAS 2A a 2C mostram a expressão eficaz de AAV2-MeCP2 em células HEK293T. A FIG. 2A mostra a expressão de MeCP2 medida por Western blot. A FIG. 2B mostra a expressão de MeCP2 medida por um teste de expressão de proteína normalizada (FIG. 2B). A FIG. 2C mostra um perfil de toxicidade de células 293T transduzidas com AAV2-MeCP2 por quatro dias em uma dose de

30.000 gc/ célula.

[00029] As FIGURAS 3A a 3C mostram a expressão de AAV2- MeCP2 em neurônios corticais de camundongo. A FIG. 3A mostra que neurônios corticais primários de camundongo foram transduzidos em doses de vetores de AAV variando de 1E3-1E5 vg/ célula incluindo AAV-GFP como um controle. A FIG. 3B mostra análise Western blot da expressão de hMeCP2-myc nos neurônios 5 dias depois de infecção com genomas de vetor 3E4 (dose) / célula. A FIG. 3C mostra a ex- pressão de miR-132 em resposta à re-liberação de AAV2-MeCP?2.

[00030] As FIGURAS 4A a 4C mostram dados representativos obti- dos a partir de experimentos em camundongos in vivo. A FIG. 4A mos- tra camundongos selvagens 1 dia pós-natal injetados através da veia facial com AAV codificando a isoforma e1 de MeCP2 humana conten-

do O, 1x, 2x, ou 3x sequências alvo miR-132. Animais selvagens foram eutanizados 3 meses depois da injeção e o tecido total do cérebro, do coração e do fígado foi submetido a extração do RNA total, síntese de cDNA e qgRT-PCR usando iniciadores específicos para a isoforma e1 de MeCP2 humana. Os dados foram normalizados para AAV-MeCP2 contendo 3x sequências alvo miR-132, o qual foi ajustado para 1. À FIG. 4B mostra análise da expressão genética de MeCP2 humana iso- forma e1 no cérebro de camundongos selvagens depois de injeção in- tracraniana de AAV-MeCP2. A FIG. 4C mostra análise da expressão genética de MeCP2 humana isoforma e1 no cérebro de camundongos selvagens depois de injeção intracraniana de AAV-MeCP?2.

[00031] AFIG.5 mostra que a expressão de MeCP2 acionada pe- los constructos descritos pela presente invenção é des-direcionada de modo eficaz do coração e do fígado.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00032] Aspectos da presente invenção se referem, em parte, a ve- tores de AAV capazes de auto-regular os níveis de expressão de transgenes (por exemplo, MeCP2) para prevenir toxicidade relaciona- da com superexpressão. Em algumas modalidades, o mecanismo de autorregulação se baseia na presença de múltiplas cópias de um ele- mento regulador de miRNA (por exemplo, um ou mais sítios de ligação a miR-132) na 3UTR do cassete de transgene. Conforme descrito adi- cionalmente na seção de Exemplos, vetores de AAV capazes de auto- regular a expressão de transgenes, em algumas modalidades, têm um perfil de eficácia e segurança aprimorado comparados com outros ve- tores de AAV, por exemplo, vetores de AAV compreendendo promoto- res de transgenes nativos somtne. Deve ser reconhecido que as ob- servações descritas na seção de Exemplos no contexto dos construc- tos miR-132/MeCP2 são aplicáveis a outros constructos de expressão de transgenes compreendendo sítios de ligação de outros miRs que regulam a expressão de proteína (por exemplo, através de um laço de retorno negativo).

[00033] Em algumas modalidades, as vias de liberação que têm mais probabilidade de mediar a liberação genética global para o siste- ma nervoso central (por exemplo, injeção sistêmica e injeção intrate- cal) provavelmente vão resultar em alto nível de transdução dos ór- gãos periféricos onde a expressão do transgene (por exemplo, MeCP2) pode ser tornar tóxica. A presente invenção se baseia, em parte, no reconhecimento de que a combinação de elementos regula- dores de miRNA (MREs), tais como sítios de ligação ao miRNA (por exemplo, sítios de ligação a miR-122 e sítios de ligação a miR-1), com MREs associados com laços de retorno negativo regulando a expres- são de proteína (por exemplo, sítios de ligação a miR-132 para MeCP?2), simultaneamente regulam os níveis de expressão de trans- gene e desdirecionam a expressão de transgene nos órgãos periféri- cos.

[00034] Por conseguinte, em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um método de manipulação de um transgene, o método compreendendo: selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; selecionar um mIRNA, cuja expressão é regu- lada positivamente pelo primeiro produto na célula; e, manipular um transgene que expresse um transcripto tendo uma região codificante codificando o primeiro produto e um ou mais sítios de ligação para o MIRNA. Em algumas modalidades, o um ou mais sítios de ligação para o mMIRNA estão localizados em uma região não codificante 3' do trans- cripto.

[00035] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se um método de manipulação de um transgene, o método compreendendo: selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; selecionar um segundo gene codificando um segundo produto na célula; determinar que a expressão do segundo produto é regulada positivamente pelo primeiro produto na célula; selecionar um miRNA; determinar que a expressão do miRNA é regulada positivamente pelo segundo produto na célula; e, manipular um transgene para expressar na célula um transcripto tendo uma região codificante codificando o primeiro produto e um ou mais sítios de ligação para o miRNA. Em al- gumas modalidades, o um ou mais sítios de ligação para o miRNA es- tão localizados em uma região não codificante 3' do transcripto.

[00036] “Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "ma- nipulação de um transgene" se refere à produção (por exemplo, sínte- se) de um ácido nucleico recombinante usando técnicas de clonagem genética, tais como reação em cadeia de polimerase (PCR), digestão por enzimas de restrição, e ligação de ácido nucleico in vitro, por exemplo, conforme descrito em Sambrook et al, Molecular Cloning: À Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

[00037] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um "produto" ou "produto genético" se refere a um ácido nucleico (por exemplo, transcripto de RNA, dsRNA, miRNA, etc.), um peptídeo, uma proteína, ou um polipeptídeo que é transcrito e/ou traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA). Em al- gumas modalidades, um produto é um transcripto de RNA compreen- dendo uma região codificadora de proteínas. Em algumas modalida- des, uma região codificadora de proteínas codifica uma proteína asso- ciada com uma doença causada por uma perda de mutação da função (por exemplo, MeCP2). Exemplos adicionais de proteínas associadas com uma doença causada por uma perda de mutação da função inclu- em, mas não estão limitados a, tirosinase (Tirosinemia), beta- galactosidase do ácido lisossômico (GM1-gangliosidose), beta- hexosaminidase A e B (doença de Tay-Sach e Sandhoff), aspartoaci-

lase (ASPA; doença de Canavan), Aspartilglucosamininidase (Aspartil- glucosaminúria), proteína tioesterase de Palmitoil (doença de Batten Infantil), tripeptidil peptidase (doença de Batten infantil tardia), a- Galactosidase (doença de Fabry), a-Fucosidase (Fucosidose), proteí- na protetora / catepsina A (Galactossialidose), B-Glucosidase (doença de Gaucher), Galactosilceramidase (leucodistrofia de células globoi- des), a-Manosidase (a-Manosidose ), Arilsulfatase A (Leucodistrofia metacromática), a-L-Iduronidase (Mucopolissacaridose |), a-N- acetilglucosaminidase (Mucopolissacaridose IIIB), Arilsulfatase B (Mu- copolissacaridose VI), B-Glucuronidase (Mucopolissacaridose VII), es- fingomielinase ácida (doença de Nieman-Pick), a-Glucosidase (doença de Pompe) e Lipase ácida (doença de Wolman), FOXG1 (Síndrome FOXG1), CDKLS5, N-Glyl, Glut-1 (doença de De Vivo), etc.

[00038] Em algumas modalidades, um produto é um ácido nucleico interferente, por exemplo, um miRNA que regula a expressão ou ativi- dade de um produto genético.

[00039] Em algumas modalidades, um produto regula a expressão genética ou a expressão de proteína de um segundo produto. A regu- lação da expressão ou translação do produto genético pode ser positi- va ou negativa. "Regulação positiva" se refere a um aumento da ex- pressão ou atividade genética (por exemplo, em consequência da ex- pressão ou atividade de outro produto genético). "Regulação negativa" se refere a uma diminuição ou inibição da expressão ou atividade ge- nética (por exemplo, em consequência da expressão ou atividade de outro produto genético através de um laço de retorno).

[00040] Em algumas modalidades, produtos genéticos tais como fatores de crescimento, fatores de transcrição (por exemplo, conforme descrito em Wang et al. Nucleic Acids Res. 2010 Jan; 38 (Emissão do banco de dados): D119—D122), etc. são capazes de regular a expres- são ou a atividade de transgenes em uma célula ou em um sujeito.

Exemplos de fatores de crescimento incluem neurotrofinas, tais como fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento nervoso (NGF), neurotrofina 3, neurotrofina 4, fator neurotrófico deri- vado da glia (GDNF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fatores de cres- cimento de fibroblastos (FGF1 a 23), neurturina, fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), fator de crescimento semelhante à in- sulina 2 (IGF-2), etc.

[00041] Em algumas modalidades, transgenes conforme descrito pela presente invenção são manipulados de modo a compreenderem no mínimo um elemento regulador de miRNA (por exemplo, sítio de li- gação ao miRNA) que seja associado com um laço regulador da ex- pressão genética (por exemplo, laços de retorno negativo, laços de re- torno positivo, etc.). De modo geral, os laços reguladores da expres- são genética podem ser endógenos para uma célula, ou artificiais (por exemplo, um ou mais elementos do laço de retorno são proporciona- dos junto com um transgene). Em um exemplo de um laço de retorno negativo, a expressão de MeCP2 em uma célula provoca um aumento do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) na célula, o qual por sua vez aumenta a expressão de miR-132, que por sua vez regula a expressão de MeCP2 (FIG. 1). Deve ser reconhecido que, em algumas modalidades, a presente invenção se refere a laços de retorno positi- vo, os quais podem ser usados para amplificar a expressão do trans- gene.

[00042] Em algumas modalidades, transgenes conforme descrito pela presente invenção são manipulados de modo a compreenderem no mínimo um elemento regulador de miRNA (por exemplo, sítio de li- gação ao miRNA) que desdireciona a expressão do transgene de um ou mais tecidos não alvo. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "tecido não alvo" se refere a um tecido (por exemplo, célu- las de um tecido) no qual é indesejável a expressão do transgene. Por exemplo, em algumas modalidades, a superexpressão de MeCP2 em uma célula resulta em citotoxicidade hepática; neste contexto, o tecido do fígado (por exemplo, céulas hepáticas) é um tecido não alvo. Em algumas modalidades, um tecido não alvo é o fígado (por exemplo, cé- lulas hepáticas), o coração (por exemplo, células cardíacas), o pân- creas (por exemplo, pancreáticas), músculo (por exemplo, células musculares), células imunes (por exemplo, células apresentadoras de antígeno, etc.), ou qualquer combinação dos mesmos.

[00043] “Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "tecido-alvo" se refere a um tecido (por exemplo, células de um tecido) no qual a expressão de um transgene é preferencial em relação a ou- tros tecidos, tais como tecidos não alvo. Em algumas modalidades, um tecido-alvo é tecido do sistema nervoso central (por exemplo, células do sistema nervoso central, tais como neurônios). Exemplos não limi- tantes de tecido do sistema nervoso central incluem tecido cerebral (por exemplo, neurônios, células da glia, etc.) e tecido da medula espi- nhal.

[00044] “De modo geral, o um ou mais sítios de ligação ao miRNA de um transcripto codificado por um transgene estão localizados na região não traduzida 3' (3'UTR) do transcripto. Em algumas modalida- des, o um ou mais sítios de ligação ao miRNA estão localizados entre o último códon da região codificante do transcripto e a cauda poli-A do transcripto. No entanto, deve ser reconhecido que, em algumas moda- lidades, um ou mais sítios de ligação ao miRNA estão localizados em uma região diferente da 3 UTR do transcripto, por exemplo, em um ín- tron na extremidade 5' do transcripto. O número de sítios de ligação ao MIRNA manipulados dentro de um transgene conforme descrito pela presente invenção vai variar dependendo do produto genético codifi- cado pelo transgene, e pode ser determinado empiricamente por um especialista na técnica sem uma quantidade indevida de experimenta-

ção. Por exemplo, em algumas modalidades, um transgene conforme descrito pela presente invenção compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou sítios de ligação ao miRNA. Em algumas modalidades, um transge- ne conforme descrito pela presente invenção compreende mais de 10 (por exemplo, qualquer inteiro entre 11 e 100) sítios de ligação ao MIRNA. Em algumas modalidades, um transgene conforme descrito pela presente invenção compreende 3, 4, ou 5 sítios de ligação ao MIRNA. O um ou mais sítios de ligação ao miRNA podem cada um se ligar ao mesmo miRNA, ou a um miRNA diferente. Em algumas moda- lidades, um transgene conforme descrito pela presente invenção com- preende um ou mais (por exemplo, 3) sítio(s) de ligação a miR-122, um ou mais (por exemplo, 3) sítio(s) de ligação a miR-1, e três sítios de ligação a miR-132.

Ácidos nucleicos recombinantes

[00045] Em algumas modalidades, um transgene conforme descrito pela presente invenção é codificado por um ácido nucleico recombi- nante. Uma sequência de "ácido nucleico" se refere a uma sequência de DNA ou RNA. Em algumas modalidades, são isolados proteínas e ácidos nucleicos da presente invenção. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "isolado" significa produzido artifici- almente. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, com respeito a ácidos nucleicos, o termo "isolado" significa: (i) amplificado in vitro por, por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR); (ii) produzido de modo recombinante por clonagem; (iii) purificado, como por clivagem e separação por gel; ou (iv) sintetizado por, por exemplo, síntese químcia. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico o qual é prontamente manipulável por técnicas de DNA recombinante de co- nhecimento geral na técnica. Deste modo, uma sequência de nucleotí- deo contida em um vetor no qual são conhecidos sítios de restrição 5' e 3' ou para o qual tenham sido reveladas sequências de iniciador de reação em cadeia de polimerase (PCR) é considerada isolada mas uma sequência de ácido nucleico existente em seu estado nativo em seu hospedeiro natural não é. Um ácido nucleico isolado pode ser substancialmente purificado, mas não precisa ser. Por exemplo, um ácido nucleico que é isolado dento de um vetor de clonagem ou de ex- pressão não é puro pelo fato de que pode compreender somente uma percentagem muito pequena do material na célula na qual é inerente. Um ácido nucleico semelhante é isolado, no entanto, conforme o termo é usado aqui, neste requerimento de patente, porque é prontamente manipulável por técnicas de rotina de conhecimento geral dos peritos na técnica. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, com respeito a proteínas ou peptídeos, o termo "isolado" se refere a uma proteína ou peptídeo que tenha sido isolado de seu ambiente natural ou que tenha sido produzido artificialmente (por exemplo, por síntese químcia, por tecnologia de DNA recombinante, etc.).

[00046] O especialista na técnica também vai reconhecer que po- dem ser feitas substituições de aminoácidos conservadoras para pro- porcionar variantes funcionalmente equivalentes, ou homólogos das proteínas do capsídeo. Em alguns aspectos a presente invenção en- globa alterações de sequência que resultam em substituições de ami- noácidos conservadoras. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma substituição de aminoácido conservadora se refere a uma substituição de aminoácido que não altera a carga relativa ou o tamanho característico da proteína na qual a substituição de aminoá- cido é feita. Variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar sequência de polipeptídeo de conhecimento de um perito na técnica tais como são encontrados nas referências que compilam os métodos referidos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et a/., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ou Current

Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. Substituições de aminoácidos conservadoras in- cluem substituições feitas entre aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) M, |, L, V; (b) FE, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, TJ (D Q, N; e (9) E, D. Portanto, podem-se fazer substituições de aminoácidos conservadoras para a sequência de aminoácidos das proteínas e dos polipeptídeos revelados aqui, neste requerimento de patente.

[00047] Em algumas modalidades, um ácido nucleico conforme descrito pela presente invenção está contido dentro de um vetor. Con- forme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "vetor" inclui qualquer elemento genético, tal como um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, cromossoma, cromossoma artificial, vírus, vírion, etc., o qual é capaz de replicação quando associado com os elementos de controle apropriados e os quais podem transferir sequências genéticas entre células. Deste modo, o termo inclui veículos de clonagem e de expressão, bem como vetores virais. Exemplos de vetores virais inclu- em vetor de adenovírus, vetor de vírus adenoassociado (AAV), vetores lentivirais, vetores de vírus da herpes, vetores de baculovírus, etc. MeCP2

[00048] Em alguns aspectos, a presente invenção se refere a com- posições e métodos para expressar a proteína MeCP2 em uma célula ou em um sujeito. "MeCP2" se refere à proteína de ligação a metil CpG 2, a qual é codificada pelo gene MeCP2 e tem funções importantes (por exemplo, funciona como um repressor transcricional, ou como um ativador transcricional) em células nervosas, tais como os neurônios maduros. Um exemplo de um gene MeCP?2 é representado pelo Nú- mero de Acesso no GenBank NM 001110792 (MeCP2-e1). Outro exemplo de um gene MeCP?2 é representado pelo Número de Acesso no GenBank NM 001110792 (MeCP2-e2). O gene MeCP2 codifica duas isoformas de proteína MeCP2, referidas como MeCP?2 isoforma el e MeCP2 isoforma e2, as quais diferem no comprimento de seu término -N. Em algumas modalidades, MeCP?2 isoforma e1 é represen- tada por uma sequência estipulada na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, MeCP2 isoforma e2 é representada por uma sequência estipulada na SEQ ID NO: 2.

[00049] Em algumas modalidades, um transgene (por exemplo, um ácido nucleico recombinante) codifica um fragmento funcional de pro- teíina MeCP2 (por exemplo, um fragmento da isoforma e1 ou da iso- forma e2). Um "fragmento funcional" de MeCP2 é uma proteína MeCP? truncada que conserva a função natural (por exemplo, ativador transcricional ou repressor transcricional) da proteína MeCP2 selva- gem (por exemplo, comprimento total). Em algumas modalidades, um fragmento funcional de MeCP2 compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, ou mais truncações de aminoácido em relação à proteína MeCP2 de comprimento total. Em algumas modalidades, um fragmento funcional de MeCP2 compreende entre cerca de 1 e 10, 5 e 50, 20 e 100 trun- cações de aminoácido em relação à proteína MeCP2 de comprimento total.

[00050] Em algumas modalidades, um transgene (por exemplo, um ácido nucleico recombinante) codifica uma variante da proteína MeCP?2 (por exemplo, uma variante da isoforma e1 ou da isoforma e2). Uma variante da proteína MeCP2 pode ter entre cerca de 50% e cerca de 99,9% de identidade com uma proteína MeCP2 selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, uma MeCP?2 variante tem cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99% de iden- tidade com uma proteína MeCP2 selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2). MmiRNA e sítios de ligação ao miRNA

[00051] A presente invenção se baseia, em parte, no reconheci-

mento de que combinando elementos reguladores de miRNA (MREs), tais como sítios de ligação ao miRNA (por exemplo, sítios de ligação a mMiR-122 e sítios de ligação a miR-1), com MREs associados com la- ços de retorno negativo regulando a expressão de proteína (por exem- plo, sítios de ligação a miR-132 para MeCP2), regulam simultanea- mente os níveis de expressão de transgene e des-direciona a expres- são do transgene nos órgãos periféricos.

[00052] — miRNAs e outros ácidos nucleicos interferentes pequenos regulam a expressão genética através de clivagem / degradação de transcripto de RNA alvo ou repressão translacional do RNA mensagei- ro alvo (MRNA). miRNAs são expressos nativamente, tipicamente co- mo produtos de RNA não traduzido 19-25 final. miRNAs apresentam sua atividade através de interações específicas para sequências com as regiões não traduzidas 3' (UTR) de mMRNAs alvo. Estes miRNAs ex- pressos endogenamente formam precursores de hairpin os quais são em seguida processados em um duplex de miRNA, e adicionalmente em uma molécula de miRNA de cadeia única "madura". Este miRNA maduro guia um complexo de multiproteínas, miRISC, o qual identifica o Sítio-alvo, por exemplo, nas regiões UTR 3', de MRNAs alvo com ba- se em sua complementaridade com o miRNA maduro.

[00053] A seguinte lista não limitante de genes de miRNA, e seus homólogos, são úteis nos métodos e composições da presente in- venção (por exemplo, para mediar a expressão auto-regulada ou o de- targeting de um transgene): hsa-let-7a, hsa-let-7a“*, hsa-let-7b, hsa-let- 7b*, hsa-let-7c, hsa-let-7c", hsa-let-7d, hsa-let-7d*, hsa-let-7e, hsa-let- 7e*, hsa-let-7f, hsa-let-7f-1*, hsa-let-7f-2*, hsa-let-7g, hsa-let-79*, hsa- let-7i, hsa-let-7i", hsa-miR-1, hsa-miR-100, hsa-miR-100*, hsa-miR- 101, hsa-miR-101*, hsa-miR-103, hsa-miR-105, hsa-miR-105*, hsa- miR-106a, hsa-miR-106a*, hsa-miR-106b, hsa-miR-106b*, hsa-miR- 107, hsa-miR-10a, hsa-miR-10a*, hsa-miR-10b, hsa-miR-10b*, hsa-

mMiR-1178, hsa-miR-1179, hsa-miR-1180, hsa-miR-1181, hsa-miR- 1182, hsa-miR-1183, hsa-miR-1184, hsa-miR-1185, hsa-miR-1197, hsa-miR-1200, hsa-miR-1201, hsa-miR-1202, hsa-miR-1203, hsa-miR- 1204, hsa-miR-1205, hsa-miR-1206, hsa-miR-1207-3p, hsa-miR-1207- 5p, hsa-miR-1208, hsa-miR-122, hsa-miR-122*, hsa-miR-1224-3p, hsa-miR-1224-5p, hsa-miR-1225-3p, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1226, hsa-miR-1226*, hsa-miR-1227, hsa-miR-1228, hsa-miR-1228*, hsa- mMiR-1229, hsa-miR-1231, hsa-miR-1233, hsa-miR-1234, hsa-miR- 1236, hsa-miR-1237, hsa-miR-1238, hsa-miR-124, hsa-miR-124*, hsa- MIR-1243, hsa-miR-1244, hsa-miR-1245, hsa-miR-1246, hsa-miR- 1247, hsa-miR-1248, hsa-miR-1249, hsa-miR-1250, hsa-miR-1251, hsa-miR-1252, hsa-miR-1253, hsa-miR-1254, hsa-miR-1255a, hsa- MIiR-1255b, hsa-miR-1256, hsa-miR-1257, hsa-miR-1258, hsa-miR- 1259, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR- 125b-1*, hsa-miR-125b-2*, hsa-miR-126, hsa-miR-126*, hsa-miR- 1260, hsa-miR-1261, hsa-miR-1262, hsa-miR-1263, hsa-miR-1264, hsa-miR-1265, hsa-miR-1266, hsa-miR-1267, hsa-miR-1268, hsa-miR- 1269, hsa-miR-1270, hsa-miR-1271, hsa-miR-1272, hsa-miR-1273, hsa-miR-127-3p, hsa-miR-1274a, hsa-miR-1274b, hsa-miR-1275, hsa- mMiR-127-5p, hsa-miR-1276, hsa-miR-1277, hsa-miR-1278, hsa-miR- 1279, hsa-miR-128, hsa-miR-1280, hsa-miR-1281, hsa-miR-1282, hsa- mMiR-1283, hsa-miR-1284, hsa-miR-1285, hsa-miR-1286, hsa-miR- 1287, hsa-miR-1288, hsa-miR-1289, hsa-miR-129*, hsa-miR-1290, hsa-miR-1291, hsa-miR-1292, hsa-miR-1293, hsa-miR-129-3p, hsa- mMIR-1294, hsa-miR-1295, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-1296, hsa-miR- 1297, hsa-miR-1298, hsa-miR-1299, hsa-miR-1300, hsa-miR-1301, hsa-miR-1302, hsa-miR-1303, hsa-miR-1304, hsa-miR-1305, hsa-miR- 1306, hsa-miR-1307, hsa-miR-1308, hsa-miR-130a, hsa-miR-1302a”, hsa-miR-130b, hsa-miR-130b*, hsa-miR-132, hsa-miR-132"*, hsa-miR- 1321, hsa-miR-1322, hsa-miR-1323, hsa-miR-1324, hsa-miR-133a,

hsa-miR-133b, hsa-miR-134, hsa-miR-135a, hsa-miR-135a"*, hsa-miR- 135b, hsa-miR-135b*, hsa-miR-136, hsa-miR-136*, hsa-miR-137, hsa- miR-138, hsa-miR-138-1*, hsa-miR-138-2*, hsa-miR-139-3p, hsa-miR- 139-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-141, hsa-miR- 141*, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-143, hsa-miR-143”", hsa-miR-144, hsa-miR-144*, hsa-miR-145, hsa-miR-145*, hsa-miR- 146a, hsa-miR-146a*, hsa-miR-146b-3p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR- 147, hsa-miR-147b, hsa-miR-148a, hsa-miR-148a*, hsa-miR-148b, hsa-miR-148b*, hsa-miR-149, hsa-miR-149*, hsa-miR-150, hsa-miR- 150”, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-151-5p, hsa-miR-152, hsa-miR-153, hsa-miR-154, hsa-miR-154"*, hsa-miR-155, hsa-miR-155*, hsa-miR- 15a, hsa-miR-15a*, hsa-miR-15b, hsa-miR-15b*, hsa-miR-16, hsa-miR- 16-1*, hsa-miR-16-2*, hsa-miR-17, hsa-miR-17*, hsa-miR-181a, hsa- mMiR-181a“*, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR- 181c*, hsa-miR-181d, hsa-miR-182, hsa-miR-182*, hsa-miR-1825, hsa-miR-1826, hsa-miR-1827, hsa-miR-183, hsa-miR-183*, hsa-miR- 184, hsa-miR-185, hsa-miR-185*, hsa-miR-186, hsa-miR-186*, hsa- miR-187, hsa-miR-187*, hsa-miR-188-3p, hsa-miR-188-5p, hsa-miR- 18a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-18b, hsa-miR-18b*, hsa-miR-190, hsa- mMiR-190b, hsa-miR-191, hsa-miR-191*, hsa-miR-192, hsa-miR-192”", hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b, hsa-miR-193b”, hsa-miR-194, hsa-miR-194*, hsa-miR-195, hsa-miR-195*, hsa-miR- 196a, hsa-miR-196a*, hsa-miR-196b, hsa-miR-197, hsa-miR-198, hsa- miR-199a-3p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-19a, hsa- mMiR-19a*, hsa-miR-19b, hsa-miR-19b-1*, hsa-miR-19b-2*, hsa-miR- 200a, hsa-miR-200a*, hsa-miR-200b, hsa-miR-200b*, hsa-miR-200c, hsa-miR-200c*, hsa-miR-202, hsa-miR-202*, hsa-miR-203, hsa-miR- 204, hsa-miR-205, hsa-miR-206, hsa-miR-208a, hsa-miR-208b, hsa- mMiR-20a, hsa-miR-20a”*, hsa-miR-20b, hsa-miR-20b*, hsa-miR-21, hsa- MIR-21*, hsa-miR-210, hsa-miR-211, hsa-miR-212, hsa-miR-214, hsa-

MIR-214*, hsa-miR-215, hsa-miR-216a, hsa-miR-216b, hsa-miR-217, hsa-miR-218, hsa-miR-218-1*, hsa-miR-218-2*, hsa-miR-219-1-3p, hsa-miR-219-2-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-22, hsa-miR-22*, hsa- mMiR-220a, hsa-miR-220b, hsa-miR-220c, hsa-miR-221, hsa-miR-221”, hsa-miR-222, hsa-miR-222*, hsa-miR-223, hsa-miR-223*, hsa-miR- 224, hsa-miR-23a, hsa-miR-23a*, hsa-miR-23b, hsa-miR-23b*, hsa- MIR-24, hsa-miR-24-1*, hsa-miR-24-2*, hsa-miR-25, hsa-miR-25“*, hsa- miR-26a, hsa-miR-26a-1*, hsa-miR-26a-2*, hsa-miR-26b, hsa-miR- 26b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-27a*, hsa-miR-27b, hsa-miR-27b*, hsa- miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-296-3p, hsa-miR-296-5p, hsa- miR-297, hsa-miR-298, hsa-miR-299-3p, hsa-miR-299-5p, hsa-miR- 29a, hsa-miR-29a*, hsa-miR-29b, hsa-miR-29b-1*, hsa-miR-29b-2*, hsa-miR-29c, hsa-miR-29c*, hsa-miR-300, hsa-miR-301a, hsa-miR- 301b, hsa-miR-302a, hsa-miR-302a*, hsa-miR-302b, hsa-miR-302b”*, hsa-miR-302c, hsa-miR-302c*, hsa-miR-302d, hsa-miR-302d*, hsa- miR-302e, hsa-miR-302f, hsa-miR-30a, hsa-miR-30a*, hsa-miR-30b, hsa-miR-30b*, hsa-miR-30c, hsa-miR-30c-1*, hsa-miR-30c-2*, hsa- MIR-30d, hsa-miR-30d*, hsa-miR-30e, hsa-miR-30e“, hsa-miR-31, hsa- MIR-31*, hsa-miR-32, hsa-miR-32*, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa- mMiR-320c, hsa-miR-320d, hsa-miR-323-3p, hsa-miR-323-5p, hsa-miR- 324-3p, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-325, hsa-miR-326, hsa-miR-328, hsa-miR-329, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-331-3p, hsa- MIR-331-5p, hsa-miR-335, hsa-miR-335*, hsa-miR-337-3p, hsa-miR- 337-5p, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-339-3p, hsa-miR- 339-5p, hsa-miR-33a, hsa-miR-33a”*, hsa-miR-33b, hsa-miR-33b”, hsa- miR-340, hsa-miR-340*, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR- 345, hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34a*, hsa-miR-34b, hsa- miR-34b*, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-361-3p, hsa- MIR-361-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363, hsa-miR- 363*, hsa-miR-365, hsa-miR-367, hsa-miR-367*, hsa-miR-369-3p, hsa-

MIR-369-5p, hsa-miR-370, hsa-miR-371-3p, hsa-miR-371-5p, hsa-miR- 372, hsa-miR-373, hsa-miR-373*, hsa-miR-374a, hsa-miR-374a*, hsa- mMiR-374b, hsa-miR-374b*, hsa-miR-375, hsa-miR-376a, hsa-miR- 376a*, hsa-miR-376b, hsa-miR-376c, hsa-miR-377, hsa-miR-377*, hsa-miR-378, hsa-miR-378*, hsa-miR-379, hsa-miR-379", hsa-miR- 380, hsa-miR-380*, hsa-miR-381, hsa-miR-382, hsa-miR-383, hsa- mMiR-384, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-409-5p, hsa-miR-410, hsa-miR- 411, hsa-miR-411*, hsa-miR-412, hsa-miR-421, hsa-miR-422a, hsa- mMIR-423-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-424, hsa-miR-424*, hsa-miR- 425, hsa-miR-425*, hsa-miR-429, hsa-miR-431, hsa-miR-431*, hsa- MIR-432, hsa-miR-432*, hsa-miR-433, hsa-miR-448, hsa-miR-449a, hsa-miR-449b, hsa-miR-450a, hsa-miR-450b-3p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-451, hsa-miR452, hsa-miR-452*, hsa-miR-453, hsa-miR-454, hsa-miR-454*, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-483-3p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-484, hsa-miR-485-3p, hsa-miR-485-5p, hsa- MIR-486-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-487a, hsa-miR-487b, hsa-miR- 488, hsa-miR-488*, hsa-miR-489, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-492, hsa-miR-493, hsa- mMIR-493*, hsa-miR-494, hsa-miR-495, hsa-miR-496, hsa-miR-497, hsa-miR-497*, hsa-miR-498, hsa-miR-499-3p, hsa-miR-499-5p, hsa- miR-500, hsa-miR-500*, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-501-5p, hsa-miR- 502-3p, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-503, hsa-miR-504, hsa-miR-505, hsa-miR-505*, hsa-miR-506, hsa-miR-507, hsa-miR-508-3p, hsa-miR- 508-5p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-509-3p, hsa-miR-509-5p, hsa- mIR-510, hsa-miR-511, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-512-5p, hsa-miR- 513a-3p, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-513b, hsa-miR-513c, hsa-miR- 514, hsa-miR-515-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR- 516a-5p, hsa-miR-516b, hsa-miR-517*, hsa-miR-517a, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a-3p, hsa-miR-518a-5p, hsa-miR-518b, hsa-miR-518c, hsa-miR-518c*, hsa-miR-518d-3p, hsa-miR-518d-5p,

hsa-miR-518e, hsa-miR-518e*, hsa-miR-518f, hsa-miR-518f*, hsa-miR- 519a, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-519d, hsa-miR- 519e, hsa-miR-519e*, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR- 520b, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR- 520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-521, hsa- miR-522, hsa-miR-523, hsa-miR-524-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR- 525-3p, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-526b, hsa-miR-526b”*, hsa-miR-532- 3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-539, hsa-miR-541, hsa-miR-541*, hsa- mMIR-542-3p, hsa-miR-542-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-544, hsa-miR- 545, hsa-miR-545*, hsa-miR-548a-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR- 548b-3p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-548c-5p, hsa- miR-548d-3p, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-548e, hsa-miR-548f, hsa- miR-5489g, hsa-miR-548h, hsa-miR-548i, hsa-miR-548], hsa-miR-548KkK, hsa-miR-5481, hsa-miR-548m, hsa-miR-548n, hsa-miR-5480, hsa-miR- 548p, hsa-miR-549, hsa-miR-550, hsa-miR-550*, hsa-miR-551a, hsa- mMiR-551b, hsa-miR-551b*, hsa-miR-552, hsa-miR-553, hsa-miR-554, hsa-miR-555, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-556-5p, hsa-miR-557, hsa- MiR-558, hsa-miR-559, hsa-miR-561, hsa-miR-562, hsa-miR-563, hsa- MIiR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-567, hsa-miR-568, hsa-miR-569, hsa- mMIR-570, hsa-miR-571, hsa-miR-572, hsa-miR-573, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-574-5p, hsa-miR-575, hsa-miR-576-3p, hsa-miR-576-5p, hsa- MIR-577, hsa-miR-578, hsa-miR-579, hsa-miR-580, hsa-miR-581, hsa- miR-582-3p, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-584, hsa-miR- 585, hsa-miR-586, hsa-miR-587, hsa-miR-588, hsa-miR-589, hsa-miR- 589*, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-590-5p, hsa-miR-591, hsa-miR-592, hsa-miR-593, hsa-miR-593*, hsa-miR-595, hsa-miR-596, hsa-miR-597, hsa-miR-598, hsa-miR-599, hsa-miR-600, hsa-miR-601, hsa-miR-602, hsa-miR-603, hsa-miR-604, hsa-miR-605, hsa-miR-606, hsa-miR-607, hsa-miR-608, hsa-miR-609, hsa-miR-610, hsa-miR-611, hsa-miR-612, hsa-miR-613, hsa-miR-614, hsa-miR-615-3p, hsa-miR-615-5p, hsa-

miR-616, hsa-miR-616*, hsa-miR-617, hsa-miR-618, hsa-miR-619, hsa-miR-620, hsa-miR-621, hsa-miR-622, hsa-miR-623, hsa-miR-624, hsa-miR-624*, hsa-miR-625, hsa-miR-625*, hsa-miR-626, hsa-miR- 627, hsa-miR-628-3p, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-629, hsa-miR-629*, hsa-miR-630, hsa-miR-631, hsa-miR-632, hsa-miR-633, hsa-miR-634, hsa-miR-635, hsa-miR-636, hsa-miR-637, hsa-miR-638, hsa-miR-639, hsa-miR-640, hsa-miR-641, hsa-miR-642, hsa-miR-643, hsa-miR-644, hsa-miR-645, hsa-miR-646, hsa-miR-647, hsa-miR-648, hsa-miR-649, hsa-miR-650, hsa-miR-651, hsa-miR-652, hsa-miR-653, hsa-miR-654- 3p, hsa-miR-654-5p, hsa-miR-655, hsa-miR-656, hsa-miR-657, hsa- MiR-658, hsa-miR-659, hsa-miR-660, hsa-miR-661, hsa-miR-662, hsa- MiR-663, hsa-miR-663b, hsa-miR-664, hsa-miR-664*, hsa-miR-665, hsa-miR-668, hsa-miR-671-3p, hsa-miR-671-5p, hsa-miR-675, hsa- mMIR-7, hsa-miR-708, hsa-miR-708*, hsa-miR-7-1*, hsa-miR-7-2*, hsa- mMiR-720, hsa-miR-744, hsa-miR-744*, hsa-miR-758, hsa-miR-760, hsa-miR-765, hsa-miR-766, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-767-5p, hsa- miR-768-3p, hsa-miR-768-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-769-5p, hsa- mMIR-770-5p, hsa-miR-802, hsa-miR-873, hsa-miR-874, hsa-miR-875- 3p, hsa-miR-875-5p, hsa-miR-876-3p, hsa-miR-876-5p, hsa-miR-877, hsa-miR-877*, hsa-miR-885-3p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-886-5p, hsa-miR-887, hsa-miR-888, hsa-miR-888*, hsa-miR- 889, hsa-miR-890, hsa-miR-891a, hsa-miR-891b, hsa-miR-892a, hsa- mMiR-892b, hsa-miR-9, hsa-miR-9*, hsa-miR-920, hsa-miR-921, hsa- miR-922, hsa-miR-923, hsa-miR-924, hsa-miR-92a, hsa-miR-92a-1*, hsa-miR-92a-2*, hsa-miR-92b, hsa-miR-92b*, hsa-miR-93, hsa-miR- 93*, hsa-miR-933, hsa-miR-934, hsa-miR-935, hsa-miR-936, hsa-miR- 937, hsa-miR-938, hsa-miR-939, hsa-miR-940, hsa-miR-941, hsa-miR- 942, hsa-miR-943, hsa-miR-944, hsa-miR-95, hsa-miR-96, hsa-miR- 96*, hsa-miR-98, hsa-miR-99a, hsa-miR-99a*, hsa-miR-99b, e hsa- miR-99b*.

[00054] Em algumas modalidades, um ou mais sítios de ligação de um constructo conforme descrito pela presente invenção (por exemplo, ácido nucleico recombinante, vetor de AAV, rAAV, etc.) des-direciona a expressão do transgene de uma célula do sistema imune (por exem- plo, uma célula apresentadora de antígeno (APC)). Em algumas moda- lidades, um mIiRNA que des-direciona a expressão do transgene de uma célula imune (por exemplo, uma célula apresentadora de antíge- no) é referido como um mIiRNA imuno-associado.

Em algumas modali- dades, um miRNA imuno-associado é um mMiRNA expresso em células imunes que apresenta no mínimo um nível de expressão 2 vezes, 3 Vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes maior em uma célula imune comparada com uma célula não-imune (por exemplo, uma célula de controle, tal como uma célula HeLa, uma célula HEK293, uma célula mesenquimal, etc.). Em algumas modali- dades, a célula do sistema imune (célula imune) na qual o miRNA imuno-associado é expresso é uma célula B, uma célula T, uma célula T killer, uma célula T helper, uma célula T yó, uma célula dendrítica, um macrófago, um monócito, uma célula endotelial vascular. ou outra célula imune.

Em algumas modalidades, a célula do sistema imune é uma célula B expressando um ou mais dos seguintes marcadores: B220 , BLAST-2 (EBVCS), Bu-1, CD19, CD20 (L26), CD22, CD24, CD27, CD57, CD72, CD79a, CD79b, CD86, chB6, D8/17, FMC7, L26, M17, MUM-1, Pax-5 (BSAP), e PC47H.

Em algumas modalidades, a célula do sistema imune é uma célula T expressando um ou mais dos seguintes marcadores: ART2, CD1a, CD1d, CD11b (Mac-1), CD134 (OX40), CD150, CD2, CD25 (receptor alfa da interleucina 2), CD3, CD38, CD4, CD45RO, CD5, CD7, CD72, CD8, CRTAM, FOXP3, FT2, GPCA, HLA-DR, HML-1, HT23A, Leu-22, Ly-2, Ly-m22, MICG, MRC OX 8, MRC OX-22, OX40, PD-1 (Morte programada -1), RT6, TOR (re- ceptor de células T), Thy-1 (CD90), e TSA-2 (Ag-2 compartilhado tími-

co). Em algumas modalidades, um miRNA imuno-associado é selecio- nado entre: miR-15a, miR-16-1, miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19b- 1, miR-20a, miR-21, miR-29a/b/c, miR-30b, miR-31, miR-34a, miR- 92a-1, miR-106a, miR-125a/b, miR-142-3p, miR-146a, miR-150, miR- 155, miR-181a, miR-223 e mIR-424, miR-221, miR-222, let-7i, miR- 148, e miR-152. Vetores de AAV Recombinantes (Vetores de rAAV)

[00055] Os "Vetores de AAV recombinante (rAAV)" da presente in- venção são tipicamente compostos de, no mínimo, um transgene e suas sequências reguladoras, e repetições de terminal invertido 5' e 3' (ITRs) de AAV. É este vetor de AAV recombinante que é embalado dentro de uma proteína do capsídeo e liberado para uma célula alvo selecionada. Em algumas modalidades, o transgene é uma sequência de ácido nucleico, heteróloga às sequências vetoriais, a qual codifica um polipeptídeo, proteína, molécula de RNA funcional (por exemplo, gRNA) ou outro produto genético, de interesse. A sequência codifican- te de ácido nucleico é ligada operacionalmente a componentes regula- dores em uma maneira a qual permite a transcrição, translação, e/ou expressão do transgene em uma célula de um tecido-alvo.

[00056] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a um vetor de AAV recombinante (rAAV) compreendendo uma sequên- cia de ácido nucleico incluindo um promotor ligado operacionalmente a um transgene, em que o transgene codifica uma proteína MeCP2 (por exemplo, MeCP?2 isoforma e1). Em algumas modalidades, um vetor de rAAV adicionalmente compreende sequências de ácido nucleico codi- ficando uma ou mais sequências de repetição de terminal invertido (ITRs) de AAV, por exemplo, ITRs de AAV2. Em algumas modalida- des, um vetor de rAAV adicionalmente compreende sequências de ácido nucleico codificando uma ou mais ITRs de AAV selecionados en- tre o grupo que consiste em AAV3, AAVA4, AAVS5, e AAV6. Em algumas modalidades, ITRs são sequências artificiais que substituem a função de ITR, por exemplo, conforme revelado em WO/2016/172008.

[00057] As sequências de AAV do vetor tipicamente compreendem as sequências de repetição de terminal invertido 5' e 3' de ação cis (Vide, por exemplo, B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)). As sequências de ITR têm cerca de 145 bp de comprimento. De modo preferencial, substancial- mente as sequências inteiras codificando as ITRs são usadas na mo- lécula, embora seja permissível algum grau de modificação menor des- tas sequências. A capacidade de modificar estas sequências de ITR está dentro do conhecimento da técnica. (Vide, por exemplo, textos tais como Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); e K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)). Um exemplo de uma molécula seme- lhante empregada na presente invenção é um plasmídeo "de ação cis- " contendo o transgene, no qual a sequência do transgene selecionado e elementos reguladores associados são flanqueados pelas sequên- cias de ITR 5' e 3' de AAV. As sequências de ITR de AAV podem ser obtidas a partir de qualquer AAV conhecido, incluindo os tipos de AAV de mamífero presentemente identificados (por exemplo, sequências de ITR de AAV2, de AAV3, de AAVA, de AAVS5, ou de AAV6).

[00058] Além dos principais elementos identificados acima para o vetor de AAV recombinante, o vetor também inclui elementos de con- trole necessários, os quais são ligados operacionalmente ao transgene em uma maneira a qual permite sua transcrição, translação e/ou ex- pressão em uma célula transfectada com o vetor de plasmídeo ou in- fectada com o vírus produzido pela presente invenção. Conforme usa- do aqui, neste requerimento de patente, sequências "ligadas operacio- nalmente" incluem tanto sequências de controle de expressão que são contíguas com o gene de interesse e sequências de controle de ex-

pressão que agem em trans ou em uma distância para controlar o ge- ne de interesse.

[00059] As sequências de controle de expressão incluem sequên- cias apropriadas de iniciação de transcrição, terminação, de promotor e de reforçador; sinais de processamento de RNA eficientes tais como sinais de emenda e de poliadenilação (polyA); sequências que estabi- lizam o mMRNA citoplasmático; sequências que reforçam a eficiência da translação (isto é, sequência de consenso de Kozak); sequências que reforçam a estabilidad das proteínas; e quando desejado, sequências que reforçam a secreção do produto codificado. Um grande número de sequências de controle de expressão, incluindo promotores os quais são nativos, constitutivos, indutíveis e/ou teciduais específicos, são conhecidas na técnica e podem ser utilizadas.

[00060] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, diz- se que uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, sequência se- quência codificante) e sequências reguladoras são ligadas "operacio- nalmente" quando são ligadas de modo covalente de tal modo a colo- car a expressão ou transcrição da sequência de ácido nucleico sob a influência ou o controle das sequências reguladoras. Se for desejado que as sequências de ácido nucleico sejam traduzidas em uma proteí- na funcional, diz-se que duas sequências de DNA são ligadas operaci- onalmente se a indução de um promotor nas sequências reguladoras 5' resultar na transcrição da sequência codificante e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA (1) não resultar na introdu- ção de uma mutação de frame-shift (), (2) não interferir com a capaci- dade da região de promotor para direcionar a transcrição das sequên- cias codificantes, ou (3) não interferir com a capacidade do transcripto de RNA correspondente para ser traduzido em uma proteína. Deste modo, uma região de promotor vai ser ligada operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico se a região de promotor for capaz de efe-

tuar a transcrição daquela sequência de DNA de tal modo que o trans- cripto resultante possa ser traduzido na proteína desejada ou no poli- peptídeo desejado. De modo similar, duas ou mais regiões codifican- tes são ligadas operacionalmente quando são ligadas de tal modo que sua transcrição a partir de um promotor comum resulte na expressão de duas ou mais proteínas tendo sido traduzidas in frame. Em algumas modalidades, sequências codificantes ligadas operacionalmente pro- duzem uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, sequências codificantes ligadas operacionalmente produzem um RNA funcional (por exemplo, gRNA, miRNA).

[00061] Para ácidos nucleicos codificando proteínas, uma sequên- cia de poliadenilação geralmente é inserida depois das sequências de transgene e antes da sequência de ITR 3' de AAV. Um constructo de rAAV útil na presente invenção também pode conter um íntron, de ma- neira desejável localizado entre a sequência de promotor / reforçador e o transgene. Uma sequência de íntron possível é derivada de SV-40, e é referida como a sequência de íntron de SV-40 T. Outro elemento ve- torial que pode ser usado é um sítio de entrada do ribossoma interno (IRES). Uma sequência de IRES é usada para produzir mais de um polipeptídeo a partir de um único transcripto genético. Uma sequência de IRES vai ser usada para produzir uma proteína que contém mais de uma cadeia de polipeptídeo. A seleção destes e/ou de outros elemen- tos vetoriais pode ser realizada, conforme apropriado, e estão disponí- veis muitas sequências semelhates [vide, por exemplo, Sambrook et al., e referências citadas no mesmo, por exemplo, às páginas 3.18

3.26 e 16.17 16.27 e Ausubel et a/., Current Protocols in Molecular Bio- logy, John Wiley & Sons, New York, 1989]. Em algumas modalidades, uma sequência do vírus da febre aftosa 2A é incluída em poliproteína; esta é um peptídeo pequeno (de aproximadamente 18 aminoácidos de comprimento) que foi demonstrado que media a clivagem de poliprote-

ínas (Ryan, M D et a/., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, NM et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene The- rapy, 2001; 8: 864-873; e Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). A atividade de clivagem da sequência 2A foi demonstrada previamente em sistemas artificiais incluindo plasmídeos e vetores de terapia genética (AAV e retrovírus) (Ryan, M D et a/., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et a/., J Virology, November 1996; p. 8124- 8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; e Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene The- rapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al, Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.; e Klump, H et a/., Gene Therapy, 2001; 8: 811- 817).

[00062] A natureza precisa das sequências reguladoras necessá- rias para expressão genética em células hospedeiras pode variar entre as espécies, os tecidos ou os tipos celulares, mas em geral vai incluir, conforme necessário, sequências 5' não transcritas e 5' não traduzidas envolvidas com a iniciação da transcrição e da translação respectiva- mente, tais como uma TATA box, sequência de capeamento (capping), sequência CAAT, elementos reforçadores, e semelhantes. Especial- mente, tais como sequências reguladoras 5' não transcritas vão incluir uma região de promotor que inclui uma sequência de promotor para controle transcricional do gene unido operacionalmente. Sequências reguladoras também podem incluir sequências de reforçador ou se- quências ativadoras a montante conforme desejado. Os vetores da presente invenção podem incluir opcionalmente sequências 5' lider ou de sinal. A escolha e o desenho de um vetor apropriado está dentro da capacidade e critério de uma pessoa versada na técnica.

[00063] “Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limita- ção, o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV) (opcionalmente com o reforçador do RSV), o promotor do citomegalo-

vírus (CMV) (opcionalmente com o reforçador do CMV) [vide, por exemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985), o promotoro do SVA40, o promotor da di-hidrofolato redutase, o promotor da B-actina, o promotor da fosfoglicerol quinase (PGK), e o promotor EF1a [Invitro- gen]. Em algumas modalidades, um promotor é um promotor de B- actina de galinha reforçado.

[00064] Os promotores indutíveis permitem a regulação da expres- são genética e podem ser regulados por compostos supridos exoge- namente, por fatores ambientais tais como a temperatura, ou pela pre- sença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação da célula em particular, ou em células em replicação somente. Promotores indutíveis e sistemas indutíveis estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo, sem limitação, Invitrogen, Clontech e Ariad. Muitos outros sistemas têm sido descritos e podem ser prontamente selecionados por um peri- to na técnica. Exemplos de promotores indutíveis regulados por pro- motores supridos exogenamente incluem o promotor de metalotionina (MT) do carneiro indutível por zinco, o promotor do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV) indutível por dexametasona (Dex), o sistema promotor da T7 polimerase (WO 98/10088); o promotor dos insetos de ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346- 3351 (1996)), o sistema repressível por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), o sistema indutível por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), vide também Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), o sistema indutível por RU486 (Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) e Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) e o sistema indu- tível por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Ainda outros tipos de promotores indutíveis os quais podem ser úteis neste contexto são os promotores os quais são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase agu- da, um estado de diferenciação da célula em particular, ou em células em replicação somente.

[00065] Em outra modalidade, vai ser usado o promotor nativo para o transgene. O promotor nativo pode ser preferencial quando se dese- ja que a expressão do transgene deve simular a expressão nativa. O promotor nativo pode ser usado quando a expressão do transgene de- ve ser regulada temporalmente ou desenvolvimentalmente, ou em uma maneira tecidual-específica, ou em resposta a estímulos transcricio- nais específicos. Por exemplo, em algumas modalidades, um promotor nativo é um promotor de MeCP2, tal como um promotor de MeCP2 de camundongo. Em algumas modalidades, um promotor de MeCP2 de camundongo é representada por uma sequência estipulada na SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade adicional, também podem ser usados ou- tros elementos de controle de expressão nativos, tais como elementos reforçadores, sítios de poliadenilação ou sequências de consenso de Kozak para simular a expressão nativa.

[00066] Em algumas modalidades, as sequências reguladoras con- ferem capacidades de expressão genética específica para o tecido. Em alguns casos, as sequências reguladoras específicas para o tecido se ligam a fatores de transcrição específicos para o tecido que indu- zem transcrição em uma maneira específica para o tecido. As sequên- cias reguladoras específicas para o tecido referidas (por exemplo, promotores, reforçadores, etc.) são de conhecimento geral na técnica. Exemplos de sequências reguladoras específicas para o tecido inclu- em, mas não estão limitadas aos seguintes promotores específicos pa- ra o tecido: um promotor de retinosquisina específico do olho ou pro- motor K12, um promotor de globulina de ligação a tiroxina (TBG) es- pecífico para o fígado, um promotor de insulina, um promotor de glu- cagon, um promotor de somatostatina, um promotor de polipeptídeo pancreático (PPY), um promotor de sinapsina-1 (Syn), um promotor de creatina quinase (MCK), um promotor de desmina de mamífero (DES), um promotor da cadeia pesada de a-miosina (a-MHC) promotor, ou um promotor de Troponina T cardíaca (cTnT). Outros promotores de exemplo incluem o promotor de Beta-actina, o promotor do núcleo do vírus da hepatite B, Sandig et a/., Gene Ther., 3:1002-9 (1996); o pro- motor de alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et a/., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), o promotor de osteocalcina óssea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); o promotor de sialoproteína óssea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), o promotor CD2 (Hansal et al/., J. Inmunol., 161:1063-8 (1998); o promotor de imuno- globulina de cadeia pesada; promotor de cadeia a de receptores de células T, promotor neuronal tal como o promotor de enolase específi- ca dos neurônios (NSE) (Andersen et a/., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503- (1993)), promotor de gene de cadeia leve de neurofilamento (Pic- cioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), e o promotor do gene vgf específico dos neurônios (Piccioli et al., Neuron, 15:373- 84 (1995)), entre outros, os quais serão evidentes para o especialista na técnica.

[00067] Em algumas modalidades, um ou mais sítios de ligação pa- ra um ou mais dos miRNAs são incorporados em um transgene de um vetor de rAAV, para inibir a expressão do transgene em um ou mais tecidos de um sujeito portando o transgene. O especialista na técnica vai reconhecer que podem ser selecionados sítios de ligação para con- trolar a expressão de um transgene em uma maneira específica para o tecido. Por exemplo, sítios de ligação para o miR-122 específico para o fígado podem ser incorporados em um transgene para inibir a ex- pressão daquele transgene no fígado. Os sítios alvo no MRNA podem estar na UTR 5', na UTR 3' ou na região codificante. Tipicamente, o sítio-alvo está na UTR 3' do MRNA. Além disso, o transgene pode ser projetado de tal modo que múltiplos miRNAs regulem o mRNA reco- nhecendo os mesmos sítios ou múltiplos sítios. A presença de múlti- plos sítios de ligação ao miRNA pode resultar na ação cooperativa de múltiplos RISCs e proporcionar inibição altamente eficiente da expres- são. A sequência de sítio-alvo pode compreender um total de 5 a 100, a 60, ou mais nucleotídeos. A sequência de sítio-alvo pode com- preender no mínimo 5 nucleotídeos da sequência de um sítio de liga- ção ao gene-alvo. Vírus adenoassociados recombinantes (rAAVs)

[00068] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se AAVs isolados. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, com respeito a AAVs, o termo "isolado" se refere a um AAV que tenha sido artificialmente produzido ou obtido. AAVs isolados podem ser produzi- dos usando métodos recombinantes. Os citados AAVs são referidos aqui, neste requerimento de patente, como "AAVs recombinantes". AAVs recombinantes (rAAVs) de modo preferencial têm capacidades de direcionamento específico para o tecido, de tal modo que uma nu- clease e/ou um transgene do rAAV venha a ser liberado especifica- mente para um ou mais tecidos predeterminados. O capsídeo de AAV é um elemento importante na determinação destas capacidades de di- recionamento específico para o tecido. Deste modo, pode ser selecio- nado um rAAV tendo um capsídeo apropriado para o tecido sendo vi- sado.

[00069] Métodos para a obtenção de AAVs recombinantes tendo uma proteína do capsídeo desejada são de conhecimento geral na técnica. (Vide, por exemplo, a patente US No. 2003/0138772), cujo conteúdo é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade). Tipicamente os métodos envolvem cultivar uma célula hospedeira a qual contém uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína do capsídeo do AAV; um gene rep funcional; um vetor de AAV recombinante composto de, repetições de terminal invertido (ITRs) de AAV e um transgene; e suficientes funções auxiliares para permitir embalar o vetor de AAV recombinante dentro das proteínas do capsídeo de AAV. Em algumas modalidades, proteí- nas do capsídeo são proteínas estruturais codificadas pelo gene cap de um AAV. AAVs compreendem três proteínas do capsídeo, proteí- nas de vírion 1 a 3 (a saber VP1, VP2 e VP3), todas as quais são transcritas a partir de um único gene cap através de emenda alternati- va. Em algumas modalidades, os pesos moleculares de VP1, VP2 e VP3 são respectivamente de cerca de 87 kDa, cerca de 72 kDa e cer- ca de 62 kDa. Em algumas modalidades, depois de translação, as pro- teínas do capsídeo formam uma concha de proteína esférica de 60- meros em torno do genoma viral. Em algumas modalidades, as fun- ções das proteínas do capsídeo são proteger o genoma viral, liberar o genoma e interagir com o hospedeiro. Em alguns aspectos, as proteí- nas do capsídeo liberam o genoma viral para um hospedeiro em uma maneira específica do tecido.

[00070] Em algumas modalidades, um rAAV descrito pela presente invenção compreende um ou mais proteínas do capsídeo capazes de cruzar a barreira hematoencefálica. Em algumas modalidades, a no mínimo uma proteína do capsídeo tem um sorotipo selecionado entre o grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV2i8, AAV2.5, AAV6, AAVB8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAV-B1, AAV9.45A-String (por exemplo, AAV9.45-AS), AAV9.45Angiopep, AAV9.47-Angiopep, e AAV9.47-AS. Em algumas modalidades, a no mínimo uma proteína do capsídeo tem um sorotipo AAV-PHP.B, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. No. 9.585.971. Em algumas modalidades, uma proteína do capsí- deo tem um sorotipo conforme descrito em WO2015/127128. WO2016/ 054554, WO2016/054557, ou WO2016/065001.

[00071] Os componentes a serem cultivados na célula hospedeira para embalar um vetor de rAAV em um capsídeo de AAV podem ser proporcionados para a célula hospedeira em trans. Alternativamente, qualquer um ou mais dos componentes requeridos (por exemplo, vetor de AAV recombinante, sequências rep, sequências cap, e/ou funções auxiliares) podem ser proporcionados por uma célula hospedeira está- vel a qual tenha sido manipulada para conter um ou mais dos compo- nentes requeridos usando métodos de conhecimento geral dos versa- dos na técnica. Mais convenientemente, uma célula hospedeira está- vel semelhante vai conter o um ou mais componentes requeridos sob o controle de um promotor indutível. No entanto, o um ou mais compo- nentes requeridos podem estar sob o controle de um promotor consti- tutivo. Exemplos de promotor induíveis e constitutivos adequados são proporcionados aqui, neste requerimento de patente, na discussão de elementos reguladores adequados para uso com o transgene. Em ain- da outra alternativa, uma célula hospedeira estável selecionada pode conter um ou mais componentes selecionados sob o controle de um promotor constitutivo e um ou mais componentes selecionados sob o controle de um ou mais promotores indutíveis. Por exemplo, uma célu- la hospedeira estável pode ser gerada, a qual é derivada a partir de células 293 (as quais contêm funções auxiliares E1 sob o controle de um promotor constitutivo), mas as quais contêm as proteínas rep e/ou cap sob o controle de promotores indutíveis. Ainda outras células hos- pedeiras estáveis podem ser geradas por um perito na técnica.

[00072] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira contendo um ácido nucleico que compreende uma sequência codificante codificando uma proteína (por exemplo, uma proteína MeCP2, tal como MeCP?2 isoforma e1). Em algumas mo- dalidades, a presente invenção se refere a uma composição compre- endendo a célula hospedeira descrita acima. Em algumas modalida- des, a composição compreendendo a célula hospedeira acima adicio-

nalmente compreende um criopreservante.

[00073] O vetor de AAV recombinante, sequências de rep, sequên- cias de cap, e funções helper requeridas para produção do rAAV da presente invenção podem ser liberados para a célula hospedeira de embalagem usando qualquer elemento genético apropriado (vetor). O elemento genético selecionado pode ser liberado por qualquer método adequado, incluindo os descritos aqui, neste requerimento de patente. Os métodos usados para construir qualquer modalidade da presente invenção são conhecidos dos peritos em manipulação de ácidos nu- cléicos e incluem engenharia genética, engenharia recombinante, e técnicas sintéticas. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. De modo similar, métodos de produção de vírions de rA- AV são de conhecimento geral e a seleção de um método adequado não é uma limitação da presente invenção. Vide, por exemplo, K. Fis- her et al., J. Virol., 70:520-532 (1993) e a Patente U.S. No. 5.478.745.

[00074] Em algumas modalidades, AAVs recombinantes podem ser produzidos usando o método de tripla transfecção (descrito em deta- lhes na Pat. U.S. No. 6.001.650). Tipicamente, os AAVs recombinan- tes são produzidos por transfecção de uma célula hospedeira com um vetor de AAV recombinante (compreendendo um transgene) a ser em- balado dentro de partículas de AAV, um vetor de função helper de AAV, e um vetor de função acessória. Um vetor de função helper de AAV codifica as sequências de "função helper de AAV" (isto é, rep e cap), as quais funcionam em trans para replicação e encapsidação de AAV produtivas. De modo preferencial, o vetor de função helper de AAV suporta eficiente produção do vetor de AAV sem gerar quaisquer vírions de AAV detectáveis (isto é, vírions de AAV contendo genes funcionais rep e cap). Exemplos não limitantes de vetores adequados para uso com a presente invenção incluem pHLP19, descrito na Pat.

U.S. No. 6.001.650 e o vetor pRep6cap6, descrito na Pat. U.S. No.

6.156.303, cuja totalidade das mesmas são incorporadas por meio de referência aqui, a este requerimento de patente. O vetor de função acessória codifica sequências de nucleotideos para funções virais e/ou celulares não derivadas de AAV, das quais o AAV é dependente para replicação (isto é, "funções acessórias"). As funções acessórias inclu- em as funções requeridas para replicação do AAV, incluindo, sem limi- tação, as porções envolvidas na ativação de transcrição genética de AAV, emenda de mMRNA de AAV estágio-específica, replicação de DNA de AAV, síntese de produtos de expressão de cap, e montagem de capsídeo de AAV. Funções acessórias baseadas em vírus podem ser derivadas de quaisquer dos vírus auxiliares conhecidos tais como adenovírus, herpes vírus (diferentes do vírus herpes simplex tipo-1), e vírus vaccinia.

[00075] Em alguns aspectos, a presente descrição refere-se células hospedeiras transfectadas. O termo "transfecção" é usado para se re- ferir à captação de DNA estranho por uma célula, e uma célula foi "transfectada" quando DNA exógeno tiver sido introduzido dentro da membrana celular. Uma série de técnicas de transfecção são conheci- das de modo geral na técnica. Vide, por exemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laborato- ry manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, e Chu et al. (1981) Gene 13:197. As técnicas referidas podem ser usadas para in- troduzir um ou mais ácidos nucleicos exógenos, tal como um vetor de integração de nucleotídeo e outras moléculas de ácido nucleico, dentro de células hospedeiras adequadas.

[00076] Uma "célula hospedeira" se refere a qualquer célula que porte, ou seja capaz de portar, uma substância de interesse. Frequen- temente, uma célula hospedeira é uma célula de mamífero. Uma célu-

la hospedeira pode ser usada como um receptor de um constructo au- xiliar de AAV, um plasmídeo de minigene de AAV, um vetor de função acessória, ou outro DNA de transferência associado com a produção de AAVs recombinantes. O termo inclui a progênie da célula original a qual foi transfectada. Deste modo, uma "célula hospedeira" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, pode se referir a uma célu- la a qual tenha sido transfectada com uma sequência de DNA exóge- na. Deve ser entendido que a progênie de uma única célula parental pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total à matriz original, devi- do a mutação natural, acidental, ou deliberada.

[00077] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "linhagem celular" se refere a uma população de células capa- zes de crescimento contínuo ou prolongado e divisão in vitro. Frequen- temente, as linhagens celulares são populações clonais derivadas a partir de uma única célula progenitora. Além disso é de conhecimento geral na técnica que podem ocorrer alterações espontâneas ou induzi- das no cariótipo durante armazenamento ou transferência de seme- lhantes populações clonais. Portanto, as células derivadas da linha- gem celular referida podem não ser precisamente idênticas às células ou culturas ancestrais, e a linhagem celular referida inclui as variantes referidas.

[00078] “Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "célula recombinante" se refere a uma célula dentro da qual foi introduzido um segmento de DNA exógeno, tal como um segmento de DNA que leve à transcrição de um polipeptídeo biologicamente ativo ou à produção de um ácido nucleico biologicamente ativo tal como um RNA.

[00079] “Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "vetor" inclui qualquer elemento genético, tal como um plasmí-

deo, fago, transposon, cosmídeo, cromossoma, cromossoma artificial, vírus, vírion, etc., o qual é capaz de replicação quando associado com os elementos de controle apropriados e o qual pode transferir sequên- cias genéticas entre as células. Deste modo, o termo inclui veículos de clonagem e de expressão, bem como vetores virais. Em algumas mo- dalidades, vetores úteis são contemplados como sendo os vetores nos quais o segmento de ácido nucleico a ser transcrito é posicionado sob o controle transcricional de um promotor. Um "promotor" se refere a uma sequência de DNA reconhecida pelo mecanismo sintético da cé- lula, ou introduzida por mecanismo sintético, requerida para iniciar a transcrição específica de um gene. A expressão "posicionado operati- vamente," "sob controle" ou "sob controle transcricional " signfica que o promotor está na localização e na orientação corretas em relação ao ácido nucleico para controlar a iniciação da RNA polimerase e a ex- pressão do gene. O termo "vetor ou constructo de expressão" significa qualquer tipo de constructo genético contendo um ácido nucleico no qual parte ou toda a sequência codificante de ácido nucleico é capaz de ser transcrita. Em algumas modalidades, expressão inclui transcri- ção do ácido nucleico, por exemplo, para gerar um produto polipeptídi- co biologicamente ativo ou RNA funcional (por exemplo, RNA guia) a partir de um gene transcrito.

[00080] Os métodos precedentes para embalar os vetores recombi- nantes nos capsídeos de AAV desejados para produzir os rAÃAVs da presente invenção não se destinam a ser limitantes e outros métodos adequados serão evidentes para o especialista na técnica. Métodos de Administração

[00081] As composições descritas pela presente invenção (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes, rAAVs, composições farma- cêuticas, etc.) podem ser liberadas para um sujeito de acordo com quaisquer métodos apropriados conhecidos na técnica. As composi-

ções (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes, rAAVs, composi- ções farmacêuticas, etc.), de modo preferencial em suspensão em um veículo fisiologicamente compatível (isto é, em uma composição), po- dem ser administradas a um sujeito, isto é, animal hospedeiro, tal co- mo um ser humano, um camundongo, um rato, um gato, um cão, um carneiro, um coelho, um cavalo, uma vaca, uma cabra, um porco, um porquinho-da-índia, um hamster, uma galinha, um peru, ou um primata não humano (por exemplo, Macaque). Em algumas modalidades, um animal hospedeiro não inclui um ser humano. Em algumas modalida- des, um sujeito é um ser humano. Em algumas modalidades, um sujei- to tem menos de um ano de idade, por exemplo, 1, 2, 3,4, 5,6,7,8,9, 10, ou 11 meses de idade.

[00082] A liberação das composições para um sujeito mamífero po- de ser, por exemplo, por injeção sistêmica (por exemplo, injeção intra- venosa) ou por injeção intratecal. Também podem ser usados métodos adicionais de administração das composições ao sistema nervoso cen- tral de um sujeito, por exemplo, injeção intracraniana, injeção intra- estriatal, etc. Além disso, podem ser usadas combinações de métodos de administração (por exemplo, administração tópica e injeção intra- estromal).

[00083] Em algumas modalidades, as composições da presente in- venção podem compreender um rAAV isolado, ou in combination com um ou mais outros vírus (por exemplo, um segundo rAAV codificante tendo um ou mais transgenes diferentes). Em algumas modalidades, uma composição compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais rA- AVs diferentes, cada um tendo um ou mais transgenes diferentes.

[00084] Em algumas modalidades, uma composição adicionalmente compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos ade- quados podem ser prontamente selecionados por um perito na técnica em vista da indicação para a qual a composição é direcionada. Por exemplo, um veículo adequado inclui salina, a qual pode ser formulada com uma variedade de soluções de tamponamento (por exemplo, sali- na tamponada com fosfato). Outros veículos de exemplo incluem sali- na estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, óleo de amendoim, óleo de gergelim, e água. A seleção do ve- ículo não é uma limitação da presente invenção.

[00085] — Opcionalmente, as composições da presente invenção po- dem conter, além do ácido nucleico recombinante ou rAAV e um ou mais veículos, outros ingredientes farmacêuticos, tais como preservan- tes, ou estabilizantes químicos. Preservantes de exemplo adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, propil galato, os parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, e pa- raclorofenol. Estabilizantes químicos adequados incluem gelatina e al- bumina.

[00086] As composições são administradas em quantidades sufici- entes para transfectar as células de um tecido desejado (por exemplo, tecido do sistema nervoso central) e para proporcionar níveis suficien- tes de transferência e expressão genética sem efeitos adversos inde- vidos. Exemplos de vias de administração farmaceuticamente aceitá- veis incluem, mas não estão limitados a, liberação direta para o órgão selecionado (por exemplo, liberação intra-estromal para o olho), oral, inhalação (incluindo liberação intranasal e intratraqueal), intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intratumoral, e outas vias de administração parental. As vias de administração podem ser combinadas, caso desejado.

[00087] A dose de vírions de rAAV requerida para obter um "efeito terapêutico" em particular, por exemplo, as unidades de dose em có- pias de genoma / por quilograma de peso corporal (GC/Kkg), vai variar com base em vários fatores incluindo, mas não limitados: à via de ad- ministração dos vírions de rAAV, do nível de expressão genética ou de

RNA requerido para obter um efeito terapêutico, da doença ou do dis- túrbio especifico que estiver sendo tratado, e da estabilidade do produ- to genético ou de RNA. Um perito na técnica pode prontamente deter- minar uma faixa de dose de vírions de rAAV para tratar um paciente tendo uma doença ou um distúrbio em particular com base nos fatores acima mencionados, bem como em outros fatores.

[00088] “Uma quantidade eficaz da composição (por exemplo, ácido nucleico recombinante, rAAV, composição farmacêutica, etc.) é uma quantidade suficiente para visar infectar um animal, visar um tecido desejado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um rAAV é uma quantidade suficiente para produzir um modelo animal transgênico somático estável. A quantidade eficaz vai depender es- sencialmente de fatores tais como a espécie, a idade, o peso, a saúde do sujeito, e o tecido a ser visado, e, portanto, pode variar entre animal e tecido. Por exemplo, uma quantidade eficaz do rAAV geralmente es- tá em uma faixa de a partir de cerca de 1 ml a cerca de 100 ml de so- lução contendo a partir de cerca de 10º a 10º cópias de genoma. Em alguns casos, é apropriada uma dosagem entre cerca de 10** a 10"? rAAV cópias de genoma. Em determinadas modalidades, 10ºº ou 10"! rAAV cópias de genoma é uma dosagem eficaz para visar o tecido do sistema nervoso central (por exemplo, o tecido da córnea). Em alguns casos, animais transgênicos estáveis são produzidos por múltiplas do- ses de um rÃAV.

[00089] Em algumas modalidades, uma dose da composição é ad- ministrada a um sujeito não mais de uma vez por dia do calendário (por exemplo, um período de 24 horas). Em algumas modalidades, uma dose da composição é administrada a um sujeito não mais de uma vez por 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 dias do calendário. Em algumas modali- dades, uma dose da composição é administrada a um sujeito não mais de uma vez por semana do calendário (por exemplo, 7 dias do calen-

dário). Em algumas modalidades, uma dose da composição é adminis- trada a um sujeito não mais do que bi-semanalmente (por exemplo, uma vez em um período de duas semanas do calendário). Em algu- mas modalidades, uma dose da composição é administrada a um su- jeito não mais de uma vez por mês do calendário (por exemplo, uma vez em 30 dias do calendário). Em algumas modalidades, uma dose da composição é administrada a um sujeito não mais de uma vez por seis meses do calendário. Em algumas modalidades, uma dose da composição é administrada a um sujeito não mais de uma vez por ano do calendário (por exemplo, 365 dias ou 366 dias em um ano bissex- to).

[00090] Em algumas modalidades, as composições são formuladas para reduzir a agregação de partículas de AAV na composição, parti- cularmente onde estão presentes altas concentrações de rAAV (por exemplo, -10º? GC/ml ou mais). Podem ser usados métodos apropria- dos para reduzir a agregação de partículas, incluindo, por exemplo, adição de surfactantes, ajuste do pH, ajuste da concentração saltina, etc. (Vide, por exemplo, Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178, cujo conteúdo é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.)

[00091] A formulação de excipientes e soluções de veículos farma- ceuticamente aceitáveis é de conhecimento geral dos peritos na técni- ca, assim como o desenvolvimento de dosagens e regimes de trata- mento adequados para o uso das composições particulares descritas aqui, neste requerimento de patente, em uma variedade de regimes de tratamento. Tipicamente, estas formulações podem conter no mínimo cerca de 0,1% do composto ativo ou mais, embora a percentagem do(s) ingrediente(s) ativo(s), logicamente, possa ser variada e possa ser convenientemente entre cerca de 1 ou 2% e cerca de 70% ou 80% ou mais do peso ou volume da formulação total. Naturalmente, a quan-

tidade de composto ativo em cada composição terapeuticamente útil pode ser preparada em um modo tal que venha a ser obtida uma do- sagem adequada em qualquer dada unidade de dose do composto. Fatores tais como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, prozao de validade do produto, bem como outras considerações farmacológicas serão contemplados por um perito na técnica de preparar as formulações farmacêuticas referidas, e deste modo, pode ser desejável uma variedade de dosagens e regimes de tratamento.

[00092] Em algumas modalidades, composições (por exemplo, áci- dos nucleicos recombinantes, rAAVs, composições farmacêuticas, etc.) em composições farmacêuticas formuladas convenientemente re- veladas aqui, neste requerimento de patente, são liberadas diretamen- te para o tecido-alvo, por exemplo, direto para o tecido do sistema ner- voso central (por exemplo, o cérebro, a medula espinhal, etc.) No en- tanto, em certas circunstâncias pode ser desejável liberar separada- mente ou adicionalmente as composições através de outra via, por exemplo, por via subcutânea, por via intraopancreática, por via intra- nasal, por via parenteral, por via intravenosa, por via intramuscular, por via intratecal, ou por via oral, por via intraperitoneal, ou por inhalação. Em algumas modalidades, as modalidades de administração conforme descrito nas Pat. U.S. Nos. 5.543.158; 5.641.515 e 5.399.363 (cada uma especificamente incorporada aqui, a este requerimento de paten- te, por meio de referência em sua totalidade) podem ser usadas para liberar rAAVs. Em algumas modalidades, um modo de administração preferencial é por injeção intravenosa.

[00093] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável in- cluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pões estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esté- reis. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições or- dinárias de armazenamento e uso, estas preparações contêm um pre- servantre para prevenir o crescimento de microorganismos. Em muitos casos, a forma é estéril e fluida na medida que exista fácil seringabili- dade. Deve ser estável sob as condições de fabricação e de armaze- namento e deve ser preservada contra a ação contaminante dos mi- croorganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos, e/ou óleos vege- tais. Pode ser mantida fluidez adequada, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partí- cula requerido no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A pre- venção da ação de microorganismos pode ser produzida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo- robutanol, fenol, ácido sórbico, timerossal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açú- cares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser produzida pelo uso nas composições de agentes de retardo da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00094] Para administração de uma solução aquosa injetável, por exemplo, a solução pode ser convenientemente tamponada, caso ne- cessário, e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com suficiente salina ou glicose. Estas soluções aquosas particulares são especial- mente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, sub- cutânea e intraperitoneal. Neste contexto, pode ser empregado um meio aquoso estéril adequado. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução de NaCl isotônica e ou adicionada a 1000 ml! de fluido hipodermocliise ou injetada no local de infusão pro-

posto, (vide, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na do- sagem necessariamente vai ocorrer dependendo da condição do hos- pedeiro. A pessoa responsável pela administração, em qualquer even- to, vai determinar a dose apropriada para o hospedeiro individual.

[00095] “Soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorpora- ção das composições (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes, rAAVs, composições farmacêuticas, etc.) na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados aqui, neste requerimento de patente, conforme requerido, seguida por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas por in- corporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril, o qual contém o meio de dispersão básico e os outros ingredi- entes requeridos entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de pre- paração preferenciais são técnicas de secagem a vácuo e de secagem por congelamento, as quais produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

[00096] As composições (por exemplo, ácidos nucleicos recombi- nantes, rAAVs, composições farmacêuticas, etc.) reveladas aqui, neste requerimento de patente, também podem ser formuladas em uma for- ma neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos de amino livre da proteína) e os quais são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou os ácidos orgânicos referidos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhan- tes. Sais formados com os grupos de carboxila livre também podem ser derivados das bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxi- dos de sódio, potássio, amônio, cpalcio, ou férrico, e as bases orgâni-

cas referidas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaí- na e semelhantes. Depois da formulação, as soluções vão ser admi- nistradas em uma maneira compatível com a formulação da dosagem e em uma quantidade tal conforme é terapeuticamente eficaz. As for- mulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagens tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármacos, e semelhantes.

[00097] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "veí- culo" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, veií- culos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de atraso da absorção, tampões, soluções de ve- ículo, suspensões, coloides, e semelhantes. O uso de semelhantes meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é de conheci- mento geral na técnica. Ingredientes ativos suplementar também po- dem ser incorporados nas composições. A expressão "farmaceutica- mente aceitáveis" se refere a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou desagradável similar, quando administradas a um hospedeiro.

[00098] “Veículos de liberação tais como lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microsferas, partículas de lipídeos, vesículas, e seme- lhantes, podem ser usados para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas. Em particular, os transgenes liberados por vetores de rAAV podem ser formulados para liberação quer encapsulados em uma partícula de lipídeo, um |li- possoma, uma vesícula, uma nanosfera, ou uma nanopartícula ou se- melhante.

[00099] As formulações referidas podem ser preferenciais para a introdução de formulações farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos nucleicos ou dos constructos de rAAV revelados aqui, neste requeri- mento de patente. A formação e o uso de lipossomas é de conheci-

mento geral dos peritos na técnica. Recentemente, foram desenvolvi- dos lipossomas com aprimorada estabilidade sérica e meios-tempos de circulação (Pat. U.S. No. 5.741.516). Além disso, têm sido descritos vários métodos de lipossoma e preparações semelhantes a liposso- mas como potenciais veículos de fármacos (Pat. U.S. Nos. 5.567.434;

5.552.157; 5.565.213; 5.738.868 e 5.795.587).

[000100] Lipossomas têm sido usados com sucesso com uma série de tipos celulares que são normalmente resistentes a transfecção por outros procedimentos. Além disso, os lipossomas são livres dos limites de comprimento do DNA que são típicos de sistemas de liberação à base de vírus. Os lipossomas têm sido usados de modo eficaz para introduzir genes, fármacos, agentes radioterapêuticos, vírus, fatores de transcrição e efetores alostéricos em uma variedade de linhagens ce- lulares cultivadas e animais cultivados. Além disso, foram completados vários testes clínicos com sucesso examinando a eficácia da liberação de fármacos mediada por lipossomas.

[000101] Lipossomas são formados a partir de fosfolipídeos que são dispersos em um meio aquoso e formam espontaneamente vesículas de duas camadas concêntricas multilamelares (também denominadas vesículas multilamelares (MLVs). As MLVs geralmente têm diâmetros de a partir de 25 nm a 4 um. Sonicação das MLVs resulta na formação de vesículas unilamelares pequenas (SUVs) com diâmetros em uma faixa de 200 a 500. ANG,, contendo uma solução aquosa no núcleo.

[000102] Alternativamente, podem ser usadas formulações de nano- cápsulas do rAAV. As nanocápsulas podem geralmente aprisionar substâncias em um modo estável e reprodutível. De modo a evitar efei- tos colaterais devido a sobrecarga polimérica intracelular, as partículas ultrafinas referidas (de tamanho em torno de 0,1 um) devem ser desig- nadas usando polímeros capazes de serem degradados in vivo. Nano- partículas de polialquil-cianoacrilato biodegradáveis que satisfazem es-

tes requisitos são contempladas para uso. Métodos para o tratamento da Síndrome de Rett

[000103] Em alguns aspectos, a presente invenção se refere a com- posições e métodos para o tratamento da Síndrome de Rett. A Sín- drome de Rett é um distúrbio neurológico genético causado por uma ou mais perda de mutações de função no gene MeCP2, por exemplo, conforme descrito em Suter et al. J Autism Dev Disord. 2014 Mar; 44(3): 703-711. Em algumas modalidades, um sujeito tendo Síndrome de Rett tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais perda de mutações de função no gene MeCP?2.

[000104] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "tratamento", "tratar", e "terapia" se referem a tratamento tera- pêutico e manipulações profiláticas ou preventivas. Os termos adicio- nalmente incluem a melhora dos sintomas existentes, a prevenção de sintomas adicionais, a melhora ou prevenção das causas subjacentes de sintomas, a prevenção ou reversão de causas de sintomas, por exemplo, sintomas associados com uma doença causada por uma perda de mutação da função, por exemplo, síndrome de Rett. Portan- to, os termos denotam que foi conferido um resultado benéfico sobre um sujeito com um distúrbio (por exemplo, a síndrome de Rett), ou com o potencial de desenvolver um distúrbio semelhante. Além disso, o termo "tratamento" é definido como a aplicação ou administração de um agente (por exemplo, agente terapêutico ou uma composição tera- pêutica) para um sujeito, ou para um tecido isolado ou uma linhagem celular de um sujeito, que possa ter uma doença, um sintoma de do- ença ou uma predisposição para uma doença, com o propósito de cu- rar, sarar, aliviar, amenizar, alterar, remediar, melhorar, apirmorar ou afetar a doença, os sintomas de doença ou a predisposição para do- ença.

[000105] Agentes terapêuticos ou composições terapêuticas podem incluir um composto em uma forma farmaceuticamente aceitável que previne e/ou reduz os sintomas de uma doença em particular (por exemplo, síndrome de Rett). Por exemplo, uma composição terapêuti- ca pode ser uma composição farmacêutica que previne e/ou reduz os sintomas da síndrome de Rett. É contemplado que a composição tera- pêutica da presente invenção vai ser proporcionada em qualquer for- ma adequada. A forma da composição terapêutica vai depender de uma série de fatores, incluindo o modo de administração conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. A composição terapêuti- ca pode conter diluentes, adjuvantes e excipientes, entre outros ingre- dientes conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.

EXEMPLO Exemplo 1: Análise da expressão genética de MeCP2 humana isofor- ma e1 in vitro

[000106] Aproximadamente 80% dos casos de Rett são causados por mutações no gene ligado a X codificando a proteína de ligação a metil CpG 2 (MeCP2), um regulador epigenético amplamente expresso que é expresso em altos níveis nos neurônios maduros. A maioria dos pacientes com síndrome de Rett carrega um alelo normal e mutante de MeCP?2. A doença resulta de inativação aleatória do cromossoma X, onde — 50% dos neurônios são deficientes de MeCP2 devido a inativa- ção do alelo normal, ao passo que nos outros -50% dos neurônios o alelo mutante é silenciado e é conservada expressão normal de MeCP?2 selvagem. A heterogeneidade da deficiência de MeCP2 no sis- tema nervoso central tem importantes implicações para o desenvolvi- mento de abordagens de terapia genética para a síndrome de Rett. Em modelos em camundongo da síndrome de Rett, a reversibilidade dos fenótipos neurológicos tem sido observada depois de restauração de expressão normal de MeCP2 em adultos. Nestes experimentos transgênicos, expressão de MeCP?2 restaurada foi acionada a partir de seu locus genômico nativo e foi realizada ativação na maioria das célu- las no cérebro. No entanto, transferência genética somática ainda tem que replicar qualquer um destes sucessos.

[000107] Geralmente, MeCP2 tem uma janela de segurança muito estreita de níveis de expressão, uma vez que os pacientes com uma duplicação do locus MeCP?2 tipicamente apresentam desenvolvimento motor e cognitivo retardados bem como grave comprometimento inte- lectual. Experimentos em modelos de camundongos transgênicos cor- roboram esta noção, uma vez que a expressão ectópica de MeCP2 é tóxica em animais selvagens, porém é segura e parcialmente eficaz para melhorar os fenótipos de doença de camundongos deficientes de MeCP2 quando a expressão do transgene se inicia durante o desen- volvimento embrionário. Notavemente, o gene MeCP2 é alternativa- mente emendado para gerar duas proteínas com diferentes términos N, designadas como MeCP2-e1 e MeCP2-e2. Os pacientes com dupli- cação do locus de MeCP2 superexpressam ambas as isoformas de MeCP?2. Portanto, os sintomas em pacientes com duplicação do locus de MeCP?2 e os resultados em camundongos transgênicos podem ser explicados por superexpressão da isoforma MeCP2-e2 e o momento da expressão do transgene durante o desenvolvimento.

[000108] Experimentos terapêuticos com AAV9-MeCP2-e1i prévios se focalizaram sobre a liberação neonatal intravascular (IV) ou intrace- rebroventricular (ICV) e em alguns casos encontraram toxicidade he- pática letal e aperto dos membros posteriores. Além disso, a idade dos camundongos tratados nos experimentos referidos não corresponde necessariamente à idade provavelmente a ser implementada na maio- ria dos pacientes com Rett, os quais presumivelmente seriam tratados depois do início dos sintomas (6 a 18 meses). Nos seres humanos, a fase primária de sinaptogênese ocorre nos primeiros 2 anos e coincide com um rápido aumento na metilação de DNA não-CG nos neurônios,

berm como no início dos sintomas nos pacientes com Rett. Em ca- mundongos, ocorre sinaptogênese entre 2 e 4 semanas de idade. Por- tanto, é crucial examinar a eficácia e a toxicidade potencial da libera- ção de AAV-gene MeCP2 em estágios de desenvolvimento relevantes além do dia O a 1 pós-natal. Adicionalmente, uma importante limitação para a implementação de liberação genética de AAV sistêmica para tratar distúrbios do sistema nervoso central é a transdução de órgãos diferentes do cérebro, tais como o fígado, o qual é o órgão com o mai- or tropismo de AAVs no corpo.

[000109] Foi projetada uma série de novos vetores AAV-MeCP2 que eliminam a expressão genética nos órgãos periféricos e também au- torregulam a expressão de MeCP2. De modo geral, MRNA de MeCP2 carrega ou uma 3'UTR curta (1,8 kb) ou longa (-10 kb), com a última sendo a expressão da isoforma preferencial no cérebro. Os construc- tos de MRNA de MeCP2 descritos neste exemplo compreendem uma sequência codificando a proteína MeCP2 isoforma-e1 e vários elemen- tos reguladores de miRNA (MREs). Foi observado que a translação de MeCP? no sistema nervoso central é regulada por miR-132 através de um mecanismo homeostático envolvendo modificações nos níveis do fator neurotrófico derivado cerebral (BNDF) em resposta à expressão de MeCP?2 (FIG. 1A). Com base neste mecanismo, uma série de veto- res AAV-MeCP2 com números crescentes dos MREs de miR-132 (por exemplo, sítios de ligação a miR-132) acoplada a um número fixo de MREs para miR-1 e miR-122 (por exemplo, sítios de ligação 3x-miR-1 e 3x-mir-122) para desdirecionar a expressão genética de AAVs dos músculos esqueléticos e do fígado (FIG. 1B).

[000110] Foi realizada uma série de experimentos in vitro. Em resu- mo, células HEK293T foram transfectadas com 30.000 gc/ célula de AAV2-MeCP?2 por quatro dias. As FIGs. 2A a 2B mostram a expressão eficaz de AAV2-MeCP2 em células HEK293T, conforme medido por

Western blot (FIG. 2A) e teste de expressão de proteína normalizada (FIG. 2B). A FIG. 2C mostra um perfil de toxicidade de células 293T transduzidas com AAV2-MeCP2 por quatro dias em uma dose de

30.000 gc/ célula.

[000111] Um estudo de dose resposta em neurônios corticais primá- rios de camundongo mostraram efeitos comparáveis obre a sobrevida celular para vetores AAV-GFP e AAV-MeCP?2 (FIG. 3A), indicando que a expressão de MeCP2 humana marcada com myc de um promotor de MeCP?2 curto de camundongo (-223 a +56) é não tóxica para os neu- rônios primários em cultura. Além disso, foi observado que os níveis de proteína MeCP2-myc eram inversamente proporcionais ao número de MREs de miR-132 (por exemplo, sítios de ligação a miR-132) presen- tes no transcripto MeCP2-myc (FIG. 3B). A FIG. 3C mostra a expres- são de miR-132 em resposta a AAV2-MeCP?2 cinco dias depois de in- fecção por AAV. Exemplo 2: Análise da expressão genética de MeCP2 humana isofor- ma e1 em camundongos selvagens depois de liberação sistêmica de AAV-MeCP2

[000112] De modo a ampliar as observações in vitro demonstrando a capacidade para titular os níveis de MeCP2 por inserção de sequên- cias alvo miR-132 descritas no Exemplo 1, camundongos selvagens no dia 1 pós-natal foram injetados através da veia facial (por exemplo, injeção intracraniana) com AAV codificando a isoforma e1 de MeCP2 humana contendo O, 1x, 2x, ou 3x sequências alvo miR-132. Análise da expressão genética do tecido do cérebro indicou que os níveis de MeCP?2 são inversamente proporcionais ao número de sequências al- vo MIR132 (FIGURAS 4A a 4C).

[000113] Em algumas modalidades, a administração sistêmica de alguns sorotipos de AAV pode transduzir tecidos fora do sistema ner- voso central, e foi observado que expressão elevada de MeCP2 em tecidos do fígado, cardíaco e esquelético está associada com conse- quências fisiológicas prejudiciais. Para minimizar a transdução cardía- ca e hepática de MeCP2, os vetores AAV-MeCP?2 descritos pela pre- sente invenção contêm no mínimo um miR-1 (por exemplo, 3x-miR-1) e no mínimo uma sequência alvo miR-122 (por exemplo, 3Xx-miR-122) (por exemplo, sítios de ligação) para des-direcionar a expressão de MeCP?2 do coração e do fígado, respectivamente. Foi realizada análise por gRT-PCR usando iniciadores contra MeCP2 humana e2 (a qual era indetectável), e MeCP2 de camundongo e1 e e2 (as quais não não se modificaram). Análise da expressão genética de tecido do coração e do fígado de animais selvagens indicou que MeCP2 é des- direcionada de modo eficaz do coração e do fígado, conforme eviden- ciado por substancialmente expressão reduzida em comparação com o cérebro (FIG. 4A e FIG. 5).

Exemplo 3: Eficácia terapêutica e segurança de vetores AAV-MeCP2 auto-reguladores

[000114] A eficácia terapêutica e a segurança dos vetores AAV- MeCP2-e1 é examinada em camundongos. Em algumas modalidades, é usada proteína do capsídeo AAV-PHP.B, já que este capsídeo tem eficiência de transdução neuronal aprimorada. Camundongos Mecp2- null (Mecp2'nt-8id/J: Machos”! e fêmeas*”) com 4 semanas de idade são tratados por administração sistêmica de vetores AAV-PHP.B- MeCP2-e1 carregando diferentes cassetes de MRE (por exemplo, em doses de vetor de 1111, 3E11, 1112 vg/ camundongo) e o peso corpo- ral e os escores fenotípicos são monitorados a cada duas semanas. Como controles, são usados camundongos MeCP2/Mecp2'm1.18ird jnje- tados com veículo e camundongos selvagens. Um subgrupo de ca- mundongos em cada coorte (n=8; 4 machos e 4 fêmeas) são sacrifica- dos em 8 semanas pós-injeção e a expressão de MeCP2 é quantifica- da por western blot e comparada através dos grupos. A eficiência de transdução no cérebro é avaliada por coloração de dupla imunofluo- rescência para MeCP2 e neurônios (usando o marcador neuronal NeuN) e é realizada quantificação dos neurônios transduzidos (MeCP2+, NeuN+) no córtex, no corpo estriado, no tálamo, no hipo- campo e no cerebelo. Os níveis de PSD-95 são avaliados por western blot e imunocoloração das seções cebrais; PSD-95 é uma proteína de arcabouço chave em maturação sináptica cujos níveis estão reduzidos nos cérebros de camundongos nulos MeCP?2.

[000115] De modo a realizar análise da biodistribuição de vetores, o DNA genômico é isolado a partir de diferentes regiões do sistema ner- voso central e dos órgãos periféricos e analisado por PCR digital. Ou- tro subgrupo de animais em cada coorte (n=16; 8 machos e 8 fêmeas) é usado para análise da sobrevida e longitudinal da performance com- portamental (por exemplo, campo aberto; interação social) e motora (por exemplo, rotarod (N.T.: barra rotatória), caminhada na grade) bem como pletismografia de corpo inteiro para avaliar os padrões respirató- rios e apnéia característica de camundongos MeCP2-null. Os estudos de desfecho são os mesmos que em 8 semanas depois do tratamento. A segurança dos vetores também é avaliada em camundongos selva- gens em um estudo de escalonamento da dose usando doses idênti- cas às indicadas acima com desfechos em 7, 30, 90 e 180 dias para avaliar os tecidos periféricos e do sistema nervoso central para evi- dência de toxicidade. Também são avaliadas a biodistribuição de veto- res de AAV e a expressão de MeCP?2. Exemplo 4: Caracterização de alterações no genoma / transcriptoma de neurônios transduzidos depois de transferência de AAV-gene MeCP2 em diferentes estágios de desenvolvimento do sistema nervoso

[000116] Um aspecto chave no desenvolvimento de uma abordagem de terapia genética segura e eficaz para Rett é caracterizar em deta- lhes o impacto de expressão de novo de MeCP2 sobre o panorama epigenético e o perfil transcriptômico de neurônios transduzidos. Para este fim, são produzidos vetores AAV-PHP.B-MeCP2-e1 carregando um cassete IRES-GFP, e permitem o isolamento de células GFP+ transduzidas do cérebro, cerebelo e medula espinhal por ou FACS ou microdissecção de captura a laser seguida por sequenciamento de bissulfito de genoma completo (MethylIC-Seqg), pequeno RNA-seq (mi- croRNAs), e RNA-Seq (mMRNAs e RNAs não codificantes). Machos MeCP2””, fêmeas MeCP2* e controles selvagens (machos e fêmeas) recebem uma injeção sistêmica de AAV-PHP.B-MeCP2-e1-IRES-GFP, vetor de controle (sem cDNA de MeCP2) e veículo nos dias 1,7, 14, e 28, bem como em 12 semanas de idade em uma dose ótima. Os ca- mundongos (n=8; 4 machos e 4 fêmeas) são eutanizados em 1 ou 3 meses depois de injeção para avaliar os parâmetros indicados acima. Informação sobre microRNAs que são superexpressos em resposta a expressão de MeCP2 é usada para camadas adicionais estabelecidas de regulação da expressão genética além da baseada em miR-132. Exemplo 5: Contribuição das isoformas de MeCP2 para o sucesso te- rapêutico ou surto de sintomas neurológicos em função da intervenção em diferentes estágios de desenvolvimento

[000117] Foi observado que a expressão de MeCP2 de 1,6 até 6 ve- zes acima dos níveis fisiologicamente normais provoca sintomas neu- rológicos tanto em pacientes com duplicação do locus MeCP2 (-2 ve- zes acima do normal) e modelos de camundongos transgênicos. A ou- tra característica comum entre pacientes e modelos de camundongos transgênicos é que ambos superexpressam a isoforma MeCP2-e2, a qual diferentemente da isoforma e1 parece ser tóxica para os neurô- nios primários em cultura. Em algumas modalidades, este efeito tóxico é eliminado por coexpressão de FoxG1, o qual é outro gene onde mu- tações são associadas com a síndrome de Rett. Em algumas modali- dades, coexpressão de FoxG1 com MeCP2 é um mecanismo adicional para controlar os efeitos colaterais associados com superexpressão de MeCP2. Experimentos terapêuticos, de segurança e epigenômicos / transcriptômicos com vetores AAV-PHP.B codificando MeCP-eli, MeCP2-e2, MeCP2-e2 e FoxG1, ou FoxG1 isolado são conduzidos em machos MeCP2”, fêmeas MeCP2*" e controles selvagens combina- dos por idade.

SEQUÊNCIAS >SEQ ID NO: 1; sequência de aminoácidos de MeCP2 humana isoforma e1 (NM 001110792)

MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKD KKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASAS PKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINP QGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPK KPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKL LVKMPFQOTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPK KRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSI EVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSP PKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDL SSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRG

EGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS > SEQ ID NO: 2; sequência de aminoácidos de MeCP2 humana isoforma e2 (NM 004992)

MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPV QPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGP MYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIA YFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGR GRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQOTSPGG KAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAA AAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVST LGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHS ESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPR GGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSM

PRPNREEPVDSRTPVTERVS >SEQ ID NO: 3; sequência de DNA de promotor de MeCP2 de camundongo AATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCcAGCCTGGGCTCC

ACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGC GCGGGCGCECAGETGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGC

GGGGCGCGACGTCTGCCEGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTT >SEQ ID NO: 4; sequência de DNA de sítio de ligação a miR-122

ACAAACACCATTGTCACACTCCA >SEQ ID NO: 5; sequência de DNA de sítio de ligação a miR-1

ATACATACTTCTTTACATTCCA >SEQ ID NO: 6; sequência de DNA de sítio de ligação a miR-132

CGACCATGGCTGTAGACTGTTA >SEQ ID NO: 7; sequência de ácido nucleico de constructo MeCP2 in vitro (plasmídeo scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(1xX)MIR122-1(3x)) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCcGGGCAAAGCCCG

GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATT

CGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGG CTCCGCCCcAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCG

ACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCEGGCGCGCAGGTGCAGCAGC ACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGÇ GGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCOTCCTCTCGGAGAG AGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGC CGCAGCGCCGAGCEGGCEGAGEGTEGGCEGTEGGCGAGGAGGAGAG ACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGG ACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAG AGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCAC TCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGG GTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCA AACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGAT GACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAG GAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAAT CCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTAC TTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGAC TTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAA ACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAG AGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAG GCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAA AAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCC AGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTEGGGCCACCACATCCACCOCAG GTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGC AGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGA GTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTG AAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATC AAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGA AGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCG GGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAG GAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCOCC

CCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAA AGGCCCCCGTGCCACTGCTCOcACCOCoTGCCCCCACCTCCACCOT GAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCcoTtTGAGCOCCOC

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CAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG >SEQ ID NO: 8; sequência de ácido nucleico de constructo MeCP2 in vitro (plasmídeo scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(2x)MIR122-1(3x)) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCcGGGCAAAGCCCG

ACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCEGGGCGCGCAGGTGCAGCAGC ACACAGGCTGGTCGGGAGGGCEGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGÇ GGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCOTCCTCTCGGAGAG AGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGC CGCAGCGCCGAGCGGCGGAGSGTGGCEGEGTGGCGAGGAGGAGAG ACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGG ACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAG AGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCAC TCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGG GTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCOCCA AACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGAT GACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAG GAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAAT CCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTAC TTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGAC TTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAA ACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAG AGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAG GCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAA AAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCC AGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTEGGGCCACCACATCCACCCAG GTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGC AGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGA GTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTG AAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATC AAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGA AGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTEGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCG GGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAG GAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCC

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GG >SEQ ID NO: 9; sequência de ácido nucleico de constructo MeCP2 in vitro (plasmídeo scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(3x) miR122-1(3x)) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCcGGGCAAAGCCCG

ACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCEGGGCGCGCAGEGTGCAGCAGC ACACAGGCTGGTCGGGAGGGCEGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGÇ GGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCOTCCTCTCGGAGAG AGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGC CGCAGCGCCGAGCGGCGGAGSGTGGCEGEGTEGGCGAGGAGGAGAG ACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGG ACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAG AGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCAC TCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGG GTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCOCCA AACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGAT GACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAG GAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAAT CCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTAC TTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGAC TTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAA ACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAG AGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAG GCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAA AAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCC AGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTEGGGCCACCACATCCACCCAG GTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGC AGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGA GTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTG AAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATC AAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGA AGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTEGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCG GGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAG GAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCC

CCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAA AGGCCCCCEGTGCCACTGCTCOcACCOCCoTGCCCCCACCTCCACCOT GAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCcoTtTGAGCCOCC

AGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGA GGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAA GACTCAGCCCGCGGTTGCCACCEGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGT ACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCT CCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACG CCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGA GGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGT AGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACT TCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTT TACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAAC AAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGC GGCCGCTTCGATCCGATCOTTTITTCCOTCTGCCAAAAATTATGGGG ACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGA AATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCA CTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTA CAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCG CTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CCGGGCTTTGCCEGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA GCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA CTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACA TCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACEOG ATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGAC

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CTTTCGCTTTCTTCCOTTCOTTTCETCGCCACGTTEGCCGGCTTTCCE CCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAG TGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGG TTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTEGCCCTTT GACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACT GGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAG GGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA ACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTT AGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTT ATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAAC CCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTAT TCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCOTTTITITGCGGCATTTTGC CTTCCTGTTTTITGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATG CTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATC TCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTT TTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATT ATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATAC ACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAA GCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGC CATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAAC GATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGG GGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGA AGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAAT GGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTA GCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTT GCAGGACCACTTCTGCGCTEGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATT GCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATT GCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATEGTAGTTATCO TACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACA GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTC AGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATT TTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTITTTGATAATCTCATG ACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGAC CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTITITCTGC GCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGG TGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT AACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT GTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTT ACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGC ACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATA CCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGA GAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGG AGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTT ATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCEGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCA ACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTC ACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTAT TACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGA CCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCC AATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATG CAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGC GCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGG CTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC

CAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG >SEQ ID NO: 10; sequência de ácido nucleico de constructo MeCP2 in vivo (genoma de vetor scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(1x)MiR122- 1(3x)) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCcGGGCAAAGCCCG

ACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCEGGCGCGCAGEGTGCAGCAGC ACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGÇ GGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCOTCCTCTCGGAGAG AGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGC CGCAGCGCCGAGCEGGCEGGAGEGTEGGCEGTEGGCGAGGAGGAGAG ACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGG ACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAG AGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCAC TCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGG GTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCA AACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGAT GACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAG GAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAAT CCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTAC TTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGAC TTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAA ACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAG AGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAG GCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAA AAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCC AGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTEGGGCCACCACATCCACCCAG GTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGC AGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGA GTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTG AAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATC AAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGA AGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCG GGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAG GAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCOCC

AGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGA GGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAA GACTCAGCCCGCGGTTGCCACEGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGT ACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCT CCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACG CCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGA GGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATA CTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTT CTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCC AACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCC AGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCOTCTGCCAAAAATTATG GGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAA GGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTIGTGTCTC TCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAA CTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCG CGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGAC GCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG

CAG >SEQ ID NO: 11; sequência de ácido nucleico de constructo MeCP2 in vivo (genoma de vetor scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(2x)MmiR122- 1(3x)) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCoGGGCAAAGCCCG

GGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATT

CGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGG CTCCGCCCccAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCG

ACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCEGGGCGCGCAGGTGCAGCAGC ACACAGGCTGGTCGGGAGGGCEGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGÇ GGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAG AGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGC CGCAGCGCCGAGCGGCEGGAGEGTGGCEGTEGGCGAGGAGGAGAG ACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGG ACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAG AGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCAC TCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGG GTCAGGCTCCGCCCEGGCTEGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCA AACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGAT GACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAG GAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAAT CCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTAC TTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGAC TTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAA ACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAG AGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAG GCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAA AAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCC AGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTEGGGGCCACCACATCCACCOCAG GTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGC AGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGA GTGTGGTGGCAGCCGCTEGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTG AAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATC AAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGA AGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCG GGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAG GAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCOCC

CCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAA AGGCCCCCGTGCCACTGCTCOcCACCCCoTGCCCCCACCOTCCACCOT GAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCocoTGAGCOCCC

AGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGA GGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAA GACTCAGCCCGCGGTTGCCACCEGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGT ACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCT CCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACG CCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGA GGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGT AGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTT CTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTA CAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAA CAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTT TTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGC ATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTG TGTTGGAATTTTTITGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAG CATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGG GCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCC

TCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG >SEQ ID NO: 12; sequência de ácido nucleico de constructo MeCP2 in vivo (genoma de vetor scCAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(3x) miR122- 1(3x))

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCG GGCGTCGGGCGACCTTTGEGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCG AGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATT

ACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCEGGCGCGCAGEGTGCAGCAGC ACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCG GGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCOTCCTCTCGGAGAG AGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTGC CGCAGCGCCGAGCEGGCEGAGEGTEGGCEGTEGGCGAGGAGGAGAG ACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGG ACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAG AGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCAC TCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGG GTCAGGCTCCGCCCCGGCTEGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCOCCA AACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGAT GACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAG GAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAAT CCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTAC TTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGAC TTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAA ACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAG AGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAG GCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAA AAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCC AGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTEGGGCCACCACATCCACCCAG GTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGC AGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGGA GTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTG AAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATC AAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGA AGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCG GGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAG GAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCOCC

CCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAA AGGCCCCCGTGCCACTGCTCOCcACCCoTGCCCCOCACCTCCACCOT GAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCcoTtTGAGCOCCOC

AGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGA GGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAA GACTCAGCCCGCGGTTGCCACEGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGT ACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCT CCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACG CCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGA GGACCTGTGACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGT AGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACT TCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTT TACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAAC AAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGC GGCCGCTTCGATCCGATCTTTITTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGG ACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGA AATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCA CTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTA CAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCG CTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA

G >SEQ ID NO: 13; sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV2

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGL VLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYL KYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKT APGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVP DPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGN WHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASGASNDNHYF GYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQ VKEVTOQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFP ADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFS YTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTOSR LQFSQAGASDIRDASRNWLPGPCYRQQARVSKTSADNNNSEYSWTG ATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKT NVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLORGNRQAATADVNT QGVLPGMVWODRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHP PPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENS

KRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL > SEQ ID NO: 14; sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV9

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQADNARGL VLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYL KYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKT APGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPD PQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWH CDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYF GYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQ VKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFP ADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFS YEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQAQNQQATL KFSVAGPSNMAVOGRNYIPGPSYRQQARVSTTVTAONNNSEFAWPGA SSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRD NVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQOSAQAQAQTEGWVQ NQOGILPGMVWQODRDVYLQAGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKH PPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKEN

SKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL > SEQ ID NO: 15; sequência de aminoácidos de capsídeo de AAV- PHP.B

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQADNARGL VLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYL KYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKT APGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPD PQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWH CDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYF GYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQ VKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFP ADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFS YEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTINGSGQANQQATL KFSVAGPSNMAVOGRNYIPGPSYRQQARVSTTVTAQNNNSEFAWPGA SSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRD NVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQTLAVPFKAQA QTEGWVQANQGILPGMVWQADRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMG GFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIE WELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTR YLTRNL

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de manipulação de um transgene, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; (b) selecionar um miRNA, cuja expressão é regulada positi- vamente pelo primeiro produto na célula; e, (c) manipular um transgene que expresse um transcripto tendo uma região codificante codificando o primeiro produto e uma re- gião não codificante 3' compreendendo um ou mais sítios de ligação para o miRNA.

2. Método de manipulação de um transgene, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; (b) selecionar um segundo gene codificando um segundo produto na célula; (c) determinar que a expressão do segundo produto é regu- lada positivamente pelo primeiro produto na célula; (d) selecionar um miRNA; (e) determinar que a expressão do miRNA é regulada posi- tivamente pelo segundo produto na célula; e, (f) manipular um transgene para expressar na célula um transcripto tendo uma região codificante codificando o primeiro produto e uma região não codificante 3' compreendendo um ou mais sítios de ligação para o miRNA.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que o primeiro produto é uma proteína.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a proteína é MeCP2, opcionalmente MeCP?2 isoforma e1 ou MeCP isoforma e2.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o segundo produto é uma proteí- na, ou um ácido nucleico, opcionalmente em que o ácido nucleico é um miRNA.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a5, caracterizado pelo fato de que o miRNA é miR-132.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda ma- nipular a região não codificante 3' do transcripto para compreender um ou mais sítios de ligação para um ou mais miRNAs de de-targeting.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o um ou mais miRNAs de de-targeting inibem a ex- pressão do transgene a partir do fígado, do coração, do pulmão, do músculo, do pâncreas, ou de células apresentadoras de antígeno.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri- zado pelo fato de que o um ou mais miRNA de de-targeting é miR-122, MIR-1, ou miR-122 e miR-1.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de manipulação do transgene compreende inserir o transgene dentro de um vetor.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um vetor de clonagem, um vetor de ex- pressão, um plasmídeo, ou um vetor viral.

12. Método de manipulação de um transgene, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; (b) selecionar um miRNA, cuja expressão é regulada positi- vamente pelo primeiro produto na célula; e,

(c) manipular um transgene que expresse um transcripto tendo uma região codificante codificando o primeiro produto e tendo um ou mais sítios de ligação para o miRNA.

13. Método de manipulação de um transgene, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) selecionar um primeiro gene codificando um primeiro produto em uma célula; (b) selecionar um segundo gene codificando um segundo produto na célula; (c) determinar que a expressão do segundo produto é regu- lada positivamente pelo primeiro produto na célula; (d) selecionar um mIiRNA; (e) determinar que a expressão do miRNA é regulada posi- tivamente pelo segundo produto na célula; e, (f) manipular um transgene para expressar na célula um transcripto tendo uma região codificante codificando o primeiro produto e tendo um ou mais sítios de ligação para o miRNA.

14. Vetor de AAV recombinante (rAAV) para expressão au- to-regulada de uma proteína, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreendendo um ácido nucleico manipulado para expressar em uma célula de um tecido alvo um transcripto codificando a proteí- na, em que o transcripto compreende no mínimo um primeiro sítio de ligação ao miRNA específico para um primeiro miRNA, em que a ex- pressão do primeiro miRNA é regulada positivamente por expressão da proteína na célula.

15. Vetor de AAV recombinante compreendendo um capsí- deo abrigando o vetor de rAAV de acordo com a reivindicação 14, ca- racterizado pelo fato de que o capsídeo compreende uma proteína do capsídeo que facilita a transdução seletiva da célula do tecido alvo.

16. Ácido nucleico recombinante caracterizado pelo fato de codificar um transcripto tendo i) uma região codificante codificando uma proteína e ii) dois ou mais sítios de ligação ao miRNA, em que os dois ou mais sítios de ligação ao miRNA compreendem: (a) no mínimo um primeiro sítio de ligação ao miRNA espe- cífico para um primeiro miRNA que é regulado positivamente por ex- pressão da proteína em uma célula de um tecido alvo; e (b) no mínimo um segundo sítio de ligação ao miRNA espe- cífico para um segundo miRNA que é expresso, independente de ex- pressão da proteína, em células de um tecido não alvo.

17. Ácido nucleico recombinante caracterizado pelo fato de codificar um transcripto tendo uma região codificante codificando uma proteína MeCP2 humana ou um fragmento funcional da mesma e uma região não codificante 3' compreendendo dois ou mais sítios de liga- ção ao miRNA, em que os dois ou mais sítios de ligação ao miRNA compreendem: (a) no mínimo um sítio de ligação ao miRNA específico para um miRNA que regula negativamente a expressão do transcripto; e (b) no mínimo um sítio de ligação ao miRNA específico para um miRNA que inibe a expressão do transcripto em uma célula de um tecido não alvo.

18. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindi- cação 17, caracterizado pelo fato de que a região codificante codifica MeCP2? isoforma e1.

19. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindi- cação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a MeCP2 humana compreende a sequência estipulada na SEQ ID NO: 1.

20. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o no mínimo um sítio de ligação ao miRNA específico para um miRNA que regula negativamente a expressão do transcripto compreende um sítio de ligação a miR-132, opcionalmente em que o no mínimo um sítio de ligação a miRNA é dois ou três sítios de ligação a miR-132.

21. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o no mínimo um sítio de ligação ao miRNA específico para um miRNA que inibe a expressão do transcripto em um tecido não alvo compreende um sítio de ligação a miR-1, um sítio de ligação a mir-122, ou um sítio de ligação a miR-1 e miR-122.

22. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que cada um entre o um ou mais sítios de ligação ao miRNA está localizado en- tre o último códon da região codificante e a cauda poli-A do transcripto.

23. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que com- preende ainda um promotor, opcionalmente um promotor MeCP2 de camundongo.

24. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindi- cação 23, caracterizado pelo fato de que o promotor MeCP2 de ca- mundongo compreende a sequência estipulada na SEQ ID NO: 3.

25. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico recombinante está localizado sobre um plasmídeo.

26. Vetor viral compreendendo o ácido nucleico recombi- nante de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, opcio- nalmente caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor de ví- rus adeno-associado (AAV), um vetor de adenovírus, um vetor lentivi- ral, um vetor de herpesvírus, ou um vetor de baculovírus.

27. Ácido nucleico recombinante caracterizado pelo fato de codificar um transcripto tendo: (a) uma região codificante codificando MeCP2 humana ou um fragmento funcional da mesma; e, (b) uma região não codificante 3' compreendendo um ou mais sítios de ligação ao miRNA, em que o transcripto é flanqueado por repetições de termi- nal invertido (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV).

28. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindi- cação 27, caracterizado pelo fato de que a região codificante codifica MeCP? isoforma e1.

29. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindi- cação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a MeCP2 humana compreende a sequência estipulada na SEQ ID NO: 1.

30. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que o um ou mais sítios de ligação ao miRNA são sítios de ligação a miR-1, miR- 122, ou miR-132, ou qualquer combinação dos mesmos.

31. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindi- cação 30, caracterizado pelo fato de que o transcripto compreende um sítio de ligação a miR-1, um sítio de ligação a mir-122, e no mínimo um sítio de ligação a miR-132.

32. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindi- cação 31, caracterizado pelo fato de que o no mínimo um sítio de liga- ção a miR-132 é dois ou três sítios de ligação a mir-132.

33. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizado pelo fato de que o um ou mais sítios de ligação ao miRNA estão localizados entre o último códon da região codificante e a cauda poli-A do transcripto.

34. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 33, caracterizado pelo fato de que com- preende ainda um promotor, opcionalmente um promotor MeCP2 de camundongo.

35. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindi- cação 34, caracterizado pelo fato de que o promotor MeCP2 de ca- mundongo compreende a sequência estipulada na SEQ ID NO: 3.

36. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 35, caracterizado pelo fato de que as ITRs são ITRs de AAV2.

37. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV) caracteri- zado pelo fato de que compreende: um capsídeo abrigando o ácido nucleico recombinante co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 24, ou 27 a 36.

38. rAAV de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende no mínimo uma ITR se- lecionada entre uma ITR de AAV2, AAV3, AAVA, AAVS5, ou AAV6.

39. rAAV de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracte- rizado pelo fato de que o capsídeo compreende uma proteína do cap- sídeo que facilita a passagem do rAAV através da barreira hematoen- cefálica.

40. rAAV de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo tem um sorotipo selecionado entre o grupo que consiste em AAV-PHP.B, AAV1, AAV2, AAV2I8, AAV2.5, AAV5, AAV6, AAV8, AAVrh8ê8, AAV9, AAVrhioO, AAV-B1, AAV9.45A-String (por exemplo, AAV9.45-AS), AAV9.45Angiopep, AAV9.47-Angiopep, AAV9.47-AS, AAV-CAM130, e AAVO9HR.

41. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizado pelo fato de que a proteína do capsídeo com- preende ou consiste em uma sequência estipulada na SEQ ID NO: 14 ou 15 (AAV-PHP.B, AAV9).

42. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de o ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, ou 27 a 36, ou o rAAV como definido em qual-

quer uma das reivindicações 37 a 41, e um excipiente farmaceutica- mente aceitável.

43. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracte- rizada pelo fato de que a composição é formulada para injeção, opcio- nalmente em que a injeção é injeção sistêmica (por exemplo, injeção intravenosa) ou injeção intratecal.

44. Método de tratamento da síndrome de Rett em um su- jeito, caracterizado pelo fato de que o método compreende, adminis- trar a um sujeito tendo ou suspeito de ter síndrome de Rett uma quan- tidade eficaz: (a) do ácido nucleico recombinante como definido em qual- quer uma das reivindicações 17 a 24, ou 27 a 36; (b) do rAAV como definido em qualquer uma das reivindica- ções 37 a 41; ou, (c) da composição como definida na reivindicação 42 ou 43.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que o sujeito é um sujeito humano, opcionalmente em que o sujeito tem menos de um ano de idade.

46. Método de acordo com a reivindicação 44 ou 45, carac- terizado pelo fato de que o sujeito é definido por uma mutação em no mínimo uma cópia do gene MeCP2, opcionalmente em que a mutação é uma perda de mutação da função.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 46, caracterizado pelo fato de que a administração é inje- ção, opcionalmente injeção sistêmica (por exemplo, injeção intraveno- sa) ou injeção intratecal.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 47, caracterizado pelo fato de que a administração resulta em uma quantidade eficaz de (a), (b), ou (c) cruzando a barreira hema- toencefálica do sujeito.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 48, caracterizado pelo fato de que a administração resulta em um nível não tóxico de expressão de MeCP2 no cérebro do sujeito.