CN114026236A

CN114026236A - 可用于治疗雷特综合征的组合物

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Publication number: CN114026236A
Application number: CN202080046692.7A
Authority: CN
Inventors: J·M·威尔逊; R·施米德
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2019-04-24
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2022-02-08
Also published as: EP3973060A4; CA3133889A1; US20220202960A1; KR20220003553A; EP3973060A1; AU2020261051A1; SG11202111279QA; WO2020219766A8; WO2020219766A1; JP2022530095A

Abstract

提供了具有AAV衣壳和载体基因组的重组腺相关病毒(rAAV)，所述载体基因组包括编码功能性人甲基‑CpG结合蛋白2(hMECP2)的核酸序列。还提供了可用于产生所述rAAV的产生系统、包括所述rAAV的药物组合物，以及通过向有需要的受试者施用有效量的所述rAAV来治疗患有雷特综合征的受试者或改善雷特综合征的症状或延迟雷特综合征的进展的方法。

Description

可用于治疗雷特综合征的组合物

背景技术

雷特综合征(Rett syndrome，RTT)是一种由编码甲基-CpG结合蛋白2的X连锁基因(MECP2)中的功能丧失突变引起的严重的神经发育病症(～1:10,000活产女性)(Amir,R.E.等人(1999).雷特综合征是由编码甲基-CpG结合蛋白2的X连锁MECP2中的突变引起的(Rettsyndrome is caused by mutations in X-linked MECP2,encoding methyl-CpG-bindingprotein 2).《自然遗传学(Nat Genet)》23,185-188,doi:10.1038/13810)。在明显典型的产后早期发育后，受RTT影响的女孩在生命的第二年左右表现出技能退化，从而导致标志性症状，如严重的沟通缺陷(例如，丧失语言能力)和运动障碍(例如，丧失行走能力)(Katz,D.M.等人(2016).雷特综合征：跨越临床转化的门槛(Rett Syndrome:Crossing theThreshold to Clinical Translation).《神经科学趋势(Trends in neurosciences)》39,100-113,doi:10.1016/j.tins.2015.12.008)。患者还表现出终生的呼吸系统问题、胃肠功能障碍、癫痫发作、焦虑和骨科问题，这些问题给父母和看护人带来了沉重的情感和经济负担。

当前的RTT治疗是无效的，并且没有一种治疗能够克服致病性MECP2功能丧失(Katz,D.M.等人,如以上所引述)。在受影响的女性中，X染色体的等位基因之一携带致病性MeCP2突变，而另一个等位基因携带野生型等位基因。发育期间的随机X染色体失活(XCI)导致镶嵌MECP2蛋白表达，其中表达突变型MeCP2的细胞患病。在患病细胞中激活失活等位基因(Xi)上的野生型MeCP2拷贝被认为提供了一种可行的方法来使MECP2蛋白表达正常化，从而治疗RTT。先前已经表明，在成年RTT模型小鼠中恢复MeCP2显著改善了疾病症状(Guy,J.、Gan,J.、Selfridge,J.、Cobb,S.&Bird,A.(2007).在雷特综合征的小鼠模型中逆转神经系统缺陷(Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome).《科学(Science)》315,1143-1147,doi:10.1126/science.1138389)。这一观察结果表明，在患有RTT的个体中恢复MeCP2表达可以提供一种变革性的治疗。

通过利用小分子化合物或RNAi技术，在增殖的非神经元细胞中实现了极其温和的MeCP2激活水平(Bhatnagar,S.等人(2014).哺乳动物失活X染色体的遗传和药理学再激活(Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive Xchromosome).《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》111,12591-12598,doi:10.1073/pnas.1413620111；和Sripathy,S.等人,(2017).针对失活X染色体上的MeCP2的重新激活的筛选将BMP/TGF-β超家族鉴定为XIST表达的调节因子(Screening forreactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression).《美国国家科学院院刊》,doi:10.1073/pnas.1621356114)。另外，已对非神经元和神经元细胞进行了未发表的小分子筛选，但尚未出现经验证的MeCP2激活线索。

MECP2基因疗法已作为药理学治疗尝试的替代方法而被研究。包装到AAV9中并通过新生儿脑室内注射递送的具有来自小鼠Mecp2基因组基因座的内源性调控元件的MECP2表达盒显著延长了雄性雷特综合征模型的寿命和总体健康状况。然而，将行为基准校正到野生型同窝仔畜中看到的水平的功效是有限的(Sinnett,S.E.等人(2017).改善的MECP2基因疗法在脑池内递送后延长了MeCP2缺陷型小鼠的生存期而无明显毒性(Improved MECP2Gene Therapy Extends the Survival of MeCP2-Null Mice without ApparentToxicity after Intracistemal Delivery).《分子疗法-方法和临床发展(Mol TherMethods Clin Dev)》5,106-115,doi:10.1016/j.omtm.2017.04.006；和Gadalla,K.K.E.等人,(2017).在雷特综合征的小鼠模型中开发具有改善的安全特征和功效的新型AAV基因治疗盒(Development of a Novel AAV Gene Therapy Cassette with Improved SafetyFeatures and Efficacy in a Mouse Model of Rett Syndrome).《分子疗法-方法和临床发展》5,180-190,doi:10.1016/j.omtm.2017.04.007)。当代替地使用人工截断和剪接的MECP2转基因时，在小鼠中的治疗功效得到提高(Tillotson,R.等人(2017).从根本上截短的MeCP2挽救了雷特综合征样神经系统缺陷(Radically truncated MeCP2 rescues Rettsyndrome-like neurological defects).《自然(Nature)》,doi:10.1038/nature24058)。

因此，迫切且未满足的医疗需求是开发一种用于在神经元中实现足够的MECP2蛋白水平以获得治疗益处的新方法。

发明内容

本文提供了一种治疗性重组且复制缺陷型的腺相关病毒(rAAV)，其可用于治疗有需要的受试者的雷特综合征(RTT)。所述rAAV携带载体基因组，所述载体基因组包括反向末端重复序列(ITR)和核酸序列，所述核酸序列在调控序列的控制下编码功能性人甲基-CpG结合蛋白2(hMECP2)，所述调控序列指导所述hMECP2在靶细胞中的表达。在某些实施例中，所述rAAV进一步包括AAV衣壳，例如AAVhu68衣壳或AAV-PHP.B衣壳，所述AAV衣壳中包装有所述载体基因组。在某些实施例中，所述hMECP2编码序列与SEQ ID NO:3约95％到100％相同。另外地或可替代地，所述功能性hMECP2蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些实施例中，所述hMECP2编码序列是SEQ ID NO:3。在某些实施例中，所述载体基因组进一步包括背根神经节(drg)特异性miRNA靶序列的至少两个串联重复序列。在某些实施例中，所述载体基因组具有SEQ ID NO:1的核苷酸(nt)1到nt 2728或SEQ ID NO:6的nt 1到nt 2802的序列。在某些实施例中，所述rAAV或包括所述rAAV的组合物可施用于有需要的受试者以改善雷特综合征的症状和或延迟雷特综合征的进展。

在另一方面，提供了一种可用于产生所述rAAV的产生系统。在此系统中，培养的细胞包括编码AAV衣壳蛋白的核酸序列、本文所述的载体基因组和足够的AAV rep功能和辅助功能以允许将所述载体基因组包装到AAV衣壳中。在某些实施例中，所述AAV衣壳是进化枝F衣壳，例如AAVhu68、AAV9或AAV-PHP.B。

在一方面，本文提供了一种载体，其可用于治疗有需要的受试者的雷特综合征(RTT)。所述载体携带核酸序列，所述核酸序列在调控序列的控制下编码功能性人甲基-CpG结合蛋白2(hMECP2)，所述调控序列指导所述hMECP2在靶细胞中的表达。在某些实施例中，所述hMECP2编码序列与SEQ ID NO:3约95％到100％相同。另外地或可替代地，所述功能性hMECP2蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些实施例中，所述hMECP2编码序列是SEQID NO:3。在某些实施例中，所述载体进一步携带背根神经节(drg)特异性miRNA靶序列的至少两个串联重复序列。在某些实施例中，所述载体或包括所述载体的组合物可施用于有需要的受试者以改善雷特综合征的症状和或延迟雷特综合征的进展。

在另外的方面，本文提供了一种包括如本文所述的rAAV或载体和水性悬浮介质的组合物。

在另一方面，提供了一种治疗患有雷特综合征的受试者或改善雷特综合征的症状或延迟雷特综合征的进展的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所述的rAAV或载体。在某些实施例中，所述载体或rAAV可通过小脑延髓池内注射(ICM)施用于患者。在某些实施例中，提供了一种可施用于18岁或更年轻的患有雷特综合征的患者的载体或组合物。在某些实施例中，提供了一种被施用于18岁或更年长的患有雷特综合征的患者的载体或组合物。

通过以下对本发明的详细描述，本发明的这些和其它方面变得显而易见。

附图说明

图1提供了用于产生包括AAV.hSyn.hMECP2co.SV40载体基因组的rAAV的质粒的示意图。此质粒的全核酸序列被示出为SEQ ID NO:1。

图2A到2B提供了用于产生包括AAV.hSyn.hMECP2co.miR183.SV40载体基因组的rAAV的质粒的示意图并显示出hMECP2的成功表达。图2A提供了质粒的示意图，其中此质粒的全核酸序列被示出为SEQ ID NO:6(表达载体SEQ ID NO:15)。图2B提供了蛋白质印迹，其示出当在3周时以5×10¹¹GC/小鼠的IV注射向Mecp2-ko小鼠皮层施用rAAV时，小鼠脑中的MECP2表达不受表达盒中的miR183的影响。

图3提供了用于产生包括AAV.CB7.CI.hMECP2.rBG载体基因组的rAAV的质粒的示意图。此质粒的全核酸序列被示出为SEQ ID NO:4。

图4A到4E示出了hMECP2通过AAV-PHP.B.hSyn-MECP2co载体在Mecp2-ko小鼠中的成功表达。图4A提供了代表性图像，其通过DAPI染色示出了Mecp2-ko小鼠的脑皮层中的细胞核。图4B示出在图4A的相同显微视野中未检测到MECP2蛋白。图4C是图4A和4B的图像的叠加。图4D是示出了野生型小鼠的脑皮层中MECP2表达的代表性图像。图4E是示出了通过AAV-PHP.B.hSyn-MECP2co载体处理的Mecp2-ko小鼠的脑皮层中MECP2表达的代表性图像。更多细节参见实例2。比例尺为100μm。

图5A到5C提供了用3×10¹⁰GC/小鼠、1×10¹¹GC/小鼠、2.5×10¹¹GC/小鼠和5×10¹¹GC/小鼠的AAV-PHP.B.hSyn-MECP2co载体处理的Mecp2-ko小鼠(HEMI或KO)的Kaplan-Meier存活图(图5A)和体重(图5B和5C)。仅用PBS施用的野生型同窝仔畜和Mecp2-ko小鼠用作对照。更多细节参见实例2。

图6A到6F示出了用AAV-PHP.B.hSyn-MECP2co载体处理的Mecp2-ko小鼠(HEMI)中MECP2表达的行为矫正和定量。在适用的情况下，仅用PBS施用的野生型同窝仔畜和Mecp2-ko小鼠用作对照。图6A和图6B分别提供了在旷场测定(Open Field Assay)中测试的行走活动水平和直立活动水平；而图6C和图6D分别提供了在高架零迷宫(Elevated Zero Maze)中测试的在开放区域中花费的时间和进入开放区域的频率(rAAV以1×10¹¹GC/小鼠、2.5×10¹¹GC/小鼠和5×10¹¹GC/小鼠施用)。图6E和图6F示出了从三重染色免疫荧光图像半自动定量并以在不同处理剂量下的MECP2+/NeuN+细胞％的形式绘制的神经元的代表性百分比(图6E，大脑皮层；图6F，海马体)。更多细节参见实例2。

图7A到7C示出了用1×10¹¹GC/小鼠和2.5×10¹¹GC/小鼠的AAV-PHP.B.hSyn-MECP2co载体处理的Mecp2-ko小鼠(HEMI)的行为矫正。在适用的情况下，仅用PBS施用的野生型同窝仔畜和Mecp2-ko小鼠用作对照。图7A提供了使用转棒仪测试的掉落潜伏期，图7B示出了所掩埋珠子数，并且图7C示出了使用Y迷宫测试的自发改变指数。更多细节参见实例2。

图8A到8B提供了在处理后幼年小鼠的背白质的代表性图像以及MECP2相对过表达的印迹。图8A提供了用增加剂量的AAV.hSyn.hMECP2(第1组，3×10⁹GC/小鼠；第2组，1×10¹⁰GC/小鼠；第3组，5×10¹⁰GC/小鼠；第4组，1×10¹¹GC/小鼠；第5组，5×10¹¹GC/小鼠；第6组，1×10¹²GC/小鼠；以及第7组，5×10¹²GC/小鼠)处理的幼年wt小鼠的背白质的LuxolFast染色的代表性图像。图8B提供了在以不同剂量注射AAV载体后WT脑中MECP2的相对过表达的图(从蛋白质印迹定量)。更多细节参见实例2。

图9示出了进行或未进行载体处理的野生型小鼠的海马体的锥体层、脊髓灰质和背根神经节细胞(DRG)中的细胞和MECP2阳性细胞。

图10A到10C提供了针对用1×10¹²GC/小鼠的AAV.hSyn.hMECP2或仅PBS处理的成年wt小鼠在旷场测定中测试的行走活动(图10A)、直立活动(图10B)和使用转棒仪测试的掉落潜伏期(图10C)。更多细节参见实例2。

图11提供了示出在用AAVhu68.MECP载体处理的恒河猴中观察到的背白质束中轴突病变的代表性图像。更多细节参见实例3。

图12示出了测试组中脊髓白质束中髓鞘的轻度到中度损失。更多细节参见实例3。

图13A到13D提供了跨各种组织的载体生物分布。图13A示出了AAVhu68.MeP426.MECP2.RDHl.Stuffer载体的生物分布。图13B示出了AAVhu68.MeP426.MECP2-myc.RDHl.Staffer载体的生物分布。图13C示出了AAVhu68sc.mMeP546.SVI.MeCP2el.SpA载体的生物分布。图13D示出了AAVhu68.CB7.CI.MECP2.rBG载体的生物分布。更多细节参见实例3。

图14示出了在使用抗myc抗体的第2组中hMECP2在脑皮层和脊髓的背根神经节两者中的成功表达。更多细节参见实例3。

图15示出了在使用抗MECP2抗体的第2组和第4组中hMECP2在脑皮层和脊髓的背根神经节两者中的成功表达。更多细节参见实例3。

图16A到16C提供了以不同剂量(图16A，3×10¹³GC/NHP；图16B，1×10¹³GC/NHP；以及图16C，3×10¹²GC/NHP)施用的AAVhu68.hSyn.MECP2co.SV40载体跨各种组织的生物分布。更多细节参见实例3。

图17提供了通过AAVhu68.hSyn.MECP2co.SV40载体实现的跨各种组织的hMECP2的相对表达。更多细节参见实例3。

图18A到18C示出了在具有通过miR183实现的DRG脱靶的情况下非人灵长类动物(NHP)中轴突病变的减少。图18A提供了DRG细胞中MECP2表达的代表性图像(原位杂交，MECP2以红色示出，细胞核以蓝色示出)。图18B(脊髓)和图18C(DRG)提供了具有来自NHP的白质轨迹和DRG的病理学评分的图，所述NHP被注射高剂量的具有或不具有miR183的AAVhu68.hSYN.MECP2co(N＝3/组，组织在3个月后收获)。更多细节参见实例3。

具体实施方式

本文提供了用于治疗雷特综合征的组合物和方法。将有效量的具有AAV衣壳(例如，AAVhu68或AAV-PHP.B)并在所述AAV衣壳中包装有载体基因组的重组腺相关病毒(rAAV)递送到有需要的受试者，所述载体基因组编码功能性人甲基-CpG结合蛋白2(hMECP2)。

I.人甲基-CpG结合蛋白2(hMECP2)

甲基-CpG结合蛋白2(MECP2、MeCP2或MeCp2)是一种与甲基化DNA结合并且然后与其它蛋白(例如，组蛋白脱乙酰酶、辅阻遏物SIN3A或转录因子CREB1)相互作用形成复合物的染色体蛋白，所述复合物关闭基因或充当转录激活剂。人MECP2(hMECP2)蛋白(UniProtKB-P51608，MECP2_HUMAN)的两种同种型已被鉴定：hMECP2同种型A(也称为hMECP2β或hMECP2-e2)(P51608-1，SEQ ID NO:8)和同种型B(也称为hMECP2α或hMECP2-el)(P51608-2，SEQ ID NO:2)。在某些实施例中，当提及人MECP2蛋白时，MECP2和hMECP2可以互换使用。

如本文所使用的，功能性hMECP2蛋白是指MECP2蛋白的同种型、天然变体、变体、多形体或截短体，其与雷特综合征无关和/或其递送或表达可以在动物模型或患者中改善雷特综合征的症状或延迟雷特综合征的进展。参见OMIM#312750(omim.org/entry/312750),genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝MECP2和uniprot.org/uniprot/P51608，所述网页中的每个网页通过引用整体并入本文。在某些实施例中，功能性hMECP2蛋白具有SEQID NO:2的氨基酸序列或与所述氨基酸序列至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hMECP2蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与所述氨基酸序列至少约78％到至少约80％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hMECP2蛋白具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与所述氨基酸序列至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hMECP2蛋白具有NCBI参考序列NP_001303266.1(SEQ ID NO:19)、NP_004983.1(SEQ ID NO:20)或NP_001104262.1(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hMECP2是截短的hMECP2，其包括具有所述序列的甲基-CpG结合结构域(MBD)和NCoR/SMRT相互作用结构域(NID)。参见WO 2018172795A1，其通过引用整体并入本文。

在某些实施例中，功能性hMECP2蛋白在RTT动物模型中改善雷特综合征的症状或延迟雷特综合征的进展。一个例示的RTT动物模型是Mecp2-ko小鼠。在一个实施例中，RTT动物模型是雄性半合子Mecp2-ko小鼠。RTT症状或进展可以使用各种测定/方法进行评估，所述测定/方法包含但不限于生存图(例如，Kaplan-Meier生存图)、监测体重和观察行为变化(例如，通过旷场测定、高架区迷宫(Elevated Zone Maze)、Y迷宫、珠子掩埋测定和转棒仪测定)。在某些实施例中，功能性hMECP2蛋白在RTT动物模型中的施用或表达引起RTT症状的改善或RTT进展的延迟，所述改善或所述延迟通过测定结果为在对应的野生型动物中获得的测定结果的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或超过100％得到证明。在某些实施例中，功能性hMECP2蛋白在RTT动物模型中的施用或表达引起RTT症状的改善或RTT进展的延迟，所述改善或所述延迟通过改善的测定结果得到证明，所述测定结果为从对应的未经处理的RTT动物获得的测定结果的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或超过100％。在实例2中进行了详细说明。

本文提供了编码功能性hMECP2蛋白的核酸序列，称为hMECP2编码序列或MECP2编码序列。在某些实施例中，hMECP2编码序列选自SEQ ID NO:3(称为MECP2或MECP2co)或编码氨基酸序列NP_001104262.1(SEQ ID NO:21)的NCBI参考序列NM_001110792.1(称为MECP2或MECP2el；SEQ ID NO:18)、编码氨基酸序列NP_001303266.1(SEQ ID No:19)的NM_001316337.1(SEQ ID NO:16)、编码氨基酸序列NP_004983.1(SEQ ID NO:20)的NM_004992.3(SEQ ID NO:17)、GQ203295.1、HQ141378.1、GQ203293.1、HM156733.1、GQ203294.1、GQ896382.1、GU479943.1、HM156732.1、HM020402.1、AF158180.1、AJ132917.1、AB209464.1、X89430.1、AK289444.1、BX538060.1、BC011612.1、L37298.1、Y12643.1、X99686.1、AY541280.1、GU812285.1、GU812286.1、HQ141377.1、HQ127345.1、DQ656049.2、HQ154629.1、DQ656051.2、BC031833.1、BI767019.1、HM005664.1、KU178174.1、KU178175.1、KU178176.1、KU178177.1、KU178178.1、KU178179.1、KU178180.1或与其至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的核酸序列。NCBI参考序列中的每个NCBI参考序列通过引用整体并入本文。在某些实施例中，hMECP2编码序列是经修饰或经工程化的(hMECP2或hMECP2co)。经修饰或经工程化的(hMECP2或hMECP2co)与NCBI参考序列具有小于约70％(例如，约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)的同一性。在某些实施例中，hMECP2编码序列是SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)相同的核酸序列。在某些实施例中，与SEQ ID NO:3具有所述同一性的编码序列编码SEQ ID NO:2的氨基酸。在某些实施例中，与SEQ ID NO:3具有所述同一性的编码序列不编码SEQ ID NO:16的蛋白质。在某些实施例中，与SEQ ID NO:3具有所述同一性的核酸序列不编码SEQ ID NO:17的蛋白质。在某些实施例中，与SEQ ID NO:3具有所述同一性的核酸序列不编码SEQ ID NO:18。

在某些实施例中，hMECP2编码序列是SEQ ID NO:18或与SEQ ID NO:18至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)相同的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

在某些实施例中，hMECP2编码序列是SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)相同的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO:19的氨基酸序列。

在某些实施例中，hMECP2编码序列是SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:17至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)相同的核酸序列，所述核酸序列编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列。

如本文所描述的，“核酸”可以是RNA、DNA或其修饰，并且可以是单链或双链的，并且可以选自例如包含以下的组：编码所关注蛋白质的核酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如肽-核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)等。此类核酸序列包含例如但不限于编码例如充当转录阻遏物的蛋白质的核酸序列、反义分子、核酶、小的抑制性核酸序列，例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。

在核酸序列的上下文中，术语“百分比(％)同一性”、“序列同一性”、“百分比序列同一性”或“百分比相同的”是指两个序列中的残基在比对以获得对应性时是相同的。期望序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长、基因编码序列的全长或至少约500到5000个核苷酸的片段。然而，也可能期望较小片段之间的同一性，例如至少约九个核苷酸，通常至少约20到24个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。

可以容易地确定蛋白质全长、多肽、约32个氨基酸、约330个氨基酸或其肽片段或对应核酸序列编码序列上的氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段的长度可以是至少约8个氨基酸并且可以是至多约700个氨基酸。通常，当提及两种不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“类似性”时，参考“比对”序列来确定“同一性”、“同源性”或“类似性”。“比对”序列或“比对”是指与参考序列相比，通常含有对丢失的或另外的碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。

使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序中的任一种进行比对。序列比对程序可供用于氨基酸序列，所述程序例如“Clustal X”、“Clustal Omega”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”以及“Match-Box”程序。通常，以默认设置使用这些程序中的任何程序，但是本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，所述算法或程序提供至少与通过参考算法和程序所提供的一样水平的同一性或比对。参见例如J.D.Thomson等人,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》,“多个序列比对的全面比较(Acomprehensive comparison of multiple sequencealignments)”,27(13):2682-2690(1999)。

多个序列比对程序也可用于核酸序列。此类程序的实例包含“Clustal W”、“Clustal Omega”、“CAP序列组装”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，所述程序可通过因特网上的Web服务器进行访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，也使用了载体NTI实用程序。本领域已知的许多算法可以用于测量核苷酸序列同一性，包含上述程序中包含的那些。作为另一个实例，可以使用GCG 6.1版本的程序Fasta^TM比较多核苷酸序列。Fasta^TM提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以是使用如GCG 6.1版本中所提供的采用其默认参数(字号6和评分矩阵的NOPAM系数)的Fasta^TM所确定的，所述程序通过引用并入本文中。

II.雷特综合征

MECP2基因突变是大多数雷特综合征(一种进行性神经发育病症)病例的原因并且是女性认知障碍的最常见原因之一。具有引起雷特综合征的基因突变的男性会受到毁灭性的影响。他们中的大多数在出生前或婴儿早期死亡。参见例如ninds.nih.gov/Disorders/Patient-Caregiver-Education/Fact-Sheets/Rett-Syndrome-Fact-Sheet和omim.org/entry/312750。

在本文中可互换使用的“患者”或“受试者”意指雄性或雌性哺乳动物，包含人、兽医或农场动物、家畜或宠物以及通常用于临床研究的动物。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是人类患者。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是男性或女性人类。在某些实施例中，这些方法和组合物的受试者被诊断为患有雷特综合征和/或具有雷特综合征的症状。

所述方法和组合物可以用于治疗以下四个雷特综合征阶段中的任何一个：阶段I，称为早发，通常在介于6个月与18个月之间的年龄时开始；阶段II或快速破坏阶段，通常开始于1岁与4岁之间并且可以持续数周或数月；阶段III或停滞或假平稳阶段，通常开始于2岁与10岁之间并且可以持续数年；以及阶段IV或晚期运动退化阶段，可以持续数年或数十年。在某些实施例中，受试者是小于18岁(例如，小于约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月，或小于约1岁、1.5岁、2岁、2.5岁、3岁、3.5岁、4岁、4.5岁、5岁、5.5岁、6岁、6.5岁、7岁、7.5岁、8岁、8.5岁、9岁、9.5岁、10岁、10.5岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁)的人类。另外地或可替代地，受试者是新生儿或超过1个月大(例如，超过约2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月，或大于约1岁、1.5岁、2岁、2.5岁、3岁、3.5岁、4岁、4.5岁、5岁、5.5岁、6岁、6.5岁、7岁、7.5岁、8岁、8.5岁、9岁、9.5岁、10岁、10.5岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁)的人类。在某些实施例中，患者约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月大，或约1岁、1.5岁、2岁、2.5岁、3岁、3.5岁、4岁、4.5岁、5岁、5.5岁、6岁、6.5岁、7岁、7.5岁、8岁、8.5岁、9岁、9.5岁、10岁、10.5岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁。在某些实施例中，患者为幼儿，例如，18个月大到3岁。在某些实施例中，患者为3岁到6岁、3岁到12岁、3岁到18岁、3岁到30岁。在某些实施例中，患者为18岁或更大，或为18岁以上。

雷特综合征的症状可以包含但不限于以下：正常的早期生长和发育，随后发育缓慢；肌肉张力丧失(张力减退)；进食困难和肢体运动痉挛；无法有目的地使用手；独特的手部运动；爬行或行走问题；眼神接触减少；自闭症样行为；用脚趾走路；睡眠问题；步态宽阔；磨牙和咀嚼困难；生长缓慢；癫痫发作；认知障碍和清醒时呼吸困难，如换气过度、呼吸暂停(屏气)和吞咽空气；失用症(无法执行运动功能，包含眼睛凝视和言语)；如坐或爬行等大运动技能的延迟；脑和头部生长缓慢；强迫性的手部运动，如紧握和洗手；行走困难；癫痫发作和智力障碍。

如以上所描述的，除非另外指明，否则术语“增加”、“减少”、“降低”、“减轻”、“改善”、“延迟”或其任何语法变体或指示变化的任何类似术语意指与对应的参考(例如，未经治疗的对照或未患有RTT的处于正常状况的受试者)相比约5倍、约2倍、约1倍、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％的变化。

在某些实施例中，患者接受控制与RTT相关的一些体征和症状的药物，所述体征和症状如癫痫发作、肌肉僵硬或呼吸、睡眠、胃肠道或心脏问题。

任选地，可以对有需要的受试者使用免疫抑制共疗法。用于此类共疗法的免疫抑制剂包含但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢药、T细胞抑制剂、大环内酯类(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物)以及细胞生长抑制剂，包含烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、抗体或对免疫亲和素具有活性的药剂。免疫抑制剂可以包含氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲(nitrosourea)、铂化合物、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、更生霉素(dactinomycin)、蒽环霉素(anthracycline)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、IL-2受体(CD25)或CD3定向抗体、抗IL-2抗体、环孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、阿片类或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施例中，可以在施用基因疗法之前或之后的第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天或更多天开始免疫抑制疗法。此类免疫抑制疗法可以涉及施用一种、两种或更多种药物(例如，糖皮质激素、强的松(prednelisone)、霉酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。可以以相同的剂量或经过调整的剂量向有需要的受试者施用此类免疫抑制药物一次、两次或多次。此类疗法可以涉及在同一天内共施用两种或更多种药物(例如，强的松、霉酚酸酯(MMF)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。可以在基因疗法施用之后以相同的剂量或经过调整的剂量继续使用这些药物中的一种或多种药物。根据需要，此类疗法可以持续约1周(7天)、约60天或更长时间。

在某些实施例中，选择无他克莫司的方案。

III.表达盒

本文提供了也称为表达盒的核酸序列，所述核酸序列包括在调控序列的控制下的hMECP2编码序列，所述调控序列指导hMECP2在靶细胞中的表达。如本文所使用的，“表达盒”是指包括编码序列(例如，hMECP2编码序列)、启动子的核酸分子，并且可以包含用于所述编码序列的其它调控序列。所需的调控序列以允许hMECP2编码序列在靶细胞中转录、翻译和/或表达的方式与所述编码序列可操作地连接。如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包含与hMECP2编码序列邻接的表达控制序列和以反式或在远处起作用以控制hMECP2编码序列的表达控制序列。此类调控序列通常包含例如启动子、增强子、内含子、Kozak序列、聚腺苷酸化序列和TATA信号中的一种或多种。在某些实施例中，启动子是组织特异性启动子，例如，CNS特异性或神经元特异性启动子。在某些实施例中，启动子是人突触蛋白启动子(在本文中也称为hSyn或Syn)。在某些实施例中，另外的或替代性的神经元特异性启动子序列可以选自神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(Andersen等人,(1993)《细胞与分子神经生物学(Cell.Mol.Neurobiol.)》,13:503 15)、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人,(1991)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,88:5611 5)、神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等人,(1995)《神经元(Neuron)》,15:373 84)和/或其它启动子。在某些实施例中，人突触蛋白启动子具有(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:22的nt 213到nt 678)的序列。另外地或可替代地，可以选择具有巨细胞病毒增强子(CB7)启动子的鸡β肌动蛋白启动子。此类CB7启动子可以具有例如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12的nt 198到nt 863的序列。在某些实施例中，可以选择人延伸起始因子1α启动子(EF1a)启动子。此类EFla启动子可以具有例如SEQ ID NO:13的序列。在某些实施例中，用于表达hMECP2的人泛素C(UbC)启动子或MeP426启动子或MEP546启动子。然而，在某些实施例中，可以选择其它启动子或另外的启动子。在某些实施例中，调控序列指导中枢神经系统细胞中的hMECP2表达。

在某些实施例中，靶细胞可以是中枢神经系统细胞。在某些实施例中，靶细胞是兴奋性神经元、抑制性神经元、神经胶质细胞、皮层细胞、前额皮层细胞、大脑皮层细胞、脊髓细胞中的一种或多种。在某些实施例中，靶细胞是外周神经系统(PNS)细胞，例如视网膜细胞。也可以选择除来自神经系统的细胞外的其它细胞作为靶细胞，如单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、骨髓间充质细胞、干细胞、骨髓干细胞、心脏细胞、上皮细胞、食道细胞、胃细胞、胎儿切割细胞、结肠细胞、直肠细胞、肝脏细胞、温和细胞、肺细胞、唾液腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、乳腺细胞、胰腺细胞、胰岛细胞、胆囊细胞、前列腺细胞、膀胱细胞、皮肤细胞、子宫细胞、子宫颈细胞、睾丸细胞或未患有RTT的受试者的表达功能性MECP2蛋白的任何其它细胞。参见genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝MECP2&keywords＝mecp2#expression。

在某些实施例中，另外的或替代性的启动子序列可以作为表达控制序列(调节序列)的一部分包含在内，例如定位在所选5'ITR序列与编码序列之间。可以在本文所描述的载体中利用组成型启动子、可调控启动子[参见例如WO 2011/126808和WO 2013/04943]、组织特异性启动子或对生理学线索有应答的启动子。启动子可以选自不同的来源，例如人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多瘤病毒启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)或神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)潜伏期相关启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子、神经元特异性启动子(NSE)、血小板源性生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑色素浓缩激素(MCH)启动子、CBA、基质金属蛋白启动子(MPP)和鸡β-肌动蛋白启动子。

除了启动子之外，载体可以含有一个或多个其它合适的转录起始序列、转录终止序列、增强子序列、有效的RNA加工信号，如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定胞质mRNA的序列，例如WPRE；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时，增强所编码产物的分泌的序列。合适的增强子的实例是CMV增强子。其它合适的增强子包含适合于所期望的靶组织适应症的增强子。在一个实施例中，调控序列包括一种或多种表达增强子。在一个实施例中，调控序列含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以相同或彼此不同。例如，增强子可以包含CMV立即早期增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。可替代地，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列隔开。在仍另一个实施例中，表达盒进一步含有内含子，例如，鸡β-肌动蛋白内含子。在某些实施例中，内含子是嵌合内含子(CI)-由人β-珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白G(IgG)剪接受体元件组成的杂交内含子。其它合适的内含子包含本领域已知的内含子，例如，如WO 2011/126808中描述的内含子。合适的polyA序列的实例包含例如兔珠蛋白polyA、SV40、SV50、牛生长激素(bGH)、人生长激素和合成polyA。任选地，可以选择一个或多个序列来稳定mRNA。此类序列的实例是经过修饰的WPRE序列，其可以在polyA序列的上游和编码序列的下游被工程化(参见例如MA Zanta-Boussif等人,《基因疗法(Gene Therapy)》(2009)16:605-619)。在某些实施例中，不存在WPRE序列。

IV.miRNA

在某些实施例中，除hMECP2编码序列之外，另一种非AAV编码序列可以包含在内，例如，肽、多肽、蛋白质、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制剂)或所关注的其它基因产物。有用的基因产物可以包含miRNA。miRNA和其它小干扰核酸通过靶信使RNA(mRNA)的靶RNA转录物裂解/降解或翻译抑制来调控基因表达。miRNA是天然表达的，通常作为最终的19-25种非翻译的RNA产物。miRNA通过与靶mRNA的3'非翻译区(UTR)的序列特异性相互作用展现出其活性。这些内源表达的miRNA形成发夹前体，所述发夹前体随后被加工成miRNA双链体，并且被进一步加工成“成熟的”单链miRNA分子。这种成熟的miRNA引导多蛋白复合物miRISC，所述多蛋白复合物基于与成熟的miRNA的互补性来鉴定靶mRNA的靶位点，例如在3'UTR区中。

如本文所使用的，“miRNA靶序列”是定位在DNA正链(5'到3')上的序列，并且至少部分地与miRNA序列互补，所述miRNA序列包含miRNA种子序列。miRNA靶序列对于经过编码的转基因产物的非翻译区是外源的，并且被设计成在期望抑制转基因表达的细胞中被miRNA特异性地靶向。术语“miR183簇靶序列”是指对miR183簇(可替代地被称为家族)的一个或多个成员有应答的靶序列，包含miR-183、miR-96和miR-182(如Dambal,S.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res)》43:7173-7188,2015所描述的，所述文献通过引用并入本文中)。不希望受理论束缚，用于转基因(对基因产物进行编码)的信使RNA(mRNA)存在于递送有含有miRNA的表达盒的细胞类型中，使得miRNA与3'UTR miRNA靶序列的特异性结合导致mRNA沉默和切割，由此减少或消除仅在表达miRNA的细胞中的转基因表达。

通常，miRNA靶序列的长度为至少7个核苷酸到约28个核苷酸、长度为至少8个核苷酸到约28个核苷酸、7个核苷酸到28个核苷酸、8个核苷酸到18个核苷酸、长度为12个核苷酸到28个核苷酸、约20个到约26个核苷酸、约22个核苷酸、约24个核苷酸或约26个核苷酸，并且所述miRNA靶序列含有至少一个与miRNA种子序列互补的连续区(例如，7或8个核苷酸)。在某些实施例中，靶序列包括与miRNA种子序列具有精确互补性(100％)或部分互补性且具有一些错配的序列。在某些实施例中，靶序列包括与miRNA种子序列100％互补的至少7个到8个核苷酸。在某些实施例中，靶序列由与miRNA种子序列100％互补的序列组成。在某些实施例中，靶序列含有与种子序列100％互补的序列的多个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，100％互补性区包括靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，靶序列的剩余部分与miRNA具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，在含有DNA正链的表达盒中，miRNA靶序列是miRNA的反向补体。

在某些实施例中，表达盒mRNA或DNA正链的至少第一和/或至少第二miRNA靶序列的miRNA靶序列选自：(i)AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(miR183，SEQ ID NO:7)；(ii)AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA(miR-96，SEQ ID NO:9)；(iii)AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(miR182，SEQ ID NO:10)。在其它实施例中，选择AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC(SEQ ID NO:11)。

在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为miR-183靶序列的至少一个miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有miR-183靶序列，所述靶序列包含AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(SEQ ID NO:7)，其中与miR-183种子序列互补的序列加下划线。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与miR-183种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-183靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包含与miR-183种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-183靶序列含有与SEQ ID NO:7具有部分互补性的序列，并且因此当与SEQ ID NO:7比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:7比对时，miR-183靶序列包括具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个错配的序列，其中错配可以不连续。在某些实施例中，miR-183靶序列包含具有100％互补性的区，所述区还包括miR-183靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包含与miR-183种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-183靶序列的剩余部分与miR-183具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miR-183靶序列，所述miR-183靶序列包括截短的SEQ ID NO:1，即在SEQ ID NO:1的5'或3'端中的任一端或两端处缺少至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和一个miR-183靶序列。在又其它实施例中，表达盒或载体基因组包括至少两个、三个或四个miR-183靶序列。

在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为miR-182靶序列的至少一个miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有miR-182靶序列，其包含AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO:10)。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与miR-182种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-182靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包含与miR-182种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-182靶序列含有与SEQ ID NO:10具有部分互补性的序列，并且因此当与SEQ ID NO:10比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:10比对时，miR-183靶序列包括具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个错配的序列，其中错配可以不连续。在某些实施例中，miR-182靶序列包含具有100％互补性的区，所述区还包括miR-182靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包含与miR-182种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-182靶序列的剩余部分与miR-182具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miR-182靶序列，所述miR-182靶序列包括截短的SEQID NO:10，即在SEQ ID NO:10的5'或3'端中的任一端或两端处缺少至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和一个miR-182靶序列。在又其它实施例中，表达盒或载体基因组包括至少两个、三个或四个miR-182靶序列。

本文所使用的术语“串联重复序列”是指存在两个或更多个连续的miRNA靶序列。这些miRNA靶序列可以是连续的，即一个接一个地直接定位，使得一个靶序列的3'端直接位于下一个靶序列的5'端的上游，没有中间序列，或者反之亦然。在另一个实施例中，miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由短间隔子序列隔开。

如本文所使用的，“间隔子”是任何所选核酸序列，例如，长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的定位在两个或更多个连续miRNA靶序列之间的核酸序列。在某些实施例中，间隔子的长度为1个到8个核苷酸、长度为2个到7个核苷酸、长度为3个到6个核苷酸、长度为四个核苷酸、4个到9个核苷酸、3个到7个核苷酸或更大的值。合适地，间隔子是非编码序列。在某些实施例中，间隔子可以具有四(4)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是GGAT。在某些实施例中，间隔子是六(6)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是CACGTG或GCATGC。

在某些实施例中，串联重复序列含有相同的miRNA靶序列中的两个、三个、四个或更多个。在某些实施例中，串联重复序列含有至少两个不同的miRNA靶序列、至少三个不同的miRNA靶序列或至少四个不同的miRNA靶序列等。在某些实施例中，串联重复序列可以含有相同的miRNA靶序列中的两个或三个以及不同的第四miRNA靶序列。

在某些实施例中，表达盒中可以有至少两组不同的串联重复序列。例如，3'UTR可以含有紧邻转基因下游的串联重复序列、UTR序列和两个或更多个更接近UTR的3'端的串联重复序列。在另一个实例中，5'UTR可以含有一个、两个或更多个miRNA靶序列。在另一个实例中，3'可以含有串联重复序列，并且5'UTR可以含有至少一个miRNA靶序列。

在某些实施例中，表达盒含有两个、三个、四个或更多个串联重复序列，所述串联重复序列在转基因的终止密码子的约0个到20个核苷酸内开始。在其它实施例中，表达盒含有距转基因的终止密码子至少100个到约4000个核苷酸的miRNA串联重复序列。

参见2019年12月20日提交的PCT/US19/67872，其通过引用并入本文并且要求于2018年12月21日提交的美国临时美国专利申请第62/783,956号的优先权，所述申请通过引用特此并入。

在某些实施例中，载体基因组进一步包括背根神经节(drg)特异性miRNA靶序列的至少一个、至少两个、至少三个或优选地至少四个串联重复序列。靶miRNA序列可以选自SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11。在某些实施例中，载体基因组具有SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:23)的核苷酸(nt)1到nt 2728、SEQ ID NO:6(或SEQ ID NO:15)的nt 1到nt 2802和/或SEQ ID NO:4(或SEQ ID NO:24)的nt 1到nt 3949的序列或与其至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的核酸序列，所述载体基因组进一步包括至少一个、至少两个、至少三个和或至少四个miRNAdrg脱靶序列。在某些实施例中，载体基因组包括SEQ ID NO:3的序列或与所述序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％到至少100％相同的序列，所述载体基因组进一步包括至少一个、至少两个、至少三个和或至少4个miRNA drg脱靶序列。靶miRNA序列可以选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11。

V.rAAV

本文提供了可用于治疗雷特综合征的重组腺相关病毒(rAAV)。所述rAAV包括：(a)AAV衣壳；以及(b)包装在(a)的AAV衣壳中的载体基因组。合适地，所选AAV衣壳靶向待处理的细胞。在某些实施例中，衣壳来自进化枝F。然而，在某些实施例中，可以选择另一种AAV衣壳源。载体基因组包括反向末端重复序列(ITR)和核酸序列，所述核酸序列在调控序列的控制下编码功能性人甲基-CpG结合蛋白2(hMECP2)，所述调控序列指导hMECP2表达。在某些实施例中，hMECP2编码序列与SEQ ID NO:3至少约95％相同。在某些实施例中，hMECP编码序列与hMECP转录物变体1到3(NM_001316337.1(SEQ ID NO:16)、NM_004992.3(SEQ ID NO:17)和NM_001110792.1(SEQ ID NO:18))中的任一种的同一性小于80％。在某些实施例中，功能性hMECP2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些实施例中，调控序列指导中枢神经系统细胞中的hMECP2表达。在某些实施例中，调控序列包括CNS特异性启动子，例如人突触蛋白启动子(hSyn)，或组成型启动子，例如CB7。在某些实施例中，调控元件包括Kozak序列、聚腺苷酸化序列、内含子、增强子和TATA信号中的一种或多种。在某些实施例中，载体基因组是SEQID NO:1的nt 1到nt 2728、或SEQ ID NO:4的nt 1到nt 3949、或SEQ ID NO:6的nt 1到nt2802、或与其至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的核酸序列。在某些实施例中，载体基因组进一步包括本文所述的背根神经节(drg)-脱靶miRNA靶序列。

在某些实施例中，进化枝F AAV衣壳选自AAVhu68衣壳、AAV9衣壳、AAVhu32衣壳或AAVhu31衣壳。编码合适衣壳的核酸序列可以用于产生携带所述载体基因组的AAV.hMECP2重组AAV(rAAV)。在WO 2018/160582和US 2015/0079038中提供了与AAVhu68相关的另外的细节，所述文献中的每个文献通过引用整体并入本文。本文所述的进化枝F载体非常适合将包括hMECP2编码序列的载体基因组递送到中枢神经系统内的细胞，所述中枢神经系统包含脑、海马体、运动皮层、小脑和运动神经元。这些载体可以用于靶向中枢神经系统(CNS)内的其它细胞以及CNS外的某些其它组织和细胞。在其它实施例中，可以选择进化枝A衣壳(例如，AAV1)。仍然可以选择其它AAV或其它细小病毒衣壳。

在某些实施例中，用于本文描述的组合物和方法的AAV衣壳是基于靶细胞来选择的。在某些实施例中，AAV衣壳转导CNS细胞和/或PNS细胞。在某些实施例中，AAV衣壳选自cy02衣壳、rh43衣壳、AAV8衣壳、rh01衣壳、AAV9衣壳、rh8衣壳、rh10衣壳、bb01衣壳、hu37衣壳、rh02衣壳、rh20衣壳、rh39衣壳、rh64衣壳、AAV6衣壳、AAV1衣壳、hu44衣壳、hu48衣壳、cy05衣壳、hu11衣壳、hu32衣壳、pi2衣壳或其变体。在某些实施例中，AAV衣壳是进化枝F衣壳，如AAV9衣壳、AAVhu68衣壳、AAV-PHP.B衣壳、hu31衣壳、hu32衣壳或其变体。参见例如于2015年4月14日公布的WO 2005/033321、WO 2018/160582和US 2015/0079038，所述文献中的每个文献通过引用整体并入本文。在某些实施例中，AAV衣壳是非进化枝F衣壳，例如进化枝A、B、C、D或E衣壳。在某些实施例中，非进化枝F衣壳是AAV1或其变体。在某些实施例中，AAV衣壳转导神经系统细胞以外的靶细胞。在某些实施例中，AAV衣壳是进化枝A衣壳(例如，AAV1、AAV6)、进化枝B衣壳(例如，AAV2)、进化枝C衣壳(例如，hu53)、进化枝D衣壳(例如，AAV7)或进化枝E衣壳(例如，rh10)。仍然可以选择其它AAV衣壳。

如本文所使用的，与AAV的组有关的术语“进化枝”是指如基于对AAV vp1氨基酸序列进行的比对，通过(至少1000个复制品的)至少75％的自举值(bootstrap value)和不大于0.05的泊松校正距离测量结果(Poisson correction distance measurement)使用邻接算法(Neighbor-Joining algorithm)确定的一组在系统发育上彼此相关的AAV。在文献中已经描述了邻接算法。参见例如M.Nei和S.Kumar,《分子进化和系统发育学(MolecularEvolution and Phylogenetics)》(牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(New York)(2000))。提供了可以用于实施此算法的可用计算机程序。例如，MEGA v2.1程序实施了经修改的Nei-Gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及AAV vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选AAV是含在本文所鉴定的进化枝之一中，还是在这些进化枝之外的另一个进化枝中。参见例如G Gao等人,《病毒学杂志(J Virol)》,2004年6月；78(10):6381-6388，所述文献鉴定进化枝A、B、C、D、E和F，并提供新颖AAV的核酸序列，GenBank登录号AY530553到AY530629。还参见WO 2005/033321。

如上文所指出的，提供了具有靶向期望细胞的AAV衣壳和载体基因组的rAAV，所述载体基因组至少包括将载体基因组包装到衣壳中所需的AAV ITR、hMECP2编码序列和指导其表达的调控序列。在某些实施例中，载体基因组是单链AAV载体基因组。在某些实施例中，可以在本发明中利用含有自身互补(sc)AAV载体基因组的rAAV载体。

载体的AAV序列通常包括顺式作用的5'和3'反向末端重复(ITR)序列(参见例如B.J.Carter,《细小病毒手册(Handbook of Parvoviruses)》,P.Tijsser编辑,CRC出版社(CRC Press),第155到168页(1990))。ITR序列的长度为约145碱基对(bp)。优选地，基本上对ITR进行编码的整个序列用于分子中，但是对这些序列进行一定程度的微小修饰是可允许的。修饰这些ITR序列的能力在本领域的技术范围内。(参见例如文本，如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning.A Laboratory Manual)》,第2版,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),纽约(1989)；以及K.Fisher等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》,70:520 532(1996))。在本发明中采用的这种分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选转基因序列和相关的调控元件侧接有5'和3'AAV ITR序列。在一个实施例中，ITR来自与供应衣壳的AAV不同的AAV。在一个实施例中，ITR序列来自AAV2。已经描述了被称为ΔITR的5'ITR的缩短版本，其中缺失了D序列和末端解析位点(trs)。在其它实施例中，使用了全长AAV 5'和3'ITR。然而，可以选择来自其它AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一种AAV来源的情况下，所得载体可以被称为假型。然而，这些元件的其它构型可以是合适的。

在某些实施例中，构建了包括5'AAV ITR-启动子-任选的增强子-任选的内含子-hMECP2编码序列-polyA-3'ITR的载体基因组。在某些实施例中，增强子可以定位于hMECP2编码序列的下游。在某些实施例中，载体基因组进一步包括drg脱靶序列，如本文所述的miR183或miR182。在某些实施例中，此类drg脱靶序列的两个、三个、四个或更多个拷贝可以存在于本说明书中描述的载体基因组中(例如，在hMECP2终止密码子与polyA之间的3'非翻译区(UTR)中)。在某些实施例中，rAAV是单链AAV。在某些实施例中，rAAV是自身互补AAV。在某些实施例中，ITR来自AAV2。在某些实施例中，存在多于一种启动子。在某些实施例中，启动子是突触蛋白(hSyn)。在某些实施例中，启动子是CB7。在某些实施例中，启动子是神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子。在某些实施例中，启动子是神经丝轻链基因启动子。在某些实施例中，启动子是神经元特异性vgf基因启动子。在某些实施例中，增强子存在于载体基因组中。在某些实施例中，存在多于一种增强子。在某些实施例中，内含子存在于载体基因组中。在某些实施例中，存在增强子和内含子。在某些实施例中，内含子是嵌合内含子(CI)-由人β-珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白G(IgG)剪接受体元件组成的杂交内含子。在某些实施例中，polyA是SV40 polyA(即，源自猿猴病毒40(SV40)晚期基因的聚腺苷酸化(PolyA)信号)。在某些实施例中，polyA是兔β-珠蛋白(RBG)polyA。在某些实施例中，载体基因组包括5'AAVITR-hSyn启动子-hMECP2编码序列-polyA-3'ITR。在某些实施例中，载体基因组包括5'AAVITR-CB7启动子-hMECP2编码序列-RBG polyA-3'ITR。在某些实施例中，增强子可以定位于hMECP2编码序列的下游。在某些实施例中，载体基因组进一步包括drg脱靶序列，如本文所述的miR183或miR182。在某些实施例中，此类drg脱靶序列的两个、三个、四个或更多个拷贝可以存在于本说明书中描述的载体基因组中(例如，在hMECP2终止密码子与polyA之间的3'非翻译区(UTR)中)。在某些实施例中，rAAV是单链AAV。在某些实施例中，rAAV是自身互补AAV。

如本文所使用的，载体基因组或包括载体基因组的rAAV在本文中被展示为AAV 5'ITR-启动子(任选)-Kozak(任选)-内含子(任选)-MECP2编码序列(例如，hMECP2、hMECP2co、MECP2、MECP2co)-miRNA(任选0-4+)-polyA(任选)-填充片段(任选)-AAV 3'ITR。在某些实施例中，rAAV在本文中被展示为AAV 5'ITR-启动子(任选)-Kozak(任选)-内含子(任选)-MECP2编码序列-miRNA(任选0-4+)-polyA(任选)-填充片段(任选)-AAV 3'ITR。

另外，本文提供了一种可用于产生如本文所述的rAAV的rAAV产生系统。所述产生系统包括细胞培养物，所述细胞培养物包括：(a)编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；(b)载体基因组；以及(c)足以允许将载体基因组包装到AAV衣壳中的AAV rep功能和辅助功能。在某些实施例中，载体基因组是SEQ ID NO:1的nt 1到nt 2728、或SEQ ID NO:4的nt 1到nt 3949、或SEQ ID NO:6的nt 1到nt 2802。在某些实施例中，细胞培养物是人胚肾293细胞培养物。在某些实施例中，AAV rep来自不同的AAV。在某些实施例中，其中AAV rep来自AAV2。在某些实施例中，AAV rep编码序列和cap基因在同一核酸分子上，其中rep序列与cap基因之间任选地存在间隔子。在某些实施例中，间隔子是atgacttaaaccaggt(SEQ ID NO:14)。

供产生AAV病毒载体(例如，重组(r)AAV)之用，载体基因组可以携带在递送到包装宿主细胞的任何合适的载体(例如，质粒)上。可在本发明使用的质粒可以被工程化，使得其适合于在原核细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及其它细胞中进行体外复制和包装。合适的转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可以由本领域的技术人员容易地设计。

用于产生和分离适合于用作载体的AAV的方法是本领域已知的。通常参见例如Grieger和Samulski,2005,腺相关病毒作为基因疗法载体：载体开发、产生和临床应用(Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vector development,production and clinical applications),《生化工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.)》99:119-145；Buning等人,2008,腺相关病毒载体技术的最新开发(Recent developments in adeno-associated virus vector technology),《基因医学杂志(J.Gene Med.)》10:717-733；以及下文引用的参考文献，这些参考文献中的每个参考文献通过引用整体并入本文中。为了将基因包装到病毒粒子中，ITR是在与含有基因的核酸分子相同的构建体中需要的顺式的唯一AAV组分。cap和rep基因可以反式供应。

在一个实施例中，所选基因元件可以通过任何合适的方法递送到AAV包装细胞，所述方法包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的粒料、病毒感染和原生质体融合。也可以制备稳定的AAV包装细胞。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如《分子克隆：实验室手册》,由Green和Sambrook编辑,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),冷泉港,纽约(2012)。

术语“AAV中间体”或“AAV载体中间体”是指缺少包装在其中的所期望的基因组序列的组装的rAAV衣壳。这些也可以被称为“空”衣壳。此类衣壳可以不含有表达盒的可检测基因组序列，或者含有不足以实现基因产物的表达的仅部分包装的基因组序列。这些空衣壳是无功能的以将所关注的基因转移到宿主细胞。

可以使用已知的技术产生本文所描述的重组腺相关病毒(AAV)。参见例如WO2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此类方法涉及培养宿主细胞，所述宿主细胞含有对AAV衣壳蛋白进行编码的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因构成的表达盒；以及足够的辅助功能以允许将表达盒包装到AAV衣壳蛋白中。已经描述了产生衣壳的方法、其编码序列以及用于产生rAAV病毒载体的方法。参见例如Gao等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》100(10),6081-6086(2003)和US 2013/0045186A1。

在一个实施例中，提供了一种可用于产生重组AAV的产生细胞培养物。此类细胞培养物含有在宿主细胞中表达AAV衣壳蛋白的核酸；适合包装到AAV衣壳中的核酸分子，例如含有AAV ITR和对与调控序列可操作地连接的基因进行编码的非AAV核酸序列的载体基因组，所述调控序列指导所述基因在宿主细胞中的表达；以及足以允许将载体基因组包装到重组AAV衣壳中的AAV rep功能和腺病毒辅助功能。在一个实施例中，细胞培养物由哺乳动物细胞(例如，人胚肾293细胞以及其它细胞)或昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9)细胞)构成。在某些实施例中，杆状病毒提供了将载体基因组包装到重组AAV衣壳中所必需的辅助功能。

任选地，rep功能由交叉补充衣壳的AAV提供。在某些实施例中，rep功能的至少一部分来自AAVhu68B。在另一个实施例中，rep蛋白是AAVhu68rep以外的异源rep蛋白，例如但不限于AAV1 rep蛋白、AAV2 rep蛋白、AAV3 rep蛋白、AAV4 rep蛋白、AAV5 rep蛋白、AAV6rep蛋白、AAV7 rep蛋白、AAV8 rep蛋白；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78和rep40/52；或其片段；或另一种来源。这些AAVhu68或突变AAV衣壳序列中的任一种都可以处于指导其在宿主细胞中的表达的外源性调控序列的控制下。

在一个实施例中，在合适的细胞培养物(例如，HEK 293或Sf9)或悬浮液中制造细胞。用于制造本文所描述的基因疗法载体的方法包含本领域众所周知的方法，如产生用于产生基因疗法载体的质粒DNA、产生载体以及纯化载体。在一些实施例中，基因疗法载体是AAV载体，并且所产生的质粒是对AAV载体基因组和所关注的基因进行编码的AAV顺式质粒、含有AAV rep和cap基因的AAV反式质粒以及腺病毒辅助质粒。载体产生过程可以包含方法步骤，如开始细胞培养、进行细胞传代、接种细胞、用质粒DNA转染细胞、将转染后培养基交换为无血清培养基以及收获含载体的细胞和培养基。所收获的含载体的细胞和培养基在本文中被称为粗细胞收获物。在又另一种系统中，通过用基于杆状病毒的载体进行感染来将基因疗法载体引入到昆虫细胞中。关于这些产生系统的综述，通常参见例如Zhang等人,2009,用于大规模重组腺相关病毒产生的腺病毒-腺相关病毒杂交体(Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virusproduction),《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》20:922-929，这些参考文献中的每个参考文献的内容通过引用整体并入本文中。在以下美国专利中也描述了制备和使用这些及其它AAV产生系统的方法，这些美国专利中的每个美国专利的内容通过引用整体并入本文中：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。

此后，粗细胞收获物可以是本主题的方法步骤，如浓缩载体收获物、渗滤载体收获物、微流化载体收获物、核酸酶消化载体收获物、过滤经微流化的中间体、通过色谱粗纯化、通过超速离心法粗纯化、通过切向流过滤进行缓冲液交换和/或调配和过滤以制备大量载体。

在高盐浓度下进行两步亲和色谱纯化，然后使用阴离子交换树脂色谱来纯化载体药物产物并去除空衣壳。这些方法在于2016年12月9日提交的WO 2017/160360、国际专利申请第PCT/US2016/065970号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,071号以及于2015年12月11日提交并题为“AAV9的可分级纯化方法(ScalablePurification Method for AAV9)”的第62/226,357号中更详细地描述，这些申请通过引用并入本文中。

为了计算空颗粒和满颗粒的含量，将所选样品(例如，在本文的实例中经过碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化的制剂，其中基因组拷贝(GC)数＝颗粒数)的VP3带体积相对于加载的GC颗粒进行作图。所得线性等式(y＝mx+c)用于计算测试制品峰的带状体积中的颗粒的数量。然后将加载的每20μL颗粒数量(pt)乘以50，以得到颗粒(pt)/mL。将pt/mL除以GC/mL得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/GC)。pt/mL-GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL并且×100得到空颗粒的百分比。

通常，用于测定具有包装的基因组的空衣壳和AAV载体颗粒的方法是本领域已知的。参见例如Grimm等人,《基因疗法》(1999)6:1322-1330；Sommer等人,《分子疗法(Molec.Ther.)》(2003)7:122-128。为了测试变性的衣壳，所述方法包含使经处理的AAV原液经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如含有含3-8％Tris-乙酸盐的缓冲液的梯度凝胶)，然后运行凝胶直到分离出样品材料，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选地尼龙)上。然后，将抗AAV衣壳抗体用作与变性的衣壳蛋白结合的初级抗体，优选地抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选地B1抗AAV2单克隆抗体(Wobus等人,《病毒学杂志》(2000)74:9281-9293)。然后使用次级抗体，所述次级抗体与初级抗体结合并且含有一种用于检测与初级抗体的结合的装置，更优选地是含有与其共价结合的检测分子的抗IgG抗体，最优选地是与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。一种用于检测结合的方法用于半定量地确定初级抗体与次级抗体之间的结合，优选地是能够检测放射性同位素发射、电磁辐射、比色变化的检测方法，或最优选地是化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可以从柱级分中提取样品并在含有还原剂(例如，DTT)的SDS-PAGE上样缓冲液中加热，并且在预制的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，Novex)上解析衣壳蛋白。可以根据制造商的说明使用SilverXpress(加利福尼亚州英杰公司(Invitrogen,CA))或其它合适的染色方法(即SYPRO红宝石色或考马斯染色)进行银染色。在一个实施例中，可以通过定量实时PCR(Q-PCR)测量柱级分中的AAV载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用DNase I(或另一种合适的核酸酶)消化以去除外源DNA。在核酸酶失活后，使用引物和对引物之间的DNA序列具有特异性的TaqMan^TM荧光探针进一步稀释和扩增样品。在Applied BiosystemsPrism 7700序列检测系统上测量每种样品达到定义的荧光水平所需的周期的数量(阈值周期，Ct)。含有与AAV载体中所含序列相同的序列的质粒DNA用于在Q-PCR反应中产生标准曲线。从样品获得的周期阈值(Ct)的值用于通过相对于质粒标准曲线的Ct值对其进行归一化来确定载体基因组效价。也可以使用基于数字PCR的端点测定。

在一方面，使用了经过优化的q-PCR方法，所述方法利用了广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可从凯杰公司(Qiagen)商购获得)。更具体地，经过优化的qPCR基因组效价测定与标准测定类似，不同之处在于在DNase I消化之后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K处理，然后进行热失活。合适地，以等于样品大小的量用蛋白酶K缓冲液稀释样品。蛋白酶K缓冲液可以浓缩2倍或更多倍。通常，蛋白酶K处理为约0.2mg/mL，但是可以在0.1g/mL到约1mg/mL之间变化。处理步骤通常在约55℃下进行持续约15分钟，但是可以在较低温度(例如，约37℃到约50℃)下进行持续较长的时间段(例如，约20分钟到约30分钟)，或者在较高的温度(例如，至多约60℃)下进行持续较短的时间段(例如，约5到10分钟)。类似地，热失活通常在约95℃下持续约15分钟，但是温度可以降低(例如，约70℃到约90℃)并且时间延长(例如，约20分钟到约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)，并如标准测定中所描述的进行TaqMan分析。

另外地或可替代地，可以使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已经描述了用于通过ddPCR确定单链和自身互补AAV载体基因组效价的方法。参见例如M.Lock等人,《人类基因疗法方法(Hu Gene Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods)》.2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.电子出版2014年2月14日。

简而言之，用于从基因组缺陷型AAVhu68中间体中分离具有包装的基因组序列的rAAVhu68颗粒的方法涉及使包括重组AAVhu68病毒颗粒和AAVhu68衣壳中间体的悬浮液经受高效液相色谱，其中AAVhu68病毒颗粒和AAVhu68中间体与在约10.2的pH下平衡的强阴离子交换树脂结合，并经受盐梯度，同时监测洗脱液在约260纳米(nm)和约280nm下的紫外线吸光度。尽管对于rAAVhu68不是最佳的，但是pH的范围可以为约10.0到10.4。在此方法中，当A260/A280的比率达到拐点时，从洗脱的级分中收集AAVhu68完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，可以将经渗滤的产物应用于有效捕获AAV2/hu68血清型的CaptureSelect^TM Poros-AAV2/9亲和树脂(生命科技公司(Life Technologies))。在这些离子条件下，显著百分比的残留的细胞DNA和蛋白质流过柱，而AAV颗粒则被有效捕获。

将rAAV.hMECP2悬浮在合适的生理相容性组合物(例如，缓冲盐水)中。可以将此组合物冷冻储存，随后解冻，并任选地用合适的稀释剂稀释。可替代地，可以将载体制备为适于递送到患者而无需进行冷冻和解冻步骤的组合物。

如本文所使用的，术语“NAb效价”是产生多少中和抗体(例如，抗AAV Nab)的量度，所述中和抗体中和其靶向的表位(例如，AAV)的生理作用。抗AAV NAb效价可以如在例如Calcedo,R等人,针对腺相关病毒的中和抗体的世界范围的流行病(WorldwideEpidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses).《传染病杂志(Journal of Infectious Diseases)》,2009.199(3)；第381-390页中所描述的那样进行测量，其通过引用并入本文中。

缩写“sc”是指自身互补。“自身互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列所携带的编码区已经被设计成形成分子内双链DNA模板的构建体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见例如D M McCarty等人,“自身互补重组腺相关病毒(scAAV)载体独立于DNA合成而促进高效转导(Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectorspromote efficient transduction independently of DNA synthesis)”,《基因疗法》,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。在以下中描述了自身互补AAV：例如美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；和第7,456,683号，所述美国专利中的每个美国专利通过引用整体并入本文中。

“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有所关注的基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，其不能产生子代病毒粒子，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有所关注的基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。

在许多情况下，rAAV颗粒被称为DNase抗性的。然而，除此核酸内切酶(DNase)之外，其它核酸内切酶和核酸外切酶也可以用于本文所描述的纯化步骤中，以去除污染性核酸。可以选择此类核酸酶以降解单链DNA和/或双链DNA以及RNA。此类步骤可以含有单个核酸酶或针对不同靶标的核酸酶的混合物，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。

术语“抗核酸酶”表示AAV衣壳已经在表达盒周围完全组装，所述表达盒被设计成将基因递送到宿主细胞并保护这些包装的基因组序列在被设计成去除产生过程中可能存在的污染性核酸的核酸酶温育步骤期间免于降解(消化)。

VI.其它载体

本文提供包括如本文所述的表达盒的载体。在某些实施例中，表达盒包括在调控序列的控制下编码功能性人甲基-CpG结合蛋白2(hMECP2)的核酸序列，所述调控序列指导hMECP2表达。在某些实施例中，hMECP2编码序列编码

的hMECP序列，与SEQ ID NO:3至少约95％相同并编码蛋白质。

在某些实施例中，载体是选自重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺病毒的病毒载体；或选自裸DNA、裸RNA、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物的非病毒载体。所选载体可以通过任何合适的方法递送，所述方法包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的粒料、病毒感染和原生质体融合。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如Sambrook等人《分子克隆：实验室手册》,冷泉港出版社,冷泉港,纽约。

“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有所关注的基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，其不能产生子代病毒粒子，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有所关注的转基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。此类复制缺陷型病毒可以是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒(整合或非整合)或其它合适的病毒来源。

VII.组合物

本文提供了一种包括如本文所述的rAAV或载体和水性悬浮介质的组合物。在某些实施例中，悬浮液被调配用于静脉内递送、鞘内施用或脑室内施用。

本文提供了一种组合物，所述组合物含有至少一种rAAV原液和任选的载体、赋形剂和/或防腐剂。rAAV原液是指多个rAAV载体，所述多个rAAV载体的量与例如在下文关于浓度和剂量单位的讨论中描述的量相同。

如本文所使用的，“载体”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶质物等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。补充性活性成分也可以并入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。递送媒剂(如脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)可以用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞中。具体地，rAAV载体递送的载体基因组可以被调配成用于递送或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。

在一个实施例中，组合物包含适合于递送到受试者的最终调配物，所述组合物是例如缓冲到生理上相容的pH和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，调配物中存在一种或多种表面活性剂。在另一个实施例中，可以将组合物作为稀释以施用于受试者的浓缩物运输。在其它实施例中，可以在施用时将组合物冻干并重构。

可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如

F68[BASF]，也被称为泊洛沙姆(Poloxamer)188，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字×100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字×10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。在一个实施例中，表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％(按重量比计，w/w％)的量存在。在另一个实施例中，表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％(按体积比计，w/w％)的量存在。在又另一个实施例中，表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在，其中n％表示每100mL悬浮液n克。

在另一个实施例中，组合物包含载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。鉴于转移病毒所针对的适应症，本领域的技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包含盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起调配。其它示例性载体包含无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲液/载体应包含防止rAAV粘附到输注管道上但不干扰rAAV体内结合活性的组分。可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如泊洛沙姆188(也以商品名

F68[BASF]、

F68、

F68、

P188已知)，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字×100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字×10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在。

在某些实施例中，含有rAAV.hMECP2的组合物以在6.8到8、或7.2到7.8、或7.5到8的范围内的pH递送。对于鞘内递送，可能期望pH高于7.5，例如，7.5到8、或7.8。

在某些实施例中，调配物可以含有不包括碳酸氢钠的缓冲盐水溶液。此类调配物可以含有缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括水中的磷酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁以及其混合物中的一种或多种，如哈佛缓冲液(Harvard's buffer)。水溶液可以进一步含有

P188，即可从巴斯夫(BASF)商购获得的泊洛沙姆，其先前以商品名

F68出售。水溶液的pH可以为7.2。

在另一个实施例中，调配物可以含有缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括1mM磷酸钠(Na₃PO₄)、150mM氯化钠(NaCl)、3mM氯化钾(KCl)、1.4mM氯化钙(CaCl₂)、0.8mM氯化镁(MgCl₂)和0.001％泊洛沙姆(例如，

)188，pH 7.2。参见例如harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。在某些实施例中，哈佛缓冲液是优选的，因为在使用哈佛缓冲液的情况下观察到更好的pH稳定性。

在某些实施例中，调配物缓冲液是具有Pluronic F68的人工CSF。在其它实施例中，调配物可以含有一种或多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的实例可以包含例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。

任选地，除了rAAV和载体之外，本发明的组合物还可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包含明胶和白蛋白。

根据本发明的组合物可以包括药学上可接受的载体，如上文所定义的。合适地，本文所描述的组合物包括有效量的一种或多种AAV，所述一种或多种AAV悬浮于药学上合适的载体中和/或与合适的赋形剂混合，所述合适的赋形剂被设计成通过注射、渗透泵、鞘内导管递送到受试者或通过另一种装置或途径递送。在一个实例中，组合物被调配用于鞘内递送。在一个实例中，组合物被调配用于静脉内(iv)递送。

VIII.方法

本文提供了一种治疗雷特综合征的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所述的rAAV或载体。

在某些实施例中，本文的“有效量”是实现RTT症状改善和/或RTT进展延迟的量。

以足够的量施用载体以转染细胞并提供足够水平的基因转移和表达，以便提供治疗益处，而不会产生过度的副作用或具有医学上可接受的生理作用，这可以由医学领域的技术人员确定。常规和药学上可接受的施用途径包含但不限于直接递送到所期望的器官(例如，脑、CSF、肝脏(任选地通过肝动脉)、肺、心脏、眼睛、肾脏)、口服、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、实质内、脑室内、鞘内、ICM、腰椎穿刺和其它肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。

病毒载体(例如，rAAV)的剂量将主要取决于如所治疗的病状、患者的年龄、体重和健康状况等因素，并且因此在患者之间可能有所不同。例如，病毒载体的治疗有效人剂量通常在约25到约1000微升到约100mL溶液范围内，所述溶液含有的浓度为约1×10⁹个到1×10¹⁶个载体基因组拷贝。在某些实施例中，递送体积为约1mL到约15mL、或约2.5mL到约10mL或约5mL的悬浮液。在某些实施例中，递送体积为约1mL、约2mL、约3mL、约4mL、约5mL、约6mL、约7mL、约8mL、约9mL、约10mL、约11mL、约12mL、约13mL、约14mL或约15mL的悬浮液。在某些实施例中，以此体积施用总计约8.9×10¹²到2.7×10¹⁴GC的剂量。在某些实施例中，以此体积施用约1.1×10¹⁰GC/g脑质量到约3.3×10¹¹GC/g脑质量的剂量。在某些实施例中，以此体积施用以下剂量：约3.0×10⁹、约4.0×10⁹、约5.0×10⁹、约6.0×10⁹、约7.0×10⁹、约8.0×10⁹、约9.0×10⁹、约1.0×10¹⁰、约1.1×10¹⁰、约1.5×10¹⁰、约2.0×10¹⁰、约2.5×10¹⁰、约3.0×10¹⁰、约3.3×10¹⁰、约3.5×10¹⁰、约4.0×10¹⁰、约4.5×10¹⁰、约5.0×10¹⁰、约5.5×10¹⁰、约6.0×10¹⁰、约6.5×10¹⁰、约7.0×10¹⁰、约7.5×10¹⁰、约8.0×10¹⁰、约8.5×10¹⁰、约9.0×10¹⁰、约9.5×10¹⁰、约1.0×10¹¹、约1.1×10¹¹、约1.5×10¹¹、约2.0×10¹¹、约2.5×10¹¹、约3.0×10¹¹、约3.3×10¹¹、约3.5×10¹¹、约4.0×10¹¹、约4.5×10¹¹、约5.0×10¹¹、约5.5×10¹¹、约6.0×10¹¹、约6.5×10¹¹、约7.0×10¹¹、约7.5×10¹¹、约8.0×10¹¹、约8.5×10¹¹、约9.0×10¹¹GC每克脑质量。

调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。可以监测转基因产物的表达水平以确定所得病毒载体的剂量频率，优选地含有迷你基因的AAV载体。任选地，与出于治疗目的描述的剂量方案类似的剂量方案可以用于使用本发明的组合物进行免疫。

可以以剂量单位调配复制缺陷型病毒组合物，以使含有的复制缺陷型病毒的量在约1.0×10⁹GC到约1.0×10¹⁶GC的范围内(以治疗受试者)，包含所述范围内的所有整数或分数量，并且对于人类患者而言，优选地为1.0×10¹²GC到1.0×10¹⁴GC。在一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹或9×10⁹GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹¹、2×10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹或9×10¹¹GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²或9×10¹²GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³或9×10¹³GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁴、2×10¹⁴、3×10¹⁴、4×10¹⁴、5×10¹⁴、6×10¹⁴、7×10¹⁴、8×10¹⁴或9×10¹⁴GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁵、2×10¹⁵、3×10¹⁵、4×10¹⁵、5×10¹⁵、6×10¹⁵、7×10¹⁵、8×10¹⁵或9×10¹⁵GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。

在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为1×10¹⁰到约1×10¹⁵GC每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，载体的有效量为约1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹或9×10⁹GC每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰GC每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹¹、2×10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹或9×10¹¹GC每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²或9×10¹²GC每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³或9×10¹³GC每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹⁴、2×10¹⁴、3×10¹⁴、4×10¹⁴、5×10¹⁴、6×10¹⁴、7×10¹⁴、8×10¹⁴或9×10¹⁴GC每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹⁵、2×10¹⁵、3×10¹⁵、4×10¹⁵、5×10¹⁵、6×10¹⁵、7×10¹⁵、8×10¹⁵或9×10¹⁵GC每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。

在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为1×10¹⁰到约1×10¹⁵GC每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，载体的有效量为约1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹或9×10⁹GC每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰GC每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹¹、2×10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹或9×10¹¹GC每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²或9×10¹²GC每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³或9×10¹³GC每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹⁴、2×10¹⁴、3×10¹⁴、4×10¹⁴、5×10¹⁴、6×10¹⁴、7×10¹⁴、8×10¹⁴或9×10¹⁴GC每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1×10¹⁵、2×10¹⁵、3×10¹⁵、4×10¹⁵、5×10¹⁵、6×10¹⁵、7×10¹⁵、8×10¹⁵或9×10¹⁵GC每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。

上述剂量可以以各种体积的载体、赋形剂或缓冲液调配物施用，范围为约25到约1000微升或更大的体积，包含所述范围内的所有数字，这取决于待治疗区域的大小、所使用的病毒效价、施用途径以及所述方法的所期望的效果。在一个实施例中，载体、赋形剂或缓冲液的体积为至少约25μL。在一个实施例中，体积为约50μL。在另一个实施例中，体积为约75μL。在另一个实施例中，体积为约100μL。在另一个实施例中，体积为约125μL。在另一个实施例中，体积为约150μL。在另一个实施例中，体积为约175μL。在又另一个实施例中，体积为约200μL。在另一个实施例中，体积为约225μL。在又另一个实施例中，体积为约250μL。在又另一个实施例中，体积为约275μL。在又另一个实施例中，体积为约300μL。在又另一个实施例中，体积为约325μL。在另一个实施例中，体积为约350μL。在另一个实施例中，体积为约375μL。在另一个实施例中，体积为约400μL。在另一个实施例中，体积为约450μL。在另一个实施例中，体积为约500μL。在另一个实施例中，体积为约550μL。在另一个实施例中，体积为约600μL。在另一个实施例中，体积为约650μL。在另一个实施例中，体积为约700μL。在另一个实施例中，体积介于约700与约1000μL之间。

在某些实施例中，剂量可以在约1×10⁹GC/g脑质量到约1×10¹²GC/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约1×10¹⁰GC/g脑质量到约3×10¹¹GC/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约1×10¹⁰GC/g脑质量到约2.5×10¹¹GC/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约5×10¹⁰GC/g脑质量的范围内。

在一个实施例中，病毒构建体可以以至少约1×10⁹GC到约1×10¹⁵或约1×10¹¹到5×10¹³GC的剂量递送。可以由本领域的技术人员确定用于递送这些剂量和浓度的合适的体积。例如，可以选择约1μL到150mL的体积，其中对于成人而言，选择更大的体积。通常，对于新生婴儿，合适的体积为约0.5mL到约10mL，对于年龄较大的婴儿，可以选择约0.5mL到约15mL。对于幼儿，可以选择约0.5mL到约20mL的体积。对于儿童，可以选择至多约30mL的体积。对于青春期前的少年和青少年，可以选择至多约50mL的体积。在仍其它实施例中，患者可以接受鞘内施用的体积选择为约5mL到约15mL或约7.5mL到约10mL。可以确定其它合适的体积和剂量。可以调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这种剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。

可以根据所公开的方法将上文描述的重组载体递送到宿主细胞。可以将优选地悬浮于生理上相容的载体中的rAAV施用于人或非人哺乳动物患者。在某些实施例中，为了施用于人类患者，将rAAV适当地悬浮于含有盐水、表面活性剂和生理上相容的盐或盐的混合物的水溶液中。合适地，将调配物调整到生理上可接受的pH，例如，在pH 6到9、或pH 6.5到7.5、pH 7.0到7.7或pH 7.2到7.8的范围内。由于脑脊液的pH为约7.28到约7.32，对于鞘内递送，可能期望在此范围内的pH；而对于静脉内递送，可能期望约6.8到约7.2的pH。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其它pH用于其它递送途径。

如本文所使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管中，更具体地注射到蛛网膜下腔中以便其到达脑脊液(CSF)的药物施用途径。鞘内递送可以包含腰椎穿刺、室内(包含脑室内(ICY))、枕骨下/脑池内和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，可以向小脑延髓池中注射。在某些实施例中，如本文所述的rAAV、载体或组合物通过鞘内施用而施用于有需要的受试者。在某些实施例中，鞘内施用如于2019年11月29日公布的美国专利公开第2018-0339065A1号中所述的那样进行，所述美国专利公开通过引用整体并入本文。

如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指药物直接进入到小脑延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)的脑脊液中，更具体地是通过枕骨下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池(cisterna magna)中或通过永久定位的管的施用途径。

在某些实施例中，本文所描述的组合物的治疗在动物和/或人类患者中引起最小到轻度的DRG感觉神经元的无症状退化，并且在感觉神经毒性和亚临床感觉神经元病变方面具有良好的耐受性。

IX.用于将药物组合物递送到脑脊液中的设备和方法

在一方面，本文中提供的载体可以通过此部分中提供并在WO 2018/160582中描述的方法和/或装置鞘内施用，所述文献通过引用并入本文中。可替代地，可以选择其它装置和方法。在某些实施例中，方法包括通过脊柱针向患者的小脑延髓池进行CT引导的枕骨下注射的步骤。如本文中所使用的，术语计算机断层摄影(CT)是指放射线照相术，其中通过计算机由沿着轴线制成的一系列平面横截面图像构建身体结构的三维图像。在某些实施例中，所述设备在2019年11月29日公布的美国专利公开第2018-0339065A1号中进行了描述，所述美国专利公开通过引用整体并入本文。

词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被解释为是包含性而非排他性的。词语“由……组成(consist)”、“由……组成(consisting)”及其变体将被解释为是排他性而非包含性的。虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在其它情况下，也意图使用“由……组成”或“基本上由……组成”的语言来解释和描述相关的实施例。

术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包括RNA或RNA和蛋白质的产生。关于RNA，术语“表达”或“翻译”尤其涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是暂时的或可以是稳定的。

应当注意，术语“一个(a)”或“一种(an)”是指一种或多种，例如，“一种增强子”应被理解为表示一种或多种增强子。如此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换地使用。

如上文所描述的，除非另有说明，否则术语“约”在用于修改数值时意指±10％的变化。

除非在本说明书中另有定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员和参照公开文本所通常理解的相同含义，这为本领域的技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。

实例

以下实例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明。

开发了一种基因疗法来恢复已被鉴定为致病性基因缺陷的MECP2表达。使用AAV基因疗法技术将MECP2表达盒转移到脑神经元中。治疗制品的注射是通过脑脊液(CSF)、使用小脑延髓池作为进入点或通过静脉内的方式来递送的。高度优化用于在人类中表达的MECP2表达盒与具有高度改进的中枢神经系统(CNS)转导的AAV衣壳组合使用。

实例1-hSyn-MECP2co载体

质粒。将MECP2的主要人类同种型(甲基-CpG结合蛋白2，同种型α，UniProt IDP51608-2)的氨基酸序列反向翻译成DNA序列，并且然后进一步工程化。将经工程化的MECP2序列(SEQ ID NO 3，即SEQ ID NO:1的nt 696到nt 2195和SEQ ID NO:6的nt 696到nt2195，如本文所使用的，也称为hMECP2co或MECP2co)克隆到受人突触蛋白启动子控制的AAV表达质粒中(Thiel,G.、Greengard,P.和Südhof,T.C.通过人突触蛋白I基因启动子对组织特异性转录的表征(Characterization of tissue-specific transcription by thehuman synapsin I gene promoter).《美国国家科学院院刊(Proceedings of theNational Academy of Sciences)》88,3431-3435,doi:10.1073/pnas.88.8.3431(1991))。MECP2编码序列前面是Kozak序列，后面是SV40 polyA序列，并由AAV2反向末端重复序列(ITR)构成框架(图1；SEQ ID NO:1)。可替代地，在一些实验中，使用兔球蛋白polyA序列(图3；SEQ ID NO:4)。为了抑制背根神经节(DRG)中的表达，在一些实验中，对上述质粒进行修饰以紧接在MCEP2编码序列之后且在SV40 polyA序列(图2A；SEQ ID NO:6)之前含有miR183结合位点(agtgaattctaccagtgccata，SEQ ID NO:7)的四个重复序列。AAV MECP2载体是在宾夕法尼亚大学载体核心(University of Pennsylvania Vector Core)、使用衣壳PHP.B(Deverman,B.E.等人Cre依赖性选择产生用于广泛基因转移到成人大脑的AAV变体(Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to theadult brain).《自然生物技术(Nat Biotechnol)》34,204-209,doi:10.1038/nbt.3440(2016))或AAV9或AAVhu68(Hinderer,C.等人在非人灵长类动物和仔猪中高剂量静脉内施用表达人SMN的腺相关病毒载体后的严重毒性(Severe Toxicity in Nonhuman Primatesand Piglets Following High-Dose Intravenous Administration of an Adeno-Associated Virus Vector Expressing Human SMN).《人类基因疗法》29,285-298,doi:10.1089/hum.2018.015(2018))生产的，用于小鼠研究或非人灵长类动物研究。

实例2-小鼠研究。

1.材料与方法

小鼠研究。Mecp2-ko小鼠(ko小鼠)获自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J，品系#003890)，并且将杂合雌性ko小鼠与野生型(wt)C57B16雄性杂交以获得雄性Mecp2-ko小鼠(半合子，HEMI，也称为ko小鼠)和雄性wt同窝仔畜。小鼠在18-21日龄时通过每个小鼠眶后注射100ul总体积中的1×10¹¹到5×10¹¹基因组拷贝(gc)来接受AAV.MECP2载体或媒剂对照(无菌磷酸缓冲盐水，PBS)。将小鼠按基因型和注射产品混合饲养，每周称重和观察至少两次并成长到三个月。大多数接受媒剂对照的Mecp2-ko小鼠在到达3个月的时间点之前死亡或达到安乐死的人道终点，而经AAV MECP2处理的小鼠和wt小鼠存活并适合进行一系列行为测试。

蛋白质印迹和组织染色。在安乐死后，将一个皮层半球被快速冷冻，并且随后使用RIPA缓冲液产生蛋白质裂解物。使用针对鼠和人MECP2的抗体(PA1-887，赛默飞世尔(Thermo Fisher))进行蛋白质印迹。将另一半大脑在福尔马林中固定过夜，包埋在石蜡中，并且对薄切片进行处理以用相同的抗体进行免疫荧光染色。可替代地，将组织用H&E染色以进行病理学检查。脱钙的脊髓横截面也用劳克坚牢蓝(Luxol Fast Blue)染色剂(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Inc))染色。

行为测试。小鼠每天进行一次测试。每天的测试时间、操作员和环境保持不变(60dB白噪声背景和1000流明白炽灯间接照明)。每次测试前，使小鼠在它们的居住笼子里习惯30分钟。对于旷场测定，将具有最少垫料的新笼子放置到红外光束阵列(MedAssociates公司(MedAssociates,Inc.))中。在笼子中间添加一只小鼠，并且自动记录接下来30分钟内的光束制动次数，所述光束制动分为靠近地面的光束制动(一般活动)和高于地面3英寸的光束制动(直立活动)。对于高架零迷宫(EZM，Stoelting公司(StoeltingCo.))，使用具有两个相对封闭象限和两个开放象限的高架圆形平台来进行不间断的探索。将单一小鼠放置在开放象限的中间，并视频记录运动，持续15分钟。对于Y迷宫(Stoelting公司)，使用含有三个相同的Y形臂的封闭平台。将单一小鼠放置在离操作者最近的臂上，并且视频记录其运动，持续5分钟。对于珠子掩埋测定，向新笼子填充3英寸的AlphaDri垫料(Shepherd Specialty Papers)并轻轻压实。12个纯蓝色珠子在垫料上等距地间隔开，并且将单一小鼠放置在笼子的中间。30分钟后记录至少一半被垫料覆盖的珠子的数量。对于转棒仪测定，使用加速旋转梁(Ugo Basile SA)。在第一天，针对每次5分钟的三次进程，使小鼠习惯于最低转速(4rpm(每分钟转数))的旋转梁。为了测试，将小鼠放置在以4rpm缓慢旋转的梁上。将速度在5分钟内增加到40rpm的最终转速。记录每只小鼠的掉落潜伏期。休息15分钟后，重复同样的实验两次。对于一些实验，旋转器测试连续三天进行，每天进行三次进程。

数据分析。使用GraphPad Prims软件绘制和分析数据。视频文件以20fps的mp4格式记录，并使用EthoVision XT软件(版本14，诺达思信息技术公司(Noldus InformationTechnology))进行分析。

2.药物功效

开发了用于MECP2基因疗法的AAV载体(AAV.hMECP2co)。MECP2的DNA序列被工程化用于表达SEQ ID NO:2的氨基酸序列的hMECP2。表达由人突触蛋白启动子驱动，所述人突触蛋白启动子已被广泛记录为在CNS神经元中选择性表达。结果显示携带SEQ ID NO:3的MECP编码序列的AAV-PHP.B.hSyn-MECP2co载体转导了非常高比例的小鼠CNS神经元并促进了稳健且广泛的MECP2蛋白表达。还表明，通过静脉内(IV或iv)注射此载体治疗幼年Mecp2-ko小鼠克服了早期死亡率并显著改善了行为结果测量。剂量优化允许实现与野生型表现非常相似的行为矫正。

小鼠脑中观察到通过AAV-PHP.B.hSyn.MECP2co载体成功表达MECP2。将AAV-PHP.B.hSyn.MECP2co载体静脉内(iv)注射到Mecp2-ko小鼠中以实现最大的脑转导。然后如材料与方法中所述，收获小鼠脑并使用抗MECP2抗体处理以用于免疫荧光染色。图4A-4E提供了代表性图像，并且结果表明，在由AAV-PHP.B.hSyn.MECP2co载体处理的Mecp2-ko小鼠的皮层中实现了hMECP2的广泛表达(图4E)，但在用作阴性对照的未经处理的ko小鼠中未实现所述广泛表达(图4B和4C)。而且，经处理的Mecp2-ko小鼠中的hMECP2表达水平与在野生型皮层(图4D，阳性对照)中观察到的表达水平相似。另外，在小鼠脑中观察到通过AAV-PHP.B.hSyn.MECP2co.miR183成功表达MECP2(图2B)。因此，将miR183靶向序列添加到表达盒中不会影响小鼠脑中的MECP2表达。

进一步研究了幼年Mecp2-ko小鼠的治疗功效。与被确定为具有治疗功效的初始剂量的5×10¹¹GC/幼年雄性小鼠的剂量相比，AAV-PHP.B.hSyn.MECP2co载体以较低的剂量延长寿命。简而言之，在图5A中，向雄性Mecp2-ko小鼠(即，HEMI或KO或ko)静脉内注射四剂AAV-PHP.B.hSyn.MECP2co载体(3×10¹⁰GC/小鼠，表示为3e10 AAV；1×10¹¹GC/小鼠，表示为1e11 AAV；和2.5×10¹¹GC/小鼠，表示为2.5e11 AAV以及5×10¹¹GC/小鼠，表示为5e11AAV)，如材料与方法中所述。被注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)的雄性野生型同窝仔畜用作阳性对照(图中表示为PBS、WT或WT+PBS)，而用PBS处理的雄性Mecp2-ko小鼠用作阴性对照(图中表示为KO、ko+PBS或KO+PBS或HEMI+PBS)。测试组中存活小鼠的百分比绘制在图5A中的Kaplan-Meier存活图中，其显示最高三个剂量(1×10¹¹、2.5×10¹¹和5×10¹¹GC/小鼠)与阴性对照相比显著提高了Mecp2-ko小鼠的总体存活期；并且所有用1×10¹¹GC的载体处理的ko小鼠以及野生型(wt)同窝仔畜在观察期结束时存活(至少直到16周龄，如图5A所示)。所有用最低剂量3×10¹¹GC/小鼠处理的KO小鼠在观察期的第80天后都没有存活下来。还监测了测试小鼠的体重(图5B和5C)。用三种剂量(1×10¹¹、2.5×10¹¹和5×10¹¹GC/小鼠)的载体处理的ko小鼠显示体重稳定增加，而从6-9周龄开始，经PBS处理的ko小鼠逐渐失去而不是增加体重。经PBS处理的野生型小鼠显示出与经处理的ko小鼠的体重曲线类似的体重曲线，但体重略重。

此外，在通过ICV施用的以下额外剂量范围的情况下进一步研究新生Mecp2-ko小鼠的治疗功效：6×10⁹GC/小鼠到6×10¹⁰GC/小鼠(4个剂量)。

将DRG脱靶并入MECP2表达盒中，以允许施用更高剂量的载体。检查包括添加的用于DRG脱靶的miR183序列的AAVhu68.hSyn.MECP2co.miR183的治疗功效。载体通过ICM注射以2.3×10¹¹GC/小鼠的剂量递送给幼年受试者。

在MECP2基因疗法后观察到剂量依赖性行为矫正。针对以下进行行为测试，包含旷场测定、高架零迷宫、Y迷宫、珠子掩埋测定和转棒仪测定：静脉内注射有三种不同剂量的AAV-PHP.B.hSyn.MECP2co载体的雄性Mecp2-ko小鼠(即，HEMI)(1×10¹¹GC/小鼠，也表示为HEMI+AAV(1e11gc)；2.5×10¹¹GC/小鼠，表示为HEMI+AAV(2.5e11gc)；和5×10¹¹GC/小鼠，表示为HEMI+AAV(2.5e11gc))、经磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的雄性野生型同窝仔畜(阳性对照，图中标记为PBS或WT+PBS)以及经PBS处理的ko小鼠(阴性对照，表示为HEMI+PBS)。

在旷场测定中，从经PBS处理的WT获得的总行走活动或直立活动的平均百分比设置为100％，并且然后相应地计算其余组的读数并将所述读数呈现在图6A和6B中。经PBS处理的ko小鼠表现出约40％的行走活动和低于10％的直立活动。通过1×10¹¹GC的载体的处理将行走活动增加到约67％，并且2.5×10¹¹GC的载体进一步将百分比提高到约85％。直立活动分别由1×10¹¹GC或2.5×10¹¹GC的载体增加到高达约85％或约60％。然而，测试的最高剂量(5×10¹¹GC/小鼠)表现出约60％的行走活动和约32％的直立活动，所述行走活动和直立活动两者仍然高于经PBS处理的ko小鼠的行走活动和直立活动。

监测在高架零迷宫中在开放区域中花费的时间以及开放区域进入的次数并且结果呈现在图6C和6D中。在这两个图中，wt小鼠的平均读数设置为100％，并相应地计算其余组的相对百分比。对于进行的两种评估，用1×10¹¹GC或2.5×10¹¹GC的载体处理的ko小鼠显示出与wt对照相当的百分比。在用5×10¹¹GC的载体处理的ko小鼠中观察到在开放区域中的时间的减少和开放区域进入的减少。进一步地，仅用PBS施用的ko小鼠移动很少并且没有离开它们最初被放置于的开放区域，因此无法评估它们对开放或封闭区域的偏好。另外，对行为结果和治疗后小鼠脑中转导的神经元数量进行了相关性分析。三重染色免疫荧光图像(细胞核的DAPI、MECP2和神经元的NeuN)用于对以不同的剂量注射后的Mecp2-ko大脑皮层(图6E)和海马体(图6F)中表达MECP2的神经元的数量进行半自动定量。将获得的数据绘制为％MECP2+/NeuN+细胞。用6×10¹⁰GC/小鼠或更低(3×10¹⁰GC/小鼠)的剂量处理的动物存活时间不够长和/或不具有足够的活动性来进行行为测试。相关地，仅观察到少量神经元对MECP2的表达染色呈阳性(MECP2+)。在大脑皮层中，在3×10¹⁰和6×10¹⁰GC/小鼠的剂量下，分别5.7％和5.8％是MECP2+神经元。在海马体中，在3×10¹⁰和6×10¹⁰GC/小鼠的剂量下，分别5.1％和10.8％是MECP2+神经元。在大脑皮层中，在1×10¹¹、2.5×10¹¹和5×10¹¹GC/小鼠的剂量下，分别12.9％、42.6％和75.3％是MECP2+神经元。在海马体中，在1×10¹¹、2.5×10¹¹和5×10¹¹GC/小鼠的剂量下，分别16.3％、46.0％和65.4％是MECP2+神经元。因此，1×10¹¹GC/小鼠被认为是最小有效剂量。

还通过转棒仪测试评估了小鼠的运动协调性。图7A中示出了通过小鼠停留在转棒仪上的秒数测量的掉落潜伏期。与经PBS处理的ko小鼠相比，用1×10¹¹GC或2.5×10¹¹GC的载体处理的ko小鼠在停留在转棒仪上并避免掉落方面表现出显著改善。另外，对每只小鼠进行三项试验。在经PBS处理的ko小鼠中重复转棒仪测试时没有观察到改善。然而，从经PBS处理的wt小鼠以及经载体处理的ko小鼠观察到在转棒仪上的时间增加。

通过珠子掩埋测定进一步测试小鼠的行为特点。12个珠子中有约7个珠子至少有一半被wt小鼠用垫料覆盖，而经PBS处理的ko小鼠仅掩埋1个。用1×10¹¹GC或2.5×10¹¹GC的载体处理的ko小鼠分别掩埋约2或约3个珠子，这证明了对wt表型的行为矫正。

在Y迷宫中，小鼠通常更喜欢探索迷宫的新臂，而不是返回到先前访问过的臂。因此，Y迷宫自发交替指数可以用作探索新环境意愿的指标。如图7C所示，用5×10¹¹GC的载体处理使指数高达约35％，而用1×10¹¹GC或2.5×10¹¹GC的载体处理的ko小鼠的指数为约70％，这类似于如果不高于wt小鼠的情况(约58％)。仅接受PBS的Ko小鼠移动很少，并且没有达到每5分钟间隔至少9次决策的阈值，因此无法评估它们在Y迷宫中的表现。

下表进一步提供了AAV-PHP.B.hSyn.MECP2co载体在幼年ko小鼠中的药物功效，其表现为超过100天的存活期或与野生型(wt)对照相当。这些结果表明行为矫正结果取决于AAV.hMECP2co剂量。

总之，这项对幼年小鼠的治疗功效研究表明，用1×10¹¹、2.5×10¹¹和5×10¹¹GC/小鼠的AAV-PHP.B.hSyn-hMECP2co治疗延长了寿命并预防了小鼠的典型症状的发作，并且降低处理剂量改善了行为矫正的结果。

利用在NHP中具有经证实的表达功效的启动子(例如，CBA或UbC启动子)但hMECP2co核酸序列相同的AAV.hMECP2co载体也在幼年小鼠中进行了测试并显示出药物功效。

在转导的神经元数量与行为矫正之间建立了剂量依赖性。还将实现的每细胞表达水平与wt小鼠和人脑的表达水平进行比较。

3.安全性/毒性

将AAV-PHP.B.hSyn-hMECP2co载体以不同剂量静脉内注射给幼年或成年野生型C57B16小鼠，以便评估载体的安全性或毒性。

仅用增加剂量的AAV-hSyn-hMECP2处理幼年wt小鼠会对运动功能产生不利影响，并在非常高的剂量(5×10¹²GC/小鼠，这是最低治疗剂量1×10¹¹GC/小鼠的50倍)下引起轻度脊髓轴索病(spinal axionopathy)。用AAV-PHP.B.hSyn-hMECP2co载体以静脉内的方式以3×10⁹GC/小鼠(第1组)、1×10¹⁰GC/小鼠(第2组)、5×10¹⁰GC/小鼠(第3组)、1×10¹¹GC/小鼠(第4组)、5×10¹¹GC/小鼠(第5组)、1×10¹²GC/小鼠(第6组)和5×10¹²GC/小鼠(第7组)的剂量对幼年wt小鼠进行处理。在经载体处理的幼年wt小鼠中未观察到病况或死亡；并且hMECP2的表达表明在5×10¹¹GC/小鼠(第1-5组)的剂量和更低剂量下没有毒性作用。仅在最高处理组(第7组)中观察到明显症状(例如，由于后腿效应而降低移动能力)。在用1×10¹²GC/小鼠和5×10¹²GC/小鼠的载体处理的小鼠中发现背白质中的轴突病变。研究了背白质束和背神经根中的轴突病变。在进行或未进行载体处理的野生型小鼠之间比较海马体的锥体层、脊髓灰质和背根神经节细胞(DRG)中的细胞和MECP2阳性细胞(图9)。在所有测试组中均未观察到背根神经节细胞的损失。然而，Luxol Fast染色显示，在用1×10¹²GC的载体处理的小鼠中检测到1级轻度脱髓鞘，而在5×10¹²GC组中观察到2级中度脱髓鞘。在较低剂量组(第1-5组)中未发现脱髓鞘。参见图8A。另外进行的蛋白质印迹分析显示，在以5×10¹¹(如所表示的5e11)和1×10¹²(如所表示的1e12)GC/小鼠的剂量注射AAV载体后，MECP2在wt脑中相对过表达。在平行病理学分析中进行，前提是在5×10¹¹GC/小鼠剂量下观察到神经元病理正常(与WT水平相比，MECP2表达为1.8倍)。然而，在1×10¹²GC/小鼠剂量下，1级轴突病变变得明显(与WT水平相比，MECP2为2.4倍)。

用高剂量的AAV-hSyn-hMECP2处理成年wt小鼠会对行为结果产生不利影响(活动减少)，但不会引起明显的运动缺陷(在最低治疗剂量的4倍下)。将AAV.hMECP2co载体以1×10¹²GC/小鼠的剂量静脉内施用于成年小鼠。成年小鼠中的此剂量相当于4×10¹¹GC/幼年小鼠，因为成年小鼠的体重(约25g)为幼年小鼠(约10g)的约2.5倍。因此，此测试剂量(1×10¹²GC/成年小鼠)被认为是最低治疗剂量，即1×10¹¹GC/幼年小鼠的4倍。

进行旷场测定以评估成年小鼠的活动水平。结果表明，与仅用PBS处理的对照组相比，通过1×10¹²GC/小鼠的载体处理使行走/水平活动减少28％(p<0.0001，方差分析(ANOVA)，图10A)并且使直立/竖直活动减少64％(p<0.0001，方差分析，图10B)。通过转棒仪测试研究神经运动能力和协调性。如图10C所示，与经PBS处理的小鼠相比，经载体处理的小鼠更可能从转棒仪上掉落(p<0.001，双因素方差分析(2-way ANOVA))。然而，此结果可能会被图10A和10B中所示的较低活性所混淆。还以5×10¹⁰、1×10¹¹和5×10¹¹GC/小鼠的剂量向成年wt小鼠静脉内施用AAV.hMECP2co载体。然后使用如上所述的行为测定测试小鼠。

利用在非人灵长类动物(NHP)中具有经证实的表达功效的启动子(例如，CBA或UbC启动子)但hMECP2co核酸序列相同的AAV.hMECP2co载体也在幼年和成年小鼠中进行了安全性和毒性测试，如本文所述。

实例3-非人灵长类动物(NHP)研究。

1.材料与方法

非人灵长类动物实验。猕猴(恒河猴)物种的非人灵长类动物(NHP)从科文斯研究产品公司(Covance Research Products,Inc.)获得。根据基因疗法程序SOP(Gene TherapyProgram SOPs)进行检疫和畜牧驯养。在AAV载体施用前一个月和整个研究期间，定期监测体重、体温、呼吸率和心率，并获得血液和CSF样品。将全血用于细胞计数和分类以及临床血液化学检查(clinical blood chemistry panel)。CSF样品用于血细胞计数和分类以及总蛋白定量。为了通过穿刺小脑延髓池将AAV载体递送到CSF中，将麻醉的猕猴以侧卧位放置在手术台上，头部向前弯曲。使用无菌技术，将21-27号、1-1.5英寸Quincke脊柱针(碧迪公司(Becton Dickinson))推进到枕骨下空间中，直到观察到CSF流动。针指向小脑延髓池的更宽的上间隙，以避免血液污染和潜在的脑干损伤。使用荧光镜通过脊髓造影术验证针穿刺的正确放置。在给药前收集1mL CSF用于基线分析。在CSF收集后，将leur通路延伸导管连接到脊柱针，以促进1ml碘海醇(Iohexol)(商品名：欧乃派克(Omnipaque)180mg/mL，通用电气医疗(General Electric Healthcare))造影剂的给药。在验证针头放置后，将含有测试制品的注射器(体积等于1mL加上注射器和接头死区的体积)连接到柔性接头并注射30±5秒。将针移除并且直接对穿刺部位施加压力。AAVhu68.hSyn.MECP2co载体以3×10¹²、1×10¹³或3×10¹³GC/NHP的剂量注射，而AAVhu68.MECP2载体以2×10¹³GC/NHP的剂量注射。在研究的第0、14、18、41天和最后一个研究日，对所有猕猴进行神经系统评估，以详细评估神经系统功能。简而言之，评估包含姿势和步态评估、颅神经评估、本体感觉评估和脊髓/神经反射。在研究第56天，对猕猴实施安乐死，并进行总尸体剖检和尸检。从每只猕猴中收获25个主要组织，一式两份，用于快速冷冻或在福尔马林中固定。从快速冷冻组织中纯化DNA或RNA并且将其分别用于载体生物分布或转基因表达分析。对于载体生物分布，使用TaqMan qPCR测定来确定每DNA总重量的基因组拷贝数(gc)，其中探针再次指向转基因盒的polyA区和内标物。为了对转基因表达进行定量，总RNA用于通过与polyT寡核苷酸进行第一链合成来产生cDNA，然后使用对不与内源性恒河猴MECP2序列交叉反应的转基因具有特异性的探针进行TaqMan qPCR。对于组织病理学分析，将猕猴组织包埋到石蜡中，并且将这些切片分别用H&E溶液、Myc-标签或MECP2抗体染色。将相同的脊髓切片与劳克坚牢蓝一起温育以对髓鞘进行染色。所有经染色的组织切片均由通过职业验证的兽医病理学家审查，并且异常发现由同行审查核实。

2.AAVhu68.hSyn-MECP2

在非人灵长类动物中测试具有SEQ ID NO:3的MECP编码序列(编码SEQ ID NO:2的hMECP)的AAVhu68.hSyn-MECP2。恒河猴(5-7岁)通过小脑延髓池通路(ICM)以不同剂量注射到CSF中。在56天的存活阶段期间没有观察到任何不良迹象，并且血液化学测试均正常。在尸检后，通过qPCR确定载体生物分布，并在所有测试的CNS组织中发现剂量依赖性增加。这与在相同CNS组织中转基因mRNA的剂量依赖性增加相应(由TaqMan qPCR通过选择性识别转基因的测定来确定)。将载体生物分布与NHP的转基因mRNA水平进行比较，所述NHP已经通过相同的施用途径(ROA)被施用了相当剂量的先前公布的载体(Sinnett,S.E.等人和Gadalla,K.K.E.等人,如本文所引述)。与其它载体相比，AAV-hu68.hSyn-MECP2载体表现出类似的载体生物分布，然而，所述载体能够在所有CNS组织中实现高得多的mRNA表达，这可以使所述载体更适合有效的雷特综合征基因疗法。

研究1.研究了以下恒河猴种群。

NHP ID	组号	性别	年龄(年)	重量(kg)
					RA3086	1	F	4.9	6.55
RA3092	1	F	5.4	7.72
					RA1551	2	M	6.8	14.9
RA3173	2	M	4.9	7.7
					RA3157	3	M	4.9	6.55
RA3166	3	M	4.7	4.6
					RA2470	4	M	5.7	7.65
RA3152	4	M	5.7	8.8

AAV.hMECP2载体是使用AAVhu68衣壳产生的并在下表中列出。载体中的表达盒将不同的小鼠Mecp2启动子序列与野生型人MECP2编码序列(表示为MECP2或MECP2e1)相组合。

NHP ID	组	载体
			RA3086、RA3092	1	AAVhu68.MeP<u>426</u>.MECP2.RDHl.Stuffer
RA1551、RA3173	2	AAVhu68.MeP<u>426</u>.MECP2-mvc.RDHl.Staffer
			RA3157、RA3166	3	AAVhu68sc.mMeP<u>546</u>.SVI.MeCP2e1.SpA(参考产品)
RA2470、RA3152	4	AAVhu68.CB7.CI.MECP2.rBG

所指示的载体以2×10¹³GC/NHP的剂量通过小脑延髓池内(ICM)注射递送。然后在施用后观察动物56天。进行尸检和病理学检查。

在第1-4组中研究背白质束中的轴突病变，其特征在于有或没有骨髓巨噬细胞的扩张的髓鞘和轴突碎裂。如图11所示，在第1组和第2组中观察到极小到中度轴突病变，而在第3组中观察到极小到轻度轴突病变，并且在第4组中观察到中度到重度轴突病变。劳克蓝(Luxol Blue)染色显示所有测试组的脊髓白质束中的髓鞘轻度到中度损失。参见图12。图13A到13D揭示了跨组织的载体生物分布。

进一步地，MECP2表达通过IHC在第2组中用myc抗体(MeP426-MECP2_myc)或在第2组和第4组中用MECP2抗体获得。参见图14和15。在脑皮层和脊髓的背根神经节中均检测到成功表达。测量了hMECP2 mRNA表达。使用选择性扩增hMECP2的RT-qPCR探针进行的相对定量显示，尽管跨各组的载体分布类似，但是每个组和组织的表达水平不同。参见下表。

4.研究2

产生包括由hSyn启动子驱动的经工程化的hMECP2编码序列的AAVhu68.hSyn.MECP2co.SV40载体，并以3×10¹³GC/NHP、1×10¹³GC/NHP和3×10¹²GC/NHP通过ICM注射将所述载体递送到NHP受试者。研究了使用每个剂量的载体生物分布并且结果在图16A到16C中示出。使用选择性扩增hMECP2的RT-qPCR探针进行的相对定量显示，尽管跨各组的载体分布类似，但是每个组和组织的表达水平不同(图17)。参见下表。

建立hSyn启动子的表达谱，并且然后使用GFP作为读出段(readout)将所述表达谱与CBA启动子进行比较。

将DRG脱靶并入MECP2表达盒中，以允许施用更高剂量的载体。将包括由hSyn启动子驱动的经工程化的hMECP2编码序列的AAVhu68.hSyn.MECP2co载体或包括添加的用于DRG脱靶的miR183序列的AAVhu68.hSyn.MECP2co.miRl83(SEQ ID NO:15)通过ICM注射以1×10¹⁴GC/NHP的高剂量递送到NHP受试者。在处理后3个月时从NHP受试者(N＝3)中收获组织。利用对MECP2co具有特异性的探针的原位杂交显示，包含miR183盒大大减少了表达MECP2co的DRG细胞的数量和表达的RNA的量(图18A)。另外，对白质轨迹和DRG进行病理学评分。对于所有组织评分，在接受具有miR183的AAV载体的NHP中存在严重性的强烈降低趋势或显著降低(图18B和图18C)。还使收获的组织进行原位杂交测定并针对DRG细胞数量和强度进行定量。

表(序列表自由文本)

对于在数字标识符<223>下含有自由文本的序列，提供了以下信息。

本说明书中引用的所有文件均通过引用并入本文，如在2019年4月24日提交的美国专利申请第62/837,947号的优先权申请中。随此提交的标记为“19-9007PCT_SeqListing_ST25.txt”的序列表和其中的序列和文本通过引用并入。尽管已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解的是，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1. 一种能用于治疗雷特综合征的重组腺相关病毒（rAAV），其中所述rAAV包括：

（a）AAV衣壳；以及

（b）载体基因组，所述载体基因组包装在（a）的所述AAV衣壳中，其中所述载体基因组包括反向末端重复序列（ITR）和核酸序列，所述核酸序列在调控序列的控制下编码功能性人甲基-CpG结合蛋白2（hMECP2），所述调控序列指导所述hMECP2在中枢神经系统细胞中的表达，并且其中所述hMECP2编码序列是SEQ ID NO: 3或与SEQ ID NO: 3至少约95%相同的序列。

2. 根据权利要求1所述的rAAV，其中所述hMECP编码序列与hMECP转录物变体1到3（NM_001316337.1（SEQ ID NO: 16）、NM_004992.3（SEQ ID NO: 17）和NM_001110792.1（SEQ IDNO: 18））中的任一种的同一性小于80%。

3. 根据权利要求1或2所述的rAAV，其中所述功能性hMECP2具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的rAAV，其中所述调控序列包括神经元特异性启动子。

5.根据权利要求1到3中任一项所述的rAAV，其中所述调控序列包括组成型启动子。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的rAAV，其中所述调控序列包括人突触蛋白启动子或CB7启动子。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的rAAV，其中所述调控元件进一步包括Kozak序列、聚腺苷酸化序列、内含子、增强子、TATA信号和polyA序列中的一种或多种。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组进一步包括hMECP的3'非翻译区中的背根神经节（drg）特异性miRNA靶序列的至少两个串联重复序列，其中所述至少两个串联重复序列包括至少第一miRNA靶序列和至少第二miRNA靶序列以及靶miR183或miR182，所述至少第一miRNA靶序列和所述至少第二miRNA靶序列可以相同或不同。

9. 根据权利要求81到6中任一项所述的rAAV，其中表达盒mRNA或DNA正链的所述至少第一miRNA靶序列和/或所述至少第二miRNA靶序列的所述miRNA靶序列是：（i）AGTGAATTCTACCAGTGCCATA（miR183，SEQ ID NO: 7）；以及（ii）AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA（SEQ ID NO: 9）。

10.根据权利要求8或9所述的rAAV，其中所述miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由间隔子隔开，并且每个间隔子独立地选自以下中的一个或多个：（A）GGAT；（B）CACGTG；或（C）GCATGC。

11.根据权利要求110所述的rAAV，其中定位在所述miRNA靶序列之间的所述间隔子可能定位在第一个miRNA靶序列的3'和/或最后一个miRNA靶序列的5'。

12.根据权利要求10或11所述的rAAV，其中所述miRNA靶序列之间的所述间隔子是相同的。

13. 根据权利要求1到11中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组包括SEQ ID NO:6的核酸1到2802。

14.根据权利要求1到13中任一项所述的rAAV，其中所述衣壳是AAVhu68衣壳。

15.一种组合物，其包括根据权利要求1到14中任一项所述的rAAV的原液和水性悬浮介质。

16.根据权利要求l5所述的组合物，其中悬浮液被调配用于静脉内递送、鞘内施用或脑室内施用。

17. 一种载体，其包括表达盒，其中所述表达盒包括核酸序列，所述核酸序列在调控序列的控制下编码功能性人甲基-CpG结合蛋白2（hMECP2），所述调控序列指导hMECP2表达，并且其中所述hMECP2编码序列是SEQ ID NO: 3或与SEQ ID NO: 3至少约95%相同的序列。

18.根据权利要求17所述的载体，其中所述载体是选自重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺病毒的病毒载体；或选自裸DNA、裸RNA、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物的非病毒载体。

19.一种治疗雷特综合征的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1到18中任一项所述的rAAV或根据权利要求23到24所述的载体。

20.一种能用于产生根据权利要求1到18中任一项所述的rAAV的rAAV产生系统，其中所述产生系统包括细胞培养物，所述细胞培养物包括：

（a）编码进化枝F衣壳蛋白的核酸序列；

（b）载体基因组；以及

（c）足以允许将所述载体基因组包装到所述进化枝F衣壳中的AAV rep功能和辅助功能。

21. 根据权利要求20所述的rAAV产生系统，其中所述载体基因组是SEQ ID NO: 1的nt1到nt 2728、或SEQ ID NO: 4的nt 1到nt 3949、或SEQ ID NO: 6的nt 1到nt 2802。

22.根据权利要求20或21所述的rAAV产生系统，其中所述细胞培养物是人胚肾293细胞培养物。

23. 根据权利要求20到22中任一项所述的系统，其中所述AAV rep来自不同的AAV。

24. 根据权利要求23所述的系统，其中所述AAV rep来自AAV2。

25. 根据权利要求20到24中任一项所述的系统，其中AAV rep编码序列和cap基因在同一核酸分子上，其中所述rep序列与所述cap基因之间任选地存在间隔子。

26. 根据权利要求25所述的系统，其中所述间隔子是atgacttaaaccaggt（SEQ ID NO:14）。