EA045780B1 - САМОРЕГУЛИРУЕМЫЕ ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ AAV ДЛЯ БЕЗОПАСНОЙ ЭКСПРЕССИИ MeCP2 ПРИ СИНДРОМЕ PETTA - Google Patents

САМОРЕГУЛИРУЕМЫЕ ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ AAV ДЛЯ БЕЗОПАСНОЙ ЭКСПРЕССИИ MeCP2 ПРИ СИНДРОМЕ PETTA Download PDF

Info

Publication number
EA045780B1
EA045780B1 EA201992882 EA045780B1 EA 045780 B1 EA045780 B1 EA 045780B1 EA 201992882 EA201992882 EA 201992882 EA 045780 B1 EA045780 B1 EA 045780B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
mir
hsa
mecp2
nucleic acid
expression
Prior art date
Application number
EA201992882
Other languages
English (en)
Inventor
Мигель Сена Эстевес
Гуанпин ГАО
Майкл Р. Грин
Дэн Ван
Тесса Мерседес Симоне
Original Assignee
Юниверсити Оф Массачусеттс
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Юниверсити Оф Массачусеттс filed Critical Юниверсити Оф Массачусеттс
Publication of EA045780B1 publication Critical patent/EA045780B1/ru

Links

Description

Родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с §119(е) раздела 35 Кодекса законов США по дате подачи предварительной заявки на патент США с серийным номером 62/516060, поданной 6 июня 2017 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Синдром Ретта представляет собой неврологическое заболевание, вызванное мутациями с потерей функции в гене МеСР2. Наблюдали, что восстановление экспрессии МеСР2 в постнатальный период является эффективным в обращении развития некоторых из фенотипов, присутствующих у МеСР2 мышей, но остаются вопросы в отношении безопасности. Кроме того, в исследованиях, оценивающих терапевтическую эффективность определенных векторов с МеСР2, кодирующих изоформу e1, наблюдали только частичное избавление от фенотипов, характерных для синдрома Ретта. Эти исследования, как правило, сосредоточивались на внутрисосудистой (IV) или интрацеребровентрикулярной (ICV) доставке в неонатальный период и в некоторых случаях столкнулись с летальной печеночной токсичностью и поджатием задней конечности.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Аспекты настоящего раскрытия относятся к открытию, что определенные комбинации регуляторных элементов для miRNA (MRE), например, сайтов связывания miRNA, ассоциированных с петлями отрицательной обратной связи для экспрессии гена, и сайтов связывания miRNA, которые нарушают нацеливание экспрессии трансгена на нецелевые ткани, обеспечивают возможность настраиваемой экспрессии трансгена в пределах узкого диапазона, совместимого с нормальным функционированием белка и избежанием нецелевой токсичности трансгена. Вследствие этого в соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиции и способы, описанные в настоящем раскрытии, являются пригодными для лечения заболеваний и нарушений, ассоциированных с мутациями с потерей функции, например синдрома Ретта, который ассоциирован с мутациями с потерей функции в гене МЕСР2.
Соответственно в соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к способу конструирования трансгена, при этом способ предусматривает выбор первого гена, кодирующего первый продукт в клетке; выбор второго гена, кодирующего второй продукт в клетке; определение того, что экспрессия второго продукта положительно регулируется первым продуктом в клетке; выбор miRNA; определение того, что экспрессия miRNA положительно регулируется вторым продуктом в клетке; и конструирование трансгена для экспрессии в клетке транскрипта, имеющего кодирующий участок, который кодирует первый продукт, и имеющего один или несколько сайтов связывания для miRNA.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к способу конструирования трансгена, при этом способ предусматривает выбор первого гена, кодирующего первый продукт в клетке; выбор miRNA, экспрессия которой положительно регулируется первым продуктом в клетке; и конструирование трансгена, который экспрессирует транскрипт, имеющий кодирующий участок, который кодирует первый продукт, и 3'-некодирующий участок, содержащий один или несколько сайтов связывания для miRNA.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к способу конструирования трансгена, при этом способ предусматривает выбор первого гена, кодирующего первый продукт в клетке; выбор второго гена, кодирующего второй продукт в клетке; определение того, что экспрессия второго продукта положительно регулируется первым продуктом в клетке; выбор miRNA; определение того, что экспрессия miRNA положительно регулируется вторым продуктом в клетке; и конструирование трансгена для экспрессии в клетке транскрипта, имеющего кодирующий участок, который кодирует первый продукт, и 3'-некодирующий участок, содержащий один или несколько сайтов связывания для miRNA.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, кодирующей транскрипт, имеющий i) кодирующий участок, который кодирует белок, и ii) два или больше сайтов связывания miRNA, при этом два или больше сайтов связывания miRNA содержат по меньшей мере один первый сайт связывания miRNA, специфический в отношении первой miRNA, которая положительно регулируется экспрессией белка в клетке целевой ткани; и по меньшей мере один второй сайт связывания miRNA, специфический в отношении второй miRNA, которая экспрессируется независимо от экспрессии белка в клетках нецелевой ткани.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, кодирующей транскрипт, имеющий кодирующий участок, который кодирует белок человеческого МеСР2 или его функциональный фрагмент, и 3'-некодирующий участок, содержащий один или несколько сайтов связывания miRNA, при этом один или несколько сайтов связывания miRNA содержат по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая отрицательно регулирует экспрессию транскрипта; и по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая ингибирует экспрессию транскрипта в нецелевой ткани.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, кодирующей транскрипт, имеющий кодирующий участок, который кодирует человеческий МеСР2 или его функциональный фрагмент, и 3'-некодирующий участок, содержащий один или несколько сайтов связывания miRNA, при этом транскрипт фланкирован инвертированными концевыми
- 1 045780 повторами (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ITR AAV представляет собой ITR AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 или AAV6. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ITR представляют собой искусственные последовательности, которые заменяют функцию ITR, например, которые раскрыты в международной заявке WO/2016/172008.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к вирусному вектору, содержащему рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая описана в настоящем раскрытии. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вирусный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), аденовирусный вектор, лентивирусный вектор, вектор на основе вируса герпеса или вектор на основе бакуловируса.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к рекомбинантному аденоассоциированному вирусу (rAAV), содержащему рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая описана в настоящем раскрытии; по меньшей мере один инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и белок капсида.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к вектору на основе рекомбинантного AAV (rAAV) для саморегулируемой экспрессии белка, при этом вектор на основе rAAV содержит нуклеиновую кислоту, сконструированную для экспрессии в клетке целевой ткани транскрипта, кодирующего белок, при этом транскрипт содержит по меньшей мере один первый сайт связывания miRNA, специфический в отношении первой miRNA, причем экспрессия первой miRNA положительно регулируется экспрессией белка в клетке.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к композиции, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая описана в настоящем раскрытии, или rAAV, который описан в настоящем раскрытии, и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиция составлена для инъекции, например, системной инъекции (например, внутривенной инъекции) или интратекальной инъекции.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления первый продукт представляет собой белок. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления белок представляет собой МеСР2, например, изоформу el MeCP2 или изоформу е2 МеСР2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления первый продукт представляет собой miRNA или длинную некодирующую РНК.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления второй продукт представляет собой белок или нуклеиновую кислоту. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления второй продукт представляет собой нейротрофический фактор кости (BDNF). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нуклеиновая кислота представляет собой miRNA (например, miR-132). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления первая miRNA представляет собой miR-132.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая отрицательно регулирует экспрессию транскрипта, содержит сайт связывания miR-132, например, два или три сайта связывания miR-132.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая ингибирует экспрессию транскрипта в нецелевой ткани, содержит сайт связывания miR-1, сайт связывания mir-122 или сайт связывания miR-1 и miR-122. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая ингибирует экспрессию транскрипта в нецелевой ткани, содержит три сайта связывания miR-1 (например, 3х-miR-1) и три сайта связывания miR-122 (например, 3х-miR-122).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы, описанные в настоящем раскрытии, дополнительно предусматривают стадию конструирования 3'-некодирующего участка транскрипта, чтобы он содержал один или несколько сайтов связывания для одной или нескольких нарушающих нацеливание miRNA. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одна или несколько нарушающих нацеливание miRNA ингибируют экспрессию трансгена в печени, сердце, легком, мышце, поджелудочной железе или иммунных (например, антиген-презентирующих) клетках. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одна или несколько нарушающих нацеливание miRNA представляют собой miR-122, miR-1 или miR-122 и miR-1. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одна или несколько нарушающих нацеливание miRNA ингибируют экспрессию трансгена в иммунных клетках, таких как антиген-презентирующие клетки (например, дендритные клетки, макрофаги и т.д.). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одна или несколько нарушающих нацеливание miRNA представляют собой miR-15a, miR-16-1, miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1, miR-21, miR-29a, miR-29b, miR-29c, miR-30b, miR-31, miR-34a, miR-92a-1, miR-106a, miR-125a, miR-125b, miR-126, miR-142-3р, miR-146a, miR-150, miR-155, miR-181a, miR-223 или miR-424.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сайт связывания miRNA или сайты связывания miRNA расположены между последним кодоном кодирующего участка и поли-А-хвостом транскрипта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способов, описанных в настоящем рас- 2 045780 крытии, стадия конструирования трансгена предусматривает вставку трансгена в вектор. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вектор представляет собой клонирующий вектор, экспрессионный вектор, плазмидный или вирусный вектор.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор, например, промотор мышиного МеСР2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления промотор мышиного МеСР2 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота расположена на плазмиде.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления белок капсида представляет собой белок капсида, который способствует пересечению rAAV гематоэнцефалического барьера субъекта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления белок капсида имеет серотип, выбранный из группы, состоящей из AAV-РНР.В, AAV1, AAV2, AAV2i8, AAV2.5, AAV5, AAV6, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAV-B1, AAV9.45A-String (например, AAV9.45-AS), AAV9.45Angiopep, AAV9.47-Angiopep, и AAV9.47-AS, AAV5, AAVrh39, AAVrh43, CAM130, и AAV9HR. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления белок капсида имеет серотип, который описан в международной заявке WO 2015/127128, WO 2016/054554, WO 2016/054557 или WO 2016/065001. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления белок капсида содержит или состоит из последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 14 или 15 (например, AAV-PHP.B или AAV9).
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к способу лечения синдрома Ретта у субъекта, при этом способ предусматривает введение субъекту с синдромом Ретта или с подозрением на синдром Ретта эффективного количества: рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая описана в настоящем раскрытии; rAAV, который описан в настоящем раскрытии; или композиции, которая описана в настоящем раскрытии.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект представляет собой субъектачеловека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект имеет возраст менее одного года. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект характеризуется мутацией по меньшей мере в одной копии гена МеСР2, например мутацией с потерей функции.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рекомбинантную нуклеиновую кислоту, rAAV или композицию, которые описаны в настоящем раскрытии, вводят посредством инъекции, например, системной инъекции (например, внутривенной инъекции) или интратекальной инъекции. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления введение приводит в результате к пересечению эффективным количеством рекомбинантной нуклеиновой кислоты, rAAV или композиции гематоэнцефалического барьера субъекта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления введение приводит в результате к нетоксичному уровню экспрессии МеСР2 в головном мозге субъекта.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А, 1В представлена характеристика новых векторов AAV-MeCP2 для безопасной и эффективной генной терапии при синдроме Ретта. На фиг. 1А представлено схематическое изображение гомеостатического механизма ауторегуляции МеСР2. На фиг. 1В представлено схематическое изображение структуры саморегулируемых векторов AAV-MeCP2, кодирующих человеческий МеСР2-е1 с меткой myc под управлением промотора мышиного МеСР2 (с -223 по +56) и различными элементами, распознаваемыми микроРНК (например, miR-122/1T; miR-132T).
На фиг. 2А-2С представлена эффективная экспрессия AAV2-MeCP2 в клетках HEK293T. На фиг. 2А представлена экспрессия МеСР2, измеренная с помощью Вестерн-блоттинга. На фиг. 2В представлена экспрессия МеСР2, измеренная с помощью нормализованного анализа экспрессии белка (фиг. 2В). На фиг. 2С представлен профиль токсичности у клеток 293Т, трансдуцированных AAV2-MeCP2, в течение четырех суток при дозе 30000 gc(копий генома)/клетка.
На фиг. 3А-3С представлена экспрессия AAV2-MeCP2 в нейронах коры головного мозга мыши. На фиг. 3А представлены результаты для первичных нейронов коры головного мозга мышей, которых трансдуцировали дозами вектора на основе AAV в диапазоне от 1Е3-1Е5 vg(вирусных геномов)/клетка, в том числе AAV-GFP в качестве контроля. На фиг. 3В представлены результаты анализа экспрессии hMeCP2-myc методом Вестерн-блоттинга в нейронах через 5 суток после инфицирования 3Е4 геномов вектора (доза)/клетка. На фиг. 3С представлена экспрессия miR-132 в ответ на повторную доставку AAV2-MeCP2.
На фиг. 4А-4С представлены репрезентативные данные, полученные в результате in vivo экспериментов на мышах. На фиг. 4А представлены данные для мышей дикого типа, которым вводили инъекцией через лицевую вену в 1 сутки после рождения AAV, который кодирует изоформу e1 человеческого МеСР2, содержащий 0, 1, 2 или 3 последовательности-мишени miR-132. Животных дикого типа умерщвляли через 3 месяца после инъекции и целый головной мозг, ткань сердца и печени подвергали экстракции общей РНК, синтезу кДНК и qRT-PCR (количественная ПЦР с обратной транскрипцией) с применением праймеров, специфических в отношении изоформы e1 человеческого МеСР2. Данные нормализовали к AAV-MeCP2, содержащему 3 последовательности-мишени miR-132, который принимали за 1. На
- 3 045780 фиг. 4В представлен анализ экспрессии гена изоформы el человеческого МеСР2 в головном мозге мышей дикого типа после внутричерепной инъекции AAV-MeCP2. На фиг. 4С представлен анализ экспрессии гена изоформы e1 человеческого МеСР2 в головном мозге мышей дикого типа после внутричерепной инъекции AAV-MeCP2.
На фиг. 5 представлена экспрессия МеСР2, запускаемая конструкциями, описанными в настоящем раскрытии, которые эффективно нарушают нацеливание на сердце и печень.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Аспекты настоящего раскрытии относятся, отчасти, к векторам на основе AAV, способным к саморегуляции уровней экспрессии трансгена (например, МеСР2), для предупреждения токсичности, связанной со сверхэкспрессией. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления механизм саморегуляции основывается на присутствии нескольких копий регуляторного элемента для miRNA (например, одного или нескольких сайтов связывания miR-132) в 3'UTR кассеты с трансгеном. Как дополнительно описано в разделе Примеры, векторы на основе AAV, способные к саморегуляции экспрессии трансгена, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления характеризуются улучшенной эффективностью и профилем безопасности по сравнению с другими векторами на основе AAV, например, векторами на основе AAV, содержащими только нативные промоторы трансгена. Следует понимать, что наблюдения, описанные в разделе Примеры в контексте конструкций miR-132/MeCP2, являются применимыми к другим конструкциям для экспрессии трансгена, содержащим сайты связывания других miR, которые регулируют экспрессию белка (например, посредством петли отрицательной обратной связи).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления пути доставки, которые наиболее вероятно опосредуют повсеместную доставку гена в ЦНС (например, системная инъекция и интратекальная инъекция), вероятно, приводят в результате к высокому уровню трансдукции периферических органов, в которых экспрессия трансгена (например, МеСР2) может становится токсичной. Настоящее раскрытие основывается, отчасти, на понимании, что объединение регуляторных элементов для miRNA (MRE), таких как сайты связывания miRNA (например, сайты связывания miR-122 и сайты связывания miR-1), с MRE, ассоциированными с петлями отрицательной обратной связи, регулирующими экспрессию белка (например, сайты связывания miR-132 в случае МеСР2), одновременно регулирует уровни экспрессии трансгена и нарушает нацеливание экспрессии трансгена на периферические органы.
Соответственно в соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к способу конструирования трансгена, при этом способ предусматривает выбор первого гена, кодирующего первый продукт в клетке; выбор miRNA, экспрессия которой положительно регулируется первым продуктом в клетке; и конструирование трансгена, который экспрессирует транскрипт, имеющий кодирующий участок, который кодирует первый продукт, и один или несколько сайтов связывания для miRNA. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько сайтов связывания для miRNA расположены в 3'-некодирующем участке транскрипта.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к способу конструирования трансгена, при этом способ предусматривает выбор первого гена, кодирующего первый продукт в клетке; выбор второго гена, кодирующего второй продукт в клетке; определение того, что экспрессия второго продукта положительно регулируется первым продуктом в клетке; выбор miRNA; определение того, что экспрессия miRNA положительно регулируется вторым продуктом в клетке; и конструирование трансгена для экспрессии в клетке транскрипта, имеющего кодирующий участок, который кодирует первый продукт, и один или несколько сайтов связывания для miRNA. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько сайтов связывания для miRNA расположены в 3'некодирующем участке транскрипта.
В контексте данного документа конструирование трансгена относится к получению (например, синтезу) рекомбинантной нуклеиновой кислоты с применением методик клонирования гена, таких как полимеразная цепная реакция (ПНР), расщепление рестрикционными ферментами и лигирование нуклеиновой кислоты in vitro, например, как описано в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
В контексте данного документа продукт или продукт гена относится к нуклеиновой кислоте (например, РНК транскрипту, дцРНК, miRNA и т.д.), пептиду, белку или полипептиду, которые транскрибируются и/или транслируются с последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления продукт представляет собой РНК транскрипт, содержащий кодирующий белок участок. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления кодирующий белок участок кодирует белок, ассоциированный с заболеванием, вызванным мутацией с потерей функции (например, МеСР2). Дополнительные примеры белков, ассоциированных с заболеванием, вызванным мутацией с потерей функции, включают в себя без ограничения тирозиназу (тирозинемия), лизосомальную кислую бета-галактозидазу (GM1-ганглиозидоз), бета-гексозаминидазу А и В (болезнь Тея-Сакса и Сандхоффа), аспартоацилазу (ASPA; болезнь Канавана), аспартилглюкозаминидазу (апартилглюкозаминурия), пальмитоил-протеинтиоэстеразу (детская форма болезни Баттена), трипептидил-пептидазу (поздняя детская форма болезни Баттена), α-галактозидазу (болезнь Фабри), α-фукозидазу
- 4 045780 (фукозидоз), защитный белок/катепсин А (галактосиалидоз), β-глюкозидазу (болезнь Гоше), галактозилцерамидазу (глобоидно-клеточная лейкодистрофия), α-маннозидазу (α-маннозидоз), арилсульфатазу А (метахроматическая лейкодистрофия), a-L-идуронидазу (мукополисахаридоз I), α-Nацетилглюкозаминидазу (мукополисахаридоз IIIB), арилсульфатазу В (мукополисахаридоз VI), β-глюкуронидазу (мукополисахаридоз VII), кислую сфингомиелиназу (болезнь Ниманна-Пика), α-глюкозидазу (болезнь Помпе) и кислую липазу (болезнь Вольмана), FOXG1 (синдром FOXG1), CDKL5, N-GlyI, Glut-1 (болезнь де Виво) и т.д.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления продукт представляет собой интерферирующую нуклеиновую кислоту, например, miRNA, которая регулирует экспрессию или активность продукта гена.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один продукт регулирует экспрессию гена или экспрессию белка второго продукта. Регуляция экспрессии или трансляции продукта гена может быть положительной или отрицательной. Положительная регуляция относится к повышению экспрессии или активности гена (например, в результате экспрессии или активности продукта другого гена). Отрицательная регуляция относится к снижению или ингибированию экспрессии или активности гена (например, в результате экспрессии или активности продукта другого гена посредством петли обратной связи).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления продукты гена, такие как факторы роста, транскрипционные факторы (например, как описано в Wang et al., Nucleic Acids Res., 2010 Jan, 38 (номер в базе данных): Dl 19-D122) и т.д., являются способными к регуляции экспрессии или активности трансгена в клетке или у субъекта. Примеры факторов роста включают в себя нейротрофины, такие как нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF), нейротрофин 3, нейротрофин 4, глиальный нейротрофический фактор (GDNF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), фактор роста фибробластов (FGF1-23), нейротурин, инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF-2) и т.д.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансгены, которые описаны в настоящем раскрытии, сконструированы таким образом, чтобы содержать по меньшей мере один регуляторный элемент для miRNA (например, сайт связывания miRNA), который ассоциирован с регуляторной петлей экспрессии гена (например, петлями отрицательной обратной связи, петлями положительной обратной связи и т.д.). В целом, регуляторные петли экспрессии гена могут быть эндогенными по отношению к клетке или искусственными (например, один или несколько элементов петли обратной связи обеспечивают вместе с трансгеном). В одном примере петли отрицательной обратной связи экспрессия МеСР2 в клетке вызывает повышение содержания нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) в клетке, который, в свою очередь, повышает экспрессию miR-132, которая, в свою очередь, регулирует экспрессию МеСР2 (фиг. 1). Следует понимать, что в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее раскрытие относится к петлям положительной обратной связи, которые можно применять для усиления экспрессии трансгена.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансгены, которые описаны в настоящем раскрытии, сконструированы таким образом, чтобы содержать по меньшей мере один регуляторный элемент для miRNA (например, сайт связывания miRNA), который нарушает нацеливание экспрессии трансгена на одну или несколько нецелевых тканей. В контексте данного документа нецелевая ткань относится к ткани (например, клеткам ткани), в которой экспрессия трансгена является нежелательной. Например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления сверхэкспрессия МеСР2 в клетке приводит в результате к цитотоксичности в печени; в этом контексте ткань печени (например, клетки печени) является нецелевой тканью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нецелевая ткань представляет собой печень (например, клетки печени), сердце (например, клетки сердца), поджелудочную железу (например, клетки поджелудочной железы), мышцу (например, мышечные клетки), иммунную клетку (например, антиген-презентирующую клетку и т.д.) или любую их комбинацию.
В контексте данного документа целевая ткань относится к ткани (например, клеткам ткани), в которой экспрессия трансгена является предпочтительной по сравнению с другими тканями, такими как нецелевые ткани. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления целевая ткань представляет собой ткань ЦНС (например, клетки ЦНС, такие как нейроны). Неограничивающие примеры ткани ЦНС включают в себя ткань головного мозга (например, нейроны, глиальные клетки и т.д.) и ткань спинного мозга.
Обычно один или несколько сайтов связывания miRNA в транскрипте, кодируемом трансгеном, расположены в 3'-нетранслируемом участке (3'UTR) транскрипта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько сайтов связывания miRNA расположены между последним кодоном кодирующего участка транскрипта и поли-А-хвостом транскрипта. Тем не менее следует понимать, что в соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько сайтов связывания miRNA расположены в участке, отличном от 3'UTR транскрипта, например, в интроне на 5'-конце транскрипта. Число сайтов связывания miRNA, встроенных посредством конструирования в трансген,
- 5 045780 который описан в настоящем раскрытии, будет варьировать в зависимости от продукта гена, кодируемого трансгеном, и может быть определено эмпирически квалифицированным специалистом без чрезмерного количества экспериментов. Например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансген, который описан в настоящем раскрытии, содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 сайтов связывания miRNA. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансген, который описан в настоящем раскрытии, содержит более 10 (например, любое целое число от 11 до 100) сайтов связывания miRNA. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансген, который описан в настоящем раскрытии, содержит 3, 4 или 5 сайтов связывания miRNA. Каждый из одного или нескольких сайтов связывания miRNA может связываться с одной и той же miRNA или отличной miRNA. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансген, который описан в настоящем раскрытии, содержит один или несколько (например, 3) сайтов связывания miR-122, один или несколько (например, 3) сайтов связывания miR-1 и три сайта связывания miR-132.
Рекомбинантные нуклеиновые кислоты.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансген, который описан в настоящем раскрытии, кодируется рекомбинантной нуклеиновой кислотой. Последовательность нуклеиновой кислоты относится к последовательностям ДНК или РНК. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления белки и нуклеиновые кислоты согласно настоящему раскрытию являются выделенными. В контексте данного документа термин выделенный означает полученный искусственно. В контексте данного документа применительно к нуклеиновым кислотам термин выделенный означает (i) амплифицированный in vitro, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР); (ii) полученный рекомбинантно с помощью клонирования; (iii) очищенный посредством расщепления и разделения на геле; или (iv) синтезированный, например, с помощью химического синтеза. Выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая легко поддается манипуляции с помощью методик с использованием рекомбинантной ДНК, хорошо известных в уровне техники. Таким образом, нуклеотидная последовательность, которая содержится в векторе, в котором 5' и 3' сайты рестрикции являются известными, или для которой были раскрыты последовательности праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР), считается выделенной, но последовательность нуклеиновой кислоты, существующая в своем нативном состоянии в своем естественном хозяине не считается таковой. Выделенная нуклеиновая кислота может быть, по существу, очищенной, но не обязательно является таковой. Например, нуклеиновая кислота, которая является выделенной в клонирующем или экспрессионном векторе, не является чистой в том смысле, что она может составлять только малый процент материала в клетке, в которой она находится. Тем не менее такая нуклеиновая кислота является выделенной в контексте термина, используемого в данном документе, поскольку она легко поддается манипуляции с помощью стандартных методик, известных квалифицированным специалистам в данной области техники. При использовании в данном документе применительно к белкам или пептидам термин выделенный относится к белку или пептиду, который был выделен из своего естественного окружения или получен искусственно (например, с помощью химического синтеза, с помощью технологии с использованием рекомбинантной ДНК и т.д.).
Квалифицированному специалисту также будет понятно, что консервативные аминокислотные замены могут быть выполнены для того, чтобы обеспечить функционально эквивалентные варианты или гомологи белков капсида. В соответствии с некоторыми аспектами настоящим раскрытием охвачены изменения последовательности, которые приводят в результате к консервативным аминокислотным заменам. В контексте данного документа консервативная аминокислотная замена относится к аминокислотной замене, которая не изменяет характеристики относительного заряда или размера белка, в котором выполнена аминокислотная замена. Варианты могут быть получены в соответствии со способами изменения полипептидной последовательности, известными квалифицированному специалисту в данной области техники, такими как находящиеся в источниках, в которых собраны такие способы, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. Консервативные замены аминокислот включают в себя замены, производимые между аминокислотами в составе следующих групп: (а) М, I, L, V; (b) F, Y, W; (с) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N и (g) E, D. Таким образом, можно произвести консервативные аминокислотные замены в аминокислотной последовательности белков и полипептидов, раскрытых в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нуклеиновая кислота, которая описана в настоящем раскрытии, содержится в векторе. В контексте данного документа термин вектор включает в себя любой генетический элемент, такой как плазмида, фаг, транспозон, космида, хромосома, искусственная хромосома, вирус, вирион и т.д., который является способным к репликации, когда он ассоциирован с соответствующими управляющими элементами, и который может переносить последовательности генов между клетками. Таким образом, термин включает в себя средства для клонирования и экспрессии, а также вирусные векторы. Примеры вирусных векторов включают в себя аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), лентивирусные векторы, векторы на основе вируса герпеса, векторы на основе бакуловируса и т.д.
- 6 045780
МеСР2.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к композициям и способам для экспрессии белка МеСР2 в клетке или у субъекта. МеСР2 относится к метил-CpGсвязывающему белку 2, который кодируется геном МеСР2 и играет важные роли (например, функционирует в качестве транскрипционного репрессора или транскрипционного активатора) в нервных клетках, таких как зрелые нейроны. Один пример гена МеСР2 представлен под номером доступа в GenBank NM_001110792 (МеСР2-e1). Другой пример гена МеСР2 представлен под номером доступа в GenBank NM_001110792 (МеСР2-е2). Ген МеСР2 кодирует две изоформы белка МеСР2, называемые изоформой e1 MeCP2 и изоформой е2 МеСР2, которые отличаются длиной их N-конца. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изоформа e1 MeCP2 представлена последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изоформа е2 МеСР2 представлена последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 2.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансген (например, рекомбинантная нуклеиновая кислота) кодирует функциональный фрагмент белка МеСР2 (например, фрагмент изоформы e1 или изоформы е2). Функциональный фрагмент МеСР2 представляет собой усеченный белок МеСР2, который сохраняет естественную функцию (например, транскрипционный активатор или транскрипционный репрессор) белка МеСР2 дикого типа (например, полноразмерного белка). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления функциональный фрагмент МеСР2 содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более усечений аминокислот по сравнению с полноразмерным белком МеСР2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления функциональный фрагмент МеСР2 содержит приблизительно от 1 до 10, от 5 до 50, от 20 до 100 усечений аминокислот по сравнению с полноразмерным белком МеСР2.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансген (например, рекомбинантная нуклеиновая кислота) кодирует вариант белка МеСР2 (например, вариант изоформы e1 или изоформы е2). Вариант белка МеСР2 может характеризоваться идентичностью, составляющей от приблизительно 50% до приблизительно 99,9%, с белком МеСР2 дикого типа (например, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вариант МеСР2 является приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95% или приблизительно на 99% идентичным белку МеСР2 дикого типа (например, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2).
miRNA и сайты связывания miRNA.
Настоящее раскрытие основывается, отчасти, на понимании, что объединение регуляторных элементов для miRNA (MRE), таких как сайты связывания miRNA (например, сайты связывания miR-122 и сайты связывания miR-1), с MRE, ассоциированными с петлями отрицательной обратной связи, регулирующими экспрессию белка (например, сайты связывания miR-132 в случае МеСР2), одновременно регулирует уровни экспрессии трансгена и нарушает нацеливание экспрессии трансгена на периферические органы.
miRNA и другие малые интерферирующие нуклеиновые кислоты регулируют экспрессию гена посредством расщепления/разрушения РНК транскрипта-мишени или трансляционной репрессии информационной РНК(мРНК)-мишени. miRNA экспрессируются в нативном состоянии, как правило, в виде конечных 19-25 нетранслируемых РНК-продуктов. miRNA проявляют свою активность посредством последовательность-специфических взаимодействий с 3'-нетранслируемыми участками (UTR) мРНКмишеней. Эти эндогенно экспрессирующиеся miRNA образуют шпилечные предшественники, которые затем подвергаются процессингу в дуплекс miRNA, а в дальнейшем в зрелую одноцепочечную молекулу miRNA. Эта зрелая miRNA управляет мультибелковым комплексом, miRISC, который идентифицирует целевой сайт, например, в участках 3' UTR, в мРНК-мишени на основании их комплементарности зрелой miRNA.
Следующий неограничивающий перечень генов miRNA и их гомологи являются пригодными в способах и композициях согласно настоящему раскрытию (например, для опосредования саморегулируемой экспрессии или нарушения нацеливания трансгена).
hsa-let-7a, hsa-let-7a*, hsa-let-7b, hsa-let-7b*, hsa-let-7c, hsa-let-7c*, hsa-let-7d, hsa-let-7d*, hsa-let7e, hsa-let-7e*, hsa-let-7f, hsa-let-7f-l*, hsa-let-7f-2*, hsa-let-7g, hsa-let-7g*, hsa-let-7i, hsa-let7i*, hsa-miR-1, hsa-miR-100, hsa-miR-100*, hsa-miR-101, hsa-miR-101*, hsa-miR-103, hsamiR-105, hsa-miR-105*, hsa-miR-106a, hsa-miR-106a*, hsa-miR-106b, hsa-miR-106b*, hsamiR-107, hsa-miR-lOa, hsa-miR-10a*, hsa-miR-lOb, hsa-miR-10b*, hsa-miR-1178, hsa-miR1179, hsa-miR-1180, hsa-miR-1181, hsa-miR-1182, hsa-miR-1183, hsa-miR-1184, hsa-miR- 7 045780
1185, hsa-miR-1197, hsa-miR-1200, hsa-miR-1201, hsa-miR-1202, hsa-miR-1203, hsa-miR1204, hsa-miR-1205, hsa-miR-1206, hsa-miR-1207-Зр, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR-1208, hsamiR-122, hsa-miR-122*, hsa-miR-1224-3p, hsa-miR-1224-5p, hsa-miR-1225-Зр, hsa-miR-12255p, hsa-miR-1226, hsa-miR-1226*, hsa-miR-1227, hsa-miR-1228, hsa-miR-1228*, hsa-miR1229, hsa-miR-1231, hsa-miR-1233, hsa-miR-1234, hsa-miR-1236, hsa-miR-1237, hsa-miR1238, hsa-miR-124, hsa-miR-124*, hsa-miR-1243, hsa-miR-1244, hsa-miR-1245, hsa-miR-1246, hsa-miR-1247, hsa-miR-1248, hsa-miR-1249, hsa-miR-1250, hsa-miR-1251, hsa-miR-1252, hsamiR-1253, hsa-miR-1254, hsa-miR-1255a, hsa-miR-1255b, hsa-miR-1256, hsa-miR-1257, hsamiR-1258, hsa-miR-1259, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-125b1*, hsa-miR-125b-2*, hsa-miR-126, hsa-miR-126*, hsa-miR-1260, hsa-miR-1261, hsa-miR1262, hsa-miR-1263, hsa-miR-1264, hsa-miR-1265, hsa-miR-1266, hsa-miR-1267, hsa-miR1268, hsa-miR-1269, hsa-miR-1270, hsa-miR-1271, hsa-miR-1272, hsa-miR-1273, hsa-miR-1273p, hsa-miR-1274a, hsa-miR-1274b, hsa-miR-1275, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-1276, hsa-miR1277, hsa-miR-1278, hsa-miR-1279, hsa-miR-128, hsa-miR-1280, hsa-miR-1281, hsa-miR-1282, hsa-miR-1283, hsa-miR-1284, hsa-miR-1285, hsa-miR-1286, hsa-miR-1287, hsa-miR-1288, hsamiR-1289, hsa-miR-129*, hsa-miR-1290, hsa-miR-1291, hsa-miR-1292, hsa-miR-1293, hsamiR-129-Зр, hsa-miR-1294, hsa-miR-1295, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-1296, hsa-miR-1297, hsamiR-1298, hsa-miR-1299, hsa-miR-1300, hsa-miR-1301, hsa-miR-1302, hsa-miR-1303, hsamiR-1304, hsa-miR-1305, hsa-miR-1306, hsa-miR-1307, hsa-miR-1308, hsa-miR-130a, hsa-miR130a*, hsa-miR-130b, hsa-miR-130b*, hsa-miR-132, hsa-miR-132*, hsa-miR-1321, hsa-miR1322, hsa-miR-1323, hsa-miR-1324, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-134, hsa-miR-135a, hsa-miR-135a*, hsa-miR-135b, hsa-miR-135b*, hsa-miR-136, hsa-miR-136*, hsa-miR-137, hsamiR-138, hsa-miR-138-1*, hsa-miR-138-2*, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-140-Зр, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-141, hsa-miR-141*, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-143, hsa-miR-143*, hsa-miR-144, hsa-miR-144*, hsa-miR-145, hsa-miR-145*, hsa-miR-146a, hsamiR-146a*, hsa-miR-146b-3p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-147, hsa-miR-147b, hsa-miR-148a, hsa-miR-148a*, hsa-miR-148b, hsa-miR-148b*, hsa-miR-149, hsa-miR-149*, hsa-miR-150, hsamiR-150*, hsa-miR-15l-3p, hsa-miR-15l-5p, hsa-miR-152, hsa-miR-153, hsa-miR-154, hsamiR-154*, hsa-miR-155, hsa-miR-155*, hsa-miR-15a, hsa-miR-15a*, hsa-miR-15b, hsa-miR15b*, hsa-miR-16, hsa-miR-16-1*, hsa-miR-16-2*, hsa-miR-17, hsa-miR-17*, hsa-miR-181a, hsa-miR-181a*, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181c*, hsa-miR-181d, hsa-miR-182, hsa-miR-182*, hsa-miR-1825, hsa-miR-1826, hsa-miR-1827, hsa-miR-183, hsamiR-183*, hsa-miR-184, hsa-miR-185, hsa-miR-185*, hsa-miR-186, hsa-miR-186*, hsa-miR187, hsa-miR-187*, hsa-miR-188-3p, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-18a, hsa-miR-18a*, hsa-miR18b, hsa-miR-18b*, hsa-miR-190, hsa-miR-190b, hsa-miR-191, hsa-miR-191*, hsa-miR-192, hsa-miR-192*, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b, hsa-miR-193b*, hsa-miR194, hsa-miR-194*, hsa-miR-195, hsa-miR-195*, hsa-miR-196a, hsa-miR-196a*, hsa-miR-196b, hsa-miR-197, hsa-miR-198, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR19a, hsa-miR-19a*, hsa-miR-19b, hsa-miR-19b-l*, hsa-miR-19b-2*, hsa-miR-200a, hsa-miR200a*, hsa-miR-200b, hsa-miR-200b*, hsa-miR-200c, hsa-miR-200c*, hsa-miR-202, hsa-miR202*, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR-206, hsa-miR-208a, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20a*, hsa-miR-20b, hsa-miR-20b*, hsa-miR-21, hsa-miR-21*, hsa-miR210, hsa-miR-211, hsa-miR-212, hsa-miR-214, hsa-miR-214*, hsa-miR-215, hsa-miR-216a, hsa
- 8 045780 miR-216b, hsa-miR-217, hsa-miR-218, hsa-miR-218-1*, hsa-miR-218-2*, hsa-miR-219-l-3p, hsa-miR-219-2-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-22, hsa-miR-22*, hsa-miR-220a, hsa-miR-220b, hsa-miR-220c, hsa-miR-221, hsa-miR-221*, hsa-miR-222, hsa-miR-222*, hsa-miR-223, hsamiR-223*, hsa-miR-224, hsa-miR-23a, hsa-miR-23a*, hsa-miR-23b, hsa-miR-23b*, hsa-miR-24, hsa-miR-24-1*, hsa-miR-24-2*, hsa-miR-25, hsa-miR-25*, hsa-miR-26a, hsa-miR-26a-l*, hsamiR-26a-2*, hsa-miR-26b, hsa-miR-26b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-27a*, hsa-miR-27b, hsa-miR27b*, hsa-miR-28-Зр, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-296-Зр, hsa-miR-296-5p, hsa-miR-297, hsa-miR298, hsa-miR-299-Зр, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-29a*, hsa-miR-29b, hsa-miR-29b1*, hsa-miR-29b-2*, hsa-miR-29c, hsa-miR-29c*, hsa-miR-300, hsa-miR-301a, hsa-miR-301b, hsa-miR-302a, hsa-miR-302a*, hsa-miR-302b, hsa-miR-302b*, hsa-miR-302c, hsa-miR-302c*, hsa-miR-302d, hsa-miR-302d*, hsa-miR-302e, hsa-miR-302f, hsa-miR-30a, hsa-miR-30a*, hsamiR-30b, hsa-miR-30b*, hsa-miR-30c, hsa-miR-30c-l*, hsa-miR-30c-2*, hsa-miR-30d, hsamiR-30d*, hsa-miR-30e, hsa-miR-30e*, hsa-miR-31, hsa-miR-31*, hsa-miR-32, hsa-miR-32*, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-320d, hsa-miR-323-3p, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-325, hsa-miR-326, hsa-miR-328, hsa-miR-329, hsamiR-330-3p, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-331-5p, hsa-miR-335, hsa-miR-335*, hsa-miR-337-3p, hsa-miR-337-5p, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-339-3p, hsa-miR339-5p, hsa-miR-33a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-33b, hsa-miR-33b*, hsa-miR-340, hsa-miR-340*, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-345, hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34a*, hsamiR-34b, hsa-miR-34b*, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-361-3p, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363, hsa-miR-363*, hsa-miR-365, hsa-miR-367, hsamiR-367*, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-369-5p, hsa-miR-370, hsa-miR-371-3p, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-372, hsa-miR-373, hsa-miR-373*, hsa-miR-374a, hsa-miR-374a*, hsa-miR-374b, hsamiR-374b*, hsa-miR-375, hsa-miR-376a, hsa-miR-376a*, hsa-miR-376b, hsa-miR-376c, hsamiR-377, hsa-miR-377*, hsa-miR-378, hsa-miR-378*, hsa-miR-379, hsa-miR-379*, hsa-miR380, hsa-miR-380*, hsa-miR-381, hsa-miR-382, hsa-miR-383, hsa-miR-384, hsa-miR-409-Зр, hsa-miR-409-5p, hsa-miR-410, hsa-miR-411, hsa-miR-411*, hsa-miR-412, hsa-miR-421, hsamiR-422a, hsa-miR-423-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-424, hsa-miR-424*, hsa-miR-425, hsamiR-425*, hsa-miR-429, hsa-miR-431, hsa-miR-431*, hsa-miR-432, hsa-miR-432*, hsa-miR433, hsa-miR-448, hsa-miR-449a, hsa-miR-449b, hsa-miR-450a, hsa-miR-450b-3p, hsa-miR450b-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-452, hsa-miR-452*, hsa-miR-453, hsa-miR-454, hsa-miR-454*, hsa-miR-455-Зр, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-483-3p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-484, hsa-miR485-3p, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-486-Зр, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-487a, hsa-miR-487b, hsamiR-488, hsa-miR-488*, hsa-miR-489, hsa-miR-490-Зр, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-491-Зр, hsamiR-491-5p, hsa-miR-492, hsa-miR-493, hsa-miR-493*, hsa-miR-494, hsa-miR-495, hsa-miR
- 9 045780
496, hsa-miR-497, hsa-miR-497*, hsa-miR-498, hsa-miR-499-Зр, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-500, hsa-miR-500*, hsa-miR-501-Зр, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-502-Зр, hsa-miR-502-5p, hsa-miR503, hsa-miR-504, hsa-miR-505, hsa-miR-505*, hsa-miR-506, hsa-miR-507, hsa-miR-508-Зр, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-509-Зр, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-510, hsa-miR511, hsa-miR-512-Зр, hsa-miR-512-5p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-513b, hsamiR-513c, hsa-miR-514, hsa-miR-515-Зр, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-516a-5p, hsa-miR-516b, hsa-miR-517*, hsa-miR-517a, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a-3p, hsa-miR-518a-5p, hsa-miR-518b, hsa-miR-518c, hsa-miR-518c*, hsa-miR-518d-3p, hsa-miR518d-5p, hsa-miR-518e, hsa-miR-518e*, hsa-miR-518f, hsa-miR-518f*, hsa-miR-519a, hsa-miR519b-3p, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-519d, hsa-miR-519e, hsa-miR-519e*, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-520d-5p, hsamiR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-521, hsa-miR-522, hsa-miR523, hsa-miR-524-Зр, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-525-Зр, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-526b, hsamiR-526b*, hsa-miR-532-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-539, hsa-miR-541, hsa-miR-541*, hsamiR-542-Зр, hsa-miR-542-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-544, hsa-miR-545, hsa-miR-545*, hsamiR-548a-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-548b-3p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-548c-3p, hsamiR-548c-5p, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-548e, hsa-miR-548f, hsa-miR-548g, hsa-miR-548h, hsa-miR-548i, hsa-miR-548j, hsa-miR-548k, hsa-miR-5481, hsa-miR-548m, hsamiR-548n, hsa-miR-548o, hsa-miR-548p, hsa-miR-549, hsa-miR-550, hsa-miR-550*, hsa-miR551a, hsa-miR-551b, hsa-miR-551b*, hsa-miR-552, hsa-miR-553, hsa-miR-554, hsa-miR-555, hsa-miR-556-Зр, hsa-miR-556-5p, hsa-miR-557, hsa-miR-558, hsa-miR-559, hsa-miR-561, hsamiR-562, hsa-miR-563, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-567, hsa-miR-568, hsa-miR-569, hsa-miR-570, hsa-miR-571, hsa-miR-572, hsa-miR-573, hsa-miR-574-Зр, hsa-miR-574-5p, hsamiR-575, hsa-miR-576-Зр, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-578, hsa-miR-579, hsa-miR580, hsa-miR-581, hsa-miR-582-Зр, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-584, hsa-miR-585, hsa-miR-586, hsa-miR-587, hsa-miR-588, hsa-miR-589, hsa-miR-589*, hsa-miR-590-Зр, hsamiR-590-5p, hsa-miR-591, hsa-miR-592, hsa-miR-593, hsa-miR-593*, hsa-miR-595, hsa-miR596, hsa-miR-597, hsa-miR-598, hsa-miR-599, hsa-miR-600, hsa-miR-601, hsa-miR-602, hsamiR-603, hsa-miR-604, hsa-miR-605, hsa-miR-606, hsa-miR-607, hsa-miR-608, hsa-miR-609, hsa-miR-610, hsa-miR-611, hsa-miR-612, hsa-miR-613, hsa-miR-614, hsa-miR-615-Зр, hsamiR-615-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-616*, hsa-miR-617, hsa-miR-618, hsa-miR-619, hsa-miR620, hsa-miR-621, hsa-miR-622, hsa-miR-623, hsa-miR-624, hsa-miR-624*, hsa-miR-625, hsamiR-625*, hsa-miR-626, hsa-miR-627, hsa-miR-628-Зр, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-629, hsamiR-629*, hsa-miR-630, hsa-miR-631, hsa-miR-632, hsa-miR-633, hsa-miR-634, hsa-miR-635, hsa-miR-636, hsa-miR-637, hsa-miR-638, hsa-miR-639, hsa-miR-640, hsa-miR-641, hsa-miR
- 10 045780
642, hsa-miR-643, hsa-miR-644, hsa-miR-645, hsa-miR-646, hsa-miR-647, hsa-miR-648, hsamiR-649, hsa-miR-650, hsa-miR-651, hsa-miR-652, hsa-miR-653, hsa-miR-654-Зр, hsa-miR654-5p, hsa-miR-655, hsa-miR-656, hsa-miR-657, hsa-miR-658, hsa-miR-659, hsa-miR-660, hsamiR-661, hsa-miR-662, hsa-miR-663, hsa-miR-663b, hsa-miR-664, hsa-miR-664*, hsa-miR-665, hsa-miR-668, hsa-miR-671-Зр, hsa-miR-671-5p, hsa-miR-675, hsa-miR-7, hsa-miR-708, hsamiR-708*, hsa-miR-7-1*, hsa-miR-7-2*, hsa-miR-720, hsa-miR-744, hsa-miR-744*, hsa-miR758, hsa-miR-760, hsa-miR-765, hsa-miR-766, hsa-miR-767-Зр, hsa-miR-767-5p, hsa-miR-7683p, hsa-miR-768-5p, hsa-miR-769-Зр, hsa-miR-769-5p, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-802, hsa-miR873, hsa-miR-874, hsa-miR-875-Зр, hsa-miR-875-5p, hsa-miR-876-Зр, hsa-miR-876-5p, hsamiR-877, hsa-miR-877*, hsa-miR-885-Зр, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-886-Зр, hsa-miR-886-5p, hsa-miR-887, hsa-miR-888, hsa-miR-888*, hsa-miR-889, hsa-miR-890, hsa-miR-891a, hsa-miR891b, hsa-miR-892a, hsa-miR-892b, hsa-miR-9, hsa-miR-9*, hsa-miR-920, hsa-miR-921, hsamiR-922, hsa-miR-923, hsa-miR-924, hsa-miR-92a, hsa-miR-92a-l*, hsa-miR-92a-2*, hsa-miR92b, hsa-miR-92b*, hsa-miR-93, hsa-miR-93*, hsa-miR-933, hsa-miR-934, hsa-miR-935, hsamiR-936, hsa-miR-937, hsa-miR-93 8, hsa-miR-939, hsa-miR-940, hsa-miR-941, hsa-miR-942, hsa-miR-943, hsa-miR-944, hsa-miR-95, hsa-miR-96, hsa-miR-96*, hsa-miR-98, hsa-miR-99a, hsa-miR-99a*, hsa-miR-99b и hsa-miR-99b*.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько сайтов связывания в конструкции, которая описана в настоящем раскрытии (например, рекомбинантная нуклеиновая кислота, вектор на основе AAV, rAAV и т.д.), нарушают нацеливание экспрессии трансгена на клетку иммунной системы (например, антиген-презентирующую клетку (АРС)). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления miRNA, которая нарушает нацеливание экспрессии трансгена на иммунную клетку (например, антиген-презентирующую клетку), называется ассоциированной с иммунными клетками miRNA. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ассоциированная с иммунными клетками miRNA представляет собой miRNA, экспрессирующуюся в иммунных клетках, которая проявляет по меньшей мере 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-кратно более высокий уровень экспрессии в иммунной клетке по сравнению клеткой, отличной от иммунной клетки (например, контрольной клеткой, такой как клетка HeLa, клетка HEK293, мезенхимальная клетка и т.д.). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка иммунной системы (иммунная клетка), в которой экспрессируется ассоциированная с иммунными клетками miRNA, представляет собой В-клетку, Т-клетку, Т-киллерную клетку, Т-хелперную клетку, γδ Т-клетку, дендритную клетку, макрофаг, моноцит, клетку сосудистого эндотелия или другую иммунную клетку. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка иммунной системы представляет собой В-клетку, экспрессирующую один или несколько из следующих маркеров: В220, BLAST-2 (EBVCS), Bu-1, CD 19, CD20 (L26), CD22, CD24, CD27, CD57, CD72, CD79a, CD79b, CD86, chB6, D8/17, FMC7, L26, M17, MUM-1, Pax-5 (BSAP) и РС47Н. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка иммунной системы представляет собой Т-клетку, экспрессирующую один или несколько из следующих маркеров: ART2, CD1a, CD1d, CD11b (Mac-1), CD134 (OX40), CD150, CD2, CD25 (альфа-рецептор интерлейкина 2), CD3, CD38, CD4, CD45RO, CD5, CD7, CD72, CD8, CRTAM, FOXP3, FT2, GPCA, HLA-DR, HML-1, НТ23А, Leu-22, Ly-2, Ly-m22, MICG, MRC OX8, MRC OX-22, OX40, PD-1 (белок 1 программируемой гибели клетки), RT6, TCR (Т-клеточный рецептор), Thy-1 (CD90) и TSA-2 (общий тимусный Ag-2). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ассоциированная с иммунными клетками miRNA является выбранной из miR-15a, miR-16-1, miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19b-1, miR-20a, miR-21, miR-29a/b/c, miR-30b, miR-31, miR-34a, miR-92a-1, miR-106a, miR125a/b, miR-142-3р, miR-146a, miR-150, miR-155, miR-181a, miR-223 и miR-424, miR-221, miR-222, let-7i, miR-148 и miR-152.
Векторы на основе рекомбинантного AAV (векторы на основе rAAV) Векторы на основе рекомбинантного AAV (rAAV) согласно настоящему раскрытию, как правило, состоят, как минимум, из трансгена и его регуляторных последовательностей, а также 5' и 3' инвертированных концевых повторов (ITR) AAV. Он представляет собой вектор на основе рекомбинантного AAV, который упакован в белок капсида и который доставляют в выбранную целевую клетку. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансген представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, гетерологичную по отношению к последовательностям вектора, которая кодирует полипептид, белок, функциональную молекулу РНК (например, gRNA) или другой продукт гена, представляющий интерес. Кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанной с регуляторными компонентами таким образом, который обеспечивает возможность транскрипции, трансляции и/или экспрессии транс
- 11 045780 гена в клетке целевой ткани.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее раскрытие относится к вектору на основе рекомбинантного AAV (rAAV), содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, включающую в себя промотор, функционально связанный с трансгеном, при этом трансген кодирует белок МеСР2 (например, изоформу е1 МеСР2). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вектор на основе rAAV дополнительно содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие одну или несколько последовательностей инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, например, ITR AAV2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вектор на основе rAAV дополнительно содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие один или несколько ITR AAV, выбранных из группы, состоящей из AAV3, AAV4, AAV5 и AAV6. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ITR представляют собой искусственные последовательности, которые заменяют функцию ITR, например, которые раскрыты в международной заявке WO/2016/172008.
Последовательности AAV в векторе, как правило, содержат цис-действующие последовательности 5' и 3' инвертированных концевых повторов (см., например, B.J. Carter, Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, p. 155-168 (1990)). Последовательности ITR имеют длину приблизительно 145 п.о. Предпочтительно в молекуле применяют по существу полные последовательности, кодирующие ITR, хотя допустимой является некоторая степень незначительной модификации этих последовательностей. Способность к модификации этих последовательностей ITR находится в рамках квалификации специалиста в данной области техники, (см., например, тексты, такие как Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); и K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)). Примером такой молекулы, используемой в настоящем раскрытии, является цисдействующая плазмида, содержащая трансген, в которой последовательность выбранного трансгена и ассоциированные регуляторные элементы являются фланкированными последовательностями 5' и 3' ITR AAV. Последовательности ITR AAV можно получить из любого известного AAV, в том числе идентифицированных в настоящее время типов AAV млекопитающих (например, последовательности ITR AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 или AAV6).
Дополнительно к главным элементам, идентифицированным выше для вектора на основе рекомбинантного AAV, вектор также включает в себя необходимые управляющие элементы, которые являются функционально связанными с трансгеном таким образом, который обеспечивает возможность его транскрипции, трансляции и/или экспрессии в клетке, трансфицированной плазмидным вектором или инфицированной вирусом, полученным в соответствии с настоящим раскрытием. В контексте данного документа функционально связанные последовательности включают в себя как управляющие экспрессией последовательности, которые являются смежными с геном, представляющим интерес, так и управляющие экспрессией последовательности, которые действуют удаленно или на расстоянии, управляя геном, представляющим интерес.
Управляющие экспрессией последовательности включают в себя соответствующие последовательности для инициации, терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы для эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования (полиА); последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусную последовательность Козак); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, если это желательно, последовательности, которые усиливают секрецию кодируемого продукта. В уровне техники являются известными и могут использоваться большое число управляющих экспрессией последовательностей, в том числе промоторы, которые являются нативными, конститутивными, индуцируемыми и/или тканеспецифическими.
В контексте данного документа последовательность нуклеиновой кислоты (например, кодирующая последовательность) и регуляторные последовательности считаются функционально связанными, когда они являются ковалентно связанными таким образом, чтобы поместить экспрессию или транскрипцию последовательности нуклеиновой кислоты под влияние или управление регуляторных последовательностей. Если желательно, чтобы последовательности нуклеиновой кислоты транслировались в функциональный белок, две последовательности ДНК считаются функционально связанными, если индукция промотора в 5' регуляторных последовательностях приводит в результате к транскрипции кодирующей последовательности, и если природа связи между двумя последовательностями ДНК (1) не приводит в результате к введению мутации со сдвигом рамки считывания, (2) не препятствует способности промоторного участка управлять транскрипцией кодирующих последовательностей, или (3) не препятствует способности соответствующего РНК транскрипта транслироваться в белок. Следовательно, промоторный участок будет являться функционально связанным с последовательностью нуклеиновой кислоты, если промоторный участок способен к осуществлению транскрипции этой последовательности ДНК таким образом, чтобы образующийся в результате транскрипт мог транслироваться в желаемый белок или полипептид. Аналогично, два или больше кодирующих участков являются функционально связанными, когда они связаны таким образом, чтобы их транскрипция с общего промотора приводила в результате к экспрессии двух или более белков, которые подверглись трансляции в одной рамке считывания. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления функционально связанные кодирующие последова- 12 045780 тельности дают на выходе гибридный белок. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления функционально связанные кодирующие последовательности дают на выходе функциональную РНК (например, gRNA, miRNA).
В случае нуклеиновых кислот, кодирующих белок, последовательность полиаденилирования обычно вставляют после последовательностей трансгена и перед последовательностью 3' ITR AAV. Конструкция на основе rAAV, пригодная в настоящем раскрытии, также может содержать интрон, который желательно расположен между промоторной/энхансерной последовательностью и трансгеном. Одна возможная интронная последовательность получена из SV-40 и называется последовательностью Т интрона SV-40. Еще один элемент вектора, который можно применять, представляет собой участок внутренней посадки рибосомы (IRES). Последовательность IRES применяют для получения более чем одного полипептида из одного транскрипта гена. Последовательность IRES будут применять для получения белка, который содержит более чем одну полипептидную цепь. Выбор этих и/или других элементов вектора можно осуществлять в случае необходимости, и доступны многие такие последовательности (см., например, Sambrook et al., и источники, цитируемые там, например, на страницах 3.18 3.26 и 16.17 16.27, и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность 2А-пептида из вируса ящура включают в полипротеин; он представляет собой небольшой пептид (примерно 18 аминокислот в длину), который, как было показано, опосредует расщепление полипротеинов (Ryan, M.D. et al., EMBO, 1994; 4:928-933; Mattion, N.M. et al., J. Virology, November 1996, p. 8124-8127; Furler, S. et al., Gene Therapy, 2001, 8:864-873; и Halpin, С. et al., The Plant Journal, 1999, 4:453-459). Расщепляющая активность последовательности 2A-пептида была ранее продемонстрирована в искусственных системах, в том числе в плазмидах и векторах для генной терапии (AAV и ретровирусы) (Ryan, M.D. et al., EMBO, 1994, 4:928-933; Mattion, N.M. et al., J. Virology, November 1996, p. 8124-8127; Furler, S. et al., Gene Therapy, 2001, 8:864-873; и Halpin, С. et al., The Plant Journal, 1999, 4:453-459; de Felipe, P. et al., Gene Therapy, 1999, 6:198-208; de Felipe, P. et al., Human Gene Therapy, 2000; 11:1921-1931; и Klump, H. et al., Gene Therapy, 2001; 8:811-817).
Точная природа регуляторных последовательностей, необходимых для экспрессии гена в клеткаххозяевах, может варьировать в зависимости от видов, тканей или типов клеток, но они обычно будут включать в себя, если необходимо, 5'-нетранскрибируемые и 5'-нетранслируемые последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции, соответственно, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность СААТ, энхансерные элементы и т.п. В особенности, такие 5'-нетранскрибируемые регуляторные последовательности, будут включать в себя промоторный участок, который включает в себя промоторную последовательность для управления транскрипцией функционально связанного гена. Регуляторные последовательности также могут включать в себя энхансерные последовательности или вышележащие активирующие последовательности, если необходимо. Векторы согласно настоящему раскрытию необязательно могут включать в себя 5' лидерные или сигнальные последовательности. Выбор и конструирование соответствующего вектора находится в рамках способностей и усмотрения квалифицированного специалиста в данной области техники.
Примеры конститутивных промоторов включают в себя, без ограничения, ретровирусный промотор LTR вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно с энхансером CMV) [см., например, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], промотор SV40, промотор дигидрофолат-редуктазы, промотор β-актина, промотор фосфоглицерат-киназы (PGK) и промотор EF1 α [Invitrogen]. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления промотор представляет собой промотор куриного β-актина с энхансером.
Индуцируемые промоторы обеспечивают возможность регуляции экспрессии гена и могут регулироваться под действием поступающих извне соединений, факторов окружающей среды, таких как температура, или присутствия конкретного физиологического состояния, например, острой фазы, конкретного состояния дифференцировки клетки или активны только в делящихся клетках. Индуцируемые промоторы и индуцируемые системы доступны из ряда коммерческих источников, в том числе, без ограничения, Invitrogen, Clontech и Ariad. Было описано много других систем, и они могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники. Примеры индуцируемых промоторов, регулируемых под действием поступающих извне соединений, включают в себя индуцируемый цинком промотор металлотионеина (МТ) овцы, индуцируемый дексаметазоном (Dex) промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промоторную систему полимеразы Т7 (международная заявка WO 98/10088); экдизоновый промотор насекомых (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:3346-3351 (1996)), репрессируемую тетрациклином систему (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:5547-5551 (1992)), индуцируемую тетрациклином систему (Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), см. также Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), индуцируемую RU486 систему (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997); и Wang et al., Gene Then, 4:432-441 (1997)) и индуцируемую рапамицином систему (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Другие типы индуцируемых промоторов, которые могут быть пригодными в этом контексте, представляют собой промоторы, которые регулируются конкретным физиологическим состоянием, например, температурой, острой фазой, конкретным состоянием дифференцировки клетки
- 13 045780 или активны только в делящихся клетках.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления для трансгена будут применять нативный промотор. Нативный промотор может быть предпочтительным, когда желательно, чтобы экспрессия трансгена имитировала нативную экспрессию. Нативный промотор можно применять, когда экспрессия трансгена должна регулироваться в зависимости от времени или стадии развития, или тканеспецифическим образом, или в ответ на специфические транскрипционные стимулы. Например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления нативный промотор представляет собой промотор МеСР2, такой как промотор мышиного МеСР2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления промотор мышиного МеСР2 представлен последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 3. В соответствии с дополнительным вариантом осуществления другие нативные элементы для управления экспрессией, такие как энхансерные элементы, сайты полиаденилирования или консенсусные последовательности Козак, также можно применять для того, чтобы имитировать нативную экспрессию.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления регуляторные последовательности придают свойства тканеспецифической экспрессии гена. В некоторых случаях тканеспецифические регуляторные последовательности связывают тканеспецифические транскрипционные факторы, которые индуцируют транскрипцию тканеспецифическим образом. Такие тканеспецифические регуляторные последовательности (например, промоторы, энхансеры и т.д.) являются хорошо известными в уровне техники. Иллюстративные тканеспецифические регуляторные последовательности включают в себя, без ограничения, следующие тканеспецифические промоторы: специфический для глаза промотор ретиношизина или промотор K12, специфический для печени промотор тироксин-связывающего глобулина (TBG), инсулиновый промотор, глюкагоновый промотор, соматостатиновый промотор, промотор панкреатического полипептида (PPY), промотор синапсина-1 (Syn), промотор креатин-киназы (МСК), промотор десмина млекопитающего (DES), промотор тяжелой цепи а-миозина (а-МНС) или промотор сердечного тропонина Т (cTnT). Другие иллюстративные промоторы включают в себя промотор бета-актина, коровый промотор вируса гепатита В, Sandig et al., Gene Then, 3:1002-9 (1996); промотор альфа-фетопротеина (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Then, 7:1503-14 (1996)), промотор костного остеокальцина (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); промотор костного сиалопротеина (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), промотор CD2 (Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); промотор тяжелой цепи иммуноглобулина; промотор α-цепи Т-клеточного рецептора, специфический для нейронов промотор, такой как промотор нейрон-специфической енолазы (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), промотор гена легкой цепи нейрофиламента (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:5611-5 (1991)) и нейрон-специфический промотор гена vgf (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)), среди прочих, которые будут известны квалифицированному специалисту.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько сайтов связывания для одной или нескольких miRNA встроены в трансген в векторе на основе rAAV для того, чтобы ингибировать экспрессию трансгена в одной или нескольких тканях субъекта, несущего трансген. Квалифицированному специалисту будет понятно, что можно выбрать сайты связывания для управления экспрессией трансгена тканеспецифическим образом. Например, сайты связывания для специфической для печени miR-122 могут быть включены в трансген для ингибирования экспрессии этого трансгена в печени. Сайты-мишени в мРНК могут находиться в 5' UTR, 3' UTR или в кодирующем участке. Как правило, сайт-мишень находится в 3' UTR мРНК. Более того, трансген может быть сконструирован таким образом, чтобы несколько miRNA регулировали мРНК посредством распознавания одного и того же или нескольких сайтов. Наличие нескольких сайтов связывания miRNA может приводить в результате к согласованному действию нескольких RISC и обеспечивать высокоэффективное ингибирование экспрессии. Последовательность сайта-мишени может содержать в общей сложности 5-100, 10-60 или больше нуклеотидов. Последовательность сайта-мишени может содержать по меньшей мере 5 нуклеотидов последовательности сайта связывания в целевом гене.
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV).
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к выделенным AAV. В контексте данного документа применительно к AAV термин выделенный относится к AAV, который был искусственно продуцирован или получен. Выделенные AAV могут быть получены с применением способов на основе рекомбинации. Такие AAV называются в данном документе рекомбинантными AAV. Рекомбинантные AAV (rAAV) предпочтительно обладают способностью к тканеспецифическому нацеливанию, в результате чего нуклеаза и/или трансген в rAAV будут доставляться специфически в одну или несколько предварительно определенных тканей. Капсид AAV является важным элементом в определении этих способностей к тканеспецифическому нацеливанию. Таким образом, можно выбрать rAAV, имеющий капсид, подходящий для ткани, которая является целевой.
Способы получения рекомбинантных AAV, имеющих желаемый белок капсида, являются хорошо известными в уровне техники (см., например, заявку на патент США US 2003/0138772), содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Как правило, способы включают культивирование клетки-хозяина, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок капсида AAV; функциональный ген rep; вектор на основе рекомбинантного
- 14 045780
AAV, состоящий из инвертированных концевых повторов AAV (ITR) и трансгена; а также достаточные функциональные элементы помощника, чтобы обеспечить возможность упаковки вектора на основе рекомбинантного AAV в белки капсида AAV. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления белки капсида представляют собой структурные белки, кодируемые геном cap в AAV. AAV содержат три белка капсида, вирионные белки 1-3 (называемые VP1, VP2 и VP3), все из которых транскрибируются с одного гена cap посредством альтернативного сплайсинга. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулярные массы VP1, VP2 и VP3 составляют приблизительно 87 кДа, приблизительно 72 кДа и приблизительно 62 кДа, соответственно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления после трансляции белки капсида образуют сферическую оболочку из 60 мономерных белковых единиц вокруг вирусного генома. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления функции белков капсида заключаются в защите вирусного генома, доставке генома и взаимодействии с хозяином. В соответствии с некоторыми аспектами белки капсида доставляют вирусный геном хозяину тканеспецифическим образом.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления rAAV, описанный в настоящем раскрытии, содержит один или несколько белков капсида, способных к пересечению гематоэнцефалического барьера. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по меньшей мере один белок капсида имеет серотип, выбранный из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV2i8, AAV2.5, AAV6, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAV-B1, AAV9.45A-String (например, AAV9.45-AS), AAV9.45Angiopep, AAV9.47-Angiopep и AAV9.47-AS. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по меньшей мере один белок капсида имеет серотип AAV-PHP.B, например, как описано в патенте США № 9585971. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления белок капсида имеет серотип, который описан в международной заявке WO 2015/127128, WO 2016/054554, WO 2016/054557 или WO 2016/065001.
Компоненты, подлежащие культивированию в клетке-хозяине для упаковки вектора на основе rAAV в капсид AAV, могут быть обеспечены клетке-хозяину in trans (удаленно). В качестве альтернативы, любой один или несколько из требующихся компонентов (например, вектор на основе рекомбинантного AAV, последовательности rep, последовательности cap и/или функциональные элементы помощника) могут быть обеспечены стабильной клеткой-хозяином, которая была подвергнута воздействию методов генной инженерии таким образом, чтобы она содержала один или несколько из требующихся компонентов, с применением способов, известных специалисту в данной области техники. В наиболее подходящем случае такая стабильная клетка-хозяин будет содержать требующий(ие)ся компонент(ы) под управлением индуцируемого промотора. Тем не менее требующий(ие)ся компонент(ы) могут находиться под управлением конститутивного промотора. Примеры подходящих индуцируемых и конститутивных промоторов представлены в данном документе в обсуждении регуляторных элементов, подходящих для применения с трансгеном. В качестве еще одной альтернативы выбранная стабильная клетка-хозяин может содержать выбранный(ые) компонент(ы) под управлением конститутивного промотора и другой(ие) выбранный(ые) компонент(ы) под управлением одного или нескольких индуцируемых промоторов. Например, может быть создана стабильная клетка-хозяин, которая получена из клеток 293 (которые содержат функциональные элементы помощника Е1 под управлением конститутивного промотора), но которая содержит белки rep и/или cap под управлением индуцируемых промоторов. Другие стабильные клетки-хозяева могут быть получены специалистом в данной области техники.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее раскрытие относится к клеткехозяину, содержащей нуклеиновую кислоту, которая содержит кодирующую последовательность, которая кодирует белок (например, белок МеСР2, такой как изоформа el MeCP2). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее раскрытие относится к композиции, содержащей клеткухозяина, которая описана выше. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиция, содержащая описанную выше клетку-хозяина, дополнительно содержит криопротектор.
Вектор на основе рекомбинантного AAV, последовательности rep, последовательности cap и функциональные элементы помощника, требующиеся для продуцирования rAAV согласно настоящему раскрытию, могут быть доставлены в пакующую клетку-хозяин с применением любого подходящего генетического элемента (вектора). Выбранный генетический элемент можно доставлять можно доставлять с помощью любого подходящего способа, в том числе с помощью способов, описанных в данном документе. Способы, применяемые для конструирования любого варианта осуществления согласно настоящему раскрытию, являются известными специалистам, обладающим навыками манипуляций с нуклеиновыми кислотами, и включают в себя методы генной инженерии, конструирование с использованием методик на основе рекомбинации и методики синтеза (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Аналогично способы получения вирионов rAAV являются хорошо известными, и выбор подходящего способа не является ограничением в отношении настоящего раскрытия (см., например, K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993); и патент США № 5478745).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рекомбинантные AAV можно получать с применением способа тройной трансфекции (подробно описанного в патенте США № 6001650). Как правило, рекомбинантные AAV получают посредством трансфекции клетки-хозяина вектором на основе
- 15 045780 рекомбинантного AAV (содержащим трансген), который должен быть упакован в частицы AAV, вектором, обеспечивающим функциональные элементы помощника AAV, и вектором, обеспечивающим вспомогательные функциональные элементы. Вектор, обеспечивающий функциональные элементы помощника AAV, кодирует последовательности функциональных элементов помощника AAV (т.е. rep и cap), которые функционируют in trans (удаленно) для продуктивной репликации AAV и заключения его в капсид. Предпочтительно, вектор, обеспечивающий функциональные элементы помощника AAV, поддерживает эффективное продуцирование вектора на основе AAV без образования каких-либо выявляемых вирионов AAV дикого типа (т.е. вирионов AAV, содержащих функциональные гены rep и cap). Неограничивающие примеры векторов, подходящих для применения с настоящим раскрытием, включают в себя pHLP19, описанный в патенте США № 6001650, и вектор pRep6cap6, описанный в патенте США № 6156303, при этом полное содержание обоих этих источников включено в данный документ посредством ссылки. Вектор, обеспечивающий вспомогательные функциональные элементы, кодирует нуклеотидные последовательности для вирусных и/или клеточных функциональных элементов, не происходящих из AAV, от которых зависит репликация AAV (т.е. вспомогательные функциональные элементы). Вспомогательные функциональные элементы включают в себя те функциональные элементы, которые требуются для репликации AAV, в том числе без ограничения те фрагменты, которые вовлечены в активацию транскрипции генов AAV, специфический для стадии развития AAV сплайсинг мРНК, репликацию ДНК AAV, синтез продуктов экспрессии гена cap и сборку капсида AAV. Вспомогательные функциональные элементы на основе вирусов могут быть получены из любого из известных вирусовпомощников, таких как аденовирус, вирус герпеса (отличный от вируса простого герпеса 1 типа) и вирус коровьей оспы.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к трансфицированным клеткам-хозяевам. Термин трансфекция используют применительно к поглощению чужеродной ДНК клеткой, и клетка была трансфицирована, если экзогенная ДНК была введена внутрь клеточной мембраны. В целом в уровне техники известен ряд методик трансфекции. См., например, Graham et al. (1973), Virology, 52:456; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York; Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; и Chu et al. (1981), Gene, 13:197. Такие методики можно применять для введения одной или нескольких экзогенных нуклеиновых кислот, таких как интегрирующий вектор и другие молекулы нуклеиновой кислоты, в подходящие клетки-хозяева.
Клетка-хозяин относится к любой клетке, которая вмещает или способна вмещать вещество, представляющее интерес. Часто клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. Клеткухозяин можно применять в качестве реципиента конструкции-помощника AAV, плазмиды с минигеном AAV, вектора, обеспечивающего вспомогательные функциональные элементы, или другой переносимой ДНК, ассоциированной с продуцированием рекомбинантных AAV. Термин включает в себя потомство исходной клетки, которая подверглась трансфекции. Таким образом, термин клетка-хозяин в контексте данного документа может относиться к клетке, которая подверглась трансфекции экзогенной последовательностью ДНК. Понятно, что потомство одной родительской клетки не обязательно может быть полностью идентичным по морфологии или соответствовать по геномной или общей ДНК исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации.
В контексте данного документе термин клеточная линия относится к популяции клеток, способных к непрерывному или длительному росту и делению in vitro. Клеточные линии часто представляют собой клональные популяции, полученные из одной клетки-предшественника. Кроме того, в уровне техники известно, что спонтанные или индуцированные изменения могут происходить в кариотипе во время хранения или переноса таких клональных популяций. Таким образом, клетки, полученные из упомянутой клеточной линии, не обязательно могут быть в точности идентичными предковым клеткам или культурам, и упомянутая клеточная линия включает в себя такие варианты.
В контексте данного документа термин рекомбинантная клетка относится к клетке, в которую был введен экзогенный сегмент ДНК, такой как сегмент ДНК, который приводит к транскрипции биологически активного полипептида или продуцированию биологически активной нуклеиновой кислоты, такой как РНК.
В контексте данного документа термин вектор включает в себя любой генетический элемент, такой как плазмида, фаг, транспозон, космида, хромосома, искусственная хромосома, вирус, вирион и т.д., который является способным к репликации, когда он ассоциирован с соответствующими управляющими элементами, и который может переносить последовательности генов между клетками. Таким образом, термин включает в себя средства для клонирования и экспрессии, а также вирусные векторы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается, что пригодные векторы представляют собой те векторы, в которых сегмент нуклеиновой кислоты, подлежащий транскрипции, расположен под транскрипционным управлением промотора. Термин промотор относится к последовательности ДНК, которая распознается синтетическим аппаратом клетки или введенным синтетическим аппаратом и требуется для инициации специфической транскрипции гена. Фразы расположенный в функциональной связи, под управлением или под транскрипционным управлением означают, что промотор находит
- 16 045780 ся в правильном положении и ориентации относительно нуклеиновой кислоты для управления запуском РНК-полимеразы и экспрессией гена. Термин экспрессионный вектор или конструкция означает любой тип генетической конструкции, которая содержит нуклеиновую кислоту, и в которой способна транскрибироваться часть кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты или она вся. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления экспрессия включает в себя транскрипцию нуклеиновой кислоты, например, с образованием биологически активного полипептида-продукта или функциональной РНК (например, гидовой РНК), с транскрибируемого гена.
Не предполагается, что вышеуказанные способы упаковки рекомбинантных векторов в желаемые капсиды AAV с получением rAAV согласно настоящему раскрытию являются ограничивающими, и другие подходящие способы будут очевидны квалифицированному специалисту.
Способы введения.
Композиции, описанные в настоящем раскрытии (например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, rAAV, фармацевтические композиции и т.д.) можно доставлять субъекту согласно любым подходящим способам, известным в уровне техники. Композиции (например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, rAAV, фармацевтические композиции и т.д.), предпочтительно, суспендированные в физиологически совместимом носителе (т.е. в композиции), можно вводить субъекту, т.е. животному-хозяину, такому как человек, мышь, крыса, кошка, собака, овца, кролик, лошадь, корова, коза, свинья, морская свинка, хомяк, курица, индейка или отличный от человека примат (например, макак). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное-хозяин не включает в себя человека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект представляет собой человека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект имеет возраст менее года, например, имеет возраст 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 месяцев.
Доставку композиций субъекту-млекопитающему можно осуществлять, например, с помощью системной инъекции (например, внутривенной инъекции) или интратекальной инъекции. Также можно применять дополнительные способы введения композиций в ЦНС субъекта, например, внутричерепную инъекцию, инъекцию в полосатое тело и т.д. Также можно применять комбинации способов введения (например, местного введения и интрастромальной инъекции).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиции согласно настоящему раскрытию могут содержать rAAV отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими вирусами (например, вторым rAAV, кодирующим один или несколько отличных трансгенов). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиция содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более отличающихся rAAV, каждый из которых имеет один или несколько отличающихся трансгенов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие носители могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники с учетом показаний, на которые направлена композиция. Например, один подходящий носитель включает в себя солевой раствор, который может быть составлен с рядом буферных растворов (например, фосфатно-буферный солевой раствор). Другие иллюстративные носители включают в себя стерильный солевой раствор, лактозу, сахарозу, фосфат кальция, желатин, декстран, агар, пектин, арахисовое масло, кунжутное масло и воду. Выбор носителя не является ограничением настоящего раскрытия.
Необязательно композиции согласно настоящему раскрытию могут содержать дополнительно к рекомбинантной нуклеиновой кислоте или rAAV и носителю(носителям) другие фармацевтические ингредиенты, такие как консерванты или химические стабилизаторы. Подходящие иллюстративные консерванты включают в себя хлорбутанол, сорбат калия, сорбиновую кислоту, диоксид серы, пропилгаллат, парабены, этилванилин, глицерин, фенол и парахлорфенол. Подходящие химические стабилизаторы включают в себя желатин и альбумин.
Композиции вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток желаемой ткани (например, ткани ЦНС) и для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов без неоправданных неблагоприятных эффектов. Примеры фармацевтически приемлемых путей введения включают в себя, без ограничения, непосредственную доставку в выбранный орган (например, интрастромальную доставку в глаз), пероральное, ингаляционное введение (в том числе интраназальную и интратрахеальную доставку), внутриглазное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, интрадермальное, внутриопухолевое введение и другие парентеральные пути введения. Пути введения можно комбинировать, если это является желательным.
Доза вирионов rAAV, требующаяся для достижения конкретного терапевтического эффекта, например, единицы дозы в копиях генома на килограмм массы тела (gc/кг) будут варьировать в зависимости от нескольких факторов, в том числе без ограничения пути введения вириона rAAV, уровня экспрессии гена или РНК, требующегося для достижения терапевтического эффекта, конкретного заболевания или нарушения, лечение которого осуществляют, и стабильности продукта гена или РНК-продукта. Специалист в данной области техники может легко определить диапазон дозы вириона rAAV для лечения пациента, имеющего конкретное заболевание или нарушение, с учетом вышеупомянутых факторов, а также других факторов.
- 17 045780
Эффективное количество композиции (например, рекомбинантной нуклеиновой кислоты, rAAV, фармацевтической композиции и т.д.) представляет собой количество, достаточное для целенаправленного инфицирования животного, целенаправленного воздействия на желаемую ткань. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эффективное количество rAAV представляет собой количество, достаточное для получения стабильной соматической трансгенной животной модели. Эффективное количество, преимущественно, будет зависеть от таких факторов, таких как вид, возраст, масса, состояние здоровья субъекта и ткань, подлежащая целенаправленному воздействию, и, следовательно, может варьировать между животными и тканями. Например, эффективное количество rAAV обычно находится в диапазоне от приблизительно 1 мл до приблизительно 100 мл раствора, содержащего от приблизительно 109 до 1016 копий генома. В некоторых случаях подходящей является дозировка от приблизительно 1011 до 1013 копий генома rAAV. В соответствии с определенными вариантами осуществления 1010 или 1011 копий генома rAAV являются эффективными для целенаправленного воздействия на ткань ЦНС (например, ткань роговицы). В некоторых случаях стабильных трансгенных животных получают под действием нескольких доз rAAV.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дозу композиции вводят субъекту не более чем один раз в календарные сутки (например, 24-часовой период). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дозу композиции вводят субъекту не более чем один раз в 2, 3, 4, 5, 6 или 7 календарных суток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дозу композиции вводят субъекту не более чем один раз в календарную неделю (например, 7 календарных суток). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дозу композиции вводят субъекту не более чем один раз в две недели (например, один раз за период двух календарных недель). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дозу композиции вводят субъекту не более чем один раз в календарный месяц (например, один раз в 30 календарных суток). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дозу композиции вводят субъекту не более чем один раз в шесть календарных месяцев. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дозу композиции вводят субъекту не более чем один раз в календарный год (например, 365 суток или 366 суток в високосный год).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиции составляют для снижения агрегации частиц AAV в композиции, в особенности, в случае, когда присутствуют высокие концентрации rAAV (например, ~1013 gc/мл или более). Можно применять подходящие способы для снижения агрегации, в том числе, например, добавление поверхностно-активных веществ, регулирование рН, регулирование концентрации соли и т.д. (см., например, Wright F.R. et al., Molecular Therapy (2005), 12, 171-178, при этом содержание данного источника включено в данный документ посредством ссылки).
Получение составов с фармацевтически приемлемыми вспомогательными средствами и растворами-носителями является хорошо известным специалистам в данной области техники, как и разработка подходящих схем дозирования и лечения для применения конкретных композиций, описанных в данном документе, в ряде схем лечения. Как правило, эти составы могут содержать по меньшей мере приблизительно 0,1% активного соединения или большее количество, хотя процентное содержание активного(активных) ингредиента(ингредиентов) может, конечно, варьировать и может условно составлять от приблизительно 1 или 2% до приблизительно 70 или 80% массы или объема всего состава или больше. Естественно, количество активного соединения в каждой пригодной с терапевтической точки зрения композиции может быть приготовлено таким образом, что подходящая дозировка будет получена при любой заданной стандартной дозе соединения. Такие факторы, как растворимость, биологическая доступность, биологический период полувыведения, путь введения, срок хранения продукта, а также другие фармакологические особенности, будут учитываться специалистом в области приготовления таких фармацевтических составов, и в связи с этим может быть желателен ряд дозировок и схем лечения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиции (например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, rAAV, фармацевтические композиции и т.д.) в подходящим образом составленных фармацевтических композициях, раскрытых в данном документе, доставляют напрямую в целевую ткань, например, напрямую в ткань ЦНС (например, головной мозг, спинной мозг и т.д.). Тем не менее в определенных обстоятельствах желательной может быть раздельная доставка или дополнительная доставка композиций посредством другого пути, например, подкожно, внутрь поджелудочной железы, интраназально, парентерально, внутривенно, внутримышечно, интратекально или перорально, внутрибрюшинно или посредством ингаляции. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы введения, которые описаны в патентах США № 5543158; 5641515; и 5399363 (каждый из которых специально включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), можно применять для доставки rAAV. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предпочтительным способом введения является внутривенная инъекция.
Фармацевтические формы, подходящие для применения в виде инъекционного раствора, включают в себя стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Дисперсии также могут быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предотвращения роста
- 18 045780 микроорганизмов. Во многих случаях форма является стерильной и текучей настолько, насколько это обеспечивает возможность легкого введения с помощью шприца. Она должна быть стабильной при условиях производства и хранения и должна быть защищена от контаминирующего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, за счет применения покрытия, такого как лецитин, за счет поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и за счет применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать за счет различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотоничных средств, например, сахаров или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть обусловлена применением в композициях средств, которые задерживают абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
Например, в случае введения инъекционного водного раствора раствор может быть подходящим образом стабилизирован буфером, если необходимо, и жидкий разбавитель вначале делают изотоничным с использованием достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы являются особенно подходящими для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этом контексте можно использовать подходящую стерильную водную среду. Например, одну дозу можно растворить в 1 мл изотоничного раствора NaCl и либо добавить к 1000 мл жидкости для подкожной инфузии, либо вводить в предполагаемое место инфузии (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th edition, с. 1035-1038 и 1570-1580). Некоторое изменение дозировки обязательно будет возникать в зависимости от состояния хозяина. В этом случае лицо, ответственное за введение, будет определять подходящую дозу для отдельного хозяина.
Стерильные инъекционные растворы готовят посредством включения композиций (например, рекомбинантных нуклеиновых кислот, rAAV, фармацевтических композиций и т.д.) в требуемом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными в данном документе, если это необходимо, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят посредством включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильную среду, которая содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются методики вакуумной сушки и сублимационной сушки, которые дают на выходе порошок активного ингредиента, а также любого дополнительного желаемого ингредиента из их раствора, ранее подвергнутого стерилизации фильтрованием.
Композиции (например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, rAAV, фармацевтические композиции и т.д.), раскрытые в данном документе, также могут быть составлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли присоединения кислоты (образованные со свободными аминогруппами в белке), которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или с такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены с неорганическими основаниями, такими как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или трехвалентного железа, и такими органическими основаниями, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После составления растворы будут вводить способом, совместимым с дозируемым составом, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Составы можно легко вводить в ряде лекарственных форм, таких как инъекционные растворы, капсулы для высвобождения лекарственного средства и т.п.
В контексте данного документа термин носитель включает в себя любые и все растворители, дисперсионные среды, среды, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые средства, изотоничные средства и средства, задерживающие абсорбцию, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных субстратов хорошо известно в уровне техники. В композиции также могут быть включены дополнительные активные ингредиенты. Фраза фармацевтически приемлемый относится к молекулам и композициям, которые не вызывают аллергическую или подобную нежелательную реакцию при введении хозяину.
Среды для доставки, такие как липосомы, нанокапсулы, микрочастицы, микросферы, липидные частицы, пузырьки и т.п., можно применять для введения композиций согласно настоящему изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, доставляемые вектором на основе rAAV трансгены могут быть составлены для доставки инкапсулированными в любом из липидной частицы, липосомы, пузырька, наносферы или наночастицы или в подобном.
Такие составы могут быть предпочтительными для введения фармацевтически приемлемых составов нуклеиновых кислот или конструкций на основе rAAV, раскрытых в данном документе. Образование и применение липосом, в целом, является известным специалистам в данной области техники. Недавно были разработаны липосомы с улучшенной стабильностью в сыворотке крови и периодами полужизни в
- 19 045780 сыворотке крови (патент США № 5741516). Кроме того, были описаны различные способы получения липосом и липосомоподобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств (патенты США № 5567434; 5552157; 5565213; 5738868; и 5795587).
Липосомы успешно применялись с рядом типов клеток, которые в норме являются устойчивыми к трансфекции с помощью других процедур. Кроме того, липосомы свободны от ограничений по длине ДНК, которые являются типичными для систем доставки на основе вирусов. Липосомы эффективно применялись для введения генов, лекарственных средств, радиотерапевтических средств, вирусов, транскрипционных факторов и аллостерических эффекторов в ряд культивируемых клеточных линий и животных. Кроме того, завершились несколько успешных клинических испытаний, оценивающих эффективность опосредуемой липосомами доставки лекарственного средства.
Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и спонтанно образуют многослойные концентрические пузырьки из бислоев (также называемые многослойными пузырьками (MLV). MLV обычно имеют диаметры от 25 нм до 4 мкм. Ультразвуковая обработка MLV приводит в результате к образованию небольших однослойных пузырьков (SUV) с диаметрами в диапазоне от 200 до 500 Ангстрем, содержащих водный раствор во внутренней части.
В качестве альтернативы можно применять составы нанокапсул с rAAV. Нанокапсулы обычно могут стабильно и воспроизводимо захватывать вещества. Во избежание побочных эффектов вследствие внутриклеточной перегрузки полимерами, такие ультратонкодисперсные частицы (с размером около 0,1 мкм) следует конструировать с применением полимеров, которые способны разлагаться in vivo. Для применения предусматриваются биоразлагаемые полиалкил-цианоакрилатные наночастицы, которые соответствуют этим требованиям.
Способы лечения синдрома Ретта.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящее раскрытие относится к композициям и способам для лечения синдрома Ретта. Синдром Ретта представляет собой генетическое неврологическое нарушение, вызванное одной или несколькими мутациями с потерей функции в гене МеСР2, например, как описано в Suter et al., J. Autism Dev. Disord., 2014 Mar, 44(3):703-711. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления субъект, имеющий синдром Ретта, имеет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше мутаций с потерей функции в гене МеСР2.
В контексте данного документа термины лечение, осуществление лечения и терапия относятся к терапевтическому лечению, а также к профилактическим или превентивным манипуляциям. Термины дополнительно включают в себя ослабление существующих симптомов, предупреждение дополнительных симптомов, ослабление или предупреждение первопричин симптомов, предупреждение или обращение развития причин симптомов, например, симптомов, ассоциированных с заболеванием, вызванным мутацией с потерей функции, например синдрома Ретта. Таким образом, термины обозначают, что благоприятный результат был достигнут у субъекта с нарушением (например, синдромом Ретта) или у субъекта с потенциалом к развитию такого нарушения. Более того, термин лечение определен как применение или введение средства (например, терапевтического средства или терапевтической композиции) субъекту или в выделенную ткань или клеточную линию от субъекта, который может иметь заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью излечения, заживления, облегчения, смягчения, изменения, устранения, ослабления, улучшения или воздействия на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.
Терапевтические средства или терапевтические композиции могут включать в себя соединение в фармацевтически приемлемой форме, которая предупреждает и/или уменьшает симптомы конкретного заболевания (например синдрома Ретта). Например, терапевтическая композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, которая предупреждает и/или уменьшает симптомы синдрома Ретта. Предполагается, что терапевтическая композиция согласно настоящему изобретению будет обеспечена в любой подходящей форме. Форма терапевтической композиции будет зависеть от ряда факторов, в том числе от способа введения, как описано в данном документе. Терапевтическая композиция может содержать разбавители, вспомогательные вещества и вспомогательные средства в числе прочих ингредиентов, которые описаны в данном документе.
Примеры
Пример 1. Анализ экспрессии гена изоформы e1 человеческого МеСР2 in vitro.
Примерно 80% случаев синдрома Ретта вызваны мутациями в сцепленном с X-хромосомой гене, кодирующем метил-CpG-связывающий белок 2 (МеСР2), экспрессирующийся в широком спектре тканей эпигенетический регулятор, который экспрессируется на высоких уровнях в зрелых нейронах. Большинство пациентов с синдромом Ретта несут нормальный и мутантный аллель МеСР2. Заболевание является результатом случайной инактивации Х-хромосомы, при которой ~50% нейронов имеют недостаточность МеСР2 вследствие инактивации нормального аллеля, в то время как в других ~50% нейронов мутантный аллель подвергается сайленсингу, и сохраняется нормальная экспрессия МеСР2 дикого типа. Неоднородность недостаточности МеСР2 в ЦНС имеет важные последствия для разработки подходов к генной терапии для синдрома Ретта. В моделях синдрома Ретта на мышах наблюдали возможность обращения развития неврологических фенотипов после восстановления нормальной экспрессии МеСР2 у взрослых.
- 20 045780
В этих экспериментах на трансгенных животных восстановленную экспрессию МеСР2 запускали с его нативного геномного локуса, и активация достигалась в большинстве клеток в головном мозге. Тем не менее перенос гена в соматические клетки еще не повторил ни одного из этих успехов.
Обычно МеСР2 характеризуется очень узким окном безопасных уровней экспрессии, поскольку у пациентов с дупликацией локуса МеСР2, как правило, присутствует задержка развития двигательных и когнитивных функций, а также тяжелое умственное расстройство. Эксперименты в моделях на трансгенных мышах подтверждают это утверждение, поскольку эктопическая экспрессия МеСР2 является токсичной у животных дикого типа, но безопасной и отчасти эффективной в ослаблении фенотипов заболевания у мышей с недостаточностью МеСР2, когда экспрессия трансгена начинается в ходе эмбрионального развития. Примечательно, что ген МеСР2 подвергается альтернативному сплайсингу с образованием двух белков с отличающимися N-концами, обозначенными как МеСР2-е1 и МеСР2-е2. У пациентов с дупликацией локуса МеСР2 сверхэкспрессируются обе изоформы МеСР2. Таким образом, симптомы у пациентов с дупликацией локуса МеСР2 и результаты на трансгенных мышах могут объясняться сверхэкспрессией изоформы МеСР2-е2 и временным паттерном экспрессии трансгена в ходе развития.
Предшествующие терапевтические эксперименты с AAV9-MeCP2-e1 сосредоточивались на внутрисосудистой (IV) или интрацеребровентрикулярной (ICV) доставке в неонатальный период, и в некоторых случаях они столкнулись с летальной печеночной токсичностью и поджатием задней конечности. Более того, возраст мышей, получавших обработку в таких экспериментах, не обязательно соответствует тому, в котором, вероятно, должно осуществляться лечение в случае большинства пациентов с синдромом Ретта, которые предположительно будут получать лечение после появления симптомов (6-18 месяцев). У людей начальная фаза синаптогенеза происходит в первые 2 года и совпадает с быстрым повышением не-CG-метилирования ДНК в нейронах, а также появлением симптомов у пациентов с синдромом Ретта. У мышей синаптогенез происходит в возрасте от 2 до 4 недель. Таким образом, критически важной является оценка эффективности и возможной токсичности доставки гена AAV-MeCP2 на соответствующих стадиях развития после 0-1 суток после рождения. Кроме того, важным ограничением для использования системной доставки гена AAV для лечения нарушений ЦНС является трансдукция органов, отличных от головного мозга, таких как печень, которая является органом с наиболее высоким тропизмом для AAV в организме.
Был сконструирован ряд новых векторов AAV-MeCP2, которые исключают экспрессию гена в периферических органах, а также обеспечивают саморегуляцию экспрессии МеСР2. Обычно мРНК МеСР2 несет либо короткий (1,8 кбаз), либо длинный (~10 кбаз) 3'UTR, при этом последний является преимущественной изоформой, экспрессирующейся в головном мозге. Конструкции мРНК МеСР2, описанные в этом примере, содержат кодирующую последовательность белка изоформы МеСР2-е1 и несколько регуляторных элементов для miRNA (MRE). Наблюдали, что трансляция МеСР2 в ЦНС регулируется miR-132 посредством гомеостатического механизма, включающего изменения уровней нейротрофического фактора головного мозга (BNDF) в ответ на экспрессию МеСР2 (фиг. 1А). Исходя из этого механизма в ряде векторов AAV-MeCP2 увеличенные количества MRE для miR-132 (например, сайтов связывания miR-132) сочетаются с фиксированным количеством MRE для miR-1 и miR-122 (например, сайтов связывания 3х-miR-1 и 3x-mir-122) для нарушения нацеливания экспрессии генов AAV на скелетные мышцы и печень (фиг. 1В).
Осуществляли серию экспериментов in vitro. Кратко клетки HEK293T трансфицировали AAV2MeCP2 в дозе 30000 gc/клетка в течение четырех суток. На фиг. 2А, 2В представлена эффективная экспрессия AAV2-MeCP2 в клетках HEK293T, измеренная методом Вестерн-блоттинга (фиг. 2А) и с помощью нормализованного анализа экспрессии белка (фиг. 2В). На фиг. 2С представлен профиль токсичности у клеток 293Т, трансдуцированных AAV2-MeCP2, в течение четырех суток при дозе 30000 gc(копий генома)/клетка.
Исследование зависимости доза-ответ в первичных нейронах коры головного мозга демонстрировало сравнимые эффекты в отношении выживаемости клеток в случае векторов AAV-GFP и AAV-MeCP2 (фиг. 3А), указывающие на то, что экспрессия меченого myc человеческого МеСР2 с короткого мышиного промотора МеСР2 (от -223 до +56) является нетоксичной для первичных нейронов в культуре. Кроме того, наблюдали, что уровни белка МеСР2-myc были обратно пропорциональными числу MRE для miR-132 (например, сайтов связывания miR-132), присутствующих в транскрипте МеСР2-myc (фиг. 3В). На фиг. 3С представлена экспрессия miR-132 в ответ на AAV2-MeCP2 через пять суток после инфицирования AAV.
Пример 2. Анализ экспрессии гена изоформы e1 человеческого МеСР2 у мышей дикого типа после системной доставки AAV-МеСР2.
Чтобы расширить наблюдения in vitro, демонстрирующие возможность регулирования уровней МеСР2 посредством вставки последовательностей-мишеней miR-132, описанных в примере 1, мышам дикого типа в 1 сутки после рождения вводили инъекцией через лицевую вену (например, внутричерепная инъекция) AAV, кодирующий изоформу e1 человеческого МеСР2 и содержащий 0, 1, 2 или 3 последовательности-мишени miR-132. Анализ экспрессии гена в ткани головного мозга показал, что уровни МеСР2 являются обратно пропорциональными числу последовательностей-мишеней miR132 (фиг. 4А-4С).
- 21 045780
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления системное введение некоторых серотипов AAV может трансдуцировать ткани за пределами центральной нервной системы, и наблюдали, что повышенная экспрессия МеСР2 в тканях печени, сердца и скелета является ассоциированной с вредными физиологическими последствиями. Для сведения к минимуму трансдукции МеСР2 сердца и печени векторы AAV-MeCP2, описанные в настоящем раскрытии, содержат по меньшей мере одну последовательность-мишень miR-1 (например, 3х-miR-1) и по меньшей мере одну последовательность-мишень miR-122 (например, 3х-miR-l22) (например, сайты связывания) для нарушения нацеливания экспрессии МеСР2 на сердце и печень, соответственно. Осуществляли анализ методом qRT-PCR с применением праймеров для изоформы е2 человеческого МеСР2 (которая не выявлялась) и для изоформ e1 и е2 мышиного МеСР2 (уровень экспрессии которых не изменялся). Анализ экспрессии гена в ткани сердца и печени от животных дикого типа указывал на то, что нацеливание экспрессии МеСР2 на сердце и печень эффективно нарушалось, о чем свидетельствует существенно сниженный уровень экспрессии по сравнению с головным мозгом (фиг. 4А и 5).
Пример 3. Терапевтическая эффективность и безопасность саморегулирующихся векторов AAVМеСР2.
Терапевтическую эффективность и безопасность векторов AAV-MeCP2-e1 оценивают у мышей. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления применяют белок капсида AAV-PHP.B, поскольку этот капсид характеризуется улучшенной эффективностью трансдукции нейронов. Нулевые по Меср2 мыши (Mecp2tm1.1Bird/J; самцы-/у и самки+/-) в возрасте 4 недели получают обработку посредством системного введения векторов AAV-PHP.B-MeCP2-e1, несущих различные кассеты с MRE (например, в дозах вектора, составляющих 1Е11, 3Е11, 1Е12 vg/мышь), и массы тела и фенотипические оценки отслеживают каждые две недели. В качестве контролей используют MeCP2/Mecp2tmUBird мышей, которым вводят инъекцией среду, и мышей дикого типа. Подгруппу мышей в каждой когорте (n=8; 4 самца и 4 самки) умерщвляют через 8 недель после инъекции и экспрессию МеСР2 количественно определяют методом Вестерн-блоттинга и сравнивают в группах. Эффективность трансдукции в головном мозге оценивают посредством двойного иммунофлуоресцентного окрашивания в отношении МеСР2 и нейронов (с применением нейронного маркера NeuN) и осуществляют количественное определение трансдуцированных нейронов (МеСР2+, NeuN+) в коре головного мозга, полосатом теле, таламусе, гиппокампе и мозжечке. Уровни PSD-95 оценивают с помощью анализа методом Вестерн-блоттинга и иммуноокрашивания срезов головного мозга; PSD-95 представляет собой ключевой каркасный белок в созревании синапсов, уровни которого являются пониженными в головном мозге от нулевых по МеСР2 мышей.
Для осуществления анализа биологического распределения вектора геномную ДНК выделяют из различных областей ЦНС и периферических органов и анализируют с помощью цифровой ПНР. Другую подгруппу животных в каждой когорте (n=16; 8 самцов и 8 самок) используют для анализа выживаемости и продольного анализа поведенческих характеристик (например, тест открытое поле; социальное взаимодействие) и двигательной активности (например, тест способности удерживаться на вращающемся барабане, тест ходьбы по решетке), а также для плетизмографии всего тела для оценки характера дыхания и характеристик апноэ у нулевых по МеСР2 мышей. Исследования конечных показателей являются такими же, как и через 8 недель после обработки. Безопасность векторов также оценивают на мышах дикого типа в исследовании с увеличением дозы при использовании доз, идентичных указанным выше, с получением конечных результатов через 7, 30, 90 и 180 суток для оценки ЦНС и периферических тканей в отношении признаков токсичности. Также оценивают биологическое распределение вектора на основе AAV и экспрессию МеСР2.
Пример 4. Характеристика изменений в геноме/транскриптоме трансдуцированных нейронов после переноса AAV-МеСР2 гена на различных стадиях развития нервной системы.
Ключевой аспект в разработке подхода для безопасной и эффективной генной терапии синдрома Ретта заключается в подробной характеристике воздействия de novo экспрессии МеСР2 на эпигенетический ландшафт и транскриптомный профиль трансдуцированных нейронов. Для этой цели получают векторы AAV-PHP.B-MeCP2-e1, которые несут кассету IRES-GFP и обеспечивают возможность выделения трансдуцированных GFP+ клеток из головного мозга, мозжечка и спинного мозга либо с помощью метода FACS, либо с помощью лазерной захватывающей микродиссекции с последующим бисульфитным секвенированием всего генома (Methy1-Seq), секвенированием малых РНК (микроРНК) и секвенированием РНК (мРНК и некодирующих РНК). Самцы МеСР2-/у, самки МеСР2-/+ и контроли дикого типа (самцы и самки) получают системную инъекцию AAV-PHP.B-MeCP2-e1-IRES-GFP, контрольного вектора (без к ДНК МеСР2) и среды в день 1, 7, 14 и 28, а также в возрасте 12 недель в оптимальной дозе.
Мышей (n=8; 4 самца и 4 самки) умерщвляют через 1 или 3 месяца после инъекции для оценки параметров, указанных выше. Информацию о микроРНК, которые сверхэкспрессируются в ответ на экспрессию МеСР2, используют для установления дополнительных уровней регуляции экспрессии генов помимо тех, которые в основе которых лежит miR-132.
Пример 5. Вклад изоформ МеСР2 в успех терапии или появление неврологических симптомов в зависимости от вмешательства на разных стадиях развития.
Наблюдали, что экспрессия МеСР2, которая 1,6-6-кратно превышает физиологически нормальные
- 22 045780 уровни, вызывает неврологические симптомы как у пациентов с дупликацией локуса МеСР2 (~2-кратно выше нормального уровня), так и в моделях на трансгенных мышах. Другим сходством между пациентами и моделями на трансгенным мышах является то, что и у тех, и у других сверхэкспрессируется изоформа МеСР2-е2, которая, в отличие от изоформы e1, оказывается токсичной для первичных нейронов в культуре. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления этот токсический эффект устраняется при коэкспрессии FoxG1, который представляет собой другой ген, мутации в котором ассоциированы с синдромом Ретта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления коэкспрессия FoxGl с МеСР2 представляет собой дополнительный механизм для контроля побочных эффектов, ассоциированных со сверхэкспрессией МеСР2. Эксперименты по изучению терапевтических свойств, безопасности и эпигеномных/транскриптомых характеристик с использованием векторов на основе AAV-PHP.B, кодирующих МеСР-e1, МеСР2-е2, МеСР2-е2 и FoxG1 или FoxG1 отдельно, проводят на самцах МеСР2-/у, самках МеСР2+/- и контролях дикого типа, соответствующих по возрасту.
Последовательности >SEQ Ш NO: 1; аминокислотная последовательность изоформы el человеческого МеСР2 (NM_001110792)
MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEP VQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWT RKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGS PSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVK MPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAA EAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKS PGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPP
EPQDLS S S VCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQP AVATAATAAEKYKHRGEGERKDI VSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS > SEQ ID NO: 2; аминокислотная последовательность изоформы e2 человеческого MeCP2 (NM_004992)
MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPA EAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRS AGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKK PKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGK AEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKE SSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSP KGRS S S AS SPPKKEHHHHHHHSESPK AP VPLLPPLPPPPPEPES SEDPT SPPEPQDLS S S VC KEEKMPRGGSLESDGCPKEP AKTQP AV AT A AT AAEK YKHRGEGERKDIVS S SMPRPNR EEPVDSRTPVTERVS >SEQ ID NO: 3; последовательность ДНК промотора мышиного МеСР2
AATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAA GGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCA CACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCG GTT >SEQ ID NO: 4; последовательность ДНК сайта связывания miR-122
ACAAACACCATTGTCACACTCCA
- 23 045780 > SEQ ID NO: 5; последовательность ДНК сайта связывания miR-1 АТАСАТАСТТСТТТАСАТТССА > SEQ ID NO: 6; последовательность ДНК сайта связывания miR-132 CGACCATGGCTGTAGACTGTTA > SEQ ID NO: 7; последовательность нуклеиновой кислоты конструкции с МеСР2 для экспрессии in vitro (плазмида scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(lx)miR122-l(3x))
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCAT GCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCG CTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAG AGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAG GGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCC TCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTG CCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAA GTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGG TGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATC AGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGT CAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCA TCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACAC GGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTG ATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAA AAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAG AGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAG CTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACC CAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTG GGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGG GGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCG AAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGG AGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTC TATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGA CGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGT GAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGG AGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCAC
- 24 045780
CACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCC CTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAG CCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTC ACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCA CCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGA CATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGA CGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGA CGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATA CTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACC ATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACT CCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCAT GAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAAT AGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCG GGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGC GCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTT GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACT GGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCG CCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGA TCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCG GCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCC AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCG GCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTT ACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCAT CGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGG ACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTA TAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAA TTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGG GAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCC GCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTA TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCT GTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGG TGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTT TCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGC GGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTC TCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCAT
- 25 045780
GACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCA ACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATA CCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAA ACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGAT GGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTT TATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACT GGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGG CAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAG CATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTC ATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAA TCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAG GATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACC ACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAA GGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTA GTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAAT CCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTC AAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCA CACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAG CTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAG CGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGG TATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGAT GCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGG TTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTC TGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAAC GACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAA CCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCC GACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTA AGGCCTTAATTAGG
- 26 045780 >SEQ ID NO: 8; последовательность нуклеиновой кислоты конструкции с МеСР2 для экспрессии in vitro (плазмида scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(2x)miR122-l(3x))
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCAT GCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCG CTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAG AGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAG GGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCC TCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTG CCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAA GTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGG TGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATC AGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGT CAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCA TCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACAC GGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTG ATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAA AAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAG AGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAG CTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACC CAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTG GGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGG GGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCG AAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGG AGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTC TATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGA CGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGT GAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGG AGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCAC CACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCC CTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAG CCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTC ACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCA CCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGA CATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGA
- 27 045780
CGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGA CGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATA CTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCA CCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCC AACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCC AAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAG GAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTA GGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGG AGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGG TCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGC CTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCT GGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAAT AGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGA ATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCA GCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTC CTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTA GGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGAT GGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAG TCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCT CGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAA TGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAAT TTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAA TACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAAT ATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTT TGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGA TGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCG GTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTA AAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCG GTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAA AGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATG AGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACC GGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAA TGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGC AACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCG
- 28 045780
GCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCT CGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATC TACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGAT AGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACT TTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTT GATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGAC CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCT GCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAG CTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACT GTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCT ACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCG TGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGG CTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAAC TGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAG GCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGC TTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGAC TTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCC AGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCT TTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGA TACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCG GAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGC AGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAA TGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGT ATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCA TGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG >SEQ ID NO: 9; последовательность нуклеиновой кислоты конструкции с МеСР2 для экспрессии in vitro (плазмида scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(3x) miR122-l(3x))
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCAT GCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCG CTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAG AGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAG GGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCC TCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTG
- 29 045780
CCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAA GTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGG TGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATC AGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGT CAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCA TCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACAC GGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTG ATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAA AAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAG AGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAG CTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACC CAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTG GGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGG GGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCG AAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGG AGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTC TATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGA CGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGT GAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGG AGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCAC CACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCC CTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAG CCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTC ACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCA CCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGA CATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGA CGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGA CGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGT AGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCC AATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCC AACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTT CGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAG CATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATT TTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAAC TACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTC
- 30 045780
ACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTC AGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACA ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCC CCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACA GTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGG CGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCG CTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCT CTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCC AAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTT TTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTG GAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGAT TTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAA CAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACC CCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAAC CCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCC GTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAA ACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT CGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTT TCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGA GTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTAT GCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGA TCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACT CGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGA CACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAAC TACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTG CAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTG GAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAG CCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG AAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAG ACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG GATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTT TTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCC tttttttctgcgcgtAAtctgctgcttgcAAAcAAAAAAAccAccgctAccAgcggt GGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAG
- 31 045780
CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTT CAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACC GGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGG AGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCC ACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAA CAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCT GTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGG CGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGC TGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTA TTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGC GAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGG GCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTT TACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAG G >SEQ ID NO: 10; последовательность нуклеиновой кислоты конструкции с МеСР2 для экспрессии in vivo (геном вектора scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(lx)miR122-l(3x)) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCAT GCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCG CTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAG AGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAG GGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCC TCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTG CCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAA GTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGG TGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATC AGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGT CAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCA TCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACAC GGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTG ATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAA
- 32 045780
AAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAG AGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAG CTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACC CAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTG GGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGG GGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCG AAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGG AGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTC TATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGA CGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGT GAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGG AGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCAC CACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCC CTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAG CCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTC ACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCA CCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGA CATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGA CGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGA CGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATA CTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACC ATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACT CCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCAT GAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAAT AGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCG GGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGC GCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTT GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG >SEQ ID NO: 11; последовательность нуклеиновой кислоты конструкции с МеСР2 для экспрессии in vivo (геном вектора scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(2x)miR122-l(3x)) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCAT GCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCG CTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAG
- 33 045780
AGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAG GGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCC TCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTG CCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAA GTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGG TGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATC AGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGT CAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCA TCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACAC GGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTG ATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAA AAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAG AGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAG CTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACC CAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTG GGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGG GGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCG AAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGG AGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTC TATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGA CGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGT GAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGG AGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCAC CACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCC CTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAG CCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTC ACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCA CCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGA CATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGA CGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGA CGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACTCGAGATACATA CTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCCA CCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCC AACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTTCGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCC AAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAG
- 34 045780
GAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTA GGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGG AGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGG TCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG >SEQ ID NO: 12; последовательность нуклеиновой кислоты конструкции с МеСР2 для экспрессии in vivo (геном вектора scAAV-Mec229-hMeCP2-miR132(3x) miR122-l(3x)) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCAT GCTCTAGGAAGATCAATTCGGTACAATTCACGCGTCGACAATTGAGGGCGTCACCG
CTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAG AGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAG GGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCC TCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAATGGCTGCAGCCGCTG CCGCAGCGCCGAGCGGCGGAGGTGGCGGTGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAA GTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGG TGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATC AGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGT CAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCA TCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACAC GGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGACGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTG ATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAA AAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAG AGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAG CTCCAGGAACTGGCAGAGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACC CAAGGCAGCTACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTG GGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGG GGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCG AAAAGCTGAGGCAGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGTCGAAAGCCGGGG AGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTC TATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGA CGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGT GAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGG AGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCAC CACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCC
- 35 045780
CTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAG CCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTC ACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCA CCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGA CATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGA CGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGTGA CGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGTAGACTGTTACGACCATGGCTGT AGACTGTTACTCGAGATACATACTTCTTTACATTCCAATACATACTTCTTTACATTCC AATACATACTTCTTTACATTCCACCATGGACTAGTACAAACACCATTGTCACACTCC AACAAACACCATTGTCACACTCCAACAAACACCATTGTCACACTCCAGCGGCCGCTT CGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAG CATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATT TTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAAC TACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTC ACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTC AGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG > SEQ ID NO: 13; аминокислотная последовательность капсида AAV2
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNG LDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLG RAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFG QTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCD STWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHC HFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAG ASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAM ASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNL QRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK HPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTS NYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL > SEQ ID NO: 14; аминокислотная последовательность капсида AAV9
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPG NGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGG
- 36 045780
NLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRL NFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWH CDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFN RFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFT DSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQML RTGNNFQFS YEFENVPFHS S YAHSQ SLDRLMNPLIDQ YLYYLSKTINGSGQNQQTLKF S V AGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGP AMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVA TNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGF GMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPE IQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL > SEQ ID NO: 15; аминокислотная последовательность капсида AAV-PHP.B
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPG NGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGG NLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRL NFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWH CDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFN RFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFT DSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQML RTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTINGSGQNQQTLKFSV AGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGP AMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVA TNHQSAQTLAVPFKAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHP SPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKEN SKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

Claims (26)

1. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая транскрипт, содержащий кодирующий участок, который кодирует белок человеческого МеСР2 или его функциональный фрагмент, и 3'-некодирующий участок, содержащий два или больше сайтов связывания miRNA, причем два или больше сайтов связывания miRNA содержат (a) по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая отрицательно регулирует экспрессию транскрипта, где по меньшей мере один сайт связывания miRNA содержит сайт связывания miR-132; и (b) по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая ингибирует экспрессию транскрипта в клетке нецелевой ткани, где по меньшей мере один сайт связывания содержит сайт связывания miR-1 и/или сайт связывания mir-122.
2. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, причем кодирующий участок кодирует изоформу e1 MeCP2 или изоформу е2 МеСР2.
3. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1 или 2, причем человеческий МеСР2 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 2.
4. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп.1-3, причем по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая отрицательно регулирует экспрессию транскрипта, содержит два или три сайта связывания miR-132.
5. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп.1-4, причем по меньшей мере один сайт связывания miRNA, специфический в отношении miRNA, которая ингибирует экспрессию транскрипта в нецелевой ткани, содержит сайт связывания miR-1 и сайт связывания miR-122.
6. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп.1-5, дополнительно содержащая поли-Ахвост, причем каждый из одного или нескольких сайтов связывания miRNA расположен между последним кодоном кодирующего участка и поли-А-хвостом транскрипта.
- 37 045780
7. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп.1-6, дополнительно содержащая промотор, необязательно промотор мышиного МеСР2.
8. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.7, причем промотор мышиного МеСР2 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3.
9. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп.1-8, причем рекомбинантная нуклеиновая кислота расположена на плазмиде.
10. Вирусный вектор, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-8, необязательно причем вирусный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), аденовирусный вектор, лентивирусный вектор, вектор на основе вируса герпеса или вектор на основе бакуловируса.
11. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV), содержащий капсид, вмещающий рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-8.
12. rAAV по п.11, причем нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один ITR, выбранный из ITR AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 или AAV6.
13. rAAV по п.11 или 12, причем капсид содержит белок капсида, который способствует прохождению rAAV через гематоэнцефалический барьер.
14. rAAV по п.13, причем белок капсида имеет серотип, выбранный из группы, состоящей из AAV-PHP.B, AAV1, AAV2, AAV2i8, AAV2.5, AAV5, AAV6, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAVrh10, AAV-B1, AAV9.45A-String (например, AAV9.45-AS), AAV9.45Angiopep, AAV9.47-Angiopep, AAV9.47-AS, AAV-CAM130 и AAV9HR.
15. rAAV по любому из пп.11-14, причем белок капсида содержит или состоит из последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 14 или 15 (AAV-PHP.B, AAV9).
16. Композиция для повышения экспрессии МеСР2 в целевой клетке или целевой ткани, содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-8 или rAAV по любому из пп.11-15 и фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
17. Композиция по п.16, причем композиция составлена для инъекции, необязательно при этом инъекция представляет собой системную инъекцию, необязательно внутривенную инъекцию или интратекальную инъекцию.
18. Способ лечения синдрома Ретта у субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту с синдромом Ретта или подозрением на синдром Ретта эффективного количества (a) рекомбинантной нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-8;
(b) rAAV по любому из пп.11-15; или (c) композиции по п.16 или 17.
19. Способ по п.18, причем субъект представляет собой субъекта-человека, необязательно при этом субъект имеет возраст менее одного года.
20. Способ по п.18 или 19, причем субъект характеризуется мутацией по меньшей мере в одной копии гена МеСР2, необязательно при этом мутация представляет собой мутацию с потерей функции.
21. Способ по любому из пп.18-20, причем введение представляет собой инъекцию, необязательно системную инъекцию, необязательно внутривенную инъекцию или интратекальную инъекцию.
22. Способ по любому из пп.18-21, причем введение приводит в результате к пересечению эффективным количеством (а), (b) или (с) гематоэнцефалического барьера субъекта.
23. Способ по любому из пп.18-22, причем введение приводит в результате к нетоксичному уровню экспрессии МеСР2 в головном мозге субъекта.
24. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, дополнительно содержащая кодирующую область, кодирующую нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).
25. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп.1-8, в которой по меньшей мере один сайт связывания miRNA для miR-132 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6.
26. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп.1-8 или 25, причем по меньшей мере один сайт связывания miRNA для miR-122 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4, и/или по меньшей мере один сайт связывания miRNA для miR-1 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 5.
EA201992882 2017-06-06 2018-06-06 САМОРЕГУЛИРУЕМЫЕ ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ AAV ДЛЯ БЕЗОПАСНОЙ ЭКСПРЕССИИ MeCP2 ПРИ СИНДРОМЕ PETTA EA045780B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/516,060 2017-06-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045780B1 true EA045780B1 (ru) 2023-12-26

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230416779A1 (en) Self-regulating aav vectors for safe expression of mecp2 in rett syndrome
US20240139340A1 (en) Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
US12054715B2 (en) Modified AAV constructs and uses thereof
US10894949B2 (en) Recombinant AAVS having useful transcytosis properties
CN107073051B (zh) 重组aav变体及其用途
US20180265863A1 (en) Novel high efficiency library-identified aav vectors
US20230348914A1 (en) Compositions and methods for treatment of acute liver failure
EP4110931A1 (en) Inducible single aav system and uses thereof
EA045780B1 (ru) САМОРЕГУЛИРУЕМЫЕ ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ AAV ДЛЯ БЕЗОПАСНОЙ ЭКСПРЕССИИ MeCP2 ПРИ СИНДРОМЕ PETTA
US20240207441A1 (en) Capsid variants and uses thereof
US11926842B2 (en) Use of inverted terminal repeats (ITRS) from adeno-associated virus serotypes 8 and RH.39 in gene therapy vectors
US20220033824A1 (en) Modulation of sptlc1 via recombinant adeno-associated vectors
US20240243975A1 (en) Use of inverted terminal repeats (itrs) from adeno-associated virus serotypes 8 and rh.39 in gene therapy vectors
CA3098448A1 (en) Aav capsids identified by in vivo library selection