JP2023534037A - シャルコー・マリー・トゥース病の治療に有用な組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供されるのは、（ａ）ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２コード配列をコードする組換え核酸配列を含む、ＣＭＴ２を有する患者を治療するのに有用なｒＡＡＶ及び他のベクター及び組成物である。更に提供されるのは、（ｂ）ヒトＣＭＴ２Ａ対象における内因性ヒトマイトフュージン２配列と特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする核酸配列であって、ｍｉＲＮＡコード配列が、対象中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される、核酸配列を含む、ＣＭＴ２を有する患者を治療するのに有用なｒＡＡＶ及び他のベクター及び組成物である。更に提供されるのは、操作ｈＭｆｎ２コード配列及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列の両方を含む組成物であって、操作ヒトマイトフュージン２コード配列が、コードされたｍｉＲＮＡの標的部位中のＣＭＴ２Ａ患者の内因性ヒトマイトフュージン２とは異なる配列を有する、組成物である。【選択図】

Description

シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）神経障害は、末梢神経に見られる遺伝性疾患の不均一なグループである。ＣＭＴは、子供及び大人の両方に影響を与える一般的な障害である。シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）又は遺伝性運動感覚神経障害（ＨＭＳＮ）は、症候群の一部ではない遺伝性神経障害の最も一般的に使用される名称である（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｄｕａｎ，Ｘ．，Ｓｈｙ，Ｍ．Ｅ．，２０１３．Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ｕｐｄａｔｅ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、Ｂａｓｓａｍ，Ｂ．，２０１４．Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ－Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ．Ｄｉｓ．１５，１１７－１２８、Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｓｈｙ，Ｍ．Ｅ．，２０１５．ＣＭＴ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂｕｒｄｅｎ
ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｅｎｒｏｌｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＩＮＣ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｈｉｓｔｏｒｙ Ｓｔｕｄｙ（６６０１）ｆｒｏｍ ２００９－２０１３．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．８６，８７３－８７８）。

ＣＭＴニューロパシー（２型ＣＭＴ障害）の優性遺伝性軸索形態は、減少した運動及び感覚複合活動電位振幅を伴う正常又はわずかに減少した速度を有し、軸索損失が生検神経における主要な所見である。ミトコンドリア融合及び軸索に沿った輸送に必要なタンパク質である、マイトフュージン２（ＭＦＮ２）遺伝子における優性変異は、ＣＭＴ２Ａを引き起こす（Ｚｕｃｈｎｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，，２００４．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＧＴＰａｓｅ ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ ２ ｃａｕｓｅ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｔｙｐｅ
２Ａ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３６，４４９－４５１）。ＣＭＴ２Ａは、全ＣＭＴの最大７％を引き起こすと推定され、２型ＣＭＴの最も一般的な形態である（Ｆｒｅｉｄｍａｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，２０１５．ＣＭＴ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｅｎｒｏｌｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＩＮＣ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ Ｓｔｕｄｙ（６６０１）ｆｒｏｍ ２００９－２０１３．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．８６，８７３－８７８）。異なるＭＦＮ２変異は、異なる程度の神経障害を引き起こす。

大部分のＭＦＮ２変異は、重度の早期発症、軸索神経障害を引き起こし、デノボ変異である。他のＭＦＮ２優性変異は、より遅れた発症を伴う軽度の軸索神経障害を引き起こす（Ｌａｗｓｏｎ，Ｖ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，２００５．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ＣＭＴ２Ａ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ ２ ｇｅｎｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６５，１９７－２０４、Ｃｈｕｎｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｅａｒｌｙ ｏｎｓｅｔ ｓｅｖｅｒｅ ａｎｄ ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ ｍｉｌｄ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ ２（ＭＦＮ２）ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｂｒａｉｎ １２９，２１０３－２１１８、Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，２００６．ＭＦＮ２ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ／ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｔｙｐｅ ２．Ｂｒａｉｎ １２９，２０９３－２１０２、Ｆｅｅｌｙ，Ｓ．Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＭＦＮ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃａｕｓｅ ｓｅｖｅｒｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｍｏｓｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＭＴ２Ａ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７６，１６
９０－１６９６）。よりまれに、劣性ＭＦＮ２変異が、重度の早期発症性軸索神経障害を引き起こし得る。Ｍｆｎ２変異は、後根神経節（ＤＲＧ）の下位運動ニューロン及び一次感覚ニューロンに対して選択的に毒性を示す。

ＭＦＮ２におけるいくつかの優性変異は、骨髄症又は視神経萎縮を生じさせ、これらの複雑な形態のＣＭＴ２は、それぞれＨＭＳＮ－Ｖ及びＨＭＳＮ－ＶＩと称されることがあるが、ＭＦＮ２変異のみが原因ではない（Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ ｉｎ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ，５ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．１０５１－１０７４）。

哺乳動物は、異なるが重複する分布を有する２つのマイトフュージン遺伝子、Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２を有し、両方ともトランス相互作用を通じてミトコンドリア融合を促進することができる（Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．，２００５．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｓｓｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４，Ｒ２８３－Ｒ２８９）。ＭＦＮ２遺伝子におけるほぼ全ての変異は、ＧＴＰａｓｅドメインを含むが、これらに限定されない、単一の点変異としてアミノ酸置換を引き起こす（Ｃａｒｔｏｎｉ，Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎｏｕ，Ｊ．Ｃ．，２００９．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ ２
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ａ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２１８，２６８－２７３）。ＭＦＮ ２の機能喪失変異はまた、軸索神経障害を引き起こし（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，２００８．Ｓｅｖｅｒｅ ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ａｘｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ＭＦＮ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７０，１６７８－１６８１）、ミトコンドリア融合の減少をもたらすため（Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．，２００５．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｓｓｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４，Ｒ２８３－Ｒ２８９）、それは優性ＭＦＮ２変異がミトコンドリア融合に優性阻害効果を有する可能性がある（Ｄｅｔｍｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｃ．，２００７．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｕｓｅ Ｍｆｎ１ ａｎｄ Ｍｆｎ２ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｓ ｃａｕｓｅｄ
ｂｙ ＣＭＴ２Ａ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７６，４０５－４１４、Ｂａｌｏｈ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２００７．Ａｌｔｅｒｅｄ ａｘｏｎａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｔｈｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７，４２２－４３０、Ｍｉｓｋｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ ２ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ａｘｏｎａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｍｉｒｏ／Ｍｉｌｔｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３０，４２３２－４２４０、Ｍｉｓｋｏ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｄｉｓｒｕｐｔ ａｘｏｎａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ａｘｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３２，４１４５－４１５５）。

必要とされているものは、ＣＭＴ２Ａ及び関連疾患の症状、重症度及び／又は進行を軽減するために有用な治療である。

ヒトマイトフュージン２発現の欠陥に関連する症状を有する患者及び／又はＣＭＴ２Ａを有する患者を治療するために有用なウイルス及び非ウイルスベクター及び組成物が本明細書で提供される。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡｖは、（ａ）ヒトマイトフュージン２をコードする操作核酸配列と、（ｂ）（ａ）と（ｃ）との間に位置するスペーサー配列と、（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の配列に対して３’に位置するＣＭＴ２患者における内因性ヒトマイトフュージン２と特異的である、少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする核酸配列であって、（ａ）の操作核酸配列が、コードされた少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的部位を欠き、それによってコードされたｍｉＲＮＡが、操作ヒトマイトフュージン２コード配列を標的とすることから妨げる、核酸配列と、（ｃ）（ａ）及び（ｃ）と作動可能に連結される制御性配列と、を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ１又はＡＡＶｒｈ９１から選択される。特定の実施形態では、７５ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチドの長さである。一態様では、ヒト標的細胞中でベクターの発現を指示する制御性配列と作動可能に連結されるヒトマイトフュージン２コード配列を含むベクターが提供される。特定の実施形態では、少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むベクターが提供され、コードされたｍｉＲＮＡが、対象中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結されるヒト対象における内因性ヒトマイトフュージン２と特異的である。特定の実施形態では、ベクター又は他の組成物は、操作ヒトマイトフュージン２のコード配列及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡのコード配列の両方を含む。かかる実施形態では、操作ヒトマイトフュージン２コード配列は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的部位を欠き、それによってｍｉＲＮＡが、操作ヒトマイトフュージン２コード配列を標的とすることから妨げる。

特定の実施形態では、ベクターは、ヒトマイトフュージン２のコード配列、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのコード配列、及び制御性配列を含む、ベクターゲノムを含む、複製欠損ウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ１、又はＡＡＶｒｈ９１である。

特定の実施形態では、配列番号１１の核酸配列又はそれと少なくとも９０％同一の配列を有する操作マイトフュージン２コード配列を含むベクターが提供され、但し、コードされたｍｉＲＮＡにより標的とされる核酸配列が、内因性ヒトマイトフュージン２配列とは異なる。

特定の実施形態では、（ａ）配列番号１５（ｍｉＲ１６９３、６４ｎｔ）を含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｂ）配列番号１５の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｃ）配列番号１５（又は配列番号６８）の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号１５と少なくとも９９％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｄ）（ｉ）ＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴ、配列番号２７、（ｉｉ）ＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧ、配列番号２８、（ｉｉｉ）ＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧ、配列番号２９、（ｉｖ）ＴＴＧＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣ、配列番号３０、（ｖ）ＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ、配列番号３１、（ｖｉ）ＡＡＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧ、配列番号３２、（ｖｉｉ）ＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴ、配列番号３３、（ｖｉｉｉ）ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧ
ＡＧ、配列番号３４、（ｉｘ）ＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧ、配列番号３５、（ｘ）ＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴ、配列番号３６、（ｘｉ）ＴＧＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＣ、配列番号３７、（ｘｉｉ）ＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴ、配列番号３８、（ｘｉｉｉ）ＴＴＴＣＣＴＣＧＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴ、配列番号３９、（ｘｉｖ）ＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴ、配列番号４０、（ｘｖ）ＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡ、配列番号４１、（ｘｖｉ）ＡＡＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣ、配列番号４２、（ｘｖｉｉ）ＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＧＣＣ、配列番号４３、（ｘｖｉｉｉ）ＴＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡ、配列番号４４、（ｘｉｘ）ＴＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧ、配列番号４５、若しくは（ｘｘ）ＣＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡ、配列番号４６のうちの１つ以上、又は（ｉ）～（ｘｘ）のいずれかの組み合わせのうちの１つ以上を含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列を含む核酸配列を含むベクターが提供される。特定の実施形態では、単一の核酸分子は、ヒトマイトフュージン２コード配列及びｍｉＲＮＡコード配列の両方を含み、核酸分子は、ｈＭｆｎ２コード配列と少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列との間に少なくとも７５ヌクレオチドのスペーサーを更に含む。特定の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。

特定の実施形態では、組成物は、ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２コード配列をコードする組換え核酸配列と、対象中で核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結されるＣＭＴ２Ａ患者における内因性ヒトマイトフュージン２と特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする核酸配列と、を含み、操作マイトフュージン２コード配列が、コードされた少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的部位を欠き、それによってｍｉＲＮＡが操作マイトフュージン２コード配列を標的とすることから妨げる。

特定の実施形態では、薬学的組成物は、ベクター、ｒＡＡＶ、又は組成物と、薬学的に許容される水性懸濁液体、賦形剤、及び／又は希釈剤と、を含む。

特定の実施形態では、有効量のベクター、組換えＡＡＶ、又は組成物を、それを必要とする患者に送達することを含む、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）神経障害を有する患者を治療するための方法が提供される。特定の実施形態では、有効量のベクター、組換えＡＡＶ、又は組成物を、それを必要とする患者に送達することを含む、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）神経障害を有する患者における神経障害を低減するための方法が提供される。特定の実施形態では、患者を治療するための方法が提供され、方法は、アセトアミノフェン、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三環系抗うつ薬、又は抗てんかん薬、例えば、カルバマゼピン又はガバペンチンから選択される１つ以上の併用療法との組み合わせを更に含む。

特定の実施形態では、ＣＭＴ２Ａを有する患者を治療するための併用レジメンが提供され、（ａ）ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２コード配列をコードする組換え核酸配列であって、ヒトマイトフュージン２コード配列が、配列番号１１の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有し、（ｂ）のｍｉＲＮＡ標的配列中にミスマッチを有することによって、ＣＭＴ２Ａ患者における内因性ヒトマイトフュージン２コード配列とは異なる、組換え核酸配列、（ｂ）ヒトＣＭＴ２Ａ対象における内因性ヒトマイトフュージン２配列と特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする核酸配列であって、ｍＲＮＡが、対象中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される、核酸配列を共投与することを含む。

特定の実施形態では、ＣＭＴ２Ａを有する患者を治療するための併用レジメンが提供され、（ａ）ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２コード配列をコードする組換え核酸配列であって、ヒトマイトフュージン２コード配列が、（ｂ）のｍｉＲＮＡ標的配列中にミスマッチを有することによって、ＣＭＴ２Ａ患者における内因性ヒトマイトフュージン２コード配列とは異なるように操作される、組換え核酸配列、（ｂ）ヒトＣＭＴ２Ａ対象における内因性ヒトマイトフュージン２配列と特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする核酸配列であって、ｍｉＲＮＡが、対象中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される、核酸配列を共投与することを含む。特定の実施形態では、第１のベクターが、核酸（ａ）を含み、第２の異なるベクターが、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（ｂ）を含む。特定の実施形態では、第１のベクター及び／又は第２のベクターは、各々、同じ又は異なり得るウイルスベクターである。特定の実施形態では、第１及び／又は第２のベクターは、非ウイルスベクターである。

これら及び他の態様は、以下の発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。

マイトフュージン２（Ｍｆｎ２）ｍｉＲＮＡ選択（種々のｍｉＲＮＡによる内因性Ｍｆｎ２のノックダウン）を示す。図１Ａは、ｍｉＲＮＡのＡＡＶ媒介送達の静脈内送達後のＢ６マウスのマウス脳における、ｑＰＣＲによって測定した内因性Ｍｆｎ２ ＲＮＡのノックダウンを示す。図１Ｂは、ｍｉＲＮＡのＡＡＶ媒介送達の静脈内送達後のＢ６マウスのマウス脊髄における、ｑＰＣＲによって測定した内因性ｍｆｎ２ ＲＮＡのノックダウンを示す。 Ｍｆｎ２ ｃＤＮＡ導入遺伝子（すなわち、Ｍｆｎ２をコードする操作核酸配列）及びｍｉＲ１５１８を含むＡＡＶベクターの送達後のＭｆｎ２ ＲＮＡ倍率発現を示し、ＡＡＶベクターは、３×１０^１１ＧＣの用量でマウスに静脈内投与した。図２Ａは、脊髄におけるマウスＭｆｎ（ｍＭｆｎ２）ＲＮＡ倍率発現を示す。図２Ｂは、脊髄におけるラットＭｆｎ操作（ｒＭｆｎ２ｃｏ）ＲＮＡ倍率発現を示す。図２Ｃは、脊髄におけるｍｉＲ１５１８ ＲＮＡ倍率発現を示す。 Ｂ１０４ラット細胞のｍｉＲＮＡ処理後のマイトフュージン２タンパク質の発現パーセントを測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量を示す。マイトフュージン２発現は、ベータアクチンの負荷対照にわたる全パーセントの計算値からプロットされる。 ｍｉＲ１５１８を含む操作ｒＭｆｎ２ ｃＤＮＡ導入遺伝子のＡＡＶベクター送達後の処理マウスの脊髄におけるラットＭｆｎ２（ｒＭｆｎ２）ｃＤＮＡ発現の倍率発現のプロット定量化を示す。 ｍｉＲ１６９３を含む操作ｈＭｆｎ２ ｃＤＮＡ導入遺伝子のＡＡＶベクター送達後の処理マウスの脊髄におけるヒトＭｆｎ２（ｈＭｆｎ２）ｃＤＮＡ発現の倍率発現のプロット定量化を示す。 マウスにおける静脈内送達後のＡＡＶベクターからプロセシングされた成熟ｍｉＲＮＡの総量を示す。図６Ａは、ｍｉＲ１５１８プライマーを用いたｑＰＣＲによって測定された、ｍｉＲ１５１８及びｍｉＲ１６９３の倍率発現を示す。図６Ｂは、ｍｉＲ１６９３プライマーを用いたｑＰＣＲによって測定された、ｍｉＲ１５１８及びｍｉＲ１６９３の倍率発現を示す。 ＣＢ７プロモーターを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＭｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株におけるＭｆｎ２（ベクターから発現されたＭｆｎ２）の発現レベルを示し、発現レベルは、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＲＢＧ、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧでトランスフェクションした後のマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）の発現を測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量として示される。 ＣＡＧプロモーターを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＭｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株におけるＭｆｎ２（ベクターから発現されたＭｆｎ２）の発現レベルを示し、発現レベルは、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０でトランスフェクションした後のマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）の発現を測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量として示される。図 ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３細胞株におけるＭｆｎ２の発現レベルを示す。図９Ａは、ＣＢ７プロモーターを含む様々なベクター（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＲＢＧ、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧでトランスフェクションした後の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた、ＨＥＫ２９３細胞における内因性Ｍｆｎ２ノックダウンを示す。図９Ｂは、ＣＡＧプロモーターを含む様々なベクターＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０でトランスフェクションした後の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた、ＨＥＫ２９３細胞における内因性Ｍｆｎ２ノックダウンを示す。 ＣＢ７プロモーターを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３細胞株におけるＭｆｎ２（内因性Ｍｆｎ２及びベクターから発現されたＭｆｎ２）の発現レベルを示し、発現レベルは、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＲＢＧ、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧでトランスフェクションした後のマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）の発現を測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量として示される。定量は、パーセント発現としてプロットされ、トランスフェクション効率は、約９５％であると決定された。 ＣＡＧプロモーターを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３細胞株におけるＭｆｎ２（内因性Ｍｆｎ２及びベクターから発現されたＭｆｎ２）の発現レベルを示し、発現レベルは、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１６８）、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１６９）、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１７０）でトランスフェクションした後のマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）の発現を測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量として示される。定量は、パーセント発現としてプロットされ、トランスフェクション効率は、約９５％であると決定された。 ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含む様々なベクターでトランスフェクションした後の、Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ－２９３３）における成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ１５１８又はｍｉＲ５３８）をｑＰＣＲによって測定された発現レベルを示す。図１２Ａは、ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含むベクターでトランスフェクションした後の、Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株における成熟ｍｉＲ１５１８の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた発現レベルの比較を示す。図１２Ｂは、ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含むベクターでトランスフェクションした後の、Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株における成熟ｍｉＲ５３８の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた発現レベルの比較を示す。図１２Ｃは、ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含むベクターでトランスフェクションした後の、Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株における成熟ｍｉＲ１５１８及びｍｉＲ５３８の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた発現レベルの比較を示す。 マウスモデルの特徴付けを示す。図１３Ａは、マウス遺伝子型の模式図を示す。図１３Ｂは、ウエスタンブロッティングによって測定された、脳における内因性及びＦＬＡＧタグ付きＭＦＮ２の相対発現レベルによって特徴付けられる、マウスの表現型特徴付けを示す。図１３Ｃは、ウエスタンブロッティングによって測定された、脊髄における内因性ＭＦＮ２及びＦＬＡＧタグ付きＭＦＮ２の相対発現レベルによって特徴付けられる、マウスの表現型特徴付けを示す。図１３Ｄは、ＣＭＴ２Ａマウスモデル（ｎＴｇ、ＭＦＮ２^ＷＴ、及びＭＦＮ２^Ｒ４９Ｑ）におけるマウスの測定された体重を（ｇ）で示す。図１３Ｅは、落下までの時間（秒）によって測定されたマウス表現型の特徴付けを示す。図１３Ｆは、握力（ｇ）によって測定されたマウス表現型の特徴付けを示す。 ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウスにおける薬理学試験の結果を示す（試験群：Ｇ１－野生型（ＷＴ）マウス、ＰＢＳ；Ｇ２－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＰＢＳ；Ｇ３－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＢ７．ＭＦＮ２；Ｇ４－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＢ７．ＭＦＮ２．ｍｉＲ１５１８；Ｇ５－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＢ７．ＭＦＮ２．ｍｉＲ５３８；Ｇ６－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＡＧ．ＭＦＮ２．ｍｉＲ１５１８；Ｇ７－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＡＧ．ＭＦＮ２．ｍｉＲ５３８）。図１４Ａは、マウス群Ｇ１～Ｇ７において測定された体重の結果（（ｇ）としてプロットされる）を示す。図１４Ｂは、マウス群Ｇ１～Ｇ７において測定された生存の結果（０～５０日にわたる生存確率としてプロットされる）を示す。 ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウスにおける薬理学試験の握力の結果（（ｋｇ）としてプロットされる）を示す。

ヒトマイトフュージン２（又はｈＭｆｎ２）タンパク質を発現する核酸配列と、標的部位がヒトマイトフュージン２操作コード配列上に存在しない、患者の内因性ヒトマイトフュージン２遺伝子内の部位を特異的に標的とする少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする核酸配列とを、患者に共投与するための配列、ベクター、及び組成物が本明細書に提供される。好適には、ヒトマイトフュージン２コード配列は、コードされたｍｉＲＮＡの特定の標的部位を除去するように操作される。新規の操作ヒトマイトフュージン２コード配列及び新規のｍｉＲＮＡ配列が本明細書に提供される。これらは、ＣＭＴ２Ａの治療のために、単独で、又は互いに及び／又は他の療法と組み合わせて使用することができる。

本明細書で使用される場合、「内因性マイトフュージン２」という用語は、ＣＭＴ２Ａを有するヒトにおいてマイトフュージン２タンパク質をコードするマイトフュージン２遺伝子を指す。ＣＭＴ２Ａを有する患者は、いくつかのミスセンス変異又は対立遺伝子変異を有し得る。また、様々な対立遺伝子バリアントを記載する、ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ａｌｌｅｌｉｃＶａｒｉａｎｔｓ／６０８５０７も参照されたい。常染色体優性シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病２Ａ２Ａ型（ＣＭＴ２Ａ２Ａ）は、染色体１ｐ３６．２上のＭＦＮ２遺伝子（６０８５０７）のヘテロ接合変異によって引き起こされる。ＭＦＮ２遺伝子のホモ接合性又は複合ヘテロ接合性変異は、常染色体劣性ＣＭＴ２Ａ２Ｂ（６１７０８７）を引き起こす。染色体１ｐ３６．２にマッピングされるＣＭＴ２Ａの別の形態、ＣＭＴ２Ａ１（１１８２１０）は、ＫＩＦ１Ｂ遺伝子（６０５９９５）の変異によって引き起こされる。遺伝性運動感覚神経障害ＶＩ（ＨＭＳＮ６；６０１１５２）、重複する特徴を有する対立遺伝子障害も参照されたい。

ＣＭＴ２Ａを有しない患者に内因的に見出されるような天然の機能的ヒトＭｆｎ２ａ遺伝子は配列番号１８で再現され、天然の機能的ヒトＭｆ２Ａタンパク質は配列番号１９で再現される。マイトフュージン２は、筋肉、脊髄、並びに脳及び脊髄を、触覚、疼痛、熱、及び音などの感覚を検出する感覚細胞（末梢神経）に接続する神経を含む、多くの種類の細胞及び組織で作製される。この遺伝子は、代替的に、ＣＭＴ２Ａ２、ＣＲＰＰ１、Ｋ
ＩＡＡ０２１４、ＭＡＲＦ、ＭＦＮ２＿Ｈｕｍａｎ、又はミトコンドリア集合制御性因子と称され得る。２０２０年７月１２日にアクセスしたＯＭＩＭ．ＯＲＧ／ｅｎｔｒｙ／６０９２６０を参照されたい。特定の実施形態では、配列番号１９のアミノ酸配列と１００％未満の同一性を有する機能的Ｍｆｎ２タンパク質は、本明細書で提供される組成物によって送達され得る（例えば、配列番号１９と９７％～１００％の同一性を有するＭｆｎ２）。かかる実施形態では、天然の機能的ヒトＭｆｎ２の酵素機能及び結合機能は、好ましくは保持される。また、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－０９１４０も参照されたい（例えば、３０５位及び３０７位での結合部位が保存されており、及び／又はヌクレオチド１０６～１１１及び／又は２５８～２６１でのヌクレオチド結合部位が保存されている）。

一実施形態では、配列番号１１の核酸配列、又は配列番号１１と約９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、若しくは９９％～１００％同一の配列を有し、非ＣＭＴ２Ａ患者に見られるヒトミトフシン２タンパク質を発現する、操作マイトフュージン２コード配列が提供される。例えば、配列番号１９を参照されたい。配列番号２及び配列番号４も参照されたい。

特定の実施形態では、例えば、操作コード配列がｍｉＲ５３８コード配列と共投与される場合、配列番号１１の核酸配列、又は配列番号１１のｎｔ２１６～２３６が保存される（例えば、１００％同一、又は少なくとも９９％同一）ことを条件として、少なくとも８０％同一の配列を有する操作マイトフュージン２コード配列が提供される。

特定の実施形態では、例えば、操作コード配列がｍｉＲ１５１８コード配列と共投与される場合、配列番号１１の核酸配列、又は配列番号１１のｎｔ１３７１～１３９１が保存される（例えば、１００％同一、又は少なくとも９９％同一）ことを条件として、少なくとも８０％同一の配列を有する操作マイトフュージン２コード配列が提供される。好適には、配列番号１１と同一性を有する配列は、同じタンパク質を発現する。例えば、配列番号１９、配列番号２、及び配列番号４を参照されたい。

一実施形態では、配列番号２８の核酸配列、又は配列番号２４と少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、及び／又は少なくとも９９％～１００％同一の配列を有する、操作マイトフュージン２コード配列が提供される。

「５’ＵＴＲ」は、遺伝子産物のコード配列の開始コドンの上流にある。５’ＵＴＲは、一般に、３’ＵＴＲよりも短い。一般に、５’ＵＴＲは、約３ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長であるが、任意に、より長くてもよい。

「３’ＵＴＲ」は、遺伝子産物のコード配列の下流にあり、一般に、５’ＵＴＲよりも長い。特定の実施形態では、３’ＵＴＲは、約２００ヌクレオチド長～約８００ヌクレオチド長であるが、任意に、より長くても、又はより短くてもよい。

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」は、マイクロＲＮＡを指し、それは、ｍＲＮＡを調節し、タンパク質への翻訳を停止させる小さな非コードＲＮＡ分子である。一般に、ヘアピン形成ＲＮＡは、ループ配列によってアンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）と接続されたセンス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）を含む二本鎖を有するステム部分をコードする単一の核酸を含む自己相補的な「ステムループ」構造を有する。パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、相補性を共有する。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、１００％の相補性を共有する。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の相補性を共有す
る。パッセンジャー鎖及びガイド鎖は、塩基対のミスマッチにより相補性を欠き得る。いくつかの実施形態では、ヘアピン形成ＲＮＡのパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０のミスマッチを有する。一般に、ステムの最初の２～８ヌクレオチド（ループに対して）は「シード」残基と称され、標的認識及び結合において重要な役割を果たす。ステムの最初の残基（ループに対して）は、「アンカー」残基と称される。いくつかの実施形態では、ヘアピン形成ＲＮＡは、アンカー残基でミスマッチを有する。本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの破壊又はサイレンシングをもたらす、相補的塩基対形成によってｍＲＮＡ（例えば、内因性ｈＭｆｎ２内）と特異的に結合するヌクレオチドの領域である「シード配列」を含む。かかるサイレンシングは、内因性ｈＭｆｎ２の完全な消滅ではなく、下方制御をもたらし得る。特に明記しない限り、「ｍｉＲＮＡ」という用語は、人工的に設計された人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を包含する。

「自己相補的核酸」とは、核酸鎖内のヌクレオチドの相補性（例えば、塩基対合）により、それ自体とハイブリダイズ（すなわち、それ自体を折り返す）して、一本鎖二重構造を形成することができる核酸を指す。自己相補的核酸は、ヘアピンループ、ループ、バルジ、接合部、及び内部バルジなどの様々な二次構造を形成することができる。特定の自己相補的核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ又はＡｍｉＲＮＡ）は、遺伝子サイレンシングなどの制御性機能を実施する。

本明細書で提供されるコードされたｍｉＲＮＡは、ＣＭＴ２Ａを有する患者の内因性ヒトマイトフュージン２遺伝子を特異的に標的とするように設計されている。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、以下の表１、配列番号２７～４６、６８、及び８９のアンチセンス配列を含む。

特定の実施形態では、シード配列は、表に記載のアンチセンス配列と１００％同一である。特定の実施形態では、シード配列は、成熟ｍｉＲＮＡに位置し（５’から３’へ）、一般に、ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡセンス鎖の５’末端から２～７、２～８、又は約６ヌクレオチド（センス（＋）鎖の５’末端から）の位置から始まるが、それはより長い長さであり得る。特定の実施形態では、シード配列の長さは、ｍｉＲＮＡ配列の長さの約３０％以上であり、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド長、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド～２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、又は約２６ヌクレオチドであり得る。本明細書に提供される実施例では、ｍｉＲＮＡは、例えば、約５０～約８０ヌクレオチドの長さ、又は約５５ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、又は６０～６５ヌクレオチドの長さのステムループｍｉＲＮＡ前駆体配列の形態で送達される。特定の実施形態では、このｍｉＲＮＡ前駆体は、約５ヌクレオチド、約２１ヌクレオチドのシード配列、約１９ヌクレオチドのステムループ、及び約１９ヌクレオチドのセンス配列を含み、センス配列は、１つ又は２つのヌクレオチドがミスマッチであるアンチセンス配列に対応する。好適なｍｉＲＮＡコード配列の例は、配列番号１５のｍｉＲ１６９３配列である。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号１５（ｍｉＲ１６９３、６４ｎｔ）、配列番号１５の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、又は配列番号１５（又は配列番号６８）の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号１５と少なくとも９９％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列を含む。特定の実施形態では、上の表の別の配列は、配列番号１５（又は配列番号６８）の６位～２６位で置換され得る。更に別の実施形態では、配列番号１５の６位～２６位が保持され、代替配列が、ステムループ配列に対して選択される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号１６（ｍｉＲ１５１８、５９ｎｔ）、配列番号１６と少なくとも９９％の同一性を含む配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、配列番号８９（ｍｉＲ５３８、５９ｎｔ）、又は配列番号８９と少なくとも９９％の同一性を含む配列を含む。特定の実施形態では、代替ステムループ配列が選択
され、ステムのアンチセンス鎖は、配列番号１６のｎｔ６～２６、又は配列番号８９のｎｔ１～２１であり、ループ配列は、配列番号４１のｎｔ２７～４５又は配列番号８９のｎｔ２２～４０である。

特定の実施形態では、核酸分子（例えば、発現カセット又はベクターゲノム）は、１つを超えるｍｉＲＮＡコード配列を含み得る。これは、（ａ）配列番号１５（ｍｉＲ１６９３、６４ｎｔ）を含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｂ）配列番号１５の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、（ｃ）配列番号１５（又は配列番号６８）の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号１５と少なくとも９９％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列、及び／又は（ｄ）（ｉ）ＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴ、配列番号２７、（ｉｉ）ＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧ、配列番号２８、（ｉｉｉ）ＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧ、配列番号２９、（ｉｖ）ＴＴＧＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣ、配列番号３０、（ｖ）ＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ、配列番号３１、（ｖｉ）ＡＡＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧ、配列番号３２、（ｖｉｉ）ＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴ、配列番号３３、（ｖｉｉｉ）ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧ、配列番号３４、（ｉｘ）ＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧ、配列番号３５、（ｘ）ＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴ、配列番号３６、（ｘｉ）ＴＧＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＣ、配列番号３７、（ｘｉｉ）ＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴ、配列番号３８、（ｘｉｉｉ）ＴＴＴＣＣＴＣＧＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴ、配列番号３９、（ｘｉｖ）ＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴ、配列番号４０、（ｘｖ）ＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡ、配列番号４１、（ｘｖｉ）ＡＡＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣ、配列番号４２、（ｘｖｉｉ）ＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＧＣＣ、配列番号４３、（ｘｖｉｉｉ）ＴＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡ、配列番号４４、（ｘｉｘ）ＴＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧ、配列番号４５、若しくは（ｘｘ）ＣＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡ、配列番号４６のうちの１つ以上、又は（ｉ）～（ｘｘ）のいずれかの組み合わせのうちの１つ以上を含むｍｉＲＮＡコード配列のうちの１つ、２つ、又はそれ以上の配列を有するｍｉＲＮＡコード配列を含み得る。特定の実施形態では、核酸分子（例えば、発現カセット又はベクターゲノム）は、配列番号１６（ｍｉＲ１５１８）の１つ、２つ、又はそれ以上のｍｉＲＮＡコード配列を含み得る。特定の実施形態では、核酸分子（例えば、発現カセット又はベクターゲノム）は、配列番号８９（ｍｉＲ５３８）の１つ、２つ、又はそれ以上のｍｉＲＮＡコード配列を含み得る。

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、ＤＮＡプラス鎖（５’から３’）（例えば、ｈＭｆｎ２の）上に位置する配列であり、ｍｉＲＮＡシード配列を含むｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡ標的配列は、コードされた導入遺伝子産物の非翻訳領域に対して外因性であり、導入遺伝子発現の抑制が所望される細胞で、ｍｉＲＮＡによって特異的に標的化されるように設計される。理論に拘束されることは望まないが、ｈＭｆｎ２は普遍的なタンパク質であり、過剰な発現は毒性及び／又は他の負の副作用と関連付けられ得るため、ｍｉＲＮＡは、ＣＭＴ２Ａ患者に送達される操作ｈＭｆｎ２遺伝子を標的とすることを避けながら、内因性ｈＭｆｎ２遺伝子を優先的に標的とする。より詳細には、ベクターを介して送達されるｈＭｆｎ２をコードする配列は、標的部位で改変されたコドン配列を含むように設計される。

典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、約１２～約２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、又は約２６ヌクレオチ
ドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７又は８ヌクレオチド）を含有する。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、又はｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。特定の実施形態では、標的配列は、シード配列と１００％相補的である配列を複数コピー（例えば、２又は３コピー）を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、標的配列の残部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含む発現カセットでは、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補である。

したがって、配列番号１１及び２４のＭｆｎ２コード配列と９５％～９９．９％同一である本明細書に提供される配列は、構築物中の選択されたｍｉＲＮＡが標的とされる天然ヒト配列へ戻ることを回避するように設計される。

特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、操作ｈＭｆｎ２遺伝子を標的とすることを回避しながら、内因性ｈＭｆｎ２遺伝子を優先的に標的とし、内因性ｈＭｆｎ２核酸配列は、配列番号１８のものである。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、（ｉ）配列番号１８のｎｔ２１６～２３６を標的とする、ＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴ、配列番号２７；（ｉｉ）配列番号１８のｎｔ５５２～５７２を標的とする、ＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧ、配列番号２８；（ｉｉｉ）配列番号１８のｎｔ５５５～５７５を標的とする、ＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧ、配列番号２９；（ｉｖ）配列番号１８のｎｔ６２４～６４４を標的とする、ＴＴＧＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣ、配列番号３０；（ｖ）配列番号１８のｎｔ１０５５～１０７５を標的とする、ＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ、配列番号３１；（ｖｉ）配列番号１８のｎｔ１３６４～１３８４を標的とする、ＡＡＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧ、配列番号３２；（ｖｉｉ）配列番号１８のｎｔ１７９３～１８１３を標的とする、ＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴ、配列番号３３；（ｖｉｉｉ）配列番号１８のｎｔ１８４２～１８６２を標的とする、ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧ、配列番号３４；（ｉｘ）配列番号１８１のｎｔ２０６８～２０８８を標的とする、ＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧ、配列番号３５；（ｘ）配列番号１８のｎｔ２１３５～２１５５を標的とする、ＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴ、配列番号３６；（ｘｉ）５’ＵＴＲを標的とする、ＴＧＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＣ、配列番号３７；（ｘｉｉ）３’ＵＴＲを標的とする、ＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴ、配列番号３８；（ｘｉｉｉ）配列番号１８のｎｔ１１５７～１１７７を標的とする、ＴＴＴＣＣＴＣＧＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴ、配列番号３９；（ｘｉｖ）配列番号１８のｎｔ１６１６～１６３６を標的とする、ＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴ、配列番号４０；（ｘｖ）３’ＵＴＲを標的とする、ＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡ、配列番号４１；（ｘｖｉ）３’ＵＴＲを標的とする、ＡＡＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣ、配列番号４２；（ｘｖｉｉ）配列番号１８のｎｔ１１４６～１１６６を標的とする、ＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＧＣＣ、配列番号４３；（ｘｖｉｉｉ）配列番号１８のｎｔ１９１４～１９３４を標的とする、ＴＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡ、配列番号４４；（ｘｉｘ）配列番号１８のｎｔ３９０～４１０を標的とする、ＴＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧ、配列番号４５；又は（ｘｘ）配列番号１８のｎｔ９０４～９２４を標的とする、ＣＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡ、配列番号４６のうちの１つ以上を含む。

特定の実施形態では、操作ｈＭｆｎ２核酸配列は、配列番号１１又は２４のものである
。特定の実施形態では、操作ｈＭｆｎ２核酸配列は、配列番号１８のものであり、１、２、３、又は４個のヌクレオチドミスマッチが、ヌクレオチドの領域：（ｉ）配列番号１８のｎｔ２１６～２３６；（ｉｉ）配列番号１８のｎｔ５５２～５７２；（ｉｉｉ）配列番号１８のｎｔ５５５～５７５；（ｉｖ）配列番号１８のｎｔ６２４～６４４；（ｖ）配列番号１８のｎｔ１０５５～１０７５；（ｖｉ）配列番号１８のｎｔ１３６４～１３８４；（ｖｉｉ）配列番号１８のｎｔ１７９３～１８１３；（ｖｉｉｉ）配列番号１８のｎｔ１８４２～１８６２；（ｉｘ）配列番号１８のｎｔ２０６８～２０８８；（ｘ）配列番号１８のｎｔ２１３５～２１５５；（ｘｉ）配列番号１８のｎｔ１１５７～１１７７；（ｘｉｉ）配列番号１８のｎｔ１６１６～１６３６；（ｘｉｉｉ）配列番号１８のｎｔ１１４６～１１６６；（ｘｉｖ）配列番号１８のｎｔ１９１４～１９３４；（ｘｖ）配列番号１８のｎｔ３９０～４１０；又は（ｘｖｉ）配列番号１８のｎｔ９０４～９２４中に存在する。

特定の実施形態では、単一の核酸（例えば、それを含む発現カセット又はベクターゲノム）は、操作ｈＭｆｎ２コード配列及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列の両方を含み、ｍｉＲＮＡは、操作ｈＭｆｎ２配列には存在しない内因性ヒトＭｆｎ２配列の領域を特異的に標的とする。特定の実施形態では、ヒトマイトフュージン２コード配列は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの上流（５’）にあり、これらの２つの要素は、スペーサー又はリンカー配列によって分離される。特定の実施形態では、ｈＭｆｎ２コード配列の終止コドンと最も５’ｍｉＲＮＡコード配列の開始との間に少なくとも７５ヌクレオチドが存在する。特定の実施形態では、スペーサーは、約７５ヌクレオチド～約３００ヌクレオチド、又は約７５ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド、又は約７５ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、又は約７５ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチド、又は約７５ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、又は約８０ヌクレオチド～約３００ヌクレオチド、又は約８０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド、又は約８０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、又は約８０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチド、又は約８０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドである。任意に、操作ｈＭｆｎ２コード配列及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列は、約７５ヌクレオチドによって分離される。好適には、スペーサー配列は、任意の制限酵素部位を欠く非コード配列である。任意に、スペーサーは、１つ以上のイントロン配列を含み得る。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列の１つ以上は、イントロン内に位置し得る。特定の実施形態では、リンカー配列は、配列番号１７である。特定の実施形態では、リンカー配列は、配列番号９０である。

特定の実施形態では、操作ｈＭｆｎ２コード配列及びｍｉＲＮＡコード配列は、異なる核酸配列、例えば、２つ以上の異なるベクター、ベクター及びＬＮＰを含む組み合わせなどを介して送達される。特定の実施形態では、２つの異なるベクターは、ＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、これらのベクターは、異なる発現カセットを有する。他の実施形態では、これらのベクターは、同じカプシドを有する。他の実施形態では、ベクターは、異なる実施形態を有する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡコード配列は、ＬＮＰ又は別の非ウイルス送達系を介して送達される。特定の実施形態では、操作ｈＭｆｎ２配列は、ＬＮＰ又は別の非ウイルス送達系を介して送達される。特定の実施形態では、２つ以上の異なる送達系（例えば、ウイルス及び非ウイルス、２つの異なる非ウイルス）の組み合わせが使用される。これら及び他の実施形態では、２つ以上の異なるベクター又は他の送達系が実質的に同時に投与され得るか、又はこれらの系のうちの１つ以上が他の系の前に送達され得る。特定の実施形態では、操作ｈＭｆｎ２配列は、配列番号１１、又はそれと９０％～１００％同一の配列であり、それは共投与されるｍｉＲによって結合されず、かつｈＭｆｎ２をコードするｍＲＮＡをコードする。特定の実施形態では、操作ｈＭｆｎ２配列は、配列番号２４、又はそれと９０％～１００％同一の配列であり、それは共投与されるｍｉＲによって結合されず、かつｈＭｆｎ２をコードするｍＲＮＡをコードする。特定の実施形態では、ｍｉＲは、配列番号８９の配列を有するｍｉＲ５３８であり、対
象の内因性ｈＭｆｎ２を標的とするが、修飾ｈＭｆｎ２ ｃＤＮＡ配列又は修飾コードされたｍＲＮＡ配列を標的としない。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ．ｈＭｆｎ２」又は「ｒＡＡＶ．ｈＭｆｎ２」という用語は、制御性配列の制御下でヒトマイトフュージン２コード配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含むベクターゲノムをその中に有するＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルスを指すために使用される。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ．ｈＭｆｎ２ ｍｉＲＸＸＸ」又は「ｒＡＡＶ．ｈＭｆｎ２．ｍｉＲＸＸＸ」という用語は、制御性配列の制御下で内因性ヒトマイトフュージン２コード配列を標的とするｍｉＲを含むベクターゲノムをその中に有するＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルスを指すために使用される。

特定のカプシドの種類が指定され得、例えば、ＡＡＶ１．ｈＭｆｎ２又はｒＡＡＶ１．ｈＭｆｎ２は、ＡＡＶ１カプシドを有する組換えＡＡＶを指し、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＭｆｎ２又はＡＡＶｈｕ６８．Ｍｆｎ２は、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する組換えＡＡＶを指す。ＡＡＶｒｈ９１．ｈＭｆｎ２又はＡＡＶｒｈ９１．Ｍｆｎ２は、ＡＡＶｒｈ９１カプシドを有する組換えＡＡＶを指す。

「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、及びＡＡＶカプシド内にパッケージングされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子又は機能的ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を欠き、後代を生成することができないため、「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び制御性配列がＡＡＶカプシド内にパッケージングされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’及び３’最末端に位置する。一般に、ＡＡＶカプシドは、６０カプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニットであるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成され、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上で特定されるＡＡＶウイルスベクターのカプシドの源として、様々なＡＡＶが選択されてもよい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド又はその操作バリアントである。特定の実施形態では、バリアントＡＡＶ９カプシドは、ＡＡＶ９．ＰｈＰ．ｅＢカプシド（配列番号８４の核酸配列；配列番号８５のアミノ酸配列）である。特定の実施形態では、ＰｈＰ．ｅＢカプシドは、マウス研究での使用のために選択され、ヒトにおけるクレードＦベクター（例えば、ＡＡＶｈｕ６８）に好適なモデルである。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値と文字の組み合わせによって指定される。特に明記しない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶｈｕ６８、及びＡＡＶ９バリアント（例えば、２０２０年１２月１日に出願された米国仮出願第６３／１１９，８６３号）として特定されているＡＡＶを含むがこれに限定されない任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、低減したカプシド脱アミド化を有する新規ＡＡＶベクター及びその用途の両方については、ＷＯ２０１９／１６８９６１及びＷＯ２０１９／１６９００４；米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡ
ＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９、及びＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２０１８／１６０５８２（ＡＡＶｈｕ６８）も参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる。これら及び他のＡＡＶカプシドの脱アミド化プロファイルを記載する、ＷＯ２０１９／１６８９６１及びＷＯ２０１９／１６９００４も参照されたい。他の好適なＡＡＶには、ＡＡＶｒｈ９０［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２７３、］、ＡＡＶｒｈ９１［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２６６、及び２０２０年１１月４日に出願された、米国仮特許出願第６３／１０９，７３４号、及び２０２０年８月１４日に出願された、米国仮特許出願第６３／０６５，６１６号］、ＡＡＶｒｈ９２、ＡＡＶｒｈ９３、ＡＡＶｒｈ９１．９３［２０２０年４月２８日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１］が含まれ得るが、これらに限定されず、これらは参照により本明細書に組み込まれる。他の好適なＡＡＶには、２０２０年１０月２０日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０／５６５１１に記載されるＡＡＶ３Ｂバリアントが含まれ、これは、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０１、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０２、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０３、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０４、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０５、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０６、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０７、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．０８、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１０、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１１、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１２、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１３、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１４、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１５、ＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１６、又はＡＡＶ３Ｂ．ＡＲ２．１７を説明する、２０１９年１０月２１日に出願された、米国仮特許出願第６２／９２４，１１２号、及び２０２０年５月１５日に出願された、米国仮特許出願第６３／０２５，７５３号の利益を主張し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。これらの文書はまた、ｒＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶカプシドについても記載されており、参照により組み込まれる。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、又は操作され、十分に特性評価されたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２が、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、それは、異なる標的組織及び動物モデルにおいて、効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するパルボウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）カプシドの内側にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の例では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’に、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列（すなわち、導入遺伝子）、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、又は完全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補性ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲ、例えば、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）ＩＴＲが使用され得る。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節構成要素に作動可能に連結される。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。

一例では、「ベクターゲノム」は、最低限、５’から３’へ、ベクター特異的配列、操作ヒトＭｆｎ２コード配列を含む核酸配列及び任意に、調節制御配列（標的細胞におけるそれらの発現を指示する）と作動可能に連結される内因性Ｍｆｎ２を標的とするｍｉＲＮＡ配列を含み、ベクター特異的配列は、ベクターゲノムをウイルスベクターカプシド又はエンベロープタンパク質に特異的にパッケージングする末端反復配列であり得る。例えば、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ及び特定の他のパルボウイルスカプシドにパッケージン
グするために利用される。

特定の実施形態では、髄腔内注入に好適な水性液体及びベクターのストック（例えば、中枢神経系及び／又は後根神経節（例えば、神経細胞（錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘体細胞、及び介在細胞など）及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、及び上衣細胞など）を含むＣＮＳの細胞を優先的に標的とするＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶを含む組成物が提供され、ベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のための操作ｈＭｆｎ２コード配列及び／又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的内因性ｈＭｆｎ２を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターを含む組成物は、大槽（大槽内）への後頭下注入用に製剤化される。特定の実施形態では、組成物は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ｒＡＡＶ注入を介して投与される。特定の実施形態では、組成物は、オマヤレザバーを使用して投与される。特定の実施形態では、患者に、単回用量の組成物を投与する。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」とは、生物学的に有用な核酸配列と、核酸配列（例えば、タンパク質、酵素、又は他の有用な遺伝子産物、ｍＲＮＡなどをコードする遺伝子ｃＤＮＡ）及びその遺伝子産物の転写、翻訳、並びに／若しくは発現を指示又は調節する、それと作動可能に連結される制御性配列と、を含む、核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、核酸配列と連続又は非連続である制御性配列及びトランス又はシス核酸配列で作用する制御性配列の両方を含む。かかる制御性配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。発現カセットは、他の要素の中で、遺伝子配列の上流（５’～）の制御性配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどのうちの１つ以上、及びエンハンサー、又は遺伝子配列の下流（３’～）の制御性配列、例えば、ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、制御性配列は、遺伝子産物の核酸配列と作動可能に連結され、制御性配列は、介在する核酸配列、すなわち、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）によって、遺伝子産物の核酸配列から分離される。特定の実施形態では、発現カセットは、１つ以上の遺伝子産物の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、モノシストロン性又はバイシストロン性発現カセットであり得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からの１つ以上のＤＮＡ配列を指す。

典型的には、かかる発現カセットは、ウイルスベクターを生成するために使用することができ、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、及び本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含み得る。

特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＭｆｎ２コード配列（及び／又は内因性Ｍｆｎ２を標的とするｍｉＲＮＡ配列）、プロモーターを含み、かつそれらのための他の制御性配列を含み得、そのカセットは、ベクター（例えば、ｒＡＡＶ、レンチウイルス、レトロウイルスなど）にパッケージングされ得る。

ＡＡＶ
組換えパルボウイルスは、特に、ＣＭＴ２Ａの治療のためのベクターとして好適である。本明細書に記載されるように、組換えパルボウイルスは、ＡＡＶカプシド（又はボカウイルスカプシド）を含み得る。特定の実施形態では、カプシドは、後根神経節内の細胞並びに／又は下位運動ニューロン及び／若しくは一次感覚ニューロン内の細胞を標的とする。特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、内因性ｈＭｆｎ２レベルを下方制御し、ｈＭｆｎ２の過剰発現に関連する毒性を低減するために、操作ｈＭｆｎ２及び内
因性ｈＭｆｎ２を特異的に標的とするｍｉＲＮＡを含むｒＡＡＶを含む単一のｒＡＡＶストックを有し得る。他の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｈＭｆｎ２を含み得、内因性ｈＭｆｎ２を下方制御するｍｉＲＮＡを含む異なるベクターと共投与され得る。他の実施形態では、ｒＡＡＶは、内因性ｈＭｆｎ２を下方調節する少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、ｈＭｆｎ２を送達する第２のベクター（又は他の組成物）と、を含み得る。

例えば、クレードＦ由来のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶ９）を使用して生成されたベクターを使用して、ＣＮＳにおいてｈＭｆｎ２を標的にして発現するベクターを生成することができる。代替的に、クレードＡ由来のＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ９１）を使用して生成されたベクターが選択され得る。更に他の実施形態では、他のパルボウイルス又は他のＡＡＶウイルスが、ＡＡＶカプシドの好適な供給源であり得る。

ＡＡＶ１カプシドは、ＡＡＶ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶ ｖｐ３タンパク質を有するカプシドを指す。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドは、約１：１：１０の所定の比率のＡＡＶ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶ ｖｐ３タンパク質で構成され、６０個の総ｖｐタンパク質のＴ１正二十面体カプシドに組み立てられる。ＡＡＶ１カプシドは、ゲノム配列をパッケージングして、ＡＡＶ粒子（例えば、ゲノムがベクターゲノムである組換えＡＡＶ）を形成することができる。典型的には、最も長いｖｐタンパク質（すなわち、ＶＰ１）をコードするカプシド核酸配列は、ＡＡＶ１カプシドを有するｒＡＡＶの産生中にトランスで発現される。例えば、米国特許第６，７５９，２３７号、米国特許第７，１０５，３４５号、米国特許第７，１８６，５５２号、米国特許第８，６３７，２５５号、及び米国特許第９，５６７，６０７号に記載されている（これらは、参照により本明細書に援用される）。例えば、ＷＯ２０１８／１６８９６１も参照されたく、これは参照により組み込まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶ１は、質量分析を使用して決定されたカプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１６０５８２で定義されるように脱アミド化されたＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成によって特徴付けられる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、以下の位置、又はＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、５７位、３８３位、５１２位、及び／又は７１８位のＮに続くグリシンが保存されている（すなわち、未修飾のままである）ＡＡＶ１変異が構築される。特定の実施形態では、前文で示した４つの位置のＮＧは、天然配列で保存される。特定の実施形態では、人工ＮＧは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１６０５８２で定義及び特定される位置のうちの１つとは異なる位置に導入される。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＷＯ２０１８／１６０５８２で定義されるカプシドを指す（参照により本明細書に援用される）。本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、ＡＡＶｈｕ６８核酸からカプシドを発現する産生系において産生されるｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８核酸配列は、配列番号８２のアミノ酸配列をコードする配列番号８１である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８核酸配列は、配列番号８２のアミノ酸配列をコードする配列番号８３である。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。これらの亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。特定の実施形態では、ｖｐ２及び／又はｖｐ３タンパク質は、追加的に、又は代替的に、例
えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比率を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。

ＡＡＶカプシド中にパッケージングされ宿主細胞に送達されるゲノム配列は、典型的には、最低でもトランス遺伝子、及びその制御性配列、及びＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）から構成される。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節構成要素に作動可能に連結される。

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’逆位末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当該技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節要素が５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。

ＩＴＲは、ベクター産生の際のゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝要素であり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルス性シス要素である。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、及び規制当局の承認を加速させるために使用され得る。しかしながら、他のＡＡＶ起源由来のＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、シュードタイプであると称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、遺伝子産物をコードする核酸配列と、任意の制御性配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。一実施形態では、自己相補性ＡＡＶが使用される。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、１３０塩基対の短縮されたＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、ここで、外部「ａ」要素は欠失している。短縮されたＩＴＲは、内部Ａ要素をテンプレートとして使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長に戻される。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。

ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）について上記で特定された主要な要素に加えて、ベクターはまた、細胞内でのその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で導入遺伝子と作動可能に連結される、必要な従来の調節要素を含む。本明細書で使用される場合、「発現」又は「遺伝子発現」という用語は、遺伝子からの情報が、機能的な遺伝子産物の合成に使用されるプロセスを指す。遺伝子産物は、タンパク質、ペプチド、又は核酸ポリマー（ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＰＮＡなど）であり得る。

本明細書で使用される場合、「制御性配列」又は「発現制御配列」という用語は、イニ
シエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列などの核酸配列を指し、それらが操作可能に連結されるタンパク質コード核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、さもなければ制御する。制御性調節要素は、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置するプロモーター配列を含む。特に望ましい実施形態では、中枢神経系に特異的な組織プロモーターが選択される。例えば、プロモーターは神経細胞プロモーター、例えば、ｇｆａＡＢＣ（１）Ｄプロモーター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５０４７３））、又はヒトＳｙｎプロモーター（配列はＡｄｄｇｅｎｅから入手可能、参照＃５０４６５）であり得る。

他の好適なプロモーターには、例えば、構成的プロモーター、制御可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、又は生理学的ヒントに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに使用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又は神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、及びニワトリβアクチンプロモーターから選択され得る。プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの一例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離される。更に別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータ－アクチンイントロンを更に含有する。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８号などに記載されている。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが含まれる。特定の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０ポリＡである。特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡ（ＲＢＧ）である。任意に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい）。

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、組織特異的プロモーターを含み、いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、ヒトシナプシンプロモーターである。特定の実施形態では、ヒトシナプシンプロモーターは、配列番号６の核酸配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは構成的プロモーターを含み、プロモーターは、ＣＢ７プロモーター又はＣＡＧプロモーターである。特定の実施形態では、ＣＢ７プロモーターは、配列番号８６の核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、配列番号８７の核酸配列を含む。

一実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意のエンハンサー、任意のイントロン、それらを含むヒトＭｆｎ２（ｈＭｆｎ２又はｈｕＭｆｎ２）のコード配列、ポリＡ、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意のエンハンサー、任意のイントロン、それらを含むヒトＭｆｎ２のコード配列、ポリＡ、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意のエンハンサー、任意のイントロン、ｈｕＭｆｎ２コード配列、ポリＡ、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＥＦ１ａプロモーター、任意のエンハンサー、任意のプロモーター、ｈｕＭｆｎ２、ＳＶ４０ポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＵｂＣプロモーター、任意のエンハンサー、任意のイントロン、ｈｕＭｆｎ２、ＳＶ４０ポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、ｈｕＭｆｎ２、ＳＶ４０ポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、ｈｕＭｆｎ２、ウサギベータグロビンポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、操作ｈｕＭｆｎ２、リンカー、内因性ｈｕＭｆｎ２配列を標的とするｍｉＲ、ウサギベータグロビンポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、操作ｈｕＭｆｎ２、リンカー、ｍｉＲ１５１８配列、ウサギベータグロビンポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、操作ｈｕＭｆｎ２、リンカー、ｍｉＲ５３８、ウサギベータグロビンポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。例えば、配列番号１、３、６９、７１、７３、７５、７７、及び７９を参照されたい。ｈｕＭｆｎ２コード配列は、本明細書で定義される配列から選択される。例えば、配列番号１１若しくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、又は配列番号１１若しくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、あるいは本明細書に定義されるその断片を参照されたい。ベクターゲノムの他の要素又はこれらの配列上のバリエーションは、本発明の特定の実施形態について、ベクターゲノムに対して選択され得る。

ベクター産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製及びパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。

特定の実施形態では、産生プラスミドは、（ａ）ヒトマイトフュージン２をコードする操作核酸配列と、（ｂ）（ａ）と（ｃ）との間に位置するスペーサー配列と、（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の配列に対して３’に位置するＣＭＴ２患者における内因性ヒトマイトフュージン２と特異的である、少なくとも１つのｍｉＲＮＡであって、（ａ）の操作核酸配列が、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの標的部位を欠き、それによってｍｉＲＮＡが、操作ヒトマイトフュージン２コード配列を標的とすることから妨げる、少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、（ｃ）（ａ）及び（ｃ）と作動可能に連結される制御性配列と、を含む、カプシドにパッケージングするためのベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、産生プラスミドは、配列番号１、３、６９、７１、７３、７５、７７、又は７９の核酸配列を含むベクターゲノムを含む。

ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成及び単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々全体が参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。

一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを産生するために、その上に運ばれる免疫グロブリン構築物配列をパッケージング宿主細胞に導入する遺伝要素（例えば、シャトルプラスミド）に操作される。一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージ細胞も作製することができる。代替的に、発現カセットは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生成するために、又はインビトロでの抗体の混合物の産生のために使用され得
る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

「ＡＡＶ中間体」又は「ＡＡＶベクター中間体」という用語は、それにパッケージングされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含まないか、又は遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するために非機能的である。

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子と隣接する本明細書に記載の発現カセットと、発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含有する宿主細胞を培養することを伴う。また、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、記載のベクターゲノムと、ベクターゲノムをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含有する宿主細胞も本明細書で提供される。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１６０３６０Ａ２に更に詳細に記載されている。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

一実施形態では、組換えＡＡＶを産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシドへのパッケージングに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ及び宿主細胞中の産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含有するベクターゲノム、並びに組換えＡＡＶカプシドへの核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びアデノウイルスヘルパー機能を含有する。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけヒト胎児腎臓２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）から構成される。

典型的には、ｒｅｐ機能は、ベクターゲノムに隣接するＩＴＲを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ源に由来する。本明細書の実施例では、ＡＡＶ２ ＩＴＲを選択し、ＡＡＶ２ ｒｅｐを使用する。任意に、他のＲＥＰ配列又は別のＲＥＰ源（及び任意に別のＩＴＲ源）が選択され得る。例えば、ｒｅｐは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、又はｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、及びｒｅｐ４０／５２、若しくはそれらの断片であり得る。任意に、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、細胞培養物中の同じ遺伝子要素上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在し得る。これらのＡＡＶ又は変異体ＡＡＶカプシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性調節制御配列の制御下にあり得る。

一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞において製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該技術分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの産生、ベクターの産生、及びベクターの精製を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、生成されたプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランス－プラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、並びにベクター含有細胞及び培養培地の収集などの方法ステップを含み得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＭｆｎ２の製造プロセスは、プラスミドＤＮＡによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを伴う。単一バッチ又は複数バッチは、ＰＡＬＬ ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターで、ＨＥＫ２９３細胞のＰＥＩ媒介性三重トランスフェクションによって産生される。収集したＡＡＶ材料は、可能な場合、使い捨ての閉鎖型バイオプロセッシングシステムにおいて、清澄化、ＴＦＦ、アフィニティクロマトグラフィ、及びアニオン交換クロマトグラフィによって順次精製される。

収集されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書では粗細胞収集物と称される。更に別の系では、遺伝子療法ベクターは、バキュロウイルスベースベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい（その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法はまた、以下の米国特許に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

粗細胞収集物は、その後、ベクター収集物の濃縮、ベクター収集物の透析濾過、ベクター収集物の顕微溶液化、ベクター収集物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、及び／又はバルクベクターを調製するための製剤化及び濾過などの、追加の方法ステップに供される。

２工程の高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィ精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィを用いて、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号に更に詳細に記載されている（これは、参照により本明細書に援用される）。ＡＡＶ８の精製方法：２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号、及びｒｈ１０の精製方法：２０１６年１２月９日に出願され、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号（２０１５年１２月１１日にも出願されている）、並びにＡＡＶ１の精製方法：２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号、２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａ
ＡＶ１」は、全て参照により本明細書に援用される。

空及び充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードされた２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛け、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割って、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って、次いで１００を掛けることよって、空粒子のパーセンテージを得る。

一般に、空のカプシド及びパッケージされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、本方法は、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含む勾配ゲル）からなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供し、次いで、試料材料が分離するまでゲルを泳動し、ナイロン又はニトロセルロースの膜（好ましくは、ナイロン）にゲルをブロットすることを含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法が使用され、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って使用して、銀染色を実施してもよく、又は他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料は更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。

一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例え
ば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度で（例えば、約３７℃～約５０℃）より長い時間にわたって（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度で（例えば、最高約６０℃）より短い時間にわたって（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準的なアッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

追加的に、又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

簡潔に言うと、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ粒子をゲノム欠損ＡＡＶ中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶカプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィに供することを含み、ＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶ中間体は、高ｐＨで平衡化された強力アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０で紫外吸光度のために溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｐＨは、選択されたＡＡＶに応じて調節され得る。例えば、ＷＯ２０１７／１６０３６０（ＡＡＶ９）、ＷＯ２０１７／１００７０４（ＡＡＶｒｈ１０）、ＷＯ２０１７／１００６７６（例えば、ＡＡＶ８）、及びＷＯ２０１７／１００６７４（ＡＡＶ１）を参照されたい（これらは、参照により本明細書に援用される）。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達すると溶出される画分から収集される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン性条件下、残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質の著しいパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。

非ＡＡＶ及び非ウイルスベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的又は化学的部分であり、該核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入され得る。ベクターの例には、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、外因性又は異種又は操作ｈＭｆｎ２コード配列（及び／又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡ）を挿入することができ、次いで適切な標的細胞に導入することができる核酸分子である。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を、有さない細胞から選択することができる手段を有しており、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が含まれる。ベク
ターの生成、産生、特徴付け、又は定量化の従来の方法は、当業者に利用可能である。

一実施形態では、ベクターは、それについて記載された発現カセットを含む非ウイルスプラスミド、例えば、「ネイキッドＤＮＡ」、「ネイキッドプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉなどである。任意に、プラスミド又は他の核酸配列は、好適なデバイス、例えば、エレクトロスプレー、エレクトロポレーションを介して送達される。他の実施形態では、核酸分子は、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、及び他のポリマー、脂質及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲート、並びに本明細書に記載されるような他の構築物を含む様々な組成物及びナノ粒子と結合される。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ ２０１８／０３５３６１６Ａ１、ＵＳ２０１３／００３７９７７Ａ１、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１、ＵＳ９６７０１５２Ｂ２、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、共投与される操作ｈＭｆｎ２配列に存在しない部位で内因性ｈＭｆｎ２を標的とするｍｉＲＮＡ転写産物の送達に使用される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、用量当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０．０ｍｇ／ｋｇを超える）体重を超えるｍｉＲＮＡの量で送達される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、用量当たり約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１～９０ｍｇ／ｋｇ、０．１～８０ｍｇ／ｋｇ、０．１～７０ｍｇ／ｋｇ、０．１～６０ｍｇ／ｋｇ、０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～４０ｍｇ／ｋｇ、０．１～３０ｍｇ／ｋｇ、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ）体重のｍｉＲＮＡの範囲の量で送達される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、用量当たり約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、又は５００ｍｇを超える量で送達される。

特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ転写物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化される。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含む移送ビヒクルを指す。好ましくは、脂質ナノ粒子は、１つ以上のｍｉＲＮＡを１つ以上の標的細胞（例えば、後根神経節、下位運動ニューロン及び／又は上位運動ニューロン、又はＣＮＳにおいて上記で特定された細胞型）に送達するように製剤化される。好適な脂質の例には、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド）が含まれる。また、単独で、又は他の移送ビヒクルと組み合わせての、移送ビヒクルとしてのポリマーの使用も企図される。好適なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、及びポリエチレンイミンが含まれ得る。一実施形態では、移送ビヒクルは、標的細胞へのｍｉＲＮＡのトランスフェクションを促進するその能力に基づいて選択される。ｍｉＲＮＡに有用な脂質ナノ粒子は、タンパク質産生のためのデポーとして機能する標的細胞へのｍｉ
ＲＮＡの送達をカプセル化及び／又は増強するための陽イオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という語句は、選択されたｐＨ、例えば、生理的ｐＨで正味の正電荷を担持するいくつかの脂質種のいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を用いる、様々な比率の多成分脂質混合物を含むことにより調製され得る。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、コレステロール、イオン化性脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、及びカプセル化ｍＲＮＡの周囲に脂質二重層を形成するポリマーを含む慣例的な手順を使用して実施される（Ｋｏｗａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２７（４）：７１０－７２８）。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質ＤＯＰＥを有するカチオン性脂質（すなわち、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、又は１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ））を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化脂質Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡイオン化脂質、又はジケトピペラジン系イオン化脂質（ｃＫＫ－Ｅ１２）を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリ（β－アミノ）エステル（ＰＢＡＥ）を含む。例えば、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＵＳ２０１８／０３５３６１６Ａ１、ＵＳ２０１３／００３７９７７Ａ１、ＷＯ２０１５／０７４０８５Ａ１、ＵＳ９６７０１５２Ｂ２、及びＵＳ８，８５３，３７７Ｂ２を参照されたく、これらは参照により組み込まれる。

特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、操作ｈＭｆｎ２をコードする核酸配列、及び／又は操作ｈＭｆｎ２の配列上に存在しない部位で内因性ｈＭｆｎ２を標的とする少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む発現カセットが含まれる合成又は人工のウイルス粒子を指す「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」である。複製欠損ウイルスは、後代ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を保持する。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接するＥ２をコードする核酸配列のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はレンチウイルスを含む、任意の好適な複製欠損ウイルスベクターであり得る。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、又は酵母）であり得、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入される、外因性ＤＮＡ又は異種ＤＮＡを含有する。宿主細胞の例としては、限定されないが、単離された細胞、細胞培養物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非哺乳類細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、又は幹細胞が挙げられ得る。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、ｈＭｆｎ２及び／又はｍｉＲＮＡの発現が所望される任意の標的細胞を指す。特定の実施形態では、「標的細胞」という用語は、ＣＭＴ２Ａの治療を受けている対象の細胞を指すことが意図される。標的細胞の例には、中枢神経系内の細胞が含まれるが、これに限定されない。

組成物
本明細書では、ｈＭｆｎ２．ｍｉＲを含む少なくとも１つのベクター（例えば、ｒＡＡＶ．ｈＭｆｎ２．ｍｉＲストック）、及び／又はｍｉＲを含む少なくとも１つのベクター、及び／又はストックを含む少なくとも１つのベクター、並びに任意の担体、賦形剤、及び／又は保存剤を含む組成物が提供される。

本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを５つ共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生されてもよく、又は産生系の複数の実行からプールされてもよい。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない、様々な産生系を選択することができる。

特定の実施形態では、組成物は、単独で、又は他のベクターストック若しくは組成物と組み合わせて、ＣＭＴ２Ａを治療するのに使用するのに好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であるウイルスストックを少なくとも含む。特定の実施形態では、組成物は、ＣＭＴ２Ａを治療するための薬物を調製する際の使用に好適である。特定の実施形態では、組成物は、ＣＭＴ２Ａを治療する際の使用好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であるウイルスストックを含み、該ｒＡＡＶは、（ａ）アデノ随伴ウイルスカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、操作ヒトマイトフュージン２のコード配列、スペーサー配列、操作されたヒトマイトフュージンコード配列中に存在しない部位で内因性ヒトマイトフュージンを特異的に標的とする少なくとも１つのｍｉＲＮＡのコード配列、及びコードされた遺伝子産物の発現を指示する制御性配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。特定の実施形態では、組成物は、（ａ）アデノ随伴ウイルスカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、操作ヒトマイトフュージン２のコード配列、及びコードされた遺伝子産物の発現を指示する制御性配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、ｒＡＡＶを含む別個のベクターストックを含み、並びに／又は別個のベクターストックが、（ａ）アデノ随伴ウイルスカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、操作ヒトマイトフュージン２コード配列には存在しない部位で内因性ヒトマイトフュージン２を特異的に標的とする少なくとも１つのｍｉＲＮＡのコード配列、及びコードされた遺伝子産物の発現を指示する制御性配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ヒトＭｆｎ２コード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、イントロンは、ニワトリベータアクチンスプライスドナー及びウサギβスプライスアクセプターの要素からなる。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを更に含み、これらは、ベクターゲノムの全ての要素に隣接する。

ｒＡＡＶ．ｈＭｆｎ２．ｍｉＲ（ｒＡＡＶ．ｈＭｆｎ２又は別のベクター）は、ヒトＣＭＴ２Ａ患者に投与するために生理学的に適合性のある担体に懸濁され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ベクターは、食塩水、界面活性剤、及び生理学的
に適合性のある塩、又は塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、又はｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは、約７．２８～約７．３２、又は髄腔内送達の場合、約７．２～約７．４であるので、この範囲内のｐＨが望ましいが、静脈内送達の場合、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい場合がある。しかしながら、最も広範囲内の他のｐＨ、及びこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。

特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びそれらの混合物のうちの１つ以上を含む。水溶液は、ポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８を更に含んでもよく、これは、ＢＡＳＦから市販され、以前、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていた。水溶液は、７．２のｐＨ又は７．４のｐＨを有し得る。

別の実施形態では、製剤は、緩衝生理食塩水溶液を含み得、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、及び０．００１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）１８８が含まれる。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液が好ましい。

他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な透過促進剤の例としては、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、又はＥＤＴＡを含んでもよい。

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。

任意に、組成物は、ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）及び担体に加えて、防腐剤又は化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有
害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などに封入化された送達のいずれかのために製剤化され得る。

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。

好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。

ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供して、過度の悪影響なしに、又は医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。任意に、髄腔内投与以外の経路、例えば、所望の臓器（例えば、肝臓（任意に肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の親の投与経路などを使用することができる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。

ベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの範囲の、（体重が７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）約１×１０^９～１×１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度（その範囲内の全ての整数又は分数量を含み、好ましくは、ヒト患者に対して、１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣ）を含む溶液である。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^９、２ｘ１０^９、３ｘ１０^９、４ｘ１０^９、５ｘ１０^９、６ｘ１０^９、７ｘ１０^９、８ｘ１０^９、又は９ｘ１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１０、２ｘ１０^１０、３ｘ１０^１０、４ｘ１０^１０、５ｘ１０^１０、６ｘ１０^１０、７ｘ１０^１０、８ｘ１０^１０、又は９ｘ１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１１、２ｘ１
０^１１、３ｘ１０^１１、４ｘ１０^１１、５ｘ１０^１１、６ｘ１０^１１、７ｘ１０^１１、８ｘ１０^１１、又は９ｘ１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１２、２ｘ１０^１２、３ｘ１０^１２、４ｘ１０^１２、５ｘ１０^１２、６ｘ１０^１２、７ｘ１０^１２、８ｘ１０^１２、又は９ｘ１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、８ｘ１０^１３、又は９ｘ１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、又は９ｘ１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０^１５、２ｘ１０^１５、３ｘ１０^１５、４ｘ１０^１５、５ｘ１０^１５、６ｘ１０^１５、７ｘ１０^１５、８ｘ１０^１５、又は９ｘ１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲で当り得る。

特定の実施形態では、用量は、約１×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量～約１．１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約１．１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３×１０^１３ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。特定の実施形態では、用量は、１．１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。特定の実施形態では、用量は、３．３３×１０^１３ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約２×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約２×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約３×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約４×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約６×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約７×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約８×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約９×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約２×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約４×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～４．３３×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～２×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約３×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約５×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの約１×１０^１３～８×１０^１４ＧＣの範囲にある量のＡＡＶを含有するような投薬単位で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～４．３３×１０^１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含有するような投薬単位で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの約３×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含有するような投薬単位で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの約５×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含有するような投薬単位で製剤化され得る。

特定の実施形態では、ベクターは、単回用量で対象に投与される。特定の実施形態では、複数回の注入（例えば、２用量）によってベクターを送達することが所望される。

任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意に、治療目的で記載されているものと同様の投薬レジメンは、本明細書で提供される組成物を使用した免疫に利用され得る。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入を介した、投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。

本明細書で使用される場合、「槽内送達」又は「槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）の脳脊髄液内への直接的な投与経路、より詳細には、後頭下穿刺を介した、又は大槽内への直接的な注入による、又は永久的に配置されたチューブを介した、投与経路を指す。

内因性ｈＭｆｎ２（例えば、ＣＭＴ２Ａ患者）を抑制するための本明細書に記載のｍｉＲ標的配列を含む組成物は、概して、ニューロン（例えば、これらに限定されないが、下位運動ニューロン及び／又は一次感覚ニューロンを含む、中枢神経系内の１つ以上の異なる細胞型を標的とする。これらは、例えば、錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘細胞、及び介在神経細胞を含み得る）。

使用
本明細書で提供されるベクター及び組成物は、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）障害、神経障害、又はそれに関連する様々な症状を有する患者を治療するのに有用である。ＣＭＴ２Ａを有する患者を治療するための併用レジメン又は併用療法が提供される。特定の実施形態では、このレジメン又は併用療法は、（ａ）ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２コード配列をコードする組換え核酸配列であって、ヒトマイトフュージン２コード配列が、配列番号１５の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有し、（ｂ）のｍｉＲＮＡ標的配列中にミスマッチを有することによって、ＣＭＴ２Ａ患者における内因性ヒトマイトフュージン２とは異なる、組換え核酸配列、及び（ｂ）ヒトＣＭＴ２Ａ対象における内因性ヒトマイトフュージン２配列と特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡのコード配列であって、ｍＲＮＡが、対象中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される、コード配列を共投与することを含む。

特定の実施形態では、このレジメン又は併用療法は、（ａ）ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２コード配列をコードする組換え核酸配列であって、操作ヒトマイトフュージン２コード配列が、配列番号１１の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有し、（ｂ）のｍｉＲＮＡ標的配列中にミスマッチを有することによって、ＣＭＴ２Ａ患者における内因性ヒトマイトフュージン２コード配列とは異なる、組換え核酸配列、及び（ｂ）ヒトＣＭＴ２Ａ対象における内因性ヒトマイトフュージン２配列と特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮ
Ａのコード配列であって、少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列が、対象中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結され、少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号８９（ｍｉＲ５３８、５９ｎｔ）を含む１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の配列、又は配列番号２７の１つ以上のアンチセンス配列を含むｍｉＲＮＡを含む、コード配列を共投与することを含む。

特定の実施形態では、ＣＭＴ２Ａを有する患者を治療するためのこのレジメン又は併用療法は、（ａ）ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２コード配列をコードする組換え核酸配列であって、ヒトマイトフュージン２コード配列が、（ｂ）のｍｉＲＮＡ標的配列中にミスマッチを有することによって、ＣＭＴ２Ａ患者における内因性ヒトマイトフュージン２コード配列とは異なるように操作される、組換え核酸配列、及び（ｂ）ヒトＣＭＴ２Ａ対象における内因性ヒトマイトフュージン２配列と特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡのコード配列であって、ｍｉＲＮＡコード配列が、対象におけるその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結され、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのコード配列が、配列番号１５（ｍｉＲ１６９３、６４ｎｔ）を含むｍｉＲＮＡコード配列、配列番号１５の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、配列番号１５（又は配列番号６８）の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号１５と少なくとも９９％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列、又は、
（ｉ）ＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴ、配列番号２７、（ｉｉ）ＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧ、配列番号２８、（ｉｉｉ）ＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧ、配列番号２９、（ｉｖ）ＴＴＧＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣ、配列番号３０、（ｖ）ＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ、配列番号３１、（ｖｉ）ＡＡＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧ、配列番号３２、（ｖｉｉ）ＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴ、配列番号３３、（ｖｉｉｉ）ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧ、配列番号３４、（ｉｘ）ＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧ、配列番号３５、（ｘ）ＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴ、配列番号３６、（ｘｉ）ＴＧＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＣ、配列番号３７、（ｘｉｉ）ＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴ、配列番号３８、（ｘｉｉｉ）ＴＴＴＣＣＴＣＧＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴ、配列番号３９、（ｘｉｖ）ＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴ、配列番号４０、（ｘｖ）ＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡ、配列番号４１、（ｘｖｉ）ＡＡＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣ、配列番号４２、（ｘｖｉｉ）ＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＧＣＣ、配列番号４３、（ｘｖｉｉｉ）ＴＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡ、配列番号４４、（ｘｉｘ）ＴＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧ、配列番号４５、若しくは（ｘｘ）ＣＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡ、配列番号４６のうちの１つ以上、又は（ｉ）～（ｘｘ）のいずれかの組み合わせのうちの１つ以上の配列を有する、コード配列を共投与することを含む。特定の実施形態では、第１のベクターが、核酸（ａ）を含み、第２の異なるベクターが、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（ｂ）を含む。特定の実施形態では、第１のベクターが、ウイルスベクターであり、並びに／又は第２のベクターが、ウイルスベクターであり、並びに第１及び第２のウイルスベクターが、同じウイルス源由来であり得るか、又は異なり得る。特定の実施形態では、第１のベクターが、非ウイルスベクターであり、第２のベクターが、非ウイルスベクターであり、並びに第１及び第２のベクターが、同じ組成物であり得るか、又は異なり得る。

特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクター及び組成物は、Ｍｆｎ２誘導性脂肪腫症を有する患者を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクター及び組成物は、多発性対称性脂肪腫症を有する患者を治療するのに有用である。多重対称性脂肪腫症は、Ｍｆｎ２遺伝子における希少な遺伝子変異と関連しており、上半身に脂肪組織が大量に沈着して蓄積し、腕及び脚の脂肪組織が徐々に失われることを
特徴とする（Ｒｏｃｈａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ＭＦＮ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｕｐｐｅｒ ｂｏｄｙ ａｄｉｐｏｓｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ，ａｎｄ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：１－２７，Ａｐｒｉｌ １９，２０１７）。特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクター及び組成物は、Ｍｆｎ２欠乏による重度の早期発症神経障害を有する患者を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクター及び組成物は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、心筋症、及び様々ながんにおけるＭｆｎ２関連病因を有する患者を治療するのに有用である。Ｍｆｎ２調節解除とＡＤ及びＰＤとの間に示唆される関連性、例えば、Ｍｆｎ２遺伝子における単一ヌクレオチド多型とＡＤリスクとの間に関連があることが証明されている（Ｆｉｌａｄｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１８，９：３３０）。

任意に、本明細書で提供されるベクター及び組成物は、アセトアミノフェン、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三環系抗うつ薬、又は抗てんかん薬、例えば、カルバマゼピン又はガバペンチンから選択される１つ以上の併用療法と組み合わせて使用され得る。更に他の実施形態では、ベクターは、１つ以上のステロイド、例えば、プレドニゾンを含む免疫調節レジメンと組み合わせて送達され得る。

本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。

「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸、又はその断片を参照する場合、別の核酸（又はその相補的鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失によって最適に整列されるとき、整列される配列の少なくとも約９５～９９％のヌクレオチド配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、又はそのオープンリーディングフレーム、又は少なくとも１５ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

核酸配列の文脈で「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、又は「同一パーセント」という用語は、最大限対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「配列同一性パーセント」は、タンパク質の全長にわたるアミノ酸配列又はその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を超える同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズム及びコンピュータプログラムを用いることによって、当業者によって容易に決定される。

上限範囲で特に明記しない限り、同一性のパーセンテージは、同一性の最小レベルであり、参照配列に対して最大１００％の同一性までの全てのより高いレベルを包含することが理解されるであろう。特に明記しない限り、同一性のパーセンテージは、同一性の最小
レベルであり、参照配列に対して最大１００％の同一性までの全てのより高いレベルを包含することが理解されるであろう。例えば、「９５％の同一性」及び「少なくとも９５％の同一性」は、互換的に使用され得、参照配列に対する９５、９６、９７、９８、９９、最大１００％までの同一性、及びそれらの間の全ての画分を含む。

特に明記しない限り、数値は、従来の数学的ラウンディング規則に従うものと理解されるであろう。

一般的に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、又は「類似性」について言及する場合、「同一性」、「相同性」、又は「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列された」配列又は「整列」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加の塩基又はアミノ酸についての補正を含む。実施例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶ整列を行う。整列は、公共の又は市販のいずれかの様々な多重配列整列プログラムを用いて行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他の源は、当業者に既知である。代替的に、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び検索配列（ｓｅａｒｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列及びパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）とともに使用して決定することができる。「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般的に、これらのプログラムのうちのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更することができる。代替的に、当業者は、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベル又は整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語、及びその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉
を用いて解釈及び記載されるべきことも意図される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に明記しない限り、与えられた参照から１０％（±１０％、例えば、±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８、±９、±１０、又はそれらの間の値）の可変性を意味する。

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「ＣＭＴ２Ａ関連症状」又は「症状」という用語は、ＣＭＴ２Ａ患者及びＣＭＴ２Ａ動物モデルで見られる症状を指す。ＣＭＴの初期症状には、ぎこちなさ、足の拾い上げの問題による歩行のわずかな困難、足の筋肉の弱さ、疲労、反射の欠如のうちの１つ以上が含まれ得る。ＣＭＴ２Ａの一般的な症状には、足の変形（非常に高いアーチ型の足（ｆｏｏｔ）／足（ｆｅｅｔ））、足首で足を持ち上げることが困難（足の降下）、つま先の丸まり（ハンマートゥとして知られている）、ふくらはぎの痩せにつながる下肢の筋肉の喪失、足若しくは手の痺れ又は灼熱感、歩くときの「スラッピング」（歩くときに足が床に激しく当たる）、腰、脚、又は足の衰弱、脚及び手の痙攣、バランスの喪失、つまずき、転倒、物体をつかみ、保持することが困難、ビン及びボトルを開けるのが困難、疼痛（神経痛及び関節痛の両方）が含まれる。ＣＭＴ２Ａの後期症状には、例えば、腕及び手における類似の症状、脊椎の湾曲（脊柱側弯症）が含まれ得る。ＣＭＴ２Ａの他の報告された／既知の症状には、例えば、発話及び嚥下困難、呼吸困難、特に横たわっているときの呼吸困難、難聴、視力低下、声帯麻痺が含まれ得る。

本明細書で使用される「患者」又は「対象」は、臨床研究に使用される男性又は女性のヒト、及び動物モデル（例えば、イヌ、非ヒト霊長類、齧歯類、又は他の好適なモデルを含む）を意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ＣＭＴ２Ａと診断されたヒトである。特定の実施形態では、これらの方法及び組成物のヒト対象は、出生前、新生児、乳児、幼児、未就学児、小学生、十代、若年成人、又は成人である。更なる実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、小児ＣＴＭ２Ａ患者である。

本明細書で使用される場合、「治療レベル」という用語は、健康な対照の少なくとも約５％、約８％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、１００％超、約２倍、約３倍、又は約５倍のＭｆｎ２活性を意味する。ｈＭｆｎ２の活性を測定するための好適なアッセイは、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、１つ以上のサブユニットタンパク質のかかる治療レベルは、ＣＭＴ２Ａ関連症状の緩和、特定のＣＭＴ２Ａ関連症状の逆転、及び／若しくはＣＭＴ２Ａ関連症状の進行の予防、又はそれらの任意の組み合わせをもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書で提供する組成物及びレジメンによって送達されるヒトＭｆｎ２は、機能的内因性野生型タンパク質のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、配列は、配列番号１９のアミノ酸配列、又は機能的ヒトＭｆｎ２タンパク質と約９５～１００％同一である機能的タンパク質である。

「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡ又はＲＮＡ及びタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。発現は、一過性又は安定であり得る。

加えて、任意に、発現カセット（及びベクターゲノム）は、例えば、ｄｒｇ毒性及び／又は軸索障害を低減するために、ＵＴＲ内に１つ以上の後根神経節（ｄｒｇ）－ｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。例えば、２０１９年１２月２０日に出願され、現在ＷＯ２０２０
／１３２４５５として公開されている、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／６７８７２、２０２０年５月１２日に出願された、米国仮特許出願第６３／０２３５９３号、及び２０２０年６月１２日に出願された、米国仮特許出願第６３／０３８４８８号を参照されたく、全てが「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｒｇ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題され、その全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、発現カセットは、遺伝要素（例えば、プラスミド）を介してパッケージング宿主細胞に送達され、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のカプシドへパッケージングされ得る。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列、及びトランスで又は離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。

タンパク質又は核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質又は核酸が、天然では互いに同じ関係で見出されない、２つ以上の配列又は部分配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、ある遺伝子由来のプロモーターを有し、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指示するように配置される。故に、コーディング配列に関しては、プロモーターは、異種性である。

本明細書に記載される場合、調節要素は、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、転写因子、転写終結因子、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（ポリＡ）などの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節因子（ＷＰＲＥ）、翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）を含む。

本発明の文脈における「翻訳」という用語は、リボソームでのプロセスに関し、ｍＲＮＡ鎖は、アミノ酸配列の集合を制御して、タンパク質又はペプチドを生成する。

操作ｈＭｆｎ２コード配列を含む発現カセット、例えば、Ｓｙｎ．ＰＩ．ｈＭｆｎ２ｅｎｇ．ｌｉｎｋ．ｈＭｆｎ２．ｍｉＲ１６９３．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（配列番号１のｎｔ２２３～４４５５）；ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＲＢＧ（配列番号７９のｎｔ２５９～４３７０）；ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＲＢＧ（配列番号７７のｎｔ２５９～４７１０）；ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧ（配列番号７５のｎｔ２５９～４６２６）；ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（配列番号７３のｎｔ１９２～４２６２）；ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（配列番号７１のｎｔ１９２～４４７４）；及びＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（配列番号６９のｎｔ１９２～４４７４）が本明細書に提供される。

操作ｒＭｆｎ２コード配列を含む発現カセット、例えば、Ｓｙｎ．ＰＩ．ｒＭｎｆ２ｅｎｇ．ｌｉｎｋ．ｒＭｆｎ２ ｍｉＲ１５１８ ＷＰＲＥ．ＢＧＨ（配列番号３のｎｔ２２３～４４３０）が本明細書に提供される。

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって、及び本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

シャルコー・マリー・トゥース神経障害２Ａ型（ＣＭＴ２Ａ）は、ミトコンドリア融合及び軸索に沿った輸送に必要なタンパク質であるマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる。ほとんどの場合、ＣＭＴ２Ａは、優性阻害様式で作用する常染色体優性ミスセンス変異によって引き起こされる。稀に、ＣＭＴ２Ａは、劣性機能喪失変異によって引き起こされる。Ｍｆｎ２変異は、後根神経節（ＤＲＧ）の下位運動ニューロン及び一次感覚ニューロンに対して選択的に毒性である。

遺伝子療法は、Ｍｆｎ２の過剰発現によってマイトフュージン２発現を回復し、変異体Ｍｆｎ２の優性阻害活性を克服するために開発された。ＡＡＶ遺伝子療法技術は、Ｍｆｎ２発現カセットをニューロンに移送するために使用される。いくつかの実施形態では、Ｍｆｎ２発現カセットは、リンカーを介して連結されるｍｉＲＮＡを含み、ｍｉＲＮＡは、変異体（欠損）Ｍｆｎ２をノックダウンして、変異体Ｍｆｎ２を排除し、正常なマイトフュージン２タンパク質を供給することを標的とする。治療物の注入は、大槽内（ＩＣＭ）を介して、又は静脈内に送達される。ＡＡＶのＩＣＭ送達は、下位運動ニューロン及び一次感覚ニューロンを効率的に標的とする。操作Ｍｆｎ２遺伝子を含む、Ｍｆｎ２発現カセットは、ヒトでの発現用に高度に最適化され、高度に改善された中枢神経系（ＣＮＳ）形質導入を伴うＡＡＶカプシドと組み合わせて使用された。

実施例１：ＣＭＴ２Ａベクター戦略
ＡＡＶ導入遺伝子カセット戦略１では、プロモーター、イントロン、操作Ｍｆｎ２ ｃＤＮＡ、及びポリＡを含むＭｆｎ発現カセットを作製した。ＡＡＶ導入遺伝子カセット戦略２では、プロモーター、イントロン、操作Ｍｆｎ２ ｃＤＮＡを含むＭｆｎ２発現カセットを作製し、これは、ｍｉＲＮＡ、内因性変異体Ｍｆｎ２及びポリＡを標的とするｍｉＲＮＡに対する発現及び耐性を最適化するように操作した。加えて、ＡＡＶ導入遺伝子戦略２では、構築物を、インビボでのｍｉＲＮＡ及びｃＤＮＡの効率的な発現のために特定し、構築物は、シナプシンプロモーター、ｃＤＮＡ（操作Ｍｆｎ２）、リンカー、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡは、ｃＤＮＡの３’末端に位置する）、ＷＲＰＥエンハンサー、及びポリＡ（データは示さず）を含む。

内因性Ｍｆｎ２遺伝子をノックダウンするために、様々なｍｉＲＮＡ配列、様々なｍｉＲＮＡ配列を調査し、データは示されないが、とりわけ、ｍｉＲ２３８、ｍｉＲ１２０２、ｍｉＲ１５１８、及びｍｉＲ２２８２を調査した。ウエスタンブロット分析のために、ラットＢ１０４細胞を、ＣＭＶプロモーターを含むインビトロＢｌｏｃｋ－ｉＴプラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でトランスフェクトした。ｅｍＧＦＰ導入遺伝子、ｍｉＲＮＡ及びＴＫポリＡのクローニングサイト、ｍｉＲＮＡを、Ｂｌｏｃｋ－ｉＴオンラインソフトウェアを使用して設計した。細胞をトランスフェクトし、ブラスチジンでの発現のために選択した。生存細胞は、ＧＦＰに対して大部分が陽性であり、トランスフェクション全体の効率が決定され得る。Ｂ１０４細胞を７２時間後に収集し、ウエスタンブロット分析のために調製した。ウエスタンブロットは、負荷対照として、Ｍｆｎ２及びｂ－アクチンに対する抗体でプローブした。図１Ａ及び図１Ｂは、ｍｉＲＮＡのＡＡＶ媒介送達の静脈内投与後のＢ６マウスのマウス脳（図１Ａ）及び脊髄（図１Ｂ）における、ｑＰＣＲによって測定した内因性Ｍｆｎ２ ＲＮＡのノックダウンを示す。投与後１４日目にマ
ウスを剖検し、その後、脳及び脊髄組織を採取し、均質化した。ＲＮＡを試料から抽出し、Ｍｆｎ２に対するＴａｑＭａｎプライマーでのｑＰＣＲに使用した。４つの治療群を調査した（群当たりＮ＝５）：ＰＢＳ、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ｍｉＲ＿ＮＴ（３×１０^１１ＧＣの用量での非標的）、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ｍｉＲ＿１５１８（３×１０^１１ＧＣの用量で）、及びＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ｍｉＲ＿１２０２（３×１０^１１ＧＣの用量で）。調査した配列のうち、ｍｉＲ１５１８が、内因性Ｍｆｎ２の最良のノックダウンを示した。

図２Ａ～図２Ｃは、ラットＭｆｎ２（ｒＭｆｎ２）ｃＤＮＡ導入遺伝子及びｍＲ１５１８を含むＡＡＶベクターの送達後のＭｆｎ２ ＲＮＡ倍率発現を示し、ＡＡＶベクターは、３×１０^１１ＧＣの用量でマウスに静脈内投与した。投与後１４日目にマウスを剖検し、その後、脳及び脊髄組織を採取し、均質化した。ＲＮＡを試料から抽出し、Ｍｆｎ２に対するＴａｑＭａｎプライマーでのｑＰＣＲに使用した。２つの治療群を調査した（群当たりＮ＝５）：ＰＢＳ及びＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ｍｉＲ＿１５１８＋ｒＭｆｎ２。

実施例２：ｍｉＲＮＡを含む操作Ｍｆｎ２導入遺伝子の発現カセットを含むＡＡＶベクターのマウス研究
最初の研究では、野生型マウスに、操作ラットＭｆｎ２（ｒＭｆｎ２）ｃＤＮＡ核酸配列（配列番号１２）及びｍｉＲＮＡ１５１８（配列番号１６）を含む３×１０^１１ＧＣのＡＡＶベクターを静脈内注入した。４つの治療群を調査した（群当たりＮ＝５）：ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＡＧ．ｒＭｆｎ２ ｏｐｔ．ｌｉｎｋ．ｒＭｆｎ２ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｒＭｆｎ２ ｏｐｔ．ｌｉｎｋ．ｒＭｆｎ２ｍｉＲ１５１８．ｒＢＧ、及びＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．ｈＳｙｎ．ＰＩ．ｒＭｆｎ２ｏｐｔ．ｌｉｎｋ．ｒＭｆｎ２ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（ベクターゲノムは配列番号３のものである）。マウスを注入から１４日後に安楽死させた。脳及び脊髄を採取し、均質化した。ＲＮＡを試料から抽出し、ラットＭｆｎ２操作ｃＤＮＡに対するＴａｑＭａｎプライマーでのｑＰＣＲに使用した。図４は、ｍｉＲ１５１８を用いた操作ｒＭｆｎ２ ｃＤＮＡ導入遺伝子のＡＡＶベクター送達後の処理マウスの脊髄におけるラットＭｆｎ２（ｒＭｆｎ２）ｃＤＮＡ発現の倍率発現のプロット定量化を示す。

更なる試験では、野生型マウスに、操作ヒトＭｆｎ２（ｈＭｆｎ２）ｃＤＮＡ核酸配列（配列番号１１）及びｍｉＲＮＡ１６９３（配列番号１５）を含む３×１０^１１ＧＣのＡＡＶベクターを静脈内注入した。４つの治療群を調査した（群当たりＮ＝５）：ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＡＧ．ｈＭｆｎ２ｏｐｔ．ｌｉｎｋ．ｈＭｆｎ２ｍｉＲ１６９３．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２ｏｐｔ．ｌｉｎｋ．ｈＭｆｎ２ｍｉＲ１６９３．ｒＢＧ、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．ｅＢ．ｈＳｙｎ．ＰＩ．ｈＭｆｎ２ｏｐｔ．ｌｉｎｋ．ｈＭｆｎ２ｍｉＲ１６９３．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ベクターゲノムは配列番号１のものである）。マウスを注入から１４日後に安楽死させた。脳及び脊髄を採取し、均質化した。ＲＮＡを試料から抽出し、ヒトＭｆｎ２操作ｃＤＮＡに対するＴａｑＭａｎプライマーでのｑＰＣＲに使用した。図５は、ｍｉＲ１６９３を用いた操作ｈＭｆｎ２ ｃＤＮＡ導入遺伝子のＡＡＶベクター送達後の処理マウスの脊髄におけるヒトＭｆｎ２（ｈＭｆｎ２）ｃＤＮＡ発現の倍率発現のプロット定量化を示す。

ヒト及びラットＭｆｎ２の発現を調査する研究の両方において、送達されたＡＡＶベクターの中で、ＣＢ７、ＣＡＧ、及びニューロン特異的ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）などの様々なプロモーターを調査した。ｈＳｙｎプロモーターを含むＡＡＶベクターは、脊髄組織においてＭｆｎ２ ｃＤＮＡの最も高い倍率発現を示した。

更に、ＡＡＶベクターからプロセシングされた成熟ｍｉＲＮＡの総量を、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒ－ＲＮＡｓ ｂｙ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，３３（２０）に開示される確立された手順を使用して調査した。野生型マウスに、３ｘ１０^１１ＧＣのＡＡＶベクター又は対照群のＰＢＳを静脈内注入した。治療群１のＡＡＶゲノムベクターは、リンカー（配列番号１７）を介してｍｉＲＮＡ１６９３（配列番号１５）と連結される操作ヒトＭｆｎ２（ｈＭｆｎ２）ｃＤＮＡ核酸配列（配列番号１１）を更に含む、ｍｉＲ１６９３（配列番号１）を含むｈＭｆｎ２の発現カセットを含む。リンカー（配列番号１７）を介してｍｉＲＮＡ１５１８（配列番号１６）と連結される操作ラットＭｆｎ２（ｒＭｆｎ２）ｃＤＮＡ核酸配列（配列番号１２）を更に含む、ｍｉＲ１５１８（配列番号３）を含むｒＭｆｎ２の発現カセットを含む治療群２のＡＡＶベクター。治療後、マウスを注入から１４日後に安楽死させた。脳及び脊髄を採取し、均質化した。ＲＮＡを試料から抽出し、カスタムｍｉＲＮＡアッセイに使用した。カスタムｍｉＲＮＡアッセイは、ｃＤＮＡを作製するためのカスタムステムループＲＴプライマー、次いでｍｉＲＮＡを増幅するためのカスタムスモールＲＮＡ：ステムループＴａｑＭａｎプライマーからなる。このアッセイは、ベクターから処理される成熟ｍｉＲＮＡの総量を測定する。図６Ａ及び図６Ｂは、マウスにおける静脈内送達後のＡＡＶベクターからプロセシングされた成熟ｍｉＲＮＡの総量を示す。

要約すると、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６）は、最大の脊髄発現のための最良のプロモーターであるようである。「連結」（「リンカー」の場合）を含むＡＡＶベクターは、適切なｍｉＲＮＡ切除及びＲＮＡｉのプロセシングに必要な、ｃＤＮＡとｍｉＲＮＡとの間の重要なスペーサーである。クローニングが容易であるため、より小さなリンカーを試したが、機能的ではなかった。ｑＰＣＲ分析は、内因性変異体Ｍｆｎ２を標的とするｍｉＲＮＡと共送達した場合に、ラットＭｆｎ２及びヒトＭｆｎ２の適切な発現を示唆する。

実施例３．ＨＥＫ２９３及びＭｆｎ２欠損細胞におけるＡＡＶベクターのトランスフェクション効率
この研究では、以下の表３に列挙されるように、ヒトＭｆｎ２操作配列の導入遺伝子を含む様々なＡＡＶベクターを生成して調査した。

Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦは、ベクターにおけるＭｆｎ２ ｃＤＮＡの発現を検出するために使用した、Ｍｆｎ２を欠くマウス細胞株である。加えて、Ｍｆｎ２を発現するヒト細胞株であるＨＥＫ２９３細胞を、上記で特定したベクターを用いたトランスフェクションで使
用した。トランスフェクション後の細胞溶解物を、ウエスタンブロットを介した全体的なＭｆｎタンパク質発現、ｑＰＣＲを介した内因性Ｍｆｎ２ノックダウン、及びｑＰＣＲを介したｍｉＲＮＡの存在について分析した。ウエスタンブロット定量を、ＷＥＳプラットフォームを用いて実施した。Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞におけるＭｆｎ発現の分析は、細胞株がＭｆｎ２発現を欠くため、ベクターによって産生されるＭｆｎ２タンパク質のみを定量化した。ｑＰＣＲ ｍｉＲＮＡ検出アッセイでは、ステムループプライマーを成熟ｍｉＲＮＡの逆転写（ＲＴ）に使用し、ＴａｑＭａｎプローブセットを成熟ｍｉＲＮＡの増幅に使用して、ｍｉＲＮＡの発現及び／又はプロセシングを示した。内因性ヒトＭｆｎ２ノックダウンを測定するためのｑＰＣＲでは、ＨＥＫ２９３内因性Ｍｆｎ２とベクターＭｆｎ２とを識別するＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用した。Ｗｅｓ系Ｍｆｎ２タンパク質の定量化及びＭｆｎ２に対する抗体は、内因性及びベクター産生Ｍｆｎ２と交差反応するため、全体的なＭｆｎ２過剰発現を調査するために使用した。

図７は、ＣＢ７プロモーターを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＭｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株におけるＭｆｎ２の発現レベルを示す。更に、図７は、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ（ｐ６１６５）、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＲＢＧ（ｐ６１６６）、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧ（ｐ６１６７）でトランスフェクションした後のマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）の発現を測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量を示す。定量は、発現パーセントとしてプロットし、トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーによって測定し、目視観察によって近似されるように、約４０％であると決定した。Ｍｆｎ２の発現レベルについて調査したウエスタンブロット（データは示さず）では、ｂ－アクチンを負荷対照として使用した（Ｍｆｎ２：２μｇ負荷；ｂ－アクチン：０．２７μｇ負荷；定量に使用した曝露は４秒）。

図８は、ＣＡＧプロモーターを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＭｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株におけるＭｆｎ２の発現レベルを示す。更に、図８は、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１６８）、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１６９）、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１７０）でトランスフェクションした後のマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）の発現を測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量を示す。定量は、発現パーセントとしてプロットし、トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーによって測定し、目視観察によって近似されるように、約４０％であると決定した。Ｍｆｎ２の発現レベルについて調査したウエスタンブロットでは、ｂ－アクチンを負荷対照として使用した（Ｍｆｎ２：２μｇ負荷；ｂ－アクチン：０．２７μｇ負荷；定量に使用した曝露は４秒）。

図９Ａ及び図９Ｂは、ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３細胞株におけるＭｆｎ２の発現レベルを示す。高いトランスフェクション効率が観察された。図９Ａは、ＣＢ７プロモーターを含む様々なベクター（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ（ｐ６１６５）、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＲＢＧ（ｐ６１６６）、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧ（ｐ６１６７））でトランスフェクションした後の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた、ＨＥＫ２９３細胞における内因性Ｍｆｎ２ノックダウンを示す。図９Ｂは、ＣＡＧプロモーターを含む様々なベクター（ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１６８）、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１６９）、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１７０））でトランスフェクションした後の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた、ＨＥＫ２９３細胞における内因性
Ｍｆｎ２ノックダウンを示す。

図１０は、ＣＢ７プロモーターを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３細胞株におけるＭｆｎ２（内因性Ｍｆｎ２及びベクターから発現されたＭｆｎ２）の発現レベルを示す。更に、図１０は、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＲＢＧ（ｐ６１６５）、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＲＢＧ（ｐ６１６６）、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧ（ｐ６１６７）でトランスフェクションした後のマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）の発現を測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量を示す。定量は、パーセント発現としてプロットされ、トランスフェクション効率は、約９５％であると決定された。Ｍｆｎ２の発現レベルについて調査したウエスタンブロットでは、ｂ－アクチンを負荷対照として使用した（Ｍｆｎ２：０．７８μｇ負荷；ｂ－アクチン：０．７８μｇ負荷；定量に使用した曝露は４秒）。

図１１は、ＣＡＧプロモーターを含む様々なベクターでトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３細胞株におけるＭｆｎ２（内因性Ｍｆｎ２及びベクターから発現されたＭｆｎ２）の発現レベルを示す。更に、図１１は、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１６８）、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ１５１８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１６９）、ＣＡＧ．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０（ｐ６１７０）でトランスフェクションした後のマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）の発現を測定するウエスタンブロットシグナルのプロット定量を示す。定量は、パーセント発現としてプロットされ、トランスフェクション効率は、約９５％であると決定された。Ｍｆｎ２の発現レベルについて調査したウエスタンブロットでは、ｂ－アクチンを負荷対照として使用した（Ｍｆｎ２：０．７８μｇ負荷；ｂ－アクチン：０．７８μｇ負荷；定量に使用した曝露は４秒）。

図１２Ａ～図１２Ｃは、ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含む様々なベクターでトランスフェクションした後の、Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株における成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ１５１８又はＭｉＲ５３８）をｑＰＣＲによって測定された発現レベルを示す。図１２Ａは、ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含むベクターでトランスフェクションした後の、Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株における成熟ｍｉＲ１５１８の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた発現レベルの比較を示す。図１２Ｂは、ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含むベクターでトランスフェクションした後の、Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株における成熟ｍｉＲ５３８の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた発現レベルの比較を示す。図１２Ｃは、ＣＢ７又はＣＡＧプロモーターのいずれかを含むベクターでトランスフェクションした後の、Ｍｆｎ２欠損ＭＥＦ細胞株における成熟ｍｉＲ１５１８及びｍｉＲ５３８の、ｑＰＣＲによって測定され、倍率発現としてプロットされた発現レベルの比較を示す。

実施例４．ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ｔｈｙ１－ＭＦＮ２＊）、シャルコー・マリー・トゥース病２Ａ型のモデルにおける有効性についての遺伝子治療ベクター
７匹のヘミ接合性雄ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｇ（Ｔｈｙ１－ＭＦＮ２＊）４４Ｂａｌｏ／Ｊ、ＪＡＸストック＃０２９７４５）、２匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪＡＸストック＃０００６６４）、及び１８匹（１８）の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪＡＸストック＃０００６６４）を、メイン州バーハーバーのインビボ研究実験室に移した。マウスは識別のために耳に切り込みを入れ、遺伝子型を確認し、ケージ当たり３匹のマウス（２匹の雌及び１匹の雄）の密度で、ＨＥＰＡフィルター処理された空気で個別に及び積極的に換気されたポリスルホネートケージに収容した。動物室は人工蛍光灯で全体を照らし、１２時間の明暗サイクル（午前６時～午後６時までの照明）を制御
した。動物室における正常温度及び相対湿度の範囲は、それぞれ２２±４℃及び５０±１５％であった。動物室は、１時間に１５回の空気交換があるように設定した。２．５～３．０のｐＨに酸性化した、濾過した水道水、及び通常の齧歯類固形飼料は、自由摂食で提供された。マウスを繁殖動物として使用して、１０匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及び６０匹の雄ヘミ接合性ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウスの研究コホートを２ラウンドの繁殖で育てた。Ｐ０～Ｐ１で、合計７０（７０）匹のマウスを研究に登録した。

図１３Ａ～図１３Ｆは、マウスモデルの特徴付けを示す。図１３Ａは、マウス遺伝子型の模式図を示す。図１３Ｂは、ウエスタンブロッティングによって測定された、脳における内因性及びＦＬＡＧタグ付きＭＦＮ２の相対発現レベルによって特徴付けられる、マウスの表現型特徴付けを示す。図１３Ｃは、ウエスタンブロッティングによって測定された、脊髄における内因性ＭＦＮ２及びＦＬＡＧタグ付きＭＦＮ２の相対発現レベルによって特徴付けられる、マウスの表現型特徴付けを示す。図１３Ｄは、ＣＭＴ２Ａマウスモデル（ｎＴｇ、ＭＦＮ２^ＷＴ、及びＭＦＮ２^Ｒ４９Ｑ）におけるマウスの測定された体重を（ｇ）で示す。図１３Ｅは、落下までの時間（秒）によって測定されたマウス表現型の特徴付けを示す。図１３Ｆは、握力（ｇ）によって測定されたマウス表現型の特徴付けを示す。

この研究では、マウスは、上記の表４に従って、新生仔ＩＣＶ注入によってＰ０～Ｐ１で投与した。マウスの体重を毎週測定した。１５～１７週齢で、以下の試験を各マウスで実施した：ロータロッド試験、握力試験、視力試験（視動性応答）、任意の手順。加えて、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）試験を実施した。１７～１９週齢で、マウスを剖検し、以下の組織を収集した：脊髄、脛骨神経。収集した組織をＥＭ固定剤に固定し、エポキシ樹脂に包埋した。１つの切片を各組織から切断した。切片をトルイジンブルーで染色した。染色したスライドをスキャンした。スキャンした各切片について、以下のパラメータを決定した：軸索サイズ分布、軸索数、軸索領域。次いで、軸索面積分布を、各群についてプロットした。

薬理学的試験において、第１のコホートについて、１群当たり４～７匹のマウスを使用した。研究は盲検試験であった。簡潔に述べると、雄ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｗマウスを、候補ＡＡＶｈｕ６８ベクターが投与された治療群で使用した。新生仔ＩＣＶ注入を投与経路として使用し、３μＬの７．５ｘ１０^１０ＧＣ ＡＡＶベクターを両側投与した。体重は毎週測定した。握力は６週間で測定した。図１４Ａ及び図１４Ｂは、ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス
におけるパイロット薬理学試験の結果を示す（試験群：Ｇ１－野生型（ＷＴ）マウス、ＰＢＳ；Ｇ２－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＰＢＳ；Ｇ３－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＢ７．ＭＦＮ２；Ｇ４－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＢ７．ＭＦＮ２．ｍｉＲ１５１８；Ｇ５－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＢ７．ＭＦＮ２．ｍｉＲ５３８；Ｇ６－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＡＧ．ＭＦＮ２．ｍｉＲ１５１８；Ｇ７－ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウス、ＣＡＧ．ＭＦＮ２．ｍｉＲ５３８）。図１４Ａは、マウス群Ｇ１～Ｇ７において測定された体重の結果（（ｇ）としてプロットされる）を示す。図１４Ｂは、マウス群Ｇ１～Ｇ７において測定された生存の結果（０～５０日にわたる生存確率としてプロットされる）を示す。図１５は、ＭＦＮ２^Ｒ９４Ｑマウスにおけるパイロット薬理学試験の握力の結果（（ｋｇ）としてプロットされる）を示す。

実施例５．ｈＭｆｎ２及び内因性ｈＭｆｎ２を標的とするｍｉＲを共投与するＡＡＶベクター
本試験では、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧ（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧとも称される）ベクターは、単一の注入からの広範な分布を達成するために脳脊髄液（ＣＳＦ）を利用して、大槽内（ＩＣＭ）注入を介して、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）又はカニクイザル（非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に投与した。

試験物質。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧを本試験で使用する。試験物質の品質及び純度を検証する分析証明書が最終試験報告に含まれるであろう。

調製。試験物質希釈物の計算は、希釈を行う前に、訓練されたＧＴＰ担当者によって実施し、検証した。試験物質希釈物は、注入の日に指定された担当者によって実施した。試験物質希釈物は、追加の指定された担当者によって検証した。希釈した試験物質は、注入まで最大８時間、湿った氷上又は２～８℃で保たれる。

保存記録試料。試験及び対照物質の保存記録試料は、指定された担当者によって保持され、≦－６０℃で保管した。

試験物質分析。指定された担当者は、試験物質がリリース要件を満たしていることを保証する責任がある。分析証明書は、試験記録に含めるためにＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって提供される。全ての結果が記録される。データのコピーは、研究ノートに含めるために提供される。

未使用試験物質。ＮＰＲＰ担当者に提供された未使用試験物質は、保管するために返却される前に、湿った氷上に保管した。保存記録試料は、≦－６０℃で保管した。

試験系。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）又はカニクイザルクを本試験で使用する。

試験系選択についての根拠。この研究は、ＣＮＳ疾患のためのｍｉＲＮＡ試験物質（ベクター）の大槽内（ＩＣＭ）送達を含む。ＮＨＰにおけるＣＮＳのディメンションは、臨床対象集団の代表的なモデルとして機能を果たす。本試験は、アカゲザルにおけるＩＣＭ注入後の用量及び投与経路に関連する薬物動態並びに試験物質の安全性に関する重要なデータを提供する。本研究では、２匹の動物を使用した。ＮＨＰは、雄又は雌、４～５歳、及び約３～１０ｋｇから選択した。

順応期間及び管理。検疫及び環境順応、動物飼育及び管理は、標準操作（ＳＯＰ）手順
書に従って実施した。マカクはＣＴＲＢのステンレス鋼ケージに収容した。育及び管理は、ＤＶＲ担当者によって提供された。

認定霊長類食餌５０４８又は非ヒト霊長類に適切な類似の食事を、研究動物に供給した。水は自動給水システムから入手でき、全てのマカクが自由に利用できる。介入を必要とする任意の状態について、獣医スタッフによってマカクをモニタリングした。試験責任者は、可能な限り相談を受けて適切な行動を決定する。しかしながら、安楽死の可能性を含む緊急事態では、必要に応じて獣医スタッフが決定を下し、試験責任者にできるだけ早く通知した。食料報酬、同種の相互作用、及びマニピュランダの形態での充実度が提供された。動物は、ビルオートメーションによって制御される１２時間の明／暗サイクルで維持した。所望の温度範囲は、６４～８４°Ｆ（１８～２９°Ｃ）である。温度は可能な限りこの範囲に維持された。所望の湿度範囲は、３０～７０％である。湿度は可能な限りこの範囲に維持された。各マカクは、供給元によって胸に刺青された固有の識別番号で事前に識別されていた。両方の動物は、単一の治療群に含まれる。

試験設計手順。２匹のアカゲザルを本研究に使用した。両方のマカクは、単一の治療群に含まれる。ＣＳＦ、ＣＢＣ、血清化学、及びベースラインバイオマーカー評価を含むベースライン血液試料を、投薬前の０日目に、全てのマカクから収集した。また、バイタルも各マカクから取得した。０日目に、マカクを鎮静化し、試験物質の投与前に、体重測定及びバイタルサインを記録した。

試験物質投与（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧ）では、マカクを麻酔して、適切な鎮痛剤をＳＯＰに従って投与した。マカクを麻酔して、大槽への後頭下穿刺を介して試験物質を投与した。大槽内（ＩＣＭ）穿刺手順では、麻酔したマカクを、動物維持室から処置室に移し、ＣＳＦ収集及び大槽への投薬のために頭を前方に曲げた状態で、側臥位でＸ線台上に配置した。注入部位は無菌的に調製した。無菌技法を用いて、２１～２７ゲージ、１～１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎ニードル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、ＣＳＦ流れが観察されるまで、後頭下空間へと前進させた。１ｍＬのＣＳＦを、投与前に、ベースライン分析のために収集した。横切られる解剖構造は、皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬膜、及び環椎後頭筋膜を含む。ニードルを、血液の汚染及び潜在的な脳幹損傷を回避するために、より広範囲の大槽の上部空隙へ指向した。ニードル穿刺の正確な配置を、透視装置（ＯＥＣ９８００ Ｃ－Ａｒｍ、ＧＥ）を用いる脊髄造影法により確認した。ＣＳＦ収集の後、小口径Ｔ延長カテーテルを脊椎ニードルと接続して、イオヘキソール（商標名：Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０ｍｇ／ｍＬ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）造影剤及び試験物質の投薬を容易にする。最大２ｍＬのイオヘキソールを、カテーテル及び脊椎ニードルを介して投与した。ＣＳＦリターンによるニードルの配置及び蛍光透視法によるニードルの可視化を確認した後、試験物質を含むシリンジを、試験物質を含む可撓性リンカーと接続し、約２ｍＬ／分の速度で注入した。投与後、ニードルは除去され、直接的圧力が穿刺部位に適用される。マカクは、３ｘ１０^１３ＧＣ（３．３３ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ脳）の用量で試験物質（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＭｆｎ２．ＧＡ．ＬＩＮＫ．ｍｉＲ５３８．ＲＢＧ）のＩＣＭ投与を受ける。マカク当たりの総注入量は１．０ｍＬである。用量及び体積を、研究記録に文書化した。

観察のために、試験スケジュール（表５）に列挙される選択された時点で、マカクは、バイタルサイン、臨床病理、血清及びＣＳＦの収集を含むがこれらに限定されない、日常的な観察を超える追加のパラメータについてモニタリングした。

採血のために、ＡＡＶに対する中和抗体、血液学、臨床化学を含む一般的な安全パネルのために、動物の末梢静脈から採血した。採血の手順は、ＳＯＰに従って実施した。追加
の血液試料を収集して、バイオマーカー（薬理学的マーカー）の変化を測定する。全血球数、血清化学、バイオマーカー、ＡＡＶに対する中和抗体のための採血の頻度は、試験プロトコルの試験スケジュール（表５）に定義されているとおりである。

抗体アッセイ（ＡＡＶに対する中和抗体、血清）では、血液試料（最大２ｍＬ）を赤色上部チューブ（血清セパレータの有無にかかわらず）を介して収集し、凝固させ、遠心分離した。試験担当者は血清を分離する。血清を、抗体の各時点について、２つの個別にマークしたマイクロ遠心チューブ（試験番号、動物ＩＤ、群番号、時点、中和抗体、及び日付でラベル付けした）に分割し、≦－６０℃で保存した。

細胞数及び分画については、分画及び血小板数を伴う全血球数の血液試料を、ラベル付けされたラベンダー色上部チューブ（試験番号、動物ＩＤ、群番号、時点、ＣＢＣ、及び収集日）に最大２ｍＬまで収集し、４℃で保存した。血液を、血小板数及び分画を含む血球数を測定するために、一晩かけてＡｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（ラベンダー色上部チューブ用のアイスパック付き）に送付した。赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板数、白血球数、白血球分画、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、赤血球形態について、以下のパラメータを分析した。

臨床化学については、（最大２ｍＬまで）の血液試料をラベル付けされた赤色上部チューブに収集し、凝固させ、遠心分離した。血清を分離し、ラベル付けされたマイクロ遠心チューブ（試験番号、動物ＩＤ、群番号、時点、化学、及び収集日）に入れ、分析のために氷パック上で一晩かけてＡｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．に送付した。以下のパラメータを分析した：アルカリホスファターゼ、ビリルビン（合計）、クレアチニン、ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ、グルコース、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、アルブミン／グロブリン比（計算値）、アルドラーゼ、血中尿素窒素、カルシウム、塩化物、クレアチニンキナーゼ及びアイソフォーム、グロブリン（総タンパク質からアルブミンを引いたもの＝グロブリンとして計算）、乳酸脱水素酵素、リン、無機、カリウム、ナトリウム、総タンパク質。

バイオマーカー分析では、血液試料（最大２ｍＬ）を赤色上部チューブ（血清セパレータの有無にかかわらず）を介して収集し、凝固させ、遠心分離した。試験担当者は血清を分離する。次いで、血清を、２つの個別にマークされたマイクロ遠心チューブ（研究番号、動物ＩＤ、群番号、時点、血清バイオマーカー、及び収集日）に分割した。試料は、≦－６０℃で保管した。

ＰＢＭＣ／組織リンパ球単離及びＥＬＩＳＰＯＴでは、血液試料（６～１０ｍＬ）をヘパリンナトリウム（緑色上部チューブ）に収集し、ＳＯＰに従ってＰＢＭＣを単離した。採血チューブには、試験番号、動物ＩＤ、群番号、種、時点、ＰＢＭＣ、及び採血日がラベル付けした。リンパ球を、ＳＯＰに従って、脾臓、肝臓、及び骨髄から収集した。カプシド及び導入遺伝子Ｔ細胞応答のＥＬＩＳＰＯＴを、ＳＯＰに従って実施した。

ＣＳＦ収集では、最大１ｍＬのＣＳＦを分析及びバイオマーカー評価のために収集した。試験０日目を含む全てのＣＳＦ収集時点で、マカクをＳＯＰに従って麻酔し、動物維持室から処置室に移し、ＣＳＦ収集のために頭を前方に曲げた状態で、側臥位で配置した。後頭部及び頸部にわたる毛を刈った。頭蓋骨及び環椎翼（Ｃ１）の後ろにある後頭隆起を触診した。注入部位は無菌的に調製した。無菌技法を用いて、２１～２７ゲージ、１～１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎ニードル（ＢＤ）又は２１～２７ゲージニードルを、ＣＳＦ流れが観察されるまで、大槽へと前進させた。横切られる解剖構造は、皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬膜、及び環椎後頭筋膜を含む。ニードルを、血液の汚染及び潜在的な脳
幹損傷を回避するために、より広範囲の大槽の上部空隙へ指向した。ＣＳＦ収集後、ニードルは除去され、直接的圧力が穿刺部位に適用される。試料を、試験番号、動物ＩＤ、群番号、時点、ＣＳＦ、及び収集日がラベル付けされた滅菌済み１．５ｍＬエッペンドルフチューブに収集した。試料を湿った氷上に置き、すぐにＣＳＦ臨床病理学（血球数及び分画及び総タンパク質の定量化）及びＣＳＦバイオマーカーのために分割した。ＣＳＦを、試験プロトコルの試験スケジュール（表５）に概説された頻度で収集した。

ＣＳＦ臨床病理学では、ＣＳＦ（０．５ｍＬ）を、血液細胞数及び分画、及び全タンパク質定量のために、ラベンダー色上部チューブ（試験番号、動物ＩＤ、群番号、時点、ＣＳＦ臨床病理学、及び日付でラベル付けした、氷パックを有する）に分割した。

ＣＳＦバイオマーカーでは、２本の滅菌１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに収集した残りのＣＳＦの全て（ＣＳＦ臨床病理学のために未使用－最大１ｍＬ）を、８００ｇで５分間遠心分離した。研究担当者は、上清及びアリコートをクライオバイアル（試験番号、動物ＩＤ、群番号、時点、ＣＳＦバイオマーカー、及び収集日でラベル付けした）に単離する。試料は湿った氷上で出荷した。

加えて、モニタリングのために選択した全ての日に、任意の血液試料を採取する前に、各マカクを鎮静化させ、体重を測定し、呼吸数及び心拍数をモニタリングし、直腸体温計を介して体温を測定した。ＰＢＭＣ単離のための血液試料は、室温で輸送した。他の試料は、湿った氷上で輸送した。

以下の表５に記載のスケジュールに従って試験を実施した。

マカクの剖検時に、以下の表６に記載の組織を収集した。

Ａ．脳全体を収集し、次いで、正中矢状面に沿って半分に分割した。脳の右半分全体を、組織病理学のために１０％の中性緩衝ホルマリンに入れ、「Ｐａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ
Ｓａｍｐｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４０：６２４－６３６」に従って更にトリミング及び処理した。生体分布のための試料を左半球から収集し、≦－６０℃で保存した。

Ｂ．最低３つの頸部、３つの胸部、及び３つの腰部の後根神経節を採取し、組織病理学（頸部、胸部、腰部）のために３つの組織カセットに固定した。加えて、３つの対側頸部後根神経節、３つの対側胸部後根神経節、及び３つの対側３つの腰部後根神経節を採取し、生体内分布のために≦－６０°Ｃで凍結した。

Ｃ．心臓の切片には、右心室及び左心室（ＡＶ弁を含む）並びに心室中隔（弁を含む）が含まれる必要がある。

Ｄ．各脊髄を、それぞれＣ、Ｔ、又はＬとラベル付けした頸部、胸部、及び腰部セグメントに分割した。各脊髄セグメントを、３つの切片に分割した。３つのＣ、Ｔ、又はＬ切片には、各々１～３の番号が付けられるであろう。各動物から、Ｃ１－３、Ｔ１－３、及びＬ１－３の番号が付けられた、合計９つの脊髄切片を生成した。各脊髄セグメントから、切片１（Ｃ１、Ｔ１、Ｌ１）を病理組織学的分析に使用した。各脊髄セグメントから、切片２（Ｃ２、Ｔ２、Ｌ２）を生体内分布分析（ＲＮＡ及びタンパク質分析、２つのチューブ）に使用した。各脊髄セグメントから、セクション３（Ｃ３、Ｔ３、Ｌ３）をホルマリン固定し、ＬＣＭのためにパラフィン包埋した。

Ｅ．三叉神経の一部を、労働衛生上健康曝露の可能性のために収集し、≦－６０°Ｃで保存した。

Ｆ．組織病理学が適切でない剖検時に行われた全体的な観察物（例えば、流体、もつれた毛、欠落した解剖学的部位）を収集した。

実験的評価：観察
生存確認（ケージ内）では、マカクを一般的な外観又は毒性の徴候について、毎日視覚的に観察することによってモニタリングし、これには、限定されないが、神経学的徴候又は無気力、苦痛、及び行動の変化が含まれる。これはＳＯＰに従って担当者によって実施した。異常な状態がある場合は、獣医師及び試験責任者に通知する。処置は、臨床獣医師及び試験責任者が承認した後にのみ実施し、但し、マカクを危険にさらす緊急事態の場合、又はマカクを人道的に安楽死させるときは例外である。

瀕死状態のために死亡又は安楽死させたマカクは、最終的に安楽死させたマカクと同じ方法で評価した。一連の組織を収集し、あらゆる全体的な病変を記録した。

加えて、麻酔するたびに、全てのマカクを目視検査した。剖検時に、マカクに肉眼的異常がないかを調査した。全ての変化を記録した。マカクは、研究の開始時、剖検時、及び鎮静化した全ての時点で体重を測定した。

食物消費はモニターしていない。水は自由に投与し、栄養強化食品を含む標準食をマカクに与えた。

モニタリングのために選択した日に、感覚神経伝導試験を実施した。

神経学的検査については、モニタリングのために選択した日に、非ヒト霊長類神経学的評価を実施した。神経学的評価は、精神状態、姿勢及び歩行、固有感覚、脳神経、及び脊髄反射の５つのセクションに分割した。

死後分析では、瀕死状態で安楽死させた、又は死亡が確認されたマカクを含む、全てマカクに対して全体的な死後検査を実施した。全ての異常な観察結果を記録した。

この研究は、動物の継続的な評価を必要とするため、剖検の時期は、後の時点で決定された。予期せず死亡した動物は、できるだけ早く剖検した。全ての予定外の死亡について、臨床病理学、広範な全体的病理学、及び組織病理学を、試験病理学者の裁量の下で収集した組織の完全なリストに対して実施した。考えられる死因を決定するために、必要に応じて他の分析（免疫応答など）が含まれる。組織は、表６に概説されるように、全ての動物で収集した。組織病理学が適切でない剖検時に行われた全体的な観察物（例えば、流体、もつれた毛、欠落した解剖学的部位）は収集していない。

研究期間の終わりまで生き残ったマカクを安楽死させた。マカクを最初に鎮静化させ、その後安楽死させた。死亡は、心拍及び呼吸がないことによって確認した。マカクは、確実な死亡を支持するために失血され得る。

表６に記載される全ての組織を保存した。組織を、パラフィン包埋のために１０％中性緩衝ホルマリンに入れることによって固定した。組織病理学的検査に使用される眼は、パラフィン包埋の前に修正されたデビッドソン溶液で固定した。

生体内分布分析のために、表６の各組織の切片を可能な限り速やかに－８０℃に凍結した。試験責任者の裁量で、ＤＮＡを組織から抽出し、ベクター生体内分布を定量的ＰＣＲによって評価した。

組織病理学的分析のために、表６のサブセット又は全ての組織を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。追加の手順及び／又はその他の染色は、組織学的特徴を特定／明確にするために、試験病理学者の裁量で採用することができ、最終報告に文書化した。実験の詳細、試験手順、及び観察を文書化した全てデータを、試験バインダに記録し、維持した。試験が完了したら、全ての報告及び生データをアーカイブに保存した。保存された検体及び組織を、アーカイブし、保管した。試験責任者が、これらの資料の最終処分の必要性を決定する。実験の詳細及び試験手順及び観察結果を文書化した全てのデータを、ＧＴＰ担当者によって専用のノート及び試験バインダに記録し、維持した。

剖検時に収集した組織で実施されるアッセイ
試験の結論後、マカクを、完全な病理学のために採取した組織を用いて剖検した（剖検時に採取した組織のリストについては表６を参照されたい）。

組織病理学では、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、試験責任者の裁量で、組織病理学のために収集する、リストされる組織の全て又はサブセットに対して実施した。組織病理学的所見に基づき、更なる適切な染色が用いられ得る。Ｍｆｎ２ ｃＤＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現では、ホルマリン及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）中に保存された組織切片を処理し、運動ニューロンをレーザー捕捉顕微解剖した。脊髄から単離された運動ニューロンをＲＮＡ抽出し、ｑＰＣＲを、特異的プライマーセットを使用して、Ｍｆｎ２ノックダウンのレベル、Ｍｆｎ２ ｃＤＮＡ発現のレベル、及びｍｉＲＮＡ発現のレベルを決定するために実施した。Ｍｆｎ２のノックダウン及びＭｆｎ２ ｃＤＮＡの発現は、ｑＰＣＲ及びウエスタンブロットによって組織試料溶解物中で評価され得る。Ｍｆｎ２の免疫組織化学は、脳及び脊髄組織で実施され得る。簡潔には、パラフィン切片をＭｆｎ２タンパク質に指向する抗体とインキュベートした。生体内分布のために、表６の各組織の切片の一部を、可能な限り速やかに－６０℃以下に凍結した。ＤＮＡは組織から抽出し、ベクター生体内分布を定量的ＰＣＲによって評価され得る。組織リンパ球単離及びＥＬＩＳＰＯＴでは、リンパ球は、脾臓及び骨髄から採取され得、カプシド及び導入遺伝子Ｔ細胞応答はＥＬＩＳＰＯＴを実施した。

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。

本明細書に列挙される全ての特許、特許刊行物、及び他の刊行物、並びに配列表ファイル「２０－９１４１ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」は、参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／０５１，３３６号、及び２０２１年４月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１７３，０４５号は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、特に好ましい実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (49)

1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、
   （ａ）ヒトマイトフュージン２（ｈＭｆｎ２）をコードする操作核酸配列と、
   （ｂ）（ａ）と（ｃ）との間に位置するスペーサー配列と、
   （ｃ）ＣＭＴ２患者における内因性ヒトマイトフュージン２核酸配列の標的部位と特異的である、少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列であって、
   （ａ）の前記操作核酸配列が、（ｃ）の前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの前記標的部位を欠き、それによって前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、操作ｈＭｆｎ２コード配列を標的とすることから妨げる、少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列と、
   （ｄ）（ａ）及び（ｃ）と作動可能に連結され、細胞中でのその発現を指示する制御性配列と、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
2. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｈｕ６８、又はＡＡＶ１カプシドから選択される、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、配列番号１１の核酸配列又はそれと少なくとも９０％同一の配列を有する、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、配列番号１１の核酸配列又はそれと少なくとも約８０％同一の配列を有し、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列のｎｔ２１６～２３６及び／又はｎｔ１３７１～１３９１が保存される、請求項１～３に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、配列番号８９（ｍｉＲ５３８、５９ｎｔ）若しくは配列番号８９と少なくとも９９％同一の配列を含む１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の配列、又はＡＧＡＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡ、配列番号２７の１つ以上のアンチセンス配列を含むｍｉＲＮＡを含み、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、（ａ）の前記操作ｈＭｆｎ２コード配列又はそのコードされたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と結合しない、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号１５（ｍｉＲ１６９３、６４ｎｔ）を含む１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の配列、ＡＡＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧ、配列番号３２の１つ以上のアンチセンス配列を含むｍｉＲＮＡ、又は配列番号１６（ｍｉＲ１５１８、５９ｎｔ）若しくは配列番号１６と少なくとも９９％同一の配列を含むｍｉＲＮＡ標的配列を含み、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、（ａ）の前記操作ｈＭｆｎ２コード配列又はそのコードされたｍＲＮＡと結合しない、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
7. 前記スペーサーが、７５ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチドの長さである、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列が、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列に対して３’である、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
9. 前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列が、イントロン配列内に位置する、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
10. 前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列が、１つを超えるｍｉＲＮＡコード配列を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
11. 前記ベクターゲノムが、構成的プロモーター、任意にＣＢ７プロモーター又はＣＡＧプロモーターを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
12. 前記ベクターゲノムが、ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターである組織特異的プロモーターを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
13. ベクターであって、
    （ａ）ヒト標的細胞中で操作核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結されるヒトマイトフュージン２（ｈＭｆｎ２）をコードする操作核酸配列、及び／又は
    （ｂ）操作ｈＭｆｎ２コード配列中に存在しない、内因性ヒトマイトフュージン２コード配列のｍＲＮＡ上の部位を特異的に標的とすることによって、内因性ヒトマイトフュージン２の発現を阻害する、少なくとも１つのヘアピン形成ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列であって、前記少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡコード配列が、前記ヒト標的細胞中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結され、それによって前記少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡが、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列から発現を低減することから妨げる、核酸配列と、を含み、
    （ａ）の前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、（ｂ）によってコードされる前記少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡの標的部位を欠く、ベクター。
14. 前記ベクターが、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列を含む複製欠損ウイルスベクターであり、前記少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡコード配列が、１つ以上のｍｉＲＮＡコード配列又は１つ以上の人工ｍｉＲＮＡ（ＡｍｉＲＮＡ）コード配列、及び前記制御性配列である、請求項１３に記載のベクター。
15. 前記ウイルスベクターが、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列、少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡコード配列、及び前記制御性配列を含む、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムを有するＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である、請求項１４に記載のベクター。
16. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｒｈ９１カプシド、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．ＰＨＢ．ｅＢ、ＡＡＶｈｕ６８、又はＡＡＶ１から選択される、請求項１５に記載のベクター。
17. 前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、配列番号１１の核酸配列又は配列番号１１と少なくとも９０％同一の配列を有する、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のベクター。
18. 前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、配列番号１１の核酸配列又は配列番号１１と少なくとも８０％同一の配列を有し、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列のｎｔ２１６～２３６及び／又はｎｔ１３７１～１３９１が保存される、請求項１３～１７に記載のベクター。
19. 前記少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ５３８であり、コード配列が、配列番号８９の配列の核酸配列又は配列番号８９と少なくとも９９％同一の配列を含み、前記少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡが、（ａ）の前記操作ｈＭｆｎ２コード配列又はそのコードされたｍＲＮＡと結合しない、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のベクター。
20. 前記少なくとも１つのヘアピンｍｉＲＮＡコード配列が、
    （ａ）配列番号１５（ｍｉＲ１６９３、６４ｎｔ）、
    （ｂ）配列番号１５の少なくとも６０個の連続したヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号１５（又は配列番号６８）の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と
    １００％の同一性を有する配列を含む、配列番号１５と少なくとも９９％の同一性、
    （ｄ）（ｉ）ＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴ、配列番号２７、
    （ｉｉ）ＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧ、配列番号２８、
    （ｉｉｉ）ＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧ、配列番号２９、
    （ｉｖ）ＴＴＧＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣ、配列番号３０、
    （ｖ）ＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ、配列番号３１、
    （ｖｉ）ＡＡＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧ、配列番号３２、
    （ｖｉｉ）ＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴ、配列番号３３、
    （ｖｉｉｉ）ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧ、配列番号３４、
    （ｉｘ）ＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧ、配列番号３５、
    （ｘ）ＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴ、配列番号３６、
    （ｘｉ）ＴＧＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＣ、配列番号３７、
    （ｘｉｉ）ＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴ、配列番号３８、
    （ｘｉｉｉ）ＴＴＴＣＣＴＣＧＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴ、配列番号３９、
    （ｘｉｖ）ＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴ、配列番号４０、
    （ｘｖ）ＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡ、配列番号４１、
    （ｘｖｉ）ＡＡＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣ、配列番号４２、
    （ｘｖｉｉ）ＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＧＣＣ、配列番号４３、
    （ｘｖｉｉｉ）ＴＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡ、配列番号４４、
    （ｘｉｘ）ＴＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧ、配列番号４５、若しくは
    （ｘｘ）ＣＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡ、配列番号４６のうちの１つ以上のシード配列、又は（ｉ）～（ｘｘ）のいずれかの組み合わせを含むヘアピンｍｉＲＮＡコード配列のうちの１つ以上の配列を含み、
    前記ヘアピンｍｉＲＮＡが、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列又はそのコード化されたｍＲＮＡと結合しない、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のベクター。
21. 前記操作ｈＭｆｎ２コード配列及び前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列を単一の核酸分子とともに含み、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列と前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード配列との間に少なくとも７５ヌクレオチドのスペーサーを更に含む、請求項１３～２０のいずれか一項に記載のベクター。
22. 前記ｍｉＲＮＡコード配列が、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列に対して３’である、請求項１３～２１のいずれか一項に記載のベクター。
23. 前記ｍｉＲＮＡコード配列が、イントロン配列内に位置する、請求項１３～２１のいずれか一項に記載のベクター。
24. １つを超えるｍｉＲＮＡコード配列を更に含む、請求項１３～２３のいずれか一項に記載のベクター。
25. 前記制御性配列が、構成的プロモーター、任意にＣＢ７プロモーター又はＣＡＧプロモーターを含む、請求項１３～２４のいずれか一項に記載のベクター。
26. 前記制御性配列が、ニューロン特異的プロモーター、任意にヒトシナプシンプロモーターを含む、請求項１３～２４のいずれか一項に記載のベクター。
27. 前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
28. 少なくとも１つの前記非ウイルスベクターが、リポソームである、請求項２７に記載のベクター。
29. 前記ベクターが、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、又は組換え単純ヘルペスウイルスから選択される、複製不全組換えウイルスベクターである、請求項１３、１４、又は１７～２６のいずれか一項に記載のベクター。
30. ベクターであって、配列番号１１の核酸配列又は配列番号１１と少なくとも９０％同一の配列を有する操作ヒトマイトフュージン２（ｈＭｆｎ２）コード配列を含み、ヒト標的細胞中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される、ベクター。
31. 組換えアデノ随伴ウイルス、組換えレンチウイルス、又は組換え単純ヘルペスウイルスから選択される、複製欠損ウイルスベクターである、請求項３０に記載のベクター。
32. 前記ウイルスベクターが、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列、及び前記制御性配列を含む、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムを有するＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である、請求項３１に記載のベクター。
33. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｒｈ９１、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｈｕ６８、又はＡＡＶ１カプシドから選択される、請求項３２に記載のベクター。
34. 前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、配列番号１１の核酸配列を有し、ＣＢ７プロモーターを更に含む、請求項１３～１７に記載のベクター。
35. 前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、配列番号１１の核酸配列を有し、ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターを更に含む、請求項１３～１７に記載のベクター。
36. 前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、配列番号１１の核酸配列を有し、ＣＡＧプロモーターを更に含む、請求項１３～１７に記載のベクター。
37. 組成物であって、ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２（ｈＭｆｎ２）コード配列を含む組換え核酸配列と、対象中で少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現を指示する制御性配列と作動可能に連結されるシャルコー・マリー・トゥース２Ａ（ＣＭＴ２Ａ）患者における内因性ヒトマイトフュージン２核酸配列中の標的部位と特異的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、を含み、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの前記標的部位を欠き、それによって前記ｍｉＲＮＡが、前記操作Ｍｆｎ２コード配列を標的とすることから妨げる、組成物。
38. 薬学的組成物であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１３～３６のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３７に記載の組成物と、薬学的に許容される水性懸濁液体、賦形剤、及び／又は希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
39. シャルコー・マリー・トゥース２Ａ（ＣＭＴ２Ａ）神経障害を有する患者を治療するための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ、請求項１３～３６のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３７に記載の組成物を、それを必要とする患者に送達することを含む、方法。
40. シャルコー・マリー・トゥース２Ａ（ＣＭＴ２Ａ）神経障害を有する患者における神経障害を低減するための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ、請求項１３～３６のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３７に記載の組成物を、それを必要とする患者に送達することを含む、方法。
41. シャルコー・マリー・トゥース２Ａ（ＣＭＴ２Ａ）疾患又は神経障害を有する患者の治療に好適な、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ、請求項１３～３６のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３７に記載の組成物。
42. シャルコー・マリー・トゥース２Ａ（ＣＭＴ２Ａ）疾患又は神経障害を有する患者の治療のための薬物を調製するのに使用するための、請求項１～１２に記載の組換えＡＡＶ、請求項１３～３６のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３７に記載の組成物。
43. アセトアミノフェン、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三環系抗うつ薬、又は抗てんかん薬、例えば、カルバマゼピン又はガバペンチンから選択される１つ以上の併用療法と組み合わせた、請求項３９若しくは４０に記載の患者を治療するための方法、又は請求項４１若しくは４２に記載のベクターの使用。
44. ＣＭＴ２Ａを有する患者を治療するための併用レジメンであって、
    （ａ）ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２（ｈＭｆｎ２）コード配列を含む組換え核酸配列であって、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、配列番号１１の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有し、（ｂ）のｍｉＲＮＡ標的部位中にミスマッチを有することによって、前記ＣＭＴ２Ａ患者における内因性ヒトマイトフュージン２コード配列とは異なる、組換え核酸配列、
    （ｂ）ヒトＣＭＴ２Ａ対象における前記内因性ｈＭｆｎ２コード配列と特異的なｍｉＲＮＡの少なくとも１つのコード配列を含む核酸であって、前記ｍｉＲＮＡコード配列が、前記対象中でその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結され、前記ｍｉＲＮＡが、（ａ）の前記操作ｈＭｆｎ２コード配列又はそのコードされたｍＲＮＡと結合しない、核酸、を共投与することを含む、併用レジメン。
45. 前記ｍｉＲＮＡコード配列が、配列番号８９を含むか、又は配列番号８９と少なくとも９９％同一である、請求項４４に記載の併用レジメン。
46. ＣＭＴ２Ａを有する患者を治療するための併用レジメンであって、
    （ａ）ヒト標的細胞中で組換え核酸配列の発現を指示する制御性配列と作動可能に連結される操作ヒトマイトフュージン２（ｈＭｆｎ２）コード配列を含む組換え核酸配列であって、前記操作ｈＭｆｎ２コード配列が、（ｂ））の配列のｍｉＲＮＡ標的部位中にミスマッチを有することによって、前記ＣＭＴ２Ａ患者における内因性ヒトマイトフュージン２とは異なるように操作される、組換え核酸配列、
    （ｂ）ヒトＣＭＴ２Ａ対象における前記内因性ヒトマイトフュージン２コード配列と特異的なｍｉＲＮＡを含む少なくとも１つの核酸配列であって、ｍｉＲＮＡコード配列が、前記対象におけるその発現を指示する制御性配列と作動可能に連結され、少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、配列番号１５（ｍｉＲ１６９３、６４ｎｔ）を含むｍｉＲＮＡコード配列、配列番号１５の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡコード配列、配列番号１５（又は配列番号６８）の約ヌクレオチド６～約ヌクレオチド２６と１００％の同一性を有する配列を含む、配列番号１５と少なくとも９９％の同一性を含むｍｉＲＮＡコード配列、又は
    （ｉ）ＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴ、配列番号２７、
    （ｉｉ）ＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧ、配列番号２８、
    （ｉｉｉ）ＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＧ、配列番号２９、
    （ｉｖ）ＴＴＧＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣ、配列番号３０、
    （ｖ）ＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ、配列番号３１、
    （ｖｉ）ＡＡＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧ、配列番号３２、
    （ｖｉｉ）ＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴ、配列番号３３、
    （ｖｉｉｉ）ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧ、配列番号３４、
    （ｉｘ）ＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧ、配列番号３５、
    （ｘ）ＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴ、配列番号３６、
    （ｘｉ）ＴＧＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＣ、配列番号３７、
    （ｘｉｉ）ＴＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＣＡＡＣＡＣＣＴＴ、配列番号３８、
    （ｘｉｉｉ）ＴＴＴＣＣＴＣＧＣＡＧＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴ、配列番号３９、
    （ｘｉｖ）ＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴＴ、配列番号４０、
    （ｘｉｖ）ＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡ、配列番号４１、
    （ｘｖｉ）ＡＡＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣ、配列番号４２、
    （ｘｖｉｉ）ＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＧＣＣ、配列番号４３、
    （ｘｖｉｉｉ）ＴＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡ、配列番号４４、
    （ｘｉｘ）ＴＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧ、配列番号４５、若しくは
    （ｘｘ）ＣＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡ、配列番号４６、又は（ｉ）～（ｘｘ）のいずれかの組み合わせのうちの１つ以上を含むｍｉＲＮＡコード配列のうちの１つ以上の配列を有する、少なくとも１つの核酸配列、を共投与することを含む、併用レジメン。
47. 第１のベクターが、核酸（ａ）を含み、第２の異なるベクターが、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（ｂ）を含む、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の併用レジメン。
48. 前記第１のベクターが、ウイルスベクターであり、並びに／又は前記第２のベクターが、ウイルスベクターであり、並びに前記第１及び前記第２のウイルスベクターが、同じウイルス源由来であり得るか、又は異なり得る、請求項４７に記載の併用レジメン。
49. 前記第１のベクターが、非ウイルスベクターであり、前記第２のベクターが、非ウイルスベクターであり、並びに前記第１及び前記第２のベクターが、同じ組成物であり得るか、又は異なり得る、請求項４７又は４８に記載の併用レジメン。