JP2022512589A - Ｇｍ１ガングリオシドーシスの治療に有用な組成物 - Google Patents

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Abstract

ＡＡＶｈｕ６８カプシドと、リソソームβ－ガラクトシダーゼ遺伝子（例えば、ガラクトシダーゼβ１遺伝子、ＧＢＬ１）を含むベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）（すなわち、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＢＬ１）が提供される。また、例えば、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに／または神経認知発達の改善を含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの症状を改善するための、有効量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＢＬ１を含有する組成物が提供される。

Description

電子形態で提出された資料の参照による組み込み
出願人は、本明細書に電子形態で出願された配列表の資料を、参照により本明細書に組み込む。このファイルは、２０１９年８月２９日付けの「１８－８５３７ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」とラベルされ、サイズが１４４，７０３バイトである。
ＧＭ１ガングリオシドーシス（以降、ＧＭ１と称される）は、ＧＭ１ガングリオシドおよびケラタン硫酸の分解の最初のステップを触媒する酵素であるリソソーム酸性βガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）をコードするＧＬＢ１遺伝子の変異によって引き起こされる劣性リソソーム蓄積症である（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ，２００８，ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ： Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ９４： ３９１－９６）。ＧＬＢ１遺伝子は、染色体３上に位置し、２つの選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ、β－ｇａｌリソソーム酵素をコードする２．５ｋｂ転写産物およびエラスチン結合タンパク質（ＥＢＰ）をコードする２．０ｋｂ転写産物をもたらす（Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．１９８８， Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１５７： ２３８－４４、Ｍｏｒｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｍＲＮＡ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ａ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４： ２０６５５－６３）。β－ｇａｌは、８８ｋＤａ形態に翻訳後グリコシル化され、成熟６４ｋＤａリソソーム酵素にプロセシングされる８５ｋＤａ前駆体として合成される（Ｄ’Ａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｍａｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７９： ４５３５－３９）。リソソーム内で、酵素は、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）およびノイラミニダーゼヒドロラーゼと複合体化される。
残留β－ｇａｌをほとんど産生しないかまたは全く産生しないＧＬＢ１アレル（対立遺伝子）を有する患者において、ＧＭ１ガングリオシドは脳全体のニューロンに蓄積し、急速進行性の神経変性疾患をもたらす（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ ２００８）。疾患の病因を引き起こす分子機構は依然として十分に理解されていないが、仮説としては、重度の神経細胞空胞化、神経細胞アポトーシスの領域におけるアストログリオーシスおよびミクログリオーシスを伴う神経細胞死および脱髄（Ｔｅｓｓｉｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２００４，ＧＭ１－Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃａｕｓｅｓ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｄｅａｔｈ ｉｎ ａ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１５： ７５３－６６）、ミエリン欠乏症をもたらす異常な軸索原形質輸送（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ：ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｉｃ ｌｏｓｓ ａｎｄ ａｘｏｎａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，１０７： ５３９－４５）、ニューロン－オリゴデンドログリア相互作用の障害（Ｆｏｌｋｅｒｔｈ １９９９，Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｗｈｉｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５８： ８８７－９０２；Ｋａｙｅ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ’，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８： ２５５－６１）、および炎症反応（Ｊｅｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＧＭ１ ａｎｄ ＧＭ２ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ，Ｂｒａｉｎ，１２６： ９７４－８７）が挙げられる。
現在、ＧＭ１の病態修飾療法は存在しない。栄養管の配置、呼吸療法、抗てんかん薬を含む支持療法および対症療法が、現在の治療手段である（Ｊａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ： Ｍａｐｐｉｎｇ ａ ｔｉｍｅｌｉｎｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１２１： １７０－７９）。ＧＭ１およびＧＭ２患者において、グルコシルセラミドシンターゼ阻害剤であるミグルスタットによる基質合成抑制療法（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ、ＳＲＴ）が評価されている。ミグルスタットは概して良好に耐容されるが、症状管理または疾患進行において顕著な改善をもたらさず、一部の患者は用量制限的な胃腸副作用を経験する（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ）。ケトン食と組み合わせて使用する場合、ミグルスタットは耐容性が良く、一部の患者で生存率を増加させることが示されている（Ｊａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかしながら、ミグルスタットを用いた無作為化対照研究は行われておらず、ミグルスタットはＧＭ１ガングリオシドーシスの治療用に承認されていないことに留意されたい。この疾患では、骨髄または臍帯血を用いた造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の実績は限られている。２型ＧＭ１を有する患者において行われた骨髄移植は、前駆症状性若年発症ＧＭ１－ガングリオシドーシスを有する患者において白血球β－ガラクトシダーゼレベルの正常化をもたらしたが、長期的な臨床結果は改善されなかった（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ．２８（５）：７９７－７９８．）。ＨＳＣＴの効果が遅いため、急速進行性の１型ＧＭ１疾患には好適ではない（Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｄ，２００３，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．３１：２２９．）。
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、約４．７キロ塩基（ｋｂ）の長さの一本鎖直鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する小さな非エンベロープ性の正二十面体ウイルスである。野生型ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆位末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ、ＩＴＲ）、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐおよびｃａｐを含む。Ｒｅｐは、ＡＡＶの生活環に必要なｒｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子から構成され、ｃａｐは、カプシドタンパク質の重複ヌクレオチド配列であるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含有し、自己集合して正二十面体対称のカプシドを形成する。
ＡＡＶは、このウイルスが精製されたアデノウイルスストック中の混入物として発見されたため、ディペンドウイルス属に割り当てられている。ＡＡＶの生活環には、感染後にＡＡＶゲノムが宿主染色体に特異的に組み込まれる潜伏相と、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスのいずれかの感染後に、組み込まれたゲノムが、その後に感染性ウイルスへと救出、複製、およびパッケージングされる感染相とが含まれる。非病原性、非分裂細胞を含む広範な宿主範囲の感染性、および潜在的な部位特異的染色体組み込みの特性により、ＡＡＶは、遺伝子導入のための魅力的なツールとなる。
望まれることは、異常なＧＬＢ１遺伝子に関連する状態の治療のための代替療法である。
ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状の治療および／または軽減を必要とするヒト患者において、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状を治療および／または軽減するために有用である、治療用の組換え（ｒ）複製欠陥アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、望ましくは複製欠陥性であり、標的ヒト細胞でヒト（ｈ）β－ガラクトシダーゼの発現を導く調節配列の制御下で、ヒト（ｈ）β－ガラクトシダーゼをコードするＧＬＢ１遺伝子を含むベクターゲノムを有し、本明細書で使用されるように、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１と称され得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む。このｒＡＡＶは、本明細書ではｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１と称されるが、特定の例では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１ベクター、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＬＢ１、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＬＢ１ベクター、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１、またはＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１ベクターという用語が互換的に使用され、同じ構築物を参照する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶｈｕ６８ゲノム配列を含有せず、ＡＡＶｈｕ６８カプシドに対して完全に外因性である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシド以外のカプシドが利用され得る。さらなる実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ベクターゲノムを中枢神経系（ＣＮＳ、例えば、ＣＮＳ中のニューロン、グリア細胞、上皮細胞、または他の細胞）に送達するのに好適である。さらに、ｒＡＡＶの産生（例えば、生成および／または精製）に使用するための方法、ベクター（プラスミドなどのウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）、ならびに細胞が提供される。
特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号４のアミノ酸２４～６７７のシグナルペプチドおよび成熟ＧＬＢ１アミノ酸配列、またはその機能性断片をコードする。特定の実施形態では、天然ヒトＧＬＢ１シグナルペプチド、例えば、配列番号４のアミノ酸１～２３のアミノ酸配列が使用される。
特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号５、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８から選択される核酸配列、または配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８と少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を有する。さらなる実施形態では、ＧＬＢ１核酸配列は、配列番号４のアミノ酸２４～６７７またはその機能性断片をコードする。別の実施形態では、ＧＬＢ１核酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能性断片をコードする。
特定の実施形態では、調節配列は、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターを含む。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５から選択される配列を有する。
特定の実施形態では、製剤緩衝液およびｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）を含む水性医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％を含む。さらなる実施形態では、パーセンテージ（％）は、重量（ｗ）比（すなわち、ｗ／ｗ）に基づいて計算される。特定の実施形態では、組成物は、ｐＨが７．２～７．８である。特定の実施形態では、組成物は、ｐＨが６．２～７．７である。特定の実施形態では、組成物は、ｐＨが６．０～７．５である。一実施形態では、ｐＨが約７である。
特定の実施形態では、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者を治療する方法であり、本明細書に記載されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）、または提供されるものと同じものを含む組成物を投与することを含む。本方法は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有するヒト患者に送達することを伴う。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１または組成物は、大槽内へのＣＴガイドの後頭下注入を介して投与される。特定の実施形態では、本方法は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１または組成物を単回用量でヒト患者に送達することを含む。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１など）またはそれを含む組成物は、大槽内注入（ＩＣＭ）を介して患者に投与可能である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）またはそれを含む組成物が提供され、１８ヶ月齢以下の乳児ガングリオシドーシスを有する患者に投与可能である。ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）またはそれを含む組成物が提供され、これは、それを必要とする患者に投与して、ＧＭ１ガングリオシドーシスの症状、例えば、ＧＭ１の神経学的症状を改善することができる。特定の実施形態では、ＧＭ１ガングリオシドーシスの改善には、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに／または神経認知発達の改善が含まれる。
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかなる。
５’ＩＴＲ、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、キメライントロン、ヒトβ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）をコードするＧＬＢ１遺伝子、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、および３’ＩＴＲ（すなわち、「ＡＡＶｈｕ６８．Ｕｂｃ．ｈＧＬＢ１ｃｏ．ＳＶ４０」）を示すＡＡＶベクターゲノムの概略図を提供する。 シスプラスミドｐＡＡＶ．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１ｃｏ．ＳＶ４０．ＫａｎＲが保有するＡＡＶベクターゲノムを含むシスプラスミドの概略図を提供する。ＧＬＢ１：β－ガラクトシダーゼ、ＩＴＲ：逆位末端反復、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性、Ｏｒｉ：複製起点、ＰｏｌｙＡ：ポリアデニル化、およびＵｂＣ：ユビキチンＣ。 ４つのタンパク質をコードする全長ＡＡＶ２レプリカーゼ（ＡＡＶ２ Ｒｅｐ）のコード配列、およびＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシド遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質をコードする）を含むトランスプラスミドの概略図を提供する。ＡＡＶ２：アデノ随伴ウイルス血清型２、ＡＡＶｈｕ６８：アデノ随伴ウイルス血清型ｈｕ６８、Ｃａｐ：カプシド、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性、Ｏｒｉ：複製起点、およびＲｅｐ：複製酵素。 異なるプロモーターを使用して、ヒトβ－ｇａｌを発現するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１で処理した野生型マウスの脳および脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるβ－ｇａｌ活性をそれぞれ例示する。ＣＢ７、ＥＦ１ａ、またはＵｂＣプロモーターからヒトＧＬＢ１を発現するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回ＩＣＶ注入により、野生型マウスを処置した（群当たりｎ＝１０）。未処置野生型マウス（ｎ＝５）は、対照として機能した。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与して１４日後、脳（前頭皮質）およびＣＳＦを回収し、β－ｇａｌ活性を、蛍光発生基質を使用して測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。 血清および末梢臓器のβ－ｇａｌ活性を例示する。β－ｇａｌ活性は、蛍光発生基質を使用して、それぞれ血清（図３Ａ）、ならびに肺（図３Ｂ）、肝臓（図３Ｃ）、心臓（図３Ｄ）および脾臓（図３Ｅ）試料で測定した。ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ビヒクル）、ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。ＮＳ：有意差なし。 脳およびＣＳＦにおけるβ－ｇａｌ活性を例示する。剖検で脳（前頭皮質）およびＣＳＦを採取し、蛍光発生基質を使用してβ－ｇａｌ活性を測定した。ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ビヒクル）、ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。ＮＳ：有意差なし。 ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１処置ＧＬＢ１－／－マウスの脳におけるヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸ）活性の減少を示す。剖検で脳（前頭皮質）を採取し、蛍光発生基質を使用して、ＨＥＸ活性を測定した。ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ビヒクル）、ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。ＮＳ：有意差なし。 β－ｇａｌ活性と抗β－ｇａｌ抗体との間の相関を示す。剖検時に、ＡＡＶ処置マウスから採取した血清試料中のβ－ｇａｌ活性および血清抗β－ｇａｌ抗体を測定した。各点は、個々の動物を表す。 ＡＡＶ処置ＧＬＢ１－／－マウスでの歩行異常の矯正を示す。図７Ａおよび７Ｂは、平均５ヶ月齢の未処置ＧＬＢ１－／－マウス（ｎ＝１２）およびＧＬＢ１＋／－対照マウス（ｎ＝２２）が、２日連続でＣａｔＷａｌｋシステムを使用して評価されたことを示す。少なくとも３回の試行にわたって、各動物について、平均歩行速度（図７Ａ）および後肢の足跡長（図７Ｂ）を定量化した。＊＊ｐ＜０．０１マン・ホイットニ検定。図７Ｃおよび７Ｄは、ビヒクルで処置された４ヶ月齢のＧＬＢ１＋／－（ｎ＝１５）またはＧＬＢ１－／－（ｎ＝１５）マウス、およびＡＡＶで処置されたＧＬＢ１－／－マウス（ｎ＝１４）が、ＣａｔＷａｌｋシステムを使用して評価されたことを示す。平均歩行速度（図７Ｃ）および後肢の足跡長（図７Ｄ）を、試験２日目に、各動物について少なくとも３回の試行にわたって定量化した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。ＮＳ：有意差なし。図７Ｅ～Ｇは、ＡＡＶで処置されたＧＬＢ１－／－マウス（図７Ｇ）、ならびにビヒクルで処置されたＧＬＢ１＋／－（図７Ｅ）およびＧＬＢ１－／－（図７Ｆ）対照マウスについての代表的な後肢の足跡を示す。 歩行速度と歩行パラメータとの間の相関を示す。ＧＬＢ１＋／－対照（ｎ＝２２）を、ＣａｔＷａｌｋシステムを使用して２日連続で評価した。試験２日目の少なくとも３回の試行で測定された歩行運動のパラメータが記録された。相関分析は、歩行速度と、歩幅長などの歩行パラメータとの間の強い相関関係を実証した（スピアマンｒ＝０．７４３２、ｐ＜０．００１、図８Ａ）。対照的に、後肢の足跡長は速度に依存しなかった（スピアマンｒ＝－０．１２３９、ｐ＝０．４２３、図８Ｂ）。 ＩＣＶ注入によって４つの用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１（１．３×１０１１ＧＣ、４．４×１０１０ＧＣ、１．３×１０１０ＧＣもしくは４．４×１０９ＧＣ）またはビヒクルのうちの１つを受けたＧＬＢ１－／－マウスのβ－ｇａｌ活性（図９Ａ）、体重（図９Ｂ）、神経学的検査スコア（神経検査スコア、図９Ｃ）、後肢の足跡長（図９Ｄ）、およびスイング時間（図９Ｅ）ならびに後肢の歩幅長（図９Ｆ）を提供する。ビヒクルを投与されるＧＬＢ１＋／－マウス（Ｈｅｔ＋ビヒクル）は、対照として機能する。より詳細は、実施例４のセクションＡで提供される。 ＡＡＶ９（配列番号２０）、ＡＡＶｈｕ３１（整列でｈｕ．３１と表示、配列番号２１）、およびＡＡＶｈｕ３２（整列でｈｕ．３２と表示、配列番号２２）と共に、ＡＡＶｈｕ６８（配列番号２）（整列でｈｕ６８．ｖｐ１と表示）のｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列を示す整列を提供する。ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１およびＡＡＶｈｕ３２と比較して、２つの変異（Ａ６７ＥおよびＡ１５７Ｖ）がＡＡＶｈｕ６８において重要であることが見出された（図で丸く囲んである）。 ＡＡＶ９（配列番号２３）、ＡＡＶｈｕ３１（配列番号２４）、およびＡＡＶｈｕ３２（配列番号２５）と共に、ＡＡＶｈｕ６８（配列番号１）のｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列の整列を提供する。 ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１原薬を生産するための製造プロセスの例示的なフローチャートを提供する。ＡＥＸ：アニオン交換、ＣＲＬ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｄｄＰＣＲ：液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応、ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＦＦＢ：最終製剤緩衝液、ＧＣ：ゲノムコピー、ＨＥＫ２９３：ヒト胚性腎臓２９３細胞、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＰＥＩ：ポリエチレンミン、Ｐｈ．Ｅｕｒ．：欧州薬局方、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＦＦ：接線流濾過、ＵＳＰ：米国薬局方、ＷＣＢ：作業用細胞バンク。 ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１製剤を生産するための製造プロセスの例示的なフローチャートを提供する。Ａｄ５：アデノウイルス血清型５、ＡＵＣ：分析用超遠心分離、ＢＤＳ：バルク原薬、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＣＺ：Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ、ｄｄＰＣＲ：液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応、Ｅ１Ａ：初期領域１Ａ（遺伝子）、ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ、ＦＤＰ：最終薬物生成物、ＧＣ：ゲノムコピー、ＨＥＫ２９３：ヒト胚性腎臓２９３細胞、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性（遺伝子）、ＭＳ：質量分析、ＮＧＳ：次世代配列決定、Ｐｈ．Ｅｕｒ．：欧州薬局方、ｑＰＣＲ：定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染用量、ＵＰＬＣ：超高性能液体クロマトグラフィー、ＵＳＰ：米国薬局方。
ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＭ１）を治療するための、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく組成物および方法が本明細書に提供される。ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有し、正常なヒトβ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）酵素をコードするベクターゲノムを担持する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）の有効量のゲノムコピー（ＧＣ）が患者に送達される。望ましくは、このｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、水性緩衝液と共に製剤化される。特定の実施形態では、懸濁液は、髄腔内注入に好適である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１（ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１とも称される）であり、ＧＬＢ１遺伝子（すなわち、β－ガラクトシダーゼ（本明細書で使用される場合、ＧＬＢ１酵素、β－ｇａｌ、またはガラクトシダーゼとも称される）コード配列）は、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）に由来するプロモーターを含む調節配列の制御下にある。特定の実施形態では、組成物は、大槽内注入（ＩＣＭ）を介して送達される。
本明細書でＡＡＶｈｕ６８と称される系統群Ｆのアデノ随伴ウイルスのカプシドをコードする核酸配列は、ベクターゲノムを有するＡＡＶｈｕ６８カプシドおよび組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生に利用される。本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」という用語は、ウイルスカプシド、例えば、ＡＡＶカプシドにパッケージされ、宿主細胞または患者の細胞に送達され得る核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは発現カセットであり、ベクターゲノムをＡＡＶカプシドにパッケージングするのに必要な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を５’および３’最末端に有し、それらの間に、発現を導く配列と作動可能に連結された本明細書に記載されるＧＬＢ１遺伝子を含有する。ＡＡＶｈｕ６８に関連する追加の詳細は、ＷＯ２０１８／１６０５８２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）およびこの詳細な説明に提供される。本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、ＧＬＢ１遺伝子を含むベクターゲノムを、脳、海馬、運動皮質、小脳、および運動ニューロンを含む中枢神経系（ＣＮＳ）内の細胞に送達するのに非常に好適である。これらのｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、ＣＮＳ内の他の細胞、ならびにＣＮＳ外の特定の他の組織および細胞を標的にするために使用され得る。あるいは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ベクターゲノムをＣＮＳに送達するのにも好適な別のカプシド、例えば、ＡＡＶｃｙ０２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ０８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｂｂ０１、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶ１、ＡＡＶｈｕ４８、ＡＡＶｃｙ０５、ＡＡＶｈｕ１１、ＡＡＶｈｕ３２、またはＡＡＶｐｉ０２によって置換され得る。
Ｉ．ＧＭ１および治療用ＧＬＢ１遺伝子
ＧＭ１ガングリオシドーシス（すなわち、ＧＭ１）は、臨床表現型に基づいて３つのタイプに分類することができる：（１）出生から６ヶ月までの発症を伴う１型または乳児型：筋緊張低下、重度の中枢神経系（ＣＮＳ）の変性を伴って急速に進行し、１～２歳までに死亡する、（２）７ヶ月から３歳までの発症を伴う２型後期乳児型または若年型：運動および認知発達の遅れ、およびより遅い進行、ならびに（３）後期発症を伴う３型成人型または慢性異型（３～３０歳）：尾状核におけるスフィンゴ糖脂質の局所沈着に起因する進行性錐体外路障害（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ，２００８．ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ： Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，９４： ３９１－９６）。６ヶ月齢以前に症状が発症した乳児ＧＭ１対象は、運動障害および認知障害の両方の迅速かつ予測可能な進行を一様に示す。患者の大部分は、生後数年以内に死亡する（生存期間の中央値は４６ヶ月、Ｊａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。共通の基礎となる病態生理にもかかわらず、成人型（３型）のＧＭ１表現型は可変であり、疾患の経過は顕著に軽度である。３型ＧＭ１の患者のほとんどは、最初に小児後期に神経学的症状を発症し、その後の成人期における進行はほとんど見られない。
各タイプの重症度は、ＧＬＢ１遺伝子によってコードされる変異体β－ｇａｌ（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ，２００８）の残留活性と逆に関連する。ヒトにおいて１３０を超える疾患原因のＧＬＢ１変異が特定されている（Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ＧＬＢ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．７８（３）：２３６－２４６、およびＣａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｏｒｑｕｉｏ Ｂ ｄｉｓｅａｓｅ： Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．１８１２（７）：７８２－７９０．）。いくつかのＧＬＢ１変異は、遺伝的および生化学的に分析されており、臨床表現型と相関しているが（Ｇｕｒｕｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＧＭ１ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０（１）：５７－６０；Ｃａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１、およびＳｐｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｇｅｎｅ．５１２（１）：１１３－１１６）、多くのＧＬＢ１変異は特徴付けられていないままである。広義には、患者の遺伝子型は、様々な量の残留酵素活性をもたらすが、一般的には、残留酵素活性が高いほど、表現型はより軽度である（Ｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＳＡＡＭＰ ２．０： Ａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．９３（５）：１００８－１０１４．）。ＧＭ１の診断は、β－ｇａｌおよびノイラミニダーゼの生化学アッセイならびに／またはＧＬＢ１分子分析のいずれかによって確認される。しかしながら、罹患した個体の臨床症状を予測する際に遺伝子型－表現型相関を使用するには制限があり、なぜなら残存酵素活性自体がＧＬＢ１遺伝子の変異によって引き起こされる疾患サブタイプを予測することができないためである（Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｃａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。予測値は、一般に重度の早期発症の表現型を伴う２つの重度の変異（すなわち、ＧＬＢ１酵素活性を示さない変異）を有する個人に対して、最良である（Ｃａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｓｐｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。兄弟姉妹の一致率に関するデータは稀であるが、乳児ＧＭ１を有する兄弟姉妹の臨床経過が発症および一般的な疾患症状と時間の観点で類似していることを示す（Ｇｕｒｕｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
本明細書に提供される遺伝子治療ベクター、すなわち、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１）、またはそれらを含む組成物は、正常なレベルの機能性β－ガラクトシダーゼの欠損に関連する状態の治療に有用である。本明細書で使用される場合、遺伝子治療ベクターは、本明細書に記載されるｒＡＡＶを指し、患者を治療する際の使用に好適である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の１型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の２型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の３型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１の１型および２型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、１８ヶ月齢以下のＧＭ１患者を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、３型を除くＧＭ１の治療用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、正常なレベルの機能性β－ガラクトシダーゼの欠損に関連する神経学的状態の治療に有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状の改善に有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する神経学的症状の改善に有用である。
特定の実施形態では、患者は、乳児ガングリオシドーシスを有し、１８ヶ月齢以下である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を受ける患者は、１ヶ月齢～１８ヶ月齢である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を受ける患者は、４ヶ月齢～１８ヶ月齢である。特定の実施形態では、乳児は、４ヶ月未満である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を受ける患者は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８ヶ月齢である。特定の実施形態では、患者は、幼児、例えば、１８ヶ月齢～３歳である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を受ける患者は、３歳～６歳、３歳～１２歳、３歳～１８歳、３歳～３０歳である。特定の実施形態では、患者は、１８歳以上である。
特定の実施形態では、治療後にＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状の改善が観察され、例えば、寿命の延長（生存期間）、栄養管の必要性の減少、発作の発生率、頻度、および長さの減少、発作発症の遅延、生活の質の改善（例えば、ＰｅｄｓＱＬによって測定されるような）、神経認知低下の進行の減少、ならびに／または神経認知発達の改善（例えば、適応行動、認知、言語（受容的および表現的コミュニケーション）、ならびに運動機能（粗大運動、微細運動）の改善（乳幼児発達のベイリー尺度（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）、ならびヴァインランドの適応行動尺度（（Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩ）による測定）、運動マイルストーンの初期達成年齢と以降の喪失年齢（ｅａｒｌｉｅｒ ａｇｅ－ａｔ－ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｌａｔｅｒ ａｇｅ－ａｔ－ｌｏｓｓ ｆｏｒ ｍｏｔｏｒ ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ）、脳組織体積（大脳皮質および他のより小さな構造）および脳室体積の増大の遅延、脳梁、尾状核、被殻、小脳皮質を含む脳の下部構造のサイズ減少の遅延および脳萎縮および脳体積変化の安定化、視床および基底核における異常なＴ１／Ｔ２シグナル強度の進行の遅延、ＣＳＦおよび血清におけるβ－ｇａｌ酵素（ＧＬＢ１）活性の増加、ＣＳＦのＧＭ１濃度の減少、血清および／または尿のケラタン硫酸レベルの減少、ヘキソサミニダーゼ活性の減少、脳における炎症反応の減少、異常な肝臓および脾臓体積の遅延、異常な脳波（ＥＥＧ）および視覚誘発電位（ＶＥＰ）の遅延、ならびに／あるいは嚥下障害、歩行機能、運動技能、言語および／または呼吸機能の改善が含まれる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ療法なしでは適格ではなかった患者についてｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を注入後、患者は、併用療法を受ける。かかる併用療法は、酵素補充療法、基質抑制療法（例えば、ミグルスタット（ＯＧＴ９１８、Ｎ－ブチル－デオキシノジリマイシン）による）、タンガニル（アセチル－ＤＬ－ロイシン）治療、呼吸療法、栄養管使用、抗てんかん薬による）、または骨髄もしくは臍帯血による造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を含み得る。
任意選択的に、必要とする対象において、免疫抑制性併用療法を使用してもよい。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１投与前または投与後０、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の日に開始され得る。かかる免疫抑制療法は、１つ、２つ、またはそれ以上の薬物（例えば、グルココルチコイド、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の投与を伴い得る。かかる免疫抑制薬は、同じ用量または調整用量で、１回、２回、またはそれ以上、必要とする患者／対象に投与され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物、（例えば、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１投与後、同じ用量または調整用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、ｒＡＡＶ．ＵｂＣ．ＧＬＢ１）の「有効量」は、ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する症状の改善を達成する量である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の「有効量」は、以下のエンドポイントのうちの１つ以上を達成する量である：脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＧＬＢ１薬力学的および生物学的活性の増加、血清中のＧＬＢ１薬力学的および生物学的活性の増加、患者の平均寿命（生存期間）の増加、ＧＭ１ガングリオシドーシスの疾患進行の遅延（達成時のの年齢、喪失時の年齢、および年齢に適した発達および運動マイルストーンを維持または獲得する患者の割合のうちの１つ以上による評価）、ならびに乳幼児発達のベイリー尺度の年齢等価の認知、粗大運動、微細運動、受容的および発現的コミュニケーションスコアの１つ以上の変化に基づいた神経認知発達の改善（ＢＳＩＤ、例えば、ＢＳＩＤ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （ＢＳＩＤ－ＩＩＩ））、ヴァインランドの適応行動尺度の各ドメインの標準スコアの変化。より年長の子供および成人の場合、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の「有効量」は、一部の実施形態では、嚥下障害、歩行機能、運動技能、言語および／または呼吸機能、ヴァインランドの適応行動尺度（第２版（Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩ））の各ドメインの標準スコアの変化、発作頻度および発作開始年齢の減少、２４ヶ月齢での栄養管の非依存性の改善された確率を改善する量であり得る。年齢に適した発達および運動マイルストーンの例は、世界保健機関（ＷＨＯ）によって提供されている。例えば、Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎ Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｒｏｓｓ ｍｏｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＷＨＯ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔｕｄｙ．Ｆｏｏｄ Ｎｕｔｒ Ｂｕｌｌ．２５（１ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ３７－４５、ならびに以下の表を参照されたい。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（ｒＡＡＶｈｕ６８、ＧＬＢ１など）の「有効量」は、ＣＳＦおよび血清のＧＬＢ１活性、ＣＳＦのＧＭ１濃度、ならびに血清および尿のケラタン硫酸、脳ＭＲＩの変化、肝臓および脾臓体積のモニタリング、脳波（ＥＥＧ）および視覚誘発電位（ＶＥＰ）のモニタリングに対するｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の薬力学的効果を達成する量である。
Figure 2022512589000001
 Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｒｏｓｓ ｍｏｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＷＨＯ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔｕｄｙ．”Ｆｏｏｄ Ｎｕｔｒ Ｂｕｌｌ．２５（１ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ３７－４５）から適応。略語：ＷＨＯ、世界保健機関。
本明細書に記載のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、およびそれらを含む組成物は、ヒトβ－ガラクトシダーゼ（正常なＧＬＢ１酵素とも称され得る）またはその機能性断片をコードし発現するＧＬＢ１遺伝子（すなわち、β－Ｇａｌコード配列）を含有する。ＧＬＢ１酵素は、β－ガラクトシドの単糖への加水分解を触媒する。ヒトβ－ガラクトシダーゼのアミノ酸配列（２０３４ｂｐ、６７７ａａ、Ｇｅｎｂａｎｋ＃ＡＡＡ５１８１９．１、ＥＣ３．２．１．２３）は、本明細書において、配列番号４として再現され、β－ガラクトシダーゼ、アイソフォーム１としても認識される。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１６２７８（ＢＧＡＬ＿ＨＵＭＡＮ）を参照されたい。特定の実施形態では、ＧＬＢ１酵素は、配列番号４のアミノ酸２４～アミノ酸６７７の配列（すなわち、シグナルペプチドを含まない成熟ＧＬＢ１酵素）を有し得る。特定の実施形態では、ＧＬＢ１酵素は、配列番号４：のアミノ酸３１～アミノ酸６７７の配列（すなわち、β－ガラクトシダーゼ、アイソフォーム３）を有し得る。特定の実施形態では、ＧＬＢ１酵素は、配列番号２６のアミノ酸配列を有するアイソフォーム２である。全長β－ガラクトシダーゼの機能を保持する任意の断片は、本明細書に記載のＧＬＢ１遺伝子によってコードされ得、「機能性断片」と称される。例えば、β－ガラクトシダーゼの機能性断片は、全長β－ガラクトシダーゼ（すなわち、配列番号４のアミノ酸２４～アミノ酸６７７の配列、または３つのアイソフォームのうちのいずれか１つを有するβ－ガラクトシダーゼであり得る正常なＧＬＢ１酵素）の活性の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上を有し得る。β－ガラクトシダーゼの活性を評価する方法は、実施例ならびに刊行物に見出すことができる。例えば、Ｒａｄｏｓｌａｗ Ｋｗａｐｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｉｄ β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ： Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４ Ｊａｎ；２９（１）： ５７－６２を参照されたい。特定の実施形態では、機能性断片は、全長β－ガラクトシダーゼのＮ末端および／またはＣ末端に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のアミノ酸を欠く、切断β－ガラクトシダーゼである。特定の実施形態では、機能性断片は、全長β－ガラクトシダーゼと比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換（複数可）を含有する。本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換は、所与のアミノ酸を、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、およびサイズ）を有する異なるアミノ酸に変更するタンパク質中のアミノ酸置換である。
一実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号５の配列を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６と少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７と少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８と少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％同一の配列を有するように操作される。さらなる実施形態では、操作された配列は、全長β－ガラクトシダーゼまたはその機能性断片をコードする。またさらなる実施形態では、操作された配列は、配列番号４またはその機能性断片のアミノ酸２４～アミノ酸６７７をコードする。別の実施形態では、操作された配列は、配列番号４またはその機能性断片のアミノ酸配列をコードする。
特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、シグナル（リーダー）ペプチドおよびＧＬＢ１成熟タンパク質、配列番号４のアミノ酸２４～６７７を含むＧＬＢ１酵素をコードする。リーダー配列は、好ましくは、ヒト起源またはヒトリーダー配列の誘導体であり、約１５～約２８アミノ酸、好ましくは約２０～２５アミノ酸、または約２３アミノ酸長である。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、天然シグナルペプチド（配列番号４のアミノ酸１～２３）である。特定の実施形態では、ＧＬＢ１酵素は、天然リーダー配列（配列番号４のアミノ酸１～２３）の代わりに外来性リーダー配列を含む。別の実施形態では、リーダーは、ヒトＩＬ２または変異リーダー由来であり得る。別の実施形態では、ヒトセルピンＦ１分泌シグナルは、リーダーペプチドとして使用され得る。
ＩＩ．ＡＡＶｈｕ６８
配列番号２の番号付けに基づいて、ＡＡＶｈｕ６８（以前はＡＡＶ３Ｇ２と称されていた）は、ｖｐ１の６７位および１５７位の２つのコード化されたアミノ酸によって、別の系統群ＦのウイルスＡＡＶ９と異なる。対照的に、他の系統群ＦのＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３１）は、６７位にＡｌａおよび１５７位にＡｌａを有する。新規のＡＡＶｈｕ６８カプシドおよび／または操作されたＡＡＶカプシドが提供され、配列番号２の番号付けに基づいて１５７位にバリン（ＶａｌまたはＶ）を有し、任意選択的に、配列番号２の番号付けに基づいて６７位にグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）を有する。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指し、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列の整列に基づいて、少なくとも７５％のブートストラップ値（少なくとも１０００反復のうち）および０．０５以下のポアソン補正距離測定値によって隣接結合アルゴリズム（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ． Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。コンピュータプログラムが利用可能であり、それを使用して、このアルゴリズムを実装することができる。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定される１つの系統群（ｃｌａｄｅ）に含まれるか、別の系統群に含まれるか、またはこれらの系統群の外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０）： ６３８１－６３８８，ｗｈｉｃｈ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｃｌａｄｅｓ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ ａｎｄ Ｆ，ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ＡＡＶ， ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＡＹ５３０５５３ ｔｏ ＡＹ５３０６２９を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、さらに、以下のうちの１つ以上を特徴とする。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパクが、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されたｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくともアミノ酸約１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、および／または配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質、を含む。
ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、典型的には、全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸（ａａ）１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を発現するために単独で使用される。あるいは、この配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しないＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号１の約ヌクレオチド（ｎｔ）６０７～約ｎｔ２２１１から転写されるｍＲＮＡ）、または配列２のａａ２０３～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列、のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、ｖｐ１コード配列および／またはｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号１のｎｔ４１２～２２１１から転写されるｍＲＮＡ）、または配列番号２の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。
本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列、および任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１および／またはｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）からカプシドを発現する産生システムで産生されるｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有し、配列番号２の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。
一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号１の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。
しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と、少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号１のｎｔ６０７～ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。
ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードする核酸配列を設計することは、当該技術分野の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に提供される。また、図１１Ａ～１１Ｅも参照されたい。他の実施形態では、配列番号１と７０％～９９．９％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現し得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号１と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。かかる核酸配列は、選択されたシステム（すなわち、細胞型）における発現のためにコドン最適化され得、様々な方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えば、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行され得る。１つのコドン最適化方法は、例えば、米国国際特許公開第ＷＯ ２０１５／０１２９２４号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号および米国特許公開第２００６／０１３６１８４号を参照されたい。好適には、製品のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修正する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみが改変され得る。これらの方法のうちの１つを使用することによって、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。コドンへの実際の変更を実行するため、または本明細書に記載されるように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。かかる修飾または合成は、当業者に周知の標準的かつ日常的な分子生物学的操作を使用して行うことができる。１つのアプローチでは、各８０～９０ヌクレオチドの長さ、かつ所望の配列の長さにまたがる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニールすると、凝集末端を含む８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、対中の各オリゴヌクレオチドは、対中の他のオリゴヌクレオチドと相補的である領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニールするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次いで、これらの二本鎖断片のおおよそ５～６個を、粘着性一本鎖末端を介して一緒にアニールさせ、次いで、それらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法で配列決定する。一緒にライゲーションされた８０～９０塩基対断片の５～６個の断片、すなわち、約５００塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかを調製し、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表されるようにする。次いで、これらのプラスミドの挿入物を適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして、最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。追加の方法は、当業者にはすぐに明らかであろう。さらに、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能である。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１の核酸配列、または本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を含む配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列、を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号２に再現される。
本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号２は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質（あるいは、アイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意の修飾をもたらす。
本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。
例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中のすべてのｖｐ３タンパク質よりも少ない１つ（１）ｖｐ３タンパク質であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の亜集団であり得、ｖｐ３は、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらなる亜集団であり得る。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含み得る。
別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号２（ＡＡＶｈｕ６８）の番号付けに基づくアミノ酸５７での少なくとも８０％のアスパラギンは、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化され得、総ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化され得る）。かかる割合は、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。
理論に束縛されることを意図するものではないが、ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質中の少なくとも高度に脱アミドされた残基の脱アミド化は、本質的に非酵素的であると考えられ、選択されたアスパラギンを脱アミド化するカプシドタンパク質内の官能基、およびより少ない程度でグルタミン残基によって引き起こされる。大部分の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組み立ては、これらの事象がカプシド組み立て後に生じるか、または個々のモノマー（ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）における脱アミドが構造的に十分許容され、ほとんどが組み立て動態に影響を及ぼさないことを示す。一般に、細胞侵入前に内部に位置すると考えられるＶＰ１固有（ＶＰ１－ｕ）領域（約ａａ１～１３７）における広範な脱アミド化は、カプシド組み立ての前にＶＰ脱アミド化が生じ得ることを示唆する。Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の骨格窒素原子を介して、Ａｓｎの側鎖アミド基炭素原子に対して求核攻撃を行うことによって生じ得る。中間環閉鎖スクシンイミド残基が形成されると考えられる。次いで、スクシンイミド残基は、高速加水分解を行って、最終産物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）の脱アミド化は、ＡｓｐまたはＩｓｏＡｓｐをもたらし、例えば、以下に例示するように、スクシンイミド中間体を介して相互変換され得る。
Figure 2022512589000002
本明細書に提供されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３中の各脱アミド化Ｎは、独立して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート、および／またはＡｓｐおよびｉｓｏＡｓｐの相互変換ブレンド、またはこれらの組み合わせであり得る。α－およびイソアスパラギン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約５０：５０のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、もしくは約１：３のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または別の選択された比率であり得る。
特定の実施形態では、１つ以上のグルタミン（Ｑ）は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわちα－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、またはα－およびγ－グルタミン酸のブレンドに脱アミド化され得、共通のグルタリミド中間体を介して相互変換され得る。α－およびγ－グルタミン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のα対γ、約５０：５０のα：γ、もしくは約１： ３のα：γ、または別の選択された比率であり得る。
Figure 2022512589000003
したがって、ｒＡＡＶは、少なくとも１つの高度脱アミド化アスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド中に亜集団を含む。さらに、他の修飾は、特に選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。さらに他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の亜集団を含み、そのうちの少なくとも１～１０％は、ｖｐタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して脱アミド化される。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基は脱アミド化され得る。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、実施例１に提供され、参照により本明細書に組み込まれる表に示される位置に、２つ、３つ、４つ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶカプシドを有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、および／または質量分析（ＭＳ）、および／またはタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、ＮａｎｏＦｌｅｘ ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラムおよびＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。ＭＳデータは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富なまだ配列決定されていない前駆体イオンを動的に選択する。シーケンシングは、予測自動増加制御で決定された１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行われ、４ ｍ／ｚのウィンドウで前駆体の単離を行った。ｍ／ｚ ２００で１２０，０００の解像度で、調査スキャンを取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が５０ｍｓ、正規化された衝突エネルギーが３０のｍ／ｚ２００で３０，０００に設定され得る。Ｓ－レンズＲＦレベルを５０に設定して、消化物からのペプチドが占めるｍ／ｚ領域の透過率を最適化できる。前駆体イオンは、単一、割り当てられていない、または断片化選択から６つ以上の電荷状態で除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、取得したデータの分析に使用され得る。ペプチドマッピングのために、固定変更としてカルバミドメチル化が設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド、およびリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルに対する信頼レベル０．８を使用して検索を行う。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４ Ｄａ（－ＯＨおよび－ＮＨ２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化および天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定される。考えられる脱アミド化部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている等張種は、単一のピークで共移行し得る。したがって、複数の潜在的脱アミド部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の脱アミド部位を特定または区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位において独立していることを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０などの四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、またはＯｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎまたはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムとしては、例えば、ＷａｔｅｒｓまたはＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００または１２００シリーズ）からのＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムが含まれる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＰｉｎｐｏｉｎｔおよびＰｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ （Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が含まれ得る。さらに他の技法は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ． Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ． ２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。
脱アミド化に加えて、他の修飾が生じても、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、または酸化を含み得る。
脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対のグリシンを変更し、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、またはアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギンが、アミド基を含む）、および／またはアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが、アミン基を含む）に変更される。本明細書で使用される場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン、および／またはプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、または３つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つすべてでは行われない。したがって、ＡＡＶおよび／または操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法は、より低い脱アミド率を有する。加えて、または代替え的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、ＡＡＶの脱アミド化を低減し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異体ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニンまたはセリンに変化するように、アスパラギン－グリシン対における変異を含む。変異ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む１つ、２つ、または３つの変異を含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む１つ、２つ、３つ、または４つのかかる変異を含み得る。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、変異を含む２つの異なるＮＧ対であり、ＡＡＶカプシド中の構造的に別個の位置に位置する。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異の１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意選択的に、変異ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に修飾を含まないが、ＮＧ対の外側に位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミン中の脱アミド化を最小化または排除するための変異を含む。
特定の実施形態では、野生型ＡＡＶカプシド中のＮＧの１つ以上を排除するＡＡＶカプシドを操作することを含む、ｒＡＡＶの効力を増加させる方法が提供される。特定の実施形態では、「ＮＧ」の「Ｇ」のコード配列は、別のアミノ酸をコードするように操作される。以下の特定の例では、「Ｓ」または「Ａ」が置換される。しかしながら、他の好適なアミノ酸コード配列が選択され得る。実施例１の表を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって７０％超の脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合、９０％超である。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、配列番号２の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、特定の亜集団は、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸の変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。配列番号３は、修飾ＡＡＶｈｕ６８カプシドのアミノ酸配列を提供し、ある割合の脱アミド化アミノ酸または別様に修飾されたアミノ酸を有し得る位置を例示する。これらおよび他の修飾の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。
他の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶの収率を増加させること、したがって、細胞溶解の前に、または細胞溶解を必要とせずに、上清中に存在するｒＡＡＶの量を増加させることを伴う。この方法は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸番号を有する整列に基づいて、ＡＡＶ ＶＰ１カプシド遺伝子を操作して、６７位でＧｌｕ、１５７位でＶａｌ、または両方を有するカプシドタンパク質を発現させることを含む。他の実施形態では、本方法は、ＶＰ２カプシド遺伝子を操作して、１５７位にＶａｌを有するカプシドタンパク質を発現することを伴う。さらに他の実施形態では、ｒＡＡＶは、６７位にＧｌｕおよび１５７位にＶａｌの、ｖｐ１およびｖｐ２カプシドタンパク質の両方を含む修飾カプシドを有する。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質からなる自己集合ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は、典型的には、配列番号２３の核酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現され、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４のｖｐ１アミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一、または配列番号２０と９９％同一のアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。また、ＵＳ７９０６１１１およびＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。本明細書で使用される「ＡＡＶ９バリアント」には、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、およびＵＳ８，７３４，８０９に記載のバリアントが含まれる。
カプシド、したがってコード配列を生成する方法、およびｒＡＡＶを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００ （１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてヌクレオチド配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、またはそのオープンリーディングフレーム、または少なくとも１５ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」という用語は、最大限対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、望ましくは、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列またはその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、アミノ酸またはその断片に言及する場合、適切なアミノ酸の挿入または欠失を伴って別のアミノ酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてアミノ酸配列の同一性があることを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、もしくはそのタンパク質、例えば、ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または少なくとも８アミノ酸長であるそれらの断片、もしくはより好ましくは、少なくとも１５アミノ酸長にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％超の同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いることによって、当業者によって容易に決定される。
一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列した」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損または追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。実施例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶ整列を行う。整列は、公共のまたは市販のいずれかの様々な多重配列整列プログラムを用いて行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および検索配列（ｓｅａｒｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）と共に使用して決定することができる。「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたは整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
ＩＩＩ．ｒＡＡＶ
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子送達に好適なビヒクルとして記載されている。典型的には、ｒＡＡＶによる送達のための導入遺伝子（例えば、ＧＬＢ１遺伝子）を含む外因性発現カセットは、天然ＡＡＶ源由来の機能的ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を置き換え、複製不能なベクターをもたらす。これらｒｅｐおよびｃａｐの機能は、ベクター産生システム中にトランスで提供されるが、最終ｒＡＡＶ中には存在しない。
上に示されるように、ＡＡＶカプシドおよびベクターゲノムを有するｒＡＡＶが提供され、少なくとも、ベクターゲノムをカプシドにパッケージングするのに必要なＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＧＬＢ１遺伝子、およびそのための発現を導く調節配列を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８由来である。本明細書の実施例は、一本鎖ＡＡＶベクターゲノムを利用するが、特定の実施形態では、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターゲノムを含むｒＡＡＶが本発明に利用され得る。
必要な調節制御要素は、ｒＡＡＶを取り込む細胞中でその転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で遺伝子（例えば、ＧＬＢ１）と作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡ、自己切断リンカー（例えば、フーリン、フーリン－Ｆ２Ａ、ＩＲＥＳ）のうちの１つ以上を含む。以下の実施例は、ＧＬＢ１遺伝子の発現のために、ＣＢ７プロモーター（例えば、配列番号１０）、ＥＦ１ａプロモーター（例えば、配列番号１１）、またはヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター（例えば、配列番号９）を利用する。しかしながら、特定の実施形態では、他のプロモーター、または追加のプロモーターが選択され得る。
特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子に加えて、別の１つ以上の遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ配列が含まれ得る。かかる遺伝子産物は、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物であり得る。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡも含まれる。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３′非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通してそれらの活性を示す。これらの内因性発現ｍｉＲＮＡはヘアピン前駆体を形成し、その後、ｍｉＲＮＡ二本鎖に、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子に処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて、例えば、３′ＵＴＲ領域内の標的ｍＲＮＡの標的部位を特定する、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを誘導する。
ＡＡＶベクターゲノムは、典型的には、シス作用性５′および３′逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ “Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；ａｎｄ Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素が５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。Ｄ配列および末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られたｒＡＡＶは、シュードタイプであると称され得る。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。
特定の実施形態では、発現制御配列（調節配列）の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する追加的または代替的なプロモーター配列が含まれ得る。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい）、組織特異的プロモーター（例えば、ニューロン特異的プロモーターもしくはグリア細胞特異的プロモーター、またはＣＮＳ特異的プロモーター）、または生理学的手がかりに応答するプロモーターが、本明細書に記載のｒＡＡＶに利用され得る。プロモーター（複数可）は、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリβアクチンプロモーターから選択され得る。他の好適なプロモーターは、ＣＢ７プロモーターを含み得る。プロモーターに加えて、ベクターゲノムは、１つ以上の他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列（例えば、ＷＰＲＥ）、翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の適切なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、調節配列は、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離される。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリβアクチンイントロンをさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン（ＣＩ）であり、ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロンである。他の好適なイントロンとしては、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されるものなど、当該技術分野で既知のイントロンが含まれる。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。任意選択的、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６： ６０５－６１９）。特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、存在しない。
特定の実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ＧＬＢ１遺伝子－ポリＡ－３’ＩＴＲを含むベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来ではない。特定の実施形態では、２つ以上のプロモーターが存在する。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサーおよびイントロンが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン（ＣＩ）であり、ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロンである。特定の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０ポリＡ（すなわち、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリアデニル化（ＰｏｌｙＡ）シグナル）である。特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＣＢ７プロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＲＢＧポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＥＦ１ａプロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＳＶ４０ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＵｂＣプロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＳＶ４０ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号５を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％～約９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１３の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％～約９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１４の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％～約９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１５の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％～約９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１６の配列、またはそれと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％～約９９．９％同一の配列を有する。
ＩＶ．ｒＡＡＶベクターの産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、ベクターゲノムは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミドに担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製およびパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術およびパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ／または当業者によって容易に設計することができる。例示的な産生プロセスは、図１２Ａ～１２Ｂに提供される。
ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成および単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ： Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、および以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、遺伝子を含む核酸分子と同じ構築物においてシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージ細胞も作製することができる。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
用語「ＡＡＶ中間体」または「ＡＡＶベクター中間体」は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含まないか、または遺伝子産物（例えばβ－ｇａｌ）の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、目的の遺伝子を宿主細胞に導入するために非機能的である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１または本明細書に記載される組成物は、ＡＡＶ中間体を少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の含まない、すなわち、ＡＡＶ中間体が２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．１％未満であってもよい。
本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を使用して生成され得る。例えば、 ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；ＵＳ７５８８７７２ Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる発現カセット、ならびに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、およびｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
一実施形態では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶｈｕ６８など）を産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノム、および細胞（例えば、必要としている患者の細胞）で遺伝子の発現を導く調節配列と作動可能に連結されたＧＬＢ１遺伝子、ならびに組換えＡＡＶカプシドへのベクターゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけヒト胚性腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えば、ヨトウガＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞）で構成される。特定の実施形態では、バキュロウイルスは、組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド中にベクターゲノムをパッケージングするのに必要なヘルパー機能を提供する。
任意選択的に、ｒｅｐ機能は、カプシド源ＡＡＶ ＡＡＶｈｕ６８以外のＡＡＶによって提供される。特定の実施形態では、ｒｅｐ機能の少なくとも一部は、ＡＡＶｈｕ６８由来である。別の実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶｈｕ６８以外の異種ｒｅｐタンパク質であり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質、またはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、およびｒｅｐ４０／５２、またはそれらの断片、あるいは別の供給源であり得る。これらのＡＡＶｈｕ６８または変異体ＡＡＶカプシド配列のうちのいずれかは、宿主細胞でそれらの発現を導く外因性調節制御配列の制御下にあり得る。
一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物（例えば、ＨＥＫ２９３またはＳｆ９）または懸濁液で製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの産生、ベクターの産生、およびベクターの精製を含む。一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ｒＡＡＶであり、産生されたプラスミドは、目的の遺伝子を含むＡＡＶベクターゲノムをコードするシス－プラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター産生プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡを用いた細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ベクター含有細胞および培養培地の回収などの方法工程を含むことができる。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。さらに別のシステムでは、遺伝子治療ベクターは、バキュロウイルスベースベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらおよび他のＡＡＶ生産システムの製造および使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、および７，４３９，０６５。
粗細胞回収物は、その後、ｒＡＡＶ回収物の濃縮、ｒＡＡＶ回収物の透析濾過、ｒＡＡＶ回収物の顕微溶液化、ｒＡＡＶ回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過によるバッファー交換、および／またはバルクｒＡＡＶを調製するための製剤化および濾過などの方法工程に供される。
２工程の高塩濃度でのアフィニティークロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ｒＡＡＶ製剤を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願されたＷＯ２０１７／１６０３６０、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号、およびその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特出願第許第６２／３２２，０７１号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」という名称の同第６２／２２６，３５７号により詳細に記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
空のおよび完全粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配－精製された調製物、ここで（ＧＣ）＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた直線等式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して、試験物質ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、負荷した２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算して、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空のｐｔ／ｍＬを与える。空のｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで除算して、次いで、ｘ１００をすることにより、空の粒子のパーセンテージを得る。
一般に、空のカプシドおよびパッケージされたゲノムを含むｒＡＡＶ粒子のためのアッセイ方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０；Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、方法は、例えば、緩衝液中３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含有する勾配ゲルなどの３つのカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供すること、次いで、試料材料が分離するまでゲルをランさせること、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレン、好ましくは、ナイロンにゲルをブロットすることを含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する一次抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次および二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または発色変化を検出可能な検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、カラムフラクションからの試料が、採集され、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥロード用緩衝液中で加熱され、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）上で分解される。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅＩ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ｒＡＡＶ中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを使用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。
一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテアーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理工程は、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
追加的に、または代替的には、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ． Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ， Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５． ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
簡潔に言うと、パッケージされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８粒子をゲノム欠損ＡＡＶｈｕ６８中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８カプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィーに供することを含み、ＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８中間体は、約１０．２のｐＨで平衡化された強力なアニオン交換樹脂に結合され、約２６０ナノメートル（ｎｍ）および約２８０ｎｍで紫外吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｒＡＡＶｈｕ６８にはあまり最適ではないが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶｈｕ６８完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティークロマトグラフィー工程のために、透析濾過された産物を、ＡＡＶ２／ｈｕ６８血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティー樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉する。
また、産生ベクター（プラスミドなど）、または本明細書に記載されるベクターゲノムおよび／もしくはｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を産生するための宿主細胞も、本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを生成および／またはパッケージングするために、ベクターゲノムを宿主細胞に運ぶ産生ベクター。
ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）は、好適な生理学的に適合性の組成物（例えば、緩衝生理食塩水）中に懸濁される。この組成物は、保管のために凍結され、後に解凍され、任意選択的に、好適な希釈剤で希釈され得る。あるいは、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、凍結および解凍ステップを進めることなく患者への送達に好適な組成物として調製され得る。
Ｖ．組成物および使用
本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶストック（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８ストックまたは変異体ｒＡＡＶｈｕ６８ストック）および任意選択的な担体、賦形剤および／または防腐剤を含む組成物を提供する。ｒＡＡＶストックは、同じである複数のｒＡＡＶを指し、例えば、濃度および用量単位の考察において以下に記載される量である。
特に、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療用である。一実施形態では、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者、または１８ヶ月齢以下の乳児ガングリオシドーシスを有する患者への投与に好適である。一実施形態では、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの症状を改善するために、またはＧＭ１ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善するために、それを必要とする患者への投与に好適である。一部の実施形態では、組成物は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療のための薬剤の製造に使用するためのものである。
本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１および薬学的に許容される担体を含む組成物が本明細書に提供される。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。
特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１および送達ビヒクルを含む組成物が本明細書に提供される。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶ送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。
一実施形態では、組成物は、対象／患者への送達に好適な最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨおよび塩濃度に緩衝された水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。
好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字ｘ１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字ｘ１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。一実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｗ／ｗ％、重量比に基づく）の量で存在し得る。別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｖ／ｖ％、体積比に基づく）の量で存在し得る。さらに別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し、ここで、ｎ％は、懸濁液１００ｍＬ当たりのｎグラムを示す。
ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは医学分野の当業者によって決定され得る。従来のおよび薬学的に許容される投与経路には、限定されないが、所望の臓器（例えば、脳、ＣＳＦ，肝臓（任意選択的に、肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、実質内、髄腔内、ＩＣＭ、腰椎穿刺、および他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の治療有効なヒト投与量は、概して、約１×１０９～１×１０１６ベクターゲノムコピーの濃度を含有する約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの溶液の範囲である。特定の実施形態では、約１ｍＬ～約１５ｍＬ、または約２．５ｍＬ～約１０ｍＬ、または約５ｍＬ懸濁液の体積が送達される。特定の実施形態では、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ｍＬの懸濁液の体積が送達される。
一部の実施形態では、組成物は、単回用量での投与用である。一部の実施形態では、組成物は、複数回投与用である。
特定の実施形態では、患者当たり約８ｘ１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～患者当たり約３ｘ１０１４ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量が、本明細書に記載の体積で投与される。特定の実施形態では、患者当たり約２ｘ１０１２ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～患者当たり約３ｘ１０１４ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、または患者当たり約２ｘ１０１３ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～患者当たり約３ｘ１０１４ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、または患者当たり約８ｘ１０１３ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１～患者当たり約３ｘ１０１４ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、または患者当たり約９ｘ１０１３ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、または合計約８．９ｘ１０１２～２．７ｘ１０１４ＧＣの用量の体積で投与される。
特定の実施形態では、脳質量１グラム当たり１ｘ１０１０ＧＣのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（ＧＣ／ｇ脳質量）～３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が、本明細書に記載される体積で投与される。特定の実施形態では、３．４ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、または１．０ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量～３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、または約１．１ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、または約１．１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が、体積で投与される。特定の実施形態では、脳質量１グラム当たり約３．０ｘ１０９、約４．０ｘ１０９、約５．０ｘ１０９、約６．０ｘ１０９、約７．０ｘ１０９、約８．０ｘ１０９、約９．０ｘ１０９、約１．０ｘ１０１０、約１．１ｘ１０１０、約１．５ｘ１０１０、約２．０ｘ１０１０、約２．５ｘ１０１０、約３．０ｘ１０１０、約３．３ｘ１０１０、約３．５ｘ１０１０、約４．０ｘ１０１０、約４．５ｘ１０１０、約５．０ｘ１０１０、約５．５ｘ１０１０、約６．０ｘ１０１０、約６．５ｘ１０１０、約７．０ｘ１０１０、約７．５ｘ１０１０、約８．０ｘ１０１０、約８．５ｘ１０１０、約９．０ｘ１０１０、約９．５ｘ１０１０、約１．０ｘ１０１１、約１．１ｘ１０１１、約１．５ｘ１０１１、約２．０ｘ１０１１、約２．５ｘ１０１１、約３．０ｘ１０１１、約３．３ｘ１０１１、約３．５ｘ１０１１、約４．０ｘ１０１１、約４．５ｘ１０１１、約５．０ｘ１０１１、約５．５ｘ１０１１、約６．０ｘ１０１１、約６．５ｘ１０１１、約７．０ｘ１０１１、約７．５ｘ１０１１、約８．０ｘ１０１１、約８．５ｘ１０１１、約９．０ｘ１０１１ＧＣの用量が、体積で投与される。特定の実施形態では、用量は、ＧＭ１動物モデルで示された最小有効用量を反映し、脳質量１グラム当たりのゲノムコピーに基づいて、ヒト患者で使用するために調整された。一実施形態では、ヒト患者で使用するための用量は、以下の表に列挙される想定脳質量を使用して計算される。
Figure 2022512589000004
任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、かかる投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１が利用されるための治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子産物（例えばβ－ｇａｌ）の発現のレベルをモニタリングして、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１、好ましくはミニ遺伝子（例えば、ＧＬＢ１遺伝子）を含有するｒＡＡＶをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されるものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫に利用され得る。
複製欠陥ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者にとって、約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルス（例えば、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１，ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１またはｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１）を含み、その範囲内の全ての整数または小数量、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣを含むことができる。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、または９ｘ１０９ ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０、または９ｘ１０１０ ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０１１、２ｘ１０１１、３ｘ１０１１、４ｘ１０１１、５ｘ１０１１、６ｘ１０１１、７ｘ１０１１、８ｘ１０１１、または９ｘ１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０１２、２ｘ１０１２、３ｘ１０１２、４ｘ１０１２、５ｘ１０１２、６ｘ１０１２、７ｘ１０１２、８ｘ１０１２、または９ｘ１０１２ ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０１３、２ｘ１０１３、３ｘ１０１３、４ｘ１０１３、５ｘ１０１３、６ｘ１０１３、７ｘ１０１３、８ｘ１０１３、または９ｘ１０１３ ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０１４、２ｘ１０１４、３ｘ１０１４、４ｘ１０１４、５ｘ１０１４、６ｘ１０１４、７ｘ１０１４、８ｘ１０１４、または９ｘ１０１４ ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１ｘ１０１５、２ｘ１０１５、３ｘ１０１５、４ｘ１０１５、５ｘ１０１５、６ｘ１０１５、７ｘ１０１５、８ｘ１０１５、または９ｘ１０１５ ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内の全ての整数または分数量を含む、用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。
これらの上記用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の様々な容量の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤、またはその範囲内のすべての数を含むより高い容量で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、または緩衝液の容量は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３００μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬ～１０００μＬである。
特定の実施形態では、用量は、約１ｘ１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約１ｘ１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約３ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約１．８５ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。
一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約１×１０９ＧＣ～約１×１０１５、または約１×１０１１～５×１０１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量の送達に適切な容量および濃度は、当業者により決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人のために選択され得る。典型的に、新生児幼児のために、適切な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年齢の高い乳幼児のためには、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの容量が選択され得る。プレティーンおよびティーン世代のために、最大約５０ｍＬの容量が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の適切な容量および投薬量が決定され得る。任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１が利用されるための治療用途に応じて変化し得る。
上述のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性のある塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．０～７．５、またはｐＨ６．２～７．７、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８、または約ｐＨ７．０の範囲に調整される。特定の実施形態では、製剤は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、または約７．８のｐＨに調整される。特定の実施形態では、髄腔内送達の場合、約７．２８～約７．３２、約６．０～約７．５、約６．２～約７．７、約７．５～約７．８、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、または約７．８のｐＨが望ましいが、静脈内送達の場合、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。
別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と共に製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤のうちから選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８（商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８としても知られている）などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ－オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字ｘ１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字ｘ１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。
一実施例では、製剤は、例えば、水中に、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達のためには、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０ミリオスモル／リットル（ｍＯｓｍ／Ｌ））である。例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／－ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達のために、商業的に入手可能な希釈剤は、懸濁化剤として使用され得るか、または別の懸濁化剤および他の任意の賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、ＥｌｌｉｏｔｔｓＢ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。各１０ｍＬのＥｌｌｉｏｔｔｓＢ溶液には以下が含まれる：
塩化ナトリウム、ＵＳＰ ７３ｍｇ
重炭酸ナトリウム、ＵＳＰ １９ｍｇ
デキストロース、ＵＳＰ ８ｍｇ
硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ ３ｍｇ
塩化カリウム、ＵＳＰ ３ｍｇ
塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ ２ｍｇ
リン酸ナトリウム、二塩基性・７Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ ２ｍｇ
水（注入用）、ＵＳＰ １０ｍＬ適量
電解質の濃度：
ナトリウム １４９ｍＥｑ／リットル
重炭酸 ２２．６ｍＥｑ／Ｌ
カリウム ４．０ｍＥｑ／リットル
塩素 １３２ｍＥｑ／リットル
カルシウム ２．７ｍＥｑ／リットル
硫酸 ２．４ｍＥｑ／リットル
マグネシウム ２．４ｍＥｑ／リットル
リン酸 １．５ｍＥｑ／リットル
成分の式および分子量は、
Figure 2022512589000005
Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ溶液のｐＨは６～７．５であり、モル浸透圧濃度は、１リットル当たり２８８ｍＯｓｍｏｌである（計算値）。
特定の実施形態では、髄腔内最終製剤緩衝液（ＩＴＦＦＢ）製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上を含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％を含む。さらなる実施形態では、パーセンテージ（％）は、重量（ｗ）比（すなわち、ｗ／ｗ）に基づいて計算される。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１（例えば、ＩＴＦＦＢ製剤）を含有する組成物は、ｐＨが、６．０～７．５、または６．２～７．７、または６．８～８、または７．２～７．８、または７．５～８の範囲にある。特定の実施形態では、最終製剤は、ｐＨが、約７、または７～７．４、または７．２である。特定の実施形態では、髄腔内送達の場合、ｐＨが、７．５超、例えば、７．５～８、または７．８が望ましい可能性がある。
特定の実施形態では、髄腔内送達ならびに他の送達経路には、約７のｐＨが望ましい。
特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む。水溶液は、以前はＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていたＢＡＳＦから市販されているポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、水溶液は、７．２のｐＨを有し得る。特定の実施形態では、水溶液は、約７のｐＨを有し得る。
別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、および０．００１％のポロキサマー（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標））１８８を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。特定の実施形態では、製剤は、約７．２のｐＨを有する。特定の実施形態では、製剤は、約７のｐＨを有する。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌ．を参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液は、ハーバード緩衝液でより良好なｐＨ安定性が観察されるため、好ましい。以下の表は、ハーバードの緩衝液とエリオットＢ緩衝液の比較を提供する。
Figure 2022512589000006
特定の実施形態では、製剤緩衝液は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む人工ＣＳＦである。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡを含み得る。
任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（複数可）に加えて、防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の薬学的成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
本発明による組成物は、上記に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載される組成物は、有効量の薬学的に好適な担体に懸濁された、および／または注入、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別のデバイスもしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された１つ以上のＡＡＶを含む。一実施例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化される。一実施形態では、組成物は、大槽内注入（ＩＣＭ）を介した投与用に製剤化される。一実施形態では、組成物は、大槽内へのＣＴガイドの後頭下注入を介した投与用に製剤化される。
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注入による、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。
本明細書で使用される場合、「槽内送達」または「槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、または大槽内への直接的な注入による、永久的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。
特定の実施形態では、製剤緩衝液および本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１）を含む水性組成物が、それを必要とする患者に送達される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶｈｕ６８カプシド）および５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ＧＬＢ１遺伝子－ポリＡ－３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを有する。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来ではない。特定の実施形態では、２つ以上のプロモーターが存在する。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサーおよびイントロンが存在する。特定の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０ポリＡである。特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギβ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＣＢ７プロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＲＢＧポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＥＦ１ａプロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＳＶ４０ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＵｂＣプロモーター－ＧＬＢ１遺伝子－ＳＶ４０ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号５を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号６を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号７を有する。特定の実施形態では、ＧＬＢ１遺伝子は、配列番号８を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１３の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１４の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１５の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１６の配列を有する。
特定の実施形態では、最終製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％である。特定の実施形態では、界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である。特定の実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８は、懸濁液の約０．０００１％の量で存在する。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内送達の場合、ｐＨが７．５～７．８の範囲である。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内送達の場合、ｐＨが、６．２～７．７、もしくは６．９～７．５の範囲、または約７である。一実施形態では、パーセンテージ（％）は、重量比または体積比に基づいて計算される。別の実施形態では、パーセンテージは、「最終体積１００ｍｌ当たりのグラム数」を表す。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の治療は、感覚神経毒性および無症状性感覚ニューロン病変に関して良好な耐容される、動物および／またはヒト患者におけるＤＲＧ感覚ニューロンの最小～軽度の無症状変性を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、治療される対象／患者の機能的転帰および臨床転帰の改善に有用である。かかる転帰は、組成物の投与後、約３０日、約６０日、約９０日、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２．５年、約３年、約３．５年、約４年、約４．５年で測定されてもよく、次いで毎年、約５年まで測定されてもよい。測定頻度は、約１か月毎、約２か月毎、約３か月毎、約４か月毎、約５か月毎、約６か月毎、約７か月毎、約８か月毎、約９か月毎、約１０か月毎、約１１か月毎、または約１２か月毎であり得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、未治療の対照と比較して、治療された対象において測定される薬物動態および臨床有効性を示す。
特定の実施形態では、薬物動態の有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、以下のうちの１つ以上を介して測定され得る：（１）生存、（２）栄養管の非依存性性、（３）発作日記、例えば発作の発生率、発症、頻度、長さ、および発作の種類、（４）生活の質、例えばＰｅｄｓＱＬによって測定される、（５）神経認知および行動発達、（６）例えば血清またはＣＳＦにおけるβ－ｇａｌ酵素発現または活性、ならびに（７）本明細書に記載される他のパラメータ。乳児発達のベイリー尺度（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）およびヴァインランド尺度（Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ｓｃａｌｅｓ）は、組成物が、適応行動、認知、言語、運動機能、および健康に関連する生活の質における発達および／または変化に及ぼす影響を定量化するために使用され得る。
特定の実施形態では、神経認知発達は、以下のうちの１つ以上に基づく：乳幼児発達のベイリー尺度（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の年齢等価認知、粗大運動、微細運動、受容的および表現的コミュニケーションのスコアの変化、ヴァインランドの適応行動尺度（Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ）の各ドメインの標準スコアの変化、ならびに小児の生活の質調査（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ、ＰｅｄｓＱＬ）および小児の生活の質調査の乳児尺度（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｉｎｆａｎｔ Ｓｃａｌｅ、ＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ）の総スコアの変化による小児の生活の質。
ＢＳＩＤ（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、乳児発達のベイリー尺度）：主に、１～４２ヶ月齢の乳幼児の発達を評価するために使用される（Ａｌｂｅｒｓ ａｎｄ Ｇｒｉｅｖｅ，２００７，Ｔｅｓｔ Ｒｅｖｉｅｗ： Ｂａｙｌｅｙ，Ｎ．（２００６）．Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ－ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ： Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｏｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．２５（２）：１８０－１９０）。これは、標準化された一連の発達遊びタスクで構成され、うまく完了したアイテムの素のスコアを、スコアと複合スコアに変換し、スコアを、典型的には同じ年齢の発達している子供から得られた標準と比較することによって、発達指数を導き出す。Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩには、３つの主なサブテストがある：認知尺度には、見慣れているオブジェクトと見慣れていないオブジェクトへの注意、落ちているオブジェクトを探すこと、遊んでいるふりをすることなどの項目が含まれる。言語尺度には、言語の理解と表現を評価する（例えば、方向に従う能力とオブジェクトに名前を付ける能力）。および運動尺度には、粗大運動スキルと微細運動スキル（例えば、掴むこと、座ること、ブロックを積み重ねること、階段を登ること）を測定する。最新バージョンはＢＳＩＤ－ＩＩＩである。
ヴァインランド（Ｖｉｎｅｌａｎｄ）：コミュニケーション、日常生活スキル、社会化、運動スキル、不適応行動の５つの領域にわたって、誕生から成人（０～９０歳）までの適応行動を評価する。最新バージョンはＶｉｎｅｌａｎｄ ＩＩＩである。Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩからＶｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩへの改善には、発達障害をよりよく理解するための質問が組み込まれている。
ＢＳＩＤおよびＶｉｎｅｌａｎｄは、乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス患者の前向き研究のみからのデータに基づいて選択される（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ－Ｐｉｅｒｒｉ ａｎｄ Ｓｃａｇｌｉａ，２００８，ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ： Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．９４（４）：３９１－３９６．）。ＢＳＩＤ－ＩＩＩの年齢等価スコアは、認知および粗大運動のドメインの両方について２８ヶ月齢までに試験尺度の床への低下を示し、Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩ適応行動尺度のスコアは、２８ヶ月齢までには、正常をはるかに下回るものの、測定可能なままであった。これらのツールは床効果（ｆｌｏｏｒ ｅｆｆｅｃｔ）を示しているが、この重度の障害のある集団の発達変化を測定するための適切な尺度であることが示され、尺度の交差文化的妥当性により、国際的な研究に適している。
ＰｅｄｓＱＯＬおよびＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ：重度の小児疾患の場合と同様に、疾患の家族への負担は著しい。小児の生活の質調査（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（商標））は、子供とその親の生活の質を評価するための検証されたツールである（親の代理人レポートによる）。これは、健康な子供と青少年で検証され、様々な小児疾患で使用されてきた（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｔｈｅ ＰｅｄｓＱＬ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ：ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｖａｌｉｄｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｍｏｄｕｌｅ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ： ＮＭＤ．１９（１２）：８０５－８１２、Ａｂｓｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ ＵＫ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ （ＰＵＤＤＬＳ）．”ＢＭＣ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１１（１）：６８、およびＣｏｎｓｏｌａｒｏ ａｎｄ Ｒａｖｅｌｌｉ， ２０１６，ｈａｐｔｅｒ ５－Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｒ．Ｃｉｍａｚ ａｎｄ Ｔ．Ｌｅｈｍａｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．１１：１０７－１２７）。したがって、ＰｅｄｓＱＬは、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１が患者およびその家族の生活の質に及ぼす影響を評価するために含まれている。これは、２歳以上の子供の親に適用することができ、したがって、５年間のフォローアップ期間にわたる子供の年齢として有益であり得る。小児の生活の質調査の乳児尺度（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｉｎｆａｎｔ Ｓｃａｌｅ（商標））（Ｖａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１１，”Ｔｈｅ ＰｅｄｓＱＬ（商標）Ｉｎｆａｎｔ Ｓｃａｌｅｓ：ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｖａｌｉｄｉｔｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ ｉｌｌ ｉｎｆａｎｔｓ．”Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０（１）：４５－５５．）は、親によって記入された検証済みモジュラー手段であり、特に１～２４ヶ月齢の健康な乳児および病気の乳児のための健康関連の生活の質の手段を測定するように設計されている。
標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録によって運動スキルが達成したか、他の運動マイルストーンを発達させてその後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の兆しがまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成された年齢と失なわれた年齢を追跡する。運動マイルストーン達成は、第Ｉ節のＧＭ１および治療用ＧＬＢ１遺伝子の下で本明細書に提供される表に概説されるＷＨＯ基準に基づいて、６つの粗大マイルストーンについて定義される。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象は、生後数ヶ月以内に症状を発症する可能性があり、第１のＷＨＯ運動マイルストーン（支えなしで座ること）の獲得は、典型的には、４ヶ月齢より前には現れないことを考慮すると（中央値：５．９ヶ月齢）、このエンドポイントは、特に治療時により明らかな症状を有していた対象において、治療的利益の程度を評価するための感度を欠く場合がある。このため、乳児に適用され得る年齢に適した発達マイルストーンの評価も含まれる（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｖ．３７（１）：２５－３７；ｑｕｉｚ ３８，４７．）。１つの欠点は、公開されたツールは、臨床医および保護者が使用することを意図しており、通常の範囲を参照せずにマイルストーン獲得の典型的な年齢を中心としたスキルを整理することである。しかしながら、データは、乳児ＧＭ１疾患を有する未治療の子供または定型発達の子供における典型的な獲得時間と比較して、経時的な発達マイルストーンの保持、獲得、または喪失を要約するために有益であり得る。
疾患が進行すると、子供は発作を起こす可能性がある。発作活動の開始により、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１による治療が、発作の発症を予防もしくは遅延させるか、またはこの集団における発作事象の頻度を減少させるかのいずれかを決定することが可能になる。保護者は、発作の発症、頻度、長さ、および種類を追跡する、発作日記をつけるように求められる。
また、特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、疾患のＣＮＳ症状、例えば、経時的にＭＲＩで測定される体積変化を含んでもよい。すべてのガングリオシドーシスの乳児の表現型は、脳組織体積（大脳皮質および他のより小構造）および脳室体積の両方で、巨頭症および頭蓋内ＭＲＩ体積の急速な増加と一貫したパターンを有することが示された。加えて、脳梁、尾状核、および被殻、ならびに小脳皮質を含む様々な小さな脳の下部構造は、疾患の進行に伴って一般的にサイズが減少する（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｓ、およびＮｅｓｔｒａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８、本明細書で引用）。ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１による治療は、ＣＮＳ疾患の症状の進行を遅らせるか、または停止させることができ、萎縮および体積変化における安定化の証拠を伴う。視床および基底核におけるＴ１／Ｔ２シグナル強度の変化（正常／異常）は、ＧＭ１およびＧＭ２ガングリオシドーシス患者における視床構造の変化に関する報告された証拠に基づいて、含まれることもある（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｋａｓｈｉｍａ，１９９４，Ｔｈａｌａｍｉｃ ｈｙｐｅｒｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ＣＴ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．”Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１６（６）：４７２－４７４）。特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、ＭＲＩによって測定される総脳体積、脳下部構造体積、および側室体積の変化、ならびに／または視床および基底核の活性におけるＴ１／Ｔ２シグナル強度の変化を含み得る。
代替的に、または追加的に、薬力学的有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、バイオマーカー、例えば、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の薬力学および生物学的活性、ＣＳＦおよび血清中で測定され得るβ－ｇａｌ酵素（ＧＬＢ１）活性、ＣＳＦ ＧＭ１濃度、血清および尿のケラタン硫酸レベル、ヘキソサミニダーゼ活性の低下、ならびに乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスにおいて一貫した急速な萎縮を示す脳ＭＲＩを含み得るＲｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ、本明細書で引用）。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、疾患の進行を遅らせるのに有用であり、例えば、達成時の年齢、喪失時の年齢、ならびに（世界保健機関（ＷＨＯ）基準によって定義される）年齢に適した発達および運動のマイルストーンを維持または獲得する子供の割合によって評価される。
特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、肝臓および脾臓体積、ならびに／または脳波（ＥＥＧ）および視覚誘発電位（ＶＥＰ）を含み得る。
ＶＩ．脳脊髄液中への医薬組成物の送達のための装置および方法
一態様では、本明細書に提供されるｒＡＡＶまたは組成物は、この節で提供され、かつＷＯ２０１８／１６０５８２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法および／またはデバイスを介して髄腔内投与され得る。代替的には、他のデバイスおよび方法が選択され得る。
特定の実施形態では、本方法は、脊椎針を介する患者の大槽内へのＣＴガイドの後頭下注入の工程を含む。本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、コンピュータによって軸に沿って作成される一連の平面断面画像から、身体構造の３次元画像が構築される放射線撮影を指す。
処置日に、適切な濃度のｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を調製する。適切な濃度で５．６ｍＬのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を含有するシリンジを、処置室に送達する。治験薬投与には、以下の担当者が同席する：処置を行う介入医、麻酔科医および呼吸器技師（複数可）、看護師および医師助手、ＣＴ（または手術室）技師、施設研究コーディネーター。薬物投与の前に、腰椎穿刺を実施して、所定の体積のＣＳＦを除去し、次いで、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助するために、ヨード造影剤を髄腔内（ＩＴ）に注入する。静脈内（ＩＶ）造影剤は、髄腔内造影剤の代替物として、針穿刺の前またはその間に投与され得る。ＩＶまたはＩＴ造影剤を使用するかどうかは、介入医の判断に委ねられる。対象は、麻酔され、挿管され、処置テーブルに配置される。滅菌技術を使用して、注入部位を準備し、覆布をかける。透視ガイダンス下、脊髄針（２２～２５Ｇ）を大槽内に進める。針の配置を補助するために、より大きな誘導針を使用してもよい。針の配置を確認した後、エクステンションセットを脊椎針に取り付け、ＣＳＦで充填する。介入医の裁量で、造影剤を含有するシリンジを、エクステンションセットに接続してもよく、少量注入することで、大槽内に針が配置されていることを確認することができる。ＣＴガイダンス＋／－造影剤注入により針の配置を確認した後、５．６ｍＬのｒＡＡＶ．ＧＬＢ１を含むシリンジを、エクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を１～２分かけてゆっくりと注入し、５．０ｍＬの容量を送達する。注射針は、対象からゆっくりと取り出される。
本明細書に記載される髄腔内方法への追加的または代替的な投与経路は、例えば、全身、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む。
一実施形態では、用量は、脳質量によってスケールされ、ＣＳＦ区画のサイズの近似値を提供する。さらなる実施形態では、用量換算は、成体マウスでは０．４ｇ、幼若アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）では９０ｇ、および４～１８ヶ月齢の子供では８００ｇの脳質量に基づく。以下の表は、マウスＭＥＤ研究、ＮＨＰ毒性試験、および同等のヒト用量の例示的な用量を提供する。
Figure 2022512589000007
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１は、単回用量で対象に投与される。特定の実施形態では、複数回の用量（例えば、２用量）が所望され得る。例えば、６ヶ月齢未満の乳児の場合、数日、数週間、または数ヶ月間隔での複数回の用量が望ましい場合がある。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１ｘ１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約５ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量であり得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１ｘ１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約３ｘ１０１１ＧＣ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量は、約１ｘ１０１０ＧＣ／脳質量～約３．３３ｘ１０１１ＧＣ／脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量は、約１ｘ１０１１ＧＣ／脳質量～約３．３３ｘ１０１１ＧＣ／脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１．１１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約３．４ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１．０ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量～約３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１．１ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１．１１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量である。他の実施形態では、異なる用量が選択され得る。
好ましい実施形態では、対象は、ヒト患者である。この場合、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約１ｘ１０１２ＧＣ～約３ｘ１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約９ｘ１０１２ＧＣ～約３ｘ１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の用量は、約５ｘ１０１３ＧＣ～約３ｘ１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、約８．９０ｘ１０１３ＧＣ～約２．７０ｘ１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、患者当たり８ｘ１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）～患者当たり３ｘ１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、患者当たり２ｘ１０１３ＧＣ～患者当たり３ｘ１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、患者当たり８ｘ１０１３ＧＣ～患者当たり３ｘ１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、患者当たり約９ｘ１０１３ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１の単回用量は、少なくとも８．９０×１０１３ＧＣである。他の実施形態では、異なる用量が選択され得る。
組成物は、投薬量単位で製剤化され、約１×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）～約５×１０１４ＧＣの範囲にある量のＡＡＶを含み得る（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）。一部の実施形態では、組成物は、投薬単位で製剤化され、１×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）～５×１０１３ＧＣ、１×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）～５×１０１４ＧＣ、１×１０１１ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、１×１０１２ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、１×１０１３ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、８．９×１０１３ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、または８．９×１０１３ＧＣ～２．７×１０１４ＧＣの範囲の量のＡＡＶを含有する。特定の実施形態では、組成物は、用量単位で製剤化され、少なくとも１ｘ１０１３ＧＣ、２．７ｘ１０１３ＧＣ、または８．９ｘ１０１３ＧＣの量のＡＡＶを含有する。
一実施形態では、脊椎穿刺が行われ、約１５ｍＬ（以下）～約４０ｍＬのＣＳＦが除去され、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１がＣＳＦと混合され、かつ／または適合性の担体に懸濁され、対象に送達される。一実施例において、ｒＡＡＶ．ＧＬＢ１濃度は、１×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）～５×１０１４ＧＣ、１×１０１１ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、１×１０１２ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、１×１０１３ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、８．９×１０１３ＧＣ～５×１０１４ＧＣ、または８．９×１０１３ＧＣ～２．７×１０１４ＧＣであるが、他の量、例えば、約１×１０９ＧＣ、約５×１０９ＧＣ、約１×１０１０ＧＣ、約５×１０１０ＧＣ、約１×１０１１ＧＣ、約５×１０１１ＧＣ、約１×１０１２ＧＣ、約５×１０１２ＧＣ、約１．０×１０１３ＧＣ、約５×１０１３ＧＣ、約１×１０１４ＧＣ、または約５×１０１４ＧＣである。特定の実施形態では、ＧＣ中の濃度は、脊椎穿刺当たりのＧＣとして示される。特定の実施形態では、ＣＧ中の濃度は、ｍＬ当たりＧＣとして示される。
併用療法は、本明細書で提供されるｒＡＡＶ．ＧＬＢ１組成物と共に送達され得る。本出願で先に記載したような併用療法は、参照により本明細書に組み込まれる。
そのような併用療法の１つは、免疫調節剤であり得る。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子治療投与の前に開始され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物、（例えば、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上は、遺伝子治療剤の投与後、同じ用量または調整用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間、約１５日間、約３０日間、約４５日間、６０日間、またはそれ以上であり得る。
例えば、ＧＭ１において栄養が懸念される場合、胃瘻管の配置が適切である。呼吸機能が悪化すると、気管切開または非侵襲性呼吸補助が提供される。パワーチェアおよび他の機器は、生活の質を向上させることができる。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語句、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。
「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性または安定であり得る。
本明細書で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ， Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１９９（３）： ｐ．３８１－３９０に記載されているように測定され得る（参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、ＡＡＶまたは組成物の投与は、ＧＭ１ガングリオシドーシスの症状、またはＧＭ１ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善する。一部の実施形態では、処置後、患者は、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに／または神経認知発達の改善のうちの１つ以上を有する。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含み得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と互換的に使用され得る。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのかかる発現カセッは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、および本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。
タンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質または核酸が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない、２つ以上の配列または下位配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子からコーディング配列の発現を導くように配置された１つの遺伝子からのプロモーターを有する。したがって、コーディング配列に関しては、プロモーターは、異種性である。
「複製欠陥ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工ウイルス粒子を指し、目的の遺伝子（例えば、ＧＬＢ１）を含有する発現カセットを含むベクターゲノムは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージ（例えば、ＡＡＶまたはボカウイルス）された任意のウイルスゲノム配列は、複製欠陥である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、標的細胞においてベクターゲノム由来の遺伝子産物の量を送達および発現するｒＡＡＶ組成物の量を指す。有効量は、ヒト患者ではなく、動物モデルに基づいて決定され得る。好適なマウスまたはＮＨＰモデルの例は、本明細書に記載されている。
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「エンハンサー（ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、１つ以上のエンハンサー（複数可）を表すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
上述のように、「約」という用語は、別段の指定がない限り、数値を修正するために使用される場合、±１０％の変動を意味する。
上に記載したとおり、「増加」「減少」「低下」「改善」「向上」「遅延」「早期」「緩徐」「停止」またはその任意の文法的変形、または任意の類似の用語は、別途指定されない限り、対応する参照と比較して、約５倍、約２倍、約１倍、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％の変動（例えば、未治療の対照、対応するレベルのＧＭ１患者もしくはある段階でのＧＭ１患者、またはＧＭ１を有しない健常な対象もしくは健常なヒト）を意味する。
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」は、哺乳動物を指し、ヒト、獣医学用動物または農業用動物、家庭用動物または愛玩動物、ならびに通常臨床研究に使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、ヒトである。特定の実施形態では、患者は、ＧＭ１を有する。
本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されているもの、および本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供している公開文書への参照により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１：ＡＡＶｈｕ６８＋脱アミド化
ＡＡＶｈｕ６８を修飾について分析した。簡潔に、ＡＡＶｈｕ６８は、この研究に関連していないベクターゲノムを使用して産生され、各々は、２９３細胞における従来の三重トランスフェクション方法を使用して産生された。これらの技術の一般的な説明については、例えば、ｅｌｌ ＣＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＡＡＶ９ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｕｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１：２４２７－２４３５を参照されたい。簡潔には、例えば、ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接するパッケージ化される配列をコードするプラスミド（ニワトリβ－アクチンプロモーターから発現される導入遺伝子、イントロン、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリＡ）を、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドと、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄΔＦ６）とを用いたＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってパッケージした。得られたＡＡＶウイルス粒子は、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用して精製し、濃縮し、後で使用するために凍結することができる。
変性およびアルキル化：解凍したウイルス調製物（タンパク質溶液）１００μｇに、２μｌの１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）および２μｌの８Ｍ塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）を添加し、９０℃で１０分間インキュベートする。溶液を室温に冷却し、次いで、調製したばかりの１Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を５μｌ添加し、暗所で、室温で３０分間インキュベートする。３０分後、１μｌの１ＭのＤＴＴを添加することによって、アルキル化反応をクエンチする。
消化：最終ＧｎｄＨＣｌ濃度を８００ｍＭに希釈する量で、変性タンパク質溶液にｐＨ７．５～８の２０ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加する。トリプシン対タンパク質の比率が１：２０になるようにトリプシン溶液を加え、３７℃で一晩インキュベートする。消化後、ＴＦＡを最終濃度が０．５％になるように添加し、消化反応をクエンチした。
質量分析：約１マイクログラムの組み合わせた消化混合物を、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ／Ｍｓにより分析する。ＬＣは、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行われる。移動相Ａは、０．１％ギ酸を含むＭｉｌｌｉＱ水である。移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルである。１５分間にわたって４％Ｂから６％Ｂへ、次いで、２５分間（合計４０分間）で１０％Ｂへ、その後４６分間（合計８６分間）で３０％Ｂへと勾配を実行した。試料を直接カラムにロードする。カラムサイズは、７５ｃｍ×１５μｍの内径であり、２ミクロンのＣ１８媒体（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ）が充填される。ＬＣは、ソースを使用したＮａｎｏｆｌｅｘエレクトロスプレーイオン化を介して、四重極－オービトラップ質量分析器（Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインターフェースされる。カラムを３５℃に加熱し、２．２ｋＶのエレクトロスプレー電圧を印加する。質量分析器は、上位２０個のイオンからタンデム質量スペクトルを取得するようにプログラムされている。最大ＭＳ分解能は１２０，０００、ＭＳ／ＭＳ分解能は３０，０００。正規化された衝突エネルギーは３０、自動ゲイン制御は１ｅ５、最大充填ＭＳは１００ｍｓ、最大充填ＭＳ／ＭＳは５０ｍｓに設定されている。
データ処理：質量分析器の生データファイルをＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。簡潔には、すべての検索は、１０ｐｐｍの前駆体質量許容差（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、５ｐｐｍの断片質量許容差（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、トリプシン切断（ｔｒｙｐｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）、最大１個の未切断（ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）、システインアルキル化の固定修飾（ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、メチオニン／トリプトファンの酸化、アスパラギン／グルタミンの脱アミド化、リン酸化、メチル化、およびアミド化の可変修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を必要とした。
Figure 2022512589000008
Figure 2022512589000009
ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質の場合、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって７０％超の脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合９０％超である。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
したがって、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を含むＡＡＶは、ＡＡＶが異なるレベルの脱アミド化を示すＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を含有することができるため、カプシドタンパク質の異種集団を含み得る。様々なレベルの脱アミド化を有するＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質の異種集団は、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質であり得る。様々なレベルの脱アミド化を有するＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質の異種集団は、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、または配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質であり得る。様々なレベルの脱アミド化を有するＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団は、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質であり得る。
成体アカゲザルに、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（３．００ｘ１０１３ＧＣ）をＩＣＭ投与し、２８日後に剖検して、ベクターの形質導入を評価した。脳の広範な領域でＡＡＶｈｕ６８の形質導入が観察された（データは示さず）。したがって、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＣＮＳにおけるクロスコレクション（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）の可能性を提供する。
実施例２：製造－成分と材料
ベクターは、ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接するサイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７）［配列番号１０］、ヒト伸長開始因子１αプロモーター（ＥＦ１ａ）［配列番号１１］、またはヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）［配列番号９］（１２２９ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｄ６３７９１．１）］を有するニワトリβアクチンプロモーターから発現されるヒトＧＬＢ１のコード配列を含有するシスプラスミドから構築される。ヒトＧＬＢ１の様々なコード配列［配列番号４のａａ配列］が構築される。野生型配列は、配列番号５で再現される。様々な操作されたＧＬＢ１コード配列を生成し、配列番号６、７、または８に提供される。
ベクターは、接着性ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってＡＡＶ血清型ｈｕ６８カプシドにパッケージ化され、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ， Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１２５９－１２７１（２０１０）に先に記載されるように、ヨジキサノール勾配遠心分離によって精製される。ＡＡＶ血清型Ｈｕ６８カプシドは、ＷＯ２０１８／１６０５８２に記載される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、１）ＡＡＶシスベクターゲノムプラスミド、２）ＡＡＶ２レプリカーゼ（ｒｅｐ）およびＡＡＶｈｕ６８カプシド（ｃａｐ）をコードする、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲと称されるＡＡＶトランスプラスミド、３）ｐＡｄΔＦ６．ＫａｎＲと称されるヘルパーアデノウイルスプラスミド、によるヒトＨＥＫ２９３ ＷＣＢ細胞の三重トランスフェクションによって産生される
ＡＡＶシスベクターゲノムプラスミドの配列エレメントの説明：
・逆位末端反復（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ、ＩＴＲ）：ＩＴＲは、同一の逆相補配列であり、ベクターゲノムの全ての成分に隣接するＡＡＶ２（１３０ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＣ００１４０１）に由来する。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターＤＮＡ複製の起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノム複製およびパッケージングに必要な唯一のシス配列を表す。
・プロモーター：ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターに由来する調節エレメント：この遍在性プロモーター（１２２９ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｄ６３７９１．１）を選択して、任意のＣＮＳ細胞型における導入遺伝子の発現を駆動した。
・コード配列：ＧＬＢ１遺伝子は、β－ガラクトシダーゼをコードし、最大化されたヒトコドン使用に基づく。ＧＬＢ１酵素は、ガングリオシドからのβ結合ガラクトースの加水分解を触媒する（２０３４ｂｐ、６７７ａａ，Ｇｅｎｂａｎｋ＃ＡＡＡ５１８１９．１、ＥＣ３．２．１．２３）。
・キメライントロン（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｉｎｔｒｏｎ、ＣＩ）－ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロン
・ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（２３９ｂｐ、Ｇｅｎｂａｎｋ＃ＫＰ６５９６６２．１）：ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｃｉｓで遺伝子のｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化を促進する。この要素は、転写終結、新生転写物の３’末端における特異的切断事象、および長鎖ポリアデニル尾部の添加のためのシグナルとして機能する。
ＡＡＶｈｕ６８トランスプラスミド：ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ
ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲは、ペンシルベニア大学のＤｒ．Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎの研究室内で構築された。ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされる４つの野生型（ＷＴ）ＡＡＶ２レプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする。また、ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノムを収容するためにＡＡＶ血清型ｈｕ６８のビリオンシェルに組み立てる３つのＷＴ ＡＡＶｈｕ６８ビリオンタンパク質カプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードする。ＡＡＶｈｕ６８配列は、ヒト心臓組織ＤＮＡから入手した。
ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドを作製するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳベクターに由来するプラスミド骨格上の野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドｐＡＡＶ２／９ｎ由来のＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を除去し、ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子と置換した。アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子をカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子で置換し、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲを得た。通常ｒｅｐ発現を駆動するＡＡＶ ｐ５プロモーターを、ｒｅｐの５’末端からキャップの３’末端へと移動し、ｒｅｐの上流の切断ｐ５プロモーターを残す。この切断プロモーターは、ｒｅｐの発現を下方制御し、結果として、ベクター産生を最大化する役割を果たす（図１Ｃ）。プラスミドのすべての成分部分は、直接配列決定によって検証されている。
ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）アデノウイルスヘルパープラスミド
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）は、サイズが１５，７７４ｂｐである。このプラスミドには、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１機能は、ＨＥＫ２９３細胞によって提供される）が、他のアデノウイルスの複製遺伝子または構造遺伝子は含まれていない。プラスミドは、アデノウイルス逆位末端反復配列などの複製に重要なシス要素を含んでおらず、したがって、感染性のアデノウイルスが生成されることは予想されない。プラスミドは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド）に由来した。Ａｄ５ ＤＮＡに欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、アデノウイルスＤＮＡの量を３２ｋｂから１２ｋｂに低減した。最後に、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子によって置換して、ｐＡｄｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）を作製した。このプラスミドに残るＥ２、Ｅ４、およびＶＡＩのアデノウイルス遺伝子、ならびにＨＥＫ２９３細胞に存在するＥ１は、ＡＡＶベクター産生に必要である。
ＡＡＶｈｕ６８．ＧＭ１は、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション、続いて下流精製によって製造される。図１２Ａ～１２Ｂに、製造プロセスのフロー図を示す。製品の調製に入る主要な試薬は、図の左側に示され、工程内の品質評価は図の右側に示される。各産生および精製ステップの説明も提供されている。
細胞培養および回収：細胞培養および回収物製造プロセスは、４つの主要な製造工程：細胞の播種および増殖、一過性トランスフェクション、ベクター回収、およびベクターの清澄化を含む（図１２Ａ）。
細胞の播種および増殖：完全に特徴付けられたＨＥＫ２９３細胞株が、産生プロセスに使用される。
一過性トランスフェクション：約４日間の増殖後（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ）、細胞培養培地を新鮮な無血清ＤＭＥＭ培地に交換し、細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのトランスフェクション方法を使用して、３つの産生プラスミドでトランスフェクションする。最初、シス（ベクターゲノム）プラスミド、トランス（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）プラスミド、およびヘルパープラスミドを含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、ＧＭＰグレードのＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ ＨＱ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ）との比率で調製する。このプラスミド比は、小規模最適化研究におけるＡＡＶ産生に最適であると判断された。よく混合した後、溶液を室温で最大２５分間静置し、次いで無血清培地に添加して反応をクエンチし、最終的にｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターに添加する。反応器は、温度および溶存酸素（ＤＯ）が調節され、細胞は、５日間インキュベートされる。
ベクター回収：形質転換した細胞および培地は、バイオリアクターから培地を無菌的に汲み出すことによって、使い捨てバイオプロセスバッグを使用して、ＰＡＬＬ ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターから回収される。回収後、洗剤、エンドヌクレアーゼ、およびＭｇＣｌ２（エンドヌクレアーゼの補因子）を添加してベクターを遊離し、パッケージングされていないＤＮＡを消化する。生成物（使い捨てバイオプロセスバッグ内）を温度制御された単回使用のミキサー中で、３７℃で２時間インキュベートして、回収物（トランスフェクション手順で得られた）中に存在する残留細胞およびプラスミドＤＮＡの酵素消化に十分な時間を提供する。このステップは、最終的なベクター製剤（ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ、ＤＰ）中の残留ＤＮＡの量を最小限に抑えるために行われる。インキュベーション後、ＮａＣｌを最終濃度が５００ｍＭになるように添加し、濾過および下流接線流濾過（ＴＦＦ）中の生成物の回収を補助する。
ベクターの清澄化：蠕動ポンプによって駆動される滅菌された閉鎖チューブおよびバッグセットとして直列に接続されたプレフィルターおよびデプスフィルターカプセル（１．２／０．２２μｍ）を使用して、細胞および細胞デブリを産物から除去する。清澄化は、下流のフィルタおよびクロマトグラフィーカラムを汚損から保護されることを保証し、生物負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を低減する濾過は、フィルタトレイン（ｆｉｌｔｅｒ ｔｒａｉｎ）の終わりに、上流の産生プロセス中に導入される可能性のある任意の生物負荷が、下流の精製の前に除去されることを保証する。
精製プロセス：精製プロセスは、ＴＦＦによる濃縮および緩衝液交換、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、ならびにＴＦＦによる濃縮および緩衝液交換の４つの主要な製造工程を含む。これらのプロセス工程は、概要プロセス図（図１２Ｂ）に示されている。これらのプロセスの各々についての一般的な説明を以下に提供する。
大規模接線流濾過：清澄化された生成物の体積低減（２０倍）は、カスタムの滅菌された閉鎖バイオプロセスチューブ、バッグ、および膜セットを使用して、ＴＦＦによって達成される。ＴＦＦの原理は、好適な多孔度（１００ｋＤａ）の膜に平行な圧力下で溶液を流すことである。圧力差は、膜孔よりも大きな分子を保持しながら、より小さいサイズの分子を、膜を通して効果的に廃棄流路に駆動する。溶液を再循環させることで、平行流が膜表面を押し流し、膜への結合による膜孔汚れおよび生成物の損失を防ぐ。適切な膜孔径および表面積を選択することによって、液体試料は、所望の分子を保持および濃縮しながら体積を急速に減少させ得る。ＴＦＦ用途における透析濾過は、液体が膜を通して、廃棄流路に通過するのと同じ速度で再循環試料に新鮮な緩衝液を添加することを伴う。透析濾過の体積の増加に伴う、小分子の量の増加は、再循環試料から除去される。この透析濾過は、清澄化された生成物の適度な精製をもたらすが、その後のアフィニティーカラムクロマトグラフィー工程と適合性の緩衝液交換も達成する。したがって、本発明者らは、濃縮のために１００ｋＤａのＰＥＳ膜を利用し、最小の４透析濾過体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）および４００ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝液で透析濾過する。次いで、透析濾過された産物を１．２／０．２２μｍのデプスフィルターカプセルでさらに清澄化して、沈殿した材料をすべて除去する。
アフィニティークロマトグラフィー：透析濾過された産物を、ＡＡＶｈｕ６８血清型を効率的に捕捉するＰｏｒｏｓ（商標）Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶアフィニティー樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用する。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉する。適用後、カラムを５体積の低塩エンドヌクレアーゼ溶液（２５０Ｕ／ｍＬのエンドヌクレアーゼ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）および４０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で処理して、残りの宿主細胞およびプラスミド核酸をすべて除去する。カラムを洗浄して、追加の供給不純物を除去し、続いて低ｐＨ段階溶出液（４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５）で洗浄して、これを直ちに１／１０体積の中和緩衝液（２００ｍＭのＢｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ、ｐＨ１０．２）中に回収することによって中和する。
アニオン交換クロマトグラフィー：空のＡＡＶ粒子を含むプロセス内不純物のさらなる低減を達成するために、Ｐｏｒｏｓ ＡＡＶ溶出プールを５０倍に希釈して（２０ｍＭビストリスプロパン、０．００１％プルロニックＦ６８、ｐＨ１０．２）、イオン強度を低下させ、ＣＩＭｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリスマトリックス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩洗浄後、ベクター生成物を、６０カラム体積（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ、ＣＶ）のＮａＣｌ直線塩勾配（１０～１８０ｍＭのＮａＣｌ）を使用して溶出する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを含まないカプシド粒子（空の粒子）を、ベクターゲノムを含有する粒子（完全粒子）から効果的に分離し、完全粒子について濃縮された調製物が得られる。完全粒子のピーク溶出液を回収し、中和し、２０ｍＭのビストリスプロパン、０．００１％のプルロニックＦ６８（ｐＨ１０．２）中に２０倍希釈し、その場で洗浄された同じカラムに再適用する。１０～１８０ｍＭのＮａＣｌ塩勾配を再適用し、適切な全粒子ピークを回収する。ピーク面積を評価し、おおよそのベクター収率を決定するために、以前のデータと比較する。
中空線維接線流濾過による濃縮および緩衝液交換：プールされたアニオン交換中間体を濃縮し、ＴＦＦを使用して緩衝液を交換する。この工程では、１００ｋＤａの膜中空繊維ＴＦＦ膜が使用される。この工程中、生成物を標的濃度にもたらし、次いで緩衝液を髄腔内最終製剤緩衝液（ＩＴＦＦＢ、すなわち、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を含む人工ＣＳＦ）に交換する。生成物を滅菌濾過し（０．２２μｍ）、滅菌容器に保管し、最終充填のために放出されるまで、隔離場所に－６０℃以下で冷凍する。
最終充填：凍結生成物を解凍し、プールし、最終製剤緩衝液を使用して標的濃度に調整する（ＴＦＦを介した希釈または濃縮工程）。この生成物を、最終的に０．２２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌されたＷｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ’ｓ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（環状オレフィンポリマー）バイアルおよび充填容量が決定される圧着シール付きストッパーに充填される。バイアルには個別にラベルが貼られる。ラベルされたバイアルは、６０℃以下で保管される。
実施例３：
ヒトβ－ｇａｌを発現する最適化ＡＡＶベクターを開発し、マウス疾患モデルを使用して、脳酵素活性、リソソーム蓄積病変、および神経学的徴候に対するベクターのＣＳＦへの投与の影響を評価した。
Ａ．材料および方法
動物手順：動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。ＧＬＢ１ノックアウトマウスは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景でヘテロ接合担体として維持した。ＩＣＶ注入の場合、ベクターを、無菌リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）中で５μＬの体積に希釈し、カスタムの気密シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびセメント加工された１０ｍｍの２７ゲージ針を使用して、針の基部にプラスチックチューブを装着して穿通を３ｍｍの深さに制限しながら、イソフルラン麻酔マウスに対してフリーハンドで注入した。顎下血液採取は、イソフルラン麻酔のマウスで実施した。血清分離管に血液を採取し、凝固させ、遠心分離によって分離した後、アリコートし、－６０℃以下で凍結した。剖検の際、マウスにケタミンおよびキシラジンで鎮静し、ポリエチレンチューブに接続された３２ゲージ針を使用して、後頭下穿刺によってＣＳＦを採取した。安楽死は頚椎脱臼によって行った。ＣＳＦ、心臓、肺、肝臓、および脾臓をドライアイス上で直ちに凍結し、－６０℃以下で保管した。脳を除去し、前頭葉の冠状切片を回収し、生化学研究のために凍結した。残りの脳は、組織学的分析に使用した。
実施例１および２に記載されるように、ベクターを生成した。
空：完全粒子比：ベクター試料を、１２ｍｍの光路長を有する２チャネルのチャコール－エポンセンターピースを有するセルにロードする。供給された希釈緩衝液を、各細胞の参照チャネルにロードする。次いで、ロードされた細胞を、ＡＮ－６０Ｔｉ分析ローターに配置し、吸光度およびＲＩ検出器の両方を備えたＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析超遠心分離器にロードする。２０℃に完全に温度平衡化した後、ローターを、１２，０００ｒｐｍの最終実行速度にする。２８０ｎｍスキャンにおける吸光度は、おおよそ３分毎に約５．５時間記録される（各試料について１１０回の総スキャン）。生データを、ｃ（ｓ）メソッドを使用して分析し、分析プログラムＳＥＤＦＩＴに実装する。得られたサイズ分布をグラフ化し、ピークを統合する。各ピークに関連付けられたパーセンテージ値は、すべてのピーク下の総面積のピーク面積分率を表し、２８０ｎｍで生成された生データに基づく。多くの研究室では、これらの値を使用して空：完全粒子比を計算している。しかしながら、空の粒子と完全粒子は、この波長で異なる吸光係数を有するため、それに応じて生データを調整することができる。吸光係数調整の前後の両方の空の粒子および完全モノマーピーク値の比を使用して、空の粒子：完全な粒子比を決定する。
複製能のあるＡＡＶのアッセイ：試料は、産生プロセス中に生じる可能性がある複製能のあるＡＡＶ２／ｈｕ６８（ｒｃＡＡＶ）の存在について分析される。細胞ベースの成分は、試験試料および野生型（ＷＴ）ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）の希釈物をＨＥＫ２９３細胞（Ｐ１）の単層に接種することからなる。試験した生成物の最大量は、１．０×１０１０ＧＣのベクター生成物である。アデノウイルスの存在により、ｒｃＡＡＶは細胞培養物中で増幅する。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を２回目の細胞（Ｐ２）に継代し、感度を増強する（再度、Ａｄ５の存在下で）。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を３回目の細胞（Ｐ３）に継代し、感度を増強する（再度、Ａｄ５の存在下で）。２日後、細胞を溶解してＤＮＡを遊離し、次いで、ｑＰＣＲに供して、ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ配列を検出する。ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ配列がＡｄ５依存的な様式で増幅することで、ｒｃＡＡＶの存在が示される。ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶ２／ｈｕ６８代替陽性対照を使用すると、アッセイの検出限界を決定することが可能になる（０．１、１、１０、および１００ＩＵ）。ｒＡＡＶ（１．０×１０１０、１．０×１０９、１．０×１０８、および１．０×１０７ＧＣ）の段階希釈を使用して、試験試料中に存在するｒｃＡＡＶのおおよその量を定量することができる。
インビトロ有効性：ＤｄＰＣＲ ＧＣ力価を遺伝子発現に関連付けるために、インビトロの相対効力バイオアッセイを行う。簡潔に、細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。翌日、細胞を、段階希釈されたＡＡＶベクターで感染させ、３７℃／５％ＣＯ２で最大３日間インキュベートする。細胞上清を回収し、蛍光発生基質の切断に基づいてβ－ｇａｌ活性について分析する。
総タンパク質、カプシドタンパク質、タンパク質純度、およびカプシドタンパク質比：ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質の標準曲線に対して、ベクター試料を最初に総タンパク質について定量する。決定は、等量の試料を、キットで提供されるＭｉｃｒｏ－ＢＣＡ試薬と混合することによって行われる。ＢＳＡ標準の希釈も、同じ手順を適用する。混合物を６０℃でインキュベートし、５６２ｎｍで吸光度を測定する。標準曲線は、４パラメータ適合を使用して、既知の濃度の標準吸光度から生成される。未知の試料を４パラメータ回帰に従って定量する。ｒＡＡＶの純度の半定量的決定を提供するために、試料を、ゲノム力価について正規化し、５．０ｘ１０９ＧＣを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって還元条件下で分離する。次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ色素で染色する。不純物バンドはすべて、濃度測定によって定量する。３つのＡＡＶ特異的タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）に加えて現れる染色されたバンドは、タンパク質不純物と見なされる。混入物バンドの不純物質量パーセントならびにおおよその分子量が報告される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質を定量し、それらの比率を決定するためにも使用される。
酵素活性アッセイ：組織を、スチールビーズホモジナイザー（ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）中でホモジナイズした。３回の凍結融解サイクル後、サンプルを遠心分離によって清澄化するし、タンパク質含有量をＢＣＡアッセイによって定量した。血清試料を酵素アッセイに直接使用した。β－ｇａｌ活性アッセイについて、１μＬの試料を、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５８）中の９９μＬの０．５ｍＭの４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｍ１６３３）と組み合わせた。反応物を，３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、１５０μＬの２９０ｍＭグリシン、１８０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ１０．９）を添加することによって停止した。蛍光を４ＭＵの標準希釈物と比較した。β－ｇａｌ活性は、タンパク質（組織）１ｍｇ当たり、または血清もしくはＣＳＦ１ｍｌ当たり、１時間当たり遊離された４ＭＵのｎｍｏｌとして表される。１ｍＭの４－メチルウンベリフェリルＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド（Ｓｉｇｍａ Ｍ２１３３）を基質として、組織溶解物の場合は１μＬの試料体積を、血清の場合は２μＬの試料体積を使用して、β－ｇａｌ活性アッセイと同じ様式で、ＨＥＸアッセイを行った。
組織学：脳を、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、１５％および３０％スクロース中で平衡化し、次いで、ＯＣＴ包埋培体中で凍結した。凍結切片をフィリピン（Ｓｉｇｍａ、１０μｇ／ｍＬ）、またはＧＦＡＰもしくはＬＡＭＰ１に対する抗体で染色した。
抗β－ｇａｌ抗体ＥＬＩＳＡ： 高結合ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの濃度で１ウェル当たり１００μＬの組換えヒトβ－ｇａｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミンで、室温で２時間ブロッキングした。重複ウェルを、ＰＢＳ中で１：１，０００に希釈された血清試料と共に、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ブロッキング溶液中で１：５，０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体と共に１時間インキュベートし、ＴＭＢ基質を使用して現像した。
歩行分析：製造元の指示書に従って、ＣａｔＷａｌｋ ＸＴシステム（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して、歩行分析を実施した。マウスを２日連続で試験した。各試験日に、各動物について少なくとも３回の完全な試行を実施した。５秒を超える試行、または動物が装置の全長を横断せずに停止もしくは反転した試行は、分析から除外した。
Ｂ．結果
サイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７）、ヒト伸長開始因子１αプロモーター（ＥＦ１ａ）またはヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）と共にニワトリβアクチンプロモーターによって駆動されるヒトＧＬＢ１ ｃＤＮＡからなる、導入遺伝子カセットが設計された。各カセットをＡＡＶｈｕ６８カプシドにパッケージ化し、１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）の単回用量を、野生型マウスに脳室内（ＩＣＶ）注入によって投与した。注入の２週間後、脳およびＣＳＦにおいてβ－ｇａｌ活性を測定した（図２Ａ～２Ｂ）。ＵｂＣプロモーターを有するベクターでは、脳およびＣＳＦの両方で、統計的に有意なβ－ｇａｌ活性の上昇が得られ、酵素活性は、未処置の野生型マウスの活性よりも、脳でほぼ２倍、ＣＳＦで１０倍大きかった。したがって、さらなる研究のために、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１ベクターを選択した。
最適化ベクターの有効性は、ＧＬＢ１－／－マウスモデルで評価した。ＧＭ１ガングリオシドーシスのマウスモデルは、ＧＬＢ１遺伝子の６番目および／または１５番目のエキソンにネオマイシン耐性カセットを標的化挿入することによって開発されている。Ｈａｈｎ，Ｃ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ＣＮＳ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｍａｓｓｉｖｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ａｃｉｄ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，２０５－２１１（１９９７）、およびＭａｔｓｕｄａ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．Ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ａｓ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｊｏｕｒｎａｌ １４，７２９－７３６（１９９７）を参照されたい。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス患者と同様に、これらのマウスは機能的なβ－ｇａｌを発現せず、脳内にＧＭ１ガングリオシドの急速な蓄積を示す。脳ＧＭ１蓄積は、生後１週間ですでに明らかであり、３ヶ月齢までに、ＧＬＢ１－／－マウスは、８ヶ月齢の乳児ＧＭ１患者と同程度のＧＭ１蓄積を脳内に有する（Ｈａｈｎ １９９７、上で引用）。ＧＬＢ１－／－マウスの臨床表現型は、乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスの臨床表現型を最も緊密にモデル化しており、４ヶ月齢までに運動異常が現れ、１０ヶ月齢までに安楽死が必要なほどの重度の神経学的症状（例えば、運動失調または運動麻痺）を有する（Ｈａｈｎ １９９７、Ｍａｔｓｕｄａ １９９７、上で引用）。ＧＬＢ１－／－マウスモデルは、いかなる末梢臓器の関与も示さず、しばしば骨変形および肝脾腫を発症する乳児ＧＭ１患者とは異なる（Ｈａｈｎ １９９７、Ｍａｔｓｕｄａ １９９７、上で引用）。したがって、ＧＬＢ１－／－マウスは、乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスの神経学的特徴の代表的なモデルであるが、全身疾患の症状ではない。
ＧＬＢ１－／－マウスを、１ヶ月齢で処置し、４ヶ月齢まで観察した。４ヶ月齢は、典型的には、進行性疾患を有する乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス患者と同様の脳ＧＭ１レベルに関連する顕著な歩行異常を発症するであろう時期である（Ｍａｔｓｕｄａ １９９７、上で引用）。ＧＬＢ１－／－マウスを、１．０ｘ１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１（ｎ＝１５）またはビヒクル（ｎ＝１５）の単回ＩＣＶ注入で処理した。ビヒクル（ｎ＝１５）で処置されたヘテロ接合性（ＧＬＢ１＋／－）マウスの群は、正常対照として機能した。注入日（０日目）、ならびに１０、２８、６０、および９０日目に血清を回収した。処置の９０日後、ＣａｔＷａｌｋ ＸＴ歩行分析システム（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して、運動機能を評価し、その後、動物を安楽死させ、組織学的および生化学的分析のために組織を回収した。
ＩＣＶ注入手順中に、ＡＡＶで処置されたマウス１匹が死亡した。他のすべてのマウスは、９０日間の試験エンドポイントまで生存した。ＣＳＦへのＡＡＶ送達は、末梢血におけるベクター分布および有意な肝臓の形質導入をもたらすことが示されている（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ＣＮＳ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｆｅｌｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２，２０１８－２０２７ （２０１４）、Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ Ｋａｌｂｕｒｇｉ，Ｓ．，ＭｃＣｏｗｎ， Ｔ．Ｊ．＆ Ｊｕｄｅ Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｒ．Ｇｌｏｂａｌ ＣＮＳ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＡＡＶ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ＡＡＶ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０，４５０－４５９ （２０１３）、Ｈａｕｒｉｇｏｔ， Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ＩＩＩＡ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ （２０１３）、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １，１４０５１（２０１４）、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｉｎｔｒａ－Ｃｉｓｔｅｒｎａ Ｍａｇｎａ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｌｐｈａ－Ｌ－Ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｉｎ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０，７９－８８（２０１８））。ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１で処置されたＧＬＢ１－／－マウスは、ベクター投与の１０日後、ヘテロ接合（ＧＬＢ１＋／－）対照よりも高い血清β－ｇａｌ活性を示した（図３Ａ）。ヒトβ－ｇａｌに対する血清抗体は、９０日目までにＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１で処置された５／１５マウスにおいて検出可能であった。２匹のマウスを除く全てのマウスについて、血清β－ｇａｌ活性の上昇が試験全体を通して持続し、両方ともヒトβ－ｇａｌに対する抗体を発現した（図６）。心臓、肺、肝臓、および脾臓を含む末梢臓器もまた、β－ｇａｌ活性の上昇を示した（図３Ｂ～３Ｅ）。ヒト導入遺伝子産物に対する抗体を発現した一部の動物は、末梢臓器においてより低いβ－ｇａｌ活性を有した。
剖検時に回収されたＣＳＦは、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１処置ＧＬＢ１－／－マウスにおけるヘテロ接合対照の活性を上回るβ－ｇａｌ活性を示した（図４Ｂ）。ベクター処置マウスの脳におけるβ－ｇａｌ活性は、ヘテロ接合対照と類似していた（図４Ａ）。抗β－ｇａｌ抗体は、脳またはＣＳＦのβ－ｇａｌレベルに影響を与えているようには見えない。
脳の異常の修正は、生化学的および組織学的アッセイを使用して評価した。リソソーム酵素は、リソソーム貯蔵の状況で頻繁に上方制御され、この観察は、ＧＭ１ガングリオシドーシス患者において確認されている（Ｖａｎ Ｈｏｏｆ， Ｆ． ＆ Ｈｅｒｓ， Ｈ．Ｇ．Ｔｈｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７， ３４－４４ （１９６８））。したがって、リソソーム酵素であるヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸ）の活性を、脳溶解物で測定した。ビヒクル処置ＧＬＢ１－／－マウス由来の脳試料ではＨＥＸ活性が上昇し、ベクターで処置した動物では、正常化された（図５）。
リソソーム蓄積病変を、ＧＭ１ガングリオシドに結合する蛍光分子であるフィリピンで脳切片を染色すること、ならびにリソソーム関連膜１（タンパク質ＬＡＭＰ１）の免疫染色によって評価した。フィリピンはまた、非エステル化コレステロールに結合するが、以前の研究は、フィリピン染色が主に、ＧＬＢ１－／－マウスにおけるＧＭ１蓄積を反映することを実証している（Ａｒｔｈｕｒ， Ｊ．Ｒ．， Ｈｅｉｎｅｃｋｅ， Ｋ．Ａ． ＆ Ｓｅｙｆｒｉｅｄ， Ｔ．Ｎ．Ｆｉｌｉｐｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｂｏｔｈ ＧＭ１ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２， １３４５－１３５１ （２０１１））。フィリピン染色は、ビヒクル処理ＧＬＢ１－／－マウスの皮質、海馬、および視床のニューロンにおける顕著なＧＭ１の蓄積を明らかにし、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ｈＧＬＢ１で処理したマウスが正常化させた（データは示さず）。ＬＡＭＰ１免疫組織化学は、ＧＬＢ１－／－マウスの皮質および視床におけるリソソーム膜染色の増加を示し、ベクター処置マウスにおいて減少した（データは示さず）。グリオーシスは、星状細胞マーカー、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について染色することによって評価された。ベクター処置ＧＬＢ１－／－マウスは、ビヒクル処置対照と比較して、視床におけるアストログリオーシスの著しい低減を示した（データは示さず）。
ベクター処置ＧＬＢ１－／－マウスにおける神経学的機能を評価するために、４ヶ月齢（ベクターまたはビヒクル投与後３ヶ月）で歩行分析を行った。未処置のＧＬＢ１－／－マウスは、３～４ヶ月齢までに臨床的に明らかな歩行異常を示すことが以前に指摘されていた。未処置ＧＬＢ１－／－マウスおよび正常な対照のコホートに対して、ＣａｔＷａｌｋシステムを使用して実施された定量的な歩行評価から、様々な異常が明らかになり、より遅い自発的歩行速度、歩幅長の差、ならびにステップサイクルの一部の相の持続時間が含まれた（図７Ｃおよび７Ｄ）。ＧＬＢ１－／－マウスの歩行速度が著しく遅いため、これらの明らかな相違の多くの解釈は、ほとんどの歩行パラメータの速度依存性によって複雑化された（図８Ａおよび８Ｂ）（Ｂａｔｋａ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｓｐｅｅｄ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔ ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｒｅｃｏｒｄ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．： ２００７）２９７，１８３９－１８６４（２０１４））。ＧＬＢ１－／－マウスは、後肢の配置にも一貫した異常を示し、後肢の足跡長の増加として測定することができた（図７Ｄ）。この異常は、以前の報告と一致して、歩行速度とは無関係であることが見出された（Ｂａｔｋａ， ｅｔ ａｌ、上で引用）、ＧＬＢ１－／－マウスにおける速度に依存しない歩行機能障害を評価するのに有用な歩行シグネチャとなった（図８Ａおよび８Ｂ）。２日連続して同じコホートのマウスを使用して実施された試験では、より遅い自発的歩行速度および増加した後肢の足跡長が、未処置のＧＬＢ１－／－マウスにおいて再現可能な観察であることを明らかにした（図７Ａおよび７Ｂ）。ビヒクル処理ＧＬＢ１－／－マウスは、未処理の動物において以前に特定されたものと同様の歩行異常を示した（図７Ａ～７Ｇ）。歩行速度および足跡長が、ベクター処置ＧＬＢ１－／－マウスにおいて正常化した（図７Ａ～７Ｇ）。
Ｃ．考察
この研究は、４週齢でＡＡＶベクターで処置されたＧＬＢ１－／－マウスにおけるニューロン貯蔵病変の減少を実証した。これは、このモデルで顕著な脳の蓄積病変が現れた１週間後のことである（Ｈａｈｎ １９９７、本明細書で引用）。これらの結果は、ＣＳＦへのＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＬＢ１の投与が、脳β－ｇａｌ活性を増加させ、ニューロンのリソソーム蓄積病変を減少させ、神経学的低下を防止し、遺伝子移入が、脳内のＧＭ１蓄積を防止し、かつ元に戻し得ることを示唆している。
実施例４：動物モデル
Ａ．ＧＬＢ１－／－マウスモデルにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の最小有効用量（ＭＥＤ）の特定
異なる用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の影響を、ＧＬＢ１－／－マウスモデルにおけるＣＮＳ病変および神経学的徴候について評価した。有効性は、血清酵素活性、脳病変の低減、自動歩行分析によって測定される神経学的徴候（例えば、ＣａｔＷａｌｋシステムを介して）、および盲検再評価者によって実施される標準化された神経学的検査（例えば、姿勢、運動機能、感覚および反射の９点評価）、ならびに生存率によって評価した。安全性分析（採血および分析を含む）も実施した。４週齢のＧＬＢ１－／－マウスは、ＩＣＶ注入によってｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１（１．３×１０１１ＧＣ、４．４×１０１０ＧＣ、１．３×１０１０ＧＣまたは４．４×１０９ＧＣ）またはビヒクルの４回用量のうちの１つを受けた（群当たりｎ＝２４）。ビヒクル（ｎ＝２４）で処置されたヘテロ接合性の同腹仔（ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）は、正常な対照として機能した。
血清β－ｇａｌ酵素活性、歩行分析、および神経学的検査を、６０日毎に各群の動物のうちの半分について行い、一方、体重を、１２０日の観察期間で少なくとも３０日毎に測定した。結果を、図９Ａ～９Ｆとしてプロットし、以下に簡潔に説明する。
処置されたマウスはすべて健康に見え、正常な体重増加を示した。観察期間中、群間の体重に有意な差は検出されなかった（図９Ｂ）。
血清の酵素の発現は、実施例３に記載されている研究と一致した。図９Ａに示すように、ビヒクル処置ＧＬＢ１－／－マウス（陰性対照として機能）のβ－ｇａｌ酵素活性は、１０ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間前後のままで、陽性対照群（ビヒクル処理ＧＬＢ１＋／－マウスである）は、約１００ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間の酵素活性を示した。マウス１匹当たり４．４×１０１０ＧＣの用量でｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１で処置すると、β－ｇａｌ酵素活性は、６０日目および１２０日目の両方で、陰性対照と比較して有意に増加した。マウス当たり１．３×１０１１ＧＣのより高い用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１は、６０日目に、陽性対照よりもβ－ｇａｌ酵素活性をもたらし、１２０日目にはさらなる上昇がもたらされた。
ＧＭ１マウスの歩行表現型はまた、実施例３に示される以前の結果と一致した。神経学的検査スコアである後肢の足跡長、後肢スイング時間、および後肢歩幅長を取得した。結果を、図９Ｃ～９Ｆにプロットする。４つ全てのプロットされたパラメータについて、陰性対照と陽性対照との間に有意な統計的差があり、これらのパラメータが、有効性を評価するための良好な指標として機能し得ることを示す。ビヒクル処置ＧＬＢ１－／－マウスと比較して、４．４×１０１０ＧＣのｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１で処置されたマウスは、後肢の足跡長、後肢スイング時間、および後肢歩幅長において著しい改善を示した。１．３ｘ１０１１ＧＣでのより高い用量は、後肢のスイング時間の増加およびより長い歩幅長を提供し、矯正が成功したことを示す。神経学的検査は、歩行分析と比較して感度が高い。図９Ｃに示すように、用量の増加に伴って減少した神経学的スコアによって示される、用量依存的な改善が観察されたが、１．３×１０１０ＧＣのｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１による処置は、陰性対照のものと比較して、総スコアで統計的有意性を示した。表現型矯正の証拠は、マウス当たりわずか１．３×１０１０ＧＣの用量で観察された。
全ての未処置動物が生存したままであると予想される場合、同じセットのパラメータは、この動物コホート内で少なくともさらに１５０日間収集され続ける。未処置のＧｌｂ１－／－マウスと比較した生存率の変化を評価する。
前項で論じた動物のうちの半分は、処置２７０日後に安楽殺される。残りの半分の動物は、処置１５０日後に安楽殺される。別の２４匹のマウスが、ベースライン剖検対照として提供される。全ての安楽殺された動物について、組織学的および生化学的な比較は、処置動物と未処置動物との間で行われる。剖検後、脳を切片化し、ＬＡＭＰ１について染色して、リソソーム蓄積病変を評価し、これを自動イメージングシステムを使用して定量する。β－ｇａｌ活性は、脳、血清、および末梢臓器において測定される。安全性分析の場合、全血球数および血清化学パネルのために、剖検時に採血し、委員会認定の獣医病理学者による組織病理学の評価のために、脳、脊髄、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および性腺を採取する。ビヒクル処置ＧＬＢ１－／－マウスと比較して脳蓄積病変の有意な低減を達成するｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の最小用量を最小有効用量（ＭＥＤ）として選択する。
Ｂ．非ヒト霊長類（ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ、ＮＨＰ）における毒性試験
アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）は、患者集団（４～１８ヶ月齢の乳児）のサイズおよびＣＮＳ解剖学的構造を最もよく再現し、臨床投与経路（ｒｏｕｔｅ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＲＯＡ）を使用して治療することができるため、毒性試験のために選択された。幼若動物を、小児治験集団を代表するように選択した。一実施形態では、幼若アカゲザルは、１５～２０ヶ月齢である。サイズ、解剖学的構造、およびＲＯＡの類似性は、代表的なベクター分布および形質導入プロファイルをもたらし、毒性の正確な評価を可能にする。加えて、げっ歯類モデルよりもＮＨＰにおいてより厳密な神経学的評価が行われ、より敏感なＣＮＳ毒性の検出を可能にする。
ＩＣＭ投与後のＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１の毒性を調査するために、１２０日間のＧＬＰ準拠安全性研究を、幼若アカゲザルで実施する。ＩＣＭのＡＡＶ投与後、分泌された導入遺伝子産物が安定した定常レベルに到達するのに十分な時間を与えるために、１２０日間の評価期間を選択した。試験設計を以下の表に概説する。アカゲザルは、以下の３つの用量レベルのうちの１つを受ける：合計３．０×１０１２ＧＣ、合計１．０×１０１３ＧＣ、もしくは合計３．０×１０１３ＧＣ（ｎ＝６／用量）またはビヒクル（ｎ＝４）。用量レベルは、脳質量によってスケールされた場合、最小有効用量（ＭＥＤ）の試験で評価されたものと同等であるように選択された（マウスでは０．４ｇ、アカゲザルでは９０ｇを想定）。ベースラインの神経学的検査、臨床病理学（鑑別を伴う細胞数、臨床化学、および凝固パネル）、ＣＳＦ化学、およびＣＳＦ細胞学が行われる。ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１またはビヒクル投与後、動物を苦痛および異常行動の兆候について毎日モニタリングする。
血液およびＣＳＦ臨床病理評価ならびに神経学的検査は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１またはビヒクル投与後３０日間、およびその後３０日間毎に実施する。ベースラインおよびその後の各３０日間の時点で、ＡＡＶｈｕ６８に対する中和抗体、ならびにＡＡＶｈｕ６８およびＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１導入遺伝子産物に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって評価する。
Figure 2022512589000010
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１またはビヒクルのいずれかの投与後、動物の半数を６０日目に安楽死させ、半数を１２０日目に安楽死させる。組織は、包括的な顕微鏡組織病理学的検査のために採取される。組織病理学的検査は、中枢神経系組織（脳、脊髄、および後根神経節）および肝臓に焦点を当てている。なぜなら、これらはＡＡＶｈｕ６８ベクターのＩＣＭ投与後に最も重度に形質導入された組織であるからである。さらに、リンパ球は、剖検時にこれらの臓器内のカプシドおよび導入遺伝子産物の両方に反応するＴ細胞の存在を評価するために、脾臓および骨髄から採取される。
ベクターの体内分布は、組織試料中の定量的ＰＣＲによって評価される。血清およびＣＳＦ試料において、ベクターゲノムを定量する。
Ｃ．非臨床ＡＡＶ試験における感覚ニューロン毒性
ＡＡＶの全身および髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ、ＩＴ）投与を評価する非臨床試験は、一貫して、後根神経節（ＤＲＧ）内の感覚ニューロンの効率的な形質導入、およびある場合は、これらの細胞を伴う毒性の証拠を実証している。髄腔内投与は、それらの中心軸索がＣＳＦに曝されるため、感覚ニューロン形質導入を可能にし得るか、またはＤＲＧが脊髄ＣＳＦに曝されるため、ｒＡＡＶが細胞体に直接到達し得る。
ＤＲＧ感覚ニューロンの最小～軽度の無症状性の変性は、評価されたすべての用量でＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１ ＧＬＰ ＮＨＰ毒性試験に現れることが予想される。他のＡＡＶプログラムについての既存の非臨床データおよび臨床データに基づいて、感覚ニューロンの所見は、ヒトにおける有害事象を説明しないことが予想され、したがって、非臨床試験における最大耐容用量（ｍａｘｉｍｕｍ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ ｄｏｓｅ、ＭＴＤ）の決定には、無症状性の感覚ニューロンの病変は使用されない。しかしながら、ヒトにおける感覚ニューロン毒性の本当のリスクは未知である。現在の試験は、典型的に全身投与されるものよりも低い用量のＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１を必要とし、より低い程度の感覚ニューロン毒性をもたらすように見えるＩＣＭ投与経路を使用することによって、以前のＡＡＶ臨床試験の安全性プロファイルをさらに改善するように設計されている。この研究は、感覚変化の詳細なモニタリングならびに神経伝導検査を使用して、無症状性のＤＲＧ毒性でさえ検出する。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスの重症度を考慮すると、感覚ニューロン毒性の未知のリスクにもかかわらず、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＧＬＢ１のＩＣＭ投与のためのリスク－ベネフィットプロファイルが好ましいままであることが予想される。
実施例５：乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する小児対象の大槽（ＩＣＭ）に送達されたｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回用量の安全性および耐容性を評価するための第１／２相非盲検多施設用量漸増試験
ＧＭ１ガングリオシドーシスの乳児形態を有する１ヶ月～１８ヶ月の小児対象は、第１／２相試験のために選択される。なぜならば、それらは、満たされていないニーズが最も多く、運動障害および認知障害の両方の急速かつ予測可能な減少を特徴とする最も破壊的な疾患の経過を有する集団を表しているからである（Ｊａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ： Ｍａｐｐｉｎｇ ａ ｔｉｍｅｌｉｎｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．１２１（２）：１７０－１７９）。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者は、典型的には、６ヶ月齢前に神経学的症状を伴う症状の発症を有し、一部の患者は、出生時に筋緊張低下、精神運動遅延、または他の疾患症状を呈する（Ｃａｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｏｒｑｕｉｏ Ｂ ｄｉｓｅａｓｅ： Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．１８１２（７）：７８２－７９０）。乳児ＧＭ１を有する患者の大部分は、生後数年以内に死亡する（生存期間の中央値１９～４６ヶ月、研究および支持療法のレベルに依存する）（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＭＲＩ／ＭＲＳ ａｓ ａ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＧＭ１ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｐａｒｔ Ａ． １７０（３）：６３４－６４４、Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｔｈｅ ＧＭ１ ａｎｄ ＧＭ２ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ： Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｒｅｖｉｅｗｓ： ＰＥＲ．１３ Ｓｕｐｐｌ １：６６３－６７３、およびＪａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。したがって、これらの患者は、潜在的に最も好ましいリスク／ベネフィットのプロファイルを有する集団を表している。さらに、これらの患者における予測可能で急速な減少は、頑強な研究設計を支援し、合理的な経過観察期間内に機能的転帰の評価を可能にする。この群では、処置は、基礎となる病理を安定させ、それによって疾患進行を安定させ、生存期間を延長し、スキル（獲得した発達マイルストーン、神経認知および／または運動スキルなど）の喪失を防止し、神経認知および行動低下の進行を遅らせることが期待される。
成体非ヒト霊長類で実施される投与手順の非臨床的安全性試験は、４ヶ月齢以上の乳児のサイズおよび大槽の解剖学的構造を最もよく表す。しかしながら、症状の発症後の疾患の急速な経過および症状の発症時の幼い年齢を考慮すると、治療は、遺伝子治療の潜在的な利益を最大化するために可能な限り早期に行われるべきである。ここで使用される下限の年齢は、治療、具体的にはＩＣＭ手順が安全に実行できるように、登録時１か月齢である。１週齢または２週齢の幼児からの画像スキャンを慎重に検討した後、ペンシルベニア大学の専門の介入放射線科医は、治療の根拠が裏付けられている限り、１ヶ月齢の幼児でＣＴガイドのＩＣＭ投与を行うことに特定の解剖学的懸念はないことを示した。上述のように、乳児（１型）ＧＭ１を有する患者は、典型的な発作の発症年齢および１８ヶ月齢までの進行性疾患の他の徴候を有する急速な疾患の経過を有する（Ｊａｒｎｅｓ Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。進行性の神経学的疾患のため、１８ヶ月齢の上限は、低レベルの臨床機能での疾患の安定化を超えてＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１から利益を得る可能性が限られている対象の登録を防止するために選択されている。自然史研究（ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｓｔｕｄｉｅｓ）は、乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス患者が２歳までにほとんどの発達マイルストーンを失っていることを示している。
上述のように、症状の発症後の急速かつ破壊的な疾患の経過を考慮すると、遺伝子治療の潜在的な利益を最大化するために、治療は可能な限り早期に行われるべきである。兄弟姉妹の一致に関するデータは、乳児ＧＭ１を有する兄弟姉妹の臨床経過が発症および一般的な疾患症状と時間の観点で類似していることを示唆する（Ｇｕｒｕｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＧＭ１ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０（１）：５７－６０）。したがって、ＧＭ１ガングリオシドーシスの遺伝子診断および生化学的診断が確認された症候前の乳幼児が、６ヶ月齢またはそれ以前に症状の発症（低身長症を有する）が記録された罹患した年上の兄弟姉妹を有する場合、試験に含めることができる。
本研究は、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の第１／２相非盲検用量漸増試験であり、乳児形態のＧＭ１を有する小児対象の大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ、ＩＣＭ）に送達されたＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回投与後の、安全性、耐容性、および探索的有効性のエンドポイントを評価する。この研究では、乳児形態のＧＭ１ガングリオシドーシス（１型）を有する最大１２人の小児対象が登録され、対象は、ＩＣＭ投与ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単一用量を受ける。対象を２年間経過観察して、安全性、耐容性、薬物動態および臨床転帰を評価し、治療後計５年間の追加の長期経過観察（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｆｏｌｌｏｗ ｕｐ、ＬＴＦＵ）と共に、導入遺伝子発現および臨床応答の長期転帰および耐久性を評価する。ＬＴＦＵから治療後５年間は、導入遺伝子発現の耐久性の評価、ならびに、以下のＦＤＡの業界向けガイダンス（ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）の草案に従って、未治療の患者よりも優れた機能レベルで生存期間を延長し対象を安定化させる上で、治療が有効であるかどうかの評価を可能にする：ヒト遺伝子治療製品投与後の長期経過観察（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｆｏｌｌｏｗ－Ｕｐ Ａｆｔｅｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、２０１８年７月）、ヨーロッパ、ブラジルおよびその他の現地の規制。試験が完了すると、対象は、安全性（腫瘍事象のモニタリング）、生存率、および臨床転帰を含む長期転帰についてモニタリングを続けるために患者の登録に招待され得る。ＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１のその後の発症には、疾患の軽度の後発形態を有する患者の治療への拡張が含まれる。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の２つの用量を、対象の時間差順次投与で評価する。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１用量レベルは、マウスＭＥＤ試験およびＧＬＰ ＮＨＰ毒性試験のデータに基づいて決定され、低用量（コホート１に投与）および高用量（コホート２に投与）からなる。高用量は、同等のヒト用量にスケールされたＮＨＰ毒性試験における最大耐容用量（ＭＴＤ）に基づいている。ヒト対象のために選択される高用量が等価ヒト用量の３分の１～半分であるように、安全域（ｓａｆｅｔｙ ｍａｒｇｉｎ）が適用される。低用量は、動物試験において等価スケール化されたＭＥＤを超える用量である限り、典型的には、選択された高用量よりも２～３倍低い。これにより、両方の用量レベルが治療上の利益を与える可能性を有することが保証され、耐容されれば、より高い用量が有利であることが期待されることを理解する。低用量、続いて高用量の順次評価は、試験された２回の用量の最大耐容用量（ＭＴＤ）の特定を可能にする。最後に、拡大コホート（コホート３）は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１のＭＴＤを受容する。コホート３（ＭＴＤ）の６名の対象を時間差投与（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｓｉｎｇ）なしで同時に登録する。コホート３は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）とｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１による併用療法を受けてもよい。耐容されれば、より高い用量が有利であることが期待される。
この研究の主な焦点は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性と耐容性を評価することである。ＩＣＭ ＡＡＶｈｕ６８送達のＮＨＰ研究では、一部の動物においてＤＲＧ感覚ニューロンの最小から軽度の無症状性の変性が実証されているため、感覚神経毒性を評価するために詳細な検査を実施し、本治験で感覚神経伝導検査を利用して、無症状性の感覚ニューロンの病変をモニタリングする。注目すべきことに、感覚ニューロンの機能喪失（潜在的な後根神経節毒性に起因する）は、３０日、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月で、およびその後は毎年の間隔で実施される感覚神経伝導検査によって評価される。非臨床ＮＨＰ研究でＡＡＶ投与後２～４週間以内に感覚ニューロンの病変が現れることを考慮すると、治療後３ヶ月間を通してより頻繁に評価することで、ヒトにおける同様の事象の評価を可能にし、毒性動態の潜在的な変動の評価を可能にする。この試験を通して経過観察を実施することにより、ヒトにおける時間経過が異なる場合、または臨床的続発症が観察された場合の遅延効果の評価を可能にし、それらがどのくらい持続し、経時的に改善されるか、安定した状態に維持されるか、または悪化するかを評価する。
この試験では、薬物動態および有効性のエンドポイントも評価され、この集団において有意義な機能転帰および臨床転帰を示す可能性について選択された。エンドポイントは、鎮静および／またはＬＰを必要とするものを除いて、３０日、９０日、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月で測定され、その後は、最大５年間の経過観察期間に毎年測定される。長期経過観察段階では、測定頻度は１２ヶ月毎に１回に減らされる。これらの時点を選択して、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性の完全な評価を容易にした。未治療の乳児ＧＭ１患者における疾患進行の急速な速度を考慮して、早期の時点および６ヶ月間隔も選択した。このアプローチにより、未治療比較データが存在し、未治療の患者が著しい減少を示すことが予想される経過観察期間にわたって、治療された対象における薬物動態および臨床有効性の測定値の完全な評価が可能になる。
二次的および探索的な有効性のエンドポイントには、生存率、栄養管の非依存性、発作の発生率および頻度、ＰｅｄｓＱＬによって測定された生活の質、ならびに神経認知および行動発達が含まれる。乳児発達のベイリー尺度およびヴァインランド尺度は、適応行動、認知、言語、運動機能、および健康に関連する生活の質における発達および変化に対するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の影響を定量化するために使用される。各測定値は、ＧＭ１疾患の集団または関連する集団のいずれかで使用され、親および家族からの入力に基づいてさらに洗練され、それらにとって最も有意義かつ影響力のある測定値を選択する。評価を標準化するために、治験に参加する現地では、経験豊富な神経心理学者によって様々な尺度の投与について訓練される。
標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録によって運動スキルが達成したか、他の運動マイルストーンを発達させてその後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の兆しがまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成された年齢と失なわれた年齢を追跡する。運動マイルストーンの達成度は、ＷＨＯ基準に基づいて６つの粗大マイルストーンに定義されている。
乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する対象は、生後数ヶ月以内に症状を発症する可能性があり、第１のＷＨＯ運動マイルストーン（支えなしで座ること）の獲得は、典型的には、４ヶ月齢より前には現れないことを考慮すると（中央値：５．９ヶ月齢）、このエンドポイントは、特に治療時により明らかな症状を有していた対象において、治療的利益の程度を評価するための感度を欠く場合がある。このため、乳児に適用され得る年齢に適した発達マイルストーンの評価も含まれる（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｖ．３７（１）：２５－３７；ｑｕｉｚ ３８，４７．）。これらのデータは、乳児ＧＭ１疾患を有する未治療の子供または定型発達の子供における典型的な獲得時間と比較して、経時的な発達マイルストーンの保持、獲得、または喪失を要約するために有益であり得る。
疾患が進行するにつれて、子供は発作を起こす可能性がある。発作活動の開始により、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１による治療が、発作の発症を予防もしくは遅延させるか、またはこの集団における発作事象の頻度を減少させるかのいずれかを決定することが可能になる。保護者は、発作の発症、頻度、長さ、および種類を追跡する、発作日記をつけるように求められる。これらの記載事項（ｅｎｔｒｉｅｓ）は、各来院時に臨床医と話し合い、解釈される。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の疾患体積変化のＣＮＳ症状に対する効果を評価するために、経時的にＭＲＩで測定する。すべてのガングリオシドーシスの乳児の表現型は、脳組織体積（大脳皮質および他のより小さい構造）および脳室体積の両方で、巨頭症および頭蓋内ＭＲＩ体積の急速な増加と一貫したパターンを有することが示された。加えて、脳梁、尾状核、および被殻、ならびに小脳皮質を含む様々な小さな脳の下部構造は、疾患の進行に伴って一般的にサイズが減少する（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、およびＮｅｓｔｒａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８、本明細書で引用）。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１による治療は、ＣＮＳ疾患の症状の進行を遅らせるか、または停止させることが期待され、萎縮および体積変化における安定化の証拠を伴う。視床および基底核におけるＴ１／Ｔ２シグナル強度の変化（正常／異常）を評価する探索的エンドポイントは、ＧＭ１およびＧＭ２ガングリオシドーシス患者における視床構造の変化に関する報告された証拠に基づいている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｋａｓｈｉｍａ，１９９４，Ｔｈａｌａｍｉｃ ｈｙｐｅｒｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ＣＴ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＧＭ１－ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ．Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１６（６）：４７２－４７４）。
治験のためのバイオマーカーとしては、ＣＳＦおよび血清中で測定され得るβ－ｇａｌ酵素（ＧＬＢ１）活性、ならびに乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスにおいて一貫した急速な萎縮を示す脳ＭＲＩが挙げられる（Ｒｅｇｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ｂ、本明細書で引用）。追加のバイオマーカーを、回収された試料由来のＣＳＦおよび血清において、調査する。
Ａ．主要目的：
・大槽（ＩＣＭ）への単回投与後の２年間にわたって、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性を評価すること。
Ｂ．二次目的：
・ＣＳＦおよび血清中のＧＬＢ１活性に基づいて、単回ＩＣＭ投与後の２４ヶ月にわたって、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の薬物動態および生物学的活性を評価すること。この評価には、ＣＳＦのＧＭ１濃度、ならびに血清および尿のケラタン硫酸レベル、ヘキソサミニダーゼ活性がさらに含まれ得る。
・生存率に対するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の影響を評価すること
・２４ヶ月齢での栄養管依存性の確率に対するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の影響を評価すること
・達成時の年齢、喪失時の年齢、および年齢に適した発達および運動のマイルストーンを維持または獲得している子供の割合を評価することで、疾患の進行を評価すること（世界保健機関［ＷＨＯ］の基準で定義されている）
・ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１が神経認知発達に及ぼす影響を、以下に基づいて評価すること：
ｏ乳幼児発達のベイリー尺度（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の年齢等価認知、粗大運動、微細運動、受容的および表現的コミュニケーションスコアの変化
ｏヴァインランドの適応行動尺度（Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ）の各ドメインの標準スコアの変化
Ｃ．探索的目的：
・単回ＩＣＭ投与後２４ヶ月間にわたるｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の有効性を、以下によってさらに評価すること：
ｏ発作日記によって評価される発作の発症年齢と頻度
ｏ小児の生活の質調査（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ、ＰｅｄｓＱＬ）および小児生活の質調査の乳児尺度（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｉｎｆａｎｔ Ｓｃａｌｅ、ＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ）における総スコアの変化によって、小児の生活の質に対するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の影響を評価すること
・単回ＩＣＭ投与後２４ヶ月にわたるｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の薬力学的効果を、以下による測定で、さらに評価すること：
ｏＭＲＩで測定された脳の総容積、脳の下部構造の容積、および側脳室の容積の変化
ｏ視床および基底核活性におけるＴ１／Ｔ２シグナル強度の変化
・肝臓および脾臓の体積に対するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の影響を評価すること
・脳波、エコー、視覚誘発電位（ＶＥＰ）に対するｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の影響を評価すること
Ｄ．研究設計：
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の多施設、非盲検、単群、用量漸増試験（以下の表）。乳児ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する合計１２名の小児対象は、２投与コホートに登録され、ＩＣＭ注入によって投与されるｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の単回用量を受ける。安全性および耐容性を２年間にわたって評価し、すべての対象をｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の投与後５年間にわたって追跡し、安全性および耐容性、薬物動態（導入遺伝子の発現の耐久性）、ならびに臨床転帰の耐久性の長期評価を行う。
Figure 2022512589000011
可能性のある対象は、投薬前３５日目から投薬前１日目までにスクリーニングされ、試験に対する適格性が判断される。適格／除外基準（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ／ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）を満たす対象は、１日目の朝または施設の診療に従って入院する。対象は、１日目に単回ＩＣＭ用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を受け、観察のために投薬後、少なくとも２４時間病院に留まる。その後の評価は、投与の７日後、１４日後、および３０日後、次いで、１年目は６０日毎、および２年目は９０日毎に行われる。ＲＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の安全性および耐容性は、有害事象（ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ、ＡＥ）および重篤な有害事象（ｓｅｒｉｏｕｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ、ＳＡＥ）の評価、バイタルサイン、身体検査、感覚神経伝導検査、および臨床検査（化学、血液学、凝固試験、ＣＳＦ分析）を通じてモニタリングされる。ＡＡＶおよび導入遺伝子産物の免疫原性も評価される。有効性評価には、生存率、認知、運動および社会発達の測定、視覚機能および脳波（ＥＥＧ）の変化、肝臓および脾臓の体積の変化、ならびにＣＳＦ、血清、および尿におけるバイオマーカーが含まれる。
本試験は、単回ＩＣＭ注入として、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１が投与された以下の３つのコホートからなる：
・コホート１（低用量）：３人の適格な対象（対象＃１～＃３）を登録し、第１の対象と第２の対象との間に４週間の安全性観察期間を伴って、低用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与する。安全性審査トリガー（ｓａｆｅｔｙ ｒｅｖｉｅｗ ｔｒｉｇｇｅｒ、ＳＲＴ）が観察されない場合、全ての利用可能な安全性データは、コホート１の第３の対象がｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与された４週間後に、独立した安全委員会（ｓａｆｅｔｙ ｂｏａｒｄ）によって評価される。
・コホート２（高用量）：進行が決定された場合、３人の適格な対象（対象＃４～＃６）が登録され、高用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１が、第４の対象と第５の対象との間に４週間の安全性観察期間を伴って投与される。ＳＲＴが観察されない場合、独立した安全委員会は、コホート２の第３の対象がｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与された４週間後に、コホート１の対象からの安全性データを含む利用可能なすべての安全性データを評価する。
・コホート３（ＭＴＤ）：安全委員会による肯定的推奨が未決定である場合、最大６名の追加の対象を登録し、ＭＴＤで単回ＩＣＭ用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を投与する。このコホート内の対象についての投与は、対象間の４週間の安全性観察期間とずれることなく、このコホート内の最初の３人の対象の投与後に、安全性委員会の審査が必要である。
Ｅ．適格基準：
１．登録時に、１ヶ月齢超、１８ヶ月齢未満であること。
２．ＧＬＢ１遺伝子におけるホモ接合性変異もしくは複合ヘテロ接合性変異または欠失の同定、ならびに正常値の下限未満のβ－ガラクトシダーゼ酵素活性に基づいて、ＧＭ１ガングリオシドーシスの生化学的診断および分子診断が文書化されていること。
３．６ヶ月齢までの症状の発症、検査時の筋緊張低下、または親／介護者から引き出された病歴が記録されていること。
あるいは
症候前であり、かつ６ヶ月齢までに症状が発症した乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス疾患の診断が確認された兄弟姉妹を有すること。
Ｆ．除外基準：
１．ＧＭ１ガングリオシドーシス、または治験責任医師の見解では試験結果の解釈を混乱させる可能性のある二次的な原因に起因しない、臨床的に有意な神経認知障害があること。
２．治験責任医師の見解では、対象を不当なリスクにさらす、あるいは治験薬の評価を妨げる、または対象の安全性もしくは試験結果の解釈を妨げる可能性がある任意の状態（例えば、疾患の病歴、現在の疾患の証拠、身体検査時の所見、または実験室の異常）であること。
３．登録から３０日以内に入院が必要な急性の病気があること。
４．登録から３０日以内に治療または入院が必要な呼吸器の問題があること。
５．透視イメージングに対する禁忌を含む、ＩＣＭ投与手順に対する禁忌があること。
６．ＭＲＩまたは腰椎穿刺に対する禁忌があること。
７．スクリーニング前の４週間以内、またはその臨床試験で使用された治験薬の半減期の５倍の期間以内のいずれか長いほうの、治験薬を用いた他の臨床試験への登録があること（適応外ミグルスタットを投与された患者は適格である）。
Ｇ．投与経路および処置
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１は、単回用量として、１日目に、大槽内へのＣＴガイドの後頭下注入を介して対象に投与される。
１日目に、適切な濃度のｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を、試験に関連する治験薬剤部（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ ｐｈａｒｍａｃｙ）によって調製する。適切な濃度で５．６ｍＬのｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を含有するシリンジを、処置室に送達する。治験薬投与には、以下の担当者が同席する：処置を行う介入医、麻酔科医および呼吸器技師（複数可）、看護師および医師助手、ＣＴ（または手術室）技師、施設研究コーディネーター。
治験薬を投与する前に、腰椎穿刺を実施して、所定の体積のＣＳＦを除去し、次いで、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助するために、ヨード造影剤を髄腔内（ＩＴ）に注入する。静脈内（ＩＶ）造影剤は、髄腔内造影剤の代替物として、針穿刺の前またはその間に投与され得る。ＩＶまたはＩＴ造影剤を使用するかどうかは、介入医の判断に委ねられる。対象は、麻酔され、挿管され、処置テーブルに配置される。滅菌技術を使用して、注入部位を調製し、覆布をかける。透視ガイド下、脊髄針（２２～２５Ｇ）を大槽内に進める。針の配置を補助するために、より大きな誘導針を使用してもよい。針の配置を確認した後、エクステンションセットを脊椎針に取り付け、ＣＳＦで充填する。介入医の裁量で、造影剤を含有するシリンジを、エクステンションセットに接続してもよく、少量注入することで、大槽内に針が配置されていることを確認することができる。ＣＴガイダンス＋／－造影剤注入により針の配置を確認した後、５．６ｍＬのｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１を含むシリンジを、エクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を１～２分かけてゆっくりと注入し、５．０ｍＬの容量を送達する。注射針は、対象からゆっくりと取り出される。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の大槽内（ＩＣＭ）への単回用量は、投与後２年間を通して安全であり、かつ耐容可能である。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＬＢ１の大槽（ＩＣＭ）への単回投与は、生存率を改善し、２４ヶ月齢での栄養管依存の確率を低減し、かつ／または達成時の年齢、喪失時の年齢、ならびに年齢に適した発達および運動のマイルストーンを維持もしくは獲得する子供の割合によって評価される疾患進行を低減する。
治療は、神経認知機能の消失を遅らせる。
本明細書に引用される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれ、また、２０１８年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６２／７３９，８１１号、および２０１９年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／８３５，１７８号も、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、「１８－８５３７ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」とラベルされた本明細書に添付されている配列表、ならびにその中の配列およびテキストは、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、識別数字＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
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Claims (27)

  1. ＡＡＶｈｕ６８カプシドと、標的ヒト細胞でヒトβ－ガラクトシダーゼの発現を導く調節配列の制御下でヒトβ－ガラクトシダーゼをコードするＧＬＢ１遺伝子を含むベクターゲノムと、を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
  2. 前記ヒトβ－ガラクトシダーゼが、シグナルペプチドと、配列番号４のアミノ酸２４～６７７のアミノ酸配列を有する成熟β－ガラクトシダーゼと、を含む、請求項１に記載のＡＡＶ。
  3. 前記シグナルペプチドが、配列番号４のアミノ酸１～２３のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のＡＡＶ。
  4. 前記ＧＬＢ１遺伝子が、配列番号４のアミノ酸２４～６７７の前記成熟β－ガラクトシダーゼをコードする、配列番号５、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８から選択される配列、または配列番号５～８のうちのいずれか１つと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
  5. 前記調節配列が、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
  6. ベクターゲノムが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６から選択される配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
  7. 前記ＡＡＶｈｕ６８カプシドが、配列番号１の核酸配列もしくは配列番号２の予測されたアミノ酸配列をコードする配列から産生されるか、または前記ＡＡＶｈｕ６８が、
    配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質から選択されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質の異種集団と、
    配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質から選択されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質の異種集団と、
    配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質から選択されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団と、を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
  8. 製剤緩衝液と、請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＡＶと、を含む、水性医薬組成物。
  9. 前記製剤緩衝液が、
    緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上を含む人工脳脊髄液と、
    界面活性剤と、を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記界面活性剤が、前記医薬組成物の０．０００５％ｗ／ｗ～約０．００１％ｗ／ｗで存在する、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記組成物が、７．５～７．８、もしくは６．２～７．７の範囲、または約７のｐＨである、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 大槽内注入（ＩＣＭ）を介した患者への投与に好適な、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＡＶまたは請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者または１８ヶ月齢以下の乳児ガングリオシドーシスを有する患者への投与に好適な、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項１～７および１２のいずれか一項に記載のＡＡＶ、または請求項８～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. ＧＭ１ガングリオシドーシスの症状を改善する、またはＧＭ１ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善するために、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療を必要とする患者への投与に好適な、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項１～７および１２～１３のいずれか一項に記載のＡＡＶ、または請求項８～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に使用するための請求項１４に記載のＡＡＶまたは組成物であって、前記ＧＭ１ガングリオシドーシスの改善が、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに／または神経認知発達の改善を含む、ＡＡＶまたは組成物。
  16. 前記ＡＡＶまたは前記組成物が、大槽内へのＣＴガイドの後頭下注入を介して投与される、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項１～７および１２～１５のいずれか一項に記載のＡＡＶ、または請求項８～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記ＡＡＶまたは前記組成物が、単回用量で投与される、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項１～７および１２～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶ、または請求項８～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ＡＡＶが、患者当たり２×１０１２ＧＣ～患者当たり３×１０１４ＧＣの用量、または患者当たり８×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）～患者当たり３×１０１４ＧＣの用量、任意選択的に、患者当たり２×１０１３ＧＣ～患者当たり３×１０１４ＧＣの用量、患者当たり８×１０１３ＧＣ～患者当たり３×１０１４ＧＣ、または患者当たり約９×１０１３ＧＣの用量で投与される、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項１～７および１２～１７のいずれか一項に記載のＡＡＶ、または請求項８～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記投与が、１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量、任意選択的に、３．４ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、１．０ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量～約３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、または約１．１ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量で、前記ＡＡＶを送達することを含む、ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項１～７および１２～１８のいずれか一項に記載のＡＡＶ、または請求項８～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記ＧＭ１ガングリオシドーシスの治療のための医薬品の製造における、請求項１～７および１２～１９のいずれか一項に記載のＡＡＶまたは請求項８～１９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  21. ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する患者を治療する方法であって、有効量の請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＡＶまたは請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ＧＭ１ガングリオシドーシスを有する前記患者に投与することを含む、方法。
  22. 前記ＡＡＶまたは前記医薬組成物が、大槽内注入（ＩＣＭ）、任意選択的に、大槽内へのＣＴガイドの後頭下注入を介して投与される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記方法が、単回用量で前記ＡＡＶまたは前記医薬組成物を送達することを伴う、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記患者が、乳児ガングリオシドーシスを有し、１８ヶ月齢以下である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＡＡＶまたは組成物の前記投与が、ＧＭ１ガングリオシドーシスの症状を改善するか、またはＧＭ１ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善し、任意選択的に、前記患者が、治療後に、増加した平均寿命、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに／または神経認知発達の改善のうちの１つ以上を有する、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＡＡＶが、患者当たり２ｘ１０１２ＧＣ～患者当たり３ｘ１０１４ＧＣ、または患者当たり８ｘ１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）～患者当たり３ｘ１０１４ＧＣ、任意選択的に、患者当たり２ｘ１０１３ＧＣ～患者当たり３ｘ１０１４ＧＣ、患者当たり８ｘ１０１３ＧＣ～患者当たり３ｘ１０１４ＧＣ、または患者当たり約９ｘ１０１３ＧＣの用量で投与される、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ＡＡＶが、１ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量、任意選択的に、３．４ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、１．０ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量～約３．４ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量、または約１．１ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量で投与される、請求項２０～２６のいずれかに記載の方法。
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