JP2022512589A - Gm1ガングリオシドーシスの治療に有用な組成物 - Google Patents

Gm1ガングリオシドーシスの治療に有用な組成物 Download PDF

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Abstract

AAVhu68カプシドと、リソソームβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(例えば、ガラクトシダーゼβ1遺伝子、GBL1)を含むベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)(すなわち、rAAVhu68.GBL1)が提供される。また、例えば、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに/または神経認知発達の改善を含む、GM1ガングリオシドーシスの症状を改善するための、有効量のrAAVhu68.GBL1を含有する組成物が提供される。

Description

電子形態で提出された資料の参照による組み込み
出願人は、本明細書に電子形態で出願された配列表の資料を、参照により本明細書に組み込む。このファイルは、2019年8月29日付けの「18-8537PCT_SequenceListing_ST25.txt」とラベルされ、サイズが144,703バイトである。
GM1ガングリオシドーシス(以降、GM1と称される)は、GM1ガングリオシドおよびケラタン硫酸の分解の最初のステップを触媒する酵素であるリソソーム酸性βガラクトシダーゼ(β-gal)をコードするGLB1遺伝子の変異によって引き起こされる劣性リソソーム蓄積症である(Brunetti-Pierri and Scaglia,2008,GM1 gangliosidosis: Review of clinical,molecular, and therapeutic aspects,Molecular Genetics and Metabolism, 94: 391-96)。GLB1遺伝子は、染色体3上に位置し、2つの選択的にスプライシングされたmRNA、β-galリソソーム酵素をコードする2.5kb転写産物およびエラスチン結合タンパク質(EBP)をコードする2.0kb転写産物をもたらす(Oshima et al.1988, Cloning, sequencing,and expression of cDNA for human β-galactosidase,Biochemical and Biophysical Research Communications,157: 238-44、Morreau et al.1989,Alternative splicing of beta-galactosidase mRNA generates the classic lysosomal enzyme and a beta-galactosidase-related protein,Journal of Biological Chemistry,264: 20655-63)。β-galは、88kDa形態に翻訳後グリコシル化され、成熟64kDaリソソーム酵素にプロセシングされる85kDa前駆体として合成される(D’Azzo et al.1982,Molecular defect in combined beta-galactosidase and neuraminidase deficiency in man,Proceedings of the National Academy of Sciences,79: 4535-39)。リソソーム内で、酵素は、保護タンパク質カテプシンA(PPCA)およびノイラミニダーゼヒドロラーゼと複合体化される。
残留β-galをほとんど産生しないかまたは全く産生しないGLB1アレル(対立遺伝子)を有する患者において、GM1ガングリオシドは脳全体のニューロンに蓄積し、急速進行性の神経変性疾患をもたらす(Brunetti-Pierri and Scaglia 2008)。疾患の病因を引き起こす分子機構は依然として十分に理解されていないが、仮説としては、重度の神経細胞空胞化、神経細胞アポトーシスの領域におけるアストログリオーシスおよびミクログリオーシスを伴う神経細胞死および脱髄(Tessitore et al.2004,GM1-Ganglioside-Mediated Activation of the Unfolded Protein Response Causes Neuronal Death in a Neurodegenerative Gangliosidosis,Molecular Cell,15: 753-66)、ミエリン欠乏症をもたらす異常な軸索原形質輸送(van der Voorn et al.2004,The leukoencephalopathy of infantile GM1 gangliosidosis:oligodendrocytic loss and axonal dysfunction,Acta Neuropathologica,107: 539-45)、ニューロン-オリゴデンドログリア相互作用の障害(Folkerth 1999,Abnormalities of Developing White Matter in Lysosomal Storage Diseases,Journal of Neuropathology and Experimental Neurology,58: 887-902;Kaye et al.1992,Dysmyelinogenesis in animal model of GM1 gangliosidosis’,Pediatric Neurology,8: 255-61)、および炎症反応(Jeyakumar et al.2003,Central nervous system inflammation is a hallmark of pathogenesis in mouse models of GM1 and GM2 gangliosidosis,Brain,126: 974-87)が挙げられる。
現在、GM1の病態修飾療法は存在しない。栄養管の配置、呼吸療法、抗てんかん薬を含む支持療法および対症療法が、現在の治療手段である(Jarnes Utz et al.2017,Infantile gangliosidoses: Mapping a timeline of clinical changes,Molecular Genetics and Metabolism,121: 170-79)。GM1およびGM2患者において、グルコシルセラミドシンターゼ阻害剤であるミグルスタットによる基質合成抑制療法(substrate reduction therapy、SRT)が評価されている。ミグルスタットは概して良好に耐容されるが、症状管理または疾患進行において顕著な改善をもたらさず、一部の患者は用量制限的な胃腸副作用を経験する(Shapiro et al.,2009,Regier et al.,2016b)。ケトン食と組み合わせて使用する場合、ミグルスタットは耐容性が良く、一部の患者で生存率を増加させることが示されている(Jarnes Utz et al.,2017)。しかしながら、ミグルスタットを用いた無作為化対照研究は行われておらず、ミグルスタットはGM1ガングリオシドーシスの治療用に承認されていないことに留意されたい。この疾患では、骨髄または臍帯血を用いた造血幹細胞移植(HSCT)の実績は限られている。2型GM1を有する患者において行われた骨髄移植は、前駆症状性若年発症GM1-ガングリオシドーシスを有する患者において白血球β-ガラクトシダーゼレベルの正常化をもたらしたが、長期的な臨床結果は改善されなかった(Shield et al.,2005,Bone marrow transplantation correcting β-galactosidase activity does not influence neurological outcome in juvenile GM1-gangliosidosis.Journal of Inherited Metabolic Disease.28(5):797-798.)。HSCTの効果が遅いため、急速進行性の1型GM1疾患には好適ではない(Peters and Steward,2003,Hematopoietic cell transplantation for inherited metabolic diseases: an overview of outcomes and practice guidelines.Bone Marrow Transplantation.31:229.)。
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス(AAV)は、約4.7キロ塩基(kb)の長さの一本鎖直鎖DNA(ssDNA)ゲノムを有する小さな非エンベロープ性の正二十面体ウイルスである。野生型ゲノムは、DNA鎖の両端に逆位末端反復(inverted terminal repeats、ITR)、ならびに2つのオープンリーディングフレーム(ORF)であるrepおよびcapを含む。Repは、AAVの生活環に必要なrepタンパク質をコードする4つの重複遺伝子から構成され、capは、カプシドタンパク質の重複ヌクレオチド配列であるVP1、VP2、およびVP3を含有し、自己集合して正二十面体対称のカプシドを形成する。
AAVは、このウイルスが精製されたアデノウイルスストック中の混入物として発見されたため、ディペンドウイルス属に割り当てられている。AAVの生活環には、感染後にAAVゲノムが宿主染色体に特異的に組み込まれる潜伏相と、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスのいずれかの感染後に、組み込まれたゲノムが、その後に感染性ウイルスへと救出、複製、およびパッケージングされる感染相とが含まれる。非病原性、非分裂細胞を含む広範な宿主範囲の感染性、および潜在的な部位特異的染色体組み込みの特性により、AAVは、遺伝子導入のための魅力的なツールとなる。
望まれることは、異常なGLB1遺伝子に関連する状態の治療のための代替療法である。
GM1ガングリオシドーシスに関連する症状の治療および/または軽減を必要とするヒト患者において、GM1ガングリオシドーシスに関連する症状を治療および/または軽減するために有用である、治療用の組換え(r)複製欠陥アデノ随伴ウイルス(AAV)が提供される。rAAVは、望ましくは複製欠陥性であり、標的ヒト細胞でヒト(h)β-ガラクトシダーゼの発現を導く調節配列の制御下で、ヒト(h)β-ガラクトシダーゼをコードするGLB1遺伝子を含むベクターゲノムを有し、本明細書で使用されるように、rAAV.GLB1と称され得る。特定の実施形態では、rAAVは、AAVhu68カプシドを含む。このrAAVは、本明細書ではrAAVhu68.GLB1と称されるが、特定の例では、rAAVhu68.GLB1ベクター、rAAVhu68.hGLB1、rAAVhu68.hGLB1ベクター、AAVhu68.GLB1、またはAAVhu68.GLB1ベクターという用語が互換的に使用され、同じ構築物を参照する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、AAVhu68ゲノム配列を含有せず、AAVhu68カプシドに対して完全に外因性である。特定の実施形態では、AAVhu68カプシド以外のカプシドが利用され得る。さらなる実施形態では、AAVカプシドは、ベクターゲノムを中枢神経系(CNS、例えば、CNS中のニューロン、グリア細胞、上皮細胞、または他の細胞)に送達するのに好適である。さらに、rAAVの産生(例えば、生成および/または精製)に使用するための方法、ベクター(プラスミドなどのウイルスベクターまたは非ウイルスベクター)、ならびに細胞が提供される。
特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号4のアミノ酸24~677のシグナルペプチドおよび成熟GLB1アミノ酸配列、またはその機能性断片をコードする。特定の実施形態では、天然ヒトGLB1シグナルペプチド、例えば、配列番号4のアミノ酸1~23のアミノ酸配列が使用される。
特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号5、配列番号6、配列番号7もしくは配列番号8から選択される核酸配列、または配列番号6、配列番号7もしくは配列番号8と少なくとも95%~99.9%同一の配列を有する。さらなる実施形態では、GLB1核酸配列は、配列番号4のアミノ酸24~677またはその機能性断片をコードする。別の実施形態では、GLB1核酸配列は、配列番号4のアミノ酸配列またはその機能性断片をコードする。
特定の実施形態では、調節配列は、ヒトユビキチンC(UbC)プロモーターを含む。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号12、配列番号13、配列番号14、または配列番号15から選択される配列を有する。
特定の実施形態では、製剤緩衝液およびrAAV.GLB1(例えば、rAAVhu68.GLB1)を含む水性医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの1つ以上含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約0.0005%~約0.001%を含む。さらなる実施形態では、パーセンテージ(%)は、重量(w)比(すなわち、w/w)に基づいて計算される。特定の実施形態では、組成物は、pHが7.2~7.8である。特定の実施形態では、組成物は、pHが6.2~7.7である。特定の実施形態では、組成物は、pHが6.0~7.5である。一実施形態では、pHが約7である。
特定の実施形態では、GM1ガングリオシドーシスを有する患者を治療する方法であり、本明細書に記載されるrAAV.GLB1(例えば、rAAVhu68.GLB1)、または提供されるものと同じものを含む組成物を投与することを含む。本方法は、rAAV.GLB1を、GM1ガングリオシドーシスを有するヒト患者に送達することを伴う。特定の実施形態では、rAAV.GLB1または組成物は、大槽内へのCTガイドの後頭下注入を介して投与される。特定の実施形態では、本方法は、rAAV.GLB1または組成物を単回用量でヒト患者に送達することを含む。
特定の実施形態では、rAAV.GLB1(rAAVhu68.GLB1など)またはそれを含む組成物は、大槽内注入(ICM)を介して患者に投与可能である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1(例えば、rAAVhu68.GLB1)またはそれを含む組成物が提供され、18ヶ月齢以下の乳児ガングリオシドーシスを有する患者に投与可能である。rAAV.GLB1(例えば、rAAVhu68.GLB1)またはそれを含む組成物が提供され、これは、それを必要とする患者に投与して、GM1ガングリオシドーシスの症状、例えば、GM1の神経学的症状を改善することができる。特定の実施形態では、GM1ガングリオシドーシスの改善には、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに/または神経認知発達の改善が含まれる。
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかなる。
5’ITR、ヒトユビキチンC(UbC)プロモーター、キメライントロン、ヒトβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)をコードするGLB1遺伝子、SV40後期ポリAシグナル、および3’ITR(すなわち、「AAVhu68.Ubc.hGLB1co.SV40」)を示すAAVベクターゲノムの概略図を提供する。 シスプラスミドpAAV.UbC.hGLB1co.SV40.KanRが保有するAAVベクターゲノムを含むシスプラスミドの概略図を提供する。GLB1:β-ガラクトシダーゼ、ITR:逆位末端反復、KanR:カナマイシン耐性、Ori:複製起点、PolyA:ポリアデニル化、およびUbC:ユビキチンC。 4つのタンパク質をコードする全長AAV2レプリカーゼ(AAV2 Rep)のコード配列、およびAAVhu68 vp1カプシド遺伝子(VP1、VP2、およびVP3タンパク質をコードする)を含むトランスプラスミドの概略図を提供する。AAV2:アデノ随伴ウイルス血清型2、AAVhu68:アデノ随伴ウイルス血清型hu68、Cap:カプシド、KanR:カナマイシン耐性、Ori:複製起点、およびRep:複製酵素。 異なるプロモーターを使用して、ヒトβ-galを発現するrAAVhu68.GLB1で処理した野生型マウスの脳および脳脊髄液(CSF)におけるβ-gal活性をそれぞれ例示する。CB7、EF1a、またはUbCプロモーターからヒトGLB1を発現するrAAVhu68.GLB1の単回ICV注入により、野生型マウスを処置した(群当たりn=10)。未処置野生型マウス(n=5)は、対照として機能した。rAAVhu68.GLB1を投与して14日後、脳(前頭皮質)およびCSFを回収し、β-gal活性を、蛍光発生基質を使用して測定した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。 血清および末梢臓器のβ-gal活性を例示する。β-gal活性は、蛍光発生基質を使用して、それぞれ血清(図3A)、ならびに肺(図3B)、肝臓(図3C)、心臓(図3D)および脾臓(図3E)試料で測定した。PBS:リン酸緩衝生理食塩水(ビヒクル)、AAV:アデノ随伴ウイルス(AAVhu68.UbC.hGLB1)。*p<0.05、**p<0.01、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。NS:有意差なし。 脳およびCSFにおけるβ-gal活性を例示する。剖検で脳(前頭皮質)およびCSFを採取し、蛍光発生基質を使用してβ-gal活性を測定した。PBS:リン酸緩衝生理食塩水(ビヒクル)、AAV:アデノ随伴ウイルス(AAVhu68.UbC.hGLB1)。*p<0.05、**p<0.01、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。NS:有意差なし。 rAAVhu68.GLB1処置GLB1-/-マウスの脳におけるヘキソサミニダーゼ(HEX)活性の減少を示す。剖検で脳(前頭皮質)を採取し、蛍光発生基質を使用して、HEX活性を測定した。PBS:リン酸緩衝生理食塩水(ビヒクル)、AAV:アデノ随伴ウイルス(AAVhu68.UbC.hGLB1)。*p<0.05、**p<0.01、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。NS:有意差なし。 β-gal活性と抗β-gal抗体との間の相関を示す。剖検時に、AAV処置マウスから採取した血清試料中のβ-gal活性および血清抗β-gal抗体を測定した。各点は、個々の動物を表す。 AAV処置GLB1-/-マウスでの歩行異常の矯正を示す。図7Aおよび7Bは、平均5ヶ月齢の未処置GLB1-/-マウス(n=12)およびGLB1+/-対照マウス(n=22)が、2日連続でCatWalkシステムを使用して評価されたことを示す。少なくとも3回の試行にわたって、各動物について、平均歩行速度(図7A)および後肢の足跡長(図7B)を定量化した。**p<0.01マン・ホイットニ検定。図7Cおよび7Dは、ビヒクルで処置された4ヶ月齢のGLB1+/-(n=15)またはGLB1-/-(n=15)マウス、およびAAVで処置されたGLB1-/-マウス(n=14)が、CatWalkシステムを使用して評価されたことを示す。平均歩行速度(図7C)および後肢の足跡長(図7D)を、試験2日目に、各動物について少なくとも3回の試行にわたって定量化した。*p<0.05、**p<0.01、クラスカル・ウォリス検定、続いてダン検定。NS:有意差なし。図7E~Gは、AAVで処置されたGLB1-/-マウス(図7G)、ならびにビヒクルで処置されたGLB1+/-(図7E)およびGLB1-/-(図7F)対照マウスについての代表的な後肢の足跡を示す。 歩行速度と歩行パラメータとの間の相関を示す。GLB1+/-対照(n=22)を、CatWalkシステムを使用して2日連続で評価した。試験2日目の少なくとも3回の試行で測定された歩行運動のパラメータが記録された。相関分析は、歩行速度と、歩幅長などの歩行パラメータとの間の強い相関関係を実証した(スピアマンr=0.7432、p<0.001、図8A)。対照的に、後肢の足跡長は速度に依存しなかった(スピアマンr=-0.1239、p=0.423、図8B)。 ICV注入によって4つの用量のrAAVhu68.UbC.GLB1(1.3×1011GC、4.4×1010GC、1.3×1010GCもしくは4.4×10GC)またはビヒクルのうちの1つを受けたGLB1-/-マウスのβ-gal活性(図9A)、体重(図9B)、神経学的検査スコア(神経検査スコア、図9C)、後肢の足跡長(図9D)、およびスイング時間(図9E)ならびに後肢の歩幅長(図9F)を提供する。ビヒクルを投与されるGLB1+/-マウス(Het+ビヒクル)は、対照として機能する。より詳細は、実施例4のセクションAで提供される。 AAV9(配列番号20)、AAVhu31(整列でhu.31と表示、配列番号21)、およびAAVhu32(整列でhu.32と表示、配列番号22)と共に、AAVhu68(配列番号2)(整列でhu68.vp1と表示)のvp1カプシドタンパク質のアミノ酸配列を示す整列を提供する。AAV9、AAVhu31およびAAVhu32と比較して、2つの変異(A67EおよびA157V)がAAVhu68において重要であることが見出された(図で丸く囲んである)。 AAV9(配列番号23)、AAVhu31(配列番号24)、およびAAVhu32(配列番号25)と共に、AAVhu68(配列番号1)のvp1カプシドタンパク質をコードする核酸配列の整列を提供する。 rAAVhu68.GLB1原薬を生産するための製造プロセスの例示的なフローチャートを提供する。AEX:アニオン交換、CRL:Charles River Laboratories、ddPCR:液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応、DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地、DNA:デオキシリボ核酸、FFB:最終製剤緩衝液、GC:ゲノムコピー、HEK293:ヒト胚性腎臓293細胞、ITFFB:髄腔内最終製剤緩衝液、PEI:ポリエチレンミン、Ph.Eur.:欧州薬局方、SDS-PAGE:ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、TFF:接線流濾過、USP:米国薬局方、WCB:作業用細胞バンク。 rAAVhu68.GLB1製剤を生産するための製造プロセスの例示的なフローチャートを提供する。Ad5:アデノウイルス血清型5、AUC:分析用超遠心分離、BDS:バルク原薬、BSA:ウシ血清アルブミン、CZ:Crystal Zenith、ddPCR:液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応、E1A:初期領域1A(遺伝子)、ELISA:酵素結合免疫吸着アッセイ、FDP:最終薬物生成物、GC:ゲノムコピー、HEK293:ヒト胚性腎臓293細胞、ITFFB:髄腔内最終製剤緩衝液、KanR:カナマイシン耐性(遺伝子)、MS:質量分析、NGS:次世代配列決定、Ph.Eur.:欧州薬局方、qPCR:定量的ポリメラーゼ連鎖反応、SDS-PAGE:ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、TCID50:50%組織培養感染用量、UPLC:超高性能液体クロマトグラフィー、USP:米国薬局方。
GM1ガングリオシドーシス(GM1)を治療するための、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づく組成物および方法が本明細書に提供される。AAVhu68カプシドを有し、正常なヒトβ-ガラクトシダーゼ(GLB1)酵素をコードするベクターゲノムを担持する組換えAAV(rAAV)(rAAVhu68.GLB1)の有効量のゲノムコピー(GC)が患者に送達される。望ましくは、このrAAVhu68.GLB1は、水性緩衝液と共に製剤化される。特定の実施形態では、懸濁液は、髄腔内注入に好適である。特定の実施形態では、rAAVhu68.GLB1は、AAVhu68.UbC.GLB1(AAVhu68.UbC.hGLB1とも称される)であり、GLB1遺伝子(すなわち、β-ガラクトシダーゼ(本明細書で使用される場合、GLB1酵素、β-gal、またはガラクトシダーゼとも称される)コード配列)は、ヒトユビキチンC(UbC)に由来するプロモーターを含む調節配列の制御下にある。特定の実施形態では、組成物は、大槽内注入(ICM)を介して送達される。
本明細書でAAVhu68と称される系統群Fのアデノ随伴ウイルスのカプシドをコードする核酸配列は、ベクターゲノムを有するAAVhu68カプシドおよび組換えAAV(rAAV)の産生に利用される。本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」という用語は、ウイルスカプシド、例えば、AAVカプシドにパッケージされ、宿主細胞または患者の細胞に送達され得る核酸分子を指す。特定の実施形態では、ベクターゲノムは発現カセットであり、ベクターゲノムをAAVカプシドにパッケージングするのに必要な逆位末端反復(ITR)配列を5’および3’最末端に有し、それらの間に、発現を導く配列と作動可能に連結された本明細書に記載されるGLB1遺伝子を含有する。AAVhu68に関連する追加の詳細は、WO2018/160582(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)およびこの詳細な説明に提供される。本明細書に記載のrAAVhu68.GLB1は、GLB1遺伝子を含むベクターゲノムを、脳、海馬、運動皮質、小脳、および運動ニューロンを含む中枢神経系(CNS)内の細胞に送達するのに非常に好適である。これらのrAAVhu68.GLB1は、CNS内の他の細胞、ならびにCNS外の特定の他の組織および細胞を標的にするために使用され得る。あるいは、AAVhu68カプシドは、ベクターゲノムをCNSに送達するのにも好適な別のカプシド、例えば、AAVcy02、AAV8、AAVrh43、AAV9、AAVrh08、AAVrh10、AAVbb01、AAVhu37、AAVrh20、AAVrh39、AAV1、AAVhu48、AAVcy05、AAVhu11、AAVhu32、またはAAVpi02によって置換され得る。
I.GM1および治療用GLB1遺伝子
GM1ガングリオシドーシス(すなわち、GM1)は、臨床表現型に基づいて3つのタイプに分類することができる:(1)出生から6ヶ月までの発症を伴う1型または乳児型:筋緊張低下、重度の中枢神経系(CNS)の変性を伴って急速に進行し、1~2歳までに死亡する、(2)7ヶ月から3歳までの発症を伴う2型後期乳児型または若年型:運動および認知発達の遅れ、およびより遅い進行、ならびに(3)後期発症を伴う3型成人型または慢性異型(3~30歳):尾状核におけるスフィンゴ糖脂質の局所沈着に起因する進行性錐体外路障害(Brunetti-Pierri and Scaglia,2008.GM1 gangliosidosis: Review of clinical,molecular,and therapeutic aspects,Molecular Genetics and Metabolism,94: 391-96)。6ヶ月齢以前に症状が発症した乳児GM1対象は、運動障害および認知障害の両方の迅速かつ予測可能な進行を一様に示す。患者の大部分は、生後数年以内に死亡する(生存期間の中央値は46ヶ月、Jarnes Utz et al.,2017)。共通の基礎となる病態生理にもかかわらず、成人型(3型)のGM1表現型は可変であり、疾患の経過は顕著に軽度である。3型GM1の患者のほとんどは、最初に小児後期に神経学的症状を発症し、その後の成人期における進行はほとんど見られない。
各タイプの重症度は、GLB1遺伝子によってコードされる変異体β-gal(Brunetti-Pierri and Scaglia,2008)の残留活性と逆に関連する。ヒトにおいて130を超える疾患原因のGLB1変異が特定されている(Hofer et al.,2010,Phenotype determining alleles in GM1 gangliosidosis patients bearing novel GLB1 mutations.Clinical Genetics.78(3):236-246、およびCaciotti et al.,2011,M1 gangliosidosis and Morquio B disease: An update on genetic alterations and clinical findings.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease.1812(7):782-790.)。いくつかのGLB1変異は、遺伝的および生化学的に分析されており、臨床表現型と相関しているが(Gururaj et al.,2005,Magnetic Resonance Imaging Findings and Novel Mutations in GM1 Gangliosidosis.Journal of Child Neurology.20(1):57-60;Caciotti et al.,2011、およびSperb et al.,2013,Genotypic and phenotypic characterization of Brazilian patients with GM1 gangliosidosis.Gene.512(1):113-116)、多くのGLB1変異は特徴付けられていないままである。広義には、患者の遺伝子型は、様々な量の残留酵素活性をもたらすが、一般的には、残留酵素活性が高いほど、表現型はより軽度である(Ou et al.,2018,SAAMP 2.0: An algorithm to predict genotype-phenotype correlation of lysosomal storage diseases.Clinical Genetics.93(5):1008-1014.)。GM1の診断は、β-galおよびノイラミニダーゼの生化学アッセイならびに/またはGLB1分子分析のいずれかによって確認される。しかしながら、罹患した個体の臨床症状を予測する際に遺伝子型-表現型相関を使用するには制限があり、なぜなら残存酵素活性自体がGLB1遺伝子の変異によって引き起こされる疾患サブタイプを予測することができないためである(Hofer et al.,2010、Caciotti et al.,2011、Ou et al.,2018)。予測値は、一般に重度の早期発症の表現型を伴う2つの重度の変異(すなわち、GLB1酵素活性を示さない変異)を有する個人に対して、最良である(Caciotti et al.,2011、Sperb et al.,2013)。兄弟姉妹の一致率に関するデータは稀であるが、乳児GM1を有する兄弟姉妹の臨床経過が発症および一般的な疾患症状と時間の観点で類似していることを示す(Gururaj et al.,2005)。
本明細書に提供される遺伝子治療ベクター、すなわち、rAAV.GLB1(例えば、rAAVhu68.GLB1、rAAVhu68.UbC.GLB1)、またはそれらを含む組成物は、正常なレベルの機能性β-ガラクトシダーゼの欠損に関連する状態の治療に有用である。本明細書で使用される場合、遺伝子治療ベクターは、本明細書に記載されるrAAVを指し、患者を治療する際の使用に好適である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、GM1の1型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、GM1の2型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、GM1の3型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、GM1の1型および2型を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、18ヶ月齢以下のGM1患者を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、3型を除くGM1の治療用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、正常なレベルの機能性β-ガラクトシダーゼの欠損に関連する神経学的状態の治療に有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、GM1ガングリオシドーシスに関連する症状の改善に有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子治療ベクターまたは組成物は、GM1ガングリオシドーシスに関連する神経学的症状の改善に有用である。
特定の実施形態では、患者は、乳児ガングリオシドーシスを有し、18ヶ月齢以下である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1を受ける患者は、1ヶ月齢~18ヶ月齢である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1を受ける患者は、4ヶ月齢~18ヶ月齢である。特定の実施形態では、乳児は、4ヶ月未満である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1を受ける患者は、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、または約18ヶ月齢である。特定の実施形態では、患者は、幼児、例えば、18ヶ月齢~3歳である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1を受ける患者は、3歳~6歳、3歳~12歳、3歳~18歳、3歳~30歳である。特定の実施形態では、患者は、18歳以上である。
特定の実施形態では、治療後にGM1ガングリオシドーシスに関連する症状の改善が観察され、例えば、寿命の延長(生存期間)、栄養管の必要性の減少、発作の発生率、頻度、および長さの減少、発作発症の遅延、生活の質の改善(例えば、PedsQLによって測定されるような)、神経認知低下の進行の減少、ならびに/または神経認知発達の改善(例えば、適応行動、認知、言語(受容的および表現的コミュニケーション)、ならびに運動機能(粗大運動、微細運動)の改善(乳幼児発達のベイリー尺度(BSID-III)、ならびヴァインランドの適応行動尺度((Vineland-II)による測定)、運動マイルストーンの初期達成年齢と以降の喪失年齢(earlier age-at-achievement and later age-at-loss for motor milestones)、脳組織体積(大脳皮質および他のより小さな構造)および脳室体積の増大の遅延、脳梁、尾状核、被殻、小脳皮質を含む脳の下部構造のサイズ減少の遅延および脳萎縮および脳体積変化の安定化、視床および基底核における異常なT1/T2シグナル強度の進行の遅延、CSFおよび血清におけるβ-gal酵素(GLB1)活性の増加、CSFのGM1濃度の減少、血清および/または尿のケラタン硫酸レベルの減少、ヘキソサミニダーゼ活性の減少、脳における炎症反応の減少、異常な肝臓および脾臓体積の遅延、異常な脳波(EEG)および視覚誘発電位(VEP)の遅延、ならびに/あるいは嚥下障害、歩行機能、運動技能、言語および/または呼吸機能の改善が含まれる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のAAV療法なしでは適格ではなかった患者についてrAAV.GLB1を注入後、患者は、併用療法を受ける。かかる併用療法は、酵素補充療法、基質抑制療法(例えば、ミグルスタット(OGT918、N-ブチル-デオキシノジリマイシン)による)、タンガニル(アセチル-DL-ロイシン)治療、呼吸療法、栄養管使用、抗てんかん薬による)、または骨髄もしくは臍帯血による造血幹細胞移植(HSCT)を含み得る。
任意選択的に、必要とする対象において、免疫抑制性併用療法を使用してもよい。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、T細胞阻害剤、マクロライド(例えば、ラパマイシンまたはラパログ)、および細胞分裂阻害剤(アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む)が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ミトラマイシン、IL-2受容体(CD25)特異的抗体またはCD3特異的抗体、抗IL-2抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、IFN-β、IFN-γ、オピオイド、またはTNF-α(腫瘍壊死因子-α)結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、rAAV.GLB1投与前または投与後0、1、2、3、4、5、6、7、またはそれ以上の日に開始され得る。かかる免疫抑制療法は、1つ、2つ、またはそれ以上の薬物(例えば、グルココルチコイド、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)および/またはシロリムス(すなわち、ラパマイシン))の投与を伴い得る。かかる免疫抑制薬は、同じ用量または調整用量で、1回、2回、またはそれ以上、必要とする患者/対象に投与され得る。かかる療法は、同じ日に2つ以上の薬物、(例えば、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)および/またはシロリムス(すなわち、ラパマイシン))の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの1つ以上は、rAAV.GLB1投与後、同じ用量または調整用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約1週間(7日間)、約60日間、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるrAAV.GLB1(例えば、rAAV.GLB1、rAAV.UbC.GLB1)の「有効量」は、GM1ガングリオシドーシスに関連する症状の改善を達成する量である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるrAAV.GLB1の「有効量」は、以下のエンドポイントのうちの1つ以上を達成する量である:脳脊髄液(CSF)中のGLB1薬力学的および生物学的活性の増加、血清中のGLB1薬力学的および生物学的活性の増加、患者の平均寿命(生存期間)の増加、GM1ガングリオシドーシスの疾患進行の遅延(達成時のの年齢、喪失時の年齢、および年齢に適した発達および運動マイルストーンを維持または獲得する患者の割合のうちの1つ以上による評価)、ならびに乳幼児発達のベイリー尺度の年齢等価の認知、粗大運動、微細運動、受容的および発現的コミュニケーションスコアの1つ以上の変化に基づいた神経認知発達の改善(BSID、例えば、BSID Third Edition (BSID-III))、ヴァインランドの適応行動尺度の各ドメインの標準スコアの変化。より年長の子供および成人の場合、本明細書に提供されるrAAV.GLB1の「有効量」は、一部の実施形態では、嚥下障害、歩行機能、運動技能、言語および/または呼吸機能、ヴァインランドの適応行動尺度(第2版(Vineland-II))の各ドメインの標準スコアの変化、発作頻度および発作開始年齢の減少、24ヶ月齢での栄養管の非依存性の改善された確率を改善する量であり得る。年齢に適した発達および運動マイルストーンの例は、世界保健機関(WHO)によって提供されている。例えば、Wijnhoven T.M.,et al.(2004).Assessment of gross motor development in the WHO Multicentre Growth Reference Study.Food Nutr Bull.25(1 Suppl):S37-45、ならびに以下の表を参照されたい。特定の実施形態では、本明細書に提供されるrAAV.GLB1(rAAVhu68、GLB1など)の「有効量」は、CSFおよび血清のGLB1活性、CSFのGM1濃度、ならびに血清および尿のケラタン硫酸、脳MRIの変化、肝臓および脾臓体積のモニタリング、脳波(EEG)および視覚誘発電位(VEP)のモニタリングに対するrAAV.GLB1の薬力学的効果を達成する量である。
Figure 2022512589000001
Wijnhoven et al.,2004,Assessment of gross motor development in the WHO Multicentre Growth Reference Study.”Food Nutr Bull.25(1 Suppl):S37-45)から適応。略語:WHO、世界保健機関。
本明細書に記載のrAAV.GLB1、およびそれらを含む組成物は、ヒトβ-ガラクトシダーゼ(正常なGLB1酵素とも称され得る)またはその機能性断片をコードし発現するGLB1遺伝子(すなわち、β-Galコード配列)を含有する。GLB1酵素は、β-ガラクトシドの単糖への加水分解を触媒する。ヒトβ-ガラクトシダーゼのアミノ酸配列(2034bp、677aa、Genbank#AAA51819.1、EC3.2.1.23)は、本明細書において、配列番号4として再現され、β-ガラクトシダーゼ、アイソフォーム1としても認識される。例えば、UniProtKB-P16278(BGAL_HUMAN)を参照されたい。特定の実施形態では、GLB1酵素は、配列番号4のアミノ酸24~アミノ酸677の配列(すなわち、シグナルペプチドを含まない成熟GLB1酵素)を有し得る。特定の実施形態では、GLB1酵素は、配列番号4:のアミノ酸31~アミノ酸677の配列(すなわち、β-ガラクトシダーゼ、アイソフォーム3)を有し得る。特定の実施形態では、GLB1酵素は、配列番号26のアミノ酸配列を有するアイソフォーム2である。全長β-ガラクトシダーゼの機能を保持する任意の断片は、本明細書に記載のGLB1遺伝子によってコードされ得、「機能性断片」と称される。例えば、β-ガラクトシダーゼの機能性断片は、全長β-ガラクトシダーゼ(すなわち、配列番号4のアミノ酸24~アミノ酸677の配列、または3つのアイソフォームのうちのいずれか1つを有するβ-ガラクトシダーゼであり得る正常なGLB1酵素)の活性の少なくとも約25%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、またはそれ以上を有し得る。β-ガラクトシダーゼの活性を評価する方法は、実施例ならびに刊行物に見出すことができる。例えば、Radoslaw Kwapiszewski,Determination of Acid β-Galactosidase Activity: Methodology and Perspectives.Indian J Clin Biochem.2014 Jan;29(1): 57-62を参照されたい。特定の実施形態では、機能性断片は、全長β-ガラクトシダーゼのN末端および/またはC末端に、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、またはそれ以上のアミノ酸を欠く、切断β-ガラクトシダーゼである。特定の実施形態では、機能性断片は、全長β-ガラクトシダーゼと比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換(複数可)を含有する。本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換は、所与のアミノ酸を、類似の生化学的特性(例えば、電荷、疎水性、およびサイズ)を有する異なるアミノ酸に変更するタンパク質中のアミノ酸置換である。
一実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号5の配列を有する。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号6の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号7の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号8の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号6と少なくとも95%~99.9%同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号6と少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.9%同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号7と少なくとも95%~99.9%同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号7と少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.9%同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号8と少なくとも95%~99.9%同一の配列を有するように操作される。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号8と少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または少なくとも約99.9%同一の配列を有するように操作される。さらなる実施形態では、操作された配列は、全長β-ガラクトシダーゼまたはその機能性断片をコードする。またさらなる実施形態では、操作された配列は、配列番号4またはその機能性断片のアミノ酸24~アミノ酸677をコードする。別の実施形態では、操作された配列は、配列番号4またはその機能性断片のアミノ酸配列をコードする。
特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、シグナル(リーダー)ペプチドおよびGLB1成熟タンパク質、配列番号4のアミノ酸24~677を含むGLB1酵素をコードする。リーダー配列は、好ましくは、ヒト起源またはヒトリーダー配列の誘導体であり、約15~約28アミノ酸、好ましくは約20~25アミノ酸、または約23アミノ酸長である。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、天然シグナルペプチド(配列番号4のアミノ酸1~23)である。特定の実施形態では、GLB1酵素は、天然リーダー配列(配列番号4のアミノ酸1~23)の代わりに外来性リーダー配列を含む。別の実施形態では、リーダーは、ヒトIL2または変異リーダー由来であり得る。別の実施形態では、ヒトセルピンF1分泌シグナルは、リーダーペプチドとして使用され得る。
II.AAVhu68
配列番号2の番号付けに基づいて、AAVhu68(以前はAAV3G2と称されていた)は、vp1の67位および157位の2つのコード化されたアミノ酸によって、別の系統群FのウイルスAAV9と異なる。対照的に、他の系統群FのAAV(AAV9、hu31、hu31)は、67位にAlaおよび157位にAlaを有する。新規のAAVhu68カプシドおよび/または操作されたAAVカプシドが提供され、配列番号2の番号付けに基づいて157位にバリン(ValまたはV)を有し、任意選択的に、配列番号2の番号付けに基づいて67位にグルタミン酸(GluまたはE)を有する。
本明細書で使用される場合、AAVの群に関連する「系統群(clade)」という用語は、互いに系統的に関連するAAVの群を指し、AAV vp1アミノ酸配列の整列に基づいて、少なくとも75%のブートストラップ値(少なくとも1000反復のうち)および0.05以下のポアソン補正距離測定値によって隣接結合アルゴリズム(Neighbor-Joining algorithm)を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Nei and S. Kumar,Molecular Evolution and Phylogenetics(Oxford University Press,New York(2000)を参照されたい。コンピュータプログラムが利用可能であり、それを使用して、このアルゴリズムを実装することができる。例えば、MEGA v2.1プログラムは、修正Nei-Gojobori法を実装する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにAAV vp1カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたAAVが、本明細書で特定される1つの系統群(clade)に含まれるか、別の系統群に含まれるか、またはこれらの系統群の外にあるかを容易に決定することができる。例えば、G Gao,et al,J Virol,2004 Jun;78(10): 6381-6388,which identifies Clades A,B,C,D,E and F,and provides nucleic acid sequences of novel AAV, GenBank Accession Numbers AY530553 to AY530629を参照されたい。また、WO2005/033321も参照されたい。
特定の実施形態では、AAVhu68カプシドは、さらに、以下のうちの1つ以上を特徴とする。AAVhu68カプシドタンパクが、配列番号2の1~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるAAVhu68 vp1タンパク質、配列番号1から産生されたvp1タンパク質、もしくは配列番号2の1~736の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号1と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp1タンパク質、配列番号2の少なくとも約アミノ酸138~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるAAVhu68 vp2タンパク質、配列番号1の少なくともヌクレオチド412~2211を含む配列から産生されるvp2タンパク質、もしくは配列番号2の少なくともアミノ酸約138~736の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号1の少なくともヌクレオチド412~2211と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp2タンパク質、および/または配列番号2の少なくとも約アミノ酸203~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるAAVhu68 vp3タンパク質、配列番号1の少なくともヌクレオチド607~2211を含む配列から産生されるvp3タンパク質、もしくは配列番号2の少なくとも約アミノ酸203~736の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号1の少なくともヌクレオチド607~2211と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp3タンパク質、を含む。
AAVhu68 vp1、vp2、およびvp3タンパク質は、典型的には、全長vp1アミノ酸配列(アミノ酸(aa)1~736)をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、vp1コード配列は、vp1、vp2、およびvp3タンパク質を発現するために単独で使用される。あるいは、この配列は、vp1固有領域(約aa1~約aa137)および/またはvp2固有領域(約aa1~約aa202)を有しないAAVhu68 vp3アミノ酸配列(約aa203~736)をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するmRNAもしくはtRNA(例えば、配列番号1の約ヌクレオチド(nt)607~約nt2211から転写されるmRNA)、または配列2のaa203~736をコードする配列番号1と少なくとも70%~少なくとも99%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%)同一の配列、のうちの1つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、vp1コード配列および/またはvp2コード配列は、vp1固有領域(約aa1~約137)を有しない配列番号2のAAVhu68 vp2アミノ酸配列(約aa138~736)をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するmRNAもしくはtRNA(例えば、配列番号1のnt412~2211から転写されるmRNA)、または配列番号2の約aa138~736をコードする配列番号1と少なくとも70%~少なくとも99%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%)同一の配列と、共発現され得る。
本明細書に記載されるように、rAAVhu68は、配列番号2のvp1アミノ酸配列をコードするAAVhu68核酸配列、および任意選択的に、追加の核酸配列(例えば、vp1および/またはvp2固有領域を含まないvp3タンパク質をコードする配列)からカプシドを発現する産生システムで産生されるrAAVhu68カプシドを有する。単一の核酸配列vp1を使用した産生から得られたrAAVhu68は、vp1タンパク質、vp2タンパク質、およびvp3タンパク質の異種集団を産生する。より具体的には、AAVhu68カプシドは、vp1タンパク質内、vp2タンパク質内、およびvp3タンパク質内に亜集団を含有し、配列番号2の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン(NまたはAsn)残基が含まれる。例えば、アスパラギン-グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。
一実施形態では、AAVhu68 vp1核酸配列は、配列番号1の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するmRNAもしくはtRNAを有する。特定の実施形態では、vp2および/またはvp3タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてvpタンパク質の比を変化させるために、vp1とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、vp1固有領域(約aa1~約aa137)および/またはvp2固有領域(約aa1~約aa202)を有しない配列番号2のAAVhu68 vp3アミノ酸配列(約aa203~736)もしくはそれに相補的な鎖、対応するmRNAもしくはtRNA(配列番号1の約nt607~約nt2211)をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、vp1固有領域(約aa1~約137)を有しない配列番号2のAAVhu68 vp2アミノ酸配列(約aa138~736)またはそれに相補的な鎖、対応するmRNAもしくはtRNA(配列番号1のnt412~2211)をコードする核酸配列も提供される。
しかしながら、配列番号2のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、rAAVhu68カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号1の核酸配列、または配列番号1と少なくとも70%~99%同一、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%同一の配列を有し、配列番号2をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号1の核酸配列、または配列番号1の約nt412~約nt2211と、少なくとも70%~99%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%同一の配列を有し、配列番号2のvp2カプシドタンパク質(約aa138~736)をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号1の約nt607~約nt2211の核酸配列、または配列番号1のnt607~nt2211と少なくとも70%~99%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%同一の配列を有し、配列番号2のvp3カプシドタンパク質(約aa203~736)をコードする。
DNA(ゲノムまたはcDNA)、またはRNA(例えば、mRNA)を含む、このAAVhu68カプシドをコードする核酸配列を設計することは、当該技術分野の範囲内である。特定の実施形態では、AAVhu68 vp1カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号1に提供される。また、図11A~11Eも参照されたい。他の実施形態では、配列番号1と70%~99.9%同一の核酸配列を選択して、AAVhu68カプシドタンパク質を発現し得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号1と少なくとも約75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%同一、または少なくとも99%~99.9%同一である。かかる核酸配列は、選択されたシステム(すなわち、細胞型)における発現のためにコドン最適化され得、様々な方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法(例えば、GeneArt)、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えば、DNA2.0(Menlo Park,CA)を使用して実行され得る。1つのコドン最適化方法は、例えば、米国国際特許公開第WO 2015/012924号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、例えば、米国特許公開第2014/0032186号および米国特許公開第2006/0136184号を参照されたい。好適には、製品のオープンリーディングフレーム(ORF)の全長を修正する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ORFの断片のみが改変され得る。これらの方法のうちの1つを使用することによって、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。コドンへの実際の変更を実行するため、または本明細書に記載されるように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。かかる修飾または合成は、当業者に周知の標準的かつ日常的な分子生物学的操作を使用して行うことができる。1つのアプローチでは、各80~90ヌクレオチドの長さ、かつ所望の配列の長さにまたがる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニールすると、凝集末端を含む80~90塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、対中の各オリゴヌクレオチドは、対中の他のオリゴヌクレオチドと相補的である領域を超えて3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニールするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次いで、これらの二本鎖断片のおおよそ5~6個を、粘着性一本鎖末端を介して一緒にアニールさせ、次いで、それらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif.から入手可能なTOPO(登録商標)ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法で配列決定する。一緒にライゲーションされた80~90塩基対断片の5~6個の断片、すなわち、約500塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかを調製し、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表されるようにする。次いで、これらのプラスミドの挿入物を適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして、最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。追加の方法は、当業者にはすぐに明らかであろう。さらに、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能である。
特定の実施形態では、AAVhu68カプシドは、配列番号1の核酸配列、または本明細書に記載の修飾(例えば、脱アミド化アミノ酸)を含む配列番号2のvp1アミノ酸配列をコードする少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%の配列、を使用して産生される。特定の実施形態では、vp1アミノ酸配列は、配列番号2に再現される。
本明細書で使用される、vpカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するvp1、vp2、またはvp3モノマー(タンパク質)を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号2は、AAVhu68 vp1タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。vp1、vp2、およびvp3タンパク質(あるいは、アイソフォームと称される)に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のvp1、vp2、およびvp3タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。AAVカプシドは、vp1タンパク質内、vp2タンパク質内、およびvp3タンパク質内に亜集団を含み、予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン(NまたはAsn)残基が含まれる。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン-グリシン対中の少なくとも1つ、2つ、3つ、または4つの高度脱アミド化アスパラギン(N)位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意の修飾をもたらす。
本明細書で使用される場合、vpタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも1つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも1つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるvpタンパク質の群を指す。
例えば、vp1タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたAAVカプシド中の少なくとも1つの(1)vp1タンパク質であり、すべてのvp1タンパク質未満である。vp3タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたAAVカプシド中のすべてのvp3タンパク質よりも少ない1つ(1)vp3タンパク質であり得る。例えば、vp1タンパク質は、vpタンパク質の亜集団であり得、vp2タンパク質は、vpタンパク質の別個の亜集団であり得、vp3は、組み立てられたAAVカプシド中のvpタンパク質のさらなる亜集団であり得る。別の例では、vp1、vp2、およびvp3タンパク質は、例えば、少なくとも1つ、2つ、3つ、または4つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン-グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含み得る。
別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも45%の脱アミド化、少なくとも50%の脱アミド化、少なくとも60%の脱アミド化、少なくとも65%の脱アミド化、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%、または最大約100%の脱アミド化を指す(例えば、配列番号2(AAVhu68)の番号付けに基づくアミノ酸57での少なくとも80%のアスパラギンは、総vp1タンパク質に基づいて脱アミド化され得、総vp1、vp2、およびvp3タンパク質に基づいて脱アミド化され得る)。かかる割合は、2Dゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。
理論に束縛されることを意図するものではないが、AAVカプシド中のvpタンパク質中の少なくとも高度に脱アミドされた残基の脱アミド化は、本質的に非酵素的であると考えられ、選択されたアスパラギンを脱アミド化するカプシドタンパク質内の官能基、およびより少ない程度でグルタミン残基によって引き起こされる。大部分の脱アミド化vp1タンパク質の効率的なカプシド組み立ては、これらの事象がカプシド組み立て後に生じるか、または個々のモノマー(vp1、vp2、またはvp3)における脱アミドが構造的に十分許容され、ほとんどが組み立て動態に影響を及ぼさないことを示す。一般に、細胞侵入前に内部に位置すると考えられるVP1固有(VP1-u)領域(約aa1~137)における広範な脱アミド化は、カプシド組み立ての前にVP脱アミド化が生じ得ることを示唆する。Nの脱アミド化は、そのC末端残基の骨格窒素原子を介して、Asnの側鎖アミド基炭素原子に対して求核攻撃を行うことによって生じ得る。中間環閉鎖スクシンイミド残基が形成されると考えられる。次いで、スクシンイミド残基は、高速加水分解を行って、最終産物であるアスパラギン酸(Asp)またはイソアスパラギン酸(IsoAsp)をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン(NまたはAsn)の脱アミド化は、AspまたはIsoAspをもたらし、例えば、以下に例示するように、スクシンイミド中間体を介して相互変換され得る。
Figure 2022512589000002
本明細書に提供されるように、VP1、VP2、またはVP3中の各脱アミド化Nは、独立して、アスパラギン酸(Asp)、イソアスパラギン酸(isoAsp)、アスパルテート、および/またはAspおよびisoAspの相互変換ブレンド、またはこれらの組み合わせであり得る。α-およびイソアスパラギン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、10:1~1:10のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約50:50のアスパラギン酸:イソアスパラギン酸、もしくは約1:3のアスパラギン酸:イソアスパラギン酸、または別の選択された比率であり得る。
特定の実施形態では、1つ以上のグルタミン(Q)は、グルタミン酸(Glu)、すなわちα-グルタミン酸、γ-グルタミン酸(Glu)、またはα-およびγ-グルタミン酸のブレンドに脱アミド化され得、共通のグルタリミド中間体を介して相互変換され得る。α-およびγ-グルタミン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、10:1~1:10のα対γ、約50:50のα:γ、もしくは約1: 3のα:γ、または別の選択された比率であり得る。
Figure 2022512589000003
したがって、rAAVは、少なくとも1つの高度脱アミド化アスパラギンを含む少なくとも1つの亜集団を含む、脱アミド化アミノ酸を有するvp1、vp2、および/またはvp3タンパク質のrAAVカプシド中に亜集団を含む。さらに、他の修飾は、特に選択されたアスパラギン酸(DまたはAsp)残基位置での異性化を含み得る。さらに他の実施形態では、修飾は、Asp位置でのアミド化を含み得る。
特定の実施形態では、AAVカプシドは、少なくとも4個~少なくとも約25個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するvp1、vp2、およびvp3の亜集団を含み、そのうちの少なくとも1~10%は、vpタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して脱アミド化される。これらの大部分はN残基であり得る。しかしながら、Q残基は脱アミド化され得る。
特定の実施形態では、rAAVは、実施例1に提供され、参照により本明細書に組み込まれる表に示される位置に、2つ、3つ、4つ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するvp1、vp2およびvp3タンパク質を有するAAVカプシドを有する。rAAVの脱アミド化は、2Dゲル電気泳動、および/または質量分析(MS)、および/またはタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、NanoFlex source(Thermo Fisher Scientific)を備えたQ Exactive HFに結合されたAcclaim PepMapカラムおよびThermo UltiMate 3000 RSLCシステム(Thermo Fisher Scientific)で実行され得る。MSデータは、Q Exactive HFのデータ依存性Top-20法を使用して取得され、調査スキャン(200~2000m/z)から最も豊富なまだ配列決定されていない前駆体イオンを動的に選択する。シーケンシングは、予測自動増加制御で決定された1e5イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行われ、4 m/zのウィンドウで前駆体の単離を行った。m/z 200で120,000の解像度で、調査スキャンを取得した。HCDスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が50ms、正規化された衝突エネルギーが30のm/z200で30,000に設定され得る。S-レンズRFレベルを50に設定して、消化物からのペプチドが占めるm/z領域の透過率を最適化できる。前駆体イオンは、単一、割り当てられていない、または断片化選択から6つ以上の電荷状態で除外され得る。BioPharma Finder 1.0ソフトウェア(Thermo Fischer Scientific)は、取得したデータの分析に使用され得る。ペプチドマッピングのために、固定変更としてカルバミドメチル化が設定された単一エントリのタンパク質FASTAデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド、およびリン酸化の設定、10ppm質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにMS/MSスペクトルに対する信頼レベル0.8を使用して検索を行う。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量+0.984 Da(-OHおよび-NH基の質量差)を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化および天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定される。考えられる脱アミド化部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている等張種は、単一のピークで共移行し得る。したがって、複数の潜在的脱アミド部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の脱アミド部位を特定または区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位において独立していることを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Waters XevoもしくはAgilent 6530などの四重飛行質量分析器(QTOF)、またはOrbitrap FusionまたはOrbitrap Velos(Thermo Fisher)などのオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムとしては、例えば、WatersまたはAgilentシステム(1100または1200シリーズ)からのAcquity UPLCシステムが含まれる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、MassLynx(Waters)、PinpointおよびPepfinder(Thermo Fischer Scientific)、Mascot(Matrix Science)、Peaks DB (Bioinformatics Solutions)が含まれ得る。さらに他の技法は、例えば、2017年6月16日にオンラインで公開されたX. Jin et al,Hu Gene Therapy Methods,Vol. 28,No.5,pp.255-267に記載され得る。
脱アミド化に加えて、他の修飾が生じても、1つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、または酸化を含み得る。
脱アミド化の調節:特定の実施形態では、AAVは、アスパラギン-グリシン対のグリシンを変更し、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、またはアミド基を欠くアミノ酸(例えば、グルタミンおよびアスパラギンが、アミド基を含む)、および/またはアミン基を欠くアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが、アミン基を含む)に変更される。本明細書で使用される場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン、および/またはプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたAAVアミノ酸配列に見出されるアスパラギン-グリシン対のうちの1つ、2つ、または3つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン-グリシン対の4つすべてでは行われない。したがって、AAVおよび/または操作されたAAVバリアントの脱アミドを低減するための方法は、より低い脱アミド率を有する。加えて、または代替え的に、1つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、AAVの脱アミド化を低減し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異体AAVカプシドは、グリシンがアラニンまたはセリンに変化するように、アスパラギン-グリシン対における変異を含む。変異AAVカプシドは、参照AAVが天然に4つのNG対を含む1つ、2つ、または3つの変異を含み得る。特定の実施形態では、AAVカプシドは、参照AAVが天然に5つのNG対を含む1つ、2つ、3つ、または4つのかかる変異を含み得る。特定の実施形態では、変異AAVカプシドは、NG対に単一の変異のみを含む。特定の実施形態では、変異AAVカプシドは、2つの異なるNG対に変異を含む。特定の実施形態では、変異AAVカプシドは、変異を含む2つの異なるNG対であり、AAVカプシド中の構造的に別個の位置に位置する。特定の実施形態では、変異は、VP1固有領域にはない。特定の実施形態では、変異の1つは、VP1固有領域にある。任意選択的に、変異AAVカプシドは、NG対中に修飾を含まないが、NG対の外側に位置する1つ以上のアスパラギンまたはグルタミン中の脱アミド化を最小化または排除するための変異を含む。
特定の実施形態では、野生型AAVカプシド中のNGの1つ以上を排除するAAVカプシドを操作することを含む、rAAVの効力を増加させる方法が提供される。特定の実施形態では、「NG」の「G」のコード配列は、別のアミノ酸をコードするように操作される。以下の特定の例では、「S」または「A」が置換される。しかしながら、他の好適なアミノ酸コード配列が選択され得る。実施例1の表を参照されたい(参照により本明細書に援用される)。
AAVhu68カプシドタンパク質において、4個の残基(N57、N329、N452、N512)は、様々なロットにわたって70%超の脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合、90%超である。さらなるアスパラギン残基(N94、N253、N270、N304、N409、N477、およびQ599)も、様々なロットにわたって最大約20%の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
AAVhu68カプシドは、vp1タンパク質内、vp2タンパク質内、およびvp3タンパク質内に亜集団を含み、配列番号2の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン(NまたはAsn)残基が含まれる。例えば、特定の亜集団は、配列番号2のアスパラギン-グリシン対中に少なくとも1つ、2つ、3つ、または4つの高脱アミド化アスパラギン(N)位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸の変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。配列番号3は、修飾AAVhu68カプシドのアミノ酸配列を提供し、ある割合の脱アミド化アミノ酸または別様に修飾されたアミノ酸を有し得る位置を例示する。これらおよび他の修飾の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。
他の実施形態では、方法は、rAAVの収率を増加させること、したがって、細胞溶解の前に、または細胞溶解を必要とせずに、上清中に存在するrAAVの量を増加させることを伴う。この方法は、AAVhu68 vp1カプシドタンパク質のアミノ酸番号を有する整列に基づいて、AAV VP1カプシド遺伝子を操作して、67位でGlu、157位でVal、または両方を有するカプシドタンパク質を発現させることを含む。他の実施形態では、本方法は、VP2カプシド遺伝子を操作して、157位にValを有するカプシドタンパク質を発現することを伴う。さらに他の実施形態では、rAAVは、67位にGluおよび157位にValの、vp1およびvp2カプシドタンパク質の両方を含む修飾カプシドを有する。
本明細書で使用される場合、「AAV9カプシド」は、複数のAAV9 vpタンパク質からなる自己集合AAVカプシドである。AAV9 vpタンパク質は、典型的には、配列番号23の核酸配列、またはそれと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%の配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現され、GenBank受託番号AAS99264のvp1アミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、「AAV9カプシド」は、AAS99264と99%同一、または配列番号20と99%同一のアミノ酸配列を有するAAVを含む。また、US7906111およびWO2005/033321も参照されたい。本明細書で使用される「AAV9バリアント」には、例えば、WO2016/049230、US8,927,514、US2015/0344911、およびUS8,734,809に記載のバリアントが含まれる。
カプシド、したがってコード配列を生成する方法、およびrAAVを産生するための方法が記載されている。例えば、Gao,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100 (10),6081-6086(2003)およびUS 2013/0045186A1を参照されたい。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って別の核酸(またはその相補鎖)と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約95~99%においてヌクレオチド配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、またはそのオープンリーディングフレーム、または少なくとも15ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」という用語は、最大限対応するように整列させたときに同じである2つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、望ましくは、少なくとも約500~5000個のヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約9個のヌクレオチド、通常は少なくとも約20~24個のヌクレオチド、少なくとも約28~32個のヌクレオチド、少なくとも約36個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列またはその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約8アミノ酸長であり、最大で約700アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、アミノ酸またはその断片に言及する場合、適切なアミノ酸の挿入または欠失を伴って別のアミノ酸(またはその相補鎖)と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約95~99%においてアミノ酸配列の同一性があることを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、もしくはそのタンパク質、例えば、capタンパク質、repタンパク質、または少なくとも8アミノ酸長であるそれらの断片、もしくはより好ましくは、少なくとも15アミノ酸長にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「高度に保存された」という用語は、少なくとも80%の同一性、好ましくは、少なくとも90%の同一性、より好ましくは97%超の同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いることによって、当業者によって容易に決定される。
一般に、2つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列した」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質(アミノ酸)配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損または追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。実施例では、公開されたAAV9配列を参照点として使用してAAV整列を行う。整列は、公共のまたは市販のいずれかの様々な多重配列整列プログラムを用いて行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」、および「MEME」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Vector NTIユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、GCGバージョン6.1のプログラムであるFasta(商標)を用いて比較することができる。Fasta(商標)は、照会配列(query sequence)および検索配列(search sequence)の間の最良の重複領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、GCGバージョン6.1(参照により本明細書に組み込まれる)に提供されるように、Fasta(商標)をそのデフォルトパラメータ(ワードサイズ6およびスコアリングマトリックスのためのNOPAM因子)と共に使用して決定することができる。「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、および「Match-Box」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたは整列が提供される。例えば、J.D.Thomson et al,Nucl.Acids.Res.,“A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)を参照されたい。
III.rAAV
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、遺伝子送達に好適なビヒクルとして記載されている。典型的には、rAAVによる送達のための導入遺伝子(例えば、GLB1遺伝子)を含む外因性発現カセットは、天然AAV源由来の機能的rep遺伝子およびcap遺伝子を置き換え、複製不能なベクターをもたらす。これらrepおよびcapの機能は、ベクター産生システム中にトランスで提供されるが、最終rAAV中には存在しない。
上に示されるように、AAVカプシドおよびベクターゲノムを有するrAAVが提供され、少なくとも、ベクターゲノムをカプシドにパッケージングするのに必要なAAV逆位末端反復(ITR)、GLB1遺伝子、およびそのための発現を導く調節配列を含む。特定の実施形態では、AAVカプシドは、AAVhu68由来である。本明細書の実施例は、一本鎖AAVベクターゲノムを利用するが、特定の実施形態では、自己相補的(sc)AAVベクターゲノムを含むrAAVが本発明に利用され得る。
必要な調節制御要素は、rAAVを取り込む細胞中でその転写、翻訳、および/または発現を可能にする様式で遺伝子(例えば、GLB1)と作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリA、自己切断リンカー(例えば、フーリン、フーリン-F2A、IRES)のうちの1つ以上を含む。以下の実施例は、GLB1遺伝子の発現のために、CB7プロモーター(例えば、配列番号10)、EF1aプロモーター(例えば、配列番号11)、またはヒトユビキチンC(UbC)プロモーター(例えば、配列番号9)を利用する。しかしながら、特定の実施形態では、他のプロモーター、または追加のプロモーターが選択され得る。
特定の実施形態では、GLB1遺伝子に加えて、別の1つ以上の遺伝子産物をコードする非AAV配列が含まれ得る。かかる遺伝子産物は、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能性RNA分子(例えば、miRNA、miRNA阻害剤)、または他の遺伝子産物であり得る。有用な遺伝子産物としては、miRNAも含まれる。miRNAおよび他の低分子干渉核酸は、標的RNA転写産物の切断/分解または標的メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳抑制を介して遺伝子発現を制御する。miRNAは、典型的には、最終的な19~25の非翻訳RNA産物として天然に発現される。miRNAは、標的mRNAの3′非翻訳領域(UTR)との配列特異的相互作用を通してそれらの活性を示す。これらの内因性発現miRNAはヘアピン前駆体を形成し、その後、miRNA二本鎖に、さらに「成熟」一本鎖miRNA分子に処理される。この成熟miRNAは、成熟miRNAとの相補性に基づいて、例えば、3′UTR領域内の標的mRNAの標的部位を特定する、多タンパク質複合体miRISCを誘導する。
AAVベクターゲノムは、典型的には、シス作用性5′および3′逆位末端反復(ITR)配列を含む(例えば、B.J.Carter,in “Handbook of Parvoviruses”,ed.,P.Tijsser,CRC Press,pp.155 168(1990)を参照されたい)。ITR配列は、約145塩基対(bp)の長さである。好ましくは、実質的にITRをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのITR配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。(例えば、Sambrook et al,「Molecular Cloning.A Laboratory Manual”,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989);and K.Fisher et al.,J.Virol.,70:520 532(1996)を参照されたい)。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素が5’および3’AAV ITR配列に隣接する導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ITRは、カプシドを供給するものとは異なるAAV由来である。一実施形態では、ITR配列は、AAV2由来である。D配列および末端分離部位(trs)が欠失している、ΔITRと称される5’ITRの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、完全長AAV5’および3’ITRが使用される。しかしながら、他のAAV起源からのITRが選択されてもよい。ITRの供給源がAAV2由来であり、AAVカプシドが別のAAV供給源由来である場合、得られたrAAVは、シュードタイプであると称され得る。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。
特定の実施形態では、発現制御配列(調節配列)の一部として、例えば、選択される5’ITR配列とコード配列との間に位置する追加的または代替的なプロモーター配列が含まれ得る。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター(例えば、WO2011/126808およびWO2013/04943を参照されたい)、組織特異的プロモーター(例えば、ニューロン特異的プロモーターもしくはグリア細胞特異的プロモーター、またはCNS特異的プロモーター)、または生理学的手がかりに応答するプロモーターが、本明細書に記載のrAAVに利用され得る。プロモーター(複数可)は、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)最初期エンハンサー/プロモーター、SV40最初期エンハンサー/プロモーター、JCポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)または神経膠原線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV-1)潜伏関連プロモーター(LAP)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)長末端反復(LTR)プロモーター、ニューロン特異的プロモーター(NSE)、血小板由来成長因子(PDGF)プロモーター、hSYN、メラニン凝集ホルモン(MCH)プロモーター、CBA、マトリックス金属タンパク質プロモーター(MPP)、およびニワトリβアクチンプロモーターから選択され得る。他の好適なプロモーターは、CB7プロモーターを含み得る。プロモーターに加えて、ベクターゲノムは、1つ以上の他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化(ポリA)シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル、細胞質mRNAを安定化させる配列(例えば、WPRE)、翻訳効率を増強する配列(すなわち、コザックコンセンサス配列)、タンパク質の安定性を増強する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、CMVエンハンサーである。他の適切なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、調節配列は、1つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、調節配列は、2つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、CMV前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する2つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、1つ以上の配列により分離される。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリβアクチンイントロンをさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン(CI)であり、ヒトβ-グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンG(IgG)スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロンである。他の好適なイントロンとしては、例えば、WO2011/126808に記載されるものなど、当該技術分野で既知のイントロンが含まれる。好適なポリA配列の例には、例えば、SV40、SV50、ウシ成長ホルモン(bGH)、ヒト成長ホルモン、および合成ポリAが含まれる。任意選択的、1つ以上の配列を選択して、mRNAを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾WPRE配列であり、これは、ポリA配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る(例えば、MA Zanta-Boussif,et al,Gene Therapy(2009)16: 605-619)。特定の実施形態では、WPRE配列は、存在しない。
特定の実施形態では、5’AAV ITR-プロモーター-任意選択的なエンハンサー-任意選択的なイントロン-GLB1遺伝子-ポリA-3’ITRを含むベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、ITRは、AAV2由来ではない。特定の実施形態では、2つ以上のプロモーターが存在する。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、2つ以上のエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサーおよびイントロンが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン(CI)であり、ヒトβ-グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンG(IgG)スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロンである。特定の実施形態では、ポリAは、SV40ポリA(すなわち、サルウイルス40(SV40)後期遺伝子に由来するポリアデニル化(PolyA)シグナル)である。特定の実施形態では、ポリAは、ウサギベータグロビン(RBG)ポリAである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、5’AAV ITR-CB7プロモーター-GLB1遺伝子-RBGポリA-3’ITRを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、5’AAV ITR-EF1aプロモーター-GLB1遺伝子-SV40ポリA-3’ITRを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、5’AAV ITR-UbCプロモーター-GLB1遺伝子-SV40ポリA-3’ITRを含む。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号5を有する。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号6を有する。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号7を有する。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号8を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号12の配列、またはそれと少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%~約99.9%同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号13の配列、またはそれと少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%~約99.9%同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号14の配列、またはそれと少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%~約99.9%同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号15の配列、またはそれと少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%~約99.9%同一の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号16の配列、またはそれと少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%~約99.9%同一の配列を有する。
IV.rAAVベクターの産生
AAVウイルスベクター(例えば、組換え(r)AAV)の産生における使用のために、ベクターゲノムは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミドに担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製およびパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術およびパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ/または当業者によって容易に設計することができる。例示的な産生プロセスは、図12A~12Bに提供される。
ベクターとしての使用に好適なAAVを生成および単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Grieger & Samulski,2005,Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development,production and clinical applications,Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.99:119-145;Buning et al.,2008,Recent developments in adeno-associated virus vector technology,J.Gene Med.10:717-733、および以下に引用される参考文献を参照されたい(これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ITRは、遺伝子を含む核酸分子と同じ構築物においてシスで必要とされる唯一のAAV成分である。capおよびrep遺伝子は、トランスで供給され得る。
一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速DNAコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってAAVパッケージ細胞に送達され得る。安定したAAVパッケージ細胞も作製することができる。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,ed.Green and Sambrook,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2012)を参照されたい。
用語「AAV中間体」または「AAVベクター中間体」は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたrAAVカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含まないか、または遺伝子産物(例えばβ-gal)の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、目的の遺伝子を宿主細胞に導入するために非機能的である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1または本明細書に記載される組成物は、AAV中間体を少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.9%の含まない、すなわち、AAV中間体が20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、または0.1%未満であってもよい。
本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)は、既知の技術を使用して生成され得る。例えば、 WO2003/042397;WO2005/033321、WO2006/110689;US7588772 B2を参照されたい。かかる方法は、AAVカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的rep遺伝子、最低限でもAAV逆方向末端反復(ITR)および導入遺伝子からなる発現カセット、ならびに発現カセットをAAVカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、およびrAAVウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Gao,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)およびUS 2013/0045186A1を参照されたい。
一実施形態では、組換えAAV(rAAVhu68など)を産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞でAAVカプシドタンパク質を発現する核酸、AAVカプシド中にパッケージングするのに好適な核酸分子、例えば、AAV ITRを含むベクターゲノム、および細胞(例えば、必要としている患者の細胞)で遺伝子の発現を導く調節配列と作動可能に連結されたGLB1遺伝子、ならびに組換えAAVカプシドへのベクターゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なAAV rep機能およびアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞(例えば、とりわけヒト胚性腎臓293細胞)または昆虫細胞(例えば、ヨトウガSpodoptera frugiperda(Sf9)細胞)で構成される。特定の実施形態では、バキュロウイルスは、組換えAAVhu68カプシド中にベクターゲノムをパッケージングするのに必要なヘルパー機能を提供する。
任意選択的に、rep機能は、カプシド源AAV AAVhu68以外のAAVによって提供される。特定の実施形態では、rep機能の少なくとも一部は、AAVhu68由来である。別の実施形態では、repタンパク質は、AAVhu68以外の異種repタンパク質であり、例えば、限定されないが、AAV1 repタンパク質、AAV2 repタンパク質、AAV3 repタンパク質、AAV4 repタンパク質、AAV5 repタンパク質、AAV6 repタンパク質、AAV7 repタンパク質、AAV8 repタンパク質、またはrep78、rep68、rep52、rep40、rep68/78、およびrep40/52、またはそれらの断片、あるいは別の供給源であり得る。これらのAAVhu68または変異体AAVカプシド配列のうちのいずれかは、宿主細胞でそれらの発現を導く外因性調節制御配列の制御下にあり得る。
一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物(例えば、HEK293またはSf9)または懸濁液で製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドDNAの産生、ベクターの産生、およびベクターの精製を含む。一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、rAAVであり、産生されたプラスミドは、目的の遺伝子を含むAAVベクターゲノムをコードするシス-プラスミド、AAV repおよびcap遺伝子を含有するAAVトランス-プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター産生プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドDNAを用いた細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ベクター含有細胞および培養培地の回収などの方法工程を含むことができる。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。さらに別のシステムでは、遺伝子治療ベクターは、バキュロウイルスベースベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Zhang et al.,2009,Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,Human Gene Therapy 20:922-929を参照されたく、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらおよび他のAAV生産システムの製造および使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる:5,139,941、5,741,683、6,057,152、6,204,059、6,268,213、6,491,907、6,660,514、6,951,753、7,094,604、7,172,893、7,201,898、7,229,823、および7,439,065。
粗細胞回収物は、その後、rAAV回収物の濃縮、rAAV回収物の透析濾過、rAAV回収物の顕微溶液化、rAAV回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過によるバッファー交換、および/またはバルクrAAVを調製するための製剤化および濾過などの方法工程に供される。
2工程の高塩濃度でのアフィニティークロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、rAAV製剤を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、2016年12月9日に出願されたWO2017/160360、国際特許出願第PCT/US2016/065970号、およびその優先権書類、2016年4月13日に出願された米国特出願第許第62/322,071号、および2015年12月11日に出願された「Scalable Purification Method for AAV9」という名称の同第62/226,357号により詳細に記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
空のおよび完全粒子含有量を算出するために、選択された試料(例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配-精製された調製物、ここで(GC)=粒子の数)についてのVP3バンド容量が、ロードされたGC粒子に対してプロットされる。得られた直線等式(y=mx+c)を使用して、試験物質ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、負荷した20μL当たりの粒子の数(pt)に50を掛けて、粒子(pt)/mLを得る。Pt/mLをGC/mLで除算して、ゲノムコピーに対する粒子の比(pt/GC)を得る。Pt/mL~GC/mLは、空のpt/mLを与える。空のpt/mLをpt/mLで除算して、次いで、x100をすることにより、空の粒子のパーセンテージを得る。
一般に、空のカプシドおよびパッケージされたゲノムを含むrAAV粒子のためのアッセイ方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Grimm et al.,Gene Therapy(1999)6:1322-1330;Sommer et al.,Molec.Ther.(2003)7:122-128を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、方法は、例えば、緩衝液中3~8%のTris-アセテートを含有する勾配ゲルなどの3つのカプシドタンパク質を分離可能な任意のゲルからなるSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みAAVストックを供すること、次いで、試料材料が分離するまでゲルをランさせること、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレン、好ましくは、ナイロンにゲルをブロットすることを含む。抗-AAVカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗-AAVカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、B1抗-AAV-2モノクローナル抗体に結合する一次抗体として使用される(Wobus et al.,J.Virol.(2000)74:9281-9293)。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗-IgG抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗-マウスIgG抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次および二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または発色変化を検出可能な検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、SDS-PAGEのために、カラムフラクションからの試料が、採集され、還元剤(例えば、DTT)を含有するSDS-PAGEロード用緩衝液中で加熱され、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル(例えば、Novex)上で分解される。SilverXpress(Invitrogen、CA)を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の適切な染色方法、すなわち、SYPROルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のAAVベクターゲノム(vg)の濃度は、定量的リアルタイムPCR(Q-PCR)により測定されることができる。試料は希釈され、DNaseI(または別の適切なヌクレアーゼ)で消化されて、外因性DNAが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のDNA配列に特異的なTaqMan(商標)蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光(閾値サイクル、Ct)に到達するのに必要とされるサイクル数は、Applied Biosystems Prism 7700配列検出システム上で各試料について測定される。rAAV中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドDNAを使用して、Q-PCR反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値(Ct)値を用いて、プラスミド標準曲線のCt値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルPCRに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。
一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼK(例えば、Qiagenから商業的に入手可能なもの)を利用する最適化されたq-PCR方法が使用される。より具体的には、最適化されたqPCRゲノム力価アッセイは、DNaseI消化の後に、試料をプロテアーゼK緩衝液で希釈し、プロテアーゼKで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼK緩衝液で希釈される。プロテアーゼK緩衝液は、2倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテアーゼK治療は、約0.2mg/mLであるが、0.1mg/mL~約1mg/mLで変動し得る。処理工程は、一般に、約55℃で約15分間実施されるが、より低い温度(例えば、約37℃~約50℃)でより長時間(例えば、約20分間~約30分間)、またはより高い温度(例えば、最高約60℃)でより短時間(例えば、約5~10分間)実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約95℃で約15分間であるが、温度を下げてもよく(例えば、約70~約90℃)、時間を延ばしてもよい(例えば、約20分間~約30分間)。次いで、試料は希釈され(例えば、1000倍)、標準アッセイで記載されるように、TaqMan分析に供される。
追加的に、または代替的には、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)が使用されてもよい。例えば、ddPCRによる一本鎖および自己相補的なAAVベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods.2014 Apr;25(2):115-25. doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14を参照されたい。
簡潔に言うと、パッケージされたゲノム配列を有するrAAVhu68粒子をゲノム欠損AAVhu68中間体から分離するための方法は、組換えAAVhu68ウイルス粒子およびAAVhu68カプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィーに供することを含み、AAVhu68ウイルス粒子およびAAVhu68中間体は、約10.2のpHで平衡化された強力なアニオン交換樹脂に結合され、約260ナノメートル(nm)および約280nmで紫外吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。rAAVhu68にはあまり最適ではないが、pHは約10.0~10.4の範囲であり得る。この方法では、AAVhu68完全カプシドは、A260/A280の比が変曲点に到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティークロマトグラフィー工程のために、透析濾過された産物を、AAV2/hu68血清型を効率的に捕らえるCapture Select(商標)Poros-AAV2/9アフィニティー樹脂(Life Technologies)に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞DNAおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、AAV粒子は効率的に捕捉する。
また、産生ベクター(プラスミドなど)、または本明細書に記載されるベクターゲノムおよび/もしくはrAAV.GLB1を産生するための宿主細胞も、本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを生成および/またはパッケージングするために、ベクターゲノムを宿主細胞に運ぶ産生ベクター。
rAAV.GLB1(例えば、rAAVhu68.GLB1)は、好適な生理学的に適合性の組成物(例えば、緩衝生理食塩水)中に懸濁される。この組成物は、保管のために凍結され、後に解凍され、任意選択的に、好適な希釈剤で希釈され得る。あるいは、rAAV.GLB1は、凍結および解凍ステップを進めることなく患者への送達に好適な組成物として調製され得る。
V.組成物および使用
本明細書では、少なくとも1つのrAAVストック(例えば、rAAVhu68ストックまたは変異体rAAVhu68ストック)および任意選択的な担体、賦形剤および/または防腐剤を含む組成物を提供する。rAAVストックは、同じである複数のrAAVを指し、例えば、濃度および用量単位の考察において以下に記載される量である。
特に、組成物は、GM1ガングリオシドーシスの治療用である。一実施形態では、組成物は、GM1ガングリオシドーシスを有する患者、または18ヶ月齢以下の乳児ガングリオシドーシスを有する患者への投与に好適である。一実施形態では、組成物は、GM1ガングリオシドーシスの症状を改善するために、またはGM1ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善するために、それを必要とする患者への投与に好適である。一部の実施形態では、組成物は、GM1ガングリオシドーシスの治療のための薬剤の製造に使用するためのものである。
本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるrAAV.GLB1および薬学的に許容される担体を含む組成物が本明細書に提供される。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。
特定の実施形態では、本明細書に記載のrAAV.GLB1および送達ビヒクルを含む組成物が本明細書に提供される。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、rAAV送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。
一実施形態では、組成物は、対象/患者への送達に好適な最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するpHおよび塩濃度に緩衝された水性液体懸濁液である。任意選択的に、1つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。
好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、例えば、中性pHを有し、平均分子量8400を有するポロキサマー188としても知られているPluronic(登録商標)F68[BASF]などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン(ポリ(エチレンオキシド))の2つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン(ポリ(プロピレンオキシド))の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、SOLUTOL HS 15(マクロゴール-15ヒドロキシステアラート)、LABRASOL(ポリオキシカプリン酸グリセリド)、ポリオキシ10オレイルエーテル、TWEEN(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル)、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「P」(ポロキサマーについて)に続いて、3桁数字を用いて命名され、初めの2桁数字x100は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字x10は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー188が選択される。一実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約0.0005%~約0.001%(w/w%、重量比に基づく)の量で存在し得る。別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約0.0005%~約0.001%(v/v%、体積比に基づく)の量で存在し得る。さらに別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約0.0005%~約0.001%の量で存在し、ここで、n%は、懸濁液100mL当たりのnグラムを示す。
rAAV.GLB1は、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは医学分野の当業者によって決定され得る。従来のおよび薬学的に許容される投与経路には、限定されないが、所望の臓器(例えば、脳、CSF,肝臓(任意選択的に、肝動脈を介して)、肺、心臓、眼、腎臓)への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、実質内、髄腔内、ICM、腰椎穿刺、および他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
rAAV.GLB1の用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、rAAV.GLB1の治療有効なヒト投与量は、概して、約1×10~1×1016ベクターゲノムコピーの濃度を含有する約25~約1000マイクロリットル~約100mLの溶液の範囲である。特定の実施形態では、約1mL~約15mL、または約2.5mL~約10mL、または約5mL懸濁液の体積が送達される。特定の実施形態では、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、または約15mLの懸濁液の体積が送達される。
一部の実施形態では、組成物は、単回用量での投与用である。一部の実施形態では、組成物は、複数回投与用である。
特定の実施形態では、患者当たり約8x1012ゲノムコピー(GC)のrAAV.GLB1~患者当たり約3x1014GCのrAAV.GLB1の用量が、本明細書に記載の体積で投与される。特定の実施形態では、患者当たり約2x1012GCのrAAV.GLB1~患者当たり約3x1014GCのrAAV.GLB1、または患者当たり約2x1013GCのrAAV.GLB1~患者当たり約3x1014GCのrAAV.GLB1、または患者当たり約8x1013GCのrAAV.GLB1~患者当たり約3x1014GCのrAAV.GLB1、または患者当たり約9x1013GCのrAAV.GLB1、または合計約8.9x1012~2.7x1014GCの用量の体積で投与される。
特定の実施形態では、脳質量1グラム当たり1x1010GCのrAAV.GLB1(GC/g脳質量)~3.4x1011GC/g脳質量の用量が、本明細書に記載される体積で投与される。特定の実施形態では、3.4x1010GC/g脳質量~3.4x1011GC/g脳質量、または1.0x1011GC/g脳質量~3.4x1011GC/g脳質量、または約1.1x1011GC/g脳質量、または約1.1x1010GC/g脳質量~約3.3x1011GC/g脳質量の用量が、体積で投与される。特定の実施形態では、脳質量1グラム当たり約3.0x10、約4.0x10、約5.0x10、約6.0x10、約7.0x10、約8.0x10、約9.0x10、約1.0x1010、約1.1x1010、約1.5x1010、約2.0x1010、約2.5x1010、約3.0x1010、約3.3x1010、約3.5x1010、約4.0x1010、約4.5x1010、約5.0x1010、約5.5x1010、約6.0x1010、約6.5x1010、約7.0x1010、約7.5x1010、約8.0x1010、約8.5x1010、約9.0x1010、約9.5x1010、約1.0x1011、約1.1x1011、約1.5x1011、約2.0x1011、約2.5x1011、約3.0x1011、約3.3x1011、約3.5x1011、約4.0x1011、約4.5x1011、約5.0x1011、約5.5x1011、約6.0x1011、約6.5x1011、約7.0x1011、約7.5x1011、約8.0x1011、約8.5x1011、約9.0x1011GCの用量が、体積で投与される。特定の実施形態では、用量は、GM1動物モデルで示された最小有効用量を反映し、脳質量1グラム当たりのゲノムコピーに基づいて、ヒト患者で使用するために調整された。一実施形態では、ヒト患者で使用するための用量は、以下の表に列挙される想定脳質量を使用して計算される。
Figure 2022512589000004
任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、かかる投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、rAAV.GLB1が利用されるための治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子産物(例えばβ-gal)の発現のレベルをモニタリングして、rAAV.GLB1、好ましくはミニ遺伝子(例えば、GLB1遺伝子)を含有するrAAVをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されるものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫に利用され得る。
複製欠陥ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者にとって、約1.0×10GC~約1.0×1016GCの範囲にある量の複製欠陥ウイルス(例えば、rAAV.GLB1,rAAVhu68.GLB1またはrAAVhu68.UbC.GLB1)を含み、その範囲内の全ての整数または小数量、好ましくは1.0×1012GC~1.0×1014GCを含むことができる。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも1x10、2x10、3x10、4x10、5x10、6x10、7x10、8x10、または9x10GCを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、または9x1010 GCを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数を含む、用量当たり少なくとも1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、または9x1011GCを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも1x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、または9x1012 GCを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも1x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、7x1013、8x1013、または9x1013 GCを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、または9x1014 GCを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、または9x1015 GCを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内の全ての整数または分数量を含む、用量当たり1×1010~約1×1012GCの範囲であり得る。
これらの上記用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約25~約1000マイクロリットルの範囲の様々な容量の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤、またはその範囲内のすべての数を含むより高い容量で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、または緩衝液の容量は、少なくとも約25μLである。一実施形態では、容量は、約50μLである。別の実施形態では、容量は、約75μLである。別の実施形態では、容量は、約100μLである。別の実施形態では、容量は、約125μLである。別の実施形態では、容量は、約150μLである。別の実施形態では、容量は、約175μLである。さらに別の実施形態では、容量は、約200μLである。別の実施形態では、容量は、約225μLである。さらに別の実施形態では、容積は、約250μLである。さらに別の実施形態では、容積は、約275μLである。さらに別の実施形態では、容積は、約300μLである。さらに別の実施形態では、容積は、約325μLである。別の実施形態では、容量は、約350μLである。別の実施形態では、容量は、約375μLである。別の実施形態では、容量は、約400μLである。別の実施形態では、容量は、約450μLである。別の実施形態では、容量は、約500μLである。別の実施形態では、容量は、約550μLである。別の実施形態では、容量は、約600μLである。別の実施形態では、容量は、約650μLである。別の実施形態では、容量は、約700μLである。別の実施形態では、容量は、約700μL~1000μLである。
特定の実施形態では、用量は、約1x10GC/g脳質量~約1x1012GC/g脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約3x1010GC/g脳質量~約3x1011GC/g脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約5x1010GC/g脳質量~約1.85x1011GC/g脳質量の範囲であり得る。
一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約1×10GC~約1×1015、または約1×1011~5×1013GCの用量で送達され得る。これらの用量の送達に適切な容量および濃度は、当業者により決定され得る。例えば、約1μL~150mLの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人のために選択され得る。典型的に、新生児幼児のために、適切な容量は、約0.5mL~約10mL、より年齢の高い乳幼児のためには、約0.5mL~約15mLが選択され得る。幼児のために、約0.5mL~約20mLの容量が選択され得る。小児のために、最大約30mLの容量が選択され得る。プレティーンおよびティーン世代のために、最大約50mLの容量が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約5mL~約15mL、または約7.5mL~約10mLの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の適切な容量および投薬量が決定され得る。任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、rAAV.GLB1が利用されるための治療用途に応じて変化し得る。
上述のrAAV.GLB1は、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたrAAVは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、rAAVは、食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性のある塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるpH、例えば、pH6~9、またはpH6.0~7.5、またはpH6.2~7.7、またはpH6.5~7.5、pH7.0~7.7、またはpH7.2~7.8、または約pH7.0の範囲に調整される。特定の実施形態では、製剤は、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、または約7.8のpHに調整される。特定の実施形態では、髄腔内送達の場合、約7.28~約7.32、約6.0~約7.5、約6.2~約7.7、約7.5~約7.8、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、または約7.8のpHが望ましいが、静脈内送達の場合、約6.8~約7.2のpHが望ましい可能性がある。しかしながら、より広範囲にある他のpH、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。
別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および/またはアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、1つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液(例えば、リン酸緩衝食塩水)と共に製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。緩衝液/担体は、rAAVが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでrAAV結合活性を妨げない成分を含むべきである。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤のうちから選択され得る。一実施形態では、例えば、中性pHを有し、平均分子量8400を有するポロキサマー188(商品名Pluronic(登録商標)F68[BASF]、Lutrol(登録商標)F68、Synperonic(登録商標)F68、Kolliphor(登録商標)P188としても知られている)などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン(ポリ(エチレンオキシド))の2つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン(ポリ(プロピレンオキシド))の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、SOLUTOL HS 15(マクロゴール-15ヒドロキシステアラート)、LABRASOL(ポリオキシカプリン酸グリセリド)、ポリオキシ-オレイルエーテル、TWEEN(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル)、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「P」(ポロキサマーについて)に続いて、3桁数字を用いて命名され、初めの2桁数字x100は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字x10は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー188が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約0.0005%~約0.001%の量で存在し得る。
一実施例では、製剤は、例えば、水中に、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム(例えば、硫酸マグネシウム・7HO)、塩化カリウム、塩化カルシウム(例えば、塩化カルシウム・2HO)、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの1つ以上を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達のためには、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内(例えば、約275~約290ミリオスモル/リットル(mOsm/L))である。例えば、emedicine.medscape.com/-article/2093316-overviewを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達のために、商業的に入手可能な希釈剤は、懸濁化剤として使用され得るか、または別の懸濁化剤および他の任意の賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、ElliottsB(登録商標)溶液[Lukare Medical]を参照されたい。各10mLのElliottsB溶液には以下が含まれる:
塩化ナトリウム、USP 73mg
重炭酸ナトリウム、USP 19mg
デキストロース、USP 8mg
硫酸マグネシウム・7HO、USP 3mg
塩化カリウム、USP 3mg
塩化カルシウム・2HO、USP 2mg
リン酸ナトリウム、二塩基性・7HO、USP 2mg
水(注入用)、USP 10mL適量
電解質の濃度:
ナトリウム 149mEq/リットル
重炭酸 22.6mEq/L
カリウム 4.0mEq/リットル
塩素 132mEq/リットル
カルシウム 2.7mEq/リットル
硫酸 2.4mEq/リットル
マグネシウム 2.4mEq/リットル
リン酸 1.5mEq/リットル
成分の式および分子量は、
Figure 2022512589000005
Elliotts B溶液のpHは6~7.5であり、モル浸透圧濃度は、1リットル当たり288mOsmolである(計算値)。
特定の実施形態では、髄腔内最終製剤緩衝液(ITFFB)製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの1つ以上を含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約0.0005%~約0.001%を含む。さらなる実施形態では、パーセンテージ(%)は、重量(w)比(すなわち、w/w)に基づいて計算される。
特定の実施形態では、rAAVhu68.GLB1(例えば、ITFFB製剤)を含有する組成物は、pHが、6.0~7.5、または6.2~7.7、または6.8~8、または7.2~7.8、または7.5~8の範囲にある。特定の実施形態では、最終製剤は、pHが、約7、または7~7.4、または7.2である。特定の実施形態では、髄腔内送達の場合、pHが、7.5超、例えば、7.5~8、または7.8が望ましい可能性がある。
特定の実施形態では、髄腔内送達ならびに他の送達経路には、約7のpHが望ましい。
特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびそれらの混合物のうちの1つ以上を含む。水溶液は、以前はLutrol(登録商標)F68という商品名で販売されていたBASFから市販されているポロキサマーであるKolliphor(登録商標)P188をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、水溶液は、7.2のpHを有し得る。特定の実施形態では、水溶液は、約7のpHを有し得る。
別の実施形態では、製剤は、1mMのリン酸ナトリウム(NaPO)、150mMの塩化ナトリウム(NaCl)、3mMの塩化カリウム(KCl)、1.4mMの塩化カルシウム(CaCl)、0.8mMの塩化マグネシウム(MgCl)、および0.001%のポロキサマー(例えば、Kolliphor(登録商標))188を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。特定の実施形態では、製剤は、約7.2のpHを有する。特定の実施形態では、製剤は、約7のpHを有する。例えば、harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html.を参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液は、ハーバード緩衝液でより良好なpH安定性が観察されるため、好ましい。以下の表は、ハーバードの緩衝液とエリオットB緩衝液の比較を提供する。
Figure 2022512589000006
特定の実施形態では、製剤緩衝液は、Pluronic F68を含む人工CSFである。他の実施形態では、製剤は、1つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、またはEDTAを含み得る。
任意選択的に、本発明の組成物は、rAAVおよび担体(複数可)に加えて、防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の薬学的成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
本発明による組成物は、上記に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載される組成物は、有効量の薬学的に好適な担体に懸濁された、および/または注入、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別のデバイスもしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された1つ以上のAAVを含む。一実施例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化される。一実施形態では、組成物は、大槽内注入(ICM)を介した投与用に製剤化される。一実施形態では、組成物は、大槽内へのCTガイドの後頭下注入を介した投与用に製剤化される。
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注入による、より詳細には、脳脊髄液(CSF)へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内(側脳室内(ICV)を含む)、後頭下/槽内、および/またはC1-2穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。
本明細書で使用される場合、「槽内送達」または「槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、または大槽内への直接的な注入による、永久的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。
特定の実施形態では、製剤緩衝液および本明細書に提供されるrAAV.GLB1(例えば、rAAVhu68.GLB1)を含む水性組成物が、それを必要とする患者に送達される。特定の実施形態では、rAAV.GLB1は、AAVカプシド(例えば、AAVhu68カプシド)および5’AAV ITR-プロモーター-任意選択的なエンハンサー-任意選択的なイントロン-GLB1遺伝子-ポリA-3’ITRを含むベクターゲノムを有する。特定の実施形態では、ITRは、AAV2由来ではない。特定の実施形態では、2つ以上のプロモーターが存在する。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、2つ以上のエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサーおよびイントロンが存在する。特定の実施形態では、ポリAは、SV40ポリAである。特定の実施形態では、ポリAは、ウサギβ-グロビン(RBG)ポリAである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、5’AAV ITR-CB7プロモーター-GLB1遺伝子-RBGポリA-3’ITRを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、5’AAV ITR-EF1aプロモーター-GLB1遺伝子-SV40ポリA-3’ITRを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、5’AAV ITR-UbCプロモーター-GLB1遺伝子-SV40ポリA-3’ITRを含む。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号5を有する。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号6を有する。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号7を有する。特定の実施形態では、GLB1遺伝子は、配列番号8を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号12の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号13の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号14の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号15の配列を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号16の配列を有する。
特定の実施形態では、最終製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの1つ以上を含む、人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約0.0005%~約0.001%である。特定の実施形態では、界面活性剤は、Pluronic F68である。特定の実施形態では、Pluronic F68は、懸濁液の約0.0001%の量で存在する。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内送達の場合、pHが7.5~7.8の範囲である。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内送達の場合、pHが、6.2~7.7、もしくは6.9~7.5の範囲、または約7である。一実施形態では、パーセンテージ(%)は、重量比または体積比に基づいて計算される。別の実施形態では、パーセンテージは、「最終体積100ml当たりのグラム数」を表す。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の治療は、感覚神経毒性および無症状性感覚ニューロン病変に関して良好な耐容される、動物および/またはヒト患者におけるDRG感覚ニューロンの最小~軽度の無症状変性を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、治療される対象/患者の機能的転帰および臨床転帰の改善に有用である。かかる転帰は、組成物の投与後、約30日、約60日、約90日、約4ヶ月、約5ヶ月、約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、約12ヶ月、約13ヶ月、約14ヶ月、約15ヶ月、約16ヶ月、約17ヶ月、約18ヶ月、約19ヶ月、約20ヶ月、約21ヶ月、約22ヶ月、約23ヶ月、約24ヶ月、約2.5年、約3年、約3.5年、約4年、約4.5年で測定されてもよく、次いで毎年、約5年まで測定されてもよい。測定頻度は、約1か月毎、約2か月毎、約3か月毎、約4か月毎、約5か月毎、約6か月毎、約7か月毎、約8か月毎、約9か月毎、約10か月毎、約11か月毎、または約12か月毎であり得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、未治療の対照と比較して、治療された対象において測定される薬物動態および臨床有効性を示す。
特定の実施形態では、薬物動態の有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、以下のうちの1つ以上を介して測定され得る:(1)生存、(2)栄養管の非依存性性、(3)発作日記、例えば発作の発生率、発症、頻度、長さ、および発作の種類、(4)生活の質、例えばPedsQLによって測定される、(5)神経認知および行動発達、(6)例えば血清またはCSFにおけるβ-gal酵素発現または活性、ならびに(7)本明細書に記載される他のパラメータ。乳児発達のベイリー尺度(Bayley Scales of Infant Development)およびヴァインランド尺度(Vineland Scales)は、組成物が、適応行動、認知、言語、運動機能、および健康に関連する生活の質における発達および/または変化に及ぼす影響を定量化するために使用され得る。
特定の実施形態では、神経認知発達は、以下のうちの1つ以上に基づく:乳幼児発達のベイリー尺度(Bayley Scales of Infant and Toddler Development)の年齢等価認知、粗大運動、微細運動、受容的および表現的コミュニケーションのスコアの変化、ヴァインランドの適応行動尺度(Vineland Adaptive Behavior Scales)の各ドメインの標準スコアの変化、ならびに小児の生活の質調査(Pediatric Quality of Life Inventory、PedsQL)および小児の生活の質調査の乳児尺度(Pediatric Quality of Life Inventory Infant Scale、PedsQL-IS)の総スコアの変化による小児の生活の質。
BSID(Bayley Scale of Infant Development、乳児発達のベイリー尺度):主に、1~42ヶ月齢の乳幼児の発達を評価するために使用される(Albers and Grieve,2007,Test Review: Bayley,N.(2006).Bayley Scales of Infant and Toddler Development- Third Edition.San Antonio,TX: Harcourt Assessment.Journal of Psychoeducational Assessment.25(2):180-190)。これは、標準化された一連の発達遊びタスクで構成され、うまく完了したアイテムの素のスコアを、スコアと複合スコアに変換し、スコアを、典型的には同じ年齢の発達している子供から得られた標準と比較することによって、発達指数を導き出す。Bayley-IIIには、3つの主なサブテストがある:認知尺度には、見慣れているオブジェクトと見慣れていないオブジェクトへの注意、落ちているオブジェクトを探すこと、遊んでいるふりをすることなどの項目が含まれる。言語尺度には、言語の理解と表現を評価する(例えば、方向に従う能力とオブジェクトに名前を付ける能力)。および運動尺度には、粗大運動スキルと微細運動スキル(例えば、掴むこと、座ること、ブロックを積み重ねること、階段を登ること)を測定する。最新バージョンはBSID-IIIである。
ヴァインランド(Vineland):コミュニケーション、日常生活スキル、社会化、運動スキル、不適応行動の5つの領域にわたって、誕生から成人(0~90歳)までの適応行動を評価する。最新バージョンはVineland IIIである。Vineland-IIからVineland-IIIへの改善には、発達障害をよりよく理解するための質問が組み込まれている。
BSIDおよびVinelandは、乳児GM1ガングリオシドーシス患者の前向き研究のみからのデータに基づいて選択される(Brunetti-Pierri and Scaglia,2008,GM1 gangliosidosis: Review of clinical,molecular,and therapeutic aspects.Molecular Genetics and Metabolism.94(4):391-396.)。BSID-IIIの年齢等価スコアは、認知および粗大運動のドメインの両方について28ヶ月齢までに試験尺度の床への低下を示し、Vineland-II適応行動尺度のスコアは、28ヶ月齢までには、正常をはるかに下回るものの、測定可能なままであった。これらのツールは床効果(floor effect)を示しているが、この重度の障害のある集団の発達変化を測定するための適切な尺度であることが示され、尺度の交差文化的妥当性により、国際的な研究に適している。
PedsQOLおよびPedsQL-IS:重度の小児疾患の場合と同様に、疾患の家族への負担は著しい。小児の生活の質調査(Pediatric Quality of Life Inventory(商標))は、子供とその親の生活の質を評価するための検証されたツールである(親の代理人レポートによる)。これは、健康な子供と青少年で検証され、様々な小児疾患で使用されてきた(Iannaccone et al.,2009,The PedsQL in pediatric patients with Spinal Muscular Atrophy:feasibility,reliability,and validity of the Pediatric Quality of Life Inventory Generic Core Scales and Neuromuscular Module.Neuromuscular disorders : NMD.19(12):805-812、Absoud et al.,2011,Paediatric UK demyelinating disease longitudinal study (PUDDLS).”BMC Pediatrics.11(1):68、およびConsolaro and Ravelli, 2016,hapter 5-Assessment Tools in Juvenile Idiopathic Arthritis.Handbook of Systemic Autoimmune Diseases.R.Cimaz and T.Lehman,Elsevier.11:107-127)。したがって、PedsQLは、rAAV.GLB1が患者およびその家族の生活の質に及ぼす影響を評価するために含まれている。これは、2歳以上の子供の親に適用することができ、したがって、5年間のフォローアップ期間にわたる子供の年齢として有益であり得る。小児の生活の質調査の乳児尺度(Pediatric Quality of Life Inventory Infant Scale(商標))(Varni et al., 2011,”The PedsQL(商標)Infant Scales:feasibility,internal consistency reliability,and validity in healthy and ill infants.”Quality of Life Research.20(1):45-55.)は、親によって記入された検証済みモジュラー手段であり、特に1~24ヶ月齢の健康な乳児および病気の乳児のための健康関連の生活の質の手段を測定するように設計されている。
標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録によって運動スキルが達成したか、他の運動マイルストーンを発達させてその後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の兆しがまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成された年齢と失なわれた年齢を追跡する。運動マイルストーン達成は、第I節のGM1および治療用GLB1遺伝子の下で本明細書に提供される表に概説されるWHO基準に基づいて、6つの粗大マイルストーンについて定義される。乳児GM1ガングリオシドーシスを有する対象は、生後数ヶ月以内に症状を発症する可能性があり、第1のWHO運動マイルストーン(支えなしで座ること)の獲得は、典型的には、4ヶ月齢より前には現れないことを考慮すると(中央値:5.9ヶ月齢)、このエンドポイントは、特に治療時により明らかな症状を有していた対象において、治療的利益の程度を評価するための感度を欠く場合がある。このため、乳児に適用され得る年齢に適した発達マイルストーンの評価も含まれる(Scharf et al.,2016,Developmental Milestones.Pediatr Rev.37(1):25-37;quiz 38,47.)。1つの欠点は、公開されたツールは、臨床医および保護者が使用することを意図しており、通常の範囲を参照せずにマイルストーン獲得の典型的な年齢を中心としたスキルを整理することである。しかしながら、データは、乳児GM1疾患を有する未治療の子供または定型発達の子供における典型的な獲得時間と比較して、経時的な発達マイルストーンの保持、獲得、または喪失を要約するために有益であり得る。
疾患が進行すると、子供は発作を起こす可能性がある。発作活動の開始により、rAAV.GLB1による治療が、発作の発症を予防もしくは遅延させるか、またはこの集団における発作事象の頻度を減少させるかのいずれかを決定することが可能になる。保護者は、発作の発症、頻度、長さ、および種類を追跡する、発作日記をつけるように求められる。
また、特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、疾患のCNS症状、例えば、経時的にMRIで測定される体積変化を含んでもよい。すべてのガングリオシドーシスの乳児の表現型は、脳組織体積(大脳皮質および他のより小構造)および脳室体積の両方で、巨頭症および頭蓋内MRI体積の急速な増加と一貫したパターンを有することが示された。加えて、脳梁、尾状核、および被殻、ならびに小脳皮質を含む様々な小さな脳の下部構造は、疾患の進行に伴って一般的にサイズが減少する(Regier et al.,2016s、およびNestrasil et al.,2018、本明細書で引用)。rAAV.GLB1による治療は、CNS疾患の症状の進行を遅らせるか、または停止させることができ、萎縮および体積変化における安定化の証拠を伴う。視床および基底核におけるT1/T2シグナル強度の変化(正常/異常)は、GM1およびGM2ガングリオシドーシス患者における視床構造の変化に関する報告された証拠に基づいて、含まれることもある(Kobayashi and Takashima,1994,Thalamic hyperdensity on CT in infantile GM1-gangliosidosis.”Brain and Development.16(6):472-474)。特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、MRIによって測定される総脳体積、脳下部構造体積、および側室体積の変化、ならびに/または視床および基底核の活性におけるT1/T2シグナル強度の変化を含み得る。
代替的に、または追加的に、薬力学的有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、バイオマーカー、例えば、rAAV.GLB1の薬力学および生物学的活性、CSFおよび血清中で測定され得るβ-gal酵素(GLB1)活性、CSF GM1濃度、血清および尿のケラタン硫酸レベル、ヘキソサミニダーゼ活性の低下、ならびに乳児GM1ガングリオシドーシスにおいて一貫した急速な萎縮を示す脳MRIを含み得るRegier et al.,2016b、本明細書で引用)。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、疾患の進行を遅らせるのに有用であり、例えば、達成時の年齢、喪失時の年齢、ならびに(世界保健機関(WHO)基準によって定義される)年齢に適した発達および運動のマイルストーンを維持または獲得する子供の割合によって評価される。
特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能転帰、または臨床転帰は、肝臓および脾臓体積、ならびに/または脳波(EEG)および視覚誘発電位(VEP)を含み得る。
VI.脳脊髄液中への医薬組成物の送達のための装置および方法
一態様では、本明細書に提供されるrAAVまたは組成物は、この節で提供され、かつWO2018/160582(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される方法および/またはデバイスを介して髄腔内投与され得る。代替的には、他のデバイスおよび方法が選択され得る。
特定の実施形態では、本方法は、脊椎針を介する患者の大槽内へのCTガイドの後頭下注入の工程を含む。本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影(CT)という用語は、コンピュータによって軸に沿って作成される一連の平面断面画像から、身体構造の3次元画像が構築される放射線撮影を指す。
処置日に、適切な濃度のrAAV.GLB1を調製する。適切な濃度で5.6mLのrAAV.GLB1を含有するシリンジを、処置室に送達する。治験薬投与には、以下の担当者が同席する:処置を行う介入医、麻酔科医および呼吸器技師(複数可)、看護師および医師助手、CT(または手術室)技師、施設研究コーディネーター。薬物投与の前に、腰椎穿刺を実施して、所定の体積のCSFを除去し、次いで、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助するために、ヨード造影剤を髄腔内(IT)に注入する。静脈内(IV)造影剤は、髄腔内造影剤の代替物として、針穿刺の前またはその間に投与され得る。IVまたはIT造影剤を使用するかどうかは、介入医の判断に委ねられる。対象は、麻酔され、挿管され、処置テーブルに配置される。滅菌技術を使用して、注入部位を準備し、覆布をかける。透視ガイダンス下、脊髄針(22~25G)を大槽内に進める。針の配置を補助するために、より大きな誘導針を使用してもよい。針の配置を確認した後、エクステンションセットを脊椎針に取り付け、CSFで充填する。介入医の裁量で、造影剤を含有するシリンジを、エクステンションセットに接続してもよく、少量注入することで、大槽内に針が配置されていることを確認することができる。CTガイダンス+/-造影剤注入により針の配置を確認した後、5.6mLのrAAV.GLB1を含むシリンジを、エクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を1~2分かけてゆっくりと注入し、5.0mLの容量を送達する。注射針は、対象からゆっくりと取り出される。
本明細書に記載される髄腔内方法への追加的または代替的な投与経路は、例えば、全身、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む。
一実施形態では、用量は、脳質量によってスケールされ、CSF区画のサイズの近似値を提供する。さらなる実施形態では、用量換算は、成体マウスでは0.4g、幼若アカゲザル(rhesus macaque)では90g、および4~18ヶ月齢の子供では800gの脳質量に基づく。以下の表は、マウスMED研究、NHP毒性試験、および同等のヒト用量の例示的な用量を提供する。
Figure 2022512589000007
特定の実施形態では、rAAV.GLB1は、単回用量で対象に投与される。特定の実施形態では、複数回の用量(例えば、2用量)が所望され得る。例えば、6ヶ月齢未満の乳児の場合、数日、数週間、または数ヶ月間隔での複数回の用量が望ましい場合がある。
特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約1x10GC/g脳質量~約5x1011GC/g脳質量であり得る。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約1x10GC/g脳質量~約3x1011GC脳質量である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約1x1010GC/g脳質量~約3x1011GC/g脳質量である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の用量は、約1x1010GC/脳質量~約3.33x1011GC/脳質量である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の用量は、約1x1011GC/脳質量~約3.33x1011GC/脳質量である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約1.11x1010GC/g脳質量~約3.33x1011GC/g脳質量である。
特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約1x1010GC/g脳質量~約3.4x1011GC/g脳質量である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約3.4x1010GC/g脳質量~約3.4x1011GC/g脳質量である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約1.0x1011GC/g脳質量~約3.4x1011GC/g脳質量である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約1.1x1011GC/g脳質量である。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約1.11x1010GC/g脳質量である。他の実施形態では、異なる用量が選択され得る。
好ましい実施形態では、対象は、ヒト患者である。この場合、rAAV.GLB1の単回用量は、約1x1012GC~約3x1014GCである。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約9x1012GC~約3x1014GCである。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の用量は、約5x1013GC~約3x1014GCである。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、約8.90x1013GC~約2.70x1014GCである。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、患者当たり8x1012ゲノムコピー(GC)~患者当たり3x1014GCである。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、患者当たり2x1013GC~患者当たり3x1014GCである。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、患者当たり8x1013GC~患者当たり3x1014GCである。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、患者当たり約9x1013GCである。特定の実施形態では、rAAV.GLB1の単回用量は、少なくとも8.90×1013GCである。他の実施形態では、異なる用量が選択され得る。
組成物は、投薬量単位で製剤化され、約1×10ゲノムコピー(GC)~約5×1014GCの範囲にある量のAAVを含み得る(体重70kgの平均対象を治療するため)。一部の実施形態では、組成物は、投薬単位で製剤化され、1×10ゲノムコピー(GC)~5×1013GC、1×1010ゲノムコピー(GC)~5×1014GC、1×1011GC~5×1014GC、1×1012GC~5×1014GC、1×1013GC~5×1014GC、8.9×1013GC~5×1014GC、または8.9×1013GC~2.7×1014GCの範囲の量のAAVを含有する。特定の実施形態では、組成物は、用量単位で製剤化され、少なくとも1x1013GC、2.7x1013GC、または8.9x1013GCの量のAAVを含有する。
一実施形態では、脊椎穿刺が行われ、約15mL(以下)~約40mLのCSFが除去され、rAAV.GLB1がCSFと混合され、かつ/または適合性の担体に懸濁され、対象に送達される。一実施例において、rAAV.GLB1濃度は、1×1010ゲノムコピー(GC)~5×1014GC、1×1011GC~5×1014GC、1×1012GC~5×1014GC、1×1013GC~5×1014GC、8.9×1013GC~5×1014GC、または8.9×1013GC~2.7×1014GCであるが、他の量、例えば、約1×10GC、約5×10GC、約1×1010GC、約5×1010GC、約1×1011GC、約5×1011GC、約1×1012GC、約5×1012GC、約1.0×1013GC、約5×1013GC、約1×1014GC、または約5×1014GCである。特定の実施形態では、GC中の濃度は、脊椎穿刺当たりのGCとして示される。特定の実施形態では、CG中の濃度は、mL当たりGCとして示される。
併用療法は、本明細書で提供されるrAAV.GLB1組成物と共に送達され得る。本出願で先に記載したような併用療法は、参照により本明細書に組み込まれる。
そのような併用療法の1つは、免疫調節剤であり得る。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、T細胞阻害剤、マクロライド(例えば、ラパマイシンまたはラパログ)、および細胞分裂阻害剤(アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む)が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ミトラマイシン、IL-2受容体(CD25)特異的抗体またはCD3特異的抗体、抗IL-2抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、IFN-β、IFN-γ、オピオイド、またはTNF-α(腫瘍壊死因子-α)結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子治療投与の前に開始され得る。かかる療法は、同じ日に2つ以上の薬物、(例えば、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)および/またはシロリムス(すなわち、ラパマイシン))の同時投与を伴い得る。これらの薬物のうちの1つ以上は、遺伝子治療剤の投与後、同じ用量または調整用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約1週間、約15日間、約30日間、約45日間、60日間、またはそれ以上であり得る。
例えば、GM1において栄養が懸念される場合、胃瘻管の配置が適切である。呼吸機能が悪化すると、気管切開または非侵襲性呼吸補助が提供される。パワーチェアおよび他の機器は、生活の質を向上させることができる。
「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含む(comprising)」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「構成する(consist)」、「構成する(consisting)」という語句、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む(comprising)」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる(consisting of)」または「本質的にからなる(consisting essentially of)」という言葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。
「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、RNAまたはRNAおよびタンパク質の産生を含む。RNAに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性または安定であり得る。
本明細書で使用される場合、「NAb力価」という用語は、その標的化されたエピトープ(例えば、AAV)の生理学的効果を中和する中和抗体(例えば、抗AAV Nab)がどれだけ産生されるかの測定値である。抗AAV NAb力価は、例えば、Calcedo, R.,et al.,Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses.Journal of Infectious Diseases、2009.199(3): p.381-390に記載されているように測定され得る(参照により本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、AAVまたは組成物の投与は、GM1ガングリオシドーシスの症状、またはGM1ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善する。一部の実施形態では、処置後、患者は、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに/または神経認知発達の改善のうちの1つ以上を有する。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、2つ以上の発現カセットを含み得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と互換的に使用され得る。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのかかる発現カセッは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、および本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。
タンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質または核酸が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない、2つ以上の配列または下位配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの2つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子からコーディング配列の発現を導くように配置された1つの遺伝子からのプロモーターを有する。したがって、コーディング配列に関しては、プロモーターは、異種性である。
「複製欠陥ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工ウイルス粒子を指し、目的の遺伝子(例えば、GLB1)を含有する発現カセットを含むベクターゲノムは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージ(例えば、AAVまたはボカウイルス)された任意のウイルスゲノム配列は、複製欠陥である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが(ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の遺伝子のみを含有する「ガットレス(gutless)」であるように操作されることができる)、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、標的細胞においてベクターゲノム由来の遺伝子産物の量を送達および発現するrAAV組成物の量を指す。有効量は、ヒト患者ではなく、動物モデルに基づいて決定され得る。好適なマウスまたはNHPモデルの例は、本明細書に記載されている。
「a」または「an」という用語は、1つ以上を指し、例えば、「エンハンサー(an enhancer)」は、1つ以上のエンハンサー(複数可)を表すことに留意されたい。したがって、「a」(または「an」)、「1つ以上(one or more)」、および「少なくとも1つ(at least one)」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
上述のように、「約」という用語は、別段の指定がない限り、数値を修正するために使用される場合、±10%の変動を意味する。
上に記載したとおり、「増加」「減少」「低下」「改善」「向上」「遅延」「早期」「緩徐」「停止」またはその任意の文法的変形、または任意の類似の用語は、別途指定されない限り、対応する参照と比較して、約5倍、約2倍、約1倍、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、約5%の変動(例えば、未治療の対照、対応するレベルのGM1患者もしくはある段階でのGM1患者、またはGM1を有しない健常な対象もしくは健常なヒト)を意味する。
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」は、哺乳動物を指し、ヒト、獣医学用動物または農業用動物、家庭用動物または愛玩動物、ならびに通常臨床研究に使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、ヒトである。特定の実施形態では、患者は、GM1を有する。
本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されているもの、および本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供している公開文書への参照により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例1:AAVhu68+脱アミド化
AAVhu68を修飾について分析した。簡潔に、AAVhu68は、この研究に関連していないベクターゲノムを使用して産生され、各々は、293細胞における従来の三重トランスフェクション方法を使用して産生された。これらの技術の一般的な説明については、例えば、ell CL,et al.,The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice.J Clin Invest.2011;121:2427-2435を参照されたい。簡潔には、例えば、AAV2逆位末端反復に隣接するパッケージ化される配列をコードするプラスミド(ニワトリβ-アクチンプロモーターから発現される導入遺伝子、イントロン、およびサルウイルス40(SV40)後期遺伝子に由来するポリA)を、AAV2 rep遺伝子およびAAVhu68 cap遺伝子をコードするプラスミドと、アデノウイルスヘルパープラスミド(pAdΔF6)とを用いたHEK293細胞の三重トランスフェクションによってパッケージした。得られたAAVウイルス粒子は、CsCl勾配遠心分離を使用して精製し、濃縮し、後で使用するために凍結することができる。
変性およびアルキル化:解凍したウイルス調製物(タンパク質溶液)100μgに、2μlの1Mジチオスレイトール(DTT)および2μlの8M塩酸グアニジン(GndHCl)を添加し、90℃で10分間インキュベートする。溶液を室温に冷却し、次いで、調製したばかりの1Mヨードアセトアミド(IAM)を5μl添加し、暗所で、室温で30分間インキュベートする。30分後、1μlの1MのDTTを添加することによって、アルキル化反応をクエンチする。
消化:最終GndHCl濃度を800mMに希釈する量で、変性タンパク質溶液にpH7.5~8の20mM重炭酸アンモニウムを添加する。トリプシン対タンパク質の比率が1:20になるようにトリプシン溶液を加え、37℃で一晩インキュベートする。消化後、TFAを最終濃度が0.5%になるように添加し、消化反応をクエンチした。
質量分析:約1マイクログラムの組み合わせた消化混合物を、UHPLC-MS/Msにより分析する。LCは、UltiMate 3000 RSLCnano System(Thermo Scientific)で行われる。移動相Aは、0.1%ギ酸を含むMilliQ水である。移動相Bは、0.1%ギ酸を含むアセトニトリルである。15分間にわたって4%Bから6%Bへ、次いで、25分間(合計40分間)で10%Bへ、その後46分間(合計86分間)で30%Bへと勾配を実行した。試料を直接カラムにロードする。カラムサイズは、75cm×15μmの内径であり、2ミクロンのC18媒体(Acclaim PepMap)が充填される。LCは、ソースを使用したNanoflexエレクトロスプレーイオン化を介して、四重極-オービトラップ質量分析器(Q-Exactive HF, Thermo Scientific)にインターフェースされる。カラムを35℃に加熱し、2.2kVのエレクトロスプレー電圧を印加する。質量分析器は、上位20個のイオンからタンデム質量スペクトルを取得するようにプログラムされている。最大MS分解能は120,000、MS/MS分解能は30,000。正規化された衝突エネルギーは30、自動ゲイン制御は1e5、最大充填MSは100ms、最大充填MS/MSは50msに設定されている。
データ処理:質量分析器の生データファイルをBioPharma Finder 1.0 (Thermo Scientific)によって分析した。簡潔には、すべての検索は、10ppmの前駆体質量許容差(precursor mass tolerance)、5ppmの断片質量許容差(fragment mass tolerance)、トリプシン切断(tryptic cleavage)、最大1個の未切断(missed cleavage)、システインアルキル化の固定修飾(fixed modification)、メチオニン/トリプトファンの酸化、アスパラギン/グルタミンの脱アミド化、リン酸化、メチル化、およびアミド化の可変修飾(variable modification)を必要とした。
Figure 2022512589000008
Figure 2022512589000009
AAVhu68カプシドタンパク質の場合、4個の残基(N57、N329、N452、N512)は、様々なロットにわたって70%超の脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合90%超である。さらなるアスパラギン残基(N94、N253、N270、N304、N409、N477、およびQ599)も、様々なロットにわたって最大約20%の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
したがって、AAVhu68カプシドタンパク質を含むAAVは、AAVが異なるレベルの脱アミド化を示すAAVhu68カプシドタンパク質を含有することができるため、カプシドタンパク質の異種集団を含み得る。様々なレベルの脱アミド化を有するAAVhu68 vp1タンパク質の異種集団は、配列番号2の1~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるvp1タンパク質、配列番号1から産生されるvp1タンパク質、または配列番号2の1~736の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号1と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp1タンパク質であり得る。様々なレベルの脱アミド化を有するAAVhu68 vp2タンパク質の異種集団は、配列番号2の少なくとも約アミノ酸138~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるvp2タンパク質、配列番号1の少なくともヌクレオチド412~2211を含む配列から産生されるvp2タンパク質、または配列番号2の少なくとも約アミノ酸138~736の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号1の少なくともヌクレオチド412~2211と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp2タンパク質であり得る。様々なレベルの脱アミド化を有するAAVhu68 vp3タンパク質の異種集団は、配列番号2の少なくとも約アミノ酸203~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるvp3タンパク質、配列番号1の少なくともヌクレオチド607~2211を含む配列から産生されるvp3タンパク質、または配列番号2の少なくとも約アミノ酸203~736の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号1の少なくともヌクレオチド607~2211と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp3タンパク質であり得る。
成体アカゲザルに、AAVhu68.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG(3.00x1013GC)をICM投与し、28日後に剖検して、ベクターの形質導入を評価した。脳の広範な領域でAAVhu68の形質導入が観察された(データは示さず)。したがって、AAVhu68カプシドは、CNSにおけるクロスコレクション(cross-correction)の可能性を提供する。
実施例2:製造-成分と材料
ベクターは、AAV2逆位末端反復に隣接するサイトメガロウイルスエンハンサー(CB7)[配列番号10]、ヒト伸長開始因子1αプロモーター(EF1a)[配列番号11]、またはヒトユビキチンCプロモーター(UbC)[配列番号9](1229bp、GenBank#D63791.1)]を有するニワトリβアクチンプロモーターから発現されるヒトGLB1のコード配列を含有するシスプラスミドから構築される。ヒトGLB1の様々なコード配列[配列番号4のaa配列]が構築される。野生型配列は、配列番号5で再現される。様々な操作されたGLB1コード配列を生成し、配列番号6、7、または8に提供される。
ベクターは、接着性HEK293細胞の三重トランスフェクションによってAAV血清型hu68カプシドにパッケージ化され、Lock,M.,et al.Rapid, Simple,and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.Human Gene Therapy 21,1259-1271(2010)に先に記載されるように、ヨジキサノール勾配遠心分離によって精製される。AAV血清型Hu68カプシドは、WO2018/160582に記載される(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
より具体的には、AAVhu68.GLB1は、1)AAVシスベクターゲノムプラスミド、2)AAV2レプリカーゼ(rep)およびAAVhu68カプシド(cap)をコードする、pAAV2/hu68.KanRと称されるAAVトランスプラスミド、3)pAdΔF6.KanRと称されるヘルパーアデノウイルスプラスミド、によるヒトHEK293 WCB細胞の三重トランスフェクションによって産生される
AAVシスベクターゲノムプラスミドの配列エレメントの説明:
・逆位末端反復(Inverted Terminal Repeat、ITR):ITRは、同一の逆相補配列であり、ベクターゲノムの全ての成分に隣接するAAV2(130bp、GenBank#NC001401)に由来する。ITR配列は、AAVおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターDNA複製の起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ITR配列は、ベクターゲノム複製およびパッケージングに必要な唯一のシス配列を表す。
・プロモーター:ヒトユビキチンC(UbC)プロモーターに由来する調節エレメント:この遍在性プロモーター(1229bp、GenBank#D63791.1)を選択して、任意のCNS細胞型における導入遺伝子の発現を駆動した。
・コード配列:GLB1遺伝子は、β-ガラクトシダーゼをコードし、最大化されたヒトコドン使用に基づく。GLB1酵素は、ガングリオシドからのβ結合ガラクトースの加水分解を触媒する(2034bp、677aa,Genbank#AAA51819.1、EC3.2.1.23)。
・キメライントロン(chimeric intron、CI)-ヒトβ-グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンG(IgG)スプライスアクセプター要素からなるハイブリッドイントロン
・SV40ポリアデニル化シグナル(239bp、Genbank#KP659662.1):SV40ポリアデニル化シグナルは、cisで遺伝子のmRNAの効率的なポリアデニル化を促進する。この要素は、転写終結、新生転写物の3’末端における特異的切断事象、および長鎖ポリアデニル尾部の添加のためのシグナルとして機能する。
AAVhu68トランスプラスミド:pAAV2/hu68.KanR
AAV2/hu68トランスプラスミドpAAV2/hu68.KanRは、ペンシルベニア大学のDr.James M.Wilsonの研究室内で構築された。AAV2/hu68トランスプラスミドは、AAVベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされる4つの野生型(WT)AAV2レプリカーゼ(Rep)タンパク質をコードする。また、AAV2/hu68トランスプラスミドは、AAVベクターゲノムを収容するためにAAV血清型hu68のビリオンシェルに組み立てる3つのWT AAVhu68ビリオンタンパク質カプシド(Cap)タンパク質をコードする。AAVhu68配列は、ヒト心臓組織DNAから入手した。
AAV2/hu68トランスプラスミドを作製するために、pBluescript KSベクターに由来するプラスミド骨格上の野生型AAV2 repおよびAAV9 cap遺伝子をコードするプラスミドpAAV2/9n由来のAAV9cap遺伝子を除去し、AAVhu68 cap遺伝子と置換した。アンピシリン耐性(AmpR)遺伝子をカナマイシン耐性(KanR)遺伝子で置換し、pAAV2/hu68.KanRを得た。通常rep発現を駆動するAAV p5プロモーターを、repの5’末端からキャップの3’末端へと移動し、repの上流の切断p5プロモーターを残す。この切断プロモーターは、repの発現を下方制御し、結果として、ベクター産生を最大化する役割を果たす(図1C)。プラスミドのすべての成分部分は、直接配列決定によって検証されている。
pAdDeltaF6(KanR)アデノウイルスヘルパープラスミド
プラスミドpAdDeltaF6(KanR)は、サイズが15,774bpである。このプラスミドには、AAV複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちE2A、E4、およびVA RNAが含まれている(アデノウイルスE1機能は、HEK293細胞によって提供される)が、他のアデノウイルスの複製遺伝子または構造遺伝子は含まれていない。プラスミドは、アデノウイルス逆位末端反復配列などの複製に重要なシス要素を含んでおらず、したがって、感染性のアデノウイルスが生成されることは予想されない。プラスミドは、Ad5のE1、E3欠失分子クローン(pBHG10、pBR322ベースのプラスミド)に由来した。Ad5 DNAに欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、アデノウイルスDNAの量を32kbから12kbに低減した。最後に、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子によって置換して、pAdeltaF6(KanR)を作製した。このプラスミドに残るE2、E4、およびVAIのアデノウイルス遺伝子、ならびにHEK293細胞に存在するE1は、AAVベクター産生に必要である。
AAVhu68.GM1は、HEK293細胞の一過性トランスフェクション、続いて下流精製によって製造される。図12A~12Bに、製造プロセスのフロー図を示す。製品の調製に入る主要な試薬は、図の左側に示され、工程内の品質評価は図の右側に示される。各産生および精製ステップの説明も提供されている。
細胞培養および回収:細胞培養および回収物製造プロセスは、4つの主要な製造工程:細胞の播種および増殖、一過性トランスフェクション、ベクター回収、およびベクターの清澄化を含む(図12A)。
細胞の播種および増殖:完全に特徴付けられたHEK293細胞株が、産生プロセスに使用される。
一過性トランスフェクション:約4日間の増殖後(DMEM培地+10%FBS)、細胞培養培地を新鮮な無血清DMEM培地に交換し、細胞を、ポリエチレンイミン(PEI)ベースのトランスフェクション方法を使用して、3つの産生プラスミドでトランスフェクションする。最初、シス(ベクターゲノム)プラスミド、トランス(repおよびcap遺伝子)プラスミド、およびヘルパープラスミドを含有するDNA/PEI混合物を、GMPグレードのPEI(PEIPro HQ、PolyPlus Transfection SA)との比率で調製する。このプラスミド比は、小規模最適化研究におけるAAV産生に最適であると判断された。よく混合した後、溶液を室温で最大25分間静置し、次いで無血清培地に添加して反応をクエンチし、最終的にiCELLisバイオリアクターに添加する。反応器は、温度および溶存酸素(DO)が調節され、細胞は、5日間インキュベートされる。
ベクター回収:形質転換した細胞および培地は、バイオリアクターから培地を無菌的に汲み出すことによって、使い捨てバイオプロセスバッグを使用して、PALL iCELLisバイオリアクターから回収される。回収後、洗剤、エンドヌクレアーゼ、およびMgCl(エンドヌクレアーゼの補因子)を添加してベクターを遊離し、パッケージングされていないDNAを消化する。生成物(使い捨てバイオプロセスバッグ内)を温度制御された単回使用のミキサー中で、37℃で2時間インキュベートして、回収物(トランスフェクション手順で得られた)中に存在する残留細胞およびプラスミドDNAの酵素消化に十分な時間を提供する。このステップは、最終的なベクター製剤(drug product、DP)中の残留DNAの量を最小限に抑えるために行われる。インキュベーション後、NaClを最終濃度が500mMになるように添加し、濾過および下流接線流濾過(TFF)中の生成物の回収を補助する。
ベクターの清澄化:蠕動ポンプによって駆動される滅菌された閉鎖チューブおよびバッグセットとして直列に接続されたプレフィルターおよびデプスフィルターカプセル(1.2/0.22μm)を使用して、細胞および細胞デブリを産物から除去する。清澄化は、下流のフィルタおよびクロマトグラフィーカラムを汚損から保護されることを保証し、生物負荷(bioburden)を低減する濾過は、フィルタトレイン(filter train)の終わりに、上流の産生プロセス中に導入される可能性のある任意の生物負荷が、下流の精製の前に除去されることを保証する。
精製プロセス:精製プロセスは、TFFによる濃縮および緩衝液交換、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、ならびにTFFによる濃縮および緩衝液交換の4つの主要な製造工程を含む。これらのプロセス工程は、概要プロセス図(図12B)に示されている。これらのプロセスの各々についての一般的な説明を以下に提供する。
大規模接線流濾過:清澄化された生成物の体積低減(20倍)は、カスタムの滅菌された閉鎖バイオプロセスチューブ、バッグ、および膜セットを使用して、TFFによって達成される。TFFの原理は、好適な多孔度(100kDa)の膜に平行な圧力下で溶液を流すことである。圧力差は、膜孔よりも大きな分子を保持しながら、より小さいサイズの分子を、膜を通して効果的に廃棄流路に駆動する。溶液を再循環させることで、平行流が膜表面を押し流し、膜への結合による膜孔汚れおよび生成物の損失を防ぐ。適切な膜孔径および表面積を選択することによって、液体試料は、所望の分子を保持および濃縮しながら体積を急速に減少させ得る。TFF用途における透析濾過は、液体が膜を通して、廃棄流路に通過するのと同じ速度で再循環試料に新鮮な緩衝液を添加することを伴う。透析濾過の体積の増加に伴う、小分子の量の増加は、再循環試料から除去される。この透析濾過は、清澄化された生成物の適度な精製をもたらすが、その後のアフィニティーカラムクロマトグラフィー工程と適合性の緩衝液交換も達成する。したがって、本発明者らは、濃縮のために100kDaのPES膜を利用し、最小の4透析濾過体積の20mMのTris(pH7.5)および400mMのNaClからなる緩衝液で透析濾過する。次いで、透析濾過された産物を1.2/0.22μmのデプスフィルターカプセルでさらに清澄化して、沈殿した材料をすべて除去する。
アフィニティークロマトグラフィー:透析濾過された産物を、AAVhu68血清型を効率的に捕捉するPoros(商標)Capture-Select(商標)AAVアフィニティー樹脂(Life Technologies)に適用する。これらのイオン条件下、残留細胞DNAおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、AAV粒子は効率的に捕捉する。適用後、カラムを5体積の低塩エンドヌクレアーゼ溶液(250U/mLのエンドヌクレアーゼ、20mMのTris(pH7.5)および40mMのNaCl、1.5mMのMgCl)で処理して、残りの宿主細胞およびプラスミド核酸をすべて除去する。カラムを洗浄して、追加の供給不純物を除去し、続いて低pH段階溶出液(400mMのNaCl、20mMのクエン酸ナトリウム、pH2.5)で洗浄して、これを直ちに1/10体積の中和緩衝液(200mMのBis Tris Propane、pH10.2)中に回収することによって中和する。
アニオン交換クロマトグラフィー:空のAAV粒子を含むプロセス内不純物のさらなる低減を達成するために、Poros AAV溶出プールを50倍に希釈して(20mMビストリスプロパン、0.001%プルロニックF68、pH10.2)、イオン強度を低下させ、CIMultus(商標)QAモノリスマトリックス(BIA Separations)への結合を可能にする。低塩洗浄後、ベクター生成物を、60カラム体積(column volume、CV)のNaCl直線塩勾配(10~180mMのNaCl)を使用して溶出する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを含まないカプシド粒子(空の粒子)を、ベクターゲノムを含有する粒子(完全粒子)から効果的に分離し、完全粒子について濃縮された調製物が得られる。完全粒子のピーク溶出液を回収し、中和し、20mMのビストリスプロパン、0.001%のプルロニックF68(pH10.2)中に20倍希釈し、その場で洗浄された同じカラムに再適用する。10~180mMのNaCl塩勾配を再適用し、適切な全粒子ピークを回収する。ピーク面積を評価し、おおよそのベクター収率を決定するために、以前のデータと比較する。
中空線維接線流濾過による濃縮および緩衝液交換:プールされたアニオン交換中間体を濃縮し、TFFを使用して緩衝液を交換する。この工程では、100kDaの膜中空繊維TFF膜が使用される。この工程中、生成物を標的濃度にもたらし、次いで緩衝液を髄腔内最終製剤緩衝液(ITFFB、すなわち、0.001%のPluronic(登録商標)F68を含む人工CSF)に交換する。生成物を滅菌濾過し(0.22μm)、滅菌容器に保管し、最終充填のために放出されるまで、隔離場所に-60℃以下で冷凍する。
最終充填:凍結生成物を解凍し、プールし、最終製剤緩衝液を使用して標的濃度に調整する(TFFを介した希釈または濃縮工程)。この生成物を、最終的に0.22μmフィルターを通して濾過し、滅菌されたWest Pharmaceutical’s Crystal Zenith(環状オレフィンポリマー)バイアルおよび充填容量が決定される圧着シール付きストッパーに充填される。バイアルには個別にラベルが貼られる。ラベルされたバイアルは、60℃以下で保管される。
実施例3:
ヒトβ-galを発現する最適化AAVベクターを開発し、マウス疾患モデルを使用して、脳酵素活性、リソソーム蓄積病変、および神経学的徴候に対するベクターのCSFへの投与の影響を評価した。
A.材料および方法
動物手順:動物手順はすべて、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会(Animal Care and Use Committee)によって承認された。GLB1ノックアウトマウスは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手した。マウスは、C57BL/6J背景でヘテロ接合担体として維持した。ICV注入の場合、ベクターを、無菌リン酸緩衝生理食塩水(Gibco)中で5μLの体積に希釈し、カスタムの気密シリンジ(Hamilton)およびセメント加工された10mmの27ゲージ針を使用して、針の基部にプラスチックチューブを装着して穿通を3mmの深さに制限しながら、イソフルラン麻酔マウスに対してフリーハンドで注入した。顎下血液採取は、イソフルラン麻酔のマウスで実施した。血清分離管に血液を採取し、凝固させ、遠心分離によって分離した後、アリコートし、-60℃以下で凍結した。剖検の際、マウスにケタミンおよびキシラジンで鎮静し、ポリエチレンチューブに接続された32ゲージ針を使用して、後頭下穿刺によってCSFを採取した。安楽死は頚椎脱臼によって行った。CSF、心臓、肺、肝臓、および脾臓をドライアイス上で直ちに凍結し、-60℃以下で保管した。脳を除去し、前頭葉の冠状切片を回収し、生化学研究のために凍結した。残りの脳は、組織学的分析に使用した。
実施例1および2に記載されるように、ベクターを生成した。
空:完全粒子比:ベクター試料を、12mmの光路長を有する2チャネルのチャコール-エポンセンターピースを有するセルにロードする。供給された希釈緩衝液を、各細胞の参照チャネルにロードする。次いで、ロードされた細胞を、AN-60Ti分析ローターに配置し、吸光度およびRI検出器の両方を備えたBeckman-Coulter ProteomeLab XL-I分析超遠心分離器にロードする。20℃に完全に温度平衡化した後、ローターを、12,000rpmの最終実行速度にする。280nmスキャンにおける吸光度は、おおよそ3分毎に約5.5時間記録される(各試料について110回の総スキャン)。生データを、c(s)メソッドを使用して分析し、分析プログラムSEDFITに実装する。得られたサイズ分布をグラフ化し、ピークを統合する。各ピークに関連付けられたパーセンテージ値は、すべてのピーク下の総面積のピーク面積分率を表し、280nmで生成された生データに基づく。多くの研究室では、これらの値を使用して空:完全粒子比を計算している。しかしながら、空の粒子と完全粒子は、この波長で異なる吸光係数を有するため、それに応じて生データを調整することができる。吸光係数調整の前後の両方の空の粒子および完全モノマーピーク値の比を使用して、空の粒子:完全な粒子比を決定する。
複製能のあるAAVのアッセイ:試料は、産生プロセス中に生じる可能性がある複製能のあるAAV2/hu68(rcAAV)の存在について分析される。細胞ベースの成分は、試験試料および野生型(WT)ヒトアデノウイルス5型(Ad5)の希釈物をHEK293細胞(P1)の単層に接種することからなる。試験した生成物の最大量は、1.0×1010GCのベクター生成物である。アデノウイルスの存在により、rcAAVは細胞培養物中で増幅する。2日後、細胞溶解物を生成し、Ad5を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を2回目の細胞(P2)に継代し、感度を増強する(再度、Ad5の存在下で)。2日後、細胞溶解物を生成し、Ad5を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を3回目の細胞(P3)に継代し、感度を増強する(再度、Ad5の存在下で)。2日後、細胞を溶解してDNAを遊離し、次いで、qPCRに供して、AAVhu68 cap配列を検出する。AAVhu68 cap配列がAd5依存的な様式で増幅することで、rcAAVの存在が示される。AAV2 repおよびAAVhu68 cap遺伝子を含むAAV2/hu68代替陽性対照を使用すると、アッセイの検出限界を決定することが可能になる(0.1、1、10、および100IU)。rAAV(1.0×1010、1.0×10、1.0×10、および1.0×10GC)の段階希釈を使用して、試験試料中に存在するrcAAVのおおよその量を定量することができる。
インビトロ有効性:DdPCR GC力価を遺伝子発現に関連付けるために、インビトロの相対効力バイオアッセイを行う。簡潔に、細胞を96ウェルプレートに播種し、37℃/5%COで一晩インキュベートする。翌日、細胞を、段階希釈されたAAVベクターで感染させ、37℃/5%COで最大3日間インキュベートする。細胞上清を回収し、蛍光発生基質の切断に基づいてβ-gal活性について分析する。
総タンパク質、カプシドタンパク質、タンパク質純度、およびカプシドタンパク質比:ビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用して、ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質の標準曲線に対して、ベクター試料を最初に総タンパク質について定量する。決定は、等量の試料を、キットで提供されるMicro-BCA試薬と混合することによって行われる。BSA標準の希釈も、同じ手順を適用する。混合物を60℃でインキュベートし、562nmで吸光度を測定する。標準曲線は、4パラメータ適合を使用して、既知の濃度の標準吸光度から生成される。未知の試料を4パラメータ回帰に従って定量する。rAAVの純度の半定量的決定を提供するために、試料を、ゲノム力価について正規化し、5.0x10GCを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって還元条件下で分離する。次いで、SDS-PAGEゲルを、SYPRO Ruby色素で染色する。不純物バンドはすべて、濃度測定によって定量する。3つのAAV特異的タンパク質(VP1、VP2、およびVP3)に加えて現れる染色されたバンドは、タンパク質不純物と見なされる。混入物バンドの不純物質量パーセントならびにおおよその分子量が報告される。SDS-PAGEゲルは、VP1、VP2、およびVP3タンパク質を定量し、それらの比率を決定するためにも使用される。
酵素活性アッセイ:組織を、スチールビーズホモジナイザー(TissueLyzer,Qiagen)を使用して、0.9%NaCl(pH4.0)中でホモジナイズした。3回の凍結融解サイクル後、サンプルを遠心分離によって清澄化するし、タンパク質含有量をBCAアッセイによって定量した。血清試料を酵素アッセイに直接使用した。β-gal活性アッセイについて、1μLの試料を、0.15MのNaCl、0.05%のTriton-X100、0.1Mの酢酸ナトリウム(pH3.58)中の99μLの0.5mMの4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトピラノシド(Sigma M1633)と組み合わせた。反応物を,37℃で30分間インキュベートし、次いで、150μLの290mMグリシン、180mMクエン酸ナトリウム(pH10.9)を添加することによって停止した。蛍光を4MUの標準希釈物と比較した。β-gal活性は、タンパク質(組織)1mg当たり、または血清もしくはCSF1ml当たり、1時間当たり遊離された4MUのnmolとして表される。1mMの4-メチルウンベリフェリルN-アセチル-β-D-グルコサミニド(Sigma M2133)を基質として、組織溶解物の場合は1μLの試料体積を、血清の場合は2μLの試料体積を使用して、β-gal活性アッセイと同じ様式で、HEXアッセイを行った。
組織学:脳を、4%パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、15%および30%スクロース中で平衡化し、次いで、OCT包埋培体中で凍結した。凍結切片をフィリピン(Sigma、10μg/mL)、またはGFAPもしくはLAMP1に対する抗体で染色した。
抗β-gal抗体ELISA: 高結合ポリスチレンELISAプレートを、PBS中1μg/mLの濃度で1ウェル当たり100μLの組換えヒトβ-gal(R&D Systems)で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、PBS中の2%ウシ血清アルブミンで、室温で2時間ブロッキングした。重複ウェルを、PBS中で1:1,000に希釈された血清試料と共に、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ブロッキング溶液中で1:5,000に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスIgGポリクローナル抗体と共に1時間インキュベートし、TMB基質を使用して現像した。
歩行分析:製造元の指示書に従って、CatWalk XTシステム(Noldus)を使用して、歩行分析を実施した。マウスを2日連続で試験した。各試験日に、各動物について少なくとも3回の完全な試行を実施した。5秒を超える試行、または動物が装置の全長を横断せずに停止もしくは反転した試行は、分析から除外した。
B.結果
サイトメガロウイルスエンハンサー(CB7)、ヒト伸長開始因子1αプロモーター(EF1a)またはヒトユビキチンCプロモーター(UbC)と共にニワトリβアクチンプロモーターによって駆動されるヒトGLB1 cDNAからなる、導入遺伝子カセットが設計された。各カセットをAAVhu68カプシドにパッケージ化し、1011ゲノムコピー(GC)の単回用量を、野生型マウスに脳室内(ICV)注入によって投与した。注入の2週間後、脳およびCSFにおいてβ-gal活性を測定した(図2A~2B)。UbCプロモーターを有するベクターでは、脳およびCSFの両方で、統計的に有意なβ-gal活性の上昇が得られ、酵素活性は、未処置の野生型マウスの活性よりも、脳でほぼ2倍、CSFで10倍大きかった。したがって、さらなる研究のために、AAVhu68.UbC.hGLB1ベクターを選択した。
最適化ベクターの有効性は、GLB1-/-マウスモデルで評価した。GM1ガングリオシドーシスのマウスモデルは、GLB1遺伝子の6番目および/または15番目のエキソンにネオマイシン耐性カセットを標的化挿入することによって開発されている。Hahn,C.N.,et al.Generalized CNS disease and massive GM1-ganglioside accumulation in mice defective in lysosomal acid beta-galactosidase.Human molecular genetics 6,205-211(1997)、およびMatsuda, J., et al.Beta-galactosidase-deficient mouse as an animal model for GM1-gangliosidosis.Glycoconjugate journal 14,729-736(1997)を参照されたい。乳児GM1ガングリオシドーシス患者と同様に、これらのマウスは機能的なβ-galを発現せず、脳内にGM1ガングリオシドの急速な蓄積を示す。脳GM1蓄積は、生後1週間ですでに明らかであり、3ヶ月齢までに、GLB1-/-マウスは、8ヶ月齢の乳児GM1患者と同程度のGM1蓄積を脳内に有する(Hahn 1997、上で引用)。GLB1-/-マウスの臨床表現型は、乳児GM1ガングリオシドーシスの臨床表現型を最も緊密にモデル化しており、4ヶ月齢までに運動異常が現れ、10ヶ月齢までに安楽死が必要なほどの重度の神経学的症状(例えば、運動失調または運動麻痺)を有する(Hahn 1997、Matsuda 1997、上で引用)。GLB1-/-マウスモデルは、いかなる末梢臓器の関与も示さず、しばしば骨変形および肝脾腫を発症する乳児GM1患者とは異なる(Hahn 1997、Matsuda 1997、上で引用)。したがって、GLB1-/-マウスは、乳児GM1ガングリオシドーシスの神経学的特徴の代表的なモデルであるが、全身疾患の症状ではない。
GLB1-/-マウスを、1ヶ月齢で処置し、4ヶ月齢まで観察した。4ヶ月齢は、典型的には、進行性疾患を有する乳児GM1ガングリオシドーシス患者と同様の脳GM1レベルに関連する顕著な歩行異常を発症するであろう時期である(Matsuda 1997、上で引用)。GLB1-/-マウスを、1.0x1011ゲノムコピー(GC)のAAVhu68.UbC.hGLB1(n=15)またはビヒクル(n=15)の単回ICV注入で処理した。ビヒクル(n=15)で処置されたヘテロ接合性(GLB1+/-)マウスの群は、正常対照として機能した。注入日(0日目)、ならびに10、28、60、および90日目に血清を回収した。処置の90日後、CatWalk XT歩行分析システム(Noldus)を使用して、運動機能を評価し、その後、動物を安楽死させ、組織学的および生化学的分析のために組織を回収した。
ICV注入手順中に、AAVで処置されたマウス1匹が死亡した。他のすべてのマウスは、90日間の試験エンドポイントまで生存した。CSFへのAAV送達は、末梢血におけるベクター分布および有意な肝臓の形質導入をもたらすことが示されている(Hinderer,C.,et al.Intrathecal gene therapy corrects CNS pathology in a feline model of mucopolysaccharidosis I.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 22,2018-2027 (2014)、Gray,S.J.,Nagabhushan Kalburgi,S.,McCown, T.J.& Jude Samulski, R.Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates.Gene therapy 20,450-459 (2013)、Haurigot, V.,et al.Whole body correction of mucopolysaccharidosis IIIA by intracerebrospinal fluid gene therapy.The Journal of clinical investigation (2013)、Hinderer,C.,et al.Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna.Molecular therapy.Methods & clinical development 1,14051(2014)、Hordeaux,J.,et al.Toxicology Study of Intra-Cisterna Magna Adeno-Associated Virus 9 Expressing Human Alpha-L-Iduronidase in Rhesus Macaques.Molecular therapy.Methods & clinical development 10,79-88(2018))。AAVhu68.UbC.hGLB1で処置されたGLB1-/-マウスは、ベクター投与の10日後、ヘテロ接合(GLB1+/-)対照よりも高い血清β-gal活性を示した(図3A)。ヒトβ-galに対する血清抗体は、90日目までにAAVhu68.UbC.hGLB1で処置された5/15マウスにおいて検出可能であった。2匹のマウスを除く全てのマウスについて、血清β-gal活性の上昇が試験全体を通して持続し、両方ともヒトβ-galに対する抗体を発現した(図6)。心臓、肺、肝臓、および脾臓を含む末梢臓器もまた、β-gal活性の上昇を示した(図3B~3E)。ヒト導入遺伝子産物に対する抗体を発現した一部の動物は、末梢臓器においてより低いβ-gal活性を有した。
剖検時に回収されたCSFは、AAVhu68.UbC.hGLB1処置GLB1-/-マウスにおけるヘテロ接合対照の活性を上回るβ-gal活性を示した(図4B)。ベクター処置マウスの脳におけるβ-gal活性は、ヘテロ接合対照と類似していた(図4A)。抗β-gal抗体は、脳またはCSFのβ-galレベルに影響を与えているようには見えない。
脳の異常の修正は、生化学的および組織学的アッセイを使用して評価した。リソソーム酵素は、リソソーム貯蔵の状況で頻繁に上方制御され、この観察は、GM1ガングリオシドーシス患者において確認されている(Van Hoof, F. & Hers, H.G.The abnormalities of lysosomal enzymes in mucopolysaccharidoses.European journal of biochemistry 7, 34-44 (1968))。したがって、リソソーム酵素であるヘキソサミニダーゼ(HEX)の活性を、脳溶解物で測定した。ビヒクル処置GLB1-/-マウス由来の脳試料ではHEX活性が上昇し、ベクターで処置した動物では、正常化された(図5)。
リソソーム蓄積病変を、GM1ガングリオシドに結合する蛍光分子であるフィリピンで脳切片を染色すること、ならびにリソソーム関連膜1(タンパク質LAMP1)の免疫染色によって評価した。フィリピンはまた、非エステル化コレステロールに結合するが、以前の研究は、フィリピン染色が主に、GLB1-/-マウスにおけるGM1蓄積を反映することを実証している(Arthur, J.R., Heinecke, K.A. & Seyfried, T.N.Filipin recognizes both GM1 and cholesterol in GM1 gangliosidosis mouse brain.Journal of lipid research 52, 1345-1351 (2011))。フィリピン染色は、ビヒクル処理GLB1-/-マウスの皮質、海馬、および視床のニューロンにおける顕著なGM1の蓄積を明らかにし、AAVhu68.UbC.hGLB1で処理したマウスが正常化させた(データは示さず)。LAMP1免疫組織化学は、GLB1-/-マウスの皮質および視床におけるリソソーム膜染色の増加を示し、ベクター処置マウスにおいて減少した(データは示さず)。グリオーシスは、星状細胞マーカー、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)について染色することによって評価された。ベクター処置GLB1-/-マウスは、ビヒクル処置対照と比較して、視床におけるアストログリオーシスの著しい低減を示した(データは示さず)。
ベクター処置GLB1-/-マウスにおける神経学的機能を評価するために、4ヶ月齢(ベクターまたはビヒクル投与後3ヶ月)で歩行分析を行った。未処置のGLB1-/-マウスは、3~4ヶ月齢までに臨床的に明らかな歩行異常を示すことが以前に指摘されていた。未処置GLB1-/-マウスおよび正常な対照のコホートに対して、CatWalkシステムを使用して実施された定量的な歩行評価から、様々な異常が明らかになり、より遅い自発的歩行速度、歩幅長の差、ならびにステップサイクルの一部の相の持続時間が含まれた(図7Cおよび7D)。GLB1-/-マウスの歩行速度が著しく遅いため、これらの明らかな相違の多くの解釈は、ほとんどの歩行パラメータの速度依存性によって複雑化された(図8Aおよび8B)(Batka,R.J.,et al.The need for speed in rodent locomotion analyses.Anatomical record(Hoboken,N.J.: 2007)297,1839-1864(2014))。GLB1-/-マウスは、後肢の配置にも一貫した異常を示し、後肢の足跡長の増加として測定することができた(図7D)。この異常は、以前の報告と一致して、歩行速度とは無関係であることが見出された(Batka, et al、上で引用)、GLB1-/-マウスにおける速度に依存しない歩行機能障害を評価するのに有用な歩行シグネチャとなった(図8Aおよび8B)。2日連続して同じコホートのマウスを使用して実施された試験では、より遅い自発的歩行速度および増加した後肢の足跡長が、未処置のGLB1-/-マウスにおいて再現可能な観察であることを明らかにした(図7Aおよび7B)。ビヒクル処理GLB1-/-マウスは、未処理の動物において以前に特定されたものと同様の歩行異常を示した(図7A~7G)。歩行速度および足跡長が、ベクター処置GLB1-/-マウスにおいて正常化した(図7A~7G)。
C.考察
この研究は、4週齢でAAVベクターで処置されたGLB1-/-マウスにおけるニューロン貯蔵病変の減少を実証した。これは、このモデルで顕著な脳の蓄積病変が現れた1週間後のことである(Hahn 1997、本明細書で引用)。これらの結果は、CSFへのAAVhu68.hGLB1の投与が、脳β-gal活性を増加させ、ニューロンのリソソーム蓄積病変を減少させ、神経学的低下を防止し、遺伝子移入が、脳内のGM1蓄積を防止し、かつ元に戻し得ることを示唆している。
実施例4:動物モデル
A.GLB1-/-マウスモデルにおけるAAVhu68.UbC.GLB1の最小有効用量(MED)の特定
異なる用量のrAAVhu68.UbC.GLB1の影響を、GLB1-/-マウスモデルにおけるCNS病変および神経学的徴候について評価した。有効性は、血清酵素活性、脳病変の低減、自動歩行分析によって測定される神経学的徴候(例えば、CatWalkシステムを介して)、および盲検再評価者によって実施される標準化された神経学的検査(例えば、姿勢、運動機能、感覚および反射の9点評価)、ならびに生存率によって評価した。安全性分析(採血および分析を含む)も実施した。4週齢のGLB1-/-マウスは、ICV注入によってrAAVhu68.UbC.GLB1(1.3×1011GC、4.4×1010GC、1.3×1010GCまたは4.4×10GC)またはビヒクルの4回用量のうちの1つを受けた(群当たりn=24)。ビヒクル(n=24)で処置されたヘテロ接合性の同腹仔(littermate)は、正常な対照として機能した。
血清β-gal酵素活性、歩行分析、および神経学的検査を、60日毎に各群の動物のうちの半分について行い、一方、体重を、120日の観察期間で少なくとも30日毎に測定した。結果を、図9A~9Fとしてプロットし、以下に簡潔に説明する。
処置されたマウスはすべて健康に見え、正常な体重増加を示した。観察期間中、群間の体重に有意な差は検出されなかった(図9B)。
血清の酵素の発現は、実施例3に記載されている研究と一致した。図9Aに示すように、ビヒクル処置GLB1-/-マウス(陰性対照として機能)のβ-gal酵素活性は、10nmol/mL/時間前後のままで、陽性対照群(ビヒクル処理GLB1+/-マウスである)は、約100nmol/mL/時間の酵素活性を示した。マウス1匹当たり4.4×1010GCの用量でrAAVhu68.UbC.GLB1で処置すると、β-gal酵素活性は、60日目および120日目の両方で、陰性対照と比較して有意に増加した。マウス当たり1.3×1011GCのより高い用量のrAAVhu68.UbC.GLB1は、60日目に、陽性対照よりもβ-gal酵素活性をもたらし、120日目にはさらなる上昇がもたらされた。
GM1マウスの歩行表現型はまた、実施例3に示される以前の結果と一致した。神経学的検査スコアである後肢の足跡長、後肢スイング時間、および後肢歩幅長を取得した。結果を、図9C~9Fにプロットする。4つ全てのプロットされたパラメータについて、陰性対照と陽性対照との間に有意な統計的差があり、これらのパラメータが、有効性を評価するための良好な指標として機能し得ることを示す。ビヒクル処置GLB1-/-マウスと比較して、4.4×1010GCのrAAVhu68.UbC.GLB1で処置されたマウスは、後肢の足跡長、後肢スイング時間、および後肢歩幅長において著しい改善を示した。1.3x1011GCでのより高い用量は、後肢のスイング時間の増加およびより長い歩幅長を提供し、矯正が成功したことを示す。神経学的検査は、歩行分析と比較して感度が高い。図9Cに示すように、用量の増加に伴って減少した神経学的スコアによって示される、用量依存的な改善が観察されたが、1.3×1010GCのrAAVhu68.UbC.GLB1による処置は、陰性対照のものと比較して、総スコアで統計的有意性を示した。表現型矯正の証拠は、マウス当たりわずか1.3×1010GCの用量で観察された。
全ての未処置動物が生存したままであると予想される場合、同じセットのパラメータは、この動物コホート内で少なくともさらに150日間収集され続ける。未処置のGlb1-/-マウスと比較した生存率の変化を評価する。
前項で論じた動物のうちの半分は、処置270日後に安楽殺される。残りの半分の動物は、処置150日後に安楽殺される。別の24匹のマウスが、ベースライン剖検対照として提供される。全ての安楽殺された動物について、組織学的および生化学的な比較は、処置動物と未処置動物との間で行われる。剖検後、脳を切片化し、LAMP1について染色して、リソソーム蓄積病変を評価し、これを自動イメージングシステムを使用して定量する。β-gal活性は、脳、血清、および末梢臓器において測定される。安全性分析の場合、全血球数および血清化学パネルのために、剖検時に採血し、委員会認定の獣医病理学者による組織病理学の評価のために、脳、脊髄、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および性腺を採取する。ビヒクル処置GLB1-/-マウスと比較して脳蓄積病変の有意な低減を達成するrAAVhu68.UbC.GLB1の最小用量を最小有効用量(MED)として選択する。
B.非ヒト霊長類(nonhuman primates、NHP)における毒性試験
アカゲザル(rhesus monkey)は、患者集団(4~18ヶ月齢の乳児)のサイズおよびCNS解剖学的構造を最もよく再現し、臨床投与経路(route of administration、ROA)を使用して治療することができるため、毒性試験のために選択された。幼若動物を、小児治験集団を代表するように選択した。一実施形態では、幼若アカゲザルは、15~20ヶ月齢である。サイズ、解剖学的構造、およびROAの類似性は、代表的なベクター分布および形質導入プロファイルをもたらし、毒性の正確な評価を可能にする。加えて、げっ歯類モデルよりもNHPにおいてより厳密な神経学的評価が行われ、より敏感なCNS毒性の検出を可能にする。
ICM投与後のAAVhu68.UbC.GLB1の毒性を調査するために、120日間のGLP準拠安全性研究を、幼若アカゲザルで実施する。ICMのAAV投与後、分泌された導入遺伝子産物が安定した定常レベルに到達するのに十分な時間を与えるために、120日間の評価期間を選択した。試験設計を以下の表に概説する。アカゲザルは、以下の3つの用量レベルのうちの1つを受ける:合計3.0×1012GC、合計1.0×1013GC、もしくは合計3.0×1013GC(n=6/用量)またはビヒクル(n=4)。用量レベルは、脳質量によってスケールされた場合、最小有効用量(MED)の試験で評価されたものと同等であるように選択された(マウスでは0.4g、アカゲザルでは90gを想定)。ベースラインの神経学的検査、臨床病理学(鑑別を伴う細胞数、臨床化学、および凝固パネル)、CSF化学、およびCSF細胞学が行われる。AAVhu68.UbC.GLB1またはビヒクル投与後、動物を苦痛および異常行動の兆候について毎日モニタリングする。
血液およびCSF臨床病理評価ならびに神経学的検査は、rAAVhu68.UbC.GLB1またはビヒクル投与後30日間、およびその後30日間毎に実施する。ベースラインおよびその後の各30日間の時点で、AAVhu68に対する中和抗体、ならびにAAVhu68およびAAVhu68.UbC.GLB1導入遺伝子産物に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を、インターフェロンガンマ(IFN-γ)の酵素結合免疫スポット(ELISpot)アッセイによって評価する。
Figure 2022512589000010
rAAVhu68.UbC.GLB1またはビヒクルのいずれかの投与後、動物の半数を60日目に安楽死させ、半数を120日目に安楽死させる。組織は、包括的な顕微鏡組織病理学的検査のために採取される。組織病理学的検査は、中枢神経系組織(脳、脊髄、および後根神経節)および肝臓に焦点を当てている。なぜなら、これらはAAVhu68ベクターのICM投与後に最も重度に形質導入された組織であるからである。さらに、リンパ球は、剖検時にこれらの臓器内のカプシドおよび導入遺伝子産物の両方に反応するT細胞の存在を評価するために、脾臓および骨髄から採取される。
ベクターの体内分布は、組織試料中の定量的PCRによって評価される。血清およびCSF試料において、ベクターゲノムを定量する。
C.非臨床AAV試験における感覚ニューロン毒性
AAVの全身および髄腔内(intrathecal、IT)投与を評価する非臨床試験は、一貫して、後根神経節(DRG)内の感覚ニューロンの効率的な形質導入、およびある場合は、これらの細胞を伴う毒性の証拠を実証している。髄腔内投与は、それらの中心軸索がCSFに曝されるため、感覚ニューロン形質導入を可能にし得るか、またはDRGが脊髄CSFに曝されるため、rAAVが細胞体に直接到達し得る。
DRG感覚ニューロンの最小~軽度の無症状性の変性は、評価されたすべての用量でAAVhu68.UbC.GLB1 GLP NHP毒性試験に現れることが予想される。他のAAVプログラムについての既存の非臨床データおよび臨床データに基づいて、感覚ニューロンの所見は、ヒトにおける有害事象を説明しないことが予想され、したがって、非臨床試験における最大耐容用量(maximum tolerated dose、MTD)の決定には、無症状性の感覚ニューロンの病変は使用されない。しかしながら、ヒトにおける感覚ニューロン毒性の本当のリスクは未知である。現在の試験は、典型的に全身投与されるものよりも低い用量のAAVhu68.UbC.GLB1を必要とし、より低い程度の感覚ニューロン毒性をもたらすように見えるICM投与経路を使用することによって、以前のAAV臨床試験の安全性プロファイルをさらに改善するように設計されている。この研究は、感覚変化の詳細なモニタリングならびに神経伝導検査を使用して、無症状性のDRG毒性でさえ検出する。乳児GM1ガングリオシドーシスの重症度を考慮すると、感覚ニューロン毒性の未知のリスクにもかかわらず、AAVhu68.UbC.GLB1のICM投与のためのリスク-ベネフィットプロファイルが好ましいままであることが予想される。
実施例5:乳児GM1ガングリオシドーシスを有する小児対象の大槽(ICM)に送達されたrAAVhu68.GLB1の単回用量の安全性および耐容性を評価するための第1/2相非盲検多施設用量漸増試験
GM1ガングリオシドーシスの乳児形態を有する1ヶ月~18ヶ月の小児対象は、第1/2相試験のために選択される。なぜならば、それらは、満たされていないニーズが最も多く、運動障害および認知障害の両方の急速かつ予測可能な減少を特徴とする最も破壊的な疾患の経過を有する集団を表しているからである(Jarnes Utz et al.,2017,Infantile gangliosidoses: Mapping a timeline of clinical changes.Molecular Genetics and Metabolism.121(2):170-179)。乳児GM1ガングリオシドーシスを有する患者は、典型的には、6ヶ月齢前に神経学的症状を伴う症状の発症を有し、一部の患者は、出生時に筋緊張低下、精神運動遅延、または他の疾患症状を呈する(Caciotti et al.,2011,GM1 gangliosidosis and Morquio B disease: An update on genetic alterations and clinical findings.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease.1812(7):782-790)。乳児GM1を有する患者の大部分は、生後数年以内に死亡する(生存期間の中央値19~46ヶ月、研究および支持療法のレベルに依存する)(Regier et al.,2016,MRI/MRS as a surrogate marker for clinical progression in GM1 gangliosidosis.American Journal of Medical Genetics Part A. 170(3):634-644、Regier et al.,2016,The GM1 and GM2 Gangliosidoses: Natural History and Progress toward Therapy.Pediatric endocrinology reviews: PER.13 Suppl 1:663-673、およびJarnes Utz et al.,2017)。したがって、これらの患者は、潜在的に最も好ましいリスク/ベネフィットのプロファイルを有する集団を表している。さらに、これらの患者における予測可能で急速な減少は、頑強な研究設計を支援し、合理的な経過観察期間内に機能的転帰の評価を可能にする。この群では、処置は、基礎となる病理を安定させ、それによって疾患進行を安定させ、生存期間を延長し、スキル(獲得した発達マイルストーン、神経認知および/または運動スキルなど)の喪失を防止し、神経認知および行動低下の進行を遅らせることが期待される。
成体非ヒト霊長類で実施される投与手順の非臨床的安全性試験は、4ヶ月齢以上の乳児のサイズおよび大槽の解剖学的構造を最もよく表す。しかしながら、症状の発症後の疾患の急速な経過および症状の発症時の幼い年齢を考慮すると、治療は、遺伝子治療の潜在的な利益を最大化するために可能な限り早期に行われるべきである。ここで使用される下限の年齢は、治療、具体的にはICM手順が安全に実行できるように、登録時1か月齢である。1週齢または2週齢の幼児からの画像スキャンを慎重に検討した後、ペンシルベニア大学の専門の介入放射線科医は、治療の根拠が裏付けられている限り、1ヶ月齢の幼児でCTガイドのICM投与を行うことに特定の解剖学的懸念はないことを示した。上述のように、乳児(1型)GM1を有する患者は、典型的な発作の発症年齢および18ヶ月齢までの進行性疾患の他の徴候を有する急速な疾患の経過を有する(Jarnes Utz et al., 2017)。進行性の神経学的疾患のため、18ヶ月齢の上限は、低レベルの臨床機能での疾患の安定化を超えてAAVhu68.GLB1から利益を得る可能性が限られている対象の登録を防止するために選択されている。自然史研究(natural history studies)は、乳児GM1ガングリオシドーシス患者が2歳までにほとんどの発達マイルストーンを失っていることを示している。
上述のように、症状の発症後の急速かつ破壊的な疾患の経過を考慮すると、遺伝子治療の潜在的な利益を最大化するために、治療は可能な限り早期に行われるべきである。兄弟姉妹の一致に関するデータは、乳児GM1を有する兄弟姉妹の臨床経過が発症および一般的な疾患症状と時間の観点で類似していることを示唆する(Gururaj et al.,2005.Magnetic Resonance Imaging Findings and Novel Mutations in GM1 Gangliosidosis.Journal of Child Neurology.20(1):57-60)。したがって、GM1ガングリオシドーシスの遺伝子診断および生化学的診断が確認された症候前の乳幼児が、6ヶ月齢またはそれ以前に症状の発症(低身長症を有する)が記録された罹患した年上の兄弟姉妹を有する場合、試験に含めることができる。
本研究は、AAVhu68.GLB1の第1/2相非盲検用量漸増試験であり、乳児形態のGM1を有する小児対象の大槽(cisterna magna、ICM)に送達されたAAVhu68.GLB1の単回投与後の、安全性、耐容性、および探索的有効性のエンドポイントを評価する。この研究では、乳児形態のGM1ガングリオシドーシス(1型)を有する最大12人の小児対象が登録され、対象は、ICM投与AAVhu68.GLB1の単一用量を受ける。対象を2年間経過観察して、安全性、耐容性、薬物動態および臨床転帰を評価し、治療後計5年間の追加の長期経過観察(long term follow up、LTFU)と共に、導入遺伝子発現および臨床応答の長期転帰および耐久性を評価する。LTFUから治療後5年間は、導入遺伝子発現の耐久性の評価、ならびに、以下のFDAの業界向けガイダンス(FDA Guidance for Industry)の草案に従って、未治療の患者よりも優れた機能レベルで生存期間を延長し対象を安定化させる上で、治療が有効であるかどうかの評価を可能にする:ヒト遺伝子治療製品投与後の長期経過観察(Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products、2018年7月)、ヨーロッパ、ブラジルおよびその他の現地の規制。試験が完了すると、対象は、安全性(腫瘍事象のモニタリング)、生存率、および臨床転帰を含む長期転帰についてモニタリングを続けるために患者の登録に招待され得る。AAVhu68.GLB1のその後の発症には、疾患の軽度の後発形態を有する患者の治療への拡張が含まれる。
rAAVhu68.GLB1の2つの用量を、対象の時間差順次投与で評価する。rAAVhu68.GLB1用量レベルは、マウスMED試験およびGLP NHP毒性試験のデータに基づいて決定され、低用量(コホート1に投与)および高用量(コホート2に投与)からなる。高用量は、同等のヒト用量にスケールされたNHP毒性試験における最大耐容用量(MTD)に基づいている。ヒト対象のために選択される高用量が等価ヒト用量の3分の1~半分であるように、安全域(safety margin)が適用される。低用量は、動物試験において等価スケール化されたMEDを超える用量である限り、典型的には、選択された高用量よりも2~3倍低い。これにより、両方の用量レベルが治療上の利益を与える可能性を有することが保証され、耐容されれば、より高い用量が有利であることが期待されることを理解する。低用量、続いて高用量の順次評価は、試験された2回の用量の最大耐容用量(MTD)の特定を可能にする。最後に、拡大コホート(コホート3)は、rAAVhu68.GLB1のMTDを受容する。コホート3(MTD)の6名の対象を時間差投与(staggered dosing)なしで同時に登録する。コホート3は、造血幹細胞移植(HSCT)とrAAVhu68.GLB1による併用療法を受けてもよい。耐容されれば、より高い用量が有利であることが期待される。
この研究の主な焦点は、rAAVhu68.GLB1の安全性と耐容性を評価することである。ICM AAVhu68送達のNHP研究では、一部の動物においてDRG感覚ニューロンの最小から軽度の無症状性の変性が実証されているため、感覚神経毒性を評価するために詳細な検査を実施し、本治験で感覚神経伝導検査を利用して、無症状性の感覚ニューロンの病変をモニタリングする。注目すべきことに、感覚ニューロンの機能喪失(潜在的な後根神経節毒性に起因する)は、30日、3ヶ月、6ヶ月、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月で、およびその後は毎年の間隔で実施される感覚神経伝導検査によって評価される。非臨床NHP研究でAAV投与後2~4週間以内に感覚ニューロンの病変が現れることを考慮すると、治療後3ヶ月間を通してより頻繁に評価することで、ヒトにおける同様の事象の評価を可能にし、毒性動態の潜在的な変動の評価を可能にする。この試験を通して経過観察を実施することにより、ヒトにおける時間経過が異なる場合、または臨床的続発症が観察された場合の遅延効果の評価を可能にし、それらがどのくらい持続し、経時的に改善されるか、安定した状態に維持されるか、または悪化するかを評価する。
この試験では、薬物動態および有効性のエンドポイントも評価され、この集団において有意義な機能転帰および臨床転帰を示す可能性について選択された。エンドポイントは、鎮静および/またはLPを必要とするものを除いて、30日、90日、6ヶ月、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月で測定され、その後は、最大5年間の経過観察期間に毎年測定される。長期経過観察段階では、測定頻度は12ヶ月毎に1回に減らされる。これらの時点を選択して、rAAVhu68.GLB1の安全性および耐容性の完全な評価を容易にした。未治療の乳児GM1患者における疾患進行の急速な速度を考慮して、早期の時点および6ヶ月間隔も選択した。このアプローチにより、未治療比較データが存在し、未治療の患者が著しい減少を示すことが予想される経過観察期間にわたって、治療された対象における薬物動態および臨床有効性の測定値の完全な評価が可能になる。
二次的および探索的な有効性のエンドポイントには、生存率、栄養管の非依存性、発作の発生率および頻度、PedsQLによって測定された生活の質、ならびに神経認知および行動発達が含まれる。乳児発達のベイリー尺度およびヴァインランド尺度は、適応行動、認知、言語、運動機能、および健康に関連する生活の質における発達および変化に対するrAAVhu68.GLB1の影響を定量化するために使用される。各測定値は、GM1疾患の集団または関連する集団のいずれかで使用され、親および家族からの入力に基づいてさらに洗練され、それらにとって最も有意義かつ影響力のある測定値を選択する。評価を標準化するために、治験に参加する現地では、経験豊富な神経心理学者によって様々な尺度の投与について訓練される。
標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録によって運動スキルが達成したか、他の運動マイルストーンを発達させてその後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の兆しがまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成された年齢と失なわれた年齢を追跡する。運動マイルストーンの達成度は、WHO基準に基づいて6つの粗大マイルストーンに定義されている。
乳児GM1ガングリオシドーシスを有する対象は、生後数ヶ月以内に症状を発症する可能性があり、第1のWHO運動マイルストーン(支えなしで座ること)の獲得は、典型的には、4ヶ月齢より前には現れないことを考慮すると(中央値:5.9ヶ月齢)、このエンドポイントは、特に治療時により明らかな症状を有していた対象において、治療的利益の程度を評価するための感度を欠く場合がある。このため、乳児に適用され得る年齢に適した発達マイルストーンの評価も含まれる(Scharf et al.,2016,Developmental Milestones.Pediatr Rev.37(1):25-37;quiz 38,47.)。これらのデータは、乳児GM1疾患を有する未治療の子供または定型発達の子供における典型的な獲得時間と比較して、経時的な発達マイルストーンの保持、獲得、または喪失を要約するために有益であり得る。
疾患が進行するにつれて、子供は発作を起こす可能性がある。発作活動の開始により、rAAVhu68.GLB1による治療が、発作の発症を予防もしくは遅延させるか、またはこの集団における発作事象の頻度を減少させるかのいずれかを決定することが可能になる。保護者は、発作の発症、頻度、長さ、および種類を追跡する、発作日記をつけるように求められる。これらの記載事項(entries)は、各来院時に臨床医と話し合い、解釈される。
rAAVhu68.GLB1の疾患体積変化のCNS症状に対する効果を評価するために、経時的にMRIで測定する。すべてのガングリオシドーシスの乳児の表現型は、脳組織体積(大脳皮質および他のより小さい構造)および脳室体積の両方で、巨頭症および頭蓋内MRI体積の急速な増加と一貫したパターンを有することが示された。加えて、脳梁、尾状核、および被殻、ならびに小脳皮質を含む様々な小さな脳の下部構造は、疾患の進行に伴って一般的にサイズが減少する(Regier et al.,2016、およびNestrasil et al.,2018、本明細書で引用)。rAAVhu68.GLB1による治療は、CNS疾患の症状の進行を遅らせるか、または停止させることが期待され、萎縮および体積変化における安定化の証拠を伴う。視床および基底核におけるT1/T2シグナル強度の変化(正常/異常)を評価する探索的エンドポイントは、GM1およびGM2ガングリオシドーシス患者における視床構造の変化に関する報告された証拠に基づいている(Kobayashi and Takashima,1994,Thalamic hyperdensity on CT in infantile GM1-gangliosidosis.Brain and Development.16(6):472-474)。
治験のためのバイオマーカーとしては、CSFおよび血清中で測定され得るβ-gal酵素(GLB1)活性、ならびに乳児GM1ガングリオシドーシスにおいて一貫した急速な萎縮を示す脳MRIが挙げられる(Regier et al., 2016b、本明細書で引用)。追加のバイオマーカーを、回収された試料由来のCSFおよび血清において、調査する。
A.主要目的:
・大槽(ICM)への単回投与後の2年間にわたって、rAAVhu68.GLB1の安全性および耐容性を評価すること。
B.二次目的:
・CSFおよび血清中のGLB1活性に基づいて、単回ICM投与後の24ヶ月にわたって、rAAVhu68.GLB1の薬物動態および生物学的活性を評価すること。この評価には、CSFのGM1濃度、ならびに血清および尿のケラタン硫酸レベル、ヘキソサミニダーゼ活性がさらに含まれ得る。
・生存率に対するrAAVhu68.GLB1の影響を評価すること
・24ヶ月齢での栄養管依存性の確率に対するrAAVhu68.GLB1の影響を評価すること
・達成時の年齢、喪失時の年齢、および年齢に適した発達および運動のマイルストーンを維持または獲得している子供の割合を評価することで、疾患の進行を評価すること(世界保健機関[WHO]の基準で定義されている)
・rAAVhu68.GLB1が神経認知発達に及ぼす影響を、以下に基づいて評価すること:
o乳幼児発達のベイリー尺度(Bayley Scales of Infant and Toddler Development)の年齢等価認知、粗大運動、微細運動、受容的および表現的コミュニケーションスコアの変化
oヴァインランドの適応行動尺度(Vineland Adaptive Behavior Scales)の各ドメインの標準スコアの変化
C.探索的目的:
・単回ICM投与後24ヶ月間にわたるrAAVhu68.GLB1の有効性を、以下によってさらに評価すること:
o発作日記によって評価される発作の発症年齢と頻度
o小児の生活の質調査(Pediatric Quality of Life Inventory、PedsQL)および小児生活の質調査の乳児尺度(Pediatric Quality of Life Inventory Infant Scale、PedsQL-IS)における総スコアの変化によって、小児の生活の質に対するrAAVhu68.GLB1の影響を評価すること
・単回ICM投与後24ヶ月にわたるrAAVhu68.GLB1の薬力学的効果を、以下による測定で、さらに評価すること:
oMRIで測定された脳の総容積、脳の下部構造の容積、および側脳室の容積の変化
o視床および基底核活性におけるT1/T2シグナル強度の変化
・肝臓および脾臓の体積に対するrAAVhu68.GLB1の影響を評価すること
・脳波、エコー、視覚誘発電位(VEP)に対するrAAVhu68.GLB1の影響を評価すること
D.研究設計:
rAAVhu68.GLB1の多施設、非盲検、単群、用量漸増試験(以下の表)。乳児GM1ガングリオシドーシスを有する合計12名の小児対象は、2投与コホートに登録され、ICM注入によって投与されるrAAVhu68.GLB1の単回用量を受ける。安全性および耐容性を2年間にわたって評価し、すべての対象をrAAVhu68.GLB1の投与後5年間にわたって追跡し、安全性および耐容性、薬物動態(導入遺伝子の発現の耐久性)、ならびに臨床転帰の耐久性の長期評価を行う。
Figure 2022512589000011
可能性のある対象は、投薬前35日目から投薬前1日目までにスクリーニングされ、試験に対する適格性が判断される。適格/除外基準(inclusion/exclusion criteria)を満たす対象は、1日目の朝または施設の診療に従って入院する。対象は、1日目に単回ICM用量のrAAVhu68.GLB1を受け、観察のために投薬後、少なくとも24時間病院に留まる。その後の評価は、投与の7日後、14日後、および30日後、次いで、1年目は60日毎、および2年目は90日毎に行われる。RAAVhu68.GLB1の安全性および耐容性は、有害事象(adverse event、AE)および重篤な有害事象(serious adverse event、SAE)の評価、バイタルサイン、身体検査、感覚神経伝導検査、および臨床検査(化学、血液学、凝固試験、CSF分析)を通じてモニタリングされる。AAVおよび導入遺伝子産物の免疫原性も評価される。有効性評価には、生存率、認知、運動および社会発達の測定、視覚機能および脳波(EEG)の変化、肝臓および脾臓の体積の変化、ならびにCSF、血清、および尿におけるバイオマーカーが含まれる。
本試験は、単回ICM注入として、rAAVhu68.GLB1が投与された以下の3つのコホートからなる:
・コホート1(低用量):3人の適格な対象(対象#1~#3)を登録し、第1の対象と第2の対象との間に4週間の安全性観察期間を伴って、低用量のrAAVhu68.GLB1を投与する。安全性審査トリガー(safety review trigger、SRT)が観察されない場合、全ての利用可能な安全性データは、コホート1の第3の対象がrAAVhu68.GLB1を投与された4週間後に、独立した安全委員会(safety board)によって評価される。
・コホート2(高用量):進行が決定された場合、3人の適格な対象(対象#4~#6)が登録され、高用量のrAAVhu68.GLB1が、第4の対象と第5の対象との間に4週間の安全性観察期間を伴って投与される。SRTが観察されない場合、独立した安全委員会は、コホート2の第3の対象がrAAVhu68.GLB1を投与された4週間後に、コホート1の対象からの安全性データを含む利用可能なすべての安全性データを評価する。
・コホート3(MTD):安全委員会による肯定的推奨が未決定である場合、最大6名の追加の対象を登録し、MTDで単回ICM用量のrAAVhu68.GLB1を投与する。このコホート内の対象についての投与は、対象間の4週間の安全性観察期間とずれることなく、このコホート内の最初の3人の対象の投与後に、安全性委員会の審査が必要である。
E.適格基準:
1.登録時に、1ヶ月齢超、18ヶ月齢未満であること。
2.GLB1遺伝子におけるホモ接合性変異もしくは複合ヘテロ接合性変異または欠失の同定、ならびに正常値の下限未満のβ-ガラクトシダーゼ酵素活性に基づいて、GM1ガングリオシドーシスの生化学的診断および分子診断が文書化されていること。
3.6ヶ月齢までの症状の発症、検査時の筋緊張低下、または親/介護者から引き出された病歴が記録されていること。
あるいは
症候前であり、かつ6ヶ月齢までに症状が発症した乳児GM1ガングリオシドーシス疾患の診断が確認された兄弟姉妹を有すること。
F.除外基準:
1.GM1ガングリオシドーシス、または治験責任医師の見解では試験結果の解釈を混乱させる可能性のある二次的な原因に起因しない、臨床的に有意な神経認知障害があること。
2.治験責任医師の見解では、対象を不当なリスクにさらす、あるいは治験薬の評価を妨げる、または対象の安全性もしくは試験結果の解釈を妨げる可能性がある任意の状態(例えば、疾患の病歴、現在の疾患の証拠、身体検査時の所見、または実験室の異常)であること。
3.登録から30日以内に入院が必要な急性の病気があること。
4.登録から30日以内に治療または入院が必要な呼吸器の問題があること。
5.透視イメージングに対する禁忌を含む、ICM投与手順に対する禁忌があること。
6.MRIまたは腰椎穿刺に対する禁忌があること。
7.スクリーニング前の4週間以内、またはその臨床試験で使用された治験薬の半減期の5倍の期間以内のいずれか長いほうの、治験薬を用いた他の臨床試験への登録があること(適応外ミグルスタットを投与された患者は適格である)。
G.投与経路および処置
rAAVhu68.GLB1は、単回用量として、1日目に、大槽内へのCTガイドの後頭下注入を介して対象に投与される。
1日目に、適切な濃度のrAAVhu68.GLB1を、試験に関連する治験薬剤部(investigational pharmacy)によって調製する。適切な濃度で5.6mLのrAAVhu68.GLB1を含有するシリンジを、処置室に送達する。治験薬投与には、以下の担当者が同席する:処置を行う介入医、麻酔科医および呼吸器技師(複数可)、看護師および医師助手、CT(または手術室)技師、施設研究コーディネーター。
治験薬を投与する前に、腰椎穿刺を実施して、所定の体積のCSFを除去し、次いで、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助するために、ヨード造影剤を髄腔内(IT)に注入する。静脈内(IV)造影剤は、髄腔内造影剤の代替物として、針穿刺の前またはその間に投与され得る。IVまたはIT造影剤を使用するかどうかは、介入医の判断に委ねられる。対象は、麻酔され、挿管され、処置テーブルに配置される。滅菌技術を使用して、注入部位を調製し、覆布をかける。透視ガイド下、脊髄針(22~25G)を大槽内に進める。針の配置を補助するために、より大きな誘導針を使用してもよい。針の配置を確認した後、エクステンションセットを脊椎針に取り付け、CSFで充填する。介入医の裁量で、造影剤を含有するシリンジを、エクステンションセットに接続してもよく、少量注入することで、大槽内に針が配置されていることを確認することができる。CTガイダンス+/-造影剤注入により針の配置を確認した後、5.6mLのrAAVhu68.GLB1を含むシリンジを、エクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を1~2分かけてゆっくりと注入し、5.0mLの容量を送達する。注射針は、対象からゆっくりと取り出される。
rAAVhu68.GLB1の大槽内(ICM)への単回用量は、投与後2年間を通して安全であり、かつ耐容可能である。
rAAVhu68.GLB1の大槽(ICM)への単回投与は、生存率を改善し、24ヶ月齢での栄養管依存の確率を低減し、かつ/または達成時の年齢、喪失時の年齢、ならびに年齢に適した発達および運動のマイルストーンを維持もしくは獲得する子供の割合によって評価される疾患進行を低減する。
治療は、神経認知機能の消失を遅らせる。
本明細書に引用される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれ、また、2018年10月1日に出願された米国仮特許出願第62/739,811号、および2019年4月17日に出願された米国仮特許出願第62/835,178号も、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、「18-8537PCT_SequenceListing_ST25.txt」とラベルされた本明細書に添付されている配列表、ならびにその中の配列およびテキストは、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
(配列表フリーテキスト)
以下の情報は、識別数字<223>の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
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Claims (27)

  1. AAVhu68カプシドと、標的ヒト細胞でヒトβ-ガラクトシダーゼの発現を導く調節配列の制御下でヒトβ-ガラクトシダーゼをコードするGLB1遺伝子を含むベクターゲノムと、を有するアデノ随伴ウイルス(AAV)。
  2. 前記ヒトβ-ガラクトシダーゼが、シグナルペプチドと、配列番号4のアミノ酸24~677のアミノ酸配列を有する成熟β-ガラクトシダーゼと、を含む、請求項1に記載のAAV。
  3. 前記シグナルペプチドが、配列番号4のアミノ酸1~23のアミノ酸配列を有する、請求項2に記載のAAV。
  4. 前記GLB1遺伝子が、配列番号4のアミノ酸24~677の前記成熟β-ガラクトシダーゼをコードする、配列番号5、配列番号6、配列番号7もしくは配列番号8から選択される配列、または配列番号5~8のうちのいずれか1つと少なくとも95%~99.9%同一の配列を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載のAAV。
  5. 前記調節配列が、ヒトユビキチンC(UbC)プロモーターを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のAAV。
  6. ベクターゲノムが、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、または配列番号16から選択される配列を有する、請求項1~5のいずれか一項に記載のAAV。
  7. 前記AAVhu68カプシドが、配列番号1の核酸配列もしくは配列番号2の予測されたアミノ酸配列をコードする配列から産生されるか、または前記AAVhu68が、
    配列番号2の1~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるvp1タンパク質、配列番号1から産生されるvp1タンパク質、もしくは配列番号2の1~736の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号1と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp1タンパク質から選択されるAAVhu68 vp1タンパク質の異種集団と、
    配列番号2の少なくとも約アミノ酸138~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるvp2タンパク質、配列番号1の少なくともヌクレオチド412~2211を含む配列から産生されるvp2タンパク質、もしくは配列番号2の少なくとも約アミノ酸138~736の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号1の少なくともヌクレオチド412~2211と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp2タンパク質から選択されるAAVhu68 vp2タンパク質の異種集団と、
    配列番号2の少なくとも約アミノ酸203~736の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるvp3タンパク質、配列番号1の少なくともヌクレオチド607~2211を含む配列から産生されるvp3タンパク質、もしくは配列番号2の少なくとも約アミノ酸203~736の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号1の少なくともヌクレオチド607~2211と少なくとも70%同一の核酸配列から産生されるvp3タンパク質から選択されるAAVhu68 vp3タンパク質の異種集団と、を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載のAAV。
  8. 製剤緩衝液と、請求項1~7のいずれか一項に記載のAAVと、を含む、水性医薬組成物。
  9. 前記製剤緩衝液が、
    緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの1つ以上を含む人工脳脊髄液と、
    界面活性剤と、を含む、請求項8に記載の医薬組成物。
  10. 前記界面活性剤が、前記医薬組成物の0.0005%w/w~約0.001%w/wで存在する、請求項9に記載の医薬組成物。
  11. 前記組成物が、7.5~7.8、もしくは6.2~7.7の範囲、または約7のpHである、請求項8~10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 大槽内注入(ICM)を介した患者への投与に好適な、GM1ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項1~7のいずれか一項に記載のAAVまたは請求項8~11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. GM1ガングリオシドーシスを有する患者または18ヶ月齢以下の乳児ガングリオシドーシスを有する患者への投与に好適な、GM1ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項1~7および12のいずれか一項に記載のAAV、または請求項8~12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. GM1ガングリオシドーシスの症状を改善する、またはGM1ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善するために、GM1ガングリオシドーシスの治療を必要とする患者への投与に好適な、GM1ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項1~7および12~13のいずれか一項に記載のAAV、または請求項8~13のいずれか一項に記載の組成物。
  15. GM1ガングリオシドーシスの治療に使用するための請求項14に記載のAAVまたは組成物であって、前記GM1ガングリオシドーシスの改善が、平均寿命の増加、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに/または神経認知発達の改善を含む、AAVまたは組成物。
  16. 前記AAVまたは前記組成物が、大槽内へのCTガイドの後頭下注入を介して投与される、GM1ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項1~7および12~15のいずれか一項に記載のAAV、または請求項8~15のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記AAVまたは前記組成物が、単回用量で投与される、GM1ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項1~7および12~16のいずれか一項に記載のAAV、または請求項8~16のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記AAVが、患者当たり2×1012GC~患者当たり3×1014GCの用量、または患者当たり8×1012ゲノムコピー(GC)~患者当たり3×1014GCの用量、任意選択的に、患者当たり2×1013GC~患者当たり3×1014GCの用量、患者当たり8×1013GC~患者当たり3×1014GC、または患者当たり約9×1013GCの用量で投与される、GM1ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項1~7および12~17のいずれか一項に記載のAAV、または請求項8~17のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記投与が、1x1010GC/g脳質量~3.4x1011GC/g脳質量の用量、任意選択的に、3.4x1010GC/g脳質量~3.4x1011GC/g脳質量、1.0x1011GC/g脳質量~約3.4x1011GC/g脳質量、または約1.1x1011GC/g脳質量の用量で、前記AAVを送達することを含む、GM1ガングリオシドーシスの治療に使用するための、請求項1~7および12~18のいずれか一項に記載のAAV、または請求項8~18のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記GM1ガングリオシドーシスの治療のための医薬品の製造における、請求項1~7および12~19のいずれか一項に記載のAAVまたは請求項8~19のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  21. GM1ガングリオシドーシスを有する患者を治療する方法であって、有効量の請求項1~7のいずれか一項に記載のAAVまたは請求項8~11のいずれか一項に記載の医薬組成物を、GM1ガングリオシドーシスを有する前記患者に投与することを含む、方法。
  22. 前記AAVまたは前記医薬組成物が、大槽内注入(ICM)、任意選択的に、大槽内へのCTガイドの後頭下注入を介して投与される、請求項21に記載の方法。
  23. 前記方法が、単回用量で前記AAVまたは前記医薬組成物を送達することを伴う、請求項21または22に記載の方法。
  24. 前記患者が、乳児ガングリオシドーシスを有し、18ヶ月齢以下である、請求項21~23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記AAVまたは組成物の前記投与が、GM1ガングリオシドーシスの症状を改善するか、またはGM1ガングリオシドーシスの神経学的症状を改善し、任意選択的に、前記患者が、治療後に、増加した平均寿命、栄養管の必要性の減少、発作の発生率および頻度の減少、神経認知低下への進行の減少、ならびに/または神経認知発達の改善のうちの1つ以上を有する、請求項20~24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記AAVが、患者当たり2x1012GC~患者当たり3x1014GC、または患者当たり8x1012ゲノムコピー(GC)~患者当たり3x1014GC、任意選択的に、患者当たり2x1013GC~患者当たり3x1014GC、患者当たり8x1013GC~患者当たり3x1014GC、または患者当たり約9x1013GCの用量で投与される、請求項20~25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記AAVが、1x1010GC/g脳質量~3.4x1011GC/g脳質量の用量、任意選択的に、3.4x1010GC/g脳質量~3.4x1011GC/g脳質量、1.0x1011GC/g脳質量~約3.4x1011GC/g脳質量、または約1.1x1011GC/g脳質量の用量で投与される、請求項20~26のいずれかに記載の方法。
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