JP2022531861A - 異染性白質ジストロフィーの治療に有用な組成物 - Google Patents

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Abstract

ＡＡＶｈｕ６８カプシドと、機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）をコードする核酸配列を含むベクターゲノムとを有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。また、ｒＡＡＶを産生するのに有用な産生システム、ｒＡＡＶを含む医薬組成物、および有効量のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に投与することによって、異染性白質ジストロフィーを有する対象を治療するか、または異染性白質ジストロフィーの症状を改善するか、または異染性白質ジストロフィーの進行を遅延させる方法も提供される。【選択図】図１

Description

異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）は、リソソーム酵素ＡＲＳＡをコードする遺伝子の変異によって引き起こされる単一遺伝子常染色体劣性スフィンゴ脂質蓄積症である（Ｖｏｎ Ｆｉｇｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ，２０１０）。ＡＲＳＡ欠損は、一般にスルファチドと称される、硫酸化ガラクトスフィンゴ脂質（ガラクトシルセラミド－３－Ｏ－スルフェートおよびガラクトシルスフィンゴシン－３－Ｏ－スルフェート）である、その天然基質の蓄積をもたらす。スルファチドは、末梢神経系（ＰＮＳ）におけるＳｃｈｗａｎｎ細胞およびマクロファージに加えて、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるオリゴデンドロサイト、ミクログリア、および特定のタイプのニューロンのリソソーム内に蓄積する（Ｐｅｎｇ ａｎｄ Ｓｕｚｕｋｉ，１９８７）。ＰＮＳおよびＣＮＳが主に影響を受けるが、スルファチドの蓄積はまた、内臓器官でも起こり、最も顕著なのは、腎臓、肝臓（Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、および胆嚢（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｗａｉｔｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１、ＭｃＦａｄｄｅｎ ａｎｄ Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，２０１５）である。
ＭＬＤ患者（すなわち、両方の対立遺伝子に変異を有する患者）は、典型的には、合成基質に基づくアッセイにおける対照値の０～１０％であるＡＲＳＡ酵素活性を有する。単一の変異ＡＲＳＡ対立遺伝子および１つの正常な対立遺伝子を有する、ＡＲＳＡ変異保因者は、臨床的に影響を受けず、通常、対照値の約１０％であるＡＲＳＡ酵素活性を有するが、偽欠損症（ＰＤ、ＡＲＳＡ欠損の別の遺伝的に異なる形態）対立遺伝子を有する無症候者は、健常な対照の約１０～２０％であるＡＲＳＡ酵素活性を有する（Ｇｏｍｅｚ－Ｏｓｐｉｎａ，２０１７）。臨床的に、ＭＬＤの３つの形態は、疾患重症度の広範な連続スペクトルにわたる症状発症の年齢に基づいて区別することができる：それぞれ、ＭＬＤ診断の５０～６０％、２０～３０％、および１５～２０％を構成する、急速に進行する重度の後期乳児型、若年型、および遅発性の緩徐進行性成人型（Ｇｏｍｅｚ－Ｏｓｐｉｎａ，２０１７、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。乳児ＭＬＤは奇病とみなされる。後期乳児ＭＬＤは、３０ヶ月齢前に発症し、疾患の最も重症の型である。後期乳児型は、均一な臨床所見および急速に進行する、予測可能な疾患経過を有する。若年性ＭＬＤは、３０ヶ月齢～１６歳の発症年齢によって特徴付けられ、発症年齢の中央値は、研究に応じて、６歳２ヶ月（Ｋｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１ａ）～１０歳（Ｍａｈｍｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）である。臨床表現型をより良く特徴付けるために、早期若年性ＭＬＤと称される、若年性ＭＬＤ患者のサブセットが記載されており、それらの患者は、６歳以下の臨床的発症年齢であり、後期乳児ＭＬＤを伴う子供と比較して、類似しているが、それほど急速ではない初期疾患の進行がある（Ｂｉｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。早期若年性および後期乳児表現型は、まとめて早発型ＭＬＤと称される（Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。後期若年性ＭＬＤ患者（すなわち、７～１６歳で症状を発症する患者）では、行動の問題、注意欠陥、または認知機能低下が、通常、最初に発生し、時々、歩行障害と併せて発生する。
ＭＬＤに対する承認された治療または疾患修飾療法は存在しない。ＭＬＤは欠陥ＡＲＳＡによって引き起こされるため、様々な研究アプローチは、ＣＮＳの影響を受ける神経組織における機能的ＡＲＳＡを置き換えることによって、生化学的欠陥を修正することを目的とする。酵素補充療法（ＥＲＴ）および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、ＡＲＳＡ欠損細胞に正常な酵素を提供することに依存するが、遺伝子療法アプローチは、異なる細胞型における野生型ＡＲＳＡの過剰発現に基づく（Ｐａｔｉｌ ａｎｄ Ｍａｅｇａｗａ，２０１３）。臍帯血（ＵＣＢ）、同種末梢血幹細胞、または同種骨髄を使用した造血幹細胞
移植（ＨＳＣＴ）の有効性は、ＭＬＤ表現型および患者の疾患状態に対する介入のタイミングに依存する（Ｐａｔｉｌ ａｎｄ Ｍａｅｇａｗａ，２０１３、ｖａｎ Ｒａｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。骨髄移植（ＢＭＴ）は、最良の結果のために、ヒト白血球抗原の一致した同胞ドナーの利用可能性を必要とし（Ｂｏｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、感染症、および死亡などの、移植およびコンディショニング関連の合併症のリスクを有する。臍帯血（ＵＣＢ）移植は、より迅速な利用可能性、ＧｖＨＤのより低いリスク、より低い死亡率、より高い完全ドナーキメリズム率、および良好な酵素欠損の修正の利点を有するＢＭＴの代替を提供する（Ｂａｔｚｉｏｓ ａｎｄ Ｚａｆｅｉｒｉｏｕ，２０１２、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。しかしながら、ＢＭＴは欧州では広く利用可能ではない。脳生着は遅く、多くの場合、細胞が生着し、ＣＮＳに移動し、分化し、酵素レベルを回復するのに何ヶ月もかかる。さらに、ＨＳＣＴで達成された生理学的酵素レベルは、ＣＮＳ全体で欠損を修正するのに十分ではない場合がある。これは、移植が急速に進行する早発型のＭＬＤにおいて有効ではない理由を説明することができ、発症前に実施しても疾患のすべての態様を修正または安定化することができない（ｄｅ Ｈｏｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｂｏｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
したがって、これらの患者における疾患進行を停止または予防することができる迅速に開始される療法に対する実質的に満たされていない必要性が残っている。
ＨＳＣＴに加えて、ＡＲＳＡを（過剰）発現し、酵素を患部細胞に送達し、マイクロカプセル化された組換え細胞、オリゴデンドロサイトおよび神経前駆細胞、ならびに胚性幹細胞を含む、ＭＬＤの神経学的兆候を治療する、様々な他の細胞ベースのアプローチが存在する。これらの細胞療法は、動物モデルにおけるスルファチド蓄積のかなりのクリアランスを示しているが（Ｐａｔｉｌ ａｎｄ Ｍａｅｇａｗａ，２０１３）、まだヒトでは試験されていない。
ヒトＡＲＳＡコードレンチウイルスベクターを自己ＣＤ３４＋細胞に形質導入し、遺伝子修正細胞を患者に再投与することによって、造血幹細胞移植と遺伝子療法とを組み合わせた（ＨＳＣ－ＧＴ）、エクスビボレンチウイルス遺伝子療法が試みられている（Ｂｉｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。この療法は、（年上の罹患した同胞での診断後に）発症前段階で特定された患者にとって有望であるが、既に症候性である患者において有効であることは示されていない。残念なことに、新生児スクリーニングがまだ利用可能でないため、新たなＭＬＤ診断のほとんどは、症状発症後に行われ、これにより、多くのＭＬＤ患者にとって治療選択肢の可能性が少なくなる。さらに、骨髄破壊的コンディショニングレジメンに固有のリスク、およびこれらの組み込みベクターに関連する挿入変異誘発のリスクが存在する。
ＮＨＰにおける薬理毒性試験により、注射部位の周囲に局在する脳の炎症（脳炎）に起因する有意な用量制限毒性が示された（Ｚｅｒａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。同様に、脳の白質内の１２部位における脳内ベクター投与に関与する（Ｚｅｒａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、早発型ＭＬＤに罹患した子供の脳におけるＡＡＶｒｈ１０媒介性ＡＲＳＡ遺伝子移入の安全性および有効性を評価するための第１／２相臨床試験が進行中である（ＮＣＴ０１８０１７０９）（Ａｕｂｏｕｒｇ，２０１６）。治験の結果は、抽象的な形態を除いて公表されておらず、予備報告書により、発症を予防または疾患進行を停止する際の有効性の欠如が示唆されている（Ｓｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。有効性の欠如の理由については、治験依頼者によって考察されていない。ＡＡＶｒｈ１０媒介性遺伝子療法に加えて、脳内送達レンチウイルス遺伝子治療もまた、いずれかの型のＭＬＤを有する患者で採用されている（ＮＣＴ０３７２５６７０）。
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、現在、いくつかのリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）のための標準治療（ＳＯＣ）であり（Ｓａｎｄｓ，２０１４）、マンノース－６－リン酸受容体を介して注入された酵素を取り込む細胞の能力に依存する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＭＬＤでは、ＥＲＴは、Ａｒｓａ－／－マウスの腎臓、末梢神経、およびＣＮＳにおいてスルファチド蓄積を低減させる（Ｍａｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ヒトＡＲＳＡに対する免疫寛容および超常的スルファチド合成を有する悪化したＭＬＤマウスモデルでは、ＭＬＤ症状の改善およびスルファチド蓄積の低減は、早期の時点で処置されたマウスにおいてのみ見られ、進行した症状を有する患者ではＩＶ投与したＥＲＴが機能しない可能性があることが示唆された（Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。同じモデルでは、ＢＢＢを迂回するための組換えＡＲＳＡの持続的ＩＴ注入は（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、スルファチド蓄積の完全な逆転およびＣＮＳ機能障害の修正をもたらし、一方、マウスにおける他の非臨床研究では、スルファチド蓄積の低減および機能転帰の改善がもたらされた（Ｍａｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｐｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。しかしながら、ヒトでは、ＥＲＴによる代謝補正の程度は、早発型ＭＬＤにおいて発生する急速な脳脱髄を阻止するために、十分で、適時ではない可能性がある（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＢＢＢは、ほとんどの巨大タンパク質のＣＮＳへのアクセスを制限するので、ＥＲＴは、ＣＮＳに直接送達された場合にのみ機能する可能性が高く（Ａｂｂｏｔｔ，２０１３）、短い半減期が頻繁な投与を必要とすると考えられる。この仮説は、頻繁な高用量のＩＶ投与（ＮＣＴ００６８１８１１）またはＩＴ注入（Ｇｉｕｇｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）によって、これらの制限を克服しようとしたＥＲＴ臨床試験において証明されている。しかしながら、ＩＶ投与したＥＲＴによる後期乳児ＭＬＤ患者の結果（ＮＣＴ００４１８５６１）は、早発型および後期若年性ＭＬＤにおけるＩＴ投与したＥＲＴ（ＮＣＴ０１５１００２８）とともに失望的であった。
小分子ベースの治療は、（例えば、ＢＢＢを交差させることによって）ＭＬＤに対する現在の治療の制限を潜在的に克服することができ、また、疾患の異なる発症メカニズムに対処することができる。ワルファリン（クマジン）は、後期乳児ＭＬＤ患者の小さなコホートにおいて基質還元剤として試験されている抗凝固剤である。尿スルファチドレベルまたは脳バイオマーカーであるＮ－アセチルアスパラギン酸およびミオイノシトールのレベルに対する有益な効果はなかった（Ｐａｔｉｌ ａｎｄ Ｍａｅｇａｗａ，２０１３）。
他の研究アプローチで得られた全体的に失望させた非臨床結果と相まって、ＨＳＣＴおよびＨＳＣ－ＧＴの限られた利点、制限された集団、狭い治療濃度域、および関連するリスクは、特に早発型ＭＬＤ患者にとって、他の実行可能な治療選択肢に対する重要な満たされていない臨床的必要性を表す。
望まれることは、異常なＡＲＳＡ遺伝子および／または異染性白質ジストロフィーに関連する状態を治療するための代替療法である。
アリールスルファターゼＡ遺伝子（ＡＲＳＡ）変異に関連する疾患（例えば、異染性白質ジストロフィー、すなわち、ＭＬＤ、またはＡＲＳＡ偽欠損症）の治療を必要とする対象において、それらを治療するのに有用である、治療用、組換え、および複製欠損アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が本明細書に提供される。ｒＡＡＶは、望ましくは、複製欠損であり、逆位末端反復（ＩＴＲ）と、調節配列の制御下の機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）をコードする核酸配列とを含み、その調節配列が標的細胞内でｈＡＲＳＡの発現を指示する、ベクターゲノムを有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ベクターゲノムがパッケージングされるＡＡＶｈｕ６８カプシドをさらに含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶｈｕ６８ゲノム配列を含有せず、ＡＡＶｈｕ６８
カプシドに対して完全に外因性である。
特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡは、シグナルペプチドと、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ５０７の配列とを有する。特定の実施形態では、天然のｈＡＲＳＡシグナルペプチド、例えば、配列番号２のａａ１～ａａ１８が使用される。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４のａａ１～ａａ２０である。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ１５２１と約９５％～１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１または配列番号３である。さらなる実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ５０７の配列をコードする。なおさらなる実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号２または配列番号４の配列をコードする。
特定の実施形態では、調節配列は、ニワトリβ－アクチン（ＢＡ）プロモーターおよびヒトサイトメガロウイルス最初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）に由来する調節エレメント（例えば、配列番号５のｎｔ１９８～ｎｔ８６２であるＣＢ７プロモーター）、ニワトリＢＡスプライスドナーおよびウサギβ－グロビン（ｒＢＧ）スプライスアクセプターエレメントからなるキメライントロン（例えば、配列番号５のｎｔ９５６～ｎｔ１９２８であるＣＩ）、ならびにｒＢＧ遺伝子に由来するポリアデニル化（ポリＡ）シグナル（例えば、配列番号５のｎｔ３５３９～ｎｔ３６６５であるｒＢＧ）のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号５のヌクレオチド（ｎｔ）１～ｎｔ３８８３の配列を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む組成物は、ＡＲＳＡ変異に関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）の症状を改善するため、かつ／またはＡＲＳＡ変異に関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）の進行を遅延させるために、それを必要とする対象に投与可能である。
別の態様では、ｒＡＡＶを産生するのに有用な産生システムが提供される。このシステムでは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質をコードする核酸配列、本明細書に記載されるベクターゲノム、ならびにベクターゲノムのＡＡＶカプシドへのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびヘルパー機能を含む細胞が培養される。
一態様では、ＡＲＳＡ変異と関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）の治療を必要とする対象において、それを治療するのに有用なベクターが、本明細書に提供される。ベクターは、調節配列の制御下の機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）をコードする核酸配列を有し、その調節配列は標的細胞内でｈＡＲＳＡの発現を指示する。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１と約９５％～１００％同一である。追加的または代替的に、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は配列番号１である。特定の実施形態では、ベクターまたはベクターを含む組成物は、ＡＲＳＡ変異と関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）の症状を改善するため、かつ／またはＡＲＳＡ変異と関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）の進行を遅延させるために、それを必要とする対象に投与可能である。
さらなる態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶまたはベクターおよび水性懸濁媒体を含む組成物が本明細書に提供される。特定の実施形態では、製剤緩衝液および記載されるｒＡＡＶまたはベクターを含む水性組成物が提供される。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、約０．０００５％～約０．００１％の界面活性剤を含む
。特定の実施形態では、組成物は、ｐＨが７．２～７．８である。
別の態様では、ＡＲＳＡ変異と関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）を有する対象を治療するか、またはＡＲＳＡ変異と関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）の症状を改善するか、またはＡＲＳＡ変異と関連する疾患（例えば、ＭＬＤ）の進行を遅延させる方法が提供される。この方法は、有効量の本明細書に記載されるｒＡＡＶまたはベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、ベクターまたはｒＡＡＶは、大槽内注入（ＩＣＭ）、例えば、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注入を介して患者に投与可能である。特定の実施形態では、７歳以下、または６歳以下である異染性白質ジストロフィーを有する患者に投与可能であるベクターまたは組成物が提供される。特定の実施形態では、この方法は、ｒＡＡＶまたはベクターを単回用量でヒト患者に送達することを含む。
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかになる。
操作されたｈＡＲＳＡコード配列（配列番号１、すなわち、配列番号３のｎｔ７～ｎｔ１５２７、および配列番号５のｎｔ１９６８～ｎｔ３４８８）を提供する。 ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターゲノムの線形マップを提供する。ベクターゲノムは、ユビキタスＣＢ７プロモーターの制御下で、操作された型のヒトＡＲＳＡ（ｈＡＲＳＡｃｏ）を発現するものである。ＣＢ７は、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーとニワトリＢＡプロモーターとのハイブリッドからなる。ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ；ＢＡ、β－アクチン；ＣＭＶ ＩＥ、サイトメガロウイルス最初期；ＩＴＲ、逆位末端反復；ポリＡ、ポリアデニル化；およびｒＢＧ、ウサギβ－グロビン。 ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ．ＫａｎＲと称される、シスプラスミドの線形マップを提供する。ＢＡ、β－アクチン；ｂｐ、塩基対；ＣＭＶ ＩＥ、サイトメガロウイルス最初期；ｈＡＲＳＡｃｏ、ヒトアリールスルファターゼＡ（操作された）；ＩＴＲ、逆位末端反復；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；Ｏｒｉ、複製起点；ポリＡ、ポリアデニル化；ｒＢＧ、ウサギβ－グロビン。 トランスプラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲの線形マップを提供する。ＡＡＶ２：アデノ随伴ウイルス血清型２、ＡＡＶｈｕ６８：アデノ随伴ウイルス血清型ｈｕ６８、ｂｐ：塩基対、Ｃａｐ：カプシド、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性、Ｏｒｉ：複製起点、Ｒｅｐ：レプリカーゼ。 アデノウイルスヘルパープラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）を提供する。図５Ａは、親プラスミドｐＢＨＧ１０から、中間体ｐＡｄΔＦ１およびｐＡｄΔＦ５を介した、ヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ６の誘導を示す。図５Ｂは、ｐＡｄΔＦ６のアンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えて、ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）を得たことを示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏベクターを産生するための製造プロセスフロー図を提供する。ＡＡＶ、アデノ随伴ウイルス；ＡＥＸ、アニオン交換；ＣＲＬ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ｄｄＰＣＲ、ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応；ＤＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地；ＤＮＡ、デオキシリボ核酸；ＦＦＢ、最終製剤緩衝液；ＧＣ、ゲノムコピー；ＨＥＫ２９３、ヒト胚性腎臓２９３細胞；ＩＴＦＦＢ、髄腔内最終製剤緩衝液；ＰＥＩ、ポリエチレンイミン；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＴＦＦ、接線流濾過；ＵＳＰ、米国薬局方；ＷＣＢ、ワーキングセルバンク。 ＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏベクターの製造プロセスフロー図を提供する。Ａｄ５、アデノウイルス血清型５；ＡＵＣ、分析用超遠心分離；ＢＤＳ、バルク原薬；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＣＺ、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ；ｄｄＰＣＲ、ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応；Ｅ１Ａ、初期領域１Ａ（遺伝子）；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＦＤＰ、充填製剤；ＧＣ、ゲノムコピー；ＨＥＫ２９３、ヒト胚性腎臓２９３細胞；ＩＴＦＦＢ、髄腔内最終製剤緩衝液；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性（遺伝子）；ＭＳ、質量分析；ＮＧＳ、次世代配列決定；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＴＣＩＤ５０、５０％組織培養感染量；ＵＰＬＣ、超高速液体クロマトグラフィ；ＵＳＰ、米国薬局方。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターの側脳室内投与後のマウスの左右の大脳半球におけるＡＲＳＡ酵素活性を示す。６週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスに、１．００×１０１０ＧＣ（低用量）または１．００×１０１１ＧＣ（高用量）のいずれかの用量で右心室にＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターの単回ＩＣＶ注入を与えた（Ｎ＝５／群）。年齢を適合させたＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスに、対照として右心室にＰＢＳをＩＣＶ投与した（Ｎ＝４）。２１日後にマウスを剖検し、左右の大脳半球におけるＡＲＳＡ酵素活性を、発色基質である、４－ニトロカテコールスルファートの加水分解速度（ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｈｒ）に基づいて測定した。ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ（タンパク質）；ＧＣ、ゲノムコピー；ＩＣＶ、側脳室内；Ｎ、動物数；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水。より詳細については、実施例２を参照されたい。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターの側脳室内投与後のマウスの肝臓および血清におけるＡＲＳＡ酵素活性を示す。６週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスに、１．００×１０１０ＧＣ（低用量）または１．００×１０１１ＧＣ（高用量）のいずれかの用量で右心室にＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターの単回ＩＣＶ注入を与えた（Ｎ＝５／群）。年齢を適合させたＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスに、対照として右心室にＰＢＳをＩＣＶ投与した（Ｎ＝４）。２１日後にマウスを剖検し、図９Ａの血清および図９Ｂの肝臓におけるＡＲＳＡ酵素活性を、発色基質である、４－ニトロカテコールスルファートの加水分解速度（ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｈｒ）に基づいて測定した。ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ（タンパク質）；ＧＣ、ゲノムコピー；ＩＣＶ、側脳室内；Ｎ、動物数；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水。 マウスにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏＨＡ．ｒＢＧの側脳室内投与後の脳内のニューロンおよびオリゴデンドロサイトへのＡＲＳＡの送達を示す。６週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスに、１．００×１０１０ＧＣ（低用量）または１．００×１０１１ＧＣ（高用量）のいずれかの用量で右心室にＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏＨＡ．ｒＢＧの単回ＩＣＶ注入を与えた（Ｎ＝５／群）。年齢を適合させたＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスに、対照として右心室にＰＢＳをＩＣＶ投与した（Ｎ＝５）。２１日後にマウスを剖検し、脳組織を得た。組織を切片化し、免疫染色して、ＡＲＳＡ（緑：フルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート化二次抗体で検出した抗ＨＡ一次抗体）およびオリゴデンドロサイト（赤：テトラメチルローダミンコンジュゲート化二次抗体で検出した抗ＯＬＩＧ２一次抗体）を可視化した。大脳皮質の代表的な画像を、５００ｍｓの露出で２０倍の倍率で示す。トリミングした拡大写真（下段）は、ＡＲＳＡを発現する皮質下白質由来のオリゴデンドロサイトを示す。ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ（タンパク質）；ＧＣ、ゲノムコピー；ＨＡ、ヘマグルチニン；ＩＣＶ、側脳室内；Ｎ、動物数；ＯＬＩＧ２、オリゴデンドロサイト転写因子２；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの大槽内投与後の非ヒト霊長類の脳脊髄液内のＡＲＳＡ活性レベルを示す。成体カニクイザルマカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）は、３．００×１０１２ＧＣ（ＬＤ）、１．００×１０１３ＧＣ（ＭＤ）、または３．００×１０１３ＧＣ（ＨＤ）の用量でＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの単一のＩＣＭ投与を受けた（Ｎ＝２／群）。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与後（０日目）、ＣＳＦを、７、１４±１、２１±１、３５±１、および４２±２日目に採取した。ＡＲＳＡ活性を、発色基質である、４－ニトロカテコールスルファートの加水分解速度（ｎｍｏｌ／［ｈｒ＊ｍＬ］）によって測定した。ＩＣＭ投与前の各個体のベースラインＡＲＳＡ活性レベルとして定義された、内因性マカクＡＲＳＡ活性を差し引いて、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与から生じるＡＲＳＡ活性を得た。点線は、各個体のベースラインＡＲＳＡ活性レベルを表す。ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ（タンパク質）；ＣＳＦ、脳脊髄液；ＧＣ、ゲノムコピー；ＨＤ、高用量；ＩＣＭ、大槽内、ＬＤ、低用量；ＭＤ、中用量；Ｎ、動物数。凡例の矢印を使用して各試験を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの大槽内投与後の非ヒト霊長類の脳脊髄液および血清中の抗ＡＲＳＡ抗体レベルを提供する。成体カニクイザルマカクは、３．００×１０１２ＧＣ（ＬＤ）、１．００×１０１３ＧＣ（ＭＤ）、または３．００×１０１３ＧＣ（ＨＤ）の用量で０日目にＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの単一のＩＣＭ投与を受けた（Ｎ＝２／群）。未処置の年齢を適合させたカニクイザルマカクは、対照として機能した（Ｎ＝２）。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与後（０日目）、ＣＳＦを、７、１４±１、２１±１、３５±１、および４２±２日目に採取した。７、１４±１、２１±１、２８±１、３５±１、および４２±２日目に血清を回収した。間接ＥＬＩＳＡを、組換えヒトＡＲＳＡで予めコーティングしたプレートを使用して、ＣＳＦ（希釈１：２０、図１２Ａ）および血清（希釈１：１０００、図１２Ｂ）に対して実施して、抗ｈＡＲＳＡ抗体レベル（４５０ｎｍでの吸光度）を測定した。点線は、未処置対照における平均吸光度を表す。ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ（タンパク質）；ＣＳＦ、脳脊髄液；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＧＣ、ゲノムコピー；ｈＡＲＳＡ、ヒトアリールスルファターゼＡ；ＨＤ、高用量；ＩＣＭ、大槽内、ＬＤ、低用量；ＭＤ、中用量；Ｎ、動物数。凡例の矢印を使用して各試験を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの大槽内投与後の非ヒト霊長類の脳内のヒトＡＲＳＡ発現を示す。成体カニクイザルマカクは、３．００×１０１３ＧＣ（ＨＤ）の用量でＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの単一のＩＣＭ投与を受けた（Ｎ＝２）。未処置の年齢を適合させたカニクイザルマカクは、対照として機能した（Ｎ＝２）。動物を、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与の４２±２日後に剖検し、ヒトＡＲＳＡ（褐色沈殿物）を認識する抗体を使用する免疫組織化学的染色のために脳を得た。１匹のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ処置動物の脳の皮質（図１３Ｅ、図１３Ｆ、図１３Ｇ、図１３Ｉ、および図１３Ｊ）、海馬（図１３Ｈ）、視床（図１３Ｋ）、および小脳（図１３Ｌ）を通る切片の代表的な画像を、シグナル比較のための未処置対照からの切片（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、および図１３Ｄ）とともに示す。ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ（タンパク質）；ＧＣ、ゲノムコピー；ＨＤ、高用量；ＩＣＭ、大槽内；Ｎ、動物数。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの大槽内投与後の非ヒト霊長類の脊髄および後根神経節におけるヒトＡＲＳＡ発現を提供する。成体カニクイザルマカクは、３．００×１０１３ＧＣ（ＨＤ）の用量でＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの単一のＩＣＭ投与を受けた（Ｎ＝２）。未処置の年齢を適合させたカニクイザルマカクは、対照として機能した（Ｎ＝２）。動物を、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与の４２±２日後に剖検し、頸部、胸部、および腰髄ならびにＤＲＧの切片を、ヒトＡＲＳＡ（褐色沈殿物）を認識する抗体を使用する免疫組織化学的染色のために得た。１匹のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ処置動物の切片の代表的な画像（図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｆ、図１４Ｇ、図１４Ｈ、および図１４Ｉ）を、シグナル比較のための未処置対照からの切片（図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃ）とともに示す。ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ（タンパク質）；ＧＣ、ゲノムコピー；ＨＤ、高用量；ＩＣＭ、大槽内；Ｎ、動物数。
アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子の変異および／または正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ））を治療するための組成物および方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ＡＲＳＡ遺伝子の変異および／または正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患または症状を治療するための組成物および方法も提供される。ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有し、その中に機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）タンパク質をコードするベクターゲノムをパッケージングした、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、必要とする対象に送達される。望ましくは、このｒＡＡＶは、水性緩衝液とともに製剤化される。特定の実施形態では、懸濁液は、髄腔内注入に好適である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏと称され、ｈＡＲＳＡコード配列は、操作されたｈＡＲＳＡコード配列（特定されない限り、「ｈＡＲＳＡｃｏ」または「ｈＡＲＳＡ」と称され、例えば、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ１５２１、配列番号３、またはそれらと少なくとも約９５％～約９９．９％同一である配列）である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡｃｏは配列番号１である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡｃｏは配列番号３である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＡＲＳＡｃｏと称され、操作されたｈＡＲＳＡコード配列は、サイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７；配列番号１６）を有するニワトリβアクチンプロモーターを含む調節配列の制御下にある。特定の実施形態では、組成物は、大槽内注入（ＩＣＭ）を介して送達される。
本明細書でＡＡＶｈｕ６８と称される系統群Ｆのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のカプシドをコードする核酸配列は、ベクターゲノムを有するＡＡＶｈｕ６８カプシドおよび組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生に利用される。ＡＡＶｈｕ６８に関連する追加の詳細は、ＷＯ２０１８／１６０５８２およびこの詳細な説明に提供される。本明細書に記載されるＡＡＶｈｕ６８ベクターは、操作されたｈＡＲＳＡコード配列を含むベクターゲノムを、脳、海馬、運動皮質、小脳、および運動ニューロンを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）内の細胞、ならびに脳および脊髄の外側の神経および神経節を含む、末梢神経系（ＰＮＳ）に送達するのに非常に適している。これらのベクターは、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳ内の他の細胞、ならびに特定の他の組織および細胞、例えば、腎臓または肝臓または胆嚢を標的化するために使用され得る。
Ｉ．アリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）
アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）は、セレブロシド硫酸を加水分解する酵素的活性を有する（すなわち、以下の反応：セレブロシド３－硫酸塩＋Ｈ２Ｏ＝セレブロシド＋硫酸塩）。ヒトＡＲＳＡ（ｈＡＲＳＡ）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１５２８９、ＡＲＳＡ＿ＨＵＭＡＮ）の２つのアイソフォームが特定されている：Ｐ５１６０８－１、配列番号２、およびＰ５１６０８－２、配列番号１５。本明細書全体を通して、別途指定されない限り、ＡＲＳＡへの言及はｈＡＲＳＡである。
本明細書で使用される場合、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、野生型ｈＡＲＳＡタンパク質（例えば、Ｐ５１６０８－１、配列番号２、またはＰ５１６０８－２、配列番号１５）の酵素的活性（すなわち、酵素活性）の少なくとも約１０％を有するｈＡＲＳＡタンパク質のアイソフォーム、天然バリアント、バリアント、多形体、または切断型を指す。ＯＭＩＭ＃６０７５７４（ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／６０７５７４），ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＡＲＳＡおよびｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１５２８９を参照されたい。それらのウェブページの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では
、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、野生型ｈＡＲＳＡタンパク質（例えば、Ｐ５１６０８－１、配列番号２、またはＰ５１６０８－２、配列番号１５）の酵素的活性の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、野生型ｈＡＲＳＡタンパク質（例えば、Ｐ５１６０８－１、配列番号２、またはＰ５１６０８－２、配列番号１５）の酵素的活性の約１０％～約１５％、約１０％～約２０％、約１０％～約２５％、約１０％～約３０％、約１０％～約５０％、約１０％～約７５％、約１０％～約９０％、約１０％～約１００％、約１０％～約３倍、約１５％～約２０％、約１５％～約２５％、約１５％～約３０％、約１５％～約５０％、約１５％～約７５％、約１５％～約９０％、約１５％～約１００％、約１５％～約３倍、約２０％～約２５％、約２０％～約３０％、約２０％～約５０％、約２０％～約７５％、約２０％～約９０％、約２０％～約１００％、約２０％～約３倍、約２５％～約３０％、約２５％～約５０％、約２５％～約７５％、約２５％～約９０％、約２５％～約１００％、約２５％～約３倍、約５０％～約７５％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約５０％～約３倍、約７５％～約９０％、約７５％～約１００％、または約７５％～約３倍を有する。ｈＡＲＳＡの酵素的活性を測定する方法（例えば、合成基質に基づくアッセイによる、および／またはスルファチド負荷アッセイによる）は、実施例ならびに様々な刊行物、例えば、Ｋｒｅｙｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｄｕａｌ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ（ＡＲＳＡ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｌａｔｅ－ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９３ Ａｕｇ；５３（２）：３３９－４６．、Ｌｅｅ－Ｖａｕｐｅｌ Ｍ ａｎｄ Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ Ｅ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．１９８７ Ａｐｒ ３０；１６４（２）：１７１－８０、Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２０１７ Ｎｏｖ；３８（１１）：１５１１－１５２０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｕｍｕ．２３３０６．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｓｅｐ ６、およびＦｒａｎｃｅｓｃｏ
Ｍｏｒｅｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｅｎｃｈ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ ａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏｗａｒｄ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－３－ｓｕｌｆａｔｅ ｃｅｒａｍｉｄｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ
ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１４
Ｊａｎ ７；８６（１）：４７３－８１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃ４０２３５５５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｄｅｃ １１に見出すことができる。
特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチドと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ５０７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列とを含む。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチドと、（ｉｉ）配列番号１５（すなわち、配列番号２のａａ８５～ａａ５０７）のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列とを含む。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチドと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ４４４のアミノ酸配
列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列と、（ｉｉｉ）配列番号２のａａ４４８～ａａ５０７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列とを含む。さらなる実施形態では、（ｉｉ）のアミノ酸配列は、ジスルフィド結合によって（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に連結され得る。他の化学結合、例えば、共有結合、および非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合、およびＶａｎ Ｄｅｒ Ｗａａｌｓ結合を含む）が、利用されてもよい。なおさらなる実施形態では、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）のアミノ酸配列間の連結は、記載される結合の組み合わせによって形成される。別の実施形態では、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）のアミノ酸配列間の連結は、ペプチドリンカーである（例えば、ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｄｏｍａｉｎｓ／Ｌｉｎｋｅｒを参照されたい）。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチドと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸（ａａ）８５～ａａ４４４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列と、（ｉｉｉ）配列番号２のａａ４４８～ａａ５０７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列とを含む。さらなる実施形態では、（ｉｉ）のアミノ酸配列は、ジスルフィド結合によって（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に連結され得る。他の化学結合、例えば、共有結合、および非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合、およびＶａｎ Ｄｅｒ Ｗａａｌｓ結合を含む）が、利用されてもよい。なおさらなる実施形態では、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）のアミノ酸配列間の連結は、記載される結合の組み合わせによって形成される。別の実施形態では、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）のアミノ酸配列間の連結は、ペプチドリンカーである（例えば、ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｄｏｍａｉｎｓ／－Ｌｉｎｋｅｒを参照されたい）。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチドと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸（ａａ）２３～ａａ３４８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチドと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ４４８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、（ｉ）シグナルペプチドと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸（ａａ）４４８～ａａ５０７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、特定された同一性を有する機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、配列番号２の番号付けに基づいてａａ８５～ａａ５０７の外側、および／もしくは配列番号２の番号付けに基づいてａａ２９、６９、１２３、１２５、１５０、２２９、２８１、２８２のいずれか１つ以上の外側、および／もしくはｈＡＲＳＡ保存ドメイン（例えば、Ｐｆａｍ：ＰＦ００８８４を有するスルファターゼドメイン）のいずれかの外側、および／もしくは配列番号２の番号付けに基づいてａａ１９～ａａ４４４の外側、および／もしくは配列番号２の番号付けに基づいてａａ４４８～ａａ５０７の外側、および／もしくは配列番号２の番号付けに基づいてａａ２３～ａａ３４８の外側、またはそれらの任意の組み合わせにその修飾を有する。例えば、ｖｏｎ Ｂｕｌｏｗ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ
Ａ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊａｎ １２；３０５（２）：２６９－７７を参照されたい。
特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％）同一のアミノ酸配列を有する。
本明細書で使用される場合、シグナルペプチド（シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチドと呼ばれることもある）は、分泌経路の方へ定められる新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチド（通常１５～３０アミノ酸長）である（Ｂｌｏｂｅｌ Ｇ，Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ Ｂ（Ｄｅｃ １９７５）．“Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｃｒｏｓｓ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｉ．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｎａｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｙｅｌｏｍａ”．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６７（３）：８３５－５１）。これらのタンパク質には、特定のオルガネラ（小胞体、ゴルジまたはエンドソーム）内に存在するもの、細胞から分泌されるもの、またはほとんどの細胞膜に挿入されるもののいずれかが含まれる。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２のａａ１～ａａ１８のアミノ酸配列、または配列番号４のａａ１～ａａ２０のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＮＳ細胞（例えば、ニューロン）、ＰＮＳ細胞、または別の細胞（例えば、腎臓細胞、または肝臓細胞）によって分泌される別のタンパク質に由来する。シグナルペプチドは、好ましくは、ヒト起源またはヒトシグナルペプチドの誘導体であり、約１５～約３０アミノ酸、好ましくは約１７～２５アミノ酸、または約１８アミノ酸長である。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、天然シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸１～１８）である。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、天然シグナルペプチドの代わりに外因性リーダー配列を含む。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＩＬ２または変異シグナルペプチド由来であり得る。別の実施形態では、ヒトセルピンＦ１分泌シグナルが、シグナルペプチドとして使用され得る。外因性シグナルペプチドおよびｈＡＲＳＡの成熟部分（例えば、配列番号２のａａ１９～５０７、配列番号２のａａ１９～ａａ４４４、配列番号２のａａ８５～ａａａ５０７、配列番号２のａａ２３～ａａ３４８、または配列番号２のａａ４４８～５０７）を含むこのようなキメラｈＡＲＳＡタンパク質は、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質について言及される場合、本明細書に記載される様々な実施形態に含まれる。
本明細書では、ｈＡＲＳＡコード配列またはＡＲＳＡコード配列またはｈＡＲＳＡまたはＡＲＳＡと称される、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、修飾または操作された（ｈＡＲＳＡまたはｈＡＲＳＡｃｏ）である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ１５２１の配列、またはそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１のｎｔ５５～ｎｔ１５２１、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも
約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１またはそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号３またはそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号３、またはそれと少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％）同一の核酸配列である。
ｈＡＲＳＡ（これはまた、ｈＡＲＳＡコード配列でもある）の転写バリアントは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００４８７．５、ＮＭ＿００１０８５４２５．２、ＮＭ＿００１０８５４２６．２、ＮＭ＿００１０８５４２７．２、ＮＭ＿００１０８５４２８．２、ＮＭ＿００１３６２７８２．１、ＡＢ４４８７３６．１、ＡＫ０９２７５２．１、ＡＫ０９８６５９．１、ＡＫ３０１０９８．１、ＡＫ３１０５６４．１、ＡＫ３１５０１１．１、ＢＣ０１４２１０．２、ＢＩ７７０９９７．１、ＢＭ８１８８１４．１、ＢＰ３０６３５１．１、ＢＱ１８４８１３．１、ＢＵ６３２１９６．１、ＢＸ６４８６１８．１、ＣＡ４２３４９２．１、ＣＮ４０９２３５．１、ＣＲ４５６３８３．１、ＤＡ８４４７４０．１、ＤＢ０２８０１３．１、ＧＱ８９１４１６．１、ＫＵ１７７９１８．１、ＫＵ１７７９１９．１、およびＸ５２１５１．１として見出すことができる。ＮＣＢＩ参照配列の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、修飾または操作されたｈＡＲＳＡコード配列は、ＮＣＢＩ参照配列の１つと約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％未満の同一性を共有する。特定の実施形態では、修飾または操作されたｈＡＲＳＡコード配列は、ＮＣＢＩ参照配列の１つと約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を共有する。
「核酸」または「ヌクレオチド」は、本明細書で記載される場合、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの修飾であってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよく、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、疑似相補性ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などを含む群から選択され得る。かかる核酸配列には、例えば、限定されないが、例えば、転写リプレッサーとして作用する、タンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害核酸配列、例えば、限定されないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれる。
核酸配列の文脈における「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一な」という用語は、対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長にわたり得、または、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片が望まれる。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチ
ド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。
パーセント同一性は、タンパク質の全長、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、もしくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、または配列をコードする対応する核酸配列について容易に決定することができる。好適なアミノ酸フラグメントは、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり得、最大で約７００個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列された」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損もしくは追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。
整列は、公共または市販の様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。アミノ酸配列の場合、配列整列プログラム、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性または整列を提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
多重配列整列プログラムもまた、核酸配列に対して利用可能である。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用して比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および検索配列（ｓｅａｒｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）とともに使用して決定することができる。
ＩＩ．異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）
本明細書では、「疾患」、例えば、異染性白質ジストロフィーと称される、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子の変異および／または正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患または異常な状態を治療するのに有用なｒＡＡＶ、ベクター、方法および組成物が提供される。例えば、ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／２５０１００を参照されたい。
異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）は、以下の型に分類することができる：乳児ＭＬ
Ｄ（典型的に、３０ヶ月齢以下で始まる）および早期若年性ＭＬＤ（通常、３０ヶ月齢～６歳（６歳を含む）で始まるを含む早発型ＭＬＤ；早期若年性ＭＬＤおよび後期若年性ＭＬＤを含む若年性ＭＬＤ（通常、１６歳を含む、７歳～１６歳で始まる）；および成人型ＭＬＤ（１６歳よりも遅く発症する）。後期乳児ＭＬＤ患者は、運動障害および認知機能障害の両方の症状において同質である、急速かつ予測可能な衰退を伴う深刻な疾患経過を有する（Ｋｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１ａ、Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの子供の大部分は、５歳未満で死亡し、９８人の患者の平均生存期間は４．２年であり、５年生存率は２５％である（Ｍａｈｍｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。早期若年性ＭＬＤ（３０ヶ月齢～６歳の間で症状発症）を伴う子供の表現型は、後期乳児ＭＬＤを伴う子供の表現型と非常に類似しているが、早期若年性ＭＬＤ患者は、それほど急速でない初期疾患の進行がある場合がある（Ｂｉｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかしながら、明らかな症状が現れると、特に早期若年性ＭＬＤ患者が自立して歩行する能力を失うと、それらの患者の疾患経過は、後期乳児ＭＬＤ患者と同様に急速に悪化する可能性がある。また、これらの子供は、後期乳児ＭＬＤ患者と同様の兆候および症状を有し、単独で発生するか、または行動および認知症状と同時に発生する、神経筋障害を最初に発症する（Ｇｒｏｅｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｋｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。早期若年性および後期乳児表現型は、まとめて早発型ＭＬＤと称される（Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、組成物および方法は、ＭＬＤ、早発型ＭＬＤ、乳児ＭＬＤ、後期乳児ＭＬＤ、若年性ＭＬＤ、早期若年性ＭＬＤ、後期若年性ＭＬＤ、または成人型ＭＬＤの治療に有用である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、組成物、および方法は、対象における疾患症状を改善することができ、および／または疾患の進行を遅延させることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、組成物、および方法は、後期乳児ＭＬＤおよび早期若年性ＭＬＤの治療に有用である。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、方法または組成物の対象または患者は、ＭＬＤを有するか、またはＭＬＤと診断される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、方法または組成物の対象または患者は、後期乳児ＭＬＤまたは早期若年性ＭＬＤと診断される。ＭＬＤの診断は、遺伝子検査および生化学検査の両方を通じて行われ得る。遺伝子検査は、ＡＲＳＡにおける変異を同定することができ、一方、生化学検査は、スルファターゼ酵素活性および尿中スルファチド排泄を含む。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により、ＭＬＤの診断を確認することができる。ＭＲＩは、ヒトの脳の画像化を示し、ミエリンの有無を示すことができる。ＭＬＤの影響を受ける個体の脳には、古典的なミエリン喪失のパターンが存在する。疾患が進行するにつれて、画像化により、脳への損傷が蓄積することが示される。幼児では、初期の脳画像化は正常であり得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、方法または組成物の対象は、１８歳未満（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ヶ月齢未満、または約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８歳未満）のヒトである。追加的または代替的に、対象は、新生児または１ヶ月齢超（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ヶ月齢超、または約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８歳超）のヒトである。特定の実施形態では、患者は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ヶ月齢、または約１、１．５、２、２．５、３
、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８歳である。特定の実施形態では、患者は、約３０ヶ月齢～約７歳である。特定の実施形態では、患者は、約３０ヶ月齢～１６歳、７歳～１６歳、または１６歳～４０歳である。
本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」は、互換的であり、ヒトを含む、雄または雌の哺乳動物、獣医学用動物または家畜、飼育動物または愛玩動物、および通常臨床研究に使用される動物を意味する。一実施形態では、これらのｒＡＡＶ、ベクター、方法および組成物の対象は、ヒト患者である。一実施形態では、これらのｒＡＡＶ、ベクター、方法および組成物の対象は、男性または女性のヒトである。特定の実施形態では、これらのｒＡＡＶ、ベクター、方法、および組成物の対象は、異染性白質ジストロフィーおよび／または異染性白質ジストロフィーの症状と診断される。
疾患症状（例えば、ＭＬＤを有しない健常な対照と比較したＭＬＤ症状）には、以下が含まれ得るが、これらに限定されない：ＡＲＳＡ（例えば、血清中もしくはＣＳＦ中）の濃度および／もしくはレベルおよび／もしくは生物活性の減少、尿スルファチドの増加、ＣＮＳの髄鞘形成（脱髄負荷およびパターン）、ＭＲＩによって測定される白質萎縮、異常な（減少もしくは増加した）ニューロン代謝産物Ｎ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）、ミオイノシトール（ｍＩ）、コリン（Ｃｈｏ）および／もしくは乳酸塩（Ｌａｃ）レベル（例えば、プロトン磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）によって測定される）、ＣＳＦスルファチドおよびリソ－スルファチド（ｌｙｓｏ－ｓｕｌｆａｔｉｄｅ）レベルの増加、異常な視覚誘発電位（ＶＥＰ）、異常な脳幹聴覚誘発反応（ＢＡＥＲ）、胆嚢壁肥厚（例えば、超音波評価による）、運動機能障害（例えば、異染性白質ジストロフィーのための粗大運動能力分類（ＧＭＦＣ－ＭＬＤ）もしくは粗大運動能力尺度（ＧＭＦＭ）によって測定される）、達成時の年齢、喪失時の年齢、および運動マイルストーンを維持もしくは獲得する子供の割合によって評価される運動マイルストーン達成の遅延（世界保健機関［ＷＨＯ］基準によって定義される）、認知機能障害（例えば、Ｂａｙｌｅｙ乳幼児発達検査［ＢＳＩＤ－ＩＩＩ］、児童向けＷｅｃｈｓｌｅｒ式知能検査、第５版［ＷＩＳＣ－Ｖ］によって測定された合計知能指数［ＩＱ］およびサブドメインＩＱ）、寿命の延長（患者と比較して）、神経学的臨床検査（ＮＣＥ）の異常な結果、尺骨、深腓骨、正中、腓腹神経の神経伝導速度（ＮＣＶ）の低下、発作日記によって捕捉される発作のより早い発症年齢およびより高い頻度、行動機能障害（例えば、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度、第３版（Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩ）によって測定される）、より低いＬａｎｓｋｙパフォーマンス指数、小児の生活の質調査（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）（例えば、ＰｅｄｓＱＬおよびＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ）の減少、ならびに／または介護者／親の生活の質の減少。
特定の実施形態では、疾患症状（例えば、ＭＬＤを有しない健常な対照と比較したＭＬＤ症状）には、異常な特性（例えば、バイオマーカー活性、電気生理学的活性、および／またはイメージングパラメータ）および臨床観察（例えば、粗大および微細運動機能の障害、認知および言語発達の障害、異常な神経学的検査所見、行動およびマイルストーン発達の障害、ならびに介護者／親が報告した転帰および生活の質の評価の減少が含まれ得る。
異常な特性には、ミエリン産生オリゴデンドロサイトおよびＳｃｈｗａｎｎ細胞の機能障害、末梢神経伝導異常、遅い神経伝導速度（ＮＣＶ）を伴う末梢神経障害、典型的な白質（例えば、脳梁および頭頂後頭白質の膨大部、投射線維、小脳白質、脳幹神経節、ならびに視床）パターン（例えば、異常な白質内の正常なシグナル強度のバンドを有する放射状ストライプの「虎斑パターン」、例えば、Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ，２０１０、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２、ｖａｎ Ｒａｐ
ｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５を参照されたい）を示す脳磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｕ－線維（Ｕ－ｆｉｂｅｒ）病変および小脳変化、白質脱髄、特に前頭葉における白質低密度の両側の領域、ならびにミエリンの喪失を反映する脳萎縮症）、異常なレベルの脳バイオマーカーＮ－アセチルアスパラギン酸およびミオイノシトールが含まれるが、これらに限定されない。
臨床観察には、不器用さ、つま先歩き、および頻繁な転倒として現れる粗大運動障害、細かい運動技能、歩行異常、痙性対麻痺または失調性運動、神経筋障害、神経学的症状（脱力の兆候、痙攣および失禁に進行する調整の失調）、低血圧、および低下した深部腱反射、発作、認知症、てんかん、排尿困難痙攣、摂食困難、四肢の痛み、言語機能の障害、認知技能の障害、視覚および聴覚障害、以前に獲得した運動および認知マイルストーンの喪失、学校または仕事のパフォーマンスの低下、不注意、異常行動、精神症状、知的障害、制御不能な笑い、皮質障害（例えば、失行、失語、失認）、アルコールまたは薬物の使用、不十分な資金管理、情緒不安定、不相応な情動、ならびに神経精神症状（精神病、統合失調症、妄想、および幻覚を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
疾患進行は、疾患症状の対象の発症年齢、出現頻度、重症度、または再発を指す。疾患進行の遅延は、通常、疾患症状の発症年齢の上昇、出現頻度の低下、重症度の低下、または再発の少なさを意味する。
上記の通り、「増加する」「減少する」「低下させる」「改善する」「上昇する」「低い」「高い」「少ない」「多い」「向上する」「遅延する」「損なう」「異常な」「厚い」もしくはそれらの任意の文法的変形、または変化を示す任意の類似の用語は、別途指定されない限り、対応する参照（例えば、未治療の対照またはＭＬＤを有しない正常な状態の対象）と比較して、約５倍、約２倍、約１倍、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％の変動を意味する。
本明細書の組成物および方法は、即効性の疾患修飾治療を、標準治療が存在しない（ＨＳＣＴおよびＨＳＣ－ＧＴが有効でない）症候性の早発型の患者に提供し、かつ／またはＣＮＳ病理および末梢神経機能の両方を保存もしくは補正することができ、そのうちの後者はＨＳＣＴによって補正されず、進行性の微細および粗大運動機能喪失ならびに呼吸器不全を引き起こす、療法を提供し、かつ／または症状の発症前に実施する場合にのみ有効であり、すべての患者において末梢神経障害に実質的に対処することができない、苛酷な骨髄破壊的移植前治療を必要とする、ＨＳＣ－ＧＴに対する代替の治療選択肢を提供する。
特定の実施形態では、患者は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、ベクター、組成物または方法なしでは適格ではなかった併用療法を受ける。かかる併用療法は、臍帯血（ＵＣＢ）、同種末梢血幹細胞、または同種骨髄を介した酵素補充療法（ＥＲＴ）および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を含み得る。
任意選択的に、免疫抑制性併用療法を、それを必要とする対象において使用してもよい。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、および細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリ
ムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与前または投与後０、１、２、３、４、５、６、７日以上の日に開始され得る。かかる免疫抑制療法は、１つ、２つ以上の薬物（例えば、グルココルチコイド、プレネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の投与を伴い得る。かかる免疫抑制薬は、同じ用量または調整用量で、１回、２回、またはそれ超、必要とする対象に投与され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬物、（例えば、プレドネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を含み得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、同じ用量または調整された用量で、遺伝子療法投与後に継続されてもよい。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、またはそれ超であり得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まないレジメンが選択される。
ＩＩＩ．発現カセット
本明細書では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質をコードするｈＡＲＳＡコード配列と、発現カセットとも称される標的細胞中でｈＡＲＳＡの発現を指示する調節配列とを含む核酸配列が提供される。本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列（例えば、ｈＡＲＳＡコード配列）、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得る。必要な調節配列は、標的細胞中でその転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式でｈＡＲＳＡコード配列と作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列には、ｈＡＲＳＡコード配列と隣接する発現制御配列、およびｈＡＲＳＡコード配列を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、およびＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７）プロモーター（例えば、本明細書でｈＳｙｎまたはＳｙｎとも称される、配列番号５のｎｔ１９８～ｎｔ８６２）を有するニワトリβアクチンプロモーターである。しかしながら、特定の実施形態では、他のプロモーター、または追加のプロモーターが選択され得る。
特定の実施形態では、調節配列は、標的細胞中でｈＡＲＳＡの発現を指示する。特定の実施形態では、標的細胞は、神経系細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、ＣＮＳ内のニューロン、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、ＰＮＳ内のマクロファージ、または内臓器官（例えば、腎臓細胞、肝臓細胞および胆嚢細胞）内の細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、中枢神経系細胞であり得る。特定の実施形態では、標的細胞は、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、グリア細胞、皮質細胞、前頭皮質細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞のうちの１つ以上である。特定の実施形態では、標的細胞は、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、例えば、網膜細胞である。神経系由来の細胞以外の他の細胞は、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、リンパ節細胞、扁桃細胞、骨髄間葉細胞、幹細胞、骨髄幹細胞、心臓細胞、上皮細胞、食道細胞、胃細胞、胎児切断細胞、結腸細胞、直腸細胞、肝臓細胞、親切な細胞、肺細胞、唾液腺細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、乳房細胞、膵臓細胞、ランゲルハンス細胞の島、胆嚢細胞、前立腺細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、子宮細胞、子宮頸部細胞、精巣細胞、またはＭＬＤを有しない対象において機能的ｈＡＲＳＡタンパク質を発現する任意の他の細胞などの標的細胞としても選択され得る。ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＡＲＳＡ＆ｋｅｙｗｏｒｄｓ＝ａｒｓａ＃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを参照されたい。
特定の実施形態では、調節配列は、ユビキタスプロモーター、例えば、ＣＢ７プロモーターを含む。特定の実施形態では、調節エレメントは、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化
配列、イントロン、エンハンサー、およびＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。
特定の実施形態では、発現制御配列（調節配列）の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する追加的または代替的なプロモーター配列が含まれ得る。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、または生理学的刺激に応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに利用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリβ－アクチンプロモーターから選択され得る。
プロモーターに加えて、発現カセットは、１つ以上の他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えば、ＷＰＲＥ、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、調節配列は、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ最初期エンハンサー（配列番号１９）を含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。あるいは、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離され得る。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリβ－アクチンイントロン（配列番号１７）をさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン（ＣＩ）であり、ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプターエレメントからなるハイブリッドイントロンである。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ ２０１１／１２６８０８に記載される。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ウサギグロビンポリＡ、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい）。特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、存在しない。
任意選択的に、特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列に加えて、別の非ＡＡＶコード配列、例えば、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物を含んでもよい。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡが含まれ得る。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通してそれらの活性を示す。これらの内因性発現
ｍｉＲＮＡはヘアピン前駆体を形成し、その後、ｍｉＲＮＡ二本鎖に、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子に処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて、例えば、３′ＵＴＲ領域内の標的ｍＲＮＡの標的部位を特定する、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを誘導する。
特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＮＳまたは末梢後根神経節における発現レベルを調節するための後根神経節（ｄｒｇ）特異的ｍｉＲＮＡ脱標的化（ｄｅｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ）配列をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、遺伝子産物コード配列の３’側の非翻訳領域（ＵＴＲ）に、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、またはｍｉＲ－９６に特異的な少なくとも１つの標的配列が存在する。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｈＡＲＳＡコード配列の５’および３’の両方に位置する。特定の実施形態では、発現カセットｍＲＮＡまたはＤＮＡプラス鎖の少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列および／または少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列は、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号：２０）、（ｉｉ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号：２１）、（ｉｉｉ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号：２２）、および（ｉｖ）ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号：２３）から選択される。特定の実施形態では、構築物は、少なくとも２つのタンデム反復をさらに含み、同じまたは異なり得る、少なくとも１つの第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、少なくとも１つの第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、タンデムｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であるか、または１～１０個の核酸のスペーサーによって分離されており、当該スペーサーは、ｍｉＲＮＡ標的配列ではない。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列があり、ｈＡＲＳＡコード配列の３’に位置する。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＡＲＳＡコード配列の３’末端から２０ヌクレオチド以内である。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＡＲＳＡコード配列の３’末端から少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡタンデム反復は、２００～１２００ヌクレオチド長を含む。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列があり、ｈＡＲＳＡコード配列の５’に位置する。特定の実施形態では、２つ以上の連続したｍｉＲＮＡ標的配列は、連続しており、スペーサーによって分離されていない。特定の実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、スペーサーによって分離されており、各スペーサーは、（Ａ）ＧＧＡＴ、（Ｂ）ＣＡＣＧＴＧ、または（Ｃ）ＧＣＡＴＧＣのうちの１つ以上から独立して選択される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置するスペーサーは、第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’および／または最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置し得る。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列間のスペーサーは同じである。
２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号、および２０１９年１２月２０日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６７８７２号を参照されたい（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ｍｉＲ配列は、発現カセットまたはベクターゲノムに含まれない。
ＩＶ．ＡＡＶｈｕ６８
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ＲＢＧについてのカプシドとして選択されたＡＡＶｈｕ６８血清型は、アミノ酸レベルでＡＡＶ９と９９％同一である。ＡＡＶｈｕ６８は、ＡＡＶ９に匹敵するＮＨＰおよびマウスの神経系における形質導入特性を示す。これには、皮質ニューロンの広範な形質導入（データは示さず）、およびミエリン産生オリゴデンドロサイトの小さなサブセットが含まれる。さらに、ＡＡＶｈｕ６８は、
脊髄および末梢神経に突出する軸索とともにＰＮＳおよびＤＲＧ感覚ニューロンに突出する軸索を有する運動ニューロンを形質導入する（データは示さず）。腹角の下位運動ニューロンおよびＤＲＧの感覚ニューロンにおいて形質導入が観察された。形質導入された運動ニューロンは、末梢神経に寄与する軸索を有する。したがって、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＭＬＤ患者において両方、影響を受ける、ＣＮＳおよびＰＮＳにおける細胞を標的とする。さらに、新たに合成されたＡＲＳＡは、トランスーゴルジ網からリソソームに直接輸送され得るが、これはまた、マンノース－６－リン酸受容体を介して他の細胞によって分泌され、取り込まれ、その後リソソームに輸送され得る。したがって、内在する欠陥は、機能的酵素を欠くＣＮＳの隣接細胞に供給されるｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡ発現ＡＲＳＡ酵素によって交差補正され得る。
配列番号７の番号付けに基づいて、ＡＡＶｈｕ６８（以前はＡＡＶ３Ｇ２と称されていた）は、ｖｐ１の６７位および１５７位の２つのコード化されたアミノ酸によって、別の系統群ＦのウイルスＡＡＶ９と異なる。対照的に、他の系統群ＦのＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３１）は、６７位にＡｌａおよび１５７位にＡｌａを有する。新規のＡＡＶｈｕ６８カプシドおよび／または操作されたＡＡＶカプシドが提供され、配列番号７の番号付けに基づいて１５７位にバリン（ＶａｌまたはＶ）を有し、任意選択的に、配列番号７の番号付けに基づいて６７位にグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドステレオタイプは、ＡＡＶｈｕ３１ ｖｐ１（配列番号１１および１２）またはＡＡＶｈｕ３２ ｖｐ１（配列番号１３および１４）から選択され得る。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指し、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列の整列に基づいて、少なくとも７５％のブートストラップ値（少なくとも１０００反復のうち）および０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合アルゴリズム（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するのに使用され得るコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定される１つの系統群に含まれるか、別の系統群に含まれるか、またはこれらの系統群の外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００４ Ｊｕｎ；７８（１０：６３８１－６３８８）を参照されたい。これは、系統群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを同定し、新規ＡＡＶの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９）を提供する。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、さらに、以下のうちの１つ以上を特徴とする。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパクが、配列番号７の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号６から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号７の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号６と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号７の少なくともアミノ酸約１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号６の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号７の少なくともアミノ酸約１３８～７３６の予測アミ
ノ酸配列をコードする配列番号６の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、および／または配列番号７の少なくともアミノ酸約２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現により産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号６の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号７の少なくともアミノ酸約２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号６の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。
ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、典型的には、全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を発現するために、単独で使用される。あるいは、この配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しないＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号６の約ヌクレオチド（ｎｔ）６０７～約ｎｔ２２１１から転写されるｍＲＮＡ）、または配列７のａａ２０３～７３６をコードする配列番号６と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列、のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、ｖｐ１コード配列および／またはｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号７のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号６のｎｔ４１２～２２１１から転写されるｍＲＮＡ）、または配列番号７の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号６と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。
本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号７のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列、および任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１および／またはｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）からカプシドを発現する産生システムで産生されるｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有し、配列番号７の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。
一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号６の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号７のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号６の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコー
ドする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を有しない配列番号７のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号６のｎｔ４１２～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。
しかしながら、配列番号７のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号６の核酸配列、または配列番号６と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号７をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号６の核酸配列、または配列番号６の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と、少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号７のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号６の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号６のｎｔ６０７～ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号７のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。
ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードする核酸配列を設計することは、当業者の知識の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６に提供される。例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたい（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号６の核酸配列、または本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を含む配列番号７のｖｐ１アミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号７に再現される。
本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではないエレメントからなる集団を指す。配列番号７は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。
本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。
例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡ
ＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中のすべてのｖｐ３タンパク質よりも少ない１つの（１）ｖｐ３タンパク質であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の亜集団であり得、ｖｐ３は、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらなる亜集団であり得る。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含み得る。
別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号７（ＡＡＶｈｕ６８）に基づくアミノ酸５７での少なくとも８０％のアスパラギンは、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化され得、総ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化され得る）。かかる割合は、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。
理論に束縛されることを意図するものではないが、ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質中の少なくとも高度に脱アミドされた残基の脱アミド化は、本質的に非酵素的であると考えられ、選択されたアスパラギンを脱アミド化するカプシドタンパク質内の官能基、およびより少ない程度でグルタミン残基によって引き起こされる。大部分の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組み立ては、これらの事象がカプシド組み立て後に生じるか、または個々のモノマー（ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）における脱アミドが構造的に十分許容され、ほとんどが組み立て動態に影響を及ぼさないことを示す。一般に、細胞侵入前に内部に位置すると考えられているＶＰ１固有（ＶＰ１－ｕ）領域（約ａａ１～１３７）における広範な脱アミド化は、カプシドのアセンブリの前にＶＰ脱アミド化が生じ得ることを示唆する。Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の骨格窒素原子を介して、Ａｓｎの側鎖アミド基炭素原子に対して求核攻撃を行うことによって生じ得る。中間環閉鎖スクシンイミド残基が形成されると考えられる。次いで、スクシンイミド残基は、高速加水分解を行って、最終産物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）の脱アミド化は、ＡｓｐまたはＩｓｏＡｓｐをもたらし、例えば、以下に例示するように、スクシンイミド中間体を介して相互変換され得る。
Figure 2022531861000002
本明細書に提供されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３中の各脱アミド化Ｎは、独立して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート、および／またはＡｓｐおよびｉｓｏＡｓｐの相互変換ブレンド、またはこれらの組み合わせであり得る。α－およびイソアスパラギン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約５０：５０のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、もしくは約１：３のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または別の選択された比率であり得る。
特定の実施形態では、１つ以上のグルタミン（Ｑ）は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわちα－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、またはα－およびγ－グルタミン酸のブレンドに脱アミド化され得、共通のグルタルイミド中間体を介して相互変換され得る。α－およびγ－グルタミン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のα対γ、約５０：５０のα：γ、もしくは約１：３のα：γ、または別の選択された比率であり得る。
Figure 2022531861000003
したがって、ｒＡＡＶは、少なくとも１つの高度脱アミド化アスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド中に亜集団を含む。加えて、他の修飾は、特に選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。さらに他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の亜集団を含み、そのうちの少なくとも１～１０％は、ｖｐタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して脱アミド化される。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基は脱アミド化され得る。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、実施例１１に提供され、参照により本明細書に組み込まれる表に示される位置に、２つ、３つ、４つ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶカプシドを有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、および／または質量分析（ＭＳ）、および／またはタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグ
ラフィは、ＮａｎｏＦｌｅｘ ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラムおよびＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。ＭＳデータは、Ｑ
Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富なまだ配列決定されていない前駆体イオンを動的に選択する。シーケンシングは、予測自動増加制御で決定された１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行われ、４ｍ／ｚのウィンドウで前駆体の単離を行った。ｍ／ｚ２００で１２０，０００の解像度で、調査スキャンを取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が５０ｍｓ、正規化された衝突エネルギーが３０で、ｍ／ｚ２００で３０，０００に設定され得る。Ｓ－レンズＲＦレベルを５０に設定して、消化物からのペプチドが占めるｍ／ｚ領域の透過率を最適化できる。前駆体イオンは、単一、割り当てられていない、または断片化選択から６つ以上の電荷状態で除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、取得したデータの分析に使用され得る。ペプチドマッピングのために、固定変更としてカルバミドメチル化が設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド、およびリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルに対する信頼レベル０．８を使用して検索を行う。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４ Ｄａ（－ＯＨおよび－ＮＨ２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化および天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定される。考えられる脱アミド化部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている等張種は、単一のピークで共移行し得る。したがって、複数の潜在的脱アミド部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の脱アミド部位を特定または区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位において独立していることを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０などの四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、またはＯｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎまたはＯｒｂｉｔｒａｐ
Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィシステムとしては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ
ＵＰＬＣシステムまたはＡｇｉｌｅｎｔのシステム（１１００または１２００シリーズ）が含まれる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＰｉｎｐｏｉｎｔおよびＰｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が含まれ得る。さらに他の技法は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。
脱アミド化に加えて、他の修飾も生じ得るが、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、または酸化を含み得る。
脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対のグリシンを変更し、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギ
ンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、またはアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギンが、アミド基を含む）、および／またはアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが、アミン基を含む）に変更される。本明細書で使用される場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン、および／またはプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、または３つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つすべてでは行われない。したがって、ＡＡＶおよび／または操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法は、より低い脱アミド率を有する。加えて、または代替え的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、ＡＡＶの脱アミド化を低減し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異体ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニンまたはセリンに変化するように、アルギニン－グリシン対における変異を含む。変異ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む１つ、２つ、または３つの変異を含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む１つ、２つ、３つ、または４つのかかる変異を含み得る。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、変異を含む２つの異なるＮＧ対であり、ＡＡＶカプシド中の構造的に別個の位置に位置する。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異の１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意選択的に、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に修飾を含まないが、ＮＧ対の外側に位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミンの脱アミド化を最小化または排除するための変異を含む。
ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって７０％超の脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合、９０％超である。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初に、トリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、配列番号７の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、配列番号７のアスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。配列番号８は、修飾ＡＡＶｈｕ６８カプシドのアミノ酸配列を提供し、ある割合の脱アミド化アミノ酸または別様に修飾されたアミノ酸を有し得る位置を例示する。これらおよび他の修飾の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質からなる自己集合ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は、典型的には、配列番号９の核酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現され、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４のｖｐ１アミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一、または配列
番号１０と９９％同一のアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。また、ＵＳ７９０６１１１およびＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。本明細書で使用される「ＡＡＶ９バリアント」には、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、およびＵＳ８，７３４，８０９に記載のバリアントが含まれる。
カプシド、そのコード配列を生成する方法、およびｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてヌクレオチド配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、またはそのオープンリーディングフレーム、または少なくとも１５ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」という用語は、最大限対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、望ましくは、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列またはその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、アミノ酸またはその断片に対して言及される場合、適切なアミノ酸の挿入または欠失を伴って別のアミノ酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてアミノ酸配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、もしくはそのタンパク質、例えば、ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または少なくとも８アミノ酸長であるそれらの断片、もしくはより好ましくは、少なくとも１５アミノ酸長にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、９７％超の同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いることによって、当業者によって容易に決定される。
一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列された」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損または追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。実施例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶ整列を行う。整列は、公共のまたは市販の様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃ
ｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用して比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および検索配列（ｓｅａｒｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）とともに使用して決定することができる。「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性または整列を提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
Ｖ．ｒＡＡＶ
アリールスルファターゼＡ遺伝子（ＡＲＳＡ）変異と関連する疾患、または正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ））を治療する必要のある対象において、それらを治療するために有用である、治療用、組換え型、および複製欠損アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、本明細書に提供される。ｒＡＡＶは、望ましくは、複製欠損であり、逆位末端反復（ＩＴＲ）と、調節配列の制御下の機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）をコードする核酸配列とを含み、その調節配列が標的細胞内でｈＡＲＳＡの発現を指示する、ベクターゲノムを有する。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、機能的ｈＡＲＳＡをコードする、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ１５２１の配列、またはそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、第ＩＩＩ部に記載されるように、逆位末端反復（ＩＴＲ）および発現カセットを含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドを含む。
ＡＡＶカプシドは、標的細胞に基づいて選択され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、神経系（例えば、ＣＮＳまたはＰＮＳ）におけるベクターゲノムの送達に好適である。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ニューロン、神経系細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、ＣＮＳのニューロン、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、ＰＮＳのマクロファージ、または内臓器官（例えば、腎臓細胞、肝臓細胞、および胆嚢細胞）の細胞におけるベクターゲノムの送達に好適である。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、本明細書に記載される別の標的細胞におけるベクターゲノムの送達に好適である。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ｃｙ０２カプシド、ｒｈ４３カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ｒｈ０１カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ｒｈ８カプシド、ｒｈ１０カプシド、ｂｂ０１カプシド、ｈｕ３７カプシド、ｒｈ０２カプシド、ｒｈ２０カプシド、ｒｈ
３９カプシド、ｒｈ６４カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ１カプシド、ｈｕ４４カプシド、ｈｕ４８カプシド、ｃｙ０５カプシド ｈｕ１１カプシド、ｈｕ３２カプシド、ｐｉ２カプシド、またはそれらの変形から選択される。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶｈｕ６８カプシド、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂカプシド、ｈｕ３１カプシド、ｈｕ３２カプシド、またはそれらの変形などの系統群Ｆのカプシドである。例えば、２０１５年４月１４日に公開されたＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２０１８／１６０５８２、およびＵＳ２０１５／００７９０３８を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、系統群Ｆではないカプシド、例えば、系統群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥのカプシドである。特定の実施形態では、系統群Ｆではないカプシドは、ＡＡＶ１またはその変形である。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、神経系細胞以外の標的細胞を形質導入する。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、系統群Ａのカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６）、系統群Ｂのカプシド（例えば、ＡＡＶ２）、系統群Ｃのカプシド（例えば、ｈｕ５３）、系統群Ｄのカプシド（例えば、ＡＡＶ７）、または系統群Ｅのカプシド（例えば、ｒｈ１０）である。それでも、他のＡＡＶカプシドが選択されてもよい。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ベクターゲノムがパッケージングされるＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号７の予測アミノ酸配列をコードする配列から産生される。
より詳細については、第Ｖ部を参照されたい。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶｈｕ６８ゲノム配列を含有せず、ＡＡＶｈｕ６８カプシドに対して完全に外因性である。
機能的ｈＡＲＳＡは、第Ｉ部に記載されている。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡは、シグナルペプチドと、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ５０７の配列とを有する。特定の実施形態では、天然のｈＡＲＳＡシグナルペプチド、例えば、配列番号２のａａ１～ａａ１８が使用される。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４のａａ１～ａａ２０のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ１５２１と約９５％～１００％同一である。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１または配列番号３である。さらなる実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ５０７の配列をコードする。なおさらなる実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号２または配列番号４の配列をコードする。ｈＡＲＳＡコード配列についてのより詳細は、第Ｉ部を参照されたい。
特定の実施形態では、調節配列は、神経系細胞におけるｈＡＲＳＡの発現を指示する。特定の実施形態では、調節配列は、ユビキタスプロモーター、例えば、ＣＢ７プロモーターを含む。さらなる実施形態では、調節エレメントは、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、イントロン、エンハンサー、およびＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、調節配列は、ニワトリβ－アクチン（ＢＡ）プロモーターおよびヒトサイトメガロウイルス最初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）に由来する調節エレメント（例えば、配列番号５のｎｔ１９８～ｎｔ８６２であるＣＢ７プロモーター）、ニワトリＢＡスプライスドナーおよびウサギβ－グロビン（ｒＢＧ）スプライスアクセプターエレメントからなるキメライントロン（例えば、配列番号５のｎｔ９５６～ｎｔ１９２８であるＣＩ）、ならびにｒＢＧ遺伝子に由来するポリアデニル化（ポリＡ）シグナル（例えば、配列番号５のｎｔ３５３９～ｎｔ３６６５であるｒＢＧ）のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号５のヌクレオチド（ｎｔ）１～ｎｔ３８８
３の配列を有する。より詳細については、第ＩＩＩ部を参照されたい。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶを含む組成物は、ＡＲＳＡ変異と関連する疾患もしくは正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、ＭＬＤ）の症状を改善するため、かつ／またはＡＲＳＡ変異と関連する疾患もしくは正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、ＭＬＤ）の進行を遅延させるために、それらを必要とする対象に投与可能である。より詳細について、第ＩＩ部を参照されたい。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注入を介することを含む、大槽内注入（ＩＣＭ）を介した患者への投与に好適である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、７歳以下の対象への投与に好適である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、異染性白質ジストロフィーもしくはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連する疾患の症状を改善するため、かつ／または異染性白質ジストロフィーもしくはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連する疾患の進行を遅延させるために、それらを必要とする対象への投与に好適である。より詳細については、第ＩＩ部および第ＶＩＩＩ部を参照されたい。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、単回用量で対象に投与される。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、一本鎖ＡＡＶベクターゲノムである。特定の実施形態では、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターゲノムを含有するｒＡＡＶベクターが本発明に利用され得る。
必要な調節制御エレメントは、ｒＡＡＶを取り込む細胞中でその転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で遺伝子（例えば、ｈＡＲＳＡコード配列）と作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡ、自己切断リンカー（例えば、フーリン、フーリン－Ｆ２Ａ、ＩＲＥＳ）のうちの１つ以上を含む。以下の例は、ｈＡＲＳＡの発現のためにＣＢ７プロモーターを利用する。しかしながら、特定の実施形態では、他のプロモーター、または追加のプロモーターが選択され得る。特定の実施形態では、発現制御配列（調節配列）の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する追加的または代替的なプロモーター配列が含まれ得る。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、または生理学的刺激に応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに利用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリβ－アクチンプロモーターから選択され得る。プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えば、ＷＰＲＥ、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強
する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、調節配列は、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ最初期エンハンサー（配列番号１９）を含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。あるいは、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離され得る。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリβ－アクチンイントロン（配列番号１７）をさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン（ＣＩ）であり、ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプターエレメントからなるハイブリッドイントロンである。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ ２０１１／１２６８０８に記載される。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい）。特定の実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、存在しない。
特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列に加えて、別の非ＡＡＶコード配列、例えば、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物を含んでもよい。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡが含まれ得る。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通してそれらの活性を示す。これらの内因性発現ｍｉＲＮＡはヘアピン前駆体を形成し、その後、ｍｉＲＮＡ二本鎖に、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子に処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて、例えば、３′ＵＴＲ領域内の標的ｍＲＮＡの標的部位を特定する、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを誘導する。
ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’および３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；ａｎｄ Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列および関連する調節エレメントが５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。Ｄ配列および末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では
、全長ＡＡＶ ５’および３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、疑似型であると称され得る。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も好適であり得る。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．プロモーター．任意選択的なエンハンサー．任意選択的なイントロン．ｈＡＲＳＡまたはｈＡＲＳＡｃｏ．ポリＡと称される、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－プロモーター－任意選択的なエンハンサー－任意選択的なイントロン－ｈＡＲＳＡコード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含むベクターゲノムが構築される。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。特定の実施形態では、２つ以上のプロモーターが存在する。特定の実施形態では、エンハンサーは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、ベクターゲノムに存在する。特定の実施形態では、エンハンサーおよびイントロンが存在する。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロン（ＣＩ）であり、ヒトβ－グロビンスプライスドナーおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スプライスアクセプターエレメントからなるハイブリッドイントロンである。特定の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０ポリＡ（すなわち、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリアデニル化（ポリＡ）シグナル）である。特定の実施形態では、ポリＡは、ウサギβ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ－ＣＢ７プロモーター－ｈＡＲＳＡコード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。
本明細書で使用される場合、ベクターゲノムまたはベクターゲノムを含むｒＡＡＶは、ＡＡＶ．プロモーター（任意選択的）．Ｋｏｚａｋ（任意選択的）．イントロン（任意選択的）．ｈＡＲＳＡコード配列（例えば、ｈＡＲＳＡ、ｈＡＲＳＡｃｏ）．ｍｉＲＮＡ（任意選択的）．ポリＡ（任意選択的）．Ｓｔｕｆｆｅｒ（任意選択的）として本明細書に例示される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド．プロモーター（任意選択的）．Ｋｏｚａｋ（任意選択的）．イントロン（任意選択的）．ｈＡＲＳＡコード配列．ｍｉＲＮＡ（任意選択的）．ポリＡ（任意選択的）．Ｓｔｕｆｆｅｒ（任意選択的）として本明細書に例示される。
別の態様では、ｒＡＡＶを産生するのに有用な産生システムが提供される。このシステムでは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質をコードする核酸配列、本明細書に記載されるベクターゲノム、ならびにベクターゲノムのＡＡＶカプシドへのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびヘルパー機能を含む細胞が培養された。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号５のｎｔ１～ｎｔ３８８３の配列を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、ヒト胚性腎臓２９３細胞培養物である。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、ＡＡＶｈｕ６８とは異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２由来である。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列およびｃａｐ遺伝子は、同じ核酸分子上にあり、任意選択で、ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在する。さらなる実施形態では、スペーサーは、ａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ（配列番号２４）である。
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、ベクターゲノムは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミドに担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製およびパッケージングに好適であるように操作され得る。好適なトランスフェクション技術およびパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ／または当業者によって容易に設計することができる。例示的な産生プロセスは、図６～図７に提供される。特定の実施形態では、プラスミドは、配列番号５の配列を有する。
ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成および単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、および以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、遺伝子を含む核酸分子と同じ構築物においてシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
一実施形態では、選択される遺伝子エレメントは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージ細胞も作製することができる。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
用語「ＡＡＶ中間体」または「ＡＡＶベクター中間体」は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。かかるカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を含んでいなくてもよく、または遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージングされたゲノム配列のみを含んでもよい。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するために非機能的である。
本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる発現カセット、ならびに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、およびｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
一実施形態では、組換えＡＡＶｈｕ６８を産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中にパッケージングするのに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノム、および宿主細胞で遺伝子の発現を指示する調節配列と作動可能に連結された遺伝子をコードする非ＡＡＶ核酸配列、ならびに組換えＡＡＶｈｕ６８カプシドへのベクターゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、
哺乳動物細胞（例えば、とりわけヒト胚性腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞）で構成される。特定の実施形態では、バキュロウイルスは、組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド中にベクターゲノムをパッケージングするのに必要なヘルパー機能を提供する。
任意選択的に、ｒｅｐ機能は、ＡＡＶｈｕ６８以外のＡＡＶによって提供される。特定の実施形態では、ｒｅｐ機能の少なくとも一部は、ＡＡＶｈｕ６８由来である。別の実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶｈｕ６８ｒｅｐ以外の異種ｒｅｐタンパク質であり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質、またはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、およびｒｅｐ４０／５２、またはそれらの断片、あるいは別の供給源である。これらのＡＡＶｈｕ６８または変異体ＡＡＶカプシド配列のうちのいずれかは、宿主細胞でそれらの発現を導く外因性調節制御配列の制御下にあり得る。
一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物（例えば、ＨＥＫ２９３またはＳｆ９）または懸濁液で製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該技術分野において周知の方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの産生、ベクターの産生、およびベクターの精製を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、産生されたプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノムおよび目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランス－プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ならびにベクターを含む細胞および培養培地の回収などの方法の工程を含み得る。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。さらに別のシステムでは、遺伝子治療ベクターは、バキュロウイルスベースベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらおよび他のＡＡＶ生産システムの製造および使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、および７，４３９，０６５。
粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過による緩衝液交換、ならびに／またはバルクベクターを調製するための製剤化および濾過などの、方法の工程に供され得る。
２工程の高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィ精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィを使用して、ベクター製剤を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願されたＷＯ２０１７／１６０３６０、国際特許出
願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号、およびその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
ＡＡＶ９」という名称の同第６２／２２６，３５７号により詳細に記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
空のおよび完全粒子含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配－精製された調製物、ここで（ＧＣ）＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた直線等式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して、試験物質ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、負荷した２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算して、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空のｐｔ／ｍＬを与える。空のｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで除算して、次いで、１００をかけることにより、空の粒子のパーセンテージを得る。
一般に、空のカプシドおよびパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、本方法は、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含む勾配ゲル）からなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供し、次いで、試料材料が分離するまでゲルを泳動し、ナイロンまたはニトロセルロースの膜（好ましくは、ナイロン）にゲルをブロットすることを含む。抗ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質に結合する一次抗体、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法が使用され、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って使用して、銀染色を実施してもよく、または他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを使用して増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化す
ることにより、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用され得る。
一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから市販であるなど）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅＩ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。好適には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的に、プロテアーゼＫ治療は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理工程は、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
追加的に、または代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
簡潔に言うと、パッケージされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８粒子をゲノム欠損ＡＡＶｈｕ６８中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８カプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィに供することを含み、ＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８中間体は、約１０．２のｐＨで平衡化された強力なアニオン交換樹脂に結合され、約２６０ナノメートル（ｎｍ）および約２８０ｎｍで紫外吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｒＡＡＶｈｕ６８にはあまり最適ではないが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶｈｕ６８完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィ工程のために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２／ｈｕ６８血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。
ｒＡＡＶ．ｈＡＲＳＡは、好適な生理学的に適合性の組成物（例えば、緩衝生理食塩水）中に懸濁される。この組成物は、保管のために凍結され、後に解凍され、任意選択的に、好適な希釈剤で希釈され得る。あるいは、ベクターは、凍結および解凍の工程を進めることなく患者への送達に好適な組成物として調製され得る。
本明細書で使用される場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的化されたエピトープ（例えば、ＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているように測定され得、それは参照により本明細書に組み込まれる。
略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染の際、第２の鎖の細胞介在性の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、即時の複製および転写が可能な１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、および同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工のウイルス粒子を指し、そこでは目的の遺伝子を含む発現カセットは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージングされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列はまた、複製欠損であり、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
多くの場合、ｒＡＡＶ粒子は、ＤＮａｓｅ耐性として参照される。しかし、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼが、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製工程において使用され得る。かかるヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを分解するために選択され得る。かかる工程は、単一のヌクレアーゼ、または異なる標的に指向性のヌクレアーゼの混合物を含み得、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。
「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周りで完全に構築されていることを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するように設計されたヌクレアーゼインキュベーション工程中の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。
ＶＩ．その他のベクター
一態様では、ＡＲＳＡ変異と関連する疾患、または正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、ＭＬＤ）の治療を必要とする対象において、それらを治療するのに有用なベクターが、本明細書に提供される。ベクターは、調節配列の制御下の機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）をコードする核酸配列を有し、その調節配列は標的細胞内でｈＡＲＳＡの発現を指示する。特定の
実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１と約９５％～１００％同一である。追加的または代替的に、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１である。特定の実施形態では、ベクターまたはベクターを含む組成物は、ＡＲＳＡ変異と関連する疾患もしくは正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、ＭＬＤ）の症状を改善するため、かつ／またはＡＲＳＡ変異と関連する疾患もしくは正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、ＭＬＤ）の進行を遅延させるために、それらを必要とする対象に投与可能である。
特定の実施形態では、ベクターは発現カセットを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｈＡＲＳＡの発現を指示する調節配列の制御下の機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、機能的ｈＡＲＳＡタンパク質は、シグナルペプチドと、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ５０７のアミノ酸配列とを含む。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２のａａ１～ａａ１８のアミノ酸配列、または配列番号４のａａ１～ａａ２０のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、機能的ｈＡＲＳＡをコードする、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ１５２１の配列、またはそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、ｈＡＲＳＡコード配列は、配列番号１または配列番号３である。より詳細については、第Ｉ部、および第ＩＩＩ部を参照されたい。
特定の実施形態では、ベクターは、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、もしくは組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクター、または裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、もしくはキトサンベースの製剤から選択される非ウイルスベクターである。選択されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。
特定の実施形態では、ベクターは、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注入を介することを含む、大槽内注入（ＩＣＭ）を介した患者への投与に好適である。特定の実施形態では、ベクターは、７歳以下の対象への投与に好適である。特定の実施形態では、ベクターは、異染性白質ジストロフィーもしくはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連する疾患の症状を改善するため、かつ／または異染性白質ジストロフィーもしくはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連する疾患の進行を遅延させるために、それらを必要とする対象への投与に好適である。特定の実施形態では、ベクターは、単回用量で投与される。より詳細については、第ＩＩ部および第ＶＩＩＩ部を参照されたい。
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工のウイルス粒子を指し、そこでは目的の遺伝子（例えば、ｈＡＲＳＡコード配列）を含む発現カセットは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージングされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列はまた、複製欠損であり、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製
に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス」であるように操作することができる）、これらの遺伝子は、産生の際に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。かかる複製欠損ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス（組み込みまたは非組み込み）、または別の好適なウイルス源であり得る。
ＶＩＩ．組成物
さらなる態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶまたはベクターおよび水性懸濁媒体を含む組成物が本明細書に提供される。特定の実施形態では、製剤緩衝液および記載されるｒＡＡＶまたはベクターを含む水性組成物が提供される。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、約０．０００５％～約０．００１％の界面活性剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、ｐＨが７．２～７．８である。特定の実施形態では、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ製剤は、本明細書に記載される非複製組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターおよび製剤緩衝液からなる。
特定の実施形態では、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと、製剤緩衝液とを含む、水性医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、医薬組成物の０．０００５％～約０．００１％で存在する。特定の実施形態では、組成物は、ｐＨが７．５～７．８の範囲である。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、静脈内送達、髄腔内投与、または側脳室内投与に好適である。
特定の実施形態では、記載されるベクターと、製剤緩衝液とを含む医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、製剤緩衝液は、静脈内送達、髄腔内投与、または側脳室内投与に好適である。
特定の実施形態では、組成物は、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注入を介することを含む、大槽内注入（ＩＣＭ）を介した患者への投与に好適である。特定の実施形態では、組成物は、７歳以下の対象への投与に好適である。特定の実施形態では、組成物は、異染性白質ジストロフィーもしくはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連する疾患の症状を改善するため、かつ／または異染性白質ジストロフィーもしくはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連する疾患の進行を遅延させるために、それらを必要とする対象への投与に好適である。特定の実施形態では、組成物は、単回用量で投与される。特定の実施形態では、組成物は、ｍＬ当たり少なくとも２．５０×１０１３ＧＣｒＡＡＶを有する。
本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶストック（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８ストックまたは変異体ｒＡＡＶｈｕ６８ストック）および任意選択的な担体、賦形剤および／または防腐剤を含む組成物を提供する。ｒＡＡＶストックは、同じである複数のｒＡＡＶベクターを指し、例えば、濃度および用量単位の考察において以下に記載される量である。
本明細書で使用される場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使
用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクター送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。
一実施形態では、組成物は、対象への送達に好適な最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨおよび塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。
好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。一実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｗ／ｗ％、重量比に基づく）の量で存在し得る。別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｖ／ｖ％、体積比に基づく）の量で存在し得る。さらに別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し、ｎ％は、懸濁液１００ｍＬ当たりのｎグラムを示す。さらに別の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％（ｖ／ｗ％、体積に対する重量比に基づく）の量で存在し得る。
本明細書で使用される場合、特定の実施形態では、濃度を指す場合、「％」は、重量比、例えば、溶媒の重量に対する物質（溶媒を介して溶液に溶解される）の重量の割合、または溶液の重量に対する物質（溶媒を介して溶液に溶解される）の重量の割合である。特定の実施形態では、濃度を指す場合、「％」は、体積比、例えば、溶媒の体積に対する物質（溶媒を介して溶液に溶解される）の体積の割合、または溶液の体積に対する物質（溶媒を介して溶液に溶解される）の体積の割合である。特定の実施形態では、濃度を指す場合、「％」は、１００ｍＬの溶媒または溶液当たりの物質（溶媒を介して溶液に溶解される）のグラムを示す。特定の実施形態では、濃度を指す場合、「％」は、体積に対する重量比、例えば、溶媒の体積に対する物質（溶媒を介して溶液に溶解される）の重量の割合、または溶液の体積に対する物質（溶媒を介して溶液に溶解される）の重量の割合である。
ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺
伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来のおよび薬学的に許容される投与経路には、限定されないが、所望の臓器（例えば、脳、ＣＳＦ、肝臓（任意選択的に、肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、実質内、側脳室内、髄腔内、ＩＣＭ、腰椎穿刺、および他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
ウイルスベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト投与量は、概して、約１×１０９～１×１０１６ベクターゲノムコピーの濃度を含有する約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの溶液の範囲である。特定の実施形態では、約１ｍＬ～約１５ｍＬ、または約２．５ｍＬ～約１０ｍＬ、または約５ｍＬ懸濁液の容量が送達される。特定の実施形態では、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ｍＬの懸濁液の容量が送達される。特定の実施形態では、合計で約８．９×１０１２～２．７×１０１４ＧＣの用量が、この容量で投与される。特定の実施形態では、約１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が、この容量で投与される。特定の実施形態では、脳質量１グラム当たり約３．０×１０９、約４．０×１０９、約５．０×１０９、約６．０×１０９、約７．０×１０９、約８．０×１０９、約９．０×１０９、約１．０×１０１０、約１．１×１０１０、約１．５×１０１０、約２．０×１０１０、約２．５×１０１０、約３．０×１０１０、約３．３×１０１０、約３．５×１０１０、約４．０×１０１０、約４．５×１０１０、約５．０×１０１０、約５．５×１０１０、約６．０×１０１０、約６．５×１０１０、約７．０×１０１０、約７．５×１０１０、約８．０×１０１０、約８．５×１０１０、約９．０×１０１０、約９．５×１０１０、約１．０×１０１１、約１．１×１０１１、約１．５×１０１１、約２．０×１０１１、約２．５×１０１１、約３．０×１０１１、約３．３×１０１１、約３．５×１０１１、約４．０×１０１１、約４．５×１０１１、約５．０×１０１１、約５．５×１０１１、約６．０×１０１１、約６．５×１０１１、約７．０×１０１１、約７．５×１０１１、約８．０×１０１１、約８．５×１０１１、約９．０×１０１１ＧＣの用量が、この容量で投与される。
Figure 2022531861000004
任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、かかる投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター（好ましくは、ミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクター）をもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されているものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用する免疫に利用され得る。
複製欠陥ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者にとって、約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣ（対象を治療するため）の範囲にある量の複製欠陥
ウイルスを含み、その範囲内のすべての整数または分数量、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣを含むことができる。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量当たり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９ｘ１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。
これらの上記用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の様々な容量の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤、またはその範囲内のすべての数を含むより高い容量で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、または緩衝液の容量は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３００μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００～１０００μＬである。
特定の実施形態では、用量は、約１×１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。
一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約少なくとも１×１０９ＧＣ～約１×１０１５、または約１×１０１１～５×１０１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量の送達に好適な容量および濃度は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人用に選択されてもよい。典型的に、新生児用に好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児用に、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択される。幼児のためには、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択されてもよい。子供のためには、最大約３０ｍＬの容量が選択されてもよい。プレティーンおよびティーンには、最大約５０ｍＬの容量が選択されてもよい。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の好適な容量および投薬量が決定されてもよい。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。
上述の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、生理食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性のある塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましく、静脈内送達のためには、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。
別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８（商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８としても知られている）などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ－オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。
一実施例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達のためには、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）である、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／－ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達のために、市販の希釈剤は、懸濁化剤として使用され得るか、または別の懸濁化剤および他の任意選択的な賦形剤と組み合わせて使用され得る。
例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ溶液各１０ｍＬには以下が含まれる：塩化ナトリウム、ＵＳＰ－７３ｍｇ；重炭酸ナトリウム、ＵＳＰ－１９ｍｇ；デキストロース、ＵＳＰ８ｍｇ；硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ３ｍｇ；塩化カリウム、ＵＳＰ－３ｍｇ；塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ－２ｍｇ；リン酸ナトリウム、二塩基性・７Ｈ２Ｏ、ＵＳＰ－２ｍｇ；注射用水、ＵＳＰ ｑｓ １０ｍＬ。
電解質の濃度：ナトリウム１４９ｍＥｑ／リットル；重炭酸塩２２．６ｍＥｑ／リットル；カリウム４．０ｍＥｑ／リットル；塩化物１３２ｍＥｑ／リットル；カルシウム２．７ｍＥｑ／リットル；硫酸塩２．４ｍＥｑ／リットル；マグネシウム２．４ｍＥｑ／リットル；リン酸塩１．５ｍＥｑ／リットル。
成分の式および分子量は、
Figure 2022531861000005
Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ溶液のｐＨは６～７．５であり、モル浸透圧濃度は、１リットル当たり２８８ｍＯｓｍｏｌである（計算値）。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡを含有する組成物は、ｐＨが、６．８～８、または７．２～７．８、または７．５～８の範囲で送達される。髄腔内送達の場合、ｐＨが、７．５超、例えば、７．５～８、または７．８が望ましい可能性がある。
特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む。水溶液は、以前はＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていたＢＡＳＦから市販されているポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８をさらに含んでもよい。水溶液は、７．２のｐＨを有し得る。
別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、および０．００１％のポロキサマー（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標））１８８、ｐＨ７．２を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌ．を参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液は、ハーバード緩衝液でより良好なｐＨ安定性が観察されるため、好ましい。以下の表は、ハーバード緩衝液とエリオットＢ緩衝液の比較を提供する。
Figure 2022531861000006
特定の実施形態では、製剤緩衝液は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む人工ＣＳＦである。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡを含み得る。
任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
本発明による組成物は、上記に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載される組成物は、有効量の薬学的に好適な担体に懸濁された、および／または注入、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別のデバイスもしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された１つ以上のＡＡＶを含む。一実施例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化される。
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注入による、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内へであり得る。
本明細書で使用される場合、「大槽内送達」または「大槽内投与」という用語は、小脳延髄大槽の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、もしくは大槽内への直接注入による、または永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。
特定の実施形態では、最終製剤緩衝液は、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％ｗ／ｗ～約０．００１％ｗ／ｗである。特定の実施形態では、界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８である。特定の実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８は、懸濁液の約０．０００１％の量で存在する。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内送達の場合、ｐＨが７．５～７．８である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の治療は、感覚神経毒性および無症状性感覚ニューロン病変に関して良好な耐容される、動物および／またはヒト患者におけるＤＲＧ感覚ニューロンの最小～軽度の無症状変性を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、治療される対象の機能的転帰および臨床転帰の改善に有用である。かかる転帰は、組成物の投与後、約３０日、約６０日、約９０日、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２．５年、約３年、約３．５年、約４年、約４．５年で測定されてもよく、次
いで毎年、約５年まで測定されてもよい。測定頻度は、約１ヶ月毎、約２ヶ月毎、約３ヶ月毎、約４ヶ月毎、約５ヶ月毎、約６ヶ月毎、約７ヶ月毎、約８ヶ月毎、約９ヶ月毎、約１０ヶ月毎、約１１ヶ月毎、または約１２ヶ月毎であり得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、未治療の対照と比較して、治療された対象において測定される薬物動態および臨床有効性を示す。
特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能的転帰、臨床転帰、疾患改善、または疾患進行は、以下のうちの１つ以上によって評価され得る：ＡＲＳＡ（例えば、血清中またはＣＳＦ中）の濃度および／またはレベルおよび／または生物活性、尿スルファチド、ＣＮＳの髄鞘形成（脱髄負荷およびパターン）、ＭＲＩによって測定される白質萎縮、ニューロン代謝産物Ｎ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）、ミオイノシトール（ｍＩ）、コリン（Ｃｈｏ）および／または乳酸塩（Ｌａｃ）レベル（例えば、プロトン磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）によって測定される）、ＣＳＦスルファチドおよびリソ－スルファチドレベル、視覚誘発電位（ＶＥＰ）、脳幹聴覚誘発反応（ＢＡＥＲ）、胆嚢壁肥厚（例えば、超音波評価による）、運動機能障害（例えば、異染性白質ジストロフィーのための粗大運動能力分類（ＧＭＦＣ－ＭＬＤ）または粗大運動能力尺度（ＧＭＦＭ）によって測定される）、達成時の年齢、喪失時の年齢、および運動マイルストーンを維持または獲得する子供の割合によって評価される運動マイルストーン達成（世界保健機関［ＷＨＯ］基準によって定義される）、認知機能障害（例えば、Ｂａｙｌｅｙ乳児発達検査［ＢＳＩＤ－ＩＩＩ］、児童向けＷｅｃｈｓｌｅｒ式知能検査、第５版［ＷＩＳＣ－Ｖ］によって測定された合計知能指数［ＩＱ］およびサブドメインＩＱ）、寿命（患者と比較して）、神経学的臨床検査（ＮＣＥ）、尺骨、深腓骨、正中、腓腹神経の神経伝導速度（ＮＣＶ）、発作日記によって捕捉される発作の発症年齢および頻度、行動機能障害（例えば、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度、第３版（Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩ）によって測定される）、Ｌａｎｓｋｙパフォーマンス指数、小児の生活の質調査（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）（例えば、ＰｅｄｓＱＬおよびＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ）、ならびに介護者／親の生活の質。
特定の実施形態では、薬物動態有効性、臨床有効性、機能的転帰、臨床転帰、疾患改善、または疾患進行は、異常な特性（例えば、バイオマーカー活性、電気生理学的活性、および／またはイメージングパラメータ）および臨床観察（例えば、粗大および微細運動機能、認知および言語発達、神経学的検査所見、行動およびマイルストーン発達、ならびに介護者／親が報告した転帰および生活の質の評価の減少）を評価され得る。他の疾患改善または疾患進行を評価してもよく、第ＩＩ部および第ＶＩＩＩ部を参照されたい。その相対的な節は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
代替的に、または追加的に、薬物動態有効性、臨床有効性、機能的転帰、または臨床転帰は、バイオマーカー、例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏの薬物動態および生物学的活性を含み得る。
ＩＩＸ．方法
別の態様では、ＡＲＳＡ変異と関連する疾患もしくは正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、ＭＬＤ）を有する対象を治療するか、またはＡＲＳＡ変異と関連する疾患もしくは正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、ＭＬＤ）の症状を改善するか、またはＡＲＳＡ変異と関連する疾患もしくは正常なレベルの機能的アリールスルファターゼＡの欠損によって引き起こされる疾患（例えば、ＭＬＤ）の進行を遅延させる方法が提供される。この方法は、有効量の本明細書に記載されるｒＡＡＶまたはベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、ベクターまたはｒＡ
ＡＶは、大槽内注入（ＩＣＭ）、例えば、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注入を介して患者に投与可能である。特定の実施形態では、７歳以下である異染性白質ジストロフィーを有する患者へ投与可能であるベクターまたは組成物が提供される。特定の実施形態では、この方法は、ｒＡＡＶまたはベクターを単回用量でヒト患者に送達することを含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、３．００×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）毎グラム（ＧＣ／ｇ）脳質量～１．００×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の用量で投与される。特定の実施形態では、投与後、対象の疾患症状が改善され、かつ／または疾患の進行が遅延される。
神経系指向性ＡＡＶ遺伝子療法は、主にインビボのニューロンを標的とするが、交差補正の潜在性は、ほとんどの遺伝子療法ベクターによってインビボで形質導入することができないＡＲＳＡ欠損髄鞘形成細胞を補正する可能性を開く（Ｃｅａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｌａｗｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
特定の実施形態では、本明細書の「有効量」は、ＭＬＤ症状の改善および／またはＭＬＤ進行の遅延を達成する量である。
ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来のおよび薬学的に許容される投与経路には、限定されないが、所望の臓器（例えば、脳、ＣＳＦ、肝臓（任意選択的に、肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、実質内、側脳室内、髄腔内、ＩＣＭ、腰椎穿刺、および他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の投与量は、主に、治療されている状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト投与量は、概して、約１×１０９～１×１０１６ベクターゲノムコピーの濃度を含有する約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの溶液の範囲である。特定の実施形態では、約１ｍＬ～約１５ｍＬ、または約２．５ｍＬ～約１０ｍＬ、または約５ｍＬの懸濁液の容量が送達される。特定の実施形態では、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ｍＬの懸濁液の容量が送達される。特定の実施形態では、合計で約８．９×１０１２～２．７×１０１４ＧＣの用量が、この容量で投与される。特定の実施形態では、約１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が、この容量で投与される。特定の実施形態では、脳質量１グラム当たり約３．０×１０９、約４．０×１０９、約５．０×１０９、約６．０×１０９、約７．０×１０９、約８．０×１０９、約９．０×１０９、約１．０×１０１０、約１．１×１０１０、約１．５×１０１０、約２．０×１０１０、約２．５×１０１０、約３．０×１０１０、約３．３×１０１０、約３．５×１０１０、約４．０×１０１０、約４．５×１０１０、約５．０×１０１０、約５．５×１０１０、約６．０×１０１０、約６．５×１０１０、約７．０×１０１０、約７．５×１０１０、約８．０×１０１０、約８．５×１０１０、約９．０×１０１０、約９．５×１０１０、約１．０×１０１１、約１．１×１０１１、約１．５×１０１１、約２．０×１０１１、約２．５×１０１１、約３．０×１０１１、約３．３×１０１１、約３．５×１０１１、約４．０×１０１１、約４．５×１０１１、約５．０×１０１１、約５．５×１０１１、約６．０×１０１１、約６．５×１０１１、約７．０×１０１１、約７．５×１０１１、約８．０×１０１１、約８．５×１０１１、約９．０×１０１１ＧＣの用量が、この容量で投与される。
任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、かかる投薬量を調整してもよ
く、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター（好ましくは、ミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクター）をもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されているものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫に利用され得る。
複製欠陥ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者にとって、約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣ（対象を治療するため）の範囲にある量の複製欠陥ウイルスを含み、その範囲内のすべての整数または分数量、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣを含むことができる。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む用量当たり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。
一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、１×１０１０～約１×１０１５ＧＣ毎ｋｇ体重の範囲であり得る。
一実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む約１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣ毎ｋｇ体重である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣ毎ｋｇ体重である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣ毎ｋｇ体重である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣ毎ｋｇ体重である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣ毎ｋｇ体重である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数ま
たは分数量を含む、約１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣ毎ｋｇ体重である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣ毎ｋｇ体重である。
一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、１×１０１０～約１×１０１５ＧＣ毎グラム（ｇ）脳質量の範囲であり得る。一実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣ毎グラム（ｇ）脳質量である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣ毎グラム（ｇ）脳質量である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣ毎グラム（ｇ）脳質量である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣ毎グラム（ｇ）脳質量である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣ毎グラム（ｇ）脳質量である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣ毎グラム（ｇ）脳質量である。別の実施形態では、ベクターの有効量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、約１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣ毎グラム（ｇ）脳質量である。
これらの上記用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の様々な容量の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤、またはその範囲内のすべての数を含むより高い容量で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、または緩衝液の容量は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３００μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００～１０００μＬである。
特定の実施形態では、用量は、約１×１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約２．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。
一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約少なくとも１×１０９ＧＣ～約１×１０１５、または約１×１０１１～５×１０１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量の送達に好適な容量および濃度は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人用に選択されてもよい。典型的に、新生児用に好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児用に、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択される。幼児のためには、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択されてもよい。子供のためには、最大約３０ｍＬの容量が選択されてもよい。プレティーンおよびティーンには、最大約５０ｍＬの容量が選択されてもよい。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の好適な容量および投薬量が決定されてもよい。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。
上述の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、生理食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性のある塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲で調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましく、静脈内送達のためには、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかし、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の治療は、感覚神経毒性および無症状性感覚ニューロン病変に関して良好な耐容される、動物および／またはヒト患者におけるＤＲＧ感覚ニューロンの最小～軽度の無症状変性を有する。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ、ベクター、組成物、および方法のための提案された集団は、症状発症が７歳未満であり、その予測可能で急速な衰弱が、合理的な経過観察期間内に、頑強な研究設計および機能的転帰の評価を支持する、早発型後期乳児および早発型若年性ＭＬＤを有する対象からなる。
ｒＡＡＶ、ベクター、組成物または方法による治療は、内在する病理を安定させることを含む、疾患症状改善および疾患進行遅延のためのものであり、それによって、疾患発症を予防し、正常もしくはほぼ正常な運動および認知発達を可能にするか、または技能（獲得した発達および運動マイルストーンなど）の喪失および疾患進行を実質的に予防するか、もしくは遅延させる。発症前の患者は、この治療に適格である。
ＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏのＡＡＶｈｕ６８カプシドおよびＩＣＭ ＲＯＡは、皮質ニューロン、ミエリン産生オリゴデンドロサイトの小さなサブセット、ＰＮＳに突出する軸索を有する運動ニューロン、ならびに脊髄および末梢神経の両方に突出する軸索を有するＤＲＧ感覚ニューロンを効果的に形質導入する。ＣＮＳおよびＰＮＳの両方における広範な
形質導入プロファイルを考慮すると、ＡＲＳＡ酵素交差補正は、ＨＳＣ－ＧＴまたはＨＳＣＴによって対処されない、多くのＭＬＤ患者で観察されるＣＮＳの症状および末梢神経障害の両方を治療することができる。
ＭＬＤの性質を考慮すると、ＣＮＳ損傷は、ほとんど不可逆的であると考えられ、早発型集団において急速な疾患行を伴い、本明細書に記載のｒＡＡＶ、ベクター、組成物または方法は、疾患のない、または軽度から中等度の疾患を有する患者において最大の利益になる可能性を与える。ＩＣＭ送達されるＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏなどのＡＡＶ遺伝子療法は、ＨＳＣベースの療法のものと比較して急速な動態開始を示し、投与から３週間後までにＣＳＦにおいてＡＲＳＡの発現がピークに達する（実施例を参照されたい）。結果として、ＡＡＶｈＡＲＳＡｃｏは、既に疾患のいくつかの臨床的兆候を有する患者でさえも、疾患の進行を停止させることができる。したがって、歩行可能であり、自立して少なくとも１０歩、歩くことができる患者における軽度の歩行異常、運動マイルストーン獲得の明らかな遅延（ＷＨＯ基準に基づく所与のマイルストーンを達成する年齢について９５パーセンタイル超として定義される（Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４））、および神経学的検査における軽度の兆候を伴うものを含む、軽度から中等度の兆候および症状を有する早発型ＭＬＤを有する患者は、本明細書に記載のｒＡＡＶ、ベクター、組成物または方法による治療（「治療」と称される）に適格である。
軽度から中等度の症状を有する患者に一般的に見出されない疾患進行の指標としては、胃瘻造設を必要とする摂取困難、発作の発症、低認知機能、神経学的検査で見出される重度の異常（非常に活発な反射、手足の重度の低血圧または痙攣、重度の嚥下障害、総合運動障害、または運動失調など）、および視覚または聴力喪失などが含まれ、これらは試験から除外される。特定の実施形態では、この疾患進行の遅延は、低レベルの臨床機能での疾患の安定化として示される。
特定の実施形態では、この方法の薬力学的および有効性転帰は、鎮静および／またはＬＰを必要とするものを除いて、１、３、および６ヶ月で測定され、次いで、２年間の短期経過観察期間中は、６ヶ月毎に測定される。長期経過観察段階中、評価頻度は１２ヶ月毎に１回に減らされる。未治療の早発型ＭＬＤ患者における急速な疾患進行を考慮して、初期の時点および最初の２年間の６ヶ月間隔も選択した。
特定の実施形態では、疾患症状の改善または疾患進行の遅延は、粗大運動機能の評価により示される。ＧＭＦＣ－ＭＬＤは、ＭＬＤ患者における粗大運動機能および経時的な衰弱の標準化された評価のための検証された信頼性の高い単純なツールである（Ｋｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１ｂ）。これは、脳性麻痺を有する子供の運動機能を評価し、自ら開始する運動の相違に基づいて子供の運動機能を５つのレベルのうちの１つに分類する同様のツールをモデル化した（Ｐａｌｉｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。Ｋｅｈｒｅｒらは、分類システムを、ＭＬＤを有する患者に関連し、ＭＬＤを有する子供の日常生活においてレベル間の区別が有意義であるとみなされる分類システムを提供するように適合させた（下の表）（Ｋｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１ａ、Ｋｅｈｒｅｒ ｅｔ
ａｌ．，２０１１ｂ）。ＧＭＦＣ－ＭＬＤは、ＭＬＤの自然歴を説明し（Ｋｅｈｒｅｒ
ｅｔ ａｌ．，２０１１ａ）、治療的介入後の運動機能を評価する（Ｓｅｓｓａ ｅｔ
ａｌ．，２０１６）ための両方に使用されている。ＧＭＦＣ－ＭＬＤの１つの潜在的な制限は、このツールが１８ヶ月齢以降からの子供のために検証されたことである。なぜならこれは、子供が通常歩き方を習得する年齢上限を表すからである（Ｌａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５、ＷＨＯ，２００６）。しかしながら、このツールは、この年齢より前に歩行のマイルストーンを達成した子供にも適用される。
Figure 2022531861000007
ＧＭＦＭは、疾患症状の改善または疾患進行の遅延を評価するための尺度として含まれる。これは、脳性麻痺を有する子供における経時的および介入後の粗大運動機能の変化を測定するように設計され、検証された標準観察手段である（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ Ｊｏｓｅｎｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ａｌｏｔａｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＧＭＦＭは、５つの機能領域：横たわり、かつ転がる、座る、這い、かつ膝立つ、立ち、かつ歩く、走り、かつ跳ぶ、にわたって分類された運動機能を評価する８８項目のツールである。典型的に、５歳までにスケールで最も困難な技能（歩く、走る、跳ぶ）を達成する、健常な子供のための参照曲線も開発されている（Ｐａｌｉｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。このツールは、ＭＬＤを有する子供のために検証されていないが、これは、発症前の段階で治療された対象において（ほぼ）正常な粗大運動発達を示すことで、ＨＳＣ－ＧＴを受けた早発型ＭＬＤ患者にとって有用であることが証明されている（Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｆｕｍａｇａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。８８項目の手段の利点の１つは、これが、運動機能の様々な側面に関する大量の情報を含み、小領域を別々に要約し、報告することができることである。プラトー効果のため、このツールは、研究登録前に既に最大ＧＭＦＭスコアに達している可能性がある（すなわち、新しい技能の獲得を測定することができない）年長の早期若年性患者では情報価値がないかもしれないが、それでも経時的な粗大運動機能の維持または喪失を示すことができるであろう。
末梢神経障害は、これらの患者における微細および粗大運動機能障害を悪化させる可能性がある、ＭＬＤの一般的な、痛みを伴い、徐々に衰弱する症状である（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ，２０１０、ｖａｎ Ｒａｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＨＳＣに基づく治療は、末梢神経障害を実質的に改善しないようである（Ｂｏｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５、ｖａｎ Ｒａｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏがニューロン、ＤＲＧ、および末梢神経軸索細胞を形質導入する能力により、機能障害の脳および末梢神経内でＡＲＳＡ酵素の発現が可能になる。神経学的検査は、末梢神経障害の臨床症状を評価するために実施され得、神経伝導試験は、代表的な運動および感覚神経（深腓骨神経、正中神経、尺骨神経、および腓腹神経）に対して実施され得る。ＭＬＤは主に脱髄疾患であるため、神経伝導速度は、疾患の関連する神経生理学的パラメータとみなされ（Ｂｉｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）、測定され得る。
運動マイルストーンの発達は、対象の登録時の年齢および疾患段階に依存する。登録時の対象の年齢に応じて、対象は、特定の運動技能を達成したか、または運動マイルストーンの発達の兆しがまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成した年齢（ａｇｅ－ａｔ－ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ）および喪失した年齢（ａｇｅ－ａｔ－ｌｏｓｓ）を追跡する。運動マイルストーンの達成度は、以下の表に概説されているＷＨＯ基準に基づいて６つの粗大マイルストーンに定義される。
Figure 2022531861000008
神経認知および行動的発現は、疾患症状の改善または疾患進行の遅延を示すために評価され得る。これらの発現を評価することは、行動的および認知症状が、運動機能障害と同時に発症する可能性のある疾患の重要な発現である、早期若年性ＭＬＤを有する子供において特に重要である。臨床スケールは、認知、言語、および運動機能の発達および変化に対するＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏの効果を定量化するために使用されてもよく、これは、患者の推定発達年齢に従って行われる年齢に適した評価ツールへの移行を伴って、ＢＳＩＤ－ＩＩＩおよびＷＩＳＣ－Ｖを使用して評価されてもよい。転帰は、典型的に発達している子供および未治療の子供の達成基準と比較され得る。各提案された尺度は、以前にＭＬＤ集団において使用されている（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｂｏｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
●ＢＳＩＤ－ＩＩＩ：このスケールは主に１～４２ヶ月齢の乳児および幼児の発達を評価するために使用した（Ａｌｂｅｒｓ ａｎｄ Ｇｒｉｅｖｅ，２００７）。これは、標
準化された一連の発達プレイタスクから構成される。これは、うまく完了した項目の素点を、スケールスコアおよび複合スコアに変換し、続いて、それらのスコアを、典型的に同じ年齢の発達している子供から得られた達成基準と比較することによって発達指数を導き出す。ＢＳＩＤ－ＩＩＩには、３つの主要なサブテストがある。認知スケールには、見慣れている対象物と見慣れていない対象物への注意、落ちている対象物を探すこと、および遊んでいるふりをすることなどの項目が含まれる。言語スケールは、言語の理解および表現（例えば、指示に従いおよび対象物の名前を挙げる能力）を評価する。運動スケールは、粗大および微細運動技能（例えば、掴む、座る、ブロックを積み重ねる、および階段を登る）を測定する。したがって、ＢＳＩＤ－ＩＩＩは、ＧＭＦＣ－ＭＬＤおよびＧＭＦＭを補完するための追加の運動機能情報を提供することができる。
●ＷＩＳＣ－Ｖ：このスケールは、個別に実施した知能検査または６歳～１６歳の子供である。これは、子供の一般的な知的能力を表す全検査ＩＱを生成し、５つの主要指標スコア：言語理解指標、視覚空間認識指標、流動性推理指標、ワーキングメモリ指標、および処理速度指標を提供する。これらの指標は、個別の認知領域における子供の能力を表す。
生存率は、疾患症状の改善または疾患進行の遅延の尺度として含まれる。後期乳児ＭＬＤと診断された患者の大部分は、生後５年で死亡することが予測され、５年生存率は２５％であるが（Ｍａｈｍｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、現在のレベルの支持療法では、生存期間は１０歳代まで延長することができる（Ｇｏｍｅｚ－Ｏｓｐｉｎａ，２０１７）。したがって、５年間の経過観察は、後期乳児集団における生存利益を示すのに十分であり得るが、早期若年性コホートにおける生存を評価するのに十分な長さではない場合がある。重要なことに、支持療法のレベルが向上したことで、早発型ＭＬＤを有する子供は現在、機能レベルが非常に低いにもかかわらず、１０歳を超えて生き続けることができる。
発作は、通常、早発型集団に現れる症状ではないが、それは、疾患の後期段階の特徴である（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ，２０１０、Ｍａｈｍｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。親は、発作の活動（発症、頻度、長さ、および発症のタイプ）を記録するために日記をつけるように求められることがあり、これにより、ＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏが、発作の発症を予防もしくは遅延させ得るか、または発作事象の頻度を減少させ得るかどうかを評価することが可能になる。
親および患者の生活の質とともに、適応行動の尺度は、ＭＬＤ患者で以前に利用されたツールを使用して、疾患症状の改善または疾患進行の遅延を示すために評価され得る（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｂｏｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
●Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩコミュニケーション、日常生活スキル、社会化、運動スキル、不適応行動の５つの領域にわたって、誕生から成人（０～９０歳）までの適応行動を評価する。Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩからＶｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩへの改善には、発達障害をよりよく理解するための質問が組み込まれている。
●ＰｅｄｓＱＯＬおよびＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ：重度の小児疾患の場合と同様に、疾患の家族への負担は著しい。小児の生活の質調査（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（商標））は、子供とその親の生活の質を評価するための検証されたツールである（親の代理レポートによる）。これは、健康な子供および青年期において検証され、様々な小児疾患で使用されている（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ
ａｌ．，２００９、Ａｂｓｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｃｏｎｓｏｌａｒｏ ａ
ｎｄ Ｒａｖｅｌｌｉ，２０１６）。したがって、ＰｅｄｓＱＬは、ＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏが患者およびその家族の生活の質に及ぼす影響を評価するために含まれている。これは、２歳以上の子供の親に適用することができ、したがって、５年間の経過観察期間にわたる子供の年齢として有益であり得る。小児の生活の質調査（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）（商標）乳児スケール（Ｖａｒｎｉ
ｅｔ ａｌ．，２０１１）は、１～２４ヶ月齢の健康および病気の乳児について、特に健康関連の生活の質を測定するように設計された、親によって記入される検証済みのモジュラー手段である。これはまた、５歳以上の子供による自己報告の可能性も提供する。
●Ｌａｎｓｋｙパフォーマンス指数：個人の機能状態を測定し、その個人が通常の日常活動を行う能力を表すスコアを提供するスケール。
本明細書に記載のｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏ）、ベクター、組成物、または方法の、疾患病理に対する効果は、髄鞘形成、髄鞘形成に関連する機能転帰、および潜在的な疾患バイオマーカーの変化を含む、疾患症状の改善または疾患進行の遅延を示すために測定され得る。
ＭＬＤの主要な特徴である中枢および末梢の脱髄は、ｒＡＡＶ投与後の疾患症状の改善または疾患進行の遅延を示すために検査され得る。中枢の脱髄は、白質領域のＭＲＩ測定によって追跡することができ、それらの変化は、疾患の状態および進行の指標となる（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ，２０１０、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２、ｖａｎ Ｒａｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＭＲＩによって検出された中枢の脱髄は、粗大運動機能障害の程度と正の相関がある（Ｇｒｏｅｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。末梢の脱髄は、運動神経（深腓骨神経、脛骨、および尺骨神経）および感覚神経（腓腹および正中神経）のＮＣＶ検査によって間接的に測定することができ、これはまた、末梢神経障害の読み出しも提供する。ＮＣＶ検査は、生物学的に活性なミエリンの変化（すなわち、Ｆ波および遠位潜時、振幅、または応答の有無）を示す変動をモニタリングする。
全脱髄スコアおよび脳白質萎縮の測定に加えて、ＮＡＡ、ｍＩ、ＣＨＯ、およびＬａｃを含む様々な脳神経代謝産物を、プロトンＭＲＳを使用して経時的に測定することができる。ＮＡＡレベルが、疾患のプロセスの進行に伴ってＮＡＡシグナル強度が減少すると、粗大運動機能と強く相関するという証拠がある（Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｄａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。加えて、プロトンＭＲＳ検査は、ＭＬＤ疾患進行の間のＮＡＡ／クレアチニン比の減少、およびＣｈｏ／クレアチニン比の増加、ならびにｍＩおよびＬａｃレベルを示している（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。したがって、神経代謝産物は、疾患症状の改善または疾患進行の遅延を示すバイオマーカーとして評価され得る。
末梢神経およびＣＳＦスルファチドおよびリソスルファチド蓄積は、電気生理学的パラメータの異常および腓腹神経における大きな有髄線維喪失と相関するという証拠がある（Ｄａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって、ＣＳＦ（リソ）－スルファチドレベルは、ＰＮＳにおける疾患の重症度を反映し得、末梢神経系に対する治療の影響を評価するためのマーカーを提供し得る。ＣＳＦスルファチドおよびリソ－スルファチドレベルが、疾患症状の改善または疾患進行の遅延を示すために含まれ得る。
発作と同様に、視覚喪失は、早発型ＭＬＤにおいて一般的に現れる症状ではないが、疾患の後期に現れる（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ，２０１０、ｖａｎ Ｒａｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＶＥＰの使用を通して視覚喪失を追跡することは、視覚喪失を遅延または予防するための本明細書に記載されるｒＡ
ＡＶの能力を評価する機会を提供する。ＶＥＰは、中心視力の障害または喪失の指標としての視覚刺激に対する応答を客観的に測定するために使用され得る。聴覚喪失もまた、疾患進行中によく見られ、聴覚異常の初期兆候は、ＢＡＥＲ検査によって測定され得る。
内臓組織におけるＭＬＤの後遺症の１つは、胆嚢壁におけるスルファチドの沈着を伴い、外科的介入を必要とする可能性があり、超音波で可視化することができる胆嚢壁の肥厚およびポリープをもたらす（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｗａｉｔｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。胆嚢異常は、ＭＬＤにおいてよく見られる所見であり、患者を胆嚢癌にかかりやすくし（ｖａｎ Ｒａｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、ＭＬＤのすべてのサブタイプで生じる。
特定の実施形態では、以下に列挙されるアッセイが、疾患症状の改善および／または疾患進行の遅延を示すために実施され得る。
血液学、血清化学、凝固、ＬＦＴ；尿検査；ＨｅｐＢ／ＨｅｐＣ／ＨＩＶ血清学；血清バイオマーカー（ＡＲＳＡ）；血清中および尿中のベクターＤＮＡ；血清抗ＡＡＶｈｕ６８ｎＡｂ；ＥＬＩＳｐｏｔ（カプシドおよびＡＲＳＡ）；ＣＳＦ採取および評価；ＬＰ（ＣＳＦを採取するため）；ＣＳＦ細胞学および化学；ＣＳＦ疾患バイオマーカー（ＡＲＳＡ、スルファチド、リソ－スルファチド）；ＣＳＦ抗ＡＡＶｈｕ６８ｎＡｂ；ＣＳＦ中のベクターＤＮＡ；身体検査（身長および体重を含む）；神経学的検査；バイタルサイン；ＥＣＧｄ；感覚神経伝導検査；ＧＭＦＣ－ＭＬＤ；ＧＭＦＭ；ＢＳＩＤ－ＩＩＩｅ；ＷＩＳＣ－Ｖ；Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩｅ；Ｌａｎｓｋｙパフォーマンス指数；ＰｅｄｓＱＬ；ＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ；介護者／親ＱｏＬ評価；運動マイルストーン評価；発作日記完成の訓練；発作日記のレビュー；イメージング評価；ＭＲＩ；ＭＲＳ；ＮＣＶ測定；およびＶＥＰ。
関連する略語を以下に列挙する。
ＡＡＶｈｕ６８、アデノ随伴ウイルス血清型ｈｕ６８；ＡＥ、有害事象；ＡＲＳＡ、アリールスルファターゼＡ；ＢＡＥＲ、脳幹聴覚誘発反応；ＢＳＩＤ－ＩＩＩ、乳児および幼児発達のＢａｙｌｅｙスケール、第３版；ＣＳＦ、脳脊髄液；ＤＮＡ、デオキシリボ核酸；ＥＣＧ、心電図；ＥＬＩＳｐｏｔ、酵素結合免疫スポット；ＧＭＦＣ－ＭＬＤ：異染性白質ジストロフィーにおける粗大運動機能分類；ＧＭＦＭ、粗大運動機能測定；ＨｅｐＢ、Ｂ型肝炎；ＨｅｐＣ、Ｃ型肝炎；ＨＩＶ、ヒト免疫不全ウイルス；ＩＣＭ、大槽内；ＬＦＴ、肝機能検査；ＬＰ、腰椎穿刺；ＭＲＩ、磁気共鳴イメージング；ＭＲＳ、磁気共鳴分光分析；ｎＡｂ、中和抗体；ＮＣＶ、神経伝導速度；ＰｅｄｓＱＬ／ＰｅｄＱＬ－ＩＳ、小児の生活の質調査；ＱｏＬ、生活の質；ＶＥＰ、視覚誘発電位；Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度、第３版；ＷＩＳＣ－Ｖ、児童向けＷｅｃｈｓｌｅｒ式知能検査、第５版。
ｒＡＡＶ、ベクター、組成物、および方法は、投与の数日以内にＡＲＳＡ酵素の超生理学的レベルをＣＮＳおよびＰＮＳの両方に提供し、それらの両方はＭＬＤ患者において影響を受ける。ＡＡＶｈｕ６８カプシドおよびＩＣＭ経路は、ニューロン、ＤＲＧ、および末梢神経軸索細胞の優れた形質導入の観察に基づいて選択された。髄鞘形成細胞のベクター形質導入は限定的であるが、交差補正の潜在性により、オリゴデンドロサイトによる酵素取り込みを可能にするであろう。さらに、ＡＡＶベクターおよびＡＲＳＡ酵素は、軸索に沿って輸送され得、脳内および末梢への治療酵素の発現を拡大する。
Ｘ．脳脊髄液中への医薬組成物の送達のための装置および方法
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧは、大槽内への（大槽内［ＩＣＭ］）コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイド下の後頭下注入を介して、単回用量として投与される。
単一遺伝子ＣＮＳ疾患の多くの動物モデルは、ＡＡＶ媒介性遺伝子導入を使用して成功裏に治療されており、第１世代のＡＡＶベクターを使用したいくつかの初期のヒト研究により、脳へのベクター送達の安全性が示された（Ｊａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｍａｎｄｅｌ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｒ，２００４、Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｍｉｔｔｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｂａｒｔｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。しかしながら、これらのベクターの低い効率は、動物モデルにおける有効性の臨床的利益への変換を妨げた。第２世代のＡＡＶベクターの出現により、脳への遺伝子導入の可能性が大幅に増大した。特に、ＡＡＶ９などのいくつかの系統群Ｆ分離株は、極めて効率的な脳の形質導入を示している（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらのより効率的なベクターを使用して、遺伝子療法は、様々な神経障害を治療する可能性を大幅に増強し、第２世代のベクターを利用するいくつかのプログラムが臨床に進んだ（Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｇｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
ＣＮＳ遺伝子導入の初期の研究は、第１世代のＡＡＶベクターの遺伝子導入効率の低さだけでなく、利用可能な送達方法の制限によっても困難なものであった。ほとんどの初期の非臨床および臨床研究は、脳または脊髄の実質内への直接ベクター注入を利用した（Ｖｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｗｏｒｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｃｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｅｌｌｉｎｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｔａｒｄｉｅｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。この方法は、注入部位付近での強固な形質導入をもたらすが、広範囲にわたる導入遺伝子送達を達成するために大量のベクター注入が必要であったため、ＣＮＳ全体にわたって細胞に影響を及ぼす疾患に対するこのアプローチの変換は困難であった。ＣＮＳ遺伝子導入のさらなる障害は、実質内ベクター注入が注入部位で炎症を引き起こし得、導入遺伝子産物に対する適応免疫応答を促進し得るという知見であった（Ｗｏｒｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｃｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｅｌｌｉｎｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。２つの代替的なベクター送達方法が、ＣＮＳの大きな領域をより安全かつ効果的に標的化するために開発されている。
第一は、ＡＡＶ９を含むいくつかのＡＡＶベクターが、ＩＶ送達後にＣＮＳ内で細胞を形質導入することができるという発見に基づいた（Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかしながら、ＩＶベクター送達には２つの重大な制限がある。第一に、ＣＮＳへのベクター侵入の低い効率は、導入遺伝子発現の治療レベルを達成するために極めて多くのベクター用量を必要とし、全身毒性のリスクを増加させ、多くの患者集団に対して製造することが不可能であり得るベクターの量を潜在的に必要とする（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｇｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。第二に、ＩＶベクター送達後のＣＮＳへの遺伝子導入は、ベクターカプシドへの既存のＮＡｂによって非常に制限される（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ヒトにおけるＡＡＶ ＮＡｂの保有率が高いことを考慮すると、これは、患者のかなりの集団をＩＶ ＡＡＶ治療の候補ではないままにする。ＣＮＳを標的化するためのＩＶ ＡＡＶの制限を回避するために、ＩＴベクター送達が代替的アプローチとして開発されている。ＣＳＦをベクター分散のためのビヒクルとして使用すると、ＩＴ ＲＯＡは、ＣＮＳおよびＰＮＳ全体にわたる導入遺伝子送達を、単一の最小侵襲性注入で達成する可能性を有する。動物研究は、血液脳関門を通過する必要性を排除することによって、ＩＴ送達が、ＩＶアプローチに必要とされるものより、はるかに低いベクター用量でかなり効率が良いＣＮＳ遺伝子導入をもたらすことを示した（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。抗体は、ＣＳＦにおいて非常に低いレベルで存
在するため、ＩＴベクター送達は、ＡＡＶカプシドに対する既存のＮＡｂによって影響されず、このアプローチをより広範な患者集団に適用可能にする（Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ
ａｌ．，２０１３）。ＩＴ ＡＡＶ送達は、ＣＳＦアクセスのための様々な経路を使用して行うことができる。腰椎穿刺（ＬＰ）は、ＣＳＦにアクセスするための最も一般的な方法であり、したがって、ＮＨＰにおけるＡＡＶ投与のための経路として評価された。ＬＰを介したＣＳＦへのＡＡＶ９ベクターの送達は、大槽のレベルでのより優れたベクターの注入と比較して、脳および脊髄の細胞の形質導入において少なくとも１０倍低い効率であることが見出された（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＮＨＰにおける単回ＩＣＭ注入により達成された優れた脳形質導入により、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの臨床研究のためにこのＲＯＡが選択された。一般的な手順では、ＩＣＭ注入（後頭下穿刺としても知られている）は、脳幹または近傍の血管への損傷の稀な事例のため、画像化前の時代にＬＰによって最終的に置き換えられた（Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｒｉｏｒｄａｎ，１９２９）。今日では、針の挿入中に髄質、椎骨動脈、および後下小脳動脈などの重要な構造を可視化することを可能にする、リアルタイムのＣＴガイダンス下での手順を実施することができる（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
一態様では、本明細書に提供されるベクターは、この節で提供され、かつＷＯ２０１８／１６０５８２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法および／またはデバイスを介して髄腔内投与され得る。代替的には、他のデバイスおよび方法が選択され得る。
特定の実施形態では、本方法は、脊椎針を介する患者の大槽内へのＣＴガイドの後頭下注入の工程を含む。本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、コンピュータによって軸に沿って作成される一連の平面断面画像から、身体構造の３次元画像が構築される放射線撮影を指す。
処置日に、適切な濃度のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏを調製する。適切な濃度で５．６ｍＬのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏを含有するシリンジを、処置室に送達する。治験薬投与には、以下の担当者が同席する：処置を行う介入医、麻酔科医および呼吸器技師、看護師および医師助手、ＣＴ（または手術室）技師、施設研究コーディネーター。薬物投与の前に、腰椎穿刺を実施して、所定の体積のＣＳＦを除去し、次いで、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助するために、ヨード造影剤を髄腔内（ＩＴ）に注入する。静脈内（ＩＶ）造影剤は、髄腔内造影剤の代替物として、針穿刺の前または針穿刺中に投与され得る。ＩＶまたはＩＴ造影剤を使用するかの判断は、介入医の裁量に委ねられる。対象は、麻酔され、挿管され、処置テーブルに配置される。滅菌技術を使用して、注入部位を用意し、覆布をかける。透視下で、脊髄針（２２～２５Ｇ）を大槽内に進める。針の配置を補助するために、より大きい誘導針を使用してもよい。針の配置を確認した後、エクステンションセットを脊椎針に取り付け、ＣＳＦで充填する。介入医の裁量で、造影剤を含有するシリンジを、エクステンションセットに接続してもよく、少量注入することで、大槽内に針が配置されていることを確認することができる。ＣＴガイダンス＋／－造影剤注入により針の配置を確認した後、５．６ｍＬのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏを含むシリンジを、エクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を１～２分かけてゆっくりと注入し、５．０ｍＬの容量を送達する。注射針は、対象からゆっくりと取り出される。
一実施形態では、用量は、脳質量によってスケールされ、ＣＳＦ区画のサイズの近似値を提供する。さらなる実施形態では、用量換算は、成体マウスでは０．４ｇ、幼若アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）では９０ｇ、および４～１８ヶ月齢の子供では８
００ｇの脳質量に基づく。以下の表は、マウスＭＥＤ研究、ＮＨＰ毒性試験、および同等のヒト用量の例示的な用量を提供する。
Figure 2022531861000009
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏベクターは、単回用量で対象に投与される。特定の実施形態では、複数回用量（例えば、２用量）が所望され得る。例えば、６ヶ月齢未満の乳児の場合、数日、数週間、または数ヶ月間隔での複数回用量が望ましい場合がある。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏベクターの単回用量は、約１×１０９ＧＣ～約３×１０１１ＧＣである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＨＡＲＳＡの用量は、約１×１０１０ＧＣ／脳質量～３．３３×１０１１ＧＣ／脳質量である。他の実施形態では、異なる用量が選択され得る。
組成物は、投薬量単位で製剤化されて、約１×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）～約５×１０１３ＧＣの範囲にある量のＡＡＶを含み得る（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）。一実施形態では、脊椎穿刺が行われ、約１５ｍＬ（またはそれ未満）～約４０ｍＬのＣＳＦが除去され、ベクターがＣＳＦと混合され、かつ／または適合性の担体に懸濁され、対象に送達される。一実施例では、ベクター濃度は、約３×１０１３ＧＣであるが、他の量、例えば、約１×１０９ＧＣ、約５×１０９ＧＣ、約１×１０１０ＧＣ、約５×１０１０ＧＣ、約１×１０１１ＧＣ、約５×１０１１ＧＣ、約１×１０１２ＧＣ、約５×１０１２ＧＣ、または約１．０×１０１３ＧＣである。
併用療法は、本明細書で提供されるｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏ組成物とともに送達され得る。本出願で先に記載されたような併用療法は、参照により本明細書に組み込まれる。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「構成している（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という単語、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を使用して示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して解釈および記載されるべきことも意図される。
「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性または安定であり得る。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクター
ゲノムは、２つ以上の発現カセットを含み得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と互換的に使用され得る。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのかかる発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、および本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。
タンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種」という用語は、タンパク質または核酸が、天然では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の配列またはサブ配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連しない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、１つの遺伝子由来のプロモーターを有し、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指示するように配置される。したがって、コーディング配列に関しては、プロモーターは、異種性である。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、標的細胞においてベクターゲノム由来の遺伝子産物の量を送達および発現するｒＡＡＶ組成物の量を指す。有効量は、ヒト患者ではなく、動物モデルに基づいて決定され得る。好適なマウスまたはＮＨＰモデルの例は、本明細書に記載されている。
本発明の文脈における「翻訳」という用語は、リボソームでのプロセスに関し、ｍＲＮＡ鎖は、アミノ酸配列の集合を制御して、タンパク質またはペプチドを生成する。
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「エンハンサー（ａｎ
ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、１つ以上のエンハンサーを表すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
上述のように、「約」という用語は、別段の指定がない限り、数値を修正するために使用される場合、±１０％の変動を意味する。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって、および本明細書で使用される多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
ベクターＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧまたはＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏまたはＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏとも称される）をＣＳＦに送達して、治療用ＡＲＳＡ発現レベルを達成し、ＭＬＤのいくつかのバイオマーカーを救出した。
健常な野生型マウスにおいて、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧのいくつかの概念実証薬理学的試験を実施した。健常なマウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における非臨床試験は、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧのＣＳＦ送達が、ＣＮＳ、ＰＮＳ、およびＣＳＦにおけるＡＲＳＡの過剰発現をもたらすことを示した（実施例１～４）。実施例２は、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの側脳室内
（ＩＣＶ）投与が、健常な野生型マウスの脳内で酵素的に活性なＡＲＳＡの発現をもたらすことを示した。実施例３は、観察されたＡＲＳＡの発現が、ＭＬＤ患者におけるＡＲＳＡ欠損によって影響を受ける２つの主要な細胞型である皮質ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの両方の形質導入および／または交差補正に部分的に起因することを示した。サイズに関連する動物である、カニクイザルマカク（実施例４）においても、潜在的に治療レベルのＡＲＳＡが得られており、有効性試験が、インビボおよび／またはインビトロＭＬＤ疾患モデルにおいて実施される。健常な成体カニクイザルマカクにおいても、用量範囲を試験する追加の実験を実施し、これにより、抗ヒトＡＲＳＡ（ｈＡＲＳＡ）抗体の誘導にもかかわらず、脳、脊髄、およびＤＲＧのニューロンが、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧのＩＣＭ投与後少なくとも６週間にわたってＡＲＳＡの強固な発現を示したことが実証された（実施例４）。ベースラインＣＳＦ ＡＲＳＡ活性レベルの倍加もまた、治療の２週間後に観察され（実施例４）、早発型のＭＬＤ患者においてＡＲＳＡの治療的発現レベルを達成する可能性を示唆した。
ＭＥＤ試験（実施例６）でのその後の使用のために、ＭＬＤ（実験５）の新しいマウスモデルにおけるＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの薬理学および毒性学を評価するための実験も実施する。ＭＬＤ患者由来の細胞株における疾患バイオマーカーを低減させるためのＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの有効性を試験するために、インビトロモデルが調査されている（実施例７）。さらに、実施例８は、幼若アカゲザルにおけるＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの薬理学および毒性学試験を提供する。実施例１０は、小児ＭＬＤ集団におけるＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの試験を示す。
実施例１－ＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏベクター
ＡＡＶ．ｈＡＲＳＡｃｏの成分を以下の表に示す。
Figure 2022531861000010
ベクターは、ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接するサイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＢ７；配列番号１６）を有するニワトリβアクチンプロモーターから発現されるヒトＡＲＳＡ（配列番号１および配列番号３）についてのコード配列を含有するシスプラスミドから構築される。
ベクターは、接着性ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってＡＡＶ血清型ｈｕ６８カプシドにパッケージングされ（ＷＯ２０１８／１６０５８２）、Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ ２１，１２５９－１２７１（２０１０）に先に記載されるように、ヨジキサノール勾配遠心分離によって精製される。
より具体的には、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧは、ＡＡＶシスプラスミド（ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ．ＫａｎＲ）、ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐの遺伝子をコードするＡＡＶトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ）、およびヘルパーアデノウイルスプラスミド（ｐＡｄΔＦ６．ＫａｎＲ）を用いたＨＥＫ２９３ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の細胞の三重プラスミドトランスフェクションによって産生される。ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧパッケージングベクターゲノムのサイズは、３８８３塩基（配列番号５のｎｔ１～ｎｔ３８８３）である。
シスプラスミド（図２）は、以下のベクターゲノム配列エレメントを含む：
逆位末端反復（ＩＴＲ）：ＩＴＲは、同一の逆相補配列であり、ＡＡＶ２（１３０塩基対［ｂｐ］、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１）に由来し、ベクターゲノムのすべての成分に隣接する。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターＤＮＡの複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされるシス配列のみを表す。
ヒトサイトメガロウイルス最初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）：このエンハンサー配列は、ヒト由来のサイトメガロウイルス（３８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３１０４．１）から得られ、下流導入遺伝子の発現を増加させる。
ニワトリβ－アクチン（ＢＡ）プロモーター（配列番号１８）：このユビキタスプロモーター（２８１ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）を選択して、任意の細胞型における導入遺伝子の発現を駆動させた。
キメライントロン（ＣＩ）：ハイブリッドイントロンは、ニワトリＢＡスプライスドナー（９７３ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）およびウサギβ－グロビンスプライスアクセプターエレメントからなる。イントロンは転写されるが、その両端のいずれかにある配列と合わせて、スプライシングにより成熟メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）から除去される。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのｍＲＮＡ輸送を促進し、それにより、翻訳のためのｍＲＮＡの一定レベルの蓄積を高めることが示されている。これは、遺伝子発現レベルの増加を意図した遺伝子ベクターにおいて共通の特徴である。
コード配列：ヒトＡＲＳＡ遺伝子（配列番号１または配列番号３）の遺伝子操作された相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）は、アリールスルファターゼＡをコードし、これは、硫酸化ガラクトスフィンゴ脂質、ガラクトシルセラミド－３－Ｏ－スルフェートおよびガラクトシルスフィンゴシン－３－Ｏ－スルフェートの脱硫酸化に関与するリソソーム酵素である（１５２７ｂｐ；５０９アミノ酸［ａａ］，ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０００４７８．３）。
ウサギβグロビンのポリアデニル化シグナル（ｒＢＧ ＰｏｌｙＡ）：ｒＢＧ ＰｏｌｙＡシグナル（１２７ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００８８２．１）は、ｃｉｓで導入遺伝子のｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化を促進する。このエレメントは、転写終結、新生転写物の３’末端での特異的切断事象、および長いポリアデニル尾部の付加のためのシグナルとして機能する。
プラスミドのすべての成分部分は、直接配列決定によって検証されている。
ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミド（図３）は、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲである。それは、長さ８０３０ｂｐであり、ＡＡＶベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされる４つの野生型ＡＡＶ２レプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする。また、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノムを収容するためにＡＡＶ血清型ｈｕ６８のビリオンシェルに組み立てる３つの野生型ＡＡＶｈｕ６８ビリオンタンパク質カプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードする。新規のＡＡＶｈｕ６８配列は、ヒト心臓組織ＤＮＡから入手した。
ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲトランスプラスミドを作製するために、プラスミドｐＡＡＶ２／９ｎ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳベクターに由来するプラスミド骨格上の野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子をコードする）由来のＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を除去し、ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子と置換した。アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子をまたカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子で置換し、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲを得た。このクローニング戦略では、ＡＡＶ ｐ５プロモーター配列（通常、ｒｅｐの発現を駆動する）を、ｒｅｐの５’末端からｃａｐの３’末端へ移し、ｒｅｐの上流の切断型ｐ５プロモーターを残す。この切断型プロモーターは、ｒｅｐの発現を下方制御し、結果として、ベクターの産生を最大化する役割を果たす。プラスミドのすべての成分部分は、直接配列決定によって検証されている。
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）（図４）を構築し、サイズは１５，７７０ｂｐである。このプラスミドには、ＡＡＶの複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡを含む（アデノウイルスＥ１の機能は、ＨＥＫ２９３細胞によって提供される）。しかしながら、このプラスミドには、他のアデノウイルスの複製遺伝子または構造遺伝子は含まれていない。プラスミドは、アデノウイルスＩＴＲなどの複製に重要なシスエレメントを含んでおらず、したがって、感染性のアデノウイルスが産生されることは予想されない。プラスミドは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド）に由来した。Ａｄ５に欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、かつアデノウイルスＤＮＡの量を３２ｋｂ～１２ｋｂに削減した（図５Ａ）。最終的に、アンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えて、ｐＡｄｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）を作製した（図５Ｂ）。このプラスミドに残るＥ２、Ｅ４、およびＶＡのアデノウイルス遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞に存在するＥ１とともに、ＡＡＶベクターの産生に必要である。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧは、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション、続いて下流精製によって製造される。図６および図７に、製造プロセスのフロー図を示す。製品の調製に入る主要な試薬は、図の左側に示され、プロセス内の品質評価は図の右側に示される。各産生および精製工程の説明も提供されている。製品製造は、別途指定されない限り、ユニット操作の直線的な流れに従い、使い捨ての閉鎖型バイオプロセッシングシステムを利用する。細胞播種から収穫まで、細胞培養を伴う産生プロセスのすべての工程は、滅菌された、単回使用の使い捨てチューブおよびバッグアセンブリを使用して無菌で実施される。細胞は、Ｃｏｒｎｉｎｇのフラットウェア（Ｔ－Ｆｌａｓｋｓ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫｓ［ＣＳ－１０］および／またはＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ［ＨＳ－３６］）を使用して増殖させる。細胞は、バイオリアクター内でトランスフェクトされ、すべての開放操作は、ＩＳＯクラス５環境内のクラスＩＩ生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内で実行する。精製プロセスは、可能な場合、閉鎖システムで実行する。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧについての製造プロセスを開発し、プラスミドＤＮＡによるヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の一過性トランスフェク
ションを伴う。産生で使用したＨＥＫ２９３ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）は、ＦＤＡおよび調和国際会議（ＩＣＨ）ガイドラインに詳述されているように、試験し、適格であった。臨床開発を支援するために、バルク原薬（ＢＤＳ）の単一バッチまたは複数バッチを、バイオリアクター内でのＨＥＫ２９３細胞のポリエチレンイミン－（ＰＥＩ－）媒介性三重トランスフェクションによって産生する。回収したＡＡＶ材料を、可能な場合、使い捨ての閉鎖型バイオプロセッシングシステムにおいて、清澄化、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、アフィニティクロマトグラフィ、およびアニオン交換クロマトグラフィによって連続的に精製する。この産生物を、髄腔内最終製剤緩衝液（ＩＴＦＦＢ、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含む人工ＣＳＦ）中に製剤化する。ＢＤＳバッチを凍結し、その後解凍し、必要に応じてプールし、標的濃度に調整し、０．２２μｍフィルターを通して滅菌濾過し、バイアルを充填する。
小規模またはパイロット規模のバイオリアクターおよび大規模なバイオリアクターの２つの異なるバイオリアクターを使用する。小規模バイオリアクターは、大規模バイオリアクターに対して細胞増殖のための等しい床高さを有する線形にスケーリングされたバイオリアクターである。小規模バイオリアクターおよび大規模バイオリアクターの使用により、最小限のプロセスおよび材料の効果でスケーラブルな製造が可能になる。大規模バイオリアクターおよび／または小規模バイオリアクターは、毒性ロットの産生のために利用される。大規模バイオリアクターは、臨床試験および許認可のために利用される適正製造基準（ＧＭＰ）の原薬（ＤＳ）ロットの産生のために使用される。大規模ＧＭＰ産生バッチサイズは、必要に応じて、製剤（ＤＰ）供給のために必要なベクター量を満たすように計画され、プールされる複数のバッチで生成される。ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧについての製造プロセスは、製品がＩＮＤ申請の非臨床試験から臨床開発まで移行し、かつ許認可を通じても、ほとんど変わらないままである。製品の品質に影響を与えると仮定されるプロセスパラメータは変更されない。ＧＭＰ製造に利用されるＰＥＩおよびプラスミドＤＮＡは、ＧＭＰ－Ｓｏｕｒｃｅ（商標）またはＩＮＤＲｅａｄｙ（商標）グレードの材料であるが、ＨＥＫ２９３ ＷＣＢを含む、ほとんどの重要な原材料は同じままである。
大規模バイオリアクターによるスケールアップ製造プロセスが実装され、現在のバイオリアクタープラットフォームにおいて組み合わせた製造経験に基づいて、製品の同一性、純度、効力、および安全性に変更がないことを確認するための比較性試験を通じて、プロセスの変更に関連する任意の潜在的な影響が対処される。最新の手順または新しい材料で製造された新しいロットを以前のロットと比較するために実施される比較性試験は、分析証明書（ＣＯＡ）に含まれる試験のサブセットから構成される。新しいロットは、以前に確立された仕様を満たし、比較性評価に含まれる任意の試験（以下の表）は、同様の方法論を使用して完了し、可能であれば、同じ試験場を使用して完了する。
Figure 2022531861000011
細胞培養および回収物製造プロセスは、４つの主要な製造工程：（ａ）細胞の播種および増殖、（ｂ）一過性トランスフェクション、（ｃ）ベクター回収、および（ｄ）ベクターの清澄化を含む。これらのプロセスの設定は、概要プロセス図（図６）に示されている。これらのプロセスの各々についての一般的な説明を以下に提供する。
（ａ）細胞の播種および増殖
完全に特徴付けられたＨＥＫ２９３細胞株が、産生プロセスに使用される。ＷＣＢが産生されている。ベクター産生に使用される細胞培養は、１つまたは２つの解凍されたＷＣＢバイアルから開始され、マスターバッチレコード（ＭＢＲ）文書に従って増殖される。細胞は、組織培養プラスチックを使用して増殖され、ＤＳバッチ当たりのベクター産生のために大規模なバイオリアクター容器表面積に播種するための十分な細胞量を生成することができる。細胞は、１０％のガンマ照射したニュージーランド起源のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地中で培養される。細胞は、足場依存的であり、細胞の解離は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ、動物製品不含の細胞解離用試薬を使用して成し遂げられる。細胞播種は、滅菌、単回使用の使い捨てバイオプロセス用バックおよびチューブセットを使用して成し遂げられる。リアクターは、温度、ｐＨ、および溶存酸素（ＤＯ－）が制御される。
（ｂ）一過性トランスフェクション
約４日間の増殖後（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ）、細胞培養培地を新鮮な無血清ＤＭＥＭ培地に交換し、細胞を、ＰＥＩベースのトランスフェクション方法を使用して、３つの産生プラスミドでトランスフェクトする。産生プロセスで使用されるすべてのプラスミドは、トレーサビリティ、文書管理、および材料分離を確実にするためにインフラストラクチャー利用の制御で上記のＣＭＯ品質システムのコンテキストにおいて産生される。十分なプラスミドＤＮＡトランスフェクション複合体は、最大で５００ｍ２（ＢＤＳバッチ
当たり）をトランスフェクトするためにＢＳＣ中で調製される。最初、シス（ベクターゲノム）プラスミド、トランス（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）プラスミド、およびヘルパープラスミドを含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、ＧＭＰグレードのＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ
ＨＱ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ）と任意選択の比率で調製する。このプラスミド比は、小規模最適化研究におけるＡＡＶ産生に最適であると判断された。よく混合した後、溶液を室温で最大２５分間静置し、次いで無血清培地に添加して反応をクエンチし、最終的にバイオリアクターに添加する。リアクターは、温度およびＤＯが調節され、細胞は、５日間インキュベートされる。
（ｃ）ベクター回収
トランスフェクトした細胞および培地は、バイオリアクターから培地を無菌的に汲み出すことによって、使い捨てバイオプロセスバッグを使用して、バイオリアクターから回収される。回収後、洗剤、エンドヌクレアーゼ、およびＭｇＣｌ２（エンドヌクレアーゼの補因子）を添加してベクターを遊離し、パッケージングされていないＤＮＡを消化する。生成物（使い捨てバイオプロセスバッグ内）を温度制御された単回使用のミキサー中で、３７℃で２時間インキュベートして、回収物（トランスフェクション手順で得られた）中に存在する残留細胞およびプラスミドＤＮＡの酵素消化に十分な時間を提供する。この工程は、最終的なベクターＤＰ中の残留ＤＮＡの量を最小限にするために、実施される。インキュベーション後、ＮａＣｌを最終濃度が５００ｍＭになるように添加し、濾過および下流ＴＦＦ中の生成物の回収を補助する。
（ｄ）ベクターの清澄化
蠕動ポンプによって駆動される滅菌された閉鎖チューブおよびバッグセットとして直列に接続されたプレフィルターおよびデプスフィルターカプセル（１．２／０．２２μｍ）を使用して、細胞および細胞デブリを産物から除去する。清澄化は、下流のフィルターおよびクロマトグラフィカラムを汚損から保護されることを保証し、生物負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を低減する濾過は、フィルタートレイン（ｆｉｌｔｅｒ ｔｒａｉｎ）の終わりに、上流の産生プロセス中に導入される可能性のあるあらゆる生物負荷が、下流の精製の前に除去されることを保証する。
精製プロセスは、以下の４つの主要な製造工程を含む。（ａ）ＴＦＦによる濃縮および緩衝液交換、（ｂ）アフィニティクロマトグラフィ、（ｃ）アニオン交換クロマトグラフィ、ならびに（ｄ）ＴＦＦによる濃縮および緩衝液交換。これらのプロセス工程は、概要プロセス図（図６）に示されている。これらのプロセスの各々についての一般的な説明を以下に提供する。
（ａ）大規模タンジェンシャルフロー濾過
清澄化された生成物の体積低減（２０倍）は、カスタムの滅菌された閉鎖バイオプロセッシングチューブ、バッグ、および膜セットを使用して、ＴＦＦによって達成される。ＴＦＦの原理は、好適な多孔度（１００ｋＤａ）の膜に平行な圧力下で溶液を流すことである。圧力差は、膜孔よりも大きな分子を保持しながら、より小さいサイズの分子を、膜を通して効果的に廃棄流路に駆動する。溶液を再循環させることで、平行流が膜表面を押し流し、膜への結合による膜孔汚れおよび生成物の損失を防ぐ。適切な膜孔径および表面積を選択することによって、液体試料は、所望の分子を保持および濃縮しながら体積を急速に減少させ得る。ＴＦＦ用途における透析濾過は、液体が膜を通して、廃棄流路に通過するのと同じ速度で再循環試料に新鮮な緩衝液を添加することを伴う。透析濾過の体積の増加に伴う、小分子の量の増加は、再循環試料から除去される。この透析濾過は、清澄化された生成物の適度な精製をもたらすが、その後のアフィニティカラムクロマトグラフィ工程と適合性の緩衝液交換も達成する。したがって、濃縮のために１００ｋＤａのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）膜を利用し、次いで最小の４透析濾過体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ
（ｐＨ７．５）および４００ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝液で透析濾過する。次いで、透析濾過された産物を１．２／０．２２μｍのデプスフィルターカプセルでさらに清澄化して、あらゆる沈殿した材料を除去する。
アフィニティクロマトグラフィ
透析濾過された生成物を、ＡＡＶｈｕ６８血清型を効率的に捕捉するＰｏｒｏｓ（商標）Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶアフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用する。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。適用後、カラムを５体積の低塩エンドヌクレアーゼ溶液（２５０Ｕ／ｍＬのエンドヌクレアーゼ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭのＮａＣｌ、および１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で処理して、残りの宿主細胞およびプラスミド核酸をすべて除去する。カラムを洗浄して、追加の供給不純物を除去し、続いて低ｐＨ段階溶出液（４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５）で洗浄して、これを直ちに１／１０体積の中和緩衝液（２００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン、ｐＨ１０．２）中に回収することによって中和する。
（ｃ）アニオン交換クロマトグラフィ
空のＡＡＶ粒子を含むプロセス内不純物のさらなる低減を達成するために、Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ溶出プールを５０倍に希釈して（２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、ｐＨ１０．２）、イオン強度を低下させ、ＣＩＭｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリスマトリックス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩洗浄後、ベクター生成物を、６０カラム体積（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）のＮａＣｌ直線塩勾配（１０～１８０ｍＭのＮａＣｌ）を使用して溶出する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを含まないカプシド粒子（空の粒子）を、ベクターゲノムを含有する粒子（完全粒子）から効果的に分離し、完全粒子について濃縮された調製物が得られる。完全粒子のピーク溶出液を回収し、中和する。ピーク面積を評価し、おおよそのベクター収率を決定するために、以前のデータと比較する。
（ｄ）中空線維タンジェンシャルフロー濾過による濃縮および緩衝液交換
プールされたアニオン交換中間体を濃縮し、ＴＦＦを使用して緩衝液を交換する。この工程では、１００ｋＤａの膜中空繊維ＴＦＦ膜が使用される。この工程中、生成物を標的濃度にもたらし、次いで緩衝液をＩＴＦＦＢ（０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含む人工ＣＳＦ）に交換する。
試料は試験のために除去される（図７）。バルク原薬（ＢＤＳ）を滅菌濾過し（０．２２μｍ）、滅菌容器に保管し、最終充填のためにリリースするまで、隔離場所に－６０℃以下で冷凍する。
凍結バルク原薬を解凍し、プールし、最終製剤緩衝液（ＦＦＢ）を使用して標的濃度に調整する（ＴＦＦを介した希釈または濃縮工程）。この生成物を、最終的に０．２２μｍフィルターを通して濾過し、圧着シール付きストッパーを備えた滅菌されたＷｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ’ｓ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（環状オレフィンポリマー）バイアルに充填する。ラベル付けされたバイアルは、－６０℃以下で保管される。
シス、トランスおよびヘルパープラスミドの細菌マスターセルバンク（ＢＭＣＢ）グリセロールストックを、形質転換したＳｔｂｌ２（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の１Ｌの一晩培養からの１ｍＬを、等体積の滅菌５０％グリセロールと混合することによって作製した。構築物毎に２つの０．５ｍＬアリコートのＢＭＣＢグリセロールストックを混合物から調製し、Ｎａｌｇｅｎｅ低温バイアルに－８０℃で保存する。ＢＭＣＢグリセロールストッ
クを検証するために、増幅されたプラスミドＤＮＡを、制限酵素消化、続いてゲル電気泳動、およびＱｉａｇｅｎのサンガー配列決定による完全プラスミド配列解析を含む社内構造解析に供する。プラスミドＤＮＡ製造業者への輸送のための細菌ワーキングセルバンク（ＢＷＣＢ）グリセロールストックアリコートを調製するために、３ｍＬの培養液をＢＭＣＢグリセロールストックから接種し、一晩増殖させる。次に、１ｍＬの一晩培養物を使用して、上記のようにＢＷＣＢグリセロールストックアリコートを調製する。新しいＢＷＣＢグリセロールストックアリコートを、残りの２ｍＬの一晩の細菌培養物から抽出されたＤＮＡについて前述の構造解析によって検証する。プラスミドＤＮＡ製造業者で受け取ると、ＢＷＣＢグリセロールストックは、プロジェクト固有の場所に－８０℃で保管される。生成培養物は、凍結したＢＷＣＢグリセロールストックを擦り取ることによって接種される。
適正製造基準（ＧＭＰ）ベクター製造の原料として使用されるプラスミドは、ＧＭＰ設備としての資格を有さない設備で生成されるが、プラスミドは、現在の適正製造基準（ｃＧＭＰ）中間体の要件を満たすように設計された様式で生成される。プラスミド生成は、専用コンポーネントおよび専用スイートで行われる。生成手順および監視は、以下の表に見られるような厳格なリリース基準を満たす、高純度のＤＮＡを有する一貫した品質の製品を確保するために実施される。プラスミドの生成で使用される成分は、「動物質不含」であり（成分製品についての各供給業者からのＣＯＡに基づく）、プロセスで使用されるすべての成分（発酵フラスコ、容器、膜、樹脂、カラム、チューブ、およびプラスミドと接触する任意の成分）は、単一のプラスミド専用であり、ＴＳＥ／ＢＳＥを含まないことが認定されている。利用されるＰｏｌｙＦｌｏ（登録商標）樹脂、カラム、および成分は、単一のプラスミドの製造における独占的な使用のために調達される。プラスミドの発酵、溶解、および精製は、指定されたプラスミド名が記された専用の部屋で行われる。他のプラスミドは、それらの部屋で同時に処理されない。各プラスミド生成活動の間に部屋および機器を洗浄する。組換えベクターの生成に使用する前に、製造された各プラスミドは、無菌性およびマイコプラズマの存在の試験に加えて、他のプラスミドによる汚染を排除するために次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して完全に配列決定される。
薬理学／毒性学のためのベクターの生成に使用されるすべてのプラスミドＤＮＡは、ＰｕｒｅｓｙｎのＰｒｅｍｉｕｍ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｄｙ Ｐｒｏｇｒａｍを通じて作製される。ＰｕｒｅｓｙｎのＰｒｅｍｉｕｍ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｄｙ Ｐｒｏｇｒａｍは、洗浄および分離手順ならびに使い捨てのコンポーネントを使用して生成されているが、専用の部屋で生成されているわけではない。
Figure 2022531861000012
ＨＥＫ２９３細胞は、最初は、剪断されたアデノウイルス５型（Ａｄ５）ＤＮＡをＨＥＫ細胞に形質転換することによって生成された（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。この細胞は、ｒＡＡＶ産生に必要なＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子産物を発現する。ＨＥＫ２９３細胞は高度にトランスフェクション可能であり、プラスミドＤＮＡトランスフェクションにより高レベルのｒＡＡＶを生じる。
ベクターゲノム同一性：ＤＮＡ配列決定
ＡＡＶベクター（２．００×１０１１ＧＣ）を、Ｂａｓｅｌｉｎｅ ＺｅｒｏエンドヌクレアーゼおよびプラスミドＳａｆｅ ＤＮＡｓｅで処理して、環境中の非カプセル化ＤＮＡを排除し、次いで１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で９５℃で１０分間インキュベートして、ベクターゲノムを変性させる。その後、変性したベクターゲノムを、サーモサイクラー内で反応混合物を０．６℃／分の速度で２４℃までゆっくりと冷却することによってアニーリングし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して浄化し、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器で平均５００ｂｐのサイズに剪断する。ＤＮＡ剪断は、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ試薬キットを備えた２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で評価する。剪断したＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＮＥＢＮｅｘｔＵｌｔｒａＩＩライブラリキットを使用してＮＧＳライブラリに調製し、サイズを選択し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって浄化する。次いで、個々のＮＧＳライブラリを、断片サイズ分布について再びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析し、等モル濃度でプールする前に、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）３．０蛍光光度計によって定量化する。最終的にプールしたライブラリの濃度を、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）３．０蛍光光度計によって測定し、変性させ、ＩｌｌｕｍｉｎａのＭｉｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ変性および希釈ライブラリガイドに従って８ｐＭまで希釈する。ＰｈｉＸ対照を、１０％で最終ライブラリにスパイクする。ＭｉＳｅｑシーケンサー上でＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｎａｎｏ試薬キットＶ２（２５０ｂｐペアエンド）を使用して配列決定を実施する。データ分析を、上記のように、ＮＧＳ整列アプローチを使用して実
施する。
配列決定読み取りは、自動的にデマルチプレックスされ、ＭｉＳｅｑコンピュータによってアダプタトリミングされる。各プラスミドのトリミングされた読み取りは、対応する参照配列に整列され、配列バリアントは、ＢＢＴｏｏｌｓバイオインフォマティクスソフトウェアスイート（ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｂｍａｐ）を使用して呼び出される。さらに、ＢＢＭａｐ（ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ｄａｔａ－ａｎｄ－ｔｏｏｌｓ／ｂｂｔｏｏｌｓ／）を使用して、ＶＣＦおよびＢＡＭファイルを生成する。ＶＣＦファイルを、カスタムＵＮＩＸスクリプトによってさらに解析して、簡略化されたタブ区切りテーブルを生成する（ＣＨＲＯＭ、ＲＥＦ、ＡＬＴ、ＱＵＡＬ、ＴＹＰＥ、ＤＥＰＴＨ、ＡＦ、ＲＡＦ、ＳＢ、ＤＰ４フィールドのみを保持する）。ＢＡＭファイルを、ＩＧＶ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｖｉｅｗｅｒソフトウェア（ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉｇｖ／）で目視検証して、適切なＮＧＳ整列を保証する。ＮＧＳ整列アプローチと並行して、ＮＯＶＯＰｌａｓｔｙ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎｄｉｅｒｃｋｘ／ＮＯＶＯＰｌａｓｔｙ）を使用して、長い環状配列を構築するためにデノボアセンブリを実施する。デノボ配列を、元のベクターゲノム参照配列に対して整列させて、整列アプローチにおいて見落とされ得る大きな配列配置を特徴付ける。
ベクターカプシドの同一性：ＶＰ１のＡＡＶカプシド質量分析
ＤＰのＡＡＶｈｕ６８血清型の確認は、ＡＡＶカプシドタンパク質のペプチドの分析に基づいて、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｘｉｍｉｔｙ，ＬＬＣで開発された新たなアッセイを使用して達成される。この方法は、ＶＰのトリプシン消化、続いて、カプシドタンパク質ペプチドの配列に対するＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析でのタンデム質量分析（ＭＳ）の特徴付けを含む。タンデム質量スペクトルからのスペクトルライブラリを配列決定し、標的化されたＭＳ法を使用して、特定のＡＡＶウイルス粒子血清型を一意的に識別することができるシグネチャーペプチドをアッセイする。８つの血清型（ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶｈｕ３７）に特異的なシグネチャーペプチドのバンクを、試験物質の消化によって生成されたタンデム質量スペクトルに対してスクリーニングする。陽性同定について、単一の血清型からのシグネチャーペプチドのみが検出される。
ゲノムコピー力価
ＡＡＶベクターについてのＧＣ力価を決定するためのｄｄＰＣＲベースの技術が開発されている（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。基準標準物を、パイロットランの間に生成し、アッセイを適格化するために使用する。この方法は実用的であり、ｑＰＣＲと同等またはそれ以上の力価を報告し、プラスミド標準曲線を必要としない。利用されるアッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉによる消化、続いて、ｄｄＰＣＲ分析を含み、カプセル化ベクターＧＣを測定する。ＤＮＡ検出は、ポリＡ領域を標的化する配列特異的プライマーをこの同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識されたプローブと組み合わせて使用して達成される。多数の標準物、確認用試料、および対照（バックグラウンドおよびＤＮＡ汚染について）が、アッセイに導入されている。このアッセイは、パイロット基準標準物を使用して適格とされる。このアッセイは、感受性、検出限界（ＬＯＤ）、適格性範囲、ならびにアッセイ内およびアッセイ間正確性を含むアッセイパラメータを確立して定めることによって、適格とされる。内部ＡＡＶｈｕ６８参照ロットが構築され、適格性研究を実施するために使用される。
感染単位力価
感染単位（ＩＵ）アッセイを使用して、ＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２発現ＨｅＬａ細胞）に
おけるｒＡＡＶベクターの生産的取り込みおよび複製を測定する。９６ウェルエンドポイントフォーマットは、以前公開されたものと同様のものを利用している。簡潔には、ＲＣ３２細胞を、ｒＡＡＶの各希釈において１２レプリケートを伴う、連続希釈のｒＡＡＶ ＢＤＳ、および均一希釈のＡｄ５により同時感染させる。感染の７２時間後、細胞を溶解し、ｑＰＣＲを実施して、インプットにわたってｒＡＡＶベクター増幅を検出する。エンドポイント希釈５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）算出（Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ）を実施して、ＩＵ／ｍＬとして表される複製力価を測定する。「感染性」値は、細胞との各粒子の接触、受容体結合、内部移行、核への輸送、およびゲノム複製に依存的であるので、それらは、アッセイ幾何学、ならびに使用される細胞株における適切な受容体の存在、および結合後経路により影響を受ける。受容体および結合後経路は、不死化細胞株において通常は維持されず、故に、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の数の絶対的尺度ではない。しかしながら、カプシドに封入されたＧＣ対「感染単位」の比（ＧＣ／ＩＵ比として記載される）は、ロットからロットへの産物一貫性の尺度として使用されることができる。
粒子含有量分析
分析超遠心分離器（ＡＵＣ）で測定される沈降速度は、凝集体、他の軽微な成分を検出することができ、またそれらの異なる沈降係数に基づいて異なる粒子種の相対量の適切な定量を提供することができる。これは、基本的な長さと時間の単位に基づいた絶対的な方法であり、参照として標準的な分子を必要としない。ベクター試料を、１２ｍＭの光路長を有する２チャネルのチャコール－エポンセンターピースを有するセルにロードする。供給された希釈緩衝液を、各細胞の参照チャネルにロードする。次いで、ロードされた細胞を、ＡＮ－６０Ｔｉ分析ローターに配置し、吸光度およびＲＩ検出器の両方を備えたＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析超遠心分離器にロードする。２０℃で完全に温度平衡化した後、ローターを、１２，０００毎分回転数（ＲＰＭ）の最終実行速度にする。２８０ｎｍスキャンにおける吸光度は、おおよそ３分毎に約５．５時間記録される（各試料について１１０回の総スキャン）。生データを、ｃ（ｓ）メソッドを使用して分析し、分析プログラムＳＥＤＦＩＴに実装する。得られたサイズ分布をグラフ化し、ピークを統合する。各ピークと関連付けられたパーセンテージ値は、すべてのピーク下の総面積のピーク面積分率を表し、２８０ｎｍで生成された生データに基づく。多くの研究室では、これらの値を使用して完全：空の比を計算する。しかしながら、空の粒子と完全粒子は、この波長で異なる吸光係数を有するため、それに応じて生データを調整することができる。吸光係数調整の前後の両方の空の粒子および完全モノマーピーク値の比を使用して、空：完全の比を決定し、両方の比を記録する。
宿主細胞ＤＮＡ
ｑＰＣＲアッセイを使用して、残留ＨＥＫ２９３ＤＮＡを検出する。「非関連ＤＮＡ」でスパイクした後、全ＤＮＡ（非関連、ベクター、および残留ゲノムＤＮＡ）を、約１ｍＬの生成物から抽出する。ＨＣＤＮＡは、１８Ｓ ｒＤＮＡを標的とするｑＰＣＲを使用して定量化する。検出されたＤＮＡの量は、スパイクされた非関連ＤＮＡの回収に基づいて正規化する。３つの異なるアンプリコンサイズを試験して、残留ＨＣＤＮＡのサイズスペクトルを確立する。
宿主細胞タンパク質
ＥＬＩＳＡを実施して、汚染宿主ＨＥＫ２９３細胞タンパク質のレベルを測定する。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＨＥＫ２９３ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡキットを、供給業者が提供する説明書に従って使用する。
複製能のあるＡＡＶのアッセイ
試料は、産生プロセス中に生じる可能性がある複製能のあるＡＡＶ２／ｈｕ６８（ｒｃＡＡＶ）の存在について分析される。細胞に基づく増幅および継代、続いて、リアルタイムｑＰＣＲによるｒｃＡＡＶ ＤＮＡの検出（ｃａｐｈｕ６８標的）からなる３継代アッセイが、開発されている。細胞ベースの成分は、試験試料および野生型ヒトＡｄ５の希釈物をＨＥＫ２９３細胞（Ｐ１）の単層に接種することからなる。試験した生成物の最大量は、１．００×１０１０ＧＣのベクター生成物である。アデノウイルスの存在により、ｒｃＡＡＶは細胞培養物中で増幅する。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を２回目の細胞（Ｐ２）に継代し、感度を増強する（再度、Ａｄ５の存在下で）。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を３回目の細胞（Ｐ３）に継代し、感度を増強する（再度、Ａｄ５の存在下で）。２日後、細胞を溶解してＤＮＡを遊離し、次いで、ｑＰＣＲに供して、ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ配列を検出する。ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ配列がＡｄ５依存的な様式で増幅することで、ｒｃＡＡＶの存在が示される。ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶ２／ｈｕ６８代替陽性対照を使用すると、アッセイのＬＯＤを決定することが可能になる（０．１ＩＵ、１ＩＵ、１０ＩＵ、および１００ＩＵ）。ｒＡＡＶ（１．００×１０１０ＧＣ、１．００×１０９ＧＣ、１．００×１０８ＧＣ、および１．００×１０７ＧＣ）の連続希釈を使用して、試験試料中に存在するｒｃＡＡＶのおおよその量を定量化することができる。この試験方法を実施する。
インビトロ有効性
ＤｄＰＣＲ ＧＣ力価を遺伝子発現に関連付けるために、インビトロの相対効力バイオアッセイを行う。簡潔に、細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。翌日、細胞を、段階希釈されたＡＡＶベクターで感染させ、３７℃／５％ＣＯ２で最大３日間インキュベートする。培養期間の終了時に、細胞培養培地を回収し、比色基質の切断に基づいて、ＡＲＳＡ活性についてアッセイする。アッセイの最適化は進行中である。
総タンパク質、カプシドタンパク質、タンパク質純度、およびカプシドタンパク質比
ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質の標準曲線に対して、ベクター試料を最初に総タンパク質について定量化する。決定は、等量の試料を、キットで提供されるＭｉｃｒｏ－ＢＣＡ試薬と混合することによって行われる。ＢＳＡ標準の希釈も、同じ手順を適用する。混合物を６０℃でインキュベートし、５６２ｎｍで吸光度を測定する。標準曲線は、４パラメータ適合を使用して、既知の濃度の標準吸光度から生成される。未知の試料を４パラメータ回帰に従って定量化する。
ｒＡＡＶの純度の半定量的決定を提供するために、試料を、ゲノム力価について正規化し、５．００×１０９ＧＣを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって還元条件下で分離する。次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ色素で染色する。不純物バンドはすべて、濃度測定によって定量化する。３つのＡＡＶ特異的タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）に加えて現れる染色されたバンドは、タンパク質不純物とみなされる。混入物バンドの不純物質量パーセントならびにおおよその分子量が報告される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質を定量化し、それらの比率を決定するためにも使用される。
感染単位に対するゲノムコピーの比
ＧＣ／ＩＵ比は、産物一貫性の尺度である。ｄｄＰＣＲ力価（ＧＣ／ｍＬ）を感染単位（ＩＵ／ｍＬ）で割って、算出されたＧＣ／ＩＵ比を得る。
実施例２－マウスにおける概念実証薬理学および用量範囲試験
実験を実施して、マウスにおけるＩＣＶ注射後のＡＡＶｈｕ６８．ｈＡＲＳＡｃｏベク
ターの効力を確立した。この概念実証（ＰＯＣ）実験のために、健常な６～８週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスを選択した。小さいサイズのマウスは、ＩＣＭを介してＡＡＶベクターを確実に注入することを困難にするため、ＩＣＶ経路を選択した。年齢は、過去のデータおよびこの年齢のマウスでＩＣＶ注入を実施した本発明者らの以前の経験に基づいて選択した（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。マウスにおける他のＩＣＶ投与ＡＡＶベクターの以前の経験に基づいて、２１日の剖検時点を選択して、安定した導入遺伝子発現を得た（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスのＣＳＦに、１．００×１０１０ＧＣの低用量または１．００×１０１１ＧＣの高用量のいずれかで、右脳室への単回ＩＣＶ注射によってＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターを投与した。用量は、異なるＬＳＤマウスモデルにおけるＩＣＶ投与ＡＡＶベクターの以前の用量範囲試験に基づいて選択した（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。対照として、年齢を一致させたＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの右脳室に、ビヒクル（ＰＢＳ）を単回のＩＣＶ注入により注入して、ベースラインのＡＲＳＡ活性レベルを得た。投与の２１日後、マウスを剖検し、人工基質である４－ニトロカテコールスルフェートの切断に基づく比色アッセイを使用して、脳、肝臓、および血清の試料からの透析タンパク質抽出物中のＡＲＳＡ活性レベルを定量化した。
脳はＭＬＤの治療のための主要な標的組織であるため、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクター投与の２１日後に、ＡＲＳＡ活性レベルを左対右の大脳半球で測定した。ＡＲＳＡ活性は、ＰＢＳ処置対照と比較して、低用量（１．００×１０１０ＧＣ）または高用量（１．００×１０１１ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターを投与したマウスの脳において、それぞれ１２％および３１％高かった。さらに、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ処置した動物について、右半球と左半球との間のＡＲＳＡ活性レベルの明らかな差は観察されなかった（図８）。これらの結果は、単回の片側のみのＩＣＶ注入によるＣＳＦへのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターの送達が、両方の大脳半球の細胞を形質導入するのに十分であること、および／またはＣＳＦに放出される循環ＡＲＳＡ酵素を介して交差補正を促進するのに十分であることを示唆している。ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＨＡＲＳＡＣＯ．ＲＢＧの両方の用量は、野生型マウスへのＩＣＶ投与後の脳における酵素的に活性なＡＲＳＡ酵素の過剰発現をもたらす。
神経系外の組織における機能的ＡＲＳＡ酵素活性を定量化するために、血清および肝臓の試料を、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクター投与の２１日後に得た。ＰＢＳ処置対照におけるベースラインレベルと比較して、血清中のＡＲＳＡ活性レベルは、低用量（１．００×１０１０ＧＣ）または高用量（１．００×１０１１ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターを投与したマウスにおいて、それぞれ３０％および１５１％高かった（図９Ａ）。肝臓において、ＡＲＳＡ活性レベルは、低用量（１．００×１０１０ＧＣ）または高用量（１．００×１０１１ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターを投与したマウスにおいて、それぞれ１１倍および２８倍高かった（図９Ｂ）。これらの結果は、脳に加えて、ＣＳＦ送達ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターが、特に肝臓において、末梢臓器系の細胞を形質導入および／または交差補正した可能性があることを示唆している。酵素的に活性なＡＲＳＡの過剰発現は、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの両方の用量で、肝臓および血清でも検出される。
まとめると、この実験は、マウスにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターの単回の片側のみのＩＣＶ注射が、２１日以内に脳の両半球において酵素的に活性なＡＲＳＡ酵素の用量依存的発現をもたらしたことを確認した。機能的Ａ
ＲＳＡ酵素は、血清および肝臓にも存在し、これは、ＡＡＶＨＵ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＨＡＲＳＡＣＯ．ＲＢＧベクターが、末梢臓器系において形質導入されたことを示唆している。しかしながら、本発明者らは、野生型ベースラインレベルを上回る過剰発現としてＡＲＳＡ活性を測定していたため、この過剰発現は、潜在的に有効な治療用量へのこれらの結果の変換を除外した。したがって、用量範囲を確認するために、ＭＥＤ試験をＡｒｓａ－／－マウスで実施する（実施例４）。
実施例３－マウスにおける細胞指向性試験。
野生型マウスにおけるベクターのＩＣＶ投与後に、ＡＲＳＡ酵素のＣＮＳ発現プロファイルを評価した。ＡＡＶｈｕ６８が主にニューロンを形質導入し、実験を実施して、ＡＲＳＡがミエリン産生オリゴデンドロサイトに局在しているかどうかを決定したことが示された。ＡＲＳＡのオリゴデンドロサイト特異的発現は、ＭＬＤ患者において影響を受ける主要な細胞型の交差補正の可能性を支持する。この試験のために、Ｃ末端ＨＡペプチドで標識された操作されたヒトＡＲＳＡ酵素をコードするＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧに類似するＡＡＶｈｕ６８ベクターである、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏＨＡ．ｒＢＧを利用した。抗ＡＲＳＡ抗体は、理論的には、野生型動物において内因性マウスＡＲＳＡと交差反応することができるため、抗血球凝集素（ＨＡ）抗体を使用して、ＩＣＶ投与後のＡＲＳＡ発現を評価した。この類似のＡＡＶｈｕ６８ベクターの投与後の観察されたＡＲＳＡ発現プロファイルは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与後のＡＲＳＡ発現を代表すると予測される。
成体Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウス（６～８週齢）のＣＳＦに、１．００×１０１０ＧＣの低用量または１．００×１０１１ＧＣの高用量のいずれかで、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏＨＡ．ｒＢＧをＩＣＶ投与した。ベクター投与の２１日後、マウスを剖検し、皮質および皮質下白質を含有する脳試料を得て、オリゴデンドロサイト（オリゴデンドロサイト転写因子２（ＯＬＩＧ２）の発現によって特定される）におけるＡＲＳＡの発現を評価した。ベクター用量、マウス株、年齢、および剖検時点を選択して実施例２を反映し、皮質および皮質下白質を、それらの領域が、ＩＣＶ投与後に一貫して形質導入され、ＭＬＤ治療用に標的化するための主要な組織であるため、調べた。
低用量（１．００×１０１０ＧＣ）の投与により、皮質および皮質下白質において最小数のＡＲＳＡ発現細胞がもたらされた。対照的に、高用量（１．００×１０１１ＧＣ）を投与した動物は、皮質および皮質下白質においてＡＲＳＡを発現する細胞の数が多いことが示された。さらに、多数のＡＲＳＡ陽性ＯＬＩＧ２陰性細胞（推定ニューロン）を含む脳領域において、ＡＲＳＡ発現オリゴデンドロサイトの濃縮が観察された（図１０）。オリゴデンドロサイトは典型的には、ＡＡＶｈｕ６８によって最小限に形質導入されるため、ＡＲＳＡ発現のこの細胞分布パターンは、隣接するニューロンによるオリゴデンドロサイトの交差補正が生じたことを示唆する。これらのデータは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧが、ＭＬＤ患者で影響を受けるＣＮＳおよびＰＮＳのニューロンおよび髄鞘形成細胞の両方に、分泌されるＡＲＳＡ酵素の長続きする供給源を提供することができる可能性を支持する。
まとめると、この実験は、野生型マウスにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧに類似するベクターのＩＣＶ投与の２１日後までに、ＡＲＳＡ酵素が、ＭＬＤの治療のための主要な標的細胞型である、脳内のニューロンおよびオリゴデンドロサイトの両方に首尾よく送達されたことを示した。ＨＡで標識化されたＡＲＳＡを発現する形質導入細胞が、片側のみのＩＣＶ投与後に脳の両側で観察された。２つの主要な標的細胞であるニューロンおよびオリゴデンドロサイトは、ともにＡＲＳＡを発現した。
実施例４－カニクイザルマカクにおけるパイロット用量範囲試験。
この試験は、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターのＩＣＭ投与後の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるベースラインレベルを上回るＣＳＦ内のＡＲＳＡ活性レベルを増加させるために必要な用量範囲を決定するためのパイロット試験であった。エクスビボレンチウイルスＨＳＣ－ＧＴの第１／２相試験の結果は、ＣＳＦ内の正常なレベルのＡＲＳＡ活性の達成が、早発型ＭＬＤ患者の良好な転帰と相関することを示している（Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＨＳＣ－ＧＴは、ＡＲＳＡを分泌するＣＮＳ常在細胞からの交差補正に依存するという点で、これらの実施例に記載される治療アプローチに類似するため、ＮＨＰにおけるＡＲＳＡのＣＳＦレベルは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターの潜在的な有効性を予測するものであると推論された。
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧベクターを、３．００×１０１２ＧＣ（低用量）、１．００×１０１３ＧＣ（中用量）、または３．００×１０１３ＧＣ（高用量）の用量で、成体カニクイザルマカクに対してＩＣＭ投与した。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与後４２日間（ＣＳＦ採取のための３０日目を除く）に、ＡＲＳＡ活性レベルの動態および阻害性抗ＡＲＳＡ抗体の存在を評価するために、ＣＳＦおよび血清を毎週採取した。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの用量は、ＮＨＰにおいて分泌可能なタンパク質を発現するＩＣＭ投与ベクターに関する以前の経験に基づいて選択した（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ処置後４２日間の試料採取時点は、ＩＴ ＡＡＶ投与の１４日後までに導入遺伝子発現が検出可能であるという本発明者らの以前の経験に基づいて、ＡＲＳＡ活性レベルの安定したプラトーを取得することが予測された（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ
ａｌ．，２０１８）。
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの中用量（１．００×１０１３ＧＣ）または高用量（３．００×１０１３ＧＣ）のいずれかの投与は、ベースラインレベルを上回ってＣＳＦ ＡＲＳＡ活性を増加させた。ＡＲＳＡ活性は、治療の７～１４日後にピークに達し、その後、治療の３５～４２日後までにベースラインレベルに戻った。そのピークでは、ＡＲＳＡ活性は、中用量または高用量を投与された各ＮＨＰのベースラインの少なくとも２倍であり、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧが、ＡＲＳＡ欠損ＭＬＤ患者に投与されたときに正常なＡＲＳＡレベルを回復させ得ることを示唆した。対照的に、低用量（３．００×１０１２ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧは、ＡＲＳＡ活性レベルの増加には有効ではなかった（図１１）。
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与の１４日後のＡＲＳＡ活性レベルの観察された低下は、阻害性抗ｈＡＲＳＡ抗体の産生から生じた可能性がある。分析により、ＣＳＦにおいて、治療後３週間までに、いくつかの動物において抗ｈＡＲＳＡ抗体の増加が観察されたことが明らかになった。４２日までに、すべての動物は、抗ｈＡＲＳＡ抗体の上昇を示し、より高い抗体レベルは、より高い用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧと相関するように見えた（図１２Ａ）。血清中では、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与後２１～２８日までに一部の動物において循環抗ｈＡＲＳＡ抗体の増加が明らかであった。４２日までに、ほとんどの動物は抗ｈＡＲＳＡ抗体の上昇を示したが、ＣＳＦとは異なり、血清レベルは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの用量と相関しないように見えた（図１２Ｂ）。これらの結果は、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与の１４日後に観察されたＡＲＳＡ活性の低下が、ＣＳＦおよび血清循環抗ｈＡＲＳＡ抗体の誘導によるものであることを示唆する。
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ導入遺伝子産物に対する体液性応答（すなわち、抗ｈＡＲＳＡ抗体の産生）に加えて、細胞傷害性Ｔ細胞応答による形質導入細胞の排除が、ＣＳＦ内のＡＲＳＡ活性の喪失に寄与し得る可能性もあった。この可能性に対処するために、ＣＮＳ、ＰＮＳ、および末梢組織を、ＡＲＳＡ発現の総合評価のために、治療から４２日後に剖検したＮＨＰから採取した。
高用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ（３．００×１０１３ＧＣ）を投与したＮＨＰでは、ヒトＡＲＳＡ酵素を発現する形質導入細胞が、皮質（図１３Ｅ、図１３Ｆ、図１３Ｇ、図１３Ｉ、および図１３Ｊ）、海馬（図１３Ｈ）、視床（図１３Ｋ）、および小脳（図１３Ｌ）を含む脳全体で検出された。頸部（図１４Ｄ）、胸部（図１４Ｅ）、および腰部（図１４Ｆ）脊髄の細胞は、頸部（図１４Ｇ）、胸部（図１４Ｈ）、および腰部（図１４Ｉ）ＤＲＧとともに、ヒトＡＲＳＡ酵素も発現した。これらの所見は、導入遺伝子産物に対する体液性免疫応答にもかかわらず、形質導入細胞は、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与後、少なくとも４２日間、標的組織内に依然として存在し、ニューロンおよびミエリン産生細胞を補正するために必要とされるＡＲＳＡを産生することを示唆する。これらのデータは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧが、ＭＬＤ患者のＣＮＳおよびＰＮＳの両方に、治療レベルのＡＲＳＡを提供することができる可能性を支持する。
高用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ（３．００×１０１３ＧＣ）での最小から中程度の背側感覚軸索障害が、ＩＣＭ遺伝子導入に成功した後に通常見られるものと一致することが観察された。臨床兆候の末梢神経障害は、この試験中に動物において観察されなかった。低用量（３．００×１０１２ＧＣ）または中用量（１．００×１０１３ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧを投与したＮＨＰの組織病理スライドを生成し、分析を実施した。
累積的に、この試験は、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧのＩＣＭ投与後１４日までに、ＮＨＰのＣＳＦ内の総ＡＲＳＡ活性レベルが２倍超に増加したことを示した。ＣＳＦ ＡＲＳＡ活性レベルは、ヒトＡＲＳＡ導入遺伝子に対する抗体の産生により、その後２８日間にわたってほぼベースラインレベルに戻った。しかしながら、ＰＮＳへの突起を有する細胞（例えば、ＤＲＧおよび運動ニューロン）を含む、脳および脊髄にわたって形質導入された細胞は、４２日の試験の期間の間に依然として存在した。臨床徴兆を伴わない高用量（３．００×１０１３ＧＣ）での軸索障害が観察され、ＩＣＭ ＡＡＶ投与後の以前の所見と一致した。これらのデータは、ＭＬＤ患者のＣＮＳおよびＰＮＳにおける欠損したニューロンおよびミエリン産生細胞にＡＲＳＡを送達するためのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの使用を支持する。
ＡＲＳＡの過剰発現は、ＣＳＦおよび標的組織（ＣＮＳ、ＰＮＳ）におけるＭＤおよびＨＤで達成された。ＬＤは準最適であった。
実施例５－Ａｒｓａ－／－マウスモデル。
ＭＬＤの天然に存在する動物モデルは、文献に報告されていない。ＭＬＤには、実験室で生成された２つのマウスモデルがあり、それらのどちらもＶｏｌｋｍａｒ Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎのグループがドイツで作製した（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。試験のためのこれらの公開された系統を得ることが困難であるため、クラスター化された規則的な間隔の短い回文リピート－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）遺伝子編集技術を使用して、ＭＬＤマウスモデルを生成した。３つの異なる実験室で生成したマウスモデルの比較を以下の表に提供する。
Figure 2022531861000013
Ａ．非脱髄性ＭＬＤマウス（Ａｒｓａ－／－）
古典的なＭＬＤマウスモデル（文献では「非脱髄性ＭＬＤマウス」と称される）を、Ａｒｓａ遺伝子のエクソン４への１．３ｋｂネオマイシンカセットの挿入を介した相同組換えによって開発した。この挿入により、検出可能なＡｒｓａ ｍＲＮＡおよび機能的タンパク質を欠くホモ接合性Ａｒｓａ－／－マウスで遺伝子の完全なノックアウトがもたらされた。これらのマウスは、ＭＬＤ患者において記載されているものと同様に、ＣＮＳ、ＰＮＳ、腎臓、および肝臓において進行性スルファチド貯蔵を発達させる。しかしながら、貯蔵および関連する表現型は、ヒト患者と比較すると進行が遅く、マウスでは中年（６～１２ヶ月）頃に現れる。スルファチドレベルの増加は、生化学的解析を使用して６ヶ月まで検出することができるが（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）、有意な組織学的スルファチド染色は、１０～１２ヶ月齢までにのみ観察可能である（Ｇｉｅ
ｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。Ａｒｓａ－／－マウスにおいて測定可能な最も一貫した神経学的症状は、歩行パターンの異常（フットプリント分析に基づく）および運動協調の減少（ロータロッド能力によって測定される）（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍａｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｓｔｒｏｏｂａｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）であり、これらは、通常、６～１０ヶ月齢後に現れる。ヒトＭＬＤ患者とは対照的に、Ａｒｓａ－／－マウスのＣＮＳまたはＰＮＳにおいて脱髄は見出されず、このことは、これらの動物に対して観察された驚くほど軽度な表現型および正常な寿命を説明する。
Ｂ．脱髄（悪化）ＭＬＤマウス（ｔｇ／Ａｒｓａ－／－）
遅いスルファチド貯蔵が、Ａｒｓａ－／－マウスにおいて観察された疾患発症の遅延および脱髄の欠如の原因であると仮説を立てた（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。この仮説に取り組むために、脱髄を示すＭＬＤの遺伝子的に悪化させたマウスモデル（文献では「脱髄ＭＬＤマウス」と称される）を開発した。この系統は、ミエリン産生細胞内に導入遺伝子（ｔｇ）過剰発現ＧＡＬ３ＳＴ１酵素を担持するマウスと、Ａｒｓａ－／－マウスとを交配させることによって作製した。ＧＡＬ３ＳＴ１は、スルファチドの生合成に関与し、二重変異体マウス（ｔｇ／Ａｒｓａ－／－）は、Ａｒｓａ－／－マウスと比較して、それらの組織内に約２倍多くのスルファチドを蓄積する。ｔｇ／Ａｒｓａ－／－マウスは、親アルシアン性（ａｌｃｉａｎｏｐｈｉｌｉｃ）組織学的染色によって検出されたＣＮＳおよびＰＮＳにおけるスルホリピドの貯蔵の増加、神経伝導の障害、ならびにＰＮＳおよびより少ない程度でＣＮＳにおける髄鞘形成の減少を示し（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）、これらのすべてはヒト患者におけるＭＬＤの主要な特徴である。しかしながら、これらの所見の出現は、ヒト患者の疾患進行と比較して遅延し、特徴は、約６ヶ月齢から始まり、成体マウスで顕在化した。具体的には、研究者は、生化学アッセイを使用して、６ヶ月までのスルファチド蓄積を説明し、他のすべての表現型は、１７～２２ヶ月までに生じた。スルファチド貯蔵およびその後の脱髄の遅延は、ｔｇ／Ａｒｓａ－／－マウスにおいて観察された正常な寿命の理由である可能性が高く、これは、ＭＬＤ患者の寿命が短くなったことと対照的である。
Ｃ．新規ＭＬＤマウスモデル
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの薬理活性を、ＭＬＤのインビボおよびインビトロモデルの両方において評価する。インビボモデルについては、新規のＡｒｓａ－／－（＋／－ＡＡＶ－ＰＨ．Ｂ－ＧＡＬ３ＳＴ１）マウスモデルを生成し、公開されたインビボモデル（Ａｒｓａ－／－［単一変異］およびｔｇ／Ａｒｓａ－／－［二重変異］）の利用可能性が限定されることを特徴とする。新しいマウスモデルは、ＭＬＤ患者において観察されたものと同様の表現型、具体的には、歩行異常および運動協調の減少とともに、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、腎臓、および肝臓の細胞におけるスルファチド貯蔵を含む、古典的なＡｒｓａ－／－マウスに匹敵する自然歴を示すことが評価段階にある。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９胚マイクロインジェクションを使用して新しいＡｒｓａ－／－マウス系統を生成した。１１０５ｂｐ～１１３３ｂｐの長さの範囲のエクソン２～４の欠失を有する４匹の始祖を作製した。４匹のすべての始祖を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスと一度交配させ、欠失した対立遺伝子をＦ１世代に正常に伝達した。Ｆ１世代の保因者を、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドに再び異種交配させ、任意の望ましくないオフターゲット編集をさらに希釈した。４匹すべての系統は、４匹のＡｒｓａ－／－マウス系統を生成し、特徴付けるために交配されているＦ２世代の保因者を生じた。最初のＡｒｓａ－／－マウスが誕生した。
利用される遺伝子工学戦略は、いくつかのガイドＲＮＡを使用して１５番染色体に位置
するマウスＡｒｓａ遺伝子を標的とし、エクソン４を介したエクソン２の標的とした欠失を促進する。古典的なＡｒｓａ－／－モデルは、ネオマイシンカセットの相同組換えを使用してヌル対立遺伝子を産生したが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９遺伝子編集は、以前の遺伝子標的化方法よりも少ない時間で、同等の表現型を有する完全なノックアウトを産生することが予想される。
公開されているＡｒｓａ－／－マウスモデルとは異なり、脱髄は、新しいＡｒｓａ－／－マウス系統では観察されることは予測されない。したがって、スルファチド合成酵素である、ガラクトース－３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ－１（ＧＡＬ３ＳＴ１）が過剰発現し、スルファチド貯蔵を増加させる、Ａｒｓａ－／－マウスにおける別のモデルが開発される。スルファチド貯蔵の増加は、古典的なＡｒｓａ－／－マウスモデルと同様に、ＰＮＳにおける脱髄、神経伝導の障害、および麻痺をもたらすはずである。これらの特徴は、ＭＬＤ患者において観察される。ｔｇ／Ａｒｓａ－／－マウスと同様にＧＡＬ３ＳＴ１を過剰発現するマウスも生成して、悪化した条件下で脱髄が観察され得るかどうかを決定する。しかしながら、二重変異体を生成する代わりに、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターを用いて、ＧＡＬ３ＳＴ（ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＧＡＬ３ＳＴ１ｃｏ．ｒＢＧ［ＡＡＶ－ＰＨ．Ｂ．ＧＡＬ３ＳＴ１］）を過剰発現させる。ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂカプシドは、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける全身（ＩＶ）注入後に強固なＣＮＳ指向性を示すため、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂカプシドを選択した（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。このアプローチは、混合された遺伝的背景が、その後、より純粋な遺伝的背景において再現可能ではない、Ｆ２世代における混同された神経行動学的異常を頻繁にもたらすため、異なる遺伝的背景を有する二重トランスジェニックマウスを繁殖させるという問題を回避する。したがって、これらのマウスは、同質遺伝子的背景の追加された実験的利益により、ＣＮＳにおいてＧＡＬ３ＳＴ１を高レベルで過剰発現することが予測される。
自然歴試験は、以下の表現型基準（疾患の重症度の増加順に列挙）に従って実施した。
１．ＣＮＳおよび末梢組織における残留ＡＲＳＡ活性の減少または欠如の実証；
２．ＣＮＳ、ＰＮＳ、腎臓、および肝臓におけるスルファチド貯蔵の実証；
３．組織病理学における脱髄の実証；
４．脱髄と一致する行動表現型の実証。
Ａｒｓａ－／－マウスまたはＡＡＶ－ＰＨ．Ｂ．ＧＡＬ３ＳＴ１媒介性悪化Ａｒｓａ－／－マウスのいずれかまたは両方を、薬理学およびＭＥＤ試験のために選択する。決定は、上記の表現型基準の最大数を満たすことに加えて、どのマウス系統が、Ａｒｓａ＋／－マウス保因者の交配からＡｒｓａ－／－マウスの最高の繁殖能力およびパーセンテージを示すかに基づく。
およそ８週齢のマウスを、マウス飼育施設に対する１週間の順化後、自然歴試験に登録する。系統当たり少なくとも６匹のＡｒｓａ－／－雄（Ｍ）および６匹のＡｒｓａ－／－雌（Ｆ）を評価し、野生型同腹仔と比較する。マウスを、（Ｇｕｙｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０）から適応したスコアリングシステムを使用して、運動失調の発症について毎週モニタリングする。動物の体重を測定し、運動協調（ロータロッドアッセイ）、握力、および感覚障害の兆候（ホットプレートアッセイ）について毎月評価する。ＣａｔＷａｌｋ（商標）歩行分析システムを使用して、２ヶ月毎に歩行分析を完了する。６ヶ月齢で、各コホートのサブセット（Ａｒｓａ－／－：Ｎ＝３Ｍ、３Ｆ；野生型：Ｎ＝１Ｍ、１Ｆ）を剖検し、脳、腎臓、肝臓、座骨神経、および脊髄におけるＡＲＳＡ酵素活性、脱髄、およびスルファチド貯蔵について評価する。残りのマウスを、より長い期間追跡して、これらの系統の自然歴を完全に特徴付け、遅発性脱髄の可能性をモニタリングする。
脱髄表現型の遅延または不在が観察され得る。各系統のマウスのサブセットを、スルファチド合成酵素ＧＡＬ３ＳＴ１（ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＧＡＬ３ＳＴ１ｃｏ．ｒＢＧ）をコードするＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢベクターのＩＶボーラスで処置して、スルファチド合成速度を増加させる。ｔｇ／Ａｒｓａ－／－マウスと同様に、ＧＡＬ３ＳＴ１の過剰発現により、ヒトにおいて観察される疾患進行とより類似した時間経過に沿った脱髄を示す、より急速な貯蔵過負荷および悪化した疾患モデルを作成し得る。自然歴試験におけるＡｒｓａ－／－マウスと並行して、すべてのマウスに対して臨床観察を毎週行い、全体的な健康および運動失調をモニタリングする。各コホートからのマウスのサブセット（Ａｒｓａ－／－：Ｎ＝３Ｍ、３Ｆ；Ａｒｓａ＋／＋：Ｎ＝１Ｍ、１Ｆ）を６ヶ月齢で剖検して、スルファチド貯蔵および脱髄を評価する。
実施例６－Ａｒｓａ－／－マウスにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの最小有効用量（ＭＥＤ）の特定
実施例５で特定されたＡｒｓａ－／－マウス系統を選択して、ＩＣＶ投与ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧのＭＥＤ試験を実施する。注射時の年齢、生体内パラメータ、および剖検時の年齢は、他の実施例に定義される最も関連性の高い疾患バイオマーカーに基づく。
ＭＥＤ試験は、ＧＬＰ ＮＨＰ毒性試験用に製造された毒性学的ベクターロットを使用して実施する。この試験は、４つの用量レベルを評価して、ＭＥＤ、薬理、および組織病理（有効性および安全性）を決定する。用量レベルは、実施例２および３の野生型マウスにおけるパイロット用量範囲ならびにヒトに合わせてスケーリングしたときの最大実行可能用量に基づいて選択した。ＩＣＶ注入の年齢は、自然歴の試験結果に基づいて決定する。動物を、注入後の適切な時点で屠殺して、薬理および有効性の読み出しを取得し、ＩＴＦＦＢを投与した年齢を一致させた対照と比較する。剖検時点は、実施例５に基づいて決定し、公開されているＡｒｓａ－／－モデルの自然歴に基づいて、マウスが約５～１２ヶ月齢であるときに実施し得る。しかしながら、剖検時点は、自然歴試験の結果および測定されるエンドポイントに基づいて延長され得る。有効性エンドポイントは、実施例５の結果に基づいて定義され、運動失調スコアリング、体重、ロータロッドでの運動協調、およびホットプレート上の感覚機能などのアッセイを含み得る。満たす神経行動学的エンドポイントがない場合、ＡＲＳＡ活性レベル、スルファチド貯蔵、および組織病理が、ＭＥＤを定義するために使用される基準であり得る。
実施例５は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ媒介性ＧＡＬ３ＳＴ１過剰発現（スルファチド過剰負荷）を使用して信頼できる悪化モデルを特定し、悪化したマウスのための１つの研究群を各用量レベルで実施する。これらのマウスは、試験０日目にＩＶ投与用量のＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ．ＧＡＬ３ＳＴ１およびＩＣＶ投与用量のＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧを同時に受けて、交互投与で生じ得る交差反応性ＮＡｂの産生を回避する。
Figure 2022531861000014
Figure 2022531861000015
Figure 2022531861000016
実施例７－概念実証薬理学的試験のための患者由来の細胞を使用したインビトロ疾患モデルの特徴付け。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧのインビボ研究を補完するために、ＡＡＶ媒介性ＡＲＳＡ遺伝子送達の有効性を、インビトロ疾患モデルを使用して評価する。最近、欠陥のあるグリアおよびニューロンの分化、ならびにリソソーム区画の拡大、スルファチド貯蔵、酸化ストレス、およびアポトーシスなどのＭＬＤのいくつかの特徴を再現するＭＬＤ患者由来のｉＰＳＣベースのモデルが特徴付けられた（Ｆｒａｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。１つの患者由来の細胞株（ＲＩＫＥＮセルバンク参照ＨＰＳ０２４０）、ならびに２つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＡＲＳＡノックアウトｉＰＳＣクローンを特徴付ける。適切な細胞株を同定する。ＡＡＶベクター投与後の疾患バイオマーカー救出の程度を評価する。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、培養物中で細胞を不十分に形質導入することが知られているため、これらの試験のために、異なるＡＡＶ血清型を使用して、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧであるか、またはそれに類似するＡＲＳＡコードベクターゲノムを送達することができる。
神経前駆細胞段階は、Ｆｒａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）に記載されている酸化ストレスまたは形態変化に関してあらゆる決定的な表現型を示さなかったが、分化細胞（ニューロンおよびオリゴデンドロサイト）は、公開された研究においてより顕著なスルファチド貯蔵表現型を示したため、調査中である。信頼性の高いスルファチド貯蔵により、表現型救出を、ＡＡＶ媒介性ＡＲＳＡ形質導入を使用して試験する。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、培養物中で細胞を不十分に形質導入することが知られているため、異なる血清型のカプシドを使用して、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧであるか、またはそれに類似するＡＲＳＡコードベクターゲノムを送達することができる。
インビボマウスモデル（実施例６）と、ＭＬＤの前述のインビトロモデルのうちの１つ以上との両方からのデータを使用して、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの薬理活性を支持する。
実施例８－非ヒト霊長類における毒性試験。
６～８歳の成体カニクイザルマカクを、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの非ＧＬＰパイロット用量範囲試験において使用した。若年性アカゲザル（１～２歳）を、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの毒性試験のために選択する。便宜上（動物の利用可能性）、２つの異なる種のＮＨＰが使用される。アカゲザルとカニクイザルマカクとの間で、ＡＡＶ ＩＣＭ投与後の形質導入プロファイルに差はない。成体カ
ニクイザルマカクおよび幼若アカゲザルの両方は、類似した解剖学的および生理学的特徴を有し、意図した乳児臨床集団のＣＮＳ解剖学的構造を再現し、臨床ＲＯＡ（ＩＣＭ）を使用して治療することができる。解剖学的構造およびＲＯＡの類似性から、代表的なベクター分布および形質導入プロファイルを得ることができ、これにより、マウスにおいて可能な毒性の評価よりも、正確な毒性の評価が可能になる。加えて、げっ歯類モデルよりもＮＨＰにおいてより厳密な神経学的評価が行われ、より敏感なＣＮＳ毒性の検出が可能になる。
完了した非臨床薬理学的試験により、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧのＩＣＶ投与後、健常なマウスの脳におけるニューロンおよびミエリン産生オリゴデンドロサイトの両方の形質導入および／または交差補正を介したＡＲＳＡ酵素のＡＡＶ媒介送達の可能性が示された。臨床経路（ＩＣＭ）を介してＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧを投与したカニクイザルマカクにおける薬理学的試験により、治療後の最初の１４日間に、ＣＳＦにおけるＡＲＳＡ活性が少なくとも２倍の内因性レベルで増加したことが示された。脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡＲＳＡ活性の正常レベルの達成は、本発明者らの意図した患者集団（早発型ＭＬＤ患者）に対する良好な転帰と相関するため（Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧは、ＭＬＤ患者のＣＳＦに治療レベルのＡＲＳＡを送達する可能性を有する。さらに、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ投与後、少なくとも４２日の間、ＰＮＳ（脊髄運動ニューロンおよび後根神経節［ＤＲＧ］）への突起を有する細胞を含む、ＡＲＳＡを発現する形質導入および／または交差補正細胞は、脳および脊髄全体にわたって広範に存在することが示される。したがって、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧは、ＭＬＤ患者において影響を受けるＣＮＳおよびＰＮＳのニューロンおよび髄鞘形成細胞の両方に、分泌されるＡＲＳＡ酵素の長期間持続する供給源を提供する可能性を有する。
この薬理試験を延長し、安全性データを収集するために、意図した臨床投与経路（ＲＯＡ）を使用して、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの１８０日間のＧＬＰ準拠毒性試験を幼若アカゲザルにおいて実施する。他のＡＡＶベクターのアカゲザルのＣＳＦへの髄腔内（ＩＴ）送達は、注入の２～３週間後に導入遺伝子発現のピークをもたらし、続いて９０日までに導入遺伝子発現の安定したプラトーをもたらした。本発明者らは、カニクイザルマカクにおいて、ＩＣＭ投与の１４日後にＡＲＳＡ発現のピークが観察されることを示した。したがって、１８０日の時点は、導入遺伝子産物への最大曝露期間の間に生じるあらゆる毒性を評価するのに十分である。１８０日にわたる評価はまた、注入手順による即時毒性、または試験物質に対する先天的炎症反応、ならびにベクターカプシドまたは導入遺伝子産物に対する適応免疫応答を検出するのに適切である。
ＩＣＭ投与後のＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの毒性を調査するために、１８０日間のＧＬＰ準拠安全性試験を、幼若アカゲザル（約１～２歳）において実施する。ＡＡＶのＩＣＭ投与後、分泌された導入遺伝子産物が安定した定常レベルに到達するのに十分な時間を与えるために、１８０日間の評価期間が選択された。投与年齢を、ＣＮＳ解剖学的構造に関して本発明者らの意図した乳児集団を表すように選択した。試験設計を以下の表に概説する。
Figure 2022531861000017
Figure 2022531861000018
幼若アカゲザルは、以下のＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの３つの用量レベルのうちの１つを受ける：３．０×１０１２ＧＣ、１．０×１０１３ＧＣ、または３．０×１０１３ＧＣ（用量当たりＮ＝３）。さらなる幼若マカク（Ｎ＝２）を、対照としてビヒクル（ＩＴＦＦＢ）を投与する。ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ用量レベルは、脳質量によってスケーリングされた場合、ＭＥＤ試験において評価されるものと同等であるように選択する（マウスでは０．４ｇ、アカゲザルでは９０ｇを想定）。ＮＨＰは、記載されているものと同じベクター送達デバイスを使用して投薬される。
ベースラインの神経学的検査、臨床病理学（鑑別を伴う細胞数、臨床化学、および凝固パネル）、ＣＳＦ化学、およびＣＳＦ細胞診が行われる。ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧまたはビヒクル投与後、動物を苦痛および異常行動の兆候について毎日モニタリングする。血液およびＣＳＦ臨床病理評価ならびに神経学的検査は、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧまたはビヒクル投与後３０日間、およびその後３０日間毎に実施する。ベースラインおよびその後の３０日毎の時点で、抗ＡＡＶｈｕ６８のＮＡｂならびにＡＡＶｈｕ６８およびＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ導入遺伝子産物に対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって評価する。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧまたはビヒクル投与の９０日後、動物（１～４群）の５０％を安楽死させ、組織病理学的分析を、脳、脊髄、ＤＲＧ、末梢神経、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、生殖器官、副腎、およびリンパ節を含むが、これらに限定されない、組織の包括的リストで実施する。臓器を、必要に応じて秤量する。リンパ球を、循環区画（末梢血単核細胞）から採取し、ＣＮＳ流入リンパ節を、剖検時にこれらの
臓器内のカプシドおよび導入遺伝子産物の両方に反応するＴ細胞の存在について評価する。１～４群を安楽死させてから９０日後（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧまたはビヒクル投与から１８０日後）、残りの動物（５～８群）を安楽死させ、上記のように組織病理学的分析を実施する。
ベクター生体内分布について組織、ＣＳＦ、および血清を採取し、ベクター排出を評価するために尿および糞便に加えて保管する。組織試料中のｑＰＣＲは、幼若マカクにおける同じカプシドおよびＲＯＡを使用して評価した。
ベクターのＩＣＭ投与により、ＣＳＦ区画内で即時のベクター分布がもたらされ、有効性および毒性の両方は、ＣＮＳベクター曝露に関連する。したがって、用量を、脳質量によってスケーリングし、ＣＳＦ区画のサイズの近似値を提供する。用量変換は、成体マウスでは脳質量０．４ｇ（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、幼若アカゲザルでは９０ｇ（Ｈｅｒｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、および４～１２ヶ月齢のヒト乳児では８００ｇ（Ｄｅｋａｂａｎ，１９７８）に基づく。以下の表に、同等のヒト用量を示す。
Figure 2022531861000019
実施例９－非臨床アデノ随伴ウイルス試験における感覚ニューロン毒性。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧ毒性試験において現れるＤＲＧ感覚ニューロンの最小から軽度の無症状性の変性を低減させるために、ｄｒｇ脱標的化ｍｉＲＮＡ配列を含むベクターゲノムを構築する。ｒＡＡＶベクターゲノムは、５’から３’まで、ＣＢ７プロモーター、操作されたｈＡＲＳＡコード配列、４つの連続したｍｉＲＮＡ１８３（ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡの配列、配列番号２０を有する）として構築され、これらは、スペーサーによって分離され、各スペーサーは、（Ａ）ＧＧＡＴ；（Ｂ）ＣＡＣＧＴＧ；または（Ｃ）ＧＣＡＴＧＣ、およびｒＢＧポリＡのうちの１つ以上から独立して選択される。このベクターゲノムは、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｍｉＲＮＡ１８３．ｒＢＧと称され、一方、このベクターゲノムおよびＡＡＶｈｕ６８カプシドを含むｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｍｉＲＮＡ１８３．ｒＢＧと称される。このベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクターの産生は、実施例１に記載される方法と同様に実施する。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｍｉＲＮＡ１８３．ｒＢＧの有効性および毒性を、実施例２～８および１０に記載される方法およびモデルを使用して試験する。
実施例１０－初めてのヒトでの試験。
ＡＲＳＡ酵素欠損によって引き起こされる早発型（後期乳児または早期若年性）ＭＬＤを有する小児患者（４ヶ月齢以上）において、単回ＩＣＭ注入によって投与されるＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの第１／２相、多施設、非盲検、単群、用量漸増試験を実施する。安全性および耐容性、薬力学、ならびに臨床有効性を２年間にわたっ
て評価し、すべての対象をＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの投与後５年間にわたって経過観察して、安全性および耐容性、薬力学、疾患進行、ならびに臨床転帰の長期評価を行う。
本研究は、およそ－３５日目～－１日目までの各潜在的な対象の適格性を決定するためのスクリーニング段階からなる。対象の適格性および子供を試験に参加させることへの親／保護者の意思を確認した後、対象は、脳ＭＲＩ、ＣＳＦ採取のためのＬＰ、採血、採尿、バイタル、ＥＣＧ、身体検査、神経学的検査、および臨床評価を含む、ベースライン評価を受ける。ベースライン評価は、－１日目および０日目に行われ、適格性は、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの投与前のベースラインで再確認される。
治療段階中、対象は０日目の朝に入院する。対象は、０日目に単回ＩＣＭ用量のＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧを受け、観察のために、投薬後、少なくとも２４時間病院に留まる。その後の治験来院は、投与後７日目、１４日目、３０日目、３ヶ月目、および６ヶ月目に行われ、続いて、投薬後の最初の２年間は６ヶ月毎に行われる。長期経過観察（ＬＴＦＵ）来院は、さらに３年間、１２ヶ月毎の頻度で、投薬後５年間にわたって行われる。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの単回用量は、以下に示す用量レベルのうちの１つで投与される。
コホート１（低用量）：３人の適格な対象（対象＃１～３）が順次登録され、第１の対象と第２の対象との間に４週間の安全性観察期間を伴って、低用量のＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧが投与される。ＳＲＴが観察されない場合、すべての利用可能な安全性データは、コホート１の第３の対象がＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧを投与された４週間後に、安全委員会によって評価される。
コホート２（高用量）：３人の適格な対象（対象＃４～６）が順次登録され、第４の対象と第５の対象との間に４週間の安全性観察期間を伴って、高用量のＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧが投与される。ＳＲＴが観察されない場合、安全委員会は、コホート１の対象からの安全性データを含む、対象＃６がＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧを投与されてから４週間後に利用可能なすべての安全性データを評価する。
コホート３（ＭＴＤ、最大許容用量）：安全委員会による肯定的推奨により、６人の追加の対象（対象＃７～１２）が登録され、ＭＴＤで単回ＩＣＭ用量のＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧが投与される。このコホートの対象についての投薬は、各対象間の４週間の安全性観察期間とのずれはない。
高用量コホートまたは低用量コホートのいずれかにおける９人の対象の総登録者、および（すべての用量にわたって）合計１２人の対象が登録される。ヒト対象のために選択した高用量が、ＮＨＰにおける等価ＭＴＤの３０～５０％であるように、安全域が適用される。低用量は、動物試験において等価スケーリングされたＭＥＤを超える用量である限り、典型的には、選択した高用量よりも２～３倍低い。耐容されるという理解に基づいて、より高い用量が有利であることが期待される。
早発型ＭＬＤは、症状が現れると、非常に急速な疾患経過を特徴とするため、試験は、コホート１（低用量）およびコホート２（高用量）の最初の患者の投薬から３０日後、その対象に対する治験責任医師のベネフィット－リスク評価に基づいて、対象の同時登録を可能にするように実施される。この場合、コホート内の第２の患者と第３の患者との間の
投薬期間は、急性毒性、アレルギー反応、および処置関連事象について患者を観察するための少なくとも２４時間である。疾患の希少性を考慮すると、２人の対象が治療のために同時に現れる確率は低いと考えられる。提案されたアプローチに対する根拠は、患者が急速な疾患の進行を経験したために治療期間を逃すリスクが、コホートの次の患者に投薬される前の長期の安全性経過観察の潜在的な利益を上回ることである。患者が登録から治療までの間に実質的な疾患進行を経験するこのようなシナリオは、ＨＳＣ－ＧＴで治療されたいくつかの早発型のＭＬＤ患者で観察された不良転帰の考えられる原因として挙げられており（Ｓｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、急速な疾患進行のリスクがある患者の迅速な特定および治療の必要性を強調した。
ＡＲＳＡ酵素欠損によって引き起こされる早発型（後期乳児または早期若年性）ＭＬＤを有する小児患者（４ヶ月齢以上）は、最も高い満たされていないニーズを有する集団を表す。本発明者らの提案されたＦＩＨ試験に登録されたこれらのＭＬＤ患者は、０／０（検出可能な機能的酵素が産生されない２つのヌルＡＲＳＡ対立遺伝子）または０／Ｒ（１つのヌルＡＲＳＡ対立遺伝子および少量のスルファチドをまだ分解することができる残留機能的活性を有する酵素をコードする１つの「残留」ＡＲＳＡ対立遺伝子（Ｒ）についてヘテロ接合性）遺伝子型を有し得る。これらの患者は、運動障害および認知障害の両方の急速かつ予測可能な衰弱を伴う破壊的な疾患の経過を示し、疾患の発症から数年以内に死に至る。疾患修飾治療は、ほとんどの早発患者には利用可能ではない。造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、この集団に利益をもたらさないが、遺伝子療法（ＨＳＣ－ＧＴ）による造血幹細胞は、早発集団の少数を構成する発症前患者にのみ有効な治験中の治療である。
主要エンドポイントは、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの安全性および耐容性を評価する。二次または探索的エンドポイントには、薬物動態および薬力学的特性（導入遺伝子発現、バイオマーカー活性、およびイメージングパラメータ）および臨床有効性転帰（粗大および微細運動機能、認知および言語発達、神経学的検査所見、行動およびマイルストーン発達、ならびに親が報告した転帰および生活の質の評価）が含まれる。疾患進行の予防または安定化を測定するために、有効性エンドポイントおよび経過観察のタイミングを選択した。
したがって、胆嚢の病理は、安全性シグナルおよび探索的エンドポイントの両方として、本発明者らの提案したＦＩＨ試験でモニタリングされる。
以下の評価を通して、単回ＩＣＭ用量の投与後の２４ヶ月にわたって、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの安全性および耐容性を評価すること：ＡＥおよびＳＡＥ、バイタルサインおよび身体検査、神経学的検査、心電図（ＥＣＧ）、感覚神経伝導検査（ＤＲＧ毒性評価用）、臨床検査（血清化学、血液学、凝固検査、肝機能検査［ＬＦＴ］、尿検査、ならびにＣＳＦ化学および細胞診）、ならびに／またはベクターおよび導入遺伝子産物の免疫原性。
異染性白質ジストロフィーのための粗大運動機能分類（ＧＭＦＣ－ＭＬＤ）によって測定される、治療後２年間にわたる粗大運動機能に対するＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの効果を評価すること。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの有効性についてのさらなる測定には、以下が含まれる。
以下のエンドポイントに基づいて、単回ＩＣＭ用量の投与後の２年間にわたって、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡＣＯ．ＲＢＧの薬物動態および生物学的活性を評価すること：ＣＳＦ中および血清中のＡＲＳＡのレベル。
以下によって測定される、単回ＩＣＭ用量の投与後の２年間にわたるＡＡＶ．ＣＢ７．
ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの有効性を評価すること：粗大運動機能測定（ＧＭＦＭ）、神経認知（Ｂａｙｌｅｙ乳幼児発達検査［ＢＳＩＤ－ＩＩＩ］、児童向けＷｅｃｈｓｌｅｒ式知能検査、第５版［ＷＩＳＣ－Ｖ］によって測定される合計知能指数［ＩＱ］およびサブドメインＩＱ）、生存率、神経学的臨床検査（ＮＣＥ）、尺骨、深腓骨、正中、腓腹神経のＮＣＶ、運動マイルストーンを維持または獲得する子供の達成時の年齢、喪失時の年齢、および割合によって評価される運動マイルストーン達成（世界保健機関［ＷＨＯ］基準によって定義される）。
以下によって測定される、単回ＩＣＭ用量の投与後の２年間にわたるＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの有効性をさらに評価すること：発作日記によって捕捉される発作の発症年齢および頻度、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度、第３版（Ｖｉｎｅｌａｎｄ－ＩＩＩ）、Ｌａｎｓｋｙパフォーマンス指数、小児の生活の質調査（ＰｅｄｓＱＬおよびＰｅｄｓＱＬ－ＩＳ）、介護者／親の生活の質。
以下によって測定される、単回ＩＣＭ用量の投与後の２年間にわたるＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧの薬力学的効果をさらに評価すること：ＭＲＩによって測定される、ＣＮＳの髄鞘形成（脱髄負荷およびパターン）および白質萎縮、プロトン磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）によって測定される、神経代謝産物であるＮ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）、ミオイノシトール（ｍＩ）、コリン（Ｃｈｏ）および乳酸塩（Ｌａｃ）レベル、ＣＳＦスルファチドおよびリソ－スルファチドレベル、視覚誘発電位（ＶＥＰ）、脳幹聴覚誘発反応（ＢＡＥＲ）、胆嚢壁肥厚の超音波評価。
選択基準には以下が含まれる：
（ｉ）正常範囲未満のＡＲＳＡ活性に基づくＭＬＤの文書化された生化学的診断および分子診断、ならびに既知または新規変異のいずれかの２つの疾患を引き起こすＡＲＳＡ対立遺伝子の同定。新規の変異の場合、２４時間の採尿は、スルファチドレベルの上昇を示さなければならない。
（ｉｉ）４ヶ月齢以上。
（ｉｉｉ）発症前の対象は、以下のいずれかを有しなければならない。
症状の発症年齢が７歳未満のＭＬＤに罹患した年長の兄弟姉妹（発端者）。対象は、発端者の症状発症年齢およびそれらのＡＲＳＡ遺伝子型に基づいて、以下のように、後期乳児、早期若年性、または後期乳児／早期若年性の中間に分類される：後期乳児：３０ヶ月齢以下の発端者における症状発症および遺伝子型は典型的に０／０；早期若年性：典型的に０／Ｒの遺伝子型を有する３０ヶ月齢超かつ７歳未満の発端者における症状発症；後期乳児／早期若年性の中間：７歳未満の発端者における症状発症、しかし後期乳児もしくは早期若年性として発端者を明確に特徴付けることはできない
または
ＭＬＤが、年長の罹患した兄弟姉妹を伴わない発症前の子供において診断される場合（例えば、偶発的にまたは利用可能な場合、新生児スクリーニングを介して）、利用可能なデータの全体は、対象が、遺伝子療法から利益を受ける可能性が高いＭＬＤの早発型バリアントを有することを強く示唆し、かつ対象が７歳未満である場合、対象は、治験委託者の医療モニターによる考察および承認後に適格であるとみなされ得る。
（ｉｖ）症候性後期乳児対象は、以下によって顕在されるＭＬＤの軽度の臨床的または神経学的症状を有するならば、適格である：
自立した起立もしくは歩行の達成の遅れなどの運動マイルストーンの予測される達成の遅延（ＷＨＯマイルストーン範囲で９５パーセンタイル超）
および／または
限定されないが、緊張、痙攣、または反射亢進の増加を含む、ＮＣＥでの軽度の異常。対象が自立した歩行を達成している場合、対象が少なくとも１０歩を自立して歩くことができるならば、軽度の運動失調の兆候は許容される。
（ｖ）症候性早期若年性対象は、限定されないが、緊張、痙攣、反射亢進の増加、または歩行のために補助を必要としない軽度の歩行異常を含む、ＮＣＥで軽度／中等度の異常を
有する場合、適格である。
（ｖｉ）親／保護者は、インフォームドコンセントに署名し、日付を記入する。
除外基準には以下が含まれる：
達成された運動マイルストーンの退行の証拠。
歩行のための補助を必要とする歩行可能な対象。
７０未満の合計ＩＱに基づく認知障害を有するＥＪ ＭＬＤ対象。
治験責任医師の見解では、試験結果の解釈を混乱させる可能性のあるＭＬＤに起因しない、いずれかの臨床的に有意な神経認知障害があること。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはＣ型肝炎（ＨｅｐＣ）の試験結果が陽性の患者であること。
治験責任医師の見解では、対象を過度のリスクにさらす可能性がある、または治験薬の安全性もしくは有効性の結果の評価および解釈を妨げる可能性がある、いずれかの現在または以前の状態または身体検査または臨床検査所見があること。
透視イメージングに対する禁忌を含む、ＩＣＭ投与手順に対するいずれかの禁忌があること。
ＭＲＩまたはＬＰに対するいずれかの禁忌があること。
治験薬を用いた任意の他の臨床試験への登録があり、スクリーニング前の４週間以内であるか、またはその臨床試験で使用された治験薬の５半減期以内であるかのいずれか長い方の期間内であること。
以前に同種異系ＨＳＣＴを受け、ドナー起源の残存細胞の証拠を有すること。
以前の遺伝子療法があること。
投与経路および手順は、以下に詳細に記載される。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧは、大槽内へのリアルタイムのＣＴガイド下の後頭下注入を介して、０日目に入院対象に単回用量として投与される。
０日目に、５．６ｍＬの適切な力価でＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧを含むシリンジが、試験に関連する治験薬剤部（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ）によって調製され、処置室に送達される。
治験薬の投与前に、対象は、麻酔され、挿管され、無菌技術を使用して、注入部位が用意され、覆布がかけられる。ＬＰを実施して、所定の体積のＣＳＦを除去し、その後、ヨード造影剤を髄腔内（ＩＴ）注入して、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助する。静脈内（ＩＶ）造影剤は、ＩＴ造影剤の代替物として、針穿刺の前または針穿刺中に投与され得る。ＩＶまたはＩＴ造影剤を使用するかどうかの決定は、介入医の判断に委ねられる。ＣＴ透視ガイド下、脊髄針（２２～２５Ｇ）を大槽内に進める。針の配置を補助するために、より大きな誘導針を使用してもよい。針の配置を確認した後、エクステンションセットを脊椎針に取り付け、ＣＳＦで充填する。介入医の裁量で、造影剤を含有するシリンジを、エクステンションセットに接続してもよく、少量注入することで、大槽内に針が配置されていることを確認することができる。針の配置を確認した後、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＡＲＳＡｃｏ．ｒＢＧを含むシリンジをエクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を１～２分かけてゆっくりと注入し、５．０ｍＬの容量を送達する。
有害事象（ＡＥ）および重篤な有害事象（ＳＡＥ）の収集、身体検査および神経学的検査、バイタルサイン、臨床検査（血清化学、血液学、凝固、ＬＦＴ、尿検査）、ＥＣＧ、神経伝導試験、ならびにＣＳＦ細胞診および化学（細胞数、タンパク質、グルコース）を含む安全性評価を実施する。コホート１の最初の３人の対象の後の安全性評価、およびコホート２の最初の３人の対象の後の安全性評価を実施する。
二次エンドポイントおよび探索的エンドポイントについて統計的比較を実施する。各時点での測定値は、各対象のベースライン値、ならびに同齢の健康な対照からのデータ、および各エンドポイントで利用可能な場合は同等のコホート特性を有するＭＬＤ患者からの自然歴データと比較される。
すべてのデータは、対象のデータリストに表示される。カテゴリー変数は、頻度およびパーセンテージを使用して要約され、連続変数は、記述統計量（非見逃し観察の数、平均値、標準偏差、中央値、最小値、および最大値）を使用して要約される。グラフ表示は、適切に提示される。
実施例１１－ＡＡＶｈｕ６８＋脱アミド化。
ＡＡＶｈｕ６８を修飾について分析した。簡潔には、ＡＡＶｈｕ６８ベクターは、この研究に関連していないベクターゲノムを使用して産生され、各々は、２９３細胞における従来の三重トランスフェクション方法を使用して産生された。これらの技術の一般的な説明については、例えば、Ｂｅｌｌ ＣＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＡＡＶ９ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｕｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１：２４２７－２４３５。簡潔には、ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接するパッケージ化される配列をコードするプラスミド（ニワトリβ－アクチンプロモーターから発現される導入遺伝子、イントロン、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリＡ）を、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドと、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄΔＦ６）とを用いたＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってパッケージングした。得られたＡＡＶウイルス粒子は、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用して精製し、濃縮し、後で使用するために凍結することができる。
変性およびアルキル化：解凍したウイルス調製物（タンパク質溶液）１００μｇに、２μｌの１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）および２μｌの８Ｍ塩酸グアニジン（ＧｎｄＨＣｌ）を添加し、９０℃で１０分間インキュベートする。溶液を室温まで冷却し、次いで、調製したばかりの１Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を５μｌ添加し、暗所で、室温で３０分間インキュベートする。３０分後、１μｌの１ＭのＤＴＴを添加することによって、アルキル化反応をクエンチする。
消化：最終ＧｎｄＨＣｌ濃度を８００ｍＭに希釈する量で、変性タンパク質溶液にｐＨ７．５～８の２０ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加する。トリプシン対タンパク質の比率が１：２０になるようにトリプシン溶液を加え、３７℃で一晩インキュベートする。消化後、ＴＦＡを最終濃度が０．５％になるように添加し、消化反応をクエンチした。
質量分析：約１マイクログラムの組み合わせた消化混合物を、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析する。ＬＣは、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行われる。移動相Ａは、０．１％ギ酸を含むＭｉｌｌｉＱ水である。移動相Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルである。１５分間にわたって４％Ｂ～６％Ｂへ、次いで、２５分間（合計４０分間）で１０％Ｂへ、その後４６分間（合計８６分間）で３０％ＢへとＬＣ勾配を実行した。試料を直接カラムにロードする。カラムサイズは、７５ｃｍ×１５μｍの内径であり、２ミクロンのＣ１８媒体（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ）が充填される。ＬＣは、ソースを使用したＮａｎｏｆｌｅｘエレクトロスプレーイオン化を介して、四重極－オービトラップ質量分析器（Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインターフェースされる。カラムを３５℃まで加熱し、２．２ｋＶのエレクトロスプレー電圧を印加する。
質量分析器は、上位２０個のイオンからタンデム質量スペクトルを取得するようにプログラムされている。最大ＭＳ分解能は１２０，０００、ＭＳ／ＭＳ分解能は３０，０００。正規化された衝突エネルギーは３０、自動ゲイン制御は１ｅ５、最大充填ＭＳは１００ｍｓ、最大充填ＭＳ／ＭＳは５０ｍｓに設定されている。
データ処理：質量分析器の生データファイルをＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。簡潔には、すべての検索は、１０ｐｐｍの前駆体質量許容差（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、５ｐｐｍの断片質量許容差（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、トリプシン切断（ｔｒｙｐｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）、最大１個の未切断（ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）、システインアルキル化の固定修飾（ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、メチオニン／トリプトファンの酸化、アスパラギン／グルタミンの脱アミド化、リン酸化、メチル化、およびアミド化の可変修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を必要とした。
以下の表では、Ｔは、トリプシンを指し、Ｃは、キモトリプシンを指す。
Figure 2022531861000020
Figure 2022531861000021
Figure 2022531861000022
ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質の場合、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって７０％超の脱アミド化レベルを日常的に示し、
ほとんどの場合９０％超である。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
成体アカゲザルに、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｒＢＧ（３．００×１０１３ＧＣ）をＩＣＭ投与し、２８日後に剖検して、ベクターの形質導入を評価した。脳の広範な領域でＡＡＶｈｕ６８の形質導入が観察された。したがって、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＣＮＳにおけるクロスコレクション（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）の可能性を提供する。
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ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ ｆａｉｌｓ ｔｏ ｌｅａｄ ｔｏ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５（３）：２８７－９１．
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Ｄｅｖｅｒｍａｎ Ｂ．Ｅ．，Ｐｒａｖｄｏ Ｐ．Ｌ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｂ．Ｐ．，
Ｋｕｍａｒ Ｓ．Ｒ．，Ｃｈａｎ Ｋ．Ｙ．，Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ．，Ｗｕ Ｗ．Ｌ．，Ｙａｎｇ Ｂ．，Ｈｕｂｅｒ Ｎ．，Ｐａｓｃａ Ｓ．Ｐ．，＆Ｇｒａｄｉｎａｒｕ Ｖ．（２０１６）．”Ｃｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ
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Ｄｉｎｇ Ｘ．Ｑ．，Ｂｌｅｙ Ａ．，Ｋｏｈｌｓｃｈｕｔｔｅｒ Ａ．，Ｆｉｅｈｌｅｒ Ｊ．，＆Ｌａｎｆｅｒｍａｎｎ Ｈ．（２０１２）．”Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｏｎ ａｎ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐａｔｉｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｏｎｇｏｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．”Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ．１５８ａ（１）：２５７－６０．
Ｄｏｎｓａｎｔｅ Ａ．，Ｖｏｇｌｅｒ Ｃ．，Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｊ．Ｍ．，Ｂａｒｋｅｒ Ｊ．，Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ－Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｍ．，Ｄａｌｙ Ｔ．，＆Ｓａｎｄｓ Ｍ．Ｓ．（２００１）．”Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｏｄｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｒＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１７）：１３４３－６．
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Ｅｌｌｉｎｗｏｏｄ Ｎ．Ｍ．，Ａｕｓｓｅｉｌ Ｊ．，Ｄｅｓｍａｒｉｓ Ｎ．，Ｂｉｇｏｕ Ｓ．，Ｌｉｕ Ｓ．，Ｊｅｎｓ Ｊ．Ｋ．，Ｓｎｅｌｌａ Ｅ．Ｍ．，Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ｅ．Ｅ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｃ．Ｂ．，Ｒａｏｕｌ Ｓ．，Ｊｏｕｓｓｅｍｅｔ Ｂ．，Ｒｏｕｘ Ｆ．，Ｃｈｅｒｅｌ Ｙ．，Ｌａｊａｔ Ｙ．，Ｐｉｒａｕｄ Ｍ．，Ｂｅｎｃｈａｏｕｉｒ Ｒ．，Ｈｅｒｍｅｎｉｎｇ Ｓ．，Ｐｅｔｒｙ Ｈ．，Ｆｒｏｉｓｓａｒｔ Ｒ．，Ｔａｒｄｉｅｕ Ｍ．，Ｃｉｒｏｎ Ｃ．，Ｍｏｕｌｌｉｅｒ
Ｐ．，Ｐａｒｋｅｓ Ｊ．，Ｋｌｉｎｅ Ｋ．Ｌ．，Ｍａｉｒｅ Ｉ．，Ｖａｎｉｅｒ
Ｍ．Ｔ．，Ｈｅａｒｄ Ｊ．Ｍ．，＆Ｃｏｌｌｅ Ｍ．Ａ．（２０１１）．”Ｓａｆｅ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ
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Ｆｅｒｌａ Ｒ．，Ａｌｌｉｅｇｒｏ Ｍ．，Ｍａｒｔｅａｕ Ｊ．Ｂ．，Ｄｅｌｌ’Ａｎｎｏ Ｍ．，Ｎｕｓｃｏ Ｅ．，Ｐｏｕｉｌｌｏｔ Ｓ．，Ｇａｌｉｍｂｅｒｔｉ Ｓ．，Ｖａｌｓｅｃｃｈｉ Ｍ．Ｇ．，Ｚｕｌｉａｎｉ Ｖ．，＆Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ Ａ．（２０１７）．”Ｎｏｎ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ ＡＡＶ２／８ ｖｅｃｔｏｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｔｙｐｅ ＶＩ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．６：１４３－１５８．
Ｆｌａｎｉｇａｎ Ｋ．（２０１８）．Ｖｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏａｔｅ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．ＡＳＧＣＴ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．
Ｆｏｕｓｔ Ｋ．Ｄ．，Ｎｕｒｒｅ Ｅ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｃ．Ｌ．，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ａ．，Ｃｈａｎ Ｃ．Ｍ．，＆Ｋａｓｐａｒ Ｂ．Ｋ．（２００９）．”Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ＡＡＶ９ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｎｅｏｎａｔａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．
”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（１）：５９－６５．
Ｆｒａｔｉ Ｇ．，Ｌｕｃｉａｎｉ Ｍ．，Ｍｅｎｅｇｈｉｎｉ Ｖ．，Ｄｅ Ｃｉｃｃｏ Ｓ．，Ｓｔａｈｌｍａｎ Ｍ．，Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ Ｍ．，Ｇｒｏｓｓｉ Ｓ．，Ｆｉｌｏｃａｍｏ Ｍ．，Ｍｏｒｅｎａ Ｆ．，Ｍｅｎｅｇｏｎ Ａ．，Ｍａｒｔｉｎｏ Ｓ．，＆Ｇｒｉｔｔｉ Ａ．（２０１８）．”Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｂａｓｅｄ ｍｏｄｅｌｓ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｇｌｉａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．９（６）：６９８．
Ｆｕｍａｇａｌｌｉ Ｆ．，Ｃａｌｂｉ Ｖ．，Ｚａｍｂｏｎ Ａ．，Ｃｉｏｔｔｉ Ｆ．，Ｌｏｒｉｏｌｉ Ｌ．，Ｓｅｓｓａ Ｍ．，Ｓａｒｚａｎａ Ｍ．，Ｃａｎａｌｅ
Ｓ．，Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ Ｇ．，Ｍｅｄａｇｌｉｎｉ Ｓ．，Ｄｅｌ Ｃａｒｒｏ Ｕ．，Ｑｕａｔｔｒｉｎｉ Ａ．，Ｂａｌｄｏｌｉ Ｃ．，Ｍａｒｔｉｎｏ Ｓ．，Ｄｉ
Ｓｅｒｉｏ Ｃ．，Ｃｉｃｅｒｉ Ｆ．，Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．，Ｎａｔａｌｉ Ｓｏｒａ Ｍ．Ｇ．，Ｂｉｆｆｉ Ａ．，＆Ａｉｕｔｉ Ａ．（２０１７）．”Ｕｐｄａｔｅ
ｏｎ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ（ＨＳＣ－ＧＴ）ｆｏｒ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＭＬＤ）．”Ｅｕｒ Ｊ ｏｆ Ｐａｅｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２１：ｅ２０．
Ｇａｌｌｏ Ｓ．，Ｒａｎｄｉ Ｄ．，Ｂｅｒｔｅｌｌｉ Ｍ．，Ｓａｌｖｉａｔｉ Ａ．，＆Ｐａｎｄｏｌｆｏ Ｍ．（２００４）．”Ｌａｔｅ ｏｎｓｅｔ ＭＬＤ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｎｅｒｖｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＡＳＡ ｇｅｎｅ．”Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．７５（４）：６５５－７．
Ｇａｏ Ｇ．，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ Ｌ．Ｈ．，Ａｌｖｉｒａ Ｍ．Ｒ．，Ｌｕ
Ｙ．，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ．，Ｚｈｏｕ Ｘ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．（２００４）．”Ｃｌａｄｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．”Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７８（１２）：６３８１－８．
Ｇａｒａｖｅｌｌｉ Ｌ．，Ｒｏｓａｔｏ Ｓ．，Ｍｅｌｅ Ａ．，Ｗｉｓｃｈｍｅｉｊｅｒ Ａ．，Ｒｉｖｉｅｒｉ Ｆ．，Ｇｅｌｍｉｎｉ Ｃ．，Ｓａｎｄｏｎａ Ｆ．，Ｓａｓｓａｔｅｌｌｉ Ｒ．，Ｃａｒｌｉｎｆａｎｔｅ Ｇ．，Ｇｉｏｖａｎａｒｄｉ Ｆ．，Ｇｅｍｍｉ Ｍ．，Ｄｅｌｌａ Ｇｉｕｓｔｉｎａ Ｅ．，Ａｍａｒｒｉ Ｓ．，Ｂａｎｃｈｉｎｉ Ｇ．，＆Ｂｅｄｏｇｎｉ Ｇ．（２００９）．”Ｍａｓｓｉｖｅ ｈｅｍｏｂｉｌｉａ ａｎｄ ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｉｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ
ｌｉｆｅ－ｔｈｒｅａｔｅｎｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．”Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．４０（６）：２８４－６．
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Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．＆Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ Ｉ．（２０１０）．”Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ－－ａｎ ｕｐｄａｔｅ．”Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．４１（１）：１－６．
Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．，Ｍａｔｚｎｅｒ Ｕ．，Ｈｅｓｓ Ｂ．，Ｌｕｌｌｍａｎｎ－Ｒａｕｃｈ Ｒ．，Ｃｏｅｎｅｎ Ｒ．，Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｄ．，Ｄ’Ｈｏｏｇｅ Ｒ．，ＤｅＤｅｙｎ Ｐ．，＆Ｎａｇｅｌｓ Ｇ．（１９９８）．”Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．”Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．２１（５）：５６４－７４．
Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．，Ｐｏｌｔｅｎ Ａ．，Ｋｒｅｙｓｉｎｇ Ｊ．，＆ｖｏｎ Ｆｉｇｕｒａ Ｋ．（１９８９）．”Ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ ｐｓｅｕｄｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｌｏｓｓ ｏｆ ａ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ａｎｄ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．８６（２３）：９４３６－４０．
Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．＆ｖｏｎ Ｆｉｇｕｒａ Ｋ．（１９９０）．”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．１３（４）：５６０－７１．
Ｇｉｌ－Ｆａｒｉｎａ Ｉ．，Ｆｒｏｎｚａ Ｒ．，Ｋａｅｐｐｅｌ Ｃ．，Ｌｏｐｅｚ－Ｆｒａｎｃｏ Ｅ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ Ｖ．，Ｄ’Ａｖｏｌａ Ｄ．，Ｂｅｎｉｔｏ Ａ．，Ｐｒｉｅｔｏ Ｊ．，Ｐｅｔｒｙ Ｈ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ａｓｅｇｕｉｎｏｌａｚａ Ｇ．，＆Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ．（２０１６）．”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｓ ｎｏｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ
ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２４（６）：１１００－１１０５．
Ｇｉｕｇｌｉａｎｉ Ｒ．，Ｄａｌｉ Ｃ．，Ｓｅｖｉｎ Ｃ．，Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ Ｉ．，Ｔｒｏｅｄｓｏｎ Ｃ．，Ｓａｋａｉ Ｎ．，Ｗｕ Ｊ．，＆Ｗａｓｉｌｅｗｓｋｉ Ｍ．（２０１８）．”Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｌａｔｅ－ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ
ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ａ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ ａｎｄ ｎｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ．”Ｍｏｌｅｃ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．１２３（２）：Ｓ５４．
Ｇｏｄｅｌ Ｔ．，Ｐｈａｍ Ｍ．，Ｈｅｉｌａｎｄ Ｓ．，Ｂｅｎｄｓｚｕｓ Ｍ．，＆Ｂａｕｍｅｒ Ｐ．（２０１６）．”Ｈｕｍａｎ ｄｏｒｓａｌ－ｒｏｏｔ－ｇａｎｇｌｉｏｎ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｉｎ－ｖｉｖｏ ｂｙ ＭＲＩ．”Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ．１４１：８１－８７．
Ｇｏｍｂａｓｈ Ｓ．Ｅ．，Ｃｏｗｌｅｙ Ｃ．Ｊ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｊ．Ａ．，Ｌｅｐａｋ Ｃ．Ａ．，Ｎｅｉｄｅｓ Ｍ．Ｇ．，Ｈｏｏｋ Ｋ．，Ｔｏｄｄ Ｌ．Ｊ．，Ｗａｎｇ Ｇ．Ｄ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｃ．，Ｋａｓｐａｒ Ｂ．Ｋ．，Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ Ｅ．Ｃ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ａ．Ｊ．，Ｗｏｏｄ Ｊ．Ｄ．，＆Ｆｏｕｓｔ
Ｋ．Ｄ．（２０１７）．”Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２４（１０）：６４０－６４８．
Ｇｏｍｅｚ－Ｏｓｐｉｎａ Ｎ．（２０１７）．”Ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．”ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ．Ｍ．Ｐ．Ａｄａｍ，Ｈ．Ｈ．Ａｒｄｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｐａｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ．
Ｇｒａｈａｍ Ｆ．Ｌ．，Ｓｍｉｌｅｙ Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｗ．Ｃ．，＆Ｎａｉｒｎ Ｒ．（１９７７）．”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５．”Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１）：５９－７４．
Ｇｒａｙ Ｓ．Ｊ．，Ｍａｔａｇｎｅ Ｖ．，Ｂａｃｈａｂｏｉｎａ Ｌ．，Ｙａｄａｖ Ｓ．，Ｏｊｅｄａ Ｓ．Ｒ．，＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ．Ｊ．（２０１１）．”Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ａ
ＡＶ９ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉａ：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（６）：１０５８－６９．
Ｇｒａｙ Ｓ．Ｊ．，Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ Ｋａｌｂｕｒｇｉ Ｓ．，ＭｃＣｏｗｎ Ｔ．Ｊ．，＆Ｊｕｄｅ Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ．（２０１３）．”Ｇｌｏｂａｌ ＣＮＳ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＡＡＶ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ＡＡＶ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（４）：４５０－９．
Ｇｒｅｉｇ Ｊ．Ａ．，Ｌｉｍｂｅｒｉｓ Ｍ．Ｐ．，Ｂｅｌｌ Ｐ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．Ｊ．，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ．，Ｒａｄｅｒ Ｄ．Ｊ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．（２０１７）．”Ｎｏｎ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｅｘａｍｉｎｉｎｇ ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＬＤＬＲ ｖｅｃｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃｈｏｗ－ｆｅｄ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ＬＤＬＲ（＋／－）Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２８（１）：３９－５０．
Ｇｒｏｅｓｃｈｅｌ Ｓ．，Ｋｅｈｒｅｒ Ｃ．，Ｅｎｇｅｌ Ｃ．，Ｃ Ｉ．Ｄ．，Ｂｌｅｙ Ａ．，Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ Ｒ．，Ｇｒｏｄｄ Ｗ．，＆Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ Ｉ．（２０１１）．”Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ＭＲＩ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ．”Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．３４（５）：１０９５－１０２．
Ｇｕ Ｚ．，Ｌｉｕ Ｙ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．，Ｊｉｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｑ．，Ｇｏｌｔｚｍａｎ Ｄ．，Ｋａｒａｐｌｉｓ Ａ．，＆Ｍｉａｏ Ｄ．（２０１２）．”Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＴＨｒＰ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ａｂｎｏｒｍａｌ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．７（７）：ｅ４１５４２．
Ｇｕｒｄａ Ｂ．Ｌ．，Ｄｅ Ｇｕｉｌｈｅｍ Ｄｅ Ｌａｔａｉｌｌａｄｅ Ａ．，Ｂｅｌｌ Ｐ．，Ｚｈｕ Ｙ．，Ｙｕ Ｈ．，Ｗａｎｇ Ｐ．，Ｂａｇｅｌ Ｊ．，Ｖｉｔｅ Ｃ．Ｈ．，Ｓｉｋｏｒａ Ｔ．，Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ．，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ．，Ｙｏｘ Ａ．Ｄ．，Ｓｔｅｅｔ Ｒ．Ａ．，Ｒｕａｎｅ Ｔ．，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ Ｐ．，Ｇａｏ Ｇ．，Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．，Ｃａｓａｌ Ｍ．，Ｐｏｎｄｅｒ Ｋ．Ｐ．，＆Ｈａｓｋｉｎｓ Ｍ．Ｅ．（２０１６）．”Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ＶＩＩ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２４（２）：２０６－２１６．
Ｇｕｙｅｎｅｔ Ｓ．Ｊ．，Ｆｕｒｒｅｒ Ｓ．Ａ．，Ｄａｍｉａｎ Ｖ．Ｍ．，Ｂａｕｇｈａｎ Ｔ．Ｄ．，Ｌａ Ｓｐａｄａ Ａ．Ｒ．，＆Ｇａｒｄｅｎ Ｇ．Ａ．（２０１０）．”Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ．”Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ（３９）．
Ｈａｇｅｍａｎ Ａ．Ｔ．，Ｇａｂｒｅｅｌｓ Ｆ．Ｊ．，ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｊ．Ｇ．，Ｇａｂｒｅｅｌｓ－Ｆｅｓｔｅｎ Ａ．Ａ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｃ．Ｊ．，ｖａｎ Ｏｏｓｔ Ｂ．Ａ．，＆Ｗｅｖｅｒｓ Ｒ．Ａ．（１９９５）．”Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ ｐｓｅｕｄｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．”Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．５２（４）：４０８－１３．
Ｈａｕｒｉｇｏｔ Ｖ．，Ｍａｒｃｏ Ｓ．，Ｒｉｂｅｒａ Ａ．，Ｇａｒｃｉａ Ｍ．，Ｒｕｚｏ Ａ．，Ｖｉｌｌａｃａｍｐａ Ｐ．，Ａｙｕｓｏ Ｅ．，Ａｎｏｒ Ｓ．
，Ａｎｄａｌｕｚ Ａ．，Ｐｉｎｅｄａ Ｍ．，Ｇａｒｃｉａ－Ｆｒｕｃｔｕｏｓｏ Ｇ．，Ｍｏｌａｓ Ｍ．，Ｍａｇｇｉｏｎｉ Ｌ．，Ｍｕｎｏｚ Ｓ．，Ｍｏｔａｓ Ｓ．，Ｒｕｂｅｒｔｅ Ｊ．，Ｍｉｎｇｏｚｚｉ Ｆ．，Ｐｕｍａｒｏｌａ Ｍ．，＆Ｂｏｓｃｈ Ｆ．（２０１３）．”Ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ＩＩＩＡ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．
Ｈｅｉｍ Ｐ．，Ｃｌａｕｓｓｅｎ Ｍ．，Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｂ．，Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ Ｅ．，Ｇａｒｔｎｅｒ Ｊ．，Ｈａｒｚｅｒ Ｋ．，Ｈｕｎｎｅｍａｎ Ｄ．Ｈ．，Ｋｏｈｌｅｒ Ｗ．，Ｋｕｒｌｅｍａｎｎ Ｇ．，＆Ｋｏｈｌｓｃｈｕｔｔｅｒ Ａ．（１９９７）．”Ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｉｎ Ｇｅｒｍａｎｙ．”Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．７１（４）：４７５－８．
Ｈｅｒｎｄｏｎ Ｊ．Ｇ．，Ｔｉｇｇｅｓ Ｊ．，Ｋｌｕｍｐｐ Ｓ．Ａ．，＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｄ．Ｃ．（１９９８）．”Ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｇｅ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．”Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．１９（３）：２６７－７２．
Ｈｅｓｓ Ｂ．，Ｓａｆｔｉｇ Ｐ．，Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｄ．，Ｃｏｅｎｅｎ Ｒ．，Ｌｕｌｌｍａｎｎ－Ｒａｕｃｈ Ｒ．，Ｇｏｅｂｅｌ Ｈ．Ｈ．，Ｅｖｅｒｓ Ｍ．，ｖｏｎ Ｆｉｇｕｒａ Ｋ．，Ｄ’Ｈｏｏｇｅ Ｒ．，Ｎａｇｅｌｓ Ｇ．，Ｄｅ Ｄｅｙｎ Ｐ．，Ｐｅｔｅｒｓ Ｃ．，＆Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．（１９９６）．”Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９３（２５）：１４８２１－６．
Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ．，Ｂｅｌｌ Ｐ．，Ｋａｔｚ Ｎ．，Ｖｉｔｅ Ｃ．Ｈ．，Ｌｏｕｂｏｕｔｉｎ Ｊ．Ｐ．，Ｂｏｔｅ Ｅ．，Ｙｕ Ｈ．，Ｚｈｕ Ｙ．，Ｃａｓａｌ
Ｍ．Ｌ．，Ｂａｇｅｌ Ｊ．，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ Ｐ．，Ｗａｎｇ Ｐ．，Ｈａｓｋｉｎｓ Ｍ．Ｅ．，Ｇｏｏｄｅ Ｔ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．（２０１８）．”Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｒｏｕｔｅｓ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ ａｎｉｍａｌｓ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（１）：１５－２４．
Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ．，Ｂｅｌｌ Ｐ．，Ｖｉｔｅ Ｃ．Ｈ．，Ｌｏｕｂｏｕｔｉｎ
Ｊ．Ｐ．，Ｇｒａｎｔ Ｒ．，Ｂｏｔｅ Ｅ．，Ｙｕ Ｈ．，Ｐｕｋｅｎａｓ Ｂ．，Ｈｕｒｓｔ Ｒ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．（２０１４）．”Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．１：１４０５１．
Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ．，Ｋａｔｚ Ｎ．，Ｌｏｕｂｏｕｔｉｎ Ｊ．Ｐ．，Ｂｅｌｌ
Ｐ．，Ｙｕ Ｈ．，Ｎａｙａｌ Ｍ．，Ｋｏｚａｒｓｋｙ Ｋ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｗ．Ｔ．，Ｇｏｏｄｅ Ｔ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．（２０１６）．”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｔｏ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｔｙｐｅ ＩＩ ｍｉｃｅ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７（１１）：９０６－９１５．
Ｈｏｒｄｅａｕｘ Ｊ．，Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ．，Ｇｏｏｄｅ Ｔ．，Ｋａｔｚ Ｎ．，Ｂｕｚａ Ｅ．Ｌ．，Ｂｅｌｌ Ｐ．，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ．，Ｒｉｃｈｍａｎ Ｌ．Ｋ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．（２０１８）．”Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｓｔｕｄｙ
ｏｆ ｉｎｔｒａ－ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｉｎ Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．１０：７９－８８．
Ｈｏｒｄｅａｕｘ Ｊ．，Ｙｕａｎ Ｙ．，Ｃｌａｒｋ Ｐ．Ｍ．，Ｗａｎｇ Ｑ．，Ｍａｒｔｉｎｏ Ｒ．Ａ．，Ｓｉｍｓ Ｊ．Ｊ．，Ｂｅｌｌ Ｐ．，Ｒａｙｍｏｎｄ Ａ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｗ．Ｌ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｍ．（２０１９）．”Ｔｈｅ ＧＰＩ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＹ６Ａ Ｄｒｉｖｅｓ ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ
Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ．”Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒ．
Ｈｙｄｅ Ｔ．Ｍ．，Ｚｉｅｇｌｅｒ Ｊ．Ｃ．，＆Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ Ｄ．Ｒ．（１９９２）．”Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｓｙｃｈｏｓｉｓ．”Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．４９（４）：４０１－６．
Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ Ｓ．Ｔ．，Ｈｙｎａｎ Ｌ．Ｓ．，Ｍｏｒｔｏｎ Ａ．，Ｂｕｃｈａｎａｎ Ｒ．，Ｌｉｍｂｅｒｓ Ｃ．Ａ．，Ｖａｒｎｉ Ｊ．Ｗ．，＆Ａｍ Ｓ．Ｇ．（２００９）．”Ｔｈｅ ＰｅｄｓＱＬ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ：ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ，ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｖａｌｉｄｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｍｏｄｕｌｅ．”Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ：ＮＭＤ．１９（１２）：８０５－８１２．
Ｊａｂｂｅｈｄａｒｉ Ｓ．，Ｒａｈｉｍｉａｎ Ｅ．，Ｊａｆａｒｉ Ｎ．，Ｓａｎｉｉ Ｓ．，Ｋｈａｙａｔｚａｄｅｈｋａｋｈｋｉ Ｓ．，＆Ｎｅｊａｄ Ｂｉｇｌａｒｉ Ｈ．（２０１５）．”Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ａ ｃａｓｅ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｉｒａｎｉａｎ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．”Ｉｒａｎ Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．９（３）：５７－６１．
Ｊａｋｏｂ Ｍ．，Ｍｕｈｌｅ Ｃ．，Ｐａｒｋ Ｊ．，Ｗｅｉｓｓ Ｓ．，Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ Ｓ．，＆Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｈ．（２００５）．”Ｎｏ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｒｅｎａｔａｌ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．７（５）：６３０－７．
Ｊａｎｓｏｎ Ｃ．，ＭｃＰｈｅｅ Ｓ．，Ｂｉｌａｎｉｕｋ Ｌ．，Ｈａｓｅｌｇｒｏｖｅ Ｊ．，Ｔｅｓｔａｉｕｔｉ Ｍ．，Ｆｒｅｅｓｅ Ａ．，Ｗａｎｇ Ｄ．Ｊ．，Ｓｈｅｒａ Ｄ．，Ｈｕｒｈ Ｐ．，Ｒｕｐｉｎ Ｊ．，Ｓａｓｌｏｗ Ｅ．，Ｇｏｌｄｆａｒｂ Ｏ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ Ｍ．，Ｌａｒｉｊａｎｉ Ｇ．，Ｓｈａｒｒａｒ Ｗ．，Ｌｉｏｕｔｅｒｍａｎ Ｌ．，Ｃａｍｐ Ａ．，Ｋｏｌｏｄｎｙ Ｅ．，Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｊ．，＆Ｌｅｏｎｅ Ｐ．（２００２）．”Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＡＶ－２
ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ（ＡＳＰＡ）ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（１１）：１３９１－４１２．
Ｋａｐａｕｎ Ｐ．，Ｄｉｔｔｍａｎｎ Ｒ．Ｗ．，Ｇｒａｎｉｔｚｎｙ Ｂ．，Ｅｉｃｋｈｏｆｆ Ｗ．，Ｗｕｌｂｒａｎｄ Ｈ．，Ｎｅｕｍａｉｅｒ－Ｐｒｏｂｓｔ Ｅ．，Ｚａｎｄｅｒ Ａ．，＆Ｋｏｈｌｓｃｈｕｅｔｔｅｒ Ａ．（１９９９）．”Ｓｌｏｗ
ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ６ ｙｅａｒｓ ａｆｔｅｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．１４（４）：２２２－８．
Ｋａｐｌｉｔｔ Ｍ．Ｇ．，Ｆｅｉｇｉｎ Ａ．，Ｔａｎｇ Ｃ．，Ｆｉｔｚｓｉｍｏｎｓ Ｈ．Ｌ．，Ｍａｔｔｉｓ Ｐ．，Ｌａｗｌｏｒ Ｐ．Ａ．，Ｂｌａｎｄ Ｒ．Ｊ．，Ｙｏｕｎｇ Ｄ．，Ｓｔｒｙｂｉｎｇ Ｋ．，Ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄ．，＆Ｄｕｒｉｎｇ Ｍ．Ｊ．（２００７）．”Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｂｏｒｎｅ ＧＡＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ．３６９（９５７９）：２０９７－１０５．
Ｋａｙ Ｍ．Ａ．，Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ．，Ｒａｇｎｉ Ｍ．Ｖ．，Ｌａｒｓｏｎ Ｐ．Ｊ．，Ｃｏｕｔｏ Ｌ．Ｂ．，ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ Ａ．，Ｇｌａｄｅｒ Ｂ．，Ｃｈｅｗ Ａ．Ｊ．，Ｔａｉ Ｓ．Ｊ．，Ｈｅｒｚｏｇ Ｒ．Ｗ．，Ａｒｒｕｄａ Ｖ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｆ．，Ｓｃａｌｌａｎ Ｃ．，Ｓｋａｒｓｇａｒｄ Ｅ．，Ｆｌａｋｅ
Ａ．Ｗ．，＆Ｈｉｇｈ Ｋ．Ａ．（２０００）．”Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｉｎ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ
ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ．”Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２４（３）：２５７－６１．
Ｋｅｈｒｅｒ Ｃ．，Ｂｌｕｍｅｎｓｔｏｃｋ Ｇ．，Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．，＆Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ Ｉ．（２０１１ａ）．”Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｇｒｏｓｓ ｍｏｔｏｒ ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｄｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｉｌｄ
Ｎｅｕｒｏｌ．５３（９）：８５０－８５５．
Ｋｅｈｒｅｒ Ｃ．，Ｂｌｕｍｅｎｓｔｏｃｋ Ｇ．，Ｒａａｂｅ Ｃ．，＆Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ Ｉ．（２０１１ｂ）．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｇｒｏｓｓ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｄｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．５３（２）：１５６－６０．
Ｋｅｈｒｅｒ Ｃ．，Ｇｒｏｅｓｃｈｅｌ Ｓ．，Ｋｕｓｔｅｒｍａｎｎ－Ｋｕｈｎ Ｂ．，Ｂｕｒｇｅｒ Ｆ．，Ｋｏｈｌｅｒ Ｗ．，Ｋｏｈｌｓｃｈｕｔｔｅｒ Ａ．，Ｂｌｅｙ Ａ．，Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ Ｒ．，Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．，＆Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ Ｉ．（２０１４）．”Ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｏｎｓｅｔ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ａ ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ ｃｏｈｏｒｔ．”Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．９：１８．
Ｋｉｍ Ｊ．，Ｓｕｎ Ｚ．，Ｅｚｅｋｉａｎ Ｂ．，Ｓｃｈｏｏｌｅｒ Ｇ．Ｒ．，Ｐｒａｓａｄ Ｖ．Ｋ．，Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ Ｊ．，Ｒｉｃｅ Ｈ．Ｅ．，＆Ｔｒａｃｙ Ｅ．Ｔ．（２０１７）．”Ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ．２０８：１８７－１９１．
Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ Ｉ．，Ｇｒｏｅｓｃｈｅｌ Ｓ．，Ｋｅｈｒｅｒ Ｃ．，Ｏｐｈｅｒｋ Ｋ．，Ｎａｇｅｌｅ Ｔ．，Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ Ｒ．，＆Ｍｕｌｌｅｒ Ｉ．（２０１３）．”Ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ １０ ｙｅａｒｓ ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｃｏｈｏｒｔ．”Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．４８（３）：３６９－７５．
Ｋｒｉｖｉｔ Ｗ．，Ｓｈａｐｉｒｏ Ｅ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｗ．，Ｌｉｐｔｏｎ Ｍ．，Ｌｏｃｋｍａｎ Ｌ．，Ｓｍｉｔｈ Ｓ．，Ｓｕｍｍｅｒｓ Ｃ．Ｇ．，Ｗｅｎｇ
ｅｒ Ｄ．Ａ．，Ｔｓａｉ Ｍ．Ｙ．，Ｒａｍｓａｙ Ｎ．Ｋ．，＆ｅｔ ａｌ．（１９９０）．”Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｔｅ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３２２（１）：２８－３２．
Ｋｒｕｓｅ Ｂ．，Ｈａｎｅｆｅｌｄ Ｆ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎ Ｈ．Ｊ．，Ｂｒｕｈｎ Ｈ．，Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ Ｔ．，Ｈａｎｉｃｋｅ Ｗ．，＆Ｆｒａｈｍ Ｊ．（１９９３）．”Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｔｏｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．２４１（２）：６８－７４．
Ｋｕｍｐｅｒｓｃａｋ Ｈ．Ｇ．，Ｐａｓｃｈｋｅ Ｅ．，Ｇｒａｄｉｓｎｉｋ Ｐ．，Ｖｉｄｍａｒ Ｊ．，＆Ｂｒａｄａｃ Ｓ．Ｕ．（２００５）．”Ａｄｕｌｔ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ－ｌｉｋｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｎｄ ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ２ ｓｉｓｔｅｒｓ．”Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０（１）：３３－６．
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Ｌｉ Ｃ．，Ｈｅ Ｙ．，Ｎｉｃｏｌｓｏｎ Ｓ．，Ｈｉｒｓｃｈ Ｍ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｓ．，Ｚｈａｎｇ Ｐ．，Ｋａｆｒｉ Ｔ．，＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ．Ｊ．（２０１３）．”Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ．”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２３（３）：１３９０－４０１．
Ｌｉ Ｈ．，Ｍａｌａｎｉ Ｎ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓ．Ｒ．，Ｓｃｈｌａｃｈｔｅｒｍａｎ Ａ．，Ｂｕｓｓａｄｏｒｉ Ｇ．，Ｅｄｍｏｎｓｏｎ Ｓ．Ｅ．，Ｓｈａｈ Ｒ．，Ａｒｒｕｄａ Ｖ．Ｒ．，Ｍｉｎｇｏｚｚｉ Ｆ．，Ｗｒｉｇｈｔ Ｊ．Ｆ．，Ｂｕｓｈｍａｎ Ｆ．Ｄ．，＆Ｈｉｇｈ Ｋ．Ａ．（２０１１）．”Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ．”Ｂｌｏｏｄ．１１７（１２）：３３１１－９．
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ｏｎｓ：ｉｓ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｕｎｄｅｒｄｉａｇｎｏｓｅｄ？”ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６（６）：ｅ２０２１８．
Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ Ｊｏｓｅｎｂｙ Ａ．，Ｊａｒｎｌｏ Ｇ．Ｂ．，Ｇｕｍｍｅｓｓｏｎ Ｃ．，＆Ｎｏｒｄｍａｒｋ Ｅ．（２００９）．”Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｖａｌｉｄｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＧＭＦＭ－８８ ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ ａｎｄ ｇｏａｌ ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ ＧＭＦＭ－６６ ｓｃｏｒｅ ｉｎ ａ ５－ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｓｔｕｄｙ．”Ｐｈｙｓ Ｔｈｅｒ．８９（４）：３４２－５０．
Ｍａｈｍｏｏｄ Ａ．，Ｂｅｒｒｙ Ｊ．，Ｗｅｎｇｅｒ Ｄ．Ａ．，Ｅｓｃｏｌａｒ
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Ｍａｒｃａｏ Ａ．Ｍ．，Ｗｉｅｓｔ Ｒ．，Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ Ｋ．，Ｗｉｅｓｍａｎｎ Ｕ．，Ｗｅｉｓ Ｊ．，Ｓｃｈｒｏｔｈ Ｇ．，Ｍｉｒａｎｄａ Ｍ．Ｃ．，Ｓｔｕｒｚｅｎｅｇｇｅｒ Ｍ．，＆Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．（２００５）．”Ａｄｕｌｔ ｏｎｓｅｔ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｌｅｃｔｒｏｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ
ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ：ａ ｎｅｗ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＡＲＳＡ ｇｅｎｅ．”Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．６２（２）：３０９－１３．
Ｍａｒｔｉｎ Ａ．，Ｓｅｖｉｎ Ｃ．，Ｌａｚａｒｕｓ Ｃ．，Ｂｅｌｌｅｓｍｅ Ｃ．，Ａｕｂｏｕｒｇ Ｐ．，＆Ａｄａｍｓｂａｕｍ Ｃ．（２０１２）．”Ｔｏｗａｒｄ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．”ＡＪＮＲ Ａｍ Ｊ Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．３３（９）：１７３１－９．
Ｍａｒｔｉｎ Ｈ．Ｒ．，Ｐｏｅ Ｍ．Ｄ．，Ｐｒｏｖｅｎｚａｌｅ Ｊ．Ｍ．，Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ Ｊ．，Ｍｅｎｄｉｚａｂａｌ Ａ．，＆Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．（２０１３）．”Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（４）：６１６－２４．
Ｍａｔｔｈｅｓ Ｆ．，Ｓｔｒｏｏｂａｎｔｓ Ｓ．，Ｇｅｒｌａｃｈ Ｄ．，Ｗｏｈｌｅｎｂｅｒｇ Ｃ．，Ｗｅｓｓｉｇ Ｃ．，Ｆｏｇｈ Ｊ．，Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．，Ｅｃｋｈａｒｄｔ Ｍ．，Ｄ’Ｈｏｏｇｅ Ｒ．，＆Ｍａｔｚｎｅｒ Ｕ．（２０１２）．”Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｎ ａｇｇｒａｖａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｄｅｃｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａｇｅ．”Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２１（１１）：２５９９－６０９．
Ｍａｔｚｎｅｒ Ｕ．，Ｈｅｒｂｓｔ Ｅ．，Ｈｅｄａｙａｔｉ Ｋ．Ｋ．，Ｌｕｌｌｍａｎｎ－Ｒａｕｃｈ Ｒ．，Ｗｅｓｓｉｇ Ｃ．，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｓ．，Ｅｉｓｔｒｕｐ Ｃ．，Ｍｏｌｌｅｒ Ｃ．，Ｆｏｇｈ Ｊ．，＆Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．（２００５）．”Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐ
ｈｙ．”Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１４（９）：１１３９－５２．
Ｍａｔｚｎｅｒ Ｕ．，Ｌｕｌｌｍａｎｎ－Ｒａｕｃｈ Ｒ．，Ｓｔｒｏｏｂａｎｔｓ
Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｃ．，Ｗｅｉｇｅｌｔ Ｃ．，Ｅｉｓｔｒｕｐ Ｃ．，Ｆｏｇｈ Ｊ．，Ｄ’Ｈｏｏｇｅ Ｒ．，＆Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ Ｖ．（２００９）．”Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ａｔａｘｉｃ ｇａｉｔ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１７（４）：６００－６．
ＭｃＣａｒｔｙ Ｄ．Ｍ．，Ｙｏｕｎｇ Ｓ．Ｍ．，Ｊｒ．，＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ．Ｊ．（２００４）．”Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．３８：８１９－４５．
ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｋ．＆Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ Ｓ．（２０１５）．”Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｉｎ ａ ｃｈｉｌｄ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｐｅｄｉａｔｒ Ｄｅｖ Ｐａｔｈｏｌ．１８（３）：２２８－３０．
Ｍｅｌｎｉｃｋ Ｊ．Ｌ．，Ｍａｙｏｒ Ｈ．Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ Ｋ．Ｏ．，＆Ｒａｐｐ Ｆ．（１９６５）．”Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ２０ ｍｉｌｌｉ－ｍｉｃｒｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９０（１）：２７１－４．
Ｍｅｎｄｅｌｌ Ｊ．Ｒ．，Ａｌ－Ｚａｉｄｙ Ｓ．，Ｓｈｅｌｌ Ｒ．，Ａｒｎｏｌｄ Ｗ．Ｄ．，Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ Ｌ．Ｒ．，Ｐｒｉｏｒ Ｔ．Ｗ．，Ｌｏｗｅｓ Ｌ．，Ａｌｆａｎｏ Ｌ．，Ｂｅｒｒｙ Ｋ．，Ｃｈｕｒｃｈ Ｋ．，Ｋｉｓｓｅｌ Ｊ．Ｔ．，Ｎａｇｅｎｄｒａｎ Ｓ．，Ｌ’Ｉｔａｌｉｅｎ Ｊ．，Ｓｐｒｏｕｌｅ
Ｄ．Ｍ．，Ｗｅｌｌｓ Ｃ．，Ｃａｒｄｅｎａｓ Ｊ．Ａ．，Ｈｅｉｔｚｅｒ Ｍ．Ｄ．，Ｋａｓｐａｒ Ａ．，Ｃｏｒｃｏｒａｎ Ｓ．，Ｂｒａｕｎ Ｌ．，Ｌｉｋｈｉｔｅ
Ｓ．，Ｍｉｒａｎｄａ Ｃ．，Ｍｅｙｅｒ Ｋ．，Ｆｏｕｓｔ Ｋ．Ｄ．，Ｂｕｒｇｈｅｓ Ａ．Ｈ．Ｍ．，＆Ｋａｓｐａｒ Ｂ．Ｋ．（２０１７）．”Ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ ｇｅｎｅ－ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．”Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７７（１８）：１７１３－１７２２．
Ｍｉｌｌｅｒ Ｎ．（２０１２）．”Ｇｌｙｂｅｒａ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ
ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ．”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１１（５）：４１９．
Ｍｉｔｔｅｒｍｅｙｅｒ Ｇ．，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｃ．Ｗ．，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｔｈ Ｋ．Ｈ．，Ｂａｋｅｒ Ｓ．Ｌ．，Ｓｔａｒｒ Ｐ．，Ｌａｒｓｏｎ Ｐ．，Ｋａｐｌａｎ Ｐ．Ｌ．，Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ Ｊ．，Ａｍｉｎｏｆｆ Ｍ．Ｊ．，＆Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｋ．Ｓ．（２０１２）．”Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈａｓｅ １ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＡＡＤＣ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（４）：３７７－８１．
Ｎａｔｈｗａｎｉ Ａ．Ｃ．，Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ Ｅ．Ｇ．，Ｒａｎｇａｒａｊａｎ
Ｓ．，Ｒｏｓａｌｅｓ Ｃ．，ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ｊ．，Ｌｉｎｃｈ Ｄ．Ｃ．，Ｃｈｏｗｄａｒｙ Ｐ．，Ｒｉｄｄｅｌｌ Ａ．，Ｐｉｅ Ａ．Ｊ．，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ
Ｃ．，Ｏ’Ｂｅｉｒｎｅ Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ Ｋ．，Ｐａｓｉ Ｊ．，Ｇｌａｄｅｒ Ｂ．，Ｒｕｓｔａｇｉ Ｐ．，Ｎｇ Ｃ．Ｙ．，Ｋａｙ Ｍ．Ａ．，Ｚｈｏｕ Ｊ．，Ｓｐｅｎｃｅ Ｙ．，Ｍｏｒｔｏｎ Ｃ．Ｌ．，Ａｌｌａｙ Ｊ．，Ｃｏｌｅｍａｎ Ｊ．，Ｓｌｅｅｐ Ｓ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｊ．Ｍ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｄ．，Ｂａｓｎｅｒ－Ｔｓｃｈａｋａｒｊａｎ Ｅ．，Ｍｉｎｇｏｚｚｉ Ｆ．，Ｈｉｇｈ Ｋ．Ａ．，Ｇｒａｙ Ｊ．Ｔ．，Ｒｅｉｓｓ Ｕ．Ｍ．，Ｎｉｅｎｈｕｉｓ Ａ．Ｗ．，＆
Ｄａｖｉｄｏｆｆ Ａ．Ｍ．（２０１１）．”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．”Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６５（２５）：２３５７－６５．
Ｎａｕｌｔ Ｊ．Ｃ．，Ｍａｍｉ Ｉ．，Ｌａ Ｂｅｌｌａ Ｔ．，Ｄａｔｔａ Ｓ．，Ｉｍｂｅａｕｄ Ｓ．，Ｆｒａｎｃｏｎｉ Ａ．，Ｍａｌｌｅｔ Ｍ．，Ｃｏｕｃｈｙ
Ｇ．，Ｌｅｔｏｕｚｅ Ｅ．，Ｐｉｌａｔｉ Ｃ．，Ｖｅｒｒｅｔ Ｂ．，Ｂｌａｎｃ
Ｊ．Ｆ．，Ｂａｌａｂａｕｄ Ｃ．，Ｃａｌｄｅｒａｒｏ Ｊ．，Ｌａｕｒｅｎｔ Ａ．，Ｌｅｔｅｘｉｅｒ Ｍ．，Ｂｉｏｕｌａｃ－Ｓａｇｅ Ｐ．，Ｃａｌｖｏ Ｆ．，＆Ｚｕｃｍａｎ－Ｒｏｓｓｉ Ｊ．（２０１６）．”Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ＡＡＶ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｄｏ Ｎｏｔ Ｉｎｆｏｒｍ Ｄｅｂａｔｅ Ｏｖｅｒ Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒｉｚｅｄ ＡＡＶ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２４（４）：６６０－１．
Ｎａｖａｒｒｏ Ｃ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｊ．Ｍ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ Ｃ．，Ｆａｃｈａｌ Ｃ．，＆Ａｌｖａｒｅｚ Ｍ．（１９９６）．”Ｌａｔｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ； ａ ４－ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｓｔｕｄｙ．”Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．４６（１）：２５４－６．
Ｐａｌｉｓａｎｏ Ｒ．Ｊ．，Ｃａｍｅｒｏｎ Ｄ．，Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ Ｐ．Ｌ．，Ｗａｌｔｅｒ Ｓ．Ｄ．，＆Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．（２００６）．”Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｓｓ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．”Ｄｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．４８（６）：４２４－８．
Ｐａｓｓｉｎｉ Ｍ．Ａ．，Ｄｏｄｇｅ Ｊ．Ｃ．，Ｂｕ Ｊ．，Ｙａｎｇ Ｗ．，Ｚｈａｏ Ｑ．，Ｓｏｎｄｈｉ Ｄ．，Ｈａｃｋｅｔｔ Ｎ．Ｒ．，Ｋａｍｉｎｓｋｙ Ｓ．Ｍ．，Ｍａｏ Ｑ．，Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎ Ｌ．Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ Ｓ．Ｈ．，Ｓｌｅａｔ Ｄ．Ｅ．，Ｓｔｅｗａｒｔ Ｇ．Ｒ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｂ．Ｌ．，Ｌｏｂｅｌ Ｐ．，＆Ｃｒｙｓｔａｌ Ｒ．Ｇ．（２００６）．”Ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＬＮ２ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂｒａｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｌａｔｅ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ．”Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６（５）：１３３４－４２．
Ｐａｔｉｌ Ｓ．Ａ．＆Ｍａｅｇａｗａ Ｇ．Ｈ．（２０１３）．”Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ．７：７２９－４５．
Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ Ｍ．，Ｌｅ Ｇｕｉｎｅｒ Ｃ．，Ｎｏｗｒｏｕｚｉ Ａ．，Ｔｏｒｏｍａｎｏｆｆ Ａ．，Ｃｈｅｒｅｌ Ｙ．，Ｃｈｅｎｕａｕｄ Ｐ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ．，ｖｏｎ Ｋａｌｌｅ Ｃ．，Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｆ．，Ｍｏｕｌｌｉｅｒ Ｐ．，＆Ｓｎｙｄｅｒ Ｒ．Ｏ．（２００８）．”Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｐｅｒｓｉｓｔ ａｓ ｅｐｉｓｏｍａｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｍｕｓｃｌｅ．”Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８２（１６）：７８７５－８５．
Ｐｅｎｇ Ｌ．＆Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．（１９８７）．”Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．６（５）：２２４－３０．
Ｐｅｒｕｓｉ Ｃ．，Ｌｉｒａ Ｍ．Ｇ．，Ｄｕｙｆｆ Ｒ．Ｆ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｈ．Ｃ．，Ｐｉｇｎａｔｔｉ Ｐ．Ｆ．，Ｒｉｚｚｕｔｏ Ｎ．，＆Ｓａｌｖｉａｔ
ｉ Ａ．（１９９９）．”Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｅｒｙ ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５５（２）：１３０．
Ｐｉｇｕｅｔ Ｆ．，Ｓｏｎｄｈｉ Ｄ．，Ｐｉｒａｕｄ Ｍ．，Ｆｏｕｑｕｅｔ Ｆ．，Ｈａｃｋｅｔｔ Ｎ．Ｒ．，Ａｈｏｕａｎｓｏｕ Ｏ．，Ｖａｎｉｅｒ Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｅｃｈｅ Ｉ．，Ａｕｂｏｕｒｇ Ｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｒ．Ｇ．，Ｃａｒｔｉｅｒ Ｎ．，＆Ｓｅｖｉｎ Ｃ．（２０１２）．”Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ＡＡＶｒｈ．１０ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｉｃｅ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（８）：９０３－１４．
Ｐｉｌｚ Ｈ．，Ｄｕｅｎｓｉｎｇ Ｉ．，Ｈｅｉｐｅｒｔｚ Ｒ．，Ｓｅｉｄｅｌ Ｄ．，Ｌｏｗｉｔｚｓｃｈ Ｋ．，Ｈｏｐｆ Ｈ．Ｃ．，＆Ｇｏｅｂｅｌ Ｈ．Ｈ．（１９７７）．”Ａｄｕｌｔ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｉ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｆｅｍａｌｅ ａｇｅｄ ４４ ｙｅａｒｓ，ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｔｅ．”Ｅｕｒ Ｎｅｕｒｏｌ．１５（６）：３０１－７．
Ｐｉｎｔｏ Ｒ．，Ｃａｓｅｉｒｏ Ｃ．，Ｌｅｍｏｓ Ｍ．，Ｌｏｐｅｓ Ｌ．，Ｆｏｎｔｅｓ Ａ．，Ｒｉｂｅｉｒｏ Ｈ．，Ｐｉｎｔｏ Ｅ．，Ｓｉｌｖａ Ｅ．，Ｒｏｃｈａ Ｓ．，Ｍａｒｃａｏ Ａ．，Ｒｉｂｅｉｒｏ Ｉ．，Ｌａｃｅｒｄａ Ｌ．，Ｒｉｂｅｉｒｏ Ｇ．，Ａｍａｒａｌ Ｏ．，＆Ｓａ Ｍｉｒａｎｄａ Ｍ．Ｃ．（２００４）．”Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ Ｐｏｒｔｕｇａｌ．”Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１２（２）：８７－９２．
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Ｓｏｌｄｅｒｓ Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎ Ｄ．Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｃ．，Ｒｅｍｂｅｒｇｅｒ Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｔ．，Ｒｉｎｇｄｅｎ Ｏ．，＆Ｓｏｌｄｅｒｓ Ｇ．（２０１４）．”Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ＳＣＴ：ａ ｕｓｅｆｕｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｌａｔｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．４９（８）：１０４６－５１．
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Ｓｔｒｏｌｉｎ Ｍ．，Ｋｒａｇｅｌｏｈ－Ｍａｎｎ Ｉ．，Ｋｅｈｒｅｒ Ｃ．，Ｗｉｌｋｅ Ｍ．，＆Ｇｒｏｅｓｃｈｅｌ Ｓ．（２０１７）．”Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｌｏａｄ ａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｌ．４（６）：４０３－４１０．
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Ｔａｒｄｉｅｕ Ｍ．，Ｚｅｒａｈ Ｍ．，Ｈｕｓｓｏｎ Ｂ．，ｄｅ Ｂｏｕｒｎｏｎｖｉｌｌｅ Ｓ．，Ｄｅｉｖａ Ｋ．，Ａｄａｍｓｂａｕｍ Ｃ．，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｆ．，Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ Ｍ．，Ｂｒｏｉｓｓａｎｄ Ｃ．，Ｆｕｒｌａｎ Ｖ．，Ｂａｌｌａｂｉｏ Ａ．，Ｆｒａｌｄｉ Ａ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｒ．Ｇ．，Ｂａｕｇｎｏｎ Ｔ．，Ｒｏｕｊｅａｕ Ｔ．，Ｈｅａｒｄ Ｊ．Ｍ．，＆Ｄａｎｏｓ Ｏ．（２０１４）．”Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
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（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、
数値識別子＜２２３＞の下のフリーテキストを含む配列に関して提供される。
Figure 2022531861000023
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Figure 2022531861000034
本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年５月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８４３，０９１号は、その全体が、その配列表とともに参照により組み込まれる。同様に、「ＵＰＮ－１８－８５８５ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で本明細書とともに提出された配列表、ならびにその中の配列およびテキストは、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。このような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (39)

  1. 異染性白質ジストロフィーを治療するのに有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、
    （ａ）ＡＡＶｈｕ６８カプシドと、
    （ｂ）前記（ａ）のＡＡＶカプシド中にパッケージングされたベクターゲノムであって、前記ベクターゲノムが、逆位末端反復（ＩＴＲ）と、調節配列の制御下の機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）をコードする核酸配列とを含み、前記調節配列が前記ｈＡＲＳＡの発現を指示し、前記ｈＡＲＳＡコード配列が、機能的ｈＡＲＳＡをコードする、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ１５２１の配列、またはそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  2. 前記機能的ｈＡＲＳＡタンパク質が、シグナルペプチドと、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ５０７のアミノ酸配列とを含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  3. 前記シグナルペプチドが、配列番号２のａａ１～ａａ１８のアミノ酸配列または配列番号４のａａ１～ａａ２０のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
  4. 前記調節配列が、神経系細胞においてｈＡＲＳＡの発現を指示する、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  5. 前記調節配列が、ＣＢ７プロモーター含む、ユビキタスプロモーターを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  6. 調節エレメントが、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、イントロン、エンハンサー、およびＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  7. 前記ｈＡＲＳＡコード配列が、配列番号１と少なくとも９５％～９９．９％同一であり、機能的ｈＡＲＳＡをコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  8. 前記ｈＡＲＳＡコード配列が、配列番号１または配列番号３である、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  9. 前記ベクターゲノムが、配列番号５のｎｔ１～ｎｔ３８８３の配列を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  10. 前記ＡＡＶｈｕ６８カプシドが、配列番号７の予測アミノ酸配列をコードする配列から産生される、請求項１～９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと、製剤緩衝液とを含む、水性医薬組成物。
  12. 前記製剤緩衝液が、緩衝生理食塩水、ならびにナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、またはそれらの混合物のうちの１つ以上を含む人工脳脊髄液と、界面活性剤とを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記界面活性剤が、前記医薬組成物の０．０００５％～約０．００１％で存在する、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記組成物が、７．５～７．８の範囲のｐＨである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 前記製剤緩衝液が、大槽内注入（ＩＣＭ）、静脈内送達、髄腔内投与、または側脳室内投与に好適である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  16. 発現カセットを含むベクターであって、前記発現カセットが、調節配列の制御下の機能的ヒトアリールスルファターゼＡ（ｈＡＲＳＡ）をコードする核酸配列を含み、前記調節配列が、前記ｈＡＲＳＡの発現を指示する、ベクター。
  17. 前記機能的ｈＡＲＳＡタンパク質が、シグナルペプチドと、配列番号２のアミノ酸（ａａ）１９～ａａ５０７のアミノ酸配列とを含む、請求項１６に記載のベクター。
  18. 前記シグナルペプチドが、配列番号２のａａ１～ａａ１８のアミノ酸配列または配列番号４のａａ１～ａａ２０のアミノ酸配列を有する、請求項１６または１７に記載のベクター。
  19. 前記ｈＡＲＳＡコード配列が、機能的ｈＡＲＳＡをコードする、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）５５～ｎｔ１５２１の配列、またはそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列を有する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のベクター。
  20. 前記ｈＡＲＳＡコード配列が、配列番号１または配列番号３である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のベクター。
  21. 前記ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、もしくは組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクター、または裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、もしくはキトサンベースの製剤から選択される非ウイルスベクターである、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のベクター。
  22. 請求項１６～２１のいずれか一項に記載のベクターと、製剤緩衝液とを含む、医薬組成物。
  23. 前記製剤緩衝液が、静脈内送達、大槽内注入（ＩＣＭ）髄腔内投与、または側脳室内投与に好適である、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 異染性白質ジストロフィーまたはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異に関連する疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１１～１５および２２～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１６～２１のいずれか一項に記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  25. 前記ｒＡＡＶまたは前記ベクターが、大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注入を介して投与される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記方法が、単回用量で前記ｒＡＡＶ、前記医薬組成物、または前記ベクターを送達することを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 前記ｒＡＡＶが、３．００×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）毎グラム（ＧＣ／ｇ）脳質
    量～１．００×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の用量で投与される、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記投与後、前記対象の疾患の症状が改善され、かつ／または前記疾患の進行が遅延される、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 大槽内へのＣＴガイド下の後頭下注入を介することを含む、大槽内注入（ＩＣＭ）を介する患者への投与に好適な、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１１～１５および２２～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  30. ７歳以下である対象への投与に好適な、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１１～１５および２２～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  31. 異染性白質ジストロフィーもしくはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連する疾患の症状を改善するため、かつ／または異染性白質ジストロフィーもしくはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子変異と関連する疾患の進行を遅延させるための、それを必要とする対象への投与に好適な、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１１～１５および２２～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  32. 前記ｒＡＡＶまたはベクターまたは組成物が、単回用量で投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１１～１５および２２～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  33. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを産生するのに有用なｒＡＡＶ産生システムであって、前記産生システムが、
    （ａ）ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
    （ｂ）ベクターゲノムと、
    （ｃ）前記ＡＡＶｈｕ６８カプシド中への前記ベクターゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびヘルパー機能と、を含む細胞培養物を含む、ｒＡＡＶ産生システム。
  34. 前記ベクターゲノムが、配列番号５のｎｔ１～ｎｔ３８８３の配列を有する、請求項３３に記載のｒＡＡＶ産生システム。
  35. 前記細胞培養物が、ヒト胚性腎臓２９３細胞培養物である、請求項３３または３４に記載のｒＡＡＶ産生システム。
  36. 前記ＡＡＶ ｒｅｐが、ＡＡＶｈｕ６８とは異なるＡＡＶ由来である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のシステム。
  37. 前記ＡＡＶ ｒｅｐが、ＡＡＶ２由来である、請求項３６に記載のシステム。
  38. 前記ＡＡＶ ｒｅｐコード配列およびｃａｐ遺伝子が、同じ核酸分子上にあり、任意選択的に、前記ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在する、請求項３３～３７のいずれか一項に記載のシステム。
  39. 前記スペーサーが、配列番号２４のポリヌクレオチドである、請求項３８に記載のシス
    テム。
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