CN111727256A - 用于嵌合配体受体（clr）-介导的条件性基因表达的组合物和方法 - Google Patents

用于嵌合配体受体（clr）-介导的条件性基因表达的组合物和方法 Download PDF

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CN111727256A CN201880071587.1A CN201880071587A CN111727256A CN 111727256 A CN111727256 A CN 111727256A CN 201880071587 A CN201880071587 A CN 201880071587A CN 111727256 A CN111727256 A CN 111727256A
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Abstract

公开了组合物，其包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，和(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体的序列，其中，在将(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列中时，表达外源报道分子，并且其中所述外源报道分子在结合配体时转导细胞内信号，所述细胞内信号靶向(a)的诱导型启动子以修饰基因表达。也提供了用于将组合物引入细胞的方法和作为结果而产生的细胞在过继细胞治疗中的用途。

Description

用于嵌合配体受体(CLR)-介导的条件性基因表达的组合物和 方法
相关申请
本申请要求2017年9月8日提交的临时申请USSN 62/556,310的利益，其内容整体引入本文作为参考。
序列表的并入
于2018年9月10日创建且大小为55,054KB的名为“POTH-027/001WOSeqListing.txt”的文本文件的内容特此整体引入作为参考。
公开内容领域
本公开内容涉及分子生物学，且更具体地，涉及供对嵌合配体受体(CLR)-介导的信号起反应的条件性基因表达系统里使用的组合物和方法。
背景
在本领域中已存在对控制基因修饰细胞中基因表达以用于治疗剂的长期递送的方法的长期的但未得到满足的需要。本公开内容通过在细胞表面受体激活时条件性地表达基因的基因修饰细胞提供了解决方案。
概述
本公开内容提供了一种组合物，其包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，和(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体的序列，其中，在将(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列中时，表达外源报道分子，并且其中所述外源报道分子在结合配体时转导细胞内信号，所述细胞内信号靶向(a)的诱导型启动子以修饰基因表达。在某些实施方案中，所述组合物通过增加基因表达来修饰基因表达。在某些实施方案中，所述组合物通过降低基因表达来修饰基因表达。在某些实施方案中，所述组合物通过瞬时修饰基因表达(例如，达配体与外源受体结合的持续时间)来修饰基因表达。在某些实施方案中，所述组合物急相修饰基因表达(例如，配体可逆地结合外源受体)。在某些实施方案中，所述组合物长效修饰基因表达(例如，配体不可逆地结合外源受体)。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，细胞可以是原核细胞。本公开内容的原核细胞包括但不限于细菌和古细菌(archaea)。例如，本公开内容的细菌包括但不限于单核细胞增生利斯特氏菌(listeria monocytogenes)。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，细胞可以是真核细胞。本公开内容的真核细胞包括但不限于酵母、植物、藻类、昆虫、哺乳类、两栖类、鸟类、爬行类、有袋类、啮齿类和人类。本公开内容的优选的真核细胞包括但不限于人细胞。本公开内容的示例性人细胞包括但不限于免疫细胞(例如T细胞)、髓样细胞和骨髓细胞(例如造血干细胞(HSCs))。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的外源受体包括就细胞的基因组序列而论的内源受体。示例性受体包括但不限于细胞内受体、细胞表面受体、跨膜受体、配体门控型离子通道和G蛋白偶联受体。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在某些实施方案中，非天然存在的受体是合成的、修饰的、重组的、突变的或嵌合的受体。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自T-细胞受体(TCR)的一个或多个序列。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自支架蛋白(scaffoldprotein)的一个或多个序列。在某些实施方案中，包括其中非天然存在的受体不包含跨膜结构域的那些，非天然存在的受体与第二跨膜、膜结合的和/或细胞内受体相互作用，所述第二跨膜、膜结合的和/或细胞内受体在与非天然存在的受体接触后转导细胞内信号。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在某些实施方案中，非天然存在的受体是合成的、修饰的、重组的、突变的或嵌合的受体。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自T-细胞受体(TCR)的一个或多个序列。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自支架蛋白的一个或多个序列。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含跨膜结构域。在某些实施方案中，非天然存在的受体与转导细胞内信号的细胞内受体相互作用。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，非天然存在的受体是嵌合配体受体(CLR)。在某些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在某些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体。在某些实施方案中，嵌合配体受体包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含支架蛋白；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域(endodomain)。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含信号肽。在某些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含在所述配体识别区和所述跨膜结构域之间的铰链。在某些实施方案中，信号肽包括编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。在某些实施方案中，信号肽包括编码人CD8α信号肽的序列。在某些实施方案中，信号肽包含包含MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ IDNO：17000)的氨基酸序列。在某些实施方案中，信号肽由包含atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca(SEQ ID NO：17001)的核酸序列编码。在某些实施方案中，跨膜结构域包括编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。在某些实施方案中，跨膜结构域包括编码人CD8α跨膜结构域的序列。在某些实施方案中，跨膜结构域包含包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ IDNO：17002)的氨基酸序列。在某些实施方案中，跨膜结构域由包含atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc(SEQ ID NO：17003)的核酸序列编码。在某些实施方案中，所述胞内域包括人CD3ζ胞内域。在某些实施方案中，所述至少一个共刺激结构域包括人4-1BB、CD28、CD3ζ、CD40、ICOS、MyD88、OX-40细胞内区段或其任何组合。在某些实施方案中，所述至少一个共刺激结构域包括人CD3ζ和/或4-1BB共刺激结构域。在某些实施方案中，所述CD3ζ共刺激结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含
Figure BPA0000288251470000041
在某些实施方案中，所述CD3ζ共刺激结构域由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470000042
在某些实施方案中，所述4-1BB共刺激结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：17006)。在某些实施方案中，所述4-1BB共刺激结构域由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470000043
在某些实施方案中，所述4-1BB共刺激结构域位于跨膜结构域和CD3ζ共刺激结构域之间。在某些实施方案中，铰链包括衍生自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。在某些实施方案中，铰链包括衍生自人CD8α序列的序列。在某些实施方案中，铰链包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含
Figure BPA0000288251470000044
在某些实施方案中，铰链由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470000045
在某些实施方案中，铰链由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470000046
在某些实施方案中，所述至少一种蛋白支架特异性结合所述配体。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在某些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体。在某些实施方案中，嵌合配体受体包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含支架蛋白；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。在某些实施方案中，所述至少一种蛋白支架包括抗体、抗体片段、单结构域抗体、单链抗体、抗体模拟物(mimetic)或Centyrin。在某些实施方案中，配体识别区包括抗体、抗体片段、单结构域抗体、单链抗体、抗体模拟物和Centyrin中的一种或多种。在某些实施方案中，单结构域抗体包括VHH或由VHH组成。在某些实施方案中，抗体模拟物包括affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer，Kunitz结构域肽或monobody或由其组成。在某些实施方案中，Centyrin包含至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列或由其组成。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在某些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体。在某些实施方案中，嵌合配体受体包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含支架蛋白；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。在某些实施方案中，Centyrin包含至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列或由其组成。在某些实施方案中，所述至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域衍生自人蛋白。在某些实施方案中，所述人蛋白是生腱蛋白-C。在某些实施方案中，所述共有序列包含
Figure BPA0000288251470000051
在某些实施方案中，所述共有序列包含
Figure BPA0000288251470000052
在某些实施方案中，所述共有序列在以下内的一个或多个位置处被修饰：(a)包含在共有序列的位置13-16处的氨基酸残基TEDS或由其组成的A-B环；(b)包含在共有序列的位置22-28处的氨基酸残基TAPDAAF或由其组成的B-C环；(c)包含在共有序列的位置38-43处的氨基酸残基SEKVGE或由其组成的C-D环；(d)包含在共有序列的位置51-54处的氨基酸残基GSER或由其组成的D-E环；(e)包含在共有序列的位置60-64处的氨基酸残基GLKPG或由其组成的E-F环；(f)包含在共有序列的位置75-81处的氨基酸残基KGGHRSN或由其组成的F-G环；或(g)(a)-(f)的任何组合。在某些实施方案中，Centyrin包含至少5种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。在某些实施方案中，Centyrin包含至少10种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。在某些实施方案中，Centyrin包含至少15种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。在某些实施方案中，支架以选自小于或等于10-9M、小于或等于10-10M、小于或等于10-11M、小于或等于10-12M、小于或等于10-13M、小于或等于10-14M和小于或等于10-15M的KD的至少一种亲和力结合抗原。在某些实施方案中，所述KD由表面等离振子共振测定。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在某些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体。在某些实施方案中，嵌合配体受体包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含VHH抗体；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。在某些实施方案中，VHH是骆驼科动物的(camelid)。另一方面或此外，在某些实施方案中，将VHH人源化。在某些实施方案中，所述序列包含抗体的两个重链可变区，其中VHH的互补性决定区(CDRs)是人序列。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的编码组成型启动子的序列包括编码EF1α启动子的序列。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的编码组成型启动子的序列包括编码CMV启动子、U6启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、人β肌动蛋白启动子、CAG启动子或EF1α启动子的序列。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码NFκB启动子的序列。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码干扰素(IFN)启动子的序列或编码白细胞介素-2启动子的序列。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码核受体亚家族4A组成员1(NR4A1；也称为NUR77)启动子的序列或编码NR4A1启动子的序列。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码T-细胞表面糖蛋白CD5(CD5)启动子的序列或编码CD5启动子的序列。在某些实施方案中，干扰素(IFN)启动子是IFNγ启动子。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自细胞因子或趋化因子的启动子。在某些实施方案中，细胞因子或趋化因子包括IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A/F、IL21、IL22、IL23、转化生长因子β(TGFβ)、集落刺激因子2(GM-CSF)、干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子(TNFα)、LTα、穿孔蛋白、粒酶C(Gzmc)、粒酶B(Gzmb)、C-C基序趋化因子配体5(CCL5)、C-C基序趋化因子配体4(CCL4)、C-C基序趋化因子配体3(CCL3)、X-C基序趋化因子配体1(XCL1)和LIF白细胞介素6家族细胞因子(Lif)。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，包括其中(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码NR4A1启动子的序列或编码NR4A1启动子的序列的那些，NR4A1启动子通过T细胞中的T-细胞受体(TCR)刺激和通过B细胞中的B-细胞受体(BCR)刺激被激活，因此，在本公开内容的T-细胞或B-细胞分别通过TCR或BCR激活时诱导任何在NR4A1启动子控制下的序列的表达。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，包括其中(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码CD5启动子的序列或编码CD5启动子的序列的那些，CD5启动子通过T细胞中的T-细胞受体(TCR)刺激被激活，因此，在本公开内容的T-细胞通过TCR激活时诱导任何在CD5启动子控制下的序列的表达。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自包含与细胞分化、激活、衰竭和功能有关的表面蛋白的基因的启动子。在某些实施方案中，所述基因包括CD69、CD71、CTLA4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM-3、GITR、MHCII、COX-2、FASL和4-1BB。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自与CD代谢和分化有关的基因的启动子。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自Nr4a1、Nr4a3、Tnfrsf9(4-1BB)、Sema7a、Zfp36l2、Gadd45b、Dusp5、Dusp6和Neto2的启动子。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，转基因包含就细胞的基因组序列而论内源的序列。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，转基因包含就细胞的基因组序列而论外源的序列。在某些实施方案中，外源序列是细胞基因组内的内源序列的序列变体。在某些实施方案中，外源序列是细胞中完全或部分不存在的基因的野生型序列，并且其中所述基因完全存在于健康细胞的基因组中。在某些实施方案中，外源序列是就细胞的基因组而论合成的、修饰的、重组的、嵌合的或非天然存在的序列。在某些实施方案中，转基因编码分泌的蛋白。在某些实施方案中，分泌的蛋白以治疗有效的水平从细胞中产生和/或分泌以在需要其的主体中治疗疾病或病症。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，第一转座子包含(a)的诱导型转基因构建体，且第二转座子包含(b)的受体构建体。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，第一载体包含第一转座子，且第二载体包含第二转座子。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，载体包含第一转座子和第二转座子。在某些实施方案中，第一转座子和第二转座子以相同方向取向。在某些实施方案中，第一转座子和第二转座子以相反方向取向。在某些实施方案中，载体是质粒。在某些实施方案中，载体是纳米质粒(nanoplasmid)。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，载体是病毒载体。本公开内容的病毒载体可包含分离或衍生自反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒或其任何组合的序列。病毒载体可包含分离或衍生自腺伴随病毒(AAV)的序列。病毒载体可以包含重组AAV(rAAV)。本公开内容的示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包含顺式位于编码本公开内容的构建体的序列附近的两个或更多个反向末端重复(ITR)序列。本公开内容的示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于所有血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9)。本公开内容的示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于自互补AAV(scAAV)和含有一种血清型的基因组和另一种血清型的衣壳的AAV杂种(例如，AAV2/5、AAV-DJ和AAV-DJ8)。本公开内容的示例性腺伴随病毒和重组腺伴随病毒包括但不限于rAAV-LK03和具有NP-59和NP-84衣壳变体的AAVs。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，载体是纳米颗粒。本公开内容的示例性纳米颗粒载体包括但不限于核酸(例如，RNA、DNA、合成核苷酸、修饰的核苷酸或其任何组合)、氨基酸(L-氨基酸、D-氨基酸、合成氨基酸、修饰的氨基酸或其任何组合)、聚合物(例如聚合物囊泡(polymersomes))、微团、脂质(例如，脂质体)、有机分子(例如，碳原子、片、纤维、管)、无机分子(例如，磷酸钙或金)或其任何组合。纳米颗粒载体可以被动地或主动地转运穿过细胞膜。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，第一转座子或第二转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，第一转座子和第二转座子是piggyBac转座子。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含质粒或纳米质粒，其包含编码转座酶的序列。在某些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac转座酶。在某些实施方案中，piggyBac转座酶包含包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在某些实施方案中，piggyBac转座酶是高活性变体，并且其中所述高活性变体包含在SEQ ID NO：1的位置30、165、282和538中的一个或多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对异亮氨酸(I)的取代(I30V)。在某些实施方案中，SEQ IDNO：1的位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对甘氨酸(G)的取代(G165S)。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代(M282V)。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对天冬酰胺(N)的取代(N538K)。在某些实施方案中，转座酶是Super piggyBac(SPB)转座酶。在某些实施方案中，Super piggyBac(SPB)转座酶包含包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在本公开内容的某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶。piggyBac(PB)转座酶可包含与以下序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000101
在本公开内容的某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶，其包含在以下序列的位置30、165、282或538中的一个或多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000102
在某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶，其包含在SEQ ID NO：1的序列的位置30、165、282或538的两个或更多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶，其包含在SEQ ID NO：1的序列的位置30、165、282或538的三个或更多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶，其包含在SEQ ID NO：1的序列的下述位置30、165、282和538的每一个处都具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的序列的位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对异亮氨酸(I)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的序列的位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对甘氨酸(G)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的序列的位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的序列的位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对天冬酰胺(N)的取代。
在本公开内容的某些实施方案中，转座酶是Super piggyBacTM(SPB)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的Super piggyBacTM(SPB)转座酶可以包含SEQ ID NO：1的序列的氨基酸序列或由其组成，其中位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对异亮氨酸(I)的取代，位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对甘氨酸(G)的取代，位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，且位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，Super piggyBacTM(SPB)转座酶可以包含与以下序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000111
在本公开内容的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的位置3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591中的一个或多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在位置46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570中的一个或多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置3处的氨基酸取代是天冬酰胺(N)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置46处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置46处的氨基酸取代是苏氨酸(T)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置82处的氨基酸取代是色氨酸(W)对异亮氨酸(I)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置103处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的位置119处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置125处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置125处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置177处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置177处的氨基酸取代是组氨酸(H)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置180处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置180处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置180处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的位置185处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置187处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置200处的氨基酸取代是色氨酸(W)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置207处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的位置209处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置226处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置235处的氨基酸取代是精氨酸(R)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的位置240处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置241处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的位置243处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置258处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置296处的氨基酸取代是色氨酸(W)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置296处的氨基酸取代是酪氨酸(Y)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置296处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置298处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置298处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置298处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置311处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置311处的氨基酸取代是缬氨酸对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置315处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置319处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对苏氨酸(T)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置327处的氨基酸取代是精氨酸(R)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的位置328处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置340处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置340处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置421处的氨基酸取代是组氨酸(H)对天冬氨酸(D)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置436处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置456处的氨基酸取代是酪氨酸(Y)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置470处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置485处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置503处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置503处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对(M)甲硫氨酸的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置552处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置570处的氨基酸取代是苏氨酸(T)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的位置591处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对谷氨酰胺(Q)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置591处的氨基酸取代是精氨酸(R)对谷氨酰胺(Q)的取代。
在本公开内容的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM转座酶可以包含或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的位置103、194、372、375、450、509和570中的一个或多个处的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM转座酶可以包含或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的位置103、194、372、375、450、509和570中的两个、三个、四个、五个、六个或更多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM转座酶可以包含或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的位置103、194、372、375、450、509和570处的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置103处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置194处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的位置372处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的位置375处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置450处的氨基酸取代是天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置509处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的位置570处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，piggyBacTM转座酶可包含在SEQ ID NO：1的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggyBacTM转座酶可包含在SEQ ID NO：1的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案，piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的序列的位置372、375和450处的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBacTM转座酶可包含在SEQ ID NO：1的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID NO：1的位置372处的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代和在SEQ ID NO：1的位置375处的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBacTM转座酶可包含在SEQ IDNO：1的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID NO：1的位置372处的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代、在SEQ ID NO：1的位置375处的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和在SEQ ID NO：1的位置450处的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。
在本公开内容的某些实施方案中，转座酶是Sleeping Beauty转座酶(参见，例如，美国专利No.9,228,180，其内容整体引入本文)。在某些实施方案中，Sleeping Beauty转座酶是高活性的Sleeping Beauty(SB100X)转座酶。在某些实施方案中，Sleeping Beauty转座酶包含与以下序列至少75％相同的氨基酸序列：
Figure BPA0000288251470000161
在某些实施方案中，包括其中Sleeping Beauty转座酶是高活性的SleepingBeauty(SB100X)转座酶的那些，Sleeping Beauty转座酶包含与以下序列至少75％相同的氨基酸序列：
Figure BPA0000288251470000162
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，第一转座子和/或第二转座子进一步包含选择基因。在某些实施方案中，选择基因包括neo、DHFR(二氢叶酸还原酶)、TYMS(胸苷酸合成酶)、MGMT(O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、广谱抗药基因(MDR1)、ALDH1(醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C(RAD51种内同源基因(Paralog)C)、GCS(葡糖神经酰胺合酶)、NKX2.2(NK2同源异型框2)或其任何组合。在某些实施方案中，选择基因包括DHFR。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，第一转座子和或第二转座子包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)截短的胱天蛋白酶9多肽，其中所述诱导型胱天蛋白酶多肽不包含非人序列。在某些实施方案中，非人序列是限制酶切位点。在某些实施方案中，配体结合区诱导型胱天蛋白酶多肽包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽。在某些实施方案中，FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽的氨基酸序列包含在序列的位置36处的修饰。在某些实施方案中，修饰是在位置36处缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代(F36V)。在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含以下的氨基酸序列编码：
Figure BPA0000288251470000171
在某些实施方案中，FKBP12多肽由包含以下的核酸序列编码：
Figure BPA0000288251470000172
在某些实施方案中，诱导型促凋亡(proapoptotic)多肽的接头区由包含GGGGS(SEQ ID NO：17014)的氨基酸编码。在某些实施方案中，诱导型促凋亡多肽的接头区由包含GGAGGAGGAGGATCC(SEQ ID NO：17015)的核酸序列编码。
在某些实施方案中，诱导型促凋亡多肽的截短的胱天蛋白酶9多肽由不包含在序列的位置87处的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，诱导型促凋亡多肽的截短的胱天蛋白酶9多肽由不包含在序列的位置282处的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，诱导型促凋亡多肽的截短的胱天蛋白酶9多肽由包含以下的氨基酸编码：
Figure BPA0000288251470000181
在某些实施方案中，诱导型促凋亡多肽的截短的胱天蛋白酶9多肽由包含以下的核酸序列编码：
Figure BPA0000288251470000182
在某些实施方案中，诱导型促凋亡多肽由包含以下的氨基酸序列编码
Figure BPA0000288251470000183
在某些实施方案中，诱导型促凋亡多肽由包含以下的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470000191
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，第一转座子和/或第二转座子包含至少一种自切割肽。在某些实施方案中，所述至少一种自切割肽包括T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。在某些实施方案中，所述至少一种自切割肽包括T2A肽。在某些实施方案中，所述T2A肽包含包含EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ IDNO：17020)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述GSG-T2A肽包含包含GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：17021)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述E2A肽包含包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：17022)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述GSG-E2A肽包含包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：17023)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述F2A肽包含包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：17024)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述GSG-F2A肽包含包含GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ IDNO：17025)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述P2A肽包含包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：17026)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述GSG-P2A肽包含包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：17027)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述至少一种自切割肽放在(a)选择基因和诱导型转基因构建体或(b)诱导型转基因构建体和诱导型胱天蛋白酶多肽之间的位置。在某些实施方案中，所述至少一种自切割肽放在(a)选择基因和报道分子构建体或(b)报道分子构建体和诱导型胱天蛋白酶多肽之间的位置。
本公开内容提供了包含本公开内容的组合物的细胞。
本公开内容提供了一种在细胞中诱导条件性基因表达的方法，包括：(a)在适合于允许将诱导型转基因构建体整合到细胞基因组中和表达外源报道分子的条件下，使所述细胞与本公开内容的组合物接触，和(b)使外源受体和与其特异性结合的配体接触，以转导靶向诱导型启动子的细胞内信号，从而修饰基因表达。在某些实施方案中，细胞是体内、先体外后体内、体外或原位的。在某些实施方案中，细胞是免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)样细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞或脐带血(UCB)衍生的T细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是T-细胞。在某些实施方案中，细胞是自体的。在某些在实施方案中，细胞是同种异体的。
本公开内容提供了一种在有此需要的主体中治疗疾病或病症的方法，包括在适合于允许将诱导型转基因构建体整合到细胞基因组中和表达外源报道分子的条件下向所述主体施用本公开内容的组合物，和施用外源受体所选择性结合的配体，其中所述配体与所述外源受体的结合转导细胞内信号，以靶向控制所述转基因的诱导型启动子，其中所述转基因被表达，且其中所述转基因的产物对治疗所述疾病或病症是治疗有效的。在某些实施方案中，转基因的产物是分泌的蛋白。在某些实施方案中，分泌的蛋白是凝血因子。在某些实施方案中，凝血因子是因子IX。在某些实施方案中，所述疾病或病症是凝固病症(clotting disorder)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，适合于允许将诱导型转基因构建体整合到细胞基因组中和表达外源报道分子的条件包括体内条件。在某些实施方案中，适合于允许将诱导型转基因构建体整合到细胞基因组中和表达外源报道分子的条件包括基本类似于人体内部温度的温度、基本类似于人体内部CO2水平的CO2水平、基本类似于人体内部O2水平的O2水平、具有基本类似于人体内部电解质水平的电解质水平的水或盐环境。
在本公开内容的组合物和方法的某些实施方案中，外源受体所特异性结合的配体是非天然存在的。在某些实施方案中，配体是核酸、氨基酸、聚合物、有机小分子、无机小分子或其组合。示例性配体包括但不限于合成的、修饰的、重组的、突变的、嵌合的、内源的或非天然存在的蛋白(可溶的或膜结合的)、类固醇激素、气体颗粒、核酸、生长因子、神经递质、维生素和矿物质。
本公开内容提供了一种组合物，其包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，和(b)配体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源配体的序列，其中，在将(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列中时，表达外源配体，并且其中所述外源配体在结合受体时转导细胞内信号，所述细胞内信号靶向(a)的诱导型启动子以修饰基因表达。在某些实施方案中，配体包含非天然或合成的序列。在某些实施方案中，配体包含融合蛋白。在某些实施方案中，配体结合至细胞表面。在某些实施方案中，配体包含细胞内结构域。在某些实施方案中，细胞内结构域在表达配体的细胞中转导信号。在某些实施方案中，配体的结构基本上类似于本公开内容的组合物的受体的结构。在某些实施方案中，由配体转导的信号和由受体转导的信号包括双向信号。
附图简述
专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。专利局将于请求且支付必要的费用时提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A-B是描绘用于在T-细胞中表达的NF-KB诱导型载体的一对示意图。开发了两种T细胞活化NF-KB诱导型载体；一种具有在正向取向(A)的基因表达系统(GES)，且另一种在互补方向(B)，两者都在组成型EF1a启动子之前。这些载体还指导由T2A序列分开的CAR分子和DHFR选择基因的表达。条件性NF-KB诱导型系统和EF1a指导的基因两者都是可以使用电穿孔(EP)永久整合到T细胞中的piggyBac转座子的一部分。一旦整合到基因组中，T细胞就将组成型表达膜表面上的CAR和细胞内的DHFR，而NF-KB诱导型基因GFP的表达仅在T细胞活化时才将表达到最高水平。
图2是描绘了活化的T细胞中GFP的NF-KB诱导型表达的一对图。用表达在EF1a启动子控制下的抗-BCMA CAR和DHFR突变蛋白基因的piggyBac载体以及不存在(无GES对照)或存在驱动正向取向(pNFKB-GFP正向)或反向取向(pNFKB-GFP反向)的GFP表达的NF-KB诱导型表达系统对T细胞进行核转染(nucleofected)。在有氨甲蝶呤选择的情况下培养细胞，直到细胞几乎完全静息(第19天)为止，并在第5天和第19天评估GFP表达。在第5天，所有T细胞均增殖并被高度刺激，而带有NFKB诱导型表达盒的细胞由于强的NFκB活性而产生高水平的GFP。无GES对照细胞不表达可检测水平的GFP。截止第19天，GES T细胞几乎完全静息，且GFP表达显著低于第5天(～1/8MFI)，这是因为NFκB活性较低。在第19天仍观察到GFP表达，这可能是由于GFP蛋白的长半衰期(～30小时)，或通过例如TCR、CAR、细胞因子受体或生长因子受体信号的NFκB活性的基础水平。
图3是描绘了在有BCMA+肿瘤细胞的情况下GFP的NF-KB诱导型表达的抗-BCMA CAR介导的活化的一系列图。T细胞是未修饰的(模拟T细胞)或用表达在EF1a启动子控制下的抗-BCMA CAR和DHFR突变蛋白基因的piggyBac载体以及不存在(无GES对照)或存在驱动正向取向(pNFKB-GFP正向)或反向取向(pNFKB-GFP反向)的GFP表达的NF-KB诱导型表达系统进行核转染。在具有或不具有氨甲蝶呤选择(模拟T细胞)的情况下，将所有细胞培养22天，直到细胞几乎完全静息为止。然后在不存在(无刺激)或存在BCMA-(K562)、BMCA+(RPMI8226)或阳性对照抗-CD3抗-CD28活化试剂(CD3/28刺激)的情况下刺激细胞3天。在所有条件下由无GES对照或模拟T细胞都不可检测GFP表达。然而，虽然当与BCMA-K562细胞一起培养时，pNFKB-GFP正向和反向转座的细胞比起无刺激对照来显示少量GFP表达，但它们均在有BCMA+肿瘤细胞的情况下或在阳性对照条件下显示了基因表达的引人注目的上调。在与BCMA+肿瘤细胞共培养的pNFKB-GFP正向和反向转座的细胞之间几乎没有观察到GFP表达中的差异。
图4是证实诱导型基因的表达水平可以通过在启动子之前的应答元件的数目来调节的一系列图。T细胞用piggyBac载体进行核转染，所述piggyBac载体编码抗-BCMACARTyrin再加上选择基因，两者均在人EF1a启动子控制下。进一步地，载体另外编码驱动截短的CD19蛋白(dCD19)表达的条件性NF-KB诱导型基因表达系统，并包括从0到5不等的许多NFKB应答元件(RE)，无GES(无GES)，或接受电穿孔脉冲但没有piggyBac核酸(模拟)。仅显示了关于反向(相反)方向/取向的GES的数据。所有细胞培养18天，并包括使用氨甲蝶呤添加对于piggyBac-修饰的T细胞的选择。然后使用抗-CD3抗-CD28珠活化试剂刺激细胞3天，并在第0、3和18天通过FACS评估dCD19表面表达，并且将数据显示为FACS直方图和靶蛋白染色的MFI。在第0天，在用编码GES的载体转座的所有T细胞中都检测到了低水平的表面dCD19表达。在刺激后3天，对于所有表达GES的T细胞，观察到dCD19表达的引人注目的上调，而在具有更高数目的REs的那些中，表面表达的增加倍数更大。因此，表面dCD19表达与GES中编码的REs的数目成正比。在不带有GES的T细胞表面未检测到dCD19：无GES和模拟对照。
图5是显示导致血液凝固的人凝血途径的示意图。接触活化，例如通过损伤内皮，激活了内在凝固途径。组织因子激活外在凝固途径，例如在创伤后。两种途径汇合到凝血酶原到凝血酶的转化，其催化血纤蛋白原转化为血纤蛋白。聚合的血纤蛋白与血小板一起形成凝块。在没有因子IX(圈出的)的情况下，凝固是有缺陷的。因子VIII(FVIII)缺乏导致血友病A的发展。因子IX(FIX)缺乏导致血友病B的发展。在本公开内容的组合物和方法之前，对于血友病B的标准治疗包括在每年花费约$250,000的条件下每2到3天输注重组FIX。与这种标准治疗方案形成鲜明对照的是，本公开内容的T细胞在人中维持几十年。
图6是描绘分泌FIX的T细胞的一系列荧光激活细胞分选术(FACS图)。编码人因子IX转基因的T细胞在大约80％的细胞中显示T-细胞表型。按照从左到右的次序描述了6幅图片。(1)x-轴上的前向散射(FSC)对y-轴上的侧向散射(SSC)。x-轴以50k的增量从0到250千(缩写为k)，y-轴以50k的增量从0到250k。(2)x-轴上的FSC对细胞生存力标记7氨基放线菌素D(7AAD)。x-轴以50k的增量从0到250k进行标记。y-轴从上到下读数是-103、0、103、104、105。(3)在x-轴上显示与Cy7染料缀合的抗-CD56-APC(CDC56-APC-Cy7)，单位从0到105以10的幂递增。在y-轴上显示与藻红蛋白(PE)缀合的抗-CD3，单位从0到105以10的幂递增。(4)在x-轴上显示与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗-CD8，单位从0到105以10的幂递增。在y-轴上显示与Brilliant Violet 650染料(BV650)缀合的抗-CD4，单位从0到105以10的幂递增。(5)在x-轴上显示与Brilliant Violet 421染料(BV421)缀合的抗CD62L抗体，单位从0到105以10的幂递增。在y-轴上显示与PE和Cy7缀合的抗-CD45RA抗体，单位从0到105以10的幂递增。这幅图片被装入框中。(6)在x-轴上显示与Brilliant Violet 786(BV786)缀合的抗-CCR7抗体，单位从0到105以10的幂递增。在y-轴上显示与PE和Cy7缀合的抗-CD45RA，单位从0到105以10的幂递增。
图7A是显示在产生本公开内容的修饰的T细胞期间人因子IX分泌的图。在y-轴上。因子IX浓度以纳克(ng)/毫升(mL)为单位以20的增量从0到80。在x-轴上显示9天和12天T细胞。
图7B是显示由T细胞产生的分泌的因子IX的凝固活性的图。在y-轴上显示相对于人血浆的百分比因子IX活性，以2的增量从0到8。在x-轴上是9和12天T细胞。
图8是证实CD4阳性细胞中诱导型基因的表达水平可以通过在启动子之前的应答元件的数目来调节的一系列图。表达截短的CD19(dCD19)的CAR-T细胞被BCMA+H929多发性骨髓瘤细胞以2∶1的CAR-T∶H929比刺激。dCD19的表达由最小启动子(minimal promoter)驱动，所述最小启动子通过NF-kB应答元件的0、1、2、3、4或5个重复增强。BCMA CAR的表达由人延伸因子-1α(EF-1α)启动子驱动，所述启动子是通常用于人T细胞中的基因表达的组成型启动子。在肿瘤细胞刺激之前，与模拟T细胞对照相比，CAR和dCD19的表达均处于基础水平。肿瘤刺激时(第3天)，CAR和dCD19的表达水平均被上调，且然后接着被下调(第9、14天)，并在细胞再次恢复完全静息状态时(第20天)最后达到其各自的基础水平。然而，在细胞活化和静息过程期间，所有CAR-T细胞样品中的CAR表面表达被相等地上调或下调，而dCD19的表达水平与NF-κB应答元件的数目成正比(第3、9、14天)。数据显示为FACS直方图和靶蛋白染色的MFI。因此，表面dCD19表达与GES中编码的REs的数目成正比。在不带有GES的T细胞表面未检测到dCD19：无GES和模拟对照。
图9是证实CD8阳性细胞中诱导型基因的表达水平可以通过在启动子之前的应答元件的数目来调节的一系列图。表达截短的CD19(dCD19)的CAR-T细胞被BCMA+H929多发性骨髓瘤细胞以2∶1的CAR-T∶H929比刺激。dCD19的表达由最小启动子驱动，所述最小启动子通过NF-kB应答元件的0、1、2、3、4或5个重复增强。BCMACAR的表达由人延伸因子-1α(EF-1α)启动子驱动，所述启动子是通常用于人T细胞中的基因表达的组成型启动子。在肿瘤细胞刺激之前，与模拟T细胞对照相比，CAR和dCD19的表达均处于基础水平。肿瘤刺激时(第3天)，CAR和dCD19的表达水平均被上调，且然后接着被下调(第9、14天)，并在细胞再次恢复完全静息状态时(第20天)最后达到其各自的基础水平。然而，在细胞活化和静息过程期间，所有CAR-T细胞样品中的CAR表面表达被相等地上调或下调，而dCD19的表达水平与NF-κB应答元件的数目成正比(第3、9、14天)。数据显示为FACS直方图和靶蛋白染色的MFI。因此，表面dCD19表达与GES中编码的REs的数目成正比。在不带有GES的T细胞表面未检测到dCD19：无GES和模拟对照。
图10是描绘了靶向各种可用于装甲(armor)T-细胞的限制点信号传导蛋白的敲除效率的条线图。Cas-CLOVER用于敲除静息原代人全(pan)T细胞中的限制点受体PD-1、TGFBR2、LAG-3、TIM-3和CTLA-4。在y-轴上显示百分比敲除。如通过流式细胞术所测量的，基因编辑导致在细胞表面的蛋白表达的30-70％丧失。
图11是原代T-细胞中野生型、无效和转换受体(switch receptor)及其对细胞内信号传导(抑制性或刺激性)的影响的一系列示意图。在T-细胞上内源表达的野生型抑制性受体与其内源配体的结合导致抑制信号的传递，这部分降低了T-细胞效应子功能。然而，限制点受体蛋白(例如PD1(上图)或TGFBRII(下图))的细胞内结构域(ICD)的突变(突变的无效)或缺失(截短的无效)降低或消除当一种或多种关联配体结合时它的信号传导能力。因此，改造的突变或截短的无效受体在修饰的T细胞表面上的表达导致与内源表达的野生型受体竞争与一种或多种游离内源配体的结合，从而有效地降低或消除通过内源表达的野生型受体对抑制信号的递送。具体而言，任何由突变的或无效受体的结合都将掩蔽一种或多种内源配体与野生型受体结合，并导致有效递送至修饰的T-细胞的限制点信号传导的总水平稀化，从而降低或阻断修饰的T细胞的限制点抑制和功能耗尽。通过用来自共刺激分子(例如CD3z、CD28、4-1BB)或不同的抑制分子(例如CTLA4、PD1、Lag3)的ICD来置换野生型ICD产生了转换受体。在前一种情况下，由修饰的转换受体对一种或多种内源配体的结合导致阳性信号向T-细胞的递送，从而有助于增强修饰的T细胞的刺激并可能增强靶肿瘤细胞杀伤。在后一种情况下，由修饰的转换受体对一种或多种内源配体的结合导致阴性信号向T-细胞的递送，从而消除修饰的T细胞的刺激，并可能降低靶肿瘤细胞杀伤。在受体图中显示了信号肽(紫色箭标)、细胞外结构域(ECD)(亮绿色)、跨膜结构域(黄色)、细胞内信号传导结构域(ICD)(橙色)和置换ICD(绿色)。“*”表示突变的ICD。“+”表示存在限制点信号。“-”表示不存在限制点信号。
图12是显示具有可能有助于增加受体在修饰的T细胞表面上的表达的特定改变的无效受体设计的实例的示意图。显示了PD1和TGFBRII无效受体的实例，并且显示了PD1(上图)和TGFBRII(下图)的截短的无效受体的信号肽结构域(SP)、跨膜结构域(TM)和细胞外结构域(ECD)。上部四个分子中的第一个是野生型PD-1受体，其编码野生型PD-1SP和TM。对于PD1无效受体，描绘了用人T细胞CD8a受体的SP或TM结构域(红色)置换PD1野生型SP或TM结构域(绿色；浅绿色)。第二个分子编码与天然PD-1 TM一道的CD8a SP。第三个编码野生型PD-1 SP和替换的CD8a TM，且第四个编码替换的CD8a SP和TM两者。类似地，对于TGFβRII的无效受体，用人T细胞CD8a受体的SP结构域(红色)置换野生型TGFBRII SP(粉红色)。图的左侧列出了构建体的名称和每种构建体蛋白的氨基酸长度(aa)。
图13是描绘了如通过流式细胞术测定的PD1和TGFBRII无效受体在修饰的原代人T细胞表面上表达的一系列直方图。来自图12的六种截短的无效构建体的每一种都在原代人T细胞的表面上表达。用抗-PD1(上部；蓝色直方图)或抗-TGFβRII(下部；蓝色直方图)或同种型对照或仅第二抗体(secondary)(灰色直方图)对T细胞进行染色。门控对PD-1或TGFβRII表达染色阳性的细胞(门上方显示频率)，并在每个阳性直方图上方显示平均荧光强度(MFI)值。每个图的上方都描绘了无效受体构建体的名称。两种无效受体基因策略，用替换的CD8a置换野生型SP得到成功表达。02.8aSP-PD-1和02.8aSP-TGFβRII导致在T-细胞表面的最高水平表达。02.8aSP-PD-1无效受体表现出43,680的MFI，其是内源T细胞PD-1表达的177-倍和野生型PD-1无效受体的2.8-倍。02.8aSP-TGFβRII无效受体表现出13,809的MFI，其是内源T细胞TGFβRII表达的102-倍和野生型TGFβRII无效受体的1.8-倍。对于PD1和TGRBRII两者，用替换的CD8a SP置换野生型SP导致无效或转换受体增强的表面表达，这可能有助于使在结合和掩蔽一种或多种内源配体时限制点抑制的降低或阻断达到最大。
图14是Csy4-T2A-Clo051-G4S接头-dCas9构建体图的示意绘图(实施方案2)。
图15是pRT1-Clo051-dCas9双重NLS构建体图的示意绘图(实施方案1)。
图16是一对图，其比较了对于本公开内容的Cas-Clover融合蛋白的实施方案1(pRT1-Clo051-dCas9双重NLS，如图15中所示)或实施方案2(Csy4-T2A-Clo051-G4S接头-dCas9，如图14中所示)敲除全T-细胞表面上的B2M(左)或Jurkat细胞表面上的T-细胞受体的α-链(右)的表达的功效。对于右图，如所示的，以10μg或20μg提供融合蛋白。
图17是对编码实施方案1(泳道2；pRT1-Clo051-dCas9双重NLS，如图15所示)或实施方案2(泳道3；Csy4-T2A-Clo051-G4S接头-dCas9，如图14所示)的每一种的mRNA的凝胶电泳分析的照片。此外，包括编码实施方案2的mRNA的以前制剂(“旧版本”)(泳道4)用于比较。如所示的，编码两个不同实施方案的所有mRNA样品都作为凝胶内的不同条带迁移、具有高质量并且大小相似，如所预期的。
详述
本公开内容提供了一种组合物，其包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，和(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体的序列，其中，在将(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列中时，表达外源报道分子，并且其中所述外源报道分子在结合配体时转导细胞内信号，所述细胞内信号靶向(a)的诱导型启动子以修饰基因表达。
外源受体
本公开内容的外源受体可以包括非天然存在的受体。在某些实施方案中，非天然存在的受体是合成的、修饰的、重组的、突变的或嵌合的受体。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自T-细胞受体(TCR)的一个或多个序列。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自支架蛋白的一个或多个序列。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含跨膜结构域。在某些实施方案中，非天然存在的受体与细胞内受体相互作用，所述细胞内受体转导细胞内信号。在某些实施方案中，非天然存在的受体包含细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，非天然存在的受体是嵌合配体受体(CLR)。在某些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在某些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体。在某些实施方案中，嵌合配体受体包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含支架蛋白；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。
本公开内容提供了包含至少一种Centyrin的嵌合受体。本公开内容的嵌合配体/抗原受体(CLRs/CARs)可包含不止一种Centyrin，在本文中称为CARTyrin。
本公开内容提供了包含至少一种VHH的嵌合受体。本公开内容的嵌合配体/抗原受体(CLRs/CARs)可包含不止一种VHH，在本文中称为VCAR。
本公开内容的嵌合受体可以包含人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR的信号肽。本公开内容的铰链/间隔结构域可以包含人CD8α、IgG4和/或CD4的铰链/间隔/茎。本公开内容的细胞内结构域或胞内域可以包含人CD3ζ的细胞内信号传导结构域，并且可以进一步包含人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40细胞内区段或其任何组合。示例性的跨膜结构域包括但不限于人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域。
本公开内容提供了通过将本公开内容的CLR/CAR、CARTyrin和/或VCAR引入这些细胞而使其对一种或多种配体或抗原具有特异性的基因修饰细胞，例如T细胞、NK细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞(包括来自G-CSF-动员的(mobilized)外周血的T细胞)、脐带血(UCB)衍生的T细胞。可以通过电转移本公开内容的转座子和包含编码本公开内容的转座酶的序列(优选地，编码本公开内容的转座酶的序列是mRNA序列)的质粒或纳米质粒来修饰本公开内容的细胞。
在一些实施方案中，装甲的T-细胞包含组合物，其包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，和(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体例如CLR或CAR的序列，其中，在将(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列中时，表达外源受体，并且其中所述外源受体在结合配体或抗原时转导细胞内信号，所述细胞内信号直接或间接靶向调节诱导型转基因(a)表达的诱导型启动子以修饰基因表达。
嵌合受体
本公开内容的嵌合抗原受体(CARs)和/或嵌合配体受体(CLRs)可包含(a)包含抗原/配体识别区的胞外域，(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。在某些实施方案中，胞外域可进一步包含信号肽。另一方面或此外，在某些实施方案中，胞外域可进一步包含在所述抗原/配体识别区和所述跨膜结构域之间的铰链。在本公开内容的CARs的某些实施方案中，信号肽可包括编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。在本公开内容的CARs的某些实施方案中，信号肽可包括编码人CD8α信号肽的序列。在某些实施方案中，跨膜结构域可包括编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。在本公开内容的CARs的某些实施方案中，跨膜结构域可包括编码人CD8α跨膜结构域的序列。在本公开内容的CARs/CLRs的某些实施方案中，所述胞内域可包括人CD3ζ胞内域。
在本公开内容的CARs/CLRs的某些实施方案中，所述至少一个共刺激结构域可包括人4-1BB、CD28、CD40、ICOS、MyD88、OX-40细胞内区段或其任何组合。在本公开内容的CARs的某些实施方案中，所述至少一个共刺激结构域可包括CD28和/或4-1BB共刺激结构域。在本公开内容的CARs的某些实施方案中，铰链可包括衍生自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。在本公开内容的CARs/CLRs的某些实施方案中，铰链可包括衍生自人CD8α序列的序列。
CD28共刺激结构域可以包含包含以下序列的氨基酸序列
Figure BPA0000288251470000301
或与包含以下序列的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列
Figure BPA0000288251470000302
CD28共刺激结构域可以由包含以下序列的核酸序列编码：
Figure BPA0000288251470000303
4-1BB共刺激结构域可以包含包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：17006)的氨基酸序列，或与包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：17006)的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。4-1BB共刺激结构域可以由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470000311
4-1BB共刺激结构域可以位于跨膜结构域和CD28共刺激结构域之间。
在本公开内容的CARs/CLRs的某些实施方案中，铰链可包含衍生自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。在本公开内容的CARs/CLRs的某些实施方案中，铰链可包含衍生自人CD8α序列的序列。铰链可包含包含TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：17008)的人CD8α氨基酸序列或与包含TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：17008)的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。所述人CD8α铰链氨基酸序列可以由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470000312
ScFv
本公开内容提供了单链可变区片段(scFv)组合物以及使用这些组合物识别并结合特定靶蛋白的方法。ScFv组合物包含抗体的重链可变区和轻链可变区。可将ScFv组合物并入本公开内容的CAR或CLR的抗原/配体识别区中。本公开内容的CAR或CLR的抗原/配体识别区可以包含本公开内容的ScFv或ScFv组合物。在一些实施方案中，ScFv包含免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其中VH和VL结构域用接头连接。尽管去除了恒定区并引入了接头，但ScFvs仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。示例性的接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17033)的序列。
Centyrins
本公开内容的Centyrins与本公开内容的抗原或配体特异性结合。包含一种或多种特异性结合抗原的Centyrins的本公开内容的CARs和/或CLRs可以用于使细胞(例如细胞毒性免疫细胞)的特异性指向表达特定抗原的细胞。另一方面或此外，包含特异性结合配体抗原的Centyrin的本公开内容的CLRs可以细胞内地转导信号以诱导序列在诱导型启动子的控制下的表达。
本公开内容的Centyrins可包括蛋白支架，其中所述支架能够特异性结合抗原或配体。本公开内容的Centyrins可包括蛋白支架，所述蛋白支架包含至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列，其中所述支架能够特异性结合抗原或配体。所述至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域可以衍生自人蛋白。所述人蛋白可以是生腱蛋白-C。所述共有序列可以包含
Figure BPA0000288251470000321
或
Figure BPA0000288251470000322
Centyrin可包含与以下序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或其间任何百分比同一性的氨基序列
Figure BPA0000288251470000323
或
Figure BPA0000288251470000324
Centyrin可包含与以下序列具有至少74％同一性的氨基序列
Figure BPA0000288251470000325
或
Figure BPA0000288251470000331
共有序列可通过包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470000332
共有序列可在以下内的一个或多个位置处被修饰：(a)包含在共有序列的位置13-16处的氨基酸残基TEDS(SEQ ID NO：17035)或由其组成的A-B环；(b)包含在共有序列的位置22-28处的氨基酸残基TAPDAAF(SEQ ID NO：17036)或由其组成的B-C环；(c)包含在共有序列的位置38-43处的氨基酸残基SEKVGE(SEQ ID NO：17037)或由其组成的C-D环；(d)包含在共有序列的位置51-54处的氨基酸残基GSER(SEQ ID NO：17038)或由其组成的D-E环；(e)包含在共有序列的位置60-64处的氨基酸残基GLKPG(SEQ ID NO：17039)或由其组成的E-F环；(f)包含在共有序列的位置75-81处的氨基酸残基KGGHRSN(SEQ ID NO：17040)或由其组成的F-G环；或(g)(a)-(f)的任何组合。本公开内容的Centyrins可包含至少5种纤连蛋白III型(FN3)结构域、至少10种纤连蛋白III型(FN3)结构域或至少15种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
Centryrin可以以选自小于或等于10-9M、小于或等于10-10M、小于或等于10-11M、小于或等于10-12M、小于或等于10-13M、小于或等于10-14M和小于或等于10-15M的KD的至少一种亲和力结合抗原或配体。所述KD可由表面等离振子共振测定。
抗体模拟物
术语“抗体模拟物”意图描述特异性结合靶序列并且具有不同于天然存在的抗体的结构的有机化合物。抗体模拟物可以包括蛋白、核酸或小分子。本公开内容的抗体模拟物特异性结合的靶序列可以是抗原。抗体模拟物可以提供比起抗体来优越的特性，包括但不限于优越的溶解度、组织穿透、对热和酶的稳定性(例如，对酶促降解的抗性)以及较低的生产成本。示例性的抗体模拟物包括，但不限于，affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、和avimer(也称为亲合力(avidity)多聚体)、DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白(Designed Ankyrin Repeat Protein))、Fynomer，Kunitz结构域肽和monobody。
本公开内容的affibody分子包括蛋白支架，所述蛋白支架包含一个或多个没有任何二硫键的α螺旋或由其组成。优选地，本公开内容的affibody分子包含三个α螺旋或由三个α螺旋组成。例如，本公开内容的affibody分子可以包含免疫球蛋白结合结构域。本公开内容的affibody分子可以包含A蛋白的Z结构域。
本公开内容的affilin分子包括通过修饰例如γ-B晶体蛋白或泛素的暴露的氨基酸而产生的蛋白支架。affilin分子在功能上模仿抗体对抗原的亲和力，但在结构上不模仿抗体。在用于制备affilin的任何蛋白支架中，正确折叠的蛋白质分子中那些对溶剂或可能的结合配偶体可及的氨基酸都被认为是暴露的氨基酸。这些暴露的氨基酸中的任何一种或多种可以被修饰以特异性结合靶序列或抗原。
本公开内容的affimer分子包括蛋白支架，所述蛋白支架包含经改造以展示肽环的高度稳定的蛋白，所述肽环提供对于特定靶序列高亲和力的结合位点。本公开内容的示例性affimer分子包括基于半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白或其三级结构的蛋白支架。本公开内容的示例性affimer分子可以共有包含位于反平行β片层顶部的α-螺旋的共同三级结构。
本公开内容的affitin分子包括人工蛋白支架，其结构可以例如衍生自DNA结合蛋白(例如DNA结合蛋白Sac7d)。本公开内容的affitins选择性地结合靶序列，所述靶序列可以是抗原的全部或部分。通过使DNA结合蛋白的结合表面上的一个或多个氨基酸序列随机化，并使作为结果而产生的蛋白经受核糖体展示和选择，来制备本公开内容的示例性affitins。本公开内容的affitins的靶序列可以例如在基因组中或在肽、蛋白质、病毒或细菌的表面上找到。在本公开内容的某些实施方案中，affitin分子可以用作酶的特异性抑制剂。本公开内容的affitin分子可包括耐热蛋白或其衍生物。
本公开内容的alphabody分子也可以称为细胞穿透性Alphabodies(Cell-Penetrating Alphabodies)(CPAB)。本公开内容的alphabody分子包括与多种靶序列(包括抗原)结合的小蛋白(一般小于10kDa)。alphabody分子能够到达并结合细胞内靶序列。在结构上，本公开内容的alphabody分子包含形成单链α螺旋(类似于天然存在的卷曲螺旋结构)的人工序列。本公开内容的alphabody分子可以包括蛋白支架，所述蛋白支架包含被修饰以特异性结合靶蛋白的一个或多个氨基酸。无论分子的结合特异性如何，本公开内容的alphabody分子都保持正确的折叠和热稳定性。
本公开内容的anticalin分子包括与蛋白或小分子中的靶序列或位点结合的人工蛋白。本公开内容的anticalin分子可包括衍生自人脂质运载蛋白的人工蛋白。可以使用本公开内容的anticalin分子代替例如单克隆抗体或其片段。anticalin分子可能显示比单克隆抗体或其片段更优越的组织穿透和热稳定性。本公开内容的示例性anticalin分子可包含约180个氨基酸，质量为约20kDa。在结构上，本公开内容的anticalin分子包括桶结构，所述桶结构包含通过环成对连接的反平行β链和附着的α螺旋。在优选的实施方案中，本公开内容的anticalin分子包括桶结构，所述桶结构包含通过环成对连接的八个反平行β链和附着的α螺旋。
本公开内容的avimer分子包括与靶序列(其也可以是抗原)特异性结合的人工蛋白。本公开内容的avimer可以识别相同靶内或不同靶内的多个结合位点。当本公开内容的avimer识别不止一种靶时，avimer模仿双特异性抗体的功能。人工蛋白avimer可以包含两个或更多个各自约30-35个氨基酸的肽序列。这些肽可以通过一种或多种接头肽连接。avimer的一个或多个肽的氨基酸序列可以源自膜受体的A结构域。avimer具有刚性结构，其可以任选地包含二硫键和/或钙。与抗体相比，本公开内容的avimers可显示更高的热稳定性。
本公开内容的DARPins(设计的锚蛋白重复蛋白)包括对靶序列具有高特异性和高亲和力的基因工程、重组或嵌合蛋白。在某些实施方案中，本公开内容的DARPins衍生自锚蛋白蛋白并且任选地包含锚蛋白蛋白的至少三个重复序列基序(也称为重复结构单位)。锚蛋白蛋白介导高亲和力的蛋白-蛋白相互作用。本公开内容的DARPins包含大的靶相互作用表面。
本公开内容的Fynomers包括小的结合蛋白(约7kDa)，其衍生自人Fyn SH3结构域，并被改造以以与抗体相等的亲和力和相等的特异性结合靶序列和分子。
本公开内容的Kunitz结构域肽包括包含Kunitz结构域的蛋白支架。Kunitz结构域包含用于抑制蛋白酶活性的活性位点。在结构上，本公开内容的Kunitz结构域包含富含二硫键(disulfide)的α+β折叠。这个结构通过牛胰胰蛋白酶抑制剂例示。Kunitz结构域肽识别特定的蛋白结构，并充当竞争性蛋白酶抑制剂。本公开内容的Kunitz结构域可以包括艾卡拉肽(Ecallantide)(衍生自人脂蛋白相关促凝剂抑制物(LACI))。
本公开内容的monobodies是大小与单链抗体类似的小蛋白(包含约94个氨基酸，且具有约10kDa的质量)。这些基因工程蛋白特异性地结合靶序列，包括抗原。本公开内容的monobodies可以特异性地靶向一种或多种不同的蛋白或靶序列。在优选的实施方案中，本公开内容的monobodies包括模仿人纤连蛋白结构且更优选地模仿纤连蛋白的第十个细胞外III型结构域的结构的蛋白支架。纤连蛋白的第十个细胞外III型结构域及其monobody模拟物含有形成桶的七个β片层和在每侧对应于抗体的三个互补性决定区(CDRs)的三个暴露的环。与抗体的可变结构域的结构相对比，monobody缺乏对金属离子的任何结合位点以及中央二硫键。可以通过修饰环BC和FG来最优化多特异性monobodies。本公开内容的monobodies可以包含adnectin。
VHH
在本公开内容的组合物和方法的某些实施方案中，CAR或CLR包含单结构域抗体(SdAb)。在某些实施方案中，所述SdAb是VHH。
本公开内容提供了分别包含抗原或配体识别区的CAR或CLR，其包含至少一种VHH(以产生“VCAR”或“VCLR”)。本公开内容的CARs和CLRs可以包含不止一种VHH。例如，双特异性VCAR或VCLR可以包含两种VHHs。在双特异性VCAR或VCLR的一些实施方案中，每种VHH特异性结合不同的抗原。
本公开内容的VHH蛋白特异性地结合抗原或配体。包含一种或多种特异性结合抗原的VHHs的本公开内容的CARs可以用于使细胞(例如细胞毒性免疫细胞)的特异性指向表达特定抗原的靶细胞。包含一种或多种特异性结合抗原的VHHs的本公开内容的CLRs可以在结合任一VHH的配体时转导细胞内信号以激活在诱导型启动子的控制下的序列表达。
可以改变、添加和/或缺失编码本公开内容的VHH的序列，以降低免疫原性或降低、增强或修饰结合、亲和力、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、亲合力、特异性、半衰期、稳定性、溶解度或任何其他合适的特征，如本领域中已知的。
任选地，可以在保留对抗原或配体的高亲和力和其他有利生物学性质的情况下改造VHH蛋白。为了实现这个目的，可以通过使用亲本和改造的序列的三维模型对亲本序列和各种概念上改造的产品的分析过程，任选地制备VHH蛋白。三维模型是普遍可获得的，并且是本领域技术人员熟悉的。举例说明并展示所选择的候选序列的可能的三维构象结构，并且可以测量可能的免疫原性的计算机程序是可获得的(例如，Monrovia，Calif.的Xencor，Inc.的Immunofilter程序)。对这些展示的检查允许分析残基在候选序列的功能发挥中的可能作用，即，分析影响候选VHH蛋白结合其抗原/配体的能力的残基。这样，可以从亲本和参考序列中选择残基并将其组合，从而获得所期望的特征，例如对一种或多种靶抗原/配体的亲和力。另一方面，或除上述程序以外，可以使用其他合适的改造方法。
VH
在本公开内容的组合物和方法的某些实施方案中，CAR或CLR包含单结构域抗体(SdAb)。在某些实施方案中，SdAb是VH。
本公开内容提供了包含单结构域抗体(以分别产生“VCAR”或“VCLR”)的CARs/CLRs。在某些实施方案中，单结构域抗体包括VH。在某些实施方案中，VH分离或衍生自人序列。在某些实施方案中，VH包含人CDR序列和/或人构架序列和非人或人源化序列(例如大鼠Fc结构域)。在某些实施方案中，VH是完全人源化的VH。在某些实施方案中，VH既不是天然存在的抗体也不是天然存在的抗体的片段。在某些实施方案中，VH不是单克隆抗体的片段。在某些实施方案中，VH是UniDabTM抗体(TeneoBio)。
在某些实施方案中，使用UniRatTM(TeneoBio)系统和“基于NGS的发现(NGS-basedDiscovery)”对VH进行完全改造以产生VH。使用这种方法，特定的VH不是天然存在的，且使用完全改造的系统生成。VH不衍生自直接从宿主(例如，小鼠、大鼠或人)或直接从细胞或细胞系(杂交瘤)的单个克隆分离的天然存在的单克隆抗体(mAbs)。这些VH没有接着从所述细胞系克隆。相反，VH序列使用UniRatTM系统完全改造为包含具有大鼠Fc结构域的人可变区(VH结构域)的转基因，且因此是无轻链的人/大鼠嵌合体，并与标准mAb形式不同。敲除天然大鼠基因，并且在大鼠中表达的唯一抗体来自具有与大鼠Fc连接的VH结构域的转基因(UniAbs)。这些是UniRat中表达的唯一Abs。下一代测序(NGS)和生物信息学用于鉴定免疫后UniRatTM产生的重链抗体的全部抗原特异性谱。然后，使用独特的基因装配方法将抗体谱序列信息转化为可在体外针对多种功能进行筛选的完全人重链抗体的大集合。在某些实施方案中，通过在体外使人VH结构域与人Fcs融合(以产生非天然存在的重组VH抗体)来产生完全人源化的VH。在某些实施方案中，VH被完全人源化，但是它们在体内表达为无轻链的人/大鼠嵌合体(人VH，大鼠Fc)。完全人源化的VHs在体内表达为无轻链的人/大鼠嵌合体(人VH，大鼠Fc)，为约80kDa(与150kDa相比)。
本公开内容的VCARs/VCLRs可以包含本公开内容的至少一种VH。在某些实施方案中，本公开内容的VH可被修饰以去除Fc结构域或其一部分。在某些实施方案中，本公开内容的VH的构架序列可以被修饰以例如改善表达、降低免疫原性或改善功能，
转座子/转座酶
本公开内容的示例性转座子/转座酶系统包括但不限于piggyBac转座子和转座酶、Sleeping Beauty转座子和转座酶、Helraiser转座子和转座酶以及Tol2转座子和转座酶。
piggyBac转座酶识别转座子末端的转座子特异性反向末端重复序列(ITRs)，并将ITRs之间的内容物移动到TTAA染色体位点中。对于可以包含在ITRs之间的感兴趣的基因，piggyBac转座子系统没有有效负载限制。在某些实施方案中，且，特别地，在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBacTM或Super piggyBacTM(SPB)转座酶。在某些实施方案中，且，特别地，在其中转座酶是Super piggyBacTM(SPB)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶。piggyBac(PB)转座酶可包含与以下序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000391
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶，其包含在以下序列的位置30、165、282或538中的一个或多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000392
在某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶，其包含在SEQ ID NO：14487的序列的位置30、165、282或538的两个或更多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶，其包含在SEQ ID NO：14487的序列的位置30、165、282或538的三个或更多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBacTM(PB)转座酶，其包含在SEQ ID NO：14487的序列的下述位置30、165、282和538的每一个处都具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487的序列的位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对异亮氨酸(I)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487的序列的位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对甘氨酸(G)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487的序列的位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487的序列的位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对天冬酰胺(N)的取代。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是Super piggyBacTM(SPB)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的Super piggyBacTM(SPB)转座酶可以包含SEQ ID NO：14487的序列的氨基酸序列或由其组成，其中位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对异亮氨酸(I)的取代，位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对甘氨酸(G)的取代，位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，且位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，Super piggyBacTM(SPB)转座酶可以包含与以下序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000401
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591中的一个或多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在位置46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570中的一个或多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置3处的氨基酸取代是天冬酰胺(N)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置46处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置46处的氨基酸取代是苏氨酸(T)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ IDNO：14487或SEQ ID NO：14484的位置82处的氨基酸取代是色氨酸(W)对异亮氨酸(I)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置103处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置119处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQ IDNO：14487或SEQ ID NO：14484的位置125处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置125处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置177处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置177处的氨基酸取代是组氨酸(H)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置180处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置180处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置180处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置185处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQID NO：14484的位置187处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置200处的氨基酸取代是色氨酸(W)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置207处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ IDNO：14484的位置209处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置226处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置235处的氨基酸取代是精氨酸(R)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQID NO：14484的位置240处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置241处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置243处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ IDNO：14484的位置258处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置296处的氨基酸取代是色氨酸(W)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置296处的氨基酸取代是酪氨酸(Y)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ IDNO：14484的位置296处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置298处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置298处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQID NO：14484的位置298处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置311处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置311处的氨基酸取代是缬氨酸对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ IDNO：14484的位置315处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置319处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对苏氨酸(T)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置327处的氨基酸取代是精氨酸(R)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置328处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置340处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置340处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置421处的氨基酸取代是组氨酸(H)对天冬氨酸(D)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置436处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置456处的氨基酸取代是酪氨酸(Y)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ IDNO：14484的位置470处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置485处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置503处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ IDNO：14484的位置503处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对(M)甲硫氨酸的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置552处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置570处的氨基酸取代是苏氨酸(T)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ IDNO：14484的位置591处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对谷氨酰胺(Q)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置591处的氨基酸取代是精氨酸(R)对谷氨酰胺(Q)的取代。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM转座酶可以包含或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置103、194、372、375、450、509和570中的一个或多个处的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM转座酶可以包含或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置103、194、372、375、450、509和570中的两个、三个、四个、五个、六个或更多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM转座酶可以包含或SuperpiggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置103、194、372、375、450、509和570处的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置103处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置194处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置372处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置375处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置450处的氨基酸取代是天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置509处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置570处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，piggyBacTM转座酶可包含在SEQ ID NO：14487的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggyBacTM转座酶可包含在SEQ ID NO：14487的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案，piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置372、375和450处的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBacTM转座酶可包含在SEQ ID NO：14487的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID NO：14487的位置372处的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代和在SEQ ID NO：14487的位置375处的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBacTM转座酶可包含在SEQ ID NO：14487的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID NO：14487的位置372处的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代、在SEQ ID NO：14487的位置375处的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和在SEQ ID NO：14487的位置450处的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。
sleeping beauty转座子通过识别ITRs并将ITRs之间的内容物移动到TA染色体位点中的Sleeping Beauty转座酶转座到靶基因组中。在各种实施方案中，SB转座子介导的基因转移或使用许多类似的转座子中的任何一种的基因转移可用于本公开内容的组合物和方法中。
在某些实施方案中，且，特别地，在其中转座子是Sleeping Beauty转座子的那些实施方案中，转座酶是Sleeping Beauty转座酶或高活性的Sleeping Beauty转座酶(SB100X)。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，Sleeping Beauty转座酶包含与以下序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列：
Figure BPA0000288251470000451
在本公开内容的方法的某些实施方案中，高活性的Sleeping Beauty(SB100X)转座酶包含与以下序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列：
Figure BPA0000288251470000461
Helraiser转座子由Helitron转座酶转座。Helitron转座酶转移Helraiser转座子，一种在约3000至3600万年前活跃的来自蝙蝠基因组中的古老元件。本公开内容的示例性Helraiser转座子包括Helibat1，其包含包含以下序列的核酸序列：
Figure BPA0000288251470000462
Figure BPA0000288251470000471
Figure BPA0000288251470000481
与其他转座酶不同，Helitron转座酶不含有RNA酶-H样催化结构域，而是包含由复制起始子结构域(Rep)和DNA解旋酶结构域组成的RepHel基序。Rep结构域是HUH核酸酶超家族的核酸酶结构域。
本公开内容的示例性Helitron转座酶包含包含以下序列的氨基酸序列：
Figure BPA0000288251470000491
在Helitron转座中，靠近转座子3′端的发夹起终止子的作用。然而，这个发夹可被转座酶绕过，从而导致侧翼序列的转导。此外，Helraiser转座生成了共价闭合环状中间体。此外，Helitron转座可缺乏靶位点重复。在Helraiser序列中，转座酶的侧翼是称为LTS和RTS的左和右末端序列。这些序列以保守的5′-TC/CTAG-3′基序终止。具有形成发夹终止结构潜力的19bp回文序列位于RTS上游11个核苷酸处，且由序列GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG(SEQ ID NO：14500)组成。
Tol2转座子可以分离或衍生自青
Figure BPA0000288251470000492
鱼的基因组，并且可以类似于hAT家族的转座子。本公开内容的示例性Tol2转座子由包含约4.7kb的序列编码，并含有编码Tol2转座酶的基因，其含有四个外显子。本公开内容的示例性Tol2转座酶包含包含以下序列的氨酸序列：
Figure BPA0000288251470000501
本公开内容的示例性Tol2转座子，包括反向重复序列、亚端序列和Tol2转座酶，由包含以下序列的核酸序列编码：
Figure BPA0000288251470000502
Figure BPA0000288251470000511
Figure BPA0000288251470000521
本公开内容的示例性转座子/转座酶系统包括但不限于piggyBac和piggyBac-样转座子和转座酶。
piggyBac和piggyBac-样转座酶识别转座子末端的转座子特异性反向末端重复序列(ITRs)，并将ITRs之间的内容物移动到TTAA或TTAT染色体位点中。对于可以包含在ITRs之间的感兴趣的基因，piggyBac或piggyBac-样转座子系统没有有效负载限制。
在某些实施方案中，且，特别地，在其中转座子是piggyBac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggyBacTM、Super piggyBacTM(SPB)转座酶。在某些实施方案中，且，特别地，在其中转座酶是piggyBacTM、Super piggyBacTM(SPB)的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mRNA序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000531
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶，其包含在以下序列的位置30、165、282或538中的一个或多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000532
在某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶，其包含在SEQ IDNO：14487的序列的位置30、165、282或538的两个或更多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶，其包含在SEQID NO：14487的序列的位置30、165、282或538的三个或更多个处具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶，其包含在SEQ ID NO：14487的序列的下述位置30、165、282和538的每一个处都具有氨基酸取代的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487的序列的位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对异亮氨酸(I)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487的序列的位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对甘氨酸(G)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487的序列的位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487的序列的位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对天冬酰胺(N)的取代。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是Super piggyBacTM(SPB)或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的Super piggyBacTM(SPB)或piggyBac-样转座酶可以包含SEQ ID NO：14487的序列的氨基酸序列或由其组成，其中位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对异亮氨酸(I)的取代，位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对甘氨酸(G)的取代，位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代，且位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，SuperpiggyBacTM(SPB)或piggyBac-样转座酶可以包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000541
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM、Super piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591中的一个或多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM、Super piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可以进一步包含在位置46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570中的一个或多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置3处的氨基酸取代是天冬酰胺(N)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置46处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置46处的氨基酸取代是苏氨酸(T)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置82处的氨基酸取代是色氨酸(W)对异亮氨酸(I)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置103处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置119处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置125处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置125处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置177处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置177处的氨基酸取代是组氨酸(H)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置180处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置180处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置180处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQID NO：14484的位置185处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置187处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置200处的氨基酸取代是色氨酸(W)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQID NO：14484的位置207处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置209处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置226处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置235处的氨基酸取代是精氨酸(R)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置240处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置241处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对苯丙氨酸(F)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置243处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置258处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置296处的氨基酸取代是色氨酸(W)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置296处的氨基酸取代是酪氨酸(Y)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置296处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置298处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置298处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置298处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置311处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置311处的氨基酸取代是缬氨酸对脯氨酸(P)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置315处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置319处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对苏氨酸(T)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQID NO：14484的位置327处的氨基酸取代是精氨酸(R)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置328处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对酪氨酸(Y)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置340处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ IDNO：14484的位置340处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对半胱氨酸(C)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置421处的氨基酸取代是组氨酸(H)对天冬氨酸(D)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置436处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQID NO：14484的位置456处的氨基酸取代是酪氨酸(Y)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置470处的氨基酸取代是苯丙氨酸(F)对亮氨酸(L)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置485处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQID NO：14484的位置503处的氨基酸取代是亮氨酸(L)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置503处的氨基酸取代是异亮氨酸(I)对(M)甲硫氨酸的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置552处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对缬氨酸(V)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置570处的氨基酸取代是苏氨酸(T)对丙氨酸(A)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置591处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对谷氨酰胺(Q)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置591处的氨基酸取代是精氨酸(R)对谷氨酰胺(Q)的取代。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM或piggyBac-样转座酶或可以包含或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置103、194、372、375、450、509和570中的一个或多个处的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可以包含或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置103、194、372、375、450、509和570中的两个、三个、四个、五个、六个或更多个处的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538处的上述突变的那些实施方案，piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可以包含或Super piggyBacTM转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置103、194、372、375、450、509和570处的氨基酸取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置103处的氨基酸取代是脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置194处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，SEQ IDNO：14487或SEQ ID NO：14484的位置372处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置375处的氨基酸取代是丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置450处的氨基酸取代是天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。在某些实施方案中，SEQ IDNO：14487或SEQ ID NO：14484的位置509处的氨基酸取代是甘氨酸(G)对丝氨酸(S)的取代。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的位置570处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对天冬酰胺(N)的取代。在某些实施方案中，piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可包含在SEQ ID NO：14487的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可包含在SEQ ID NO：14487的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代的那些实施方案，piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可以进一步包含在SEQ ID NO：14487或SEQ ID NO：14484的序列的位置372、375和450处的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可包含在SEQ ID NO：14487的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID NO：14487的位置372处的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代和在SEQ ID NO：14487的位置375处的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代。在某些实施方案中，piggyBacTM或piggyBac-样转座酶可包含在SEQ ID NO：14487的位置194处的缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代、在SEQ ID NO：14487的位置372处的丙氨酸(A)对精氨酸(R)的取代、在SEQ ID NO：14487的位置375处的丙氨酸(A)对赖氨酸(K)的取代和在SEQID NO：14487的位置450处的天冬酰胺(N)对天冬氨酸(D)的取代。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自昆虫。在某些实施方案中，所述昆虫是粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(GenBank检索No.AAA87375；SEQ IDNO：17083)、黑点银纹夜蛾(Argyrogramma agnata)(GenBank检索No.GU477713；SEQ ID NO：17084，SEQ ID NO：17085)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)(GenBank检索No.XP_312615(SEQ ID NO：17086)；GenBank检索No.XP_320414(SEQ ID NO：17087)；GenBank检索No.XP_310729(SEQ ID NO：17088))、棉蚜(Aphis gossypii)(GenBank检索No.GU329918；SEQ IDNO：17089，SEQ ID NO：17090)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)(GenBank检索No.XP_001948139；SEQ ID NO：17091)、小地老虎(Agrotis ipsilon)(GenBank检索No.GU477714；SEQ ID NO：17092，SEQ ID NO：17093)、家蚕(Bombyx mori)(GenBank检索No.BAD11135；SEQID NO：17094)、二化螟(Chilo suppressalis)(GenBank检索No.JX294476；SEQ ID NO：17095，SEQ ID NO：17096)、黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)(GenBank检索No.AAL39784；SEQ ID NO：17097)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)(GenBank检索No.ABS18391；SEQ ID NO：17098)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)(GenBank检索No.ABD76335；SEQ ID NO：17099)、银锭夜蛾(Macdunnoughia crassisigna)(GenBank检索No.EU287451；SEQ ID NO：17100，SEQ ID NO：17101)、棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)(GenBank检索No.GU270322；SEQ ID NO：17102，SEQ ID NO：17103)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)(GenBank检索No.XP_001814566；SEQ ID NO：17104)、银纹夜蛾(Ctenoplusia agnata)(也称为黑点银纹夜蛾)、Messour bouvieri、苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)、美洲东部熊蜂(Bombus impatiens)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)或意大利蜜蜂(Apis mellifera)。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自昆虫。在某些实施方案中，昆虫是粉纹夜蛾(AAA87375)。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自昆虫。在某些实施方案中，昆虫是家蚕(BAD11135)。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自甲壳动物。在某些实施方案中，甲壳动物是多蚤溞(Daphnia pulicaria)(AAM76342，SEQ ID NO：17105)。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是热带爪蟾(Xenopus tropicalis)(GenBank检索No.BAF82026；SEQ ID NO：17106)、智人(Homo sapiens)(GenBank检索No.NP_689808；SEQ ID NO：17107)、小鼠(Mus musculus)(GenBank检索No.NP_741958；SEQ ID NO：17108)、食蟹猕猴(Macacafascicularis)(GenBank检索No.AB179012；SEQ ID NO：17108，SEQ ID NO：17109)、大鼠(Rattus norvegicus)(GenBank检索No.XP_220453；SEQ ID NO：17110)或小棕蝠(Myotislucifugus)。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自尾索动物。在某些实施方案中，尾索动物是玻璃海鞘(Ciona intestinalis)(GenBank检索No.XP_002123602；SEQ ID NO：17111)。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶在染色体位点内的序列5’-TTAT-3’(TTAT靶序列)处插入转座子。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶在染色体位点内的序列5’-TTAA-3’(TTAA靶序列)处插入转座子。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的靶序列包含5’-CTAA-3’、5’-TTAG-3’、5’-ATAA-3’、5’-TCAA-3’、5’AGTT-3’、5’-ATTA-3’、5’-GTTA-3’、5’-TTGA-3’、5’-TTTA-3’、5’-TTAC-3’、5’-ACTA-3’、5’-AGGG-3’、5’-CTAG-3’、5’-TGAA-3’、5’-AGGT-3’、5’-ATCA-3’、5’-CTCC-3’、5’-TAAA-3’、5’-TCTC-3’、5’TGAA-3’、5’-AAAT-3’、5’-AATC-3’、5’-ACAA-3’、5’-ACAT-3’、5’-ACTC-3’、5’-AGTG-3’、5’-ATAG-3’、5’-CAAA-3’、5’-CACA-3’、5’-CATA-3’、5’-CCAG-3’、5’-CCCA-3’、5’-CGTA-3’、5’-GTCC-3’、5’-TAAG-3’、5’-TCTA-3’、5’-TGAG-3’、5’-TGTT-3’、5’-TTCA-3’5’-TTCT-3’和5’-TTTT-3’或由其组成。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自家蚕。所述piggyBac或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000611
所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000621
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶与核定位信号融合。在某些实施方案中，与核定位信号融合的piggyBac或piggyBac-样转座酶的氨基酸序列由包含以下序列的多核苷酸序列编码：
Figure BPA0000288251470000622
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是高活性的。高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶是一种比其所衍生自的天然存在的变体更具活性的转座酶。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自家蚕。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是SEQ ID NO：14505的高活性变体。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含与以下序列至少90％相同的序列：
Figure BPA0000288251470000631
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14576。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000632
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000633
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000634
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000641
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000642
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶比SEQ ID NO：14505的转座酶更具活性。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶与SEQ IDNO：14505至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或其间任何百分比相同。
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含在选自92、93、96、97、165、178、189、196、200、201、211、215、235、238、246、253、258、261、263、271、303、321、324、330、373、389、399、402、403、404、448、473、484、507、523、527、528、543、549、550、557、601、605、607、609、610或其组合的位置处的氨基酸取代(相对于SEQ ID NO：14505)。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含Q92A、V93L、V93M、P96G、F97H、F97C、H165E、H165W、E178S、E178H、C189P、A196G、L200I、A201Q、L211A、W215Y、G219S、Q235Y、Q235G、Q238L、K246I、K253V、M258V、F261L、S263K、C271S、N303R、F321W、F321D、V324K、V324H、A330V、L373C、L373V、V389L、S399N、R402K、T403L、D404Q、D404S、D404M、N441R、G448W、E449A、V469T、C473Q、R484K T507C、G523A、I527M、Y528K Y543I、E549A、K550M、P557S、E601V、E605H、E605W、D607H、S609H、L610I或其任何组合的氨基酸取代。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含Q92A、V93L、V93M、P96G、F97H、F97C、H165E、H165W、E178S、E178H、C189P、A196G、L200I、A201Q、L211A、W215Y、G219S、Q235Y、Q235G、Q238L、K246I、K253V、M258V、F261L、S263K、C271S、N303R、F321W、F321D、V324K、V324H、A330V、L373C、L373V、V389L、S399N、R402K、T403L、D404Q、D404S、D404M、N441R、G448W、E449A、V469T、C473Q、R484K T507C、G523A、I527M、Y528K Y543I、E549A、K550M、P557S、E601V、E605H、E605W、D607H、S609H和L610I的氨基酸取代。
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含非野生型的氨基酸的一个或多个取代，其中对野生型氨基酸的一个或多个取代包括E4X、A12X、M13X、L14X、E15X、D20X、E24X、S25X、S26X、S27X、D32X、H33X、E36X、E44X、E45X、E46X、I48X、D49X、R58X、A62X、N63X、A64X、I65X、I66X、N68X、E69X、D71X、S72X、D76X、P79X、R84X、Q85X、A87X、S88X、Q92X、V93X、S94X、G95X、P96X、F97X、Y98X、T99X、I145X、S149X、D150X、L152X、E154X、T157X、N160X、S161X、S162X、H165X、R166X、T168X、K169X、T170X、A171X、E173X、S175X、S176X、E178X、T179X、M183X、Q184X、T186X、T187X、L188X、C189X、L194X、I195X、A196X、L198X、L200X、A201X、L203X、I204X、K205X、A206X、N207X、Q209X、S210X、L211X、K212X、D213X、L214X、W215X、R216X、T217X、G219X、V222X、D223X、I224X、T227X、M229X、Q235X、L237X、Q238X、N239X、N240X、P302X、N303X、P305X、A306X、K307X、Y308X、I310X、K311X、I312X、L313X、A314X、L315X、V316X、D317X、A318X、K319X、N320X、F321X、Y322X、V323X、V324X、L326X、E327X、V328X、A330X、Q333X、P334X、S335X、G336X、P337X、A339X、V340X、S341X、N342X、R343X、P344X、F345X、E346X、V347X、E349X、I352X、Q353X、V355X、A356X、R357X、N361X、D365X、W367X、T369X、G370X、L373X、M374X、L375X、H376X、N379X、E380X、R382X、V386X、V389X、N392X、R394X、Q395X、S399X、F400X、I401X、R402X T403X、D404X、R405X、Q406X、P407X、N408X、S409X、S410X、V411X、F412X、F414X、Q415X、I418X、T419X、L420X、N428X V432X、M434X、D440X、N441X、S442X、I443X、D444X、E445X、G448X、E449X、Q451X、K452X、M455X、I456X、T457X、F458X、S461X、A464X、V466X、Q468X、V469X、E471X、L472X、C473X、A474X、K483X、W485X、T488X、L489X、Y491X、G492X、V493X、M496X、I499X、C502X、I503X、T507X、K509X、N510X、V511X、T512X、I513X、R515X、E517X、S521X、G523X、L524X、S525X、I527X、Y528X、E529X、H532X、S533X、N535X、K536X、K537X、N539X、I540X、T542X、Y543X、Q546X、E549X、K550X、Q551X、G553X、E554X、P555X、S556X、P557X、R558X、H559X、V560X、N561X、V562X、P563X、G564X、R565X、Y566X、V567X、Q570X、D571X、P573X、Y574X、K576X、K581X、S583X、A586X、A588X、E594X、F598X、L599X、E601X、N602X、C603X、A604X、E605X、L606X、D607X、S608X、S609X或L610X的取代(相对于SEQ ID NO：14505)。可以在美国专利No.10,041,077中找到高活性氨基酸取代的清单，所述专利的内容整体引入本文作为参考。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是整合缺陷的。在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶是可以切除其相应转座子但以比相应的野生型转座酶更低的频率整合被切除的转座子的转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是SEQ ID NO：14505的整合缺陷变体。
在某些实施方案中，有切除能力的、整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含非野生型的氨基酸的一个或多个取代，其中对野生型氨基酸的一个或多个取代包括R9X、A12X、M13X、D20X、Y21K、D23X、E24X、S25X、S26X、S27X、E28X、E30X、D32X、H33X、E36X、H37X、A39X、Y41X、D42X、T43X、E44X、E45X、E46X、R47X、D49X、S50X、S55X、A62X、N63X、A64X、I66X、A67X、N68X、E69X、D70X、D71X、S72X、D73X、P74X、D75X、D76X、D77X、I78X、S81X、V83X、R84X、Q85X、A87X、S88X、A89X、S90X、R91X、Q92X、V93X、S94X、G95X、P96X、F97X、Y98X、T99X、W012X、G103X、Y107X、K108X、L117X、I122X、Q128X、I312X、D135X、S137X、E139X、Y140X、I145X、S149X、D150X、Q153X、E154X、T157X、S161X、S162X、R164X、H165X、R166X、Q167X、T168X、K169X、T170X、A171X、A172X、E173X、R174X、S175X、S176X、A177X、E178X、T179X、S180X、Y182X、Q184X、E185X、T187X、L188X、C189X、L194X、I195X、A196X、L198X、L200X、A201X、L203X、I204X、K205X、N207X、Q209X、L211X、D213X、L214X、W215X、R216X、T217X、G219X、T220X、V222X、D223X、I224X、T227X、T228X、F234X、Q235X、L237X、Q238X、N239X、N240X、N303X、K304X、I310X、I312X、L313X、A314X、L315X、V316X、D317X、A318X、K319X、N320X、F321X、Y322X、V323X、V324X、N325X、L326X、E327X、V328X、A330X、G331X、K332X、Q333X、S335X、P337X、P344X、F345X、E349X、H359X、N361X、V362X、D365X、F368X、Y371X、E372X、L373X、H376X、E380X、R382X、R382X、V386X、G387X、T388X、V389X、K391X、N392X、R394X、Q395X、E398X、S399X、F400X、I401X、R402X T403X、D404X、R405X、Q406X、P407X、N408X、S409X、S410X、Q415X、K416X、A424X、K426X、N428X、V430X、V432X、V433X、M434X、D436X、D440X、N441X、S442X、I443X、D444X、E445X、S446X、T447X、G448X、E449X、K450X、Q451X、E454X、M455X、I456X、T457X、F458X、S461X、A464X、V466X、Q468X、V469X、C473X、A474X、N475X、N477X、K483X、R484X、P486X、T488X、L489X、G492X、V493X、M496X、I499X、I503X、Y505X、T507X、N510X、V511X、T512X、I513X、K514X、T516X、E517X、S521X、G523X、L524X、S525X、I527X、Y528X、L531X、H532X、S533X、N535X、I540X、T542X、Y543X、R545X、Q546X、E549X、L552X、G553X、E554X、P555X、S556X、P557X、R558X、H559X、V560X、N561X、V562X、P563X、G564X、V567X、Q570X、D571X、P573X、Y574X、K575X、K576X、N585X、A586X、M593X、K596X、E601X、N602X、A604X、E605X、L606X、D607X、S608X、S609X或L610X的取代(相对于SEQID NO：14505)。可以在美国专利No.10,041,077中找到整合缺陷的氨基酸取代的清单，所述专利的内容整体引入作为参考。
在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000681
在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000682
在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000683
在某些实施方案中，整合缺陷的转座酶包含与SEQ ID NO：14608至少90％相同的序列。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自家蚕。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000691
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000692
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000693
在某些实施方案中，piggyBacTM(PB)或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000694
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含对应于SEQ ID NO：14506的左序列和对应于SEQ ID NO：14507的右序列。在某些实施方案中，一个piggyBac或piggyBac-样转座子末端与SEQ ID NO：14506至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同或其间任何百分比相同，且另一个piggyBac或piggyBac-样转座子末端与SEQID NO：14507至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或其间任何百分比相同。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14506和SEQ ID NO：14507或SEQ ID NO：14509。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ IDNO：14508和SEQ ID NO：NO：14507或SEQ ID NO：14509。在某些实施方案中，左和右转座子末端在其末端共有紧邻5′-TTAT-3靶插入位点的CCCGGCGAGCATGAGG(SEQ ID NO：14510)的16bp重复序列，所述重复序列在两个末端取向相反。在某些实施方案中，左转座子末端从包含5′-TTATCCCGGCGAGCATGAGG-3(SEQ ID NO：14511)的序列开始，且右转座子以包含这个序列的反向互补序列：5′-CCTCATGCTCGCCGGGTTAT-3′(SEQ ID NO：14512)的序列结束。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含一个末端，所述末端包含SEQ ID NO：14506或SEQ ID NO：14508的至少14、16、18、20、30或40个邻接核苷酸。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含一个末端，所述末端包含SEQ ID NO：14507或SEQ ID NO：14509的至少14、16、18、20、30或40个邻接核苷酸。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含与SEQ ID NO：14506或SEQ ID NO：14508具有至少90％同一性的一个末端。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含与SEQ ID NO：14507或SEQ ID NO：14509具有至少90％同一性的一个末端。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000701
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000702
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCCGGCGAGCATGAGG(SEQID NO：14510)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14510的ITR序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含TTATCCCGGCGAGCATGAGG(SEQ ID NO：14511)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含来自SEQ ID NO：14511的至少16个邻接核苷酸。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCTCATGCTCGCCGGGTTAT(SEQ ID NO：14512)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含来自SEQ ID NO：14512的至少16个邻接核苷酸。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含一个末端，所述末端包含来自SEQ ID NO：14511的至少16个邻接核苷酸，和一个末端，所述末端包含来自SEQ ID NO：14512的至少16个邻接核苷酸。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14511和SEQ ID NO：14512。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含TTAACCCGGCGAGCATGAGG(SEQ ID NO：14513)的序列。在某些实施方式中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCTCATGCTCGCCGGGTTAA(SEQ ID NO：14514)的序列。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子可具有包含SEQ ID NO：14506和SEQ ID NO：14507，或这些中的任一个或两者的与SEQ ID NO：14506或SEQ ID NO：14507具有至少90％序列同一性的变体的末端，并且piggyBac或piggyBac-样转座酶具有SEQ IDNO：14504或SEQ ID NO：14505的序列，或与SEQ ID NO：14504或SEQ ID NO：14505具有至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比同一性的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含插入一对反向重复序列之间的异源多核苷酸，其中所述转座子能够通过与SEQ ID NO：14504或SEQ ID NO：14505具有至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比同一性的piggyBac或piggyBac-样转座酶转座。在某些实施方案中，转座子包含两个转座子末端，其各自在两个转座子末端以相反取向包含SEQ ID NO：14510。在某些实施方案中，每个反向末端重复(ITR)与SEQ ID NO：14510至少90％相同。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子能够通过piggyBac或piggyBac-样转座酶在靶核酸内的序列5′-TTAT-3处插入。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的一个末端包含来自SEQ ID NO：14506的至少16个邻接核苷酸，且另一转座子末端包含来自SEQ ID NO：14507的至少16个邻接核苷酸。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的一端包含来自SEQ ID NO：14506的至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少22个、至少25个、至少30个邻接核苷酸，且另一转座子末端包含来自SEQ ID NO：14507的至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少22个、至少25个、至少30个邻接核苷酸。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含对应于SEQ ID NO：14506和SEQ ID NO：14507的转座子末端(每个末端包含ITR)，且具有对应于5′-TTAT3′的靶序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子也包含编码转座酶的序列(例如SEQ IDNO：14505)。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含对应于SEQ ID NO：14506的一个转座子末端和对应于SEQ ID NO：14516的第二转座子末端。SEQ ID NO：14516与SEQ ID NO：14507非常相似，但是在ITR之前不久具有大的插入。尽管两个转座子末端的ITR序列相同(它们都与SEQ ID NO：14510相同)，但它们具有不同的靶序列：第二转座子具有对应于5′-TTAA-3′的靶序列，从而提供证据表明，改变ITR序列不是修饰靶序列特异性所必需的。与5′-TTAA-3’靶位点有关的piggyBac或piggyBac-样转座酶(SEQ ID NO：14504)与5′-TTAT-3′-有关的转座酶(SEQ ID NO：14505)的不同之处仅在于4个氨基酸改变(D322Y、S473C、A507T、H582R)。在某些实施方案中，与5′-TTAA-3’靶位点有关的piggyBac或piggyBac-样转座酶(SEQ ID NO：14504)比5′-TTAT-3′-有关的piggyBac或piggyBac-样转座酶(SEQ ID NO：14505)对具有5′-TTAT-3′末端的转座子的活性低。在某些实施方案中，可通过用5′-TTAT-3′来替换5′-TTAA-3’靶位点，将具有5′-TTAA-3’靶位点的piggyBac或piggyBac-样转座子转化为具有5′-TTAT-3靶位点的piggyBac或piggyBac-样转座酶。这种转座子可与识别5′-TTAT-3’靶序列的piggyBac或piggyBac-样转座酶如SEQ ID NO：14504，或与最初与5′-TTAA-3′转座子有关的转座酶的变体一起使用。在某些实施方案中，5′-TTAA-3′和5′-TTAT-3′piggyBac或piggyBac-样转座酶之间的高相似性证明，piggyBac或piggyBac-样转座酶的氨基酸序列的极少改变即可改变靶序列特异性。在某些实施方案中，对任何piggyBac或piggyBac-样转座子-转座酶基因转移系统的修饰，其中5′-TTAA-3’靶序列被5′-TTAT-3′靶序列替换，ITRs保持相同，且转座酶是原始的piggyBac或piggyBac-样转座酶或由使用低水平诱变以将突变引入转座酶产生的其变体。在某些实施方案中，可通过修饰5′-TTAT-3′-活性的piggyBac或piggyBac-样转座子-转座酶基因转移系统来形成piggyBac或piggyBac-样转座子转座酶转移系统，其中5′-TTAT-3’靶序列被5′-TTAA-3′-靶序列替换，ITRs保持相同，且piggyBac或piggyBac-样转座酶是原始的转座酶或其变体。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自家蚕。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000731
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000732
在某些实施方案中，转座子包含来自SEQ ID NO：14577的至少16个邻接碱基和来自SEQ ID NO：14578的至少16个邻接碱基，以及与CCCGGCGAGCATGAGG(SEQ ID NO：14510)至少87％相同的反向末端重复。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000733
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000741
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14595和SEQID NO：14596，并由SEQ ID NO：14505的piggyBac或piggyBac-样转座酶转座。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14595和SEQ ID：14596的ITRs侧翼不是5’-TTAA-3’序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14595和SEQ ID：14596的ITRs侧翼为5’-TTAT-3’序列。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000742
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000743
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000744
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的左末端包含SEQ ID NO：14577、SEQ ID NO：14595或SEQ ID NOs：14597-14599的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的左末端之前是左靶序列。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000751
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000752
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000753
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的右末端包含SEQ ID NO：14578、SEQ ID NO：14596或SEQ ID NOs：14600-14601的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的右末端后面是右靶序列。在某些实施方案中，转座子由SEQ ID NO：14505的转座酶转座。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的左和右末端共有相反取向并紧邻靶序列的SEQ ID NO：14510的16bp重复序列。在某些实施方案中，左转座子末端从SEQ ID NO：14510开始，且右转座子末端以SEQ ID NO：14510的反向互补序列5’-CCTCATGCTCGCCGGG-3’(SEQ ID NO：14603)结束。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含与SEQ ID NO：14510或SEQ ID NO：14603具有至少93％、至少87％或至少81％或其间任何百分比同一性的ITR。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含后面是包含选自SEQ ID NOs：88、105或107的序列的左转座子末端的靶序列和后面是靶序列的包含SEQ ID NO：14578或106的右转座子末端。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac样转座子包含一个末端，所述末端包含与SEQ ID NO：14577至少90％、至少95％或至少99％或其间任何百分比相同的序列，和一个末端，所述末端包含与SEQ ID NO：14578至少90％、至少95％或至少99％或其间任何百分比相同的序列。在某些实施方案中，一个转座子末端包含来自SEQ ID NO：14577的至少14个、至少16个、至少18个或至少20个邻接碱基，并且一个转座子末端包含来自SEQ ID NO：14578的至少14个、至少16个、至少18个或至少20个邻接碱基。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含两个转座子末端，其中每个转座子末端在两个转座子末端以相反取向包含与SEQ ID NO：14510至少81％相同、至少87％相同或至少93％相同或其间任何百分比相同的序列。一个末端可以进一步包含来自SEQ ID NO：14599的至少14个、至少16个、至少18个或至少20个邻接碱基，并且另一个末端可以进一步包含来自SEQ ID NO：14601的至少14个、至少16个、至少18个或至少20个邻接碱基。可以通过SEQ ID NO：14505的转座酶对piggyBac或piggyBac-样转座子进行转座，并且所述转座酶可以任选地与核定位信号融合。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14595和SEQID NO：14596，且piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14504或SEQ ID NO：14505。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14597和SEQ IDNO：14596，且piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14504或SEQ ID NO：14505。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14595和SEQ ID NO：14578，且piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14504或SEQ ID NO：14505。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14602和SEQ ID NO：14600，且piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14504或SEQ ID NO：14505。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含左末端，所述左末端包含1、2、3、4、5、6或7个选自ATGAGGCAGGGTAT(SEQ ID NO：14614)、ATACCCTGCCTCAT(SEQ ID NO：14615)、GGCAGGGTAT(SEQ ID NO：14616)、ATACCCTGCC(SEQ ID NO：14617)、TAAAATTTTA(SEQID NO：14618)、ATTTTATAAAAT(SEQ ID NO：14619)、TCATACCCTG(SEQ ID NO：14620)和TAAATAATAATAA(SEQ ID NO：14621)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含右末端，所述右末端包含1、2或3个选自SEQ ID NO：14617、SEQ ID NO：14620和SEQID NO：14621的序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自热带爪蟾。所述piggyBac或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000771
在一些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是SEQ ID NO：14517的高活性变体。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是SEQ ID NO：14517的整合缺陷变体。所述piggyBac或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000772
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自热带爪蟾。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含与以下序列至少90％相同的序列：
Figure BPA0000288251470000781
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶。高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶是一种比其所衍生自的天然存在的变体更具活性的转座酶。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶比SEQ ID NO：14517的转座酶更具活性。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000782
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000783
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000791
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000792
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000793
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含以下序列：
(SEQ ID NO：17042)。
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含在选自氨基酸6、7、16、19、20、21、22、23、24、26、28、31、34、67、73、76、77、88、91、141、145、146、148、150、157、162、179、182、189、192、193、196、198、200、210、212、218、248、263、270、294、297、308、310、333、336、354、357、358、359、377、423、426、428、438、447、450、462、469、472、498、502、517、520、523、533、534、576、577、582、583或587的位置处的氨基酸取代(相对于SEQ ID NO：14517)。在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含Y6C、S7G、M16S、S19G、S20Q、S20G、S20D、E21D、E22Q、F23T、F23P、S24Y、S26V、S28Q、V31K、A34E、L67A、G73H、A76V、D77N、P88A、N91D、Y141Q、Y141A、N145E、N145V、P146T、P146V、P146K、P148T、P148H、Y150G、Y150S、Y150C、H157Y、A162C、A179K、L182I、L182V、T189G、L192H、S193N、S193K、V196I、S198G、T200W、L210H、F212N、N218E、A248N、L263M、Q270L、S294T、T297M、S308R、L310R、L333M、Q336M、A354H、C357V、L358F、D359N、L377I、V423H、P426K、K428R、S438A、T447G、T447A、L450V、A462H、A462Q、I469V、I472L、Q498M、L502V、E5171、P520D、P520G、N523S、I533E、D534A、F576R、F576E、K577I、I582R、Y583F、L587Y或L587W的氨基酸取代或包括这些突变的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或全部的其任何组合(相对于SEQ ID NO：14517)。
在某些实施方案中，高活性的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含非野生型的氨基酸的一个或多个取代，其中对野生型氨基酸的一个或多个取代包括A2X、K3X、R4X、F5X、Y6X、S7X、A11X、A13X、C15X、M16X、A17X、S18X、S19X、S20X、E21X、E22X、F23X、S24X、G25X、26X、D27X、S28X、E29X、E42X、E43X、S44X、C46X、S47X、S48X、S49X、T50X、V51X、S52X、A53X、L54X、E55X、E56X、P57X、M58X、E59X、E62X、D63X、V64X、D65X、D66X、L67X、E68X、D69X、Q70X、E71X、A72X、G73X、D74X、R75X、A76X、D77X、A78X、A79X、A80X、G81X、G82X、E83X、P84X、A85X、W86X、G87X、P88X、P89X、C90X、N91X、F92X、P93X、E95X、I96X、P97X、P98X、F99X、T100X、T101X、P103X、G104X、V105X、K106X、V107X、D108X、T109X、N111X、P114X、I115X、N116X、F117X、F118X、Q119X、M122X、T123X、E124X、A125X、I126X、L127X、Q128X、D129X、M130X、L132X、Y133X、V126X、Y127X、A138X、E139X、Q140X、Y141X、L142X、Q144X、N145X、P146X、L147X、P148X、Y150X、A151X、A155X、H157X、P158X、I161X、A162X、V168X、T171X、L172X、A173X、M174X、I177X、A179X、L182X、D187X、T188X、T189X、T190X、L192X、S193X、I194X、P195X、V196X、S198X、A199X、T200X、S202X、L208X、L209X、L210X、R211X、F212X、F215X、N217X、N218X、A219X、T220X、A221X、V222X、P224X、D225X、Q226X、P227X、H229X、R231X、H233X、L235X、P237X、I239X、D240X、L242X、S243X、E244X、R244X、F246X、A247X、A248X、V249X、Y250X、T251X、P252X、C253X、Q254X、I256X、C257X、I258X、D259X、E260X、S261X、L262X、L263X、L264X、F265X、K266X、G267X、R268X、L269X、Q270X、F271X、R272X、Q273X、Y274X、I275X、P276X、S277X、K278X、R279X、A280X、R281X、Y282X、G283X、I284X、K285X、F286X、Y287X、K288X、L289X、C290X、E291X、S292X、S293X S294X、G295X、Y296X、T297X、S298X、Y299X、F300X、E304X、L310X、P313X、G314X、P316X、P317X、D318X、L319X、T320X、V321X、K324X、E328X、I330X、S331X、P332X、L333X、L334X、G335X、Q336X、F338X、L340X、D343X、N344X、F345X、Y346X、S347X、L351X、F352X、A354X、L355X、Y356X、C357X、L358X、D359X、T360X、R422X、Y423X、G424X、P426X、K428X、N429X、K430X、P431X、L432X、S434X、K435X、E436X、S438X、K439X、Y440X、G443X、R446X、T447X、L450X、Q451X、N455X、T460X、R461X、A462X、K465X、V467X、G468X、I469X、Y470X、L471X、I472X、M474X、A475X、L476X、R477X、S479X、Y480X、V482X Y483X、K484X、A485X、A486X、V487X、P488X、P490X、K491X、S493X、Y494X、Y495X、K496X、Y497T、Q498X、L499X、Q500X、I501X、L502X、P503X、A504X、L505X、L506X、F507X、G508X、G509X、V510X、E511X、E512X、Q513X、T514X、V515X、E517X、M518X、P519X、P520X、S521X、D522X、N523X、V524X、A525X、L527X、I528X、K530X、H531X、F532X、I533X、D534X、T535X、L536X、T539X、P540X、Q546X、K550X、R553X、K554X、R555X、G556X、I557X、R558X、R559X、D560X、T561X、Y564X、P566X、K567X、P569X、R570X、N571X、L574X、C575X、F576X、K577X、P578X、F580X、E581X、I582X、Y583X、T585X、Q586X、L587X、H588X或Y589X的取代(相对于SEQ ID NO：14517)。可以在美国专利No.10,041,077中找到高活性氨基酸取代的清单，所述专利的内容整体引入作为参考。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是整合缺陷的。在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶是可以切除其相应转座子但以比相应的天然存在的转座酶更低的频率整合被切除的转座子的转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶是SEQ ID NO：14517的整合缺陷变体。在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶相对于SEQ ID NO：14517是缺陷的。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶对于切除有活性，但是在整合中是缺陷的。在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含与以下序列至少90％相同的序列：
Figure BPA0000288251470000821
在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含与以下序列至少90％相同的序列：
Figure BPA0000288251470000822
在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含与以下序列至少90％相同的序列：
Figure BPA0000288251470000831
在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14611。在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含与以下序列至少90％相同的序列：
Figure BPA0000288251470000832
在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14612。在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含与以下序列至少90％相同的序列：
Figure BPA0000288251470000833
在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14613。在某些实施方案中，整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含氨基酸取代，其中在位置218处的Asn被Glu或Asp置换(N218D或N218E)(相对于SEQ ID NO：14517)。
在某些实施方案中，有切除能力的、整合缺陷的piggyBac或piggyBac-样转座酶包含非野生型的氨基酸的一个或多个取代，其中对野生型氨基酸的一个或多个取代包括A2X、K3X、R4X、F5X、Y6X、S7X、A8X、E9X、E10X、A11X、A12X、A13X、H14X、C15X、M16X、A17X、S18X、S19X、S20X、E21X、E22X、F23X、S24X、G25X、26X、D27X、S28X、E29X、V31X、P32X、P33X、A34X、S35X、E36X、S37X、D38X、S39X、S40X、T41X、E42X、E43X、S44X、W45X、C46X、S47X、S48X、S49X、T50X、V51X、S52X、A53X、L54X、E55X、E56X、P57X、M58X、E59X、V60X、M122X、T123X、E124X、A125X、L127X、Q128X、D129X、L132X、Y133X、V126X、Y127X、E139X、Q140X、Y141X、L142X、T143X、Q144X、N145X、P146X、L147X、P148X、R149X、Y150X、A151X、H154X、H157X、P158X、T159X、D160X、I161X、A162X、E163X、M164X、K165X、R166X、F167X、V168X、G169X、L170X、T171X、L172X、A173X、M174X、G175X、L176X、I177X、K178X、A179X、N180X、S181X、L182X、S184X、Y185X、D187X、T188X、T189X、T190X、V191X、L192X、S193X、I194X、P195X、V196X、F197X、S198X、A199X、T200X、M201X、S202X、R203X、N204X、R205X、Y206X、Q207X、L208X、L209X、L210X、R211X、F212X、L213X、H241X、F215X、N216X、N217X、N218X、A219X、T220X、A221X、V222X、P223X、P224X、D225X、Q226X、P227X、G228X、H229X、D230X、R231X、H233X、K234X、L235X、R236X、L238X、I239X、D240X、L242X、S243X、E244X、R244X、F246X、A247X、A248X、V249X、Y250X、T251X、P252X、C253X、Q254X、N255X、I256X、C257X、I258X、D259X、E260X、S261X、L262X、L263X、L264X、F265X、K266X、G267X、R268X、L269X、Q270X、F271X、R272X、Q273X、Y274X、I275X、P276X、S277X、K278X、R279X、A280X、R281X、Y282X、G283X、I284X、K285X、F286X、Y287X、K288X、L289X、C290X、E291X、S292X、S293X、S294X、G295X、Y296X、T297X、S298X、Y299X、F300X、I302X、E304X、G305X、K306X、D307X、S308X、K309X、L310X、D311X、P312X、P313X、G314X、C315X、P316X、P317X、D318X、L319X、T320X、V321X、S322X、G323X、K324X、I325X、V326X、W327X、E328X、L329X、I330X、S331X、P332X、L333X、L334X、G335X、Q336X、F338X、H339X、L340X、V342X、N344X、F345X、Y346X、S347X、S348X、I349X、L351X、T353X、A354X、Y356X、C357X、L358X、D359X、T360X、P361X、A362X、C363X、G364X、I366X、N367X、R368X、D369X、K371X、G372X、L373X、R375X、A376X、L377X、L378X、D379X、K380X、K381X、L382X、N383X、R384X G385X、T387X、Y388X、A389X、L390X、K392X、N393X、E394X、A397X、K399X、F400X、F401X、D402X、N405X、L406X、L409X、R422X、Y423X、G424X、E425X、P426X、K428X、N429X、K430X、P431X、L432X、S434X、K435X、E436X、S438X、K439X、Y440X、G442X、G443X、V444X、R446X、T447X、L450X、Q451X、H452X、N455X、T457X、R458X、T460X、R461X、A462X、Y464X、K465X、V467X、G468X、I469X、L471X、I472X、Q473X、M474X、L476X、R477X、N478X、S479X、Y480X、V482X Y483X、K484X、A485X、A486X、V487X、P488X、G489X、P490X、K491X、L492X、S493X、Y494X、Y495X、K496X、Q498X、L499X、Q500X、I501X、L502X、P503X、A504X、L505X、L506X、F507X、G508X、G509X、V510X、E511X、E512X、Q513X、T514X、V515X、E517X、M518X、P519X、P520X、S521X、D522X、N523X、V524X、A525X、L527X、I528X、G529X、K530X、F532X、I533X、D534X、T535X、L536X、P537X、P538X、T539X、P540X、G541X、F542X、Q543X、R544X、P545X、Q546X、K547X、G548X、C549X、K550X、V551X、C552X、R553X、K554X、R555X、G556X、I557X、R558X、R559X、D560X、T561X、R562X、Y563X、Y564X、C565X、P566X、K567X、C568X、P569X、R570X、N571X、P572X、G573X、L574X、C575X、F576X、K577X、P578X、C579X、F580X、E581X、I582X、Y583X、H584X、T585X、Q586X、L587X、H588X或Y589X的取代(相对于SEQ ID NO：14517)。可以在美国专利No.10,041,077中找到有切除能力的、整合缺陷的氨基酸取代的清单，所述专利的内容整体引入作为参考。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶与核定位信号融合。在某些实施方案中，SEQ ID NO：14517或SEQ ID NO：14518与核定位信号融合。在某些实施方案中，与核定位信号融合的piggyBac或piggyBac-样转座酶的氨基酸序列由包含以下序列的多核苷酸序列编码：
Figure BPA0000288251470000861
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自热带爪蟾。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000862
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000863
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14519和SEQID NO：14520。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000864
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000871
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000872
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14520和SEQID NO：14519、SEQ ID NO：14521或SEQ ID NO：14523。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14522和SEQ ID NO：14519、SEQ ID NO：14521或SEQ IDNO：14523。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含一个末端，所述末端包含来自SEQ ID NO：14519、SEQ ID NO：14521或SEQ ID NO：14523的至少14、16、18、20、30或40个邻接核苷酸。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含一个末端，所述末端包含来自SEQ ID NO：14520或SEQ ID NO：14522的至少14、16、18、20、30或40个邻接核苷酸。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含与SEQ ID NO：14519、SEQ IDNO：14521或SEQ ID NO：14523具有至少90％同一性的一个末端。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含与SEQ ID NO：14520或SEQ ID NO：14522具有至少90％同一性的一个末端。在一个实施方案中，一个转座子末端与SEQ ID NO：14519至少90％相同，且另一个转座子末端与SEQ ID NO：14520至少90％相同。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含TTAACCTTTTTACTGCCA(SEQ ID NO：14524)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含TTAACCCTTTGCCTGCCA(SEQ ID NO：14526)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含TTAACCYTTTTACTGCCA(SEQ ID NO：14527)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含TGGCAGTAAAAGGGTTAA(SEQ ID NO：14529)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含TGGCAGTGAAAGGGTTAA(SEQ ID NO：14531)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含TTAACCYTTTKMCTGCCA(SEQ ID NO：14533)的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的一个末端包含选自SEQ ID NO：14524、SEQ ID NO：14526和SEQ IDNO：14527的序列。在某些实施方案中，piggyBacTM(PB)或piggyBac-样转座子的一个末端包含选自SEQ ID NO：14529和SEQ ID NO：14531的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的每个反向末端重复包含CCYTTTKMCTGCCA(SEQ ID NO：14563)的ITR序列的序列。在某些实施方案中，piggyBacTM(PB)或piggyBac-样转座子的每个末端以相反取向包含SEQ ID NO：14563。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的一个ITR包含选自SEQ ID NO：14524、SEQ ID NO：14526和SEQ ID NO：14527的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的一个ITR包含选自SEQ ID NO：14529和SEQ ID NO：14531的序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac样转座子在两个转座子末端以相反取向包含SEQ ID NO：14533。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子可具有包含SEQ ID NO：14519和SEQ ID NO：14520，或这些中的任一个或两者的与SEQ ID NO：14519或SEQ ID NO：14520具有至少90％序列同一性的变体的末端，并且piggyBac或piggyBac-样转座酶具有SEQ IDNO：14517的序列，或与SEQ ID NO：14517或SEQ ID NO：14518显示至少％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比序列同一性的变体。在某些实施方案中，一个piggyBac或piggyBac-样转座子末端包含来自SEQ ID NO：14519、SEQ ID NO：14521或SEQ ID NO：14523的至少14个邻接核苷酸，并且另一个转座子末端包含来自SEQ ID NO：14520或SEQ ID NO：14522的至少14个邻接核苷酸。在某些实施方案中，一个转座子末端包含来自SEQ ID NO：14519、SEQID NO：14521或SEQ ID NO：14523的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少22个、至少25个、至少30个邻接核苷酸，并且另一个转座子末端包含来自SEQID NO：14520或SEQ ID NO：14522的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少22个、至少25个或至少30个邻接核苷酸。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶识别具有对应于SEQ ID NO：14519的左序列和对应于SEQ ID NO：14520的右序列的转座子末端。它将通过在一个转座子末端的左末端的5′-TTAA-3′序列到第二个转座子末端的右末端的5′-TTAA-3′切割DNA，包括放置在它们之间的任何异源DNA，从一个DNA分子中切除转座子，并将切除的序列插入第二个DNA分子中。在某些实施方案中，左和右转座子末端的截短和修饰的形式也将起可由piggyBac或piggyBac-样转座酶转座的转座子的一部分的作用。例如，左转座子末端可以用对应于SEQ ID NO：14521或SEQ ID NO：14523的序列置换，右转座子末端可以用对应于SEQID NO：14522的较短序列置换。在某些实施方案中，左和右转座子末端在其末端共有包括5′-TTAA-3′插入位点的18bp几乎完美重复的序列(5′-TTAACCYTTTKMCTGCCA：SEQ ID NO：14533)，所述序列在两个末端的取向相反。也就是说，在SEQ ID NO：14519和SEQ ID NO：14523中，左转座子末端从序列5′-TTAACCTTTTTACTGCCA-3′(SEQ ID NO：14524)开始，或在SEQ ID NO：14521中，左转座子末端从序列5′-TTAACCCTTTGCCTGCCA-3′(SEQ ID NO：14526)开始；右转座子以这个序列的大约反向互补序列结束：在SEQ ID NO：14520中，它终止于5′TGGCAGTAAAAGGGTTAA-3′(SEQ ID NO：14529)，在SEQ ID NO：14522中，它终止于5′-TGGCAGTGAAAGGGTTAA-3′(SEQ ID NO：14531)。本发明的一个实施方案是一种转座子，其包含插入在两个转座子末端之间的异源多核苷酸，每个转座子末端在两个转座子末端以相反取向包含SEQ ID NO：14533。在某些实施方案中，一个转座子末端包含选自SEQ ID NOS：14524、SEQ ID NO：14526和SEQ ID NO：14527的序列。在一些实施方案中，一个转座子末端包含选自SEQ ID NO：14529和SEQ ID NO：14531的序列。
在某些实施方案中，piggyBacTM(PB)或piggyBac-样转座子分离或衍生自热带爪蟾。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000901
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000902
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含来自SEQ ID NO：14573或SEQ ID NO：14574的至少16个邻接碱基以及CCYTTTBMCTGCCA(SEQ ID NO：14575)的反向末端重复。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000903
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000904
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000905
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000906
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000907
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000911
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000912
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000913
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含选自SEQ ID NO：14573和SEQ ID NOs：14579-14585的左转座子末端序列。在某些实施方案中，左转座子末端序列之前是左靶序列。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000914
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000915
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000916
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000917
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含选自SEQ ID NO：14574和SEQ ID NOs：14587-14590的右转座子末端序列。在某些实施方案中，右转座子末端序列后面是右靶序列。在某些实施方案中，左和右转座子末端共有邻近靶序列的在两个末端取向相反的14重复序列(SEQ ID NO：14575)。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含含有靶序列和选自SEQ ID NOs：14582-14584和14573的序列的左转座子末端，和包含后面是右靶序列的选自SEQ ID NOs：14588-14590和14574的序列的右转座子末端。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的左转座子末端包含
Figure BPA0000288251470000921
(SEQ ID NO：14591)和ITR。在某些实施方案中，左转座子末端包含
Figure BPA0000288251470000922
(SEQ ID NO：14592)和ITR。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子的右转座子末端包含
Figure BPA0000288251470000923
(SEQ ID NO：14593)和ITR。在某些实施方案中，右转座子末端包含
Figure BPA0000288251470000924
(SEQ ID NO：14594)和ITR。
在某些实施方案中，一个转座子末端包含与SEQ ID NO：14573至少90％、至少95％、至少99％或其间任何百分比相同的序列，且另一个转座子末端包含与SEQ ID NO：14574至少90％、至少95％、至少99％或其间任何百分比相同的序列。在某些实施方案中，一个转座子末端包含来自SEQ ID NO：14573的至少14个、至少16个、至少18个、至少20个或至少25个邻接核苷酸，并且一个转座子末端包含来自SEQ ID NO：14574的至少14个、至少16个、至少18个、至少20个或至少25个邻接核苷酸。在某些实施方案中，一个转座子末端包含来自SEQ ID NO：14591的至少14个、至少16个、至少18个、至少20个，并且另一个末端包含来自SEQ ID NO：14593的至少14个、至少16个、至少18个、至少20个。在某些实施方案中，每个转座子末端以相反取向包含SEQ ID NO：14575。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含选自SEQ ID NO：14573、SEQ ID NO：14579、SEQ ID NO：14581、SEQ ID NO：14582、SEQ ID NO：14583和SEQ ID NO：14588的序列，以及选自SEQ ID NO：14587、SEQ ID NO：14588、SEQ ID NO：14589和SEQ IDNO：14586的序列，且piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14517或SEQ ID NO：14518。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含与靶序列邻近的CCCTTTGCCTGCCA(SEQ ID NO：14622)(左ITR)和TGGCAGTGAAAGGG(SEQ ID NO：14623)(右ITR)的ITRs。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自棉铃虫。所述piggyBac或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000931
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自棉铃虫。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000932
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000941
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自棉红铃虫。所述piggyBac或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000942
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自棉红铃虫。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000943
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000944
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自银纹夜蛾。所述piggyBac或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000951
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自银纹夜蛾。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000952
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000953
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCCTAGAAGCCCAATC(SEQID NO：14564)的ITR序列。
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自小地老虎。所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000961
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自小地老虎。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000962
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000963
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自苜蓿切叶蜂。所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000964
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自苜蓿切叶蜂。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000971
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列
Figure BPA0000288251470000972
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自美洲东部熊蜂。所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000973
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自美洲东部熊蜂。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000974
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000975
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自甘蓝夜蛾。所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000981
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自甘蓝夜蛾。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000982
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000983
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自小麦瘿蚊。所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000984
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自小麦瘿蚊。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000985
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000991
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自意大利蜜蜂。所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000992
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自意大利蜜蜂。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000993
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470000994
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自Messor bouvieri。所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470000995
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自Messorbouvieri。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470001001
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470001002
在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggyBac或piggyBac-样转座酶。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座酶分离或衍生自粉纹夜蛾。所述piggyBac(PB)或piggyBac-样转座酶可包含与以下序列至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比相同的氨基酸序列或由其组成：
Figure BPA0000288251470001003
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自粉纹夜蛾。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470001004
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470001005
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470001011
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470001012
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470001013
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含以下序列：
Figure BPA0000288251470001014
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14561和SEQID NO：14562，且piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14558。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含SEQ ID NO：14609和SEQ ID NO：14610，且piggyBac或piggyBac-样转座酶包含SEQ ID NO：14558。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自棉蚜。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCTTCCAGCGGGCGCGC(SEQ ID NO：14565)的ITR序列。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自二化螟。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCCAGATTAGCCT(SEQ ID NO：14566)的ITR序列。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自烟芽夜蛾。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCCTTAATTACTCGCG(SEQ ID NO：14567)的ITR序列。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自棉红铃虫。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCCTAGATAACTAAAC(SEQ ID NO：14568)的ITR序列。
在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子分离或衍生自斑须按蚊(Anopheles stephensi)。在某些实施方案中，piggyBac或piggyBac-样转座子包含CCCTAGAAAGATA(SEQ ID NO：14569)的ITR序列。
免疫和免疫前体细胞
在某些实施方案中，本公开内容的免疫细胞包括淋巴祖细胞、天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(T-细胞)、干记忆T细胞(stem memory T cells)(TSCM细胞)、中央记忆T细胞(central memory T cells)(TCM)、干细胞样T细胞、B淋巴细胞(B-细胞)、髓样祖细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、红细胞、红细胞(RBCs)、巨核细胞或破骨细胞。
在某些实施方案中，免疫前体细胞包括可以分化为一种或多种类型的免疫细胞的任何细胞。在某些实施方案中，免疫前体细胞包括可以自我更新并发育成免疫细胞的多能干细胞。在某些实施方案中，免疫前体细胞包括造血干细胞(HSCs)或其后代。在某些实施方案中，免疫前体细胞包括可以发育成免疫细胞的前体细胞。在某些实施方案中，免疫前体细胞包括造血祖细胞(HPCs)。
造血干细胞(HSCs)
造血干细胞(HSC)是多能的自我更新细胞。来自淋巴和髓谱系的所有分化的血细胞均产生自HSCs。HSCs可在成体骨髓、外周血、动员的外周血、腹膜透析流出物和脐带血中找到。
本公开内容的HSCs可以分离或衍生自原代或培养的干细胞。本公开内容的HSCs可以分离或衍生自胚胎干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、成体干细胞或诱导多潜能干细胞(iPSC)。
本公开内容的免疫前体细胞可以包括HSC或HSC后代细胞。本公开内容的示例性HSC后代细胞包括但不限于多能干细胞、淋巴祖细胞、天然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(T-细胞)、B淋巴细胞(B-细胞)、髓样祖细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。
通过本公开内容的方法产生的HSCs可以保持“原始”干细胞的特征，所述“原始”干细胞尽管分离或衍生自成体干细胞并且尽管定型成单个谱系，但共有胚胎干细胞的特征。例如，通过本公开内容的方法产生的“原始”HSCs在分裂之后保持其“干性(stemness)”并且不分化。因此，作为过继细胞治疗，通过本公开内容的方法产生的“原始”HSCs不仅补充其数目，而且在体内扩充。当作为单剂施用时，通过本公开内容的方法产生的“原始”HSCs可以是治疗上有效的。在一些实施方案中，本公开内容的原始HSCs是CD34+。在一些实施方案中，本公开内容的原始HSCs是CD34+和CD38-。在一些实施方案中，本公开内容的原始HSCs是CD34+，CD38-和CD90+。在一些实施方案中，本公开内容的原始HSCs是CD34+，CD38-，CD90+和CD45RA-。在一些实施方案中，本公开内容的原始HSCs是CD34+，CD38-，CD90+，CD45RA-和CD49f+。在一些实施方案中，本公开内容的最原始HSCs是CD34+，CD38-，CD90+，CD45RA-和CD49f+。
在本公开内容的一些实施方案中，可以根据本公开内容的方法修饰原始HSCs、HSCs和/或HSC后代细胞以表达外源序列(例如，嵌合抗原受体或治疗用蛋白)。在本公开内容的一些实施方案中，修饰的原始HSCs、修饰的HSCs和/或修饰的HSC后代细胞可以前向分化以产生修饰的免疫细胞，包括但不限于，本公开内容的修饰的T细胞、修饰的天然杀伤细胞和/或修饰的B-细胞。
T细胞
本公开内容的修饰的T细胞可以衍生自修饰的造血干祖细胞(hematopoieticstem and progenitor cells)(HSPCs)或修饰的HSCs。
与传统的生物制剂和化疗药物不同，本公开内容的修饰的T-细胞具有在抗原识别时迅速繁殖的能力，从而潜在地消除了重复治疗的需要。为了实现这一点，在一些实施方案中，本公开内容的修饰的T-细胞不仅驱动起始应答，而且还作为有生活力的记忆T细胞的稳定群体继续存在于患者中以预防潜在的复发。另一方面，在一些实施方案中，当不期望时，本公开内容的修饰的T-细胞不继续存在于患者中。
已经将增强的努力集中于开发不通过不依赖于抗原的(紧张性)信号传导导致T细胞耗尽的抗原受体分子，以及含有早期记忆T细胞(尤其是干细胞记忆(TSCM)或干细胞样T细胞)的修饰的T-细胞产品。本公开内容的干细胞样修饰的T细胞表现出最大的自我更新能力和多能能力，以衍生中央记忆(TCM)T细胞或TCM样细胞、效应记忆(TEM)和效应T细胞(TE)，从而产生更好的肿瘤根除和长期修饰的T细胞移入。线性分化途径可能负责产生这些细胞：幼稚T细胞(TN)＞TSCM＞TCM＞TEM＞TE＞TTE，其中TN是直接产生TSCM的亲代前体细胞，其然后依次直接产生TCM等。本公开内容的T细胞的组合物可以包含每个亲代T细胞亚群中的一个或多个，而TSCM细胞是最丰富的(例如，TSCM＞TCM＞TEM＞TE＞TTE)。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，免疫细胞前体分化成或能够分化成早期记忆T细胞、干细胞样T-细胞、幼稚T细胞(TN)、TSCM、TCM、TEM、TE或TTE。在一些实施方案中，免疫细胞前体是本公开内容的原始HSC、HSC或HSC后代细胞。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，免疫细胞是早期记忆T细胞、干细胞样T-细胞、幼稚T细胞(TN)、TSCM、TCM、TEM、TE或TTE。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，免疫细胞是早期记忆T细胞。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，免疫细胞是干细胞样T-细胞。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，免疫细胞是TSCM。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，免疫细胞是TCM。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，所述方法修饰和/或所述方法产生许多修饰的T细胞，其中所述许多修饰的T细胞的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比表达早期记忆T细胞的一种或多种细胞表面标记。在某些实施方案中，许多修饰的早期记忆T细胞包括至少一种修饰的干细胞样T细胞。在某些实施方案中，许多修饰的早期记忆T细胞包括至少一种修饰的TSCM。在某些实施方案中，许多修饰的早期记忆T细胞包括至少一种修饰的TCM。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，所述方法修饰和/或所述方法产生许多修饰的T细胞，其中所述许多修饰的T细胞的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比表达干细胞样T细胞的一种或多种细胞表面标记。在某些实施方案中，许多修饰的干细胞样T细胞包括至少一种修饰的TSCM。在某些实施方案中，许多修饰的干细胞样T细胞包括至少一种修饰的TCM。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，所述方法修饰和/或所述方法产生许多修饰的T细胞，其中所述许多修饰的T细胞的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比表达干记忆T细胞(TSCM)的一种或多种细胞表面标记。在某些实施方案中，细胞表面标记包括CD62L和CD45RA。在某些实施方案中，细胞表面标记包括CD62L、CD45RA、CD28、CCR7、CD127、CD45RO、CD95、CD95和IL-2Rβ中的一种或多种。在某些实施方案中，细胞表面标记包括CD45RA、CD95、IL-2Rβ、CCR7和CD62L中的一种或多种。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，所述方法修饰和/或所述方法产生许多修饰的T细胞，其中所述许多修饰的T细胞的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比表达中央记忆T细胞(TCM)的一种或多种细胞表面标记。在某些实施方案中，细胞表面标记包括CD45RO、CD95、IL-2Rβ、CCR7和CD62L中的一种或多种。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，所述方法修饰和/或所述方法产生许多修饰的T细胞，其中所述许多修饰的T细胞的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比表达幼稚T细胞(TN)的一种或多种细胞表面标记。在某些实施方案中，细胞表面标记包括CD45RA、CCR7和CD62L中的一种或多种。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，所述方法修饰和/或所述方法产生许多修饰的T细胞，其中所述许多修饰的T细胞的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比表达效应T-细胞(修饰的TEFF)的一种或多种细胞表面标记。在某些实施方案中，细胞表面标记包括CD45RA、CD95和IL-2Rβ中的一种或多种。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，所述方法修饰和/或所述方法产生许多修饰的T细胞，其中所述许多修饰的T细胞的至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或其间任何百分比表达干细胞样T细胞、干记忆T细胞(TSCM)或中央记忆T细胞(TCM)的一种或多种细胞表面标记。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，缓冲液包含免疫细胞或其前体。缓冲液维持或增强免疫细胞或其前体(包括T-细胞)的细胞生存力水平和/或干细胞样(stem-like)表型。在某些实施方案中，在核转染(nucleofection)前，缓冲液维持或增强原代人T细胞的细胞生存力水平和/或干细胞样表型。在某些实施方案中，在核转染期间，缓冲液维持或增强原代人T细胞的细胞生存力水平和/或干细胞样表型。在某些实施方案中，在核转染后，缓冲液维持或增强原代人T细胞的细胞生存力水平和/或干细胞样表型。在某些实施方案中，缓冲液以任何绝对或相对丰度或浓度包含KCl、MgCl2、ClNa、葡萄糖和Ca(NO3)2中的一种或多种，并且任选地，所述缓冲液进一步包含选自HEPES、Tris/HCl和磷酸盐缓冲液的添加物。在某些实施方案中，缓冲液包含5mM KCl、15mM MgCl2、90mM ClNa、10mM葡萄糖和0.4mM Ca(NO3)2。在某些实施方案中，缓冲液包含5mM KCl、15mM MgCl2、90mM ClNa、10mM葡萄糖和0.4mM Ca(NO3)2以及包含20mM HEPES和75mM Tris/HCl的添加物。在某些实施方案中，缓冲液包含5mM KCl、15mM MgCl2、90mM ClNa、10mM葡萄糖和0.4mM Ca(NO3)2以及包含pH7.2的40mM Na2HPO4/NaH2PO4的添加物。在某些实施方案中，包含原代人T细胞的组合物包含100μl缓冲液和5x106-25x106的细胞。在某些实施方案中，在引入步骤期间，组合物包含可改变比例的每毫升缓冲液或其他培养基250x106的原代人T细胞。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，所述方法包括使本公开内容的免疫细胞(包括本公开内容的T细胞)和T-细胞扩充组合物接触。在本公开内容的方法的一些实施方案中，将本公开内容的转座子和/或转座酶引入本公开内容的免疫细胞的步骤可以进一步包括使免疫细胞与T-细胞扩充组合物接触。在一些实施方案中，包括其中方法的引入步骤包括电穿孔或核转染步骤的那些，可以用本公开内容的与T-细胞扩充组合物接触的免疫细胞进行电穿孔或核转染步骤。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含磷；辛酸、棕榈酸、亚油酸和油酸中的一种或多种；固醇；和链烷，基本上由其组成或由其组成。
在产生本公开内容的修饰的T细胞的方法的某些实施方案中，扩充添加物包含一种或多种细胞因子。一种或多种细胞因子可包括任何细胞因子，包括但不限于，淋巴因子。示例性的淋巴因子包括，但不限于，白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-21(IL-21)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干扰素-γ(INFγ)。一种或多种细胞因子可以包括IL-2。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含人血清清蛋白、重组人胰岛素、人运铁蛋白、2-巯基乙醇和扩充添加物。在这个方法的某些实施方案中，T-细胞扩充组合物进一步包含辛酸、烟酰胺、2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇(TMDD)、己二酸二异丙酯(DIPA)、正丁基苯磺酰胺、1，2-苯二羧酸、双(2-甲基丙基)酯、棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸酰肼、油酰胺、固醇和链烷中的一种或多种。在这个方法的某些实施方案中，T-细胞扩充组合物进一步包含辛酸、棕榈酸、亚油酸、油酸和固醇中的一种或多种。在这个方法的某些实施方案中，T-细胞扩充组合物进一步包含以下中的一种或多种：浓度为0.9mg/kg-90mg/kg(连端点在内)的辛酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的棕榈酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的亚油酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的油酸；和浓度为约0.1mg/kg-10mg/kg(连端点在内)的固醇。在这个方法的某些实施方案中，T-细胞扩充组合物进一步包含浓度为约9mg/kg的辛酸、浓度为约2mg/kg的棕榈酸、浓度为约2mg/kg的亚油酸、浓度为约2mg/kg的油酸和浓度为约1mg/kg的固醇中的一种或多种。在这个方法的某些实施方案中，T-细胞扩充组合物进一步包含以下中的一种或多种：浓度为6.4μmol/kg-640μmol/kg(连端点在内)的辛酸；浓度为0.7μmol/kg-70μmol/kg(连端点在内)的棕榈酸；浓度为0.75μmol/kg-75μmol/kg(连端点在内)的亚油酸；浓度为0.75μmol/kg-75μmol/kg(连端点在内)的油酸；和浓度为0.25μmol/kg-25μmol/kg(连端点在内)的固醇。在这个方法的某些实施方案中，T-细胞扩充组合物进一步包含浓度为约64μmol/kg的辛酸、浓度为约7μmol/kg的棕榈酸、浓度为约7.5μmol/kg的亚油酸、浓度为约7.5μmol/kg的油酸和浓度为约2.5μmol/kg的固醇中的一种或多种。
在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含人血清清蛋白、重组人胰岛素、人运铁蛋白、2-巯基乙醇和扩充添加物中的一种或多种，以产生许多扩充的修饰的T-细胞，其中所述许多修饰的T-细胞的至少2％表达早期记忆T细胞、干细胞样T细胞、干记忆T细胞(TSCM)和/或中央记忆T细胞(TCM)的一种或多种细胞表面标记。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含或进一步包含辛酸、烟酰胺、2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇(TMDD)、己二酸二异丙酯(DIPA)、正丁基苯磺酰胺、1，2-苯二羧酸、双(2-甲基丙基)酯、棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸酰肼、油酰胺、固醇和链烷中的一种或多种。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含辛酸、棕榈酸、亚油酸、油酸和固醇(例如胆固醇)中的一种或多种。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含以下中的一种或多种：浓度为0.9mg/kg-90mg/kg(连端点在内)的辛酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的棕榈酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的亚油酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的油酸；和浓度为约0.1mg/kg-10mg/kg(连端点在内)的固醇(其中mg/kg＝百万分之一)。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含浓度为约9mg/kg的辛酸、浓度为约2mg/kg的棕榈酸、浓度为约2mg/kg的亚油酸、浓度为约2mg/kg的油酸和浓度为约1mg/kg的固醇中的一种或多种(其中mg/kg＝百万分之一)。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含浓度为9.19mg/kg的辛酸、浓度为1.86mg/kg的棕榈酸、浓度为约2.12mg/kg的亚油酸、浓度为约2.13mg/kg的油酸和浓度为约1.01mg/kg的固醇中的一种或多种(其中mg/kg＝百万分之一)。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含浓度为9.19mg/kg的辛酸、浓度为1.86mg/kg的棕榈酸、浓度为2.12mg/kg的亚油酸、浓度为约2.13mg/kg的油酸和浓度为1.01mg/kg的固醇(其中mg/kg＝百万分之一)。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含以下中的一种或多种：浓度为6.4μmol/kg-640μmol/kg(连端点在内)的辛酸；浓度为0.7μmol/kg-70μmol/kg(连端点在内)的棕榈酸；浓度为0.75μmol/kg-75μmol/kg(连端点在内)的亚油酸；浓度为0.75μmol/kg-75μmol/kg(连端点在内)的油酸；和浓度为0.25μmol/kg-25μmol/kg(连端点在内)的固醇。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含浓度为约64μmol/kg的辛酸、浓度为约7μmol/kg的棕榈酸、浓度为约7.5μmol/kg的亚油酸、浓度为约7.5μmol/kg的油酸和浓度为约2.5μmol/kg的固醇中的一种或多种。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含浓度为约63.75μmol/kg的辛酸、浓度为约7.27μmol/kg的棕榈酸、浓度为约7.57μmol/kg的亚油酸、浓度为约7.56μmol/kg的油酸和浓度为约2.61μmol/kg的固醇中的一种或多种。在某些实施方案中，T-细胞扩充组合物包含浓度为约63.75μmol/kg的辛酸、浓度为约7.27μmol/kg的棕榈酸、浓度为约7.57μmol/kg的亚油酸、浓度为7.56μmol/kg的油酸和浓度为2.61μmol/kg的固醇。
如本文所用的，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与于37℃包含人血清清蛋白、重组人胰岛素、人运铁蛋白、2-巯基乙醇和扩充添加物中的一种或多种的培养基互换使用。另一方面或此外，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含磷、辛脂肪酸、棕榈脂肪酸、亚油脂肪酸和油酸中的一种或多种的培养基互换使用。在某些实施方案中，培养基包含的磷的量为可能在例如Iscove改良Dulbecco培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)((IMDM)；可在ThermoFisher Scientific作为目录号12440053获得)中找到的量的10倍。
如本文所用的，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与于37℃包含人血清清蛋白、重组人胰岛素、人运铁蛋白、2-巯基乙醇、Iscove’s MDM和扩充添加物中的一种或多种的培养基互换使用。另一方面或此外，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以下元素中的一种或多种的培养基互换使用：硼、钠、镁、磷、钾和钙。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以相应的平均浓度存在的以下元素中的一种或多种的培养基互换使用：3.7mg/L的硼、3000mg/L的钠、18mg/L的镁、29mg/L的磷、15mg/L的钾和4mg/L的钙。
如本文所用的，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与于37℃包含人血清清蛋白、重组人胰岛素、人运铁蛋白、2-巯基乙醇和扩充添加物中的一种或多种的培养基互换使用。另一方面或此外，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以下组分中的一种或多种的培养基互换使用：辛酸(CAS编号124-07-2)、烟酰胺(CAS编号98-92-0)、2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇(TMDD)(CAS编号126-86-3)、己二酸二异丙酯(DIPA)(CAS编号6938-94-9)、正丁基苯磺酰胺(CAS编号3622-84-2)、1，2-苯二羧酸、双(2-甲基丙基)酯(CAS编号84-69-5)、棕榈酸(CAS编号57-10-3)、亚油酸(CAS编号60-33-3)、油酸(CAS编号112-80-1)、硬脂酸酰肼(CAS编号4130-54-5)、油酰胺(CAS编号3322-62-1)，固醇(例如，胆固醇)(CAS编号57-88-5)和链烷(例如，十九烷)(CAS编号629-92-5)。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以下组分中的一种或多种的培养基互换使用：辛酸(CAS编号124-07-2)、烟酰胺(CAS编号98-92-0)、2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇(TMDD)(CAS编号126-86-3)、己二酸二异丙酯(DIPA)(CAS编号6938-94-9)、正丁基苯磺酰胺(CAS编号3622-84-2)、1，2-苯二羧酸、双(2-甲基丙基)酯(CAS编号84-69-5)、棕榈酸(CAS编号57-10-3)、亚油酸(CAS编号60-33-3)、油酸(CAS编号112-80-1)、硬脂酸酰肼(CAS编号4130-54-5)、油酰胺(CAS编号3322-62-1)、固醇(例如，胆固醇)(CAS编号57-88-5)、链烷(例如，十九烷)(CAS编号629-92-5)和酚红(CAS编号143-74-8)。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以下组分中的一种或多种的培养基互换使用：辛酸(CAS编号124-07-2)、烟酰胺(CAS编号98-92-0)、2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇(TMDD)(CAS编号126-86-3)、己二酸二异丙酯(DIPA)(CAS编号6938-94-9)、正丁基苯磺酰胺(CAS编号3622-84-2)、1，2-苯二羧酸、双(2-甲基丙基)酯(CAS编号84-69-5)、棕榈酸(CAS编号57-10-3)、亚油酸(CAS编号60-33-3)、油酸(CAS编号112-80-1)、硬脂酸酰肼(CAS编号4130-54-5)、油酰胺(CAS编号3322-62-1)、酚红(CAS编号143-74-8)和羊毛脂醇。
在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与于37℃包含人血清清蛋白、重组人胰岛素、人运铁蛋白、2-巯基乙醇和扩充添加物中的一种或多种的培养基互换使用。另一方面或此外，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以下离子中的一种或多种的培养基互换使用：钠、铵、钾、镁、钙、氯离子(chloride)、硫酸根和磷酸根。
如本文所用的，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与于37℃包含人血清清蛋白、重组人胰岛素、人运铁蛋白、2-巯基乙醇和扩充添加物中的一种或多种的培养基互换使用。另一方面或此外，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以下游离氨基酸中的一种或多种的培养基互换使用：组氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含相应平均摩尔百分比的以下游离氨基酸中的一种或多种的培养基互换使用：组氨酸(约1％)、天冬酰胺(约0.5％)、丝氨酸(约1.5％)、谷氨酰胺(约67％)、精氨酸(约1.5％)、甘氨酸(约1.5％)、天冬氨酸(约1％)、谷氨酸(约2％)、苏氨酸(约2％)、丙氨酸(约1％)、脯氨酸(约1.5％)、半胱氨酸(约1.5％)、赖氨酸(约3％)、酪氨酸(约1.5％)、甲硫氨酸(约1％)、缬氨酸(约3.5％)、异亮氨酸(约3％)、亮氨酸(约3.5％)、苯丙氨酸(约1.5％)和色氨酸(约0.5％)。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含相应平均摩尔百分比的以下游离氨基酸中的一种或多种的培养基互换使用：组氨酸(约.78％)、天冬酰胺(约0.4％)、丝氨酸(约1.6％)、谷氨酰胺(约67.01％)、精氨酸(约1.67％)、甘氨酸(约1.72％)、天冬氨酸(约1.00％)、谷氨酸(约1.93％)、苏氨酸(约2.38％)、丙氨酸(约1.11％)、脯氨酸(约1.49％)、半胱氨酸(约1.65％)、赖氨酸(约2.84％)、酪氨酸(约1.62％)、甲硫氨酸(约0.85％)、缬氨酸(约3.45％)、异亮氨酸(约3.14％)、亮氨酸(约3.3％)、苯丙氨酸(约1.64％)和色氨酸(约0.37％)。
如本文所用的，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与于37℃包含人血清清蛋白、重组人胰岛素、人运铁蛋白、2-巯基乙醇、Iscove’s MDM和扩充添加物中的一种或多种的培养基互换使用。另一方面或此外，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含磷、辛脂肪酸、棕榈脂肪酸、亚油脂肪酸和油酸中的一种或多种的培养基互换使用。在某些实施方案中，培养基包含的磷的量为可能在例如Iscove改良Dulbecco培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)((IMDM)；可在ThermoFisherScientific作为目录号12440053获得)中找到的量的10倍。
在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含辛酸、棕榈酸、亚油酸、油酸和固醇(例如胆固醇)中的一种或多种的培养基互换使用。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以下中的一种或多种的培养基互换使用：浓度为0.9mg/kg-90mg/kg(连端点在内)的辛酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的棕榈酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的亚油酸；浓度为0.2mg/kg-20mg/kg(连端点在内)的油酸；和浓度为约0.1mg/kg-10mg/kg(连端点在内)的固醇(其中mg/kg＝百万分之一)。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含浓度为约9mg/kg的辛酸、浓度为约2mg/kg的棕榈酸、浓度为约2mg/kg的亚油酸、浓度为约2mg/kg的油酸和浓度为约1mg/kg的固醇中的一种或多种(其中mg/kg＝百万分之一)的培养基互换使用。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含浓度为9.19mg/kg的辛酸、浓度为1.86mg/kg的棕榈酸、浓度为约2.12mg/kg的亚油酸、浓度为约2.13mg/kg的油酸和浓度为约1.01mg/kg的固醇中的一种或多种(其中mg/kg＝百万分之一)的培养基互换使用。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含浓度为9.19mg/kg的辛酸、浓度为1.86mg/kg的棕榈酸、浓度为2.12mg/kg的亚油酸、浓度为约2.13mg/kg的油酸和浓度为1.01mg/kg的固醇中的一种或多种(其中mg/kg＝百万分之一)的培养基互换使用。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含以下中的一种或多种的培养基互换使用：浓度为6.4μmol/kg-640μmol/kg(连端点在内)的辛酸；浓度为0.7μmol/kg-70μmol/kg(连端点在内)的棕榈酸；浓度为0.75μmol/kg-75μmol/kg(连端点在内)的亚油酸；浓度为0.75μmol/kg-75μmol/kg(连端点在内)的油酸；和浓度为0.25μmol/kg-25μmol/kg(连端点在内)的固醇。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含浓度为约64μmol/kg的辛酸、浓度为约7μmol/kg的棕榈酸、浓度为约7.5μmol/kg的亚油酸、浓度为约7.5μmol/kg的油酸和浓度为约2.5μmol/kg的固醇中的一种或多种的培养基互换使用。
在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含浓度为约63.75μmol/kg的辛酸、浓度为约7.27μmol/kg的棕榈酸、浓度为约7.57μmol/kg的亚油酸、浓度为约7.56μmol/kg的油酸和浓度为约2.61μmol/kg的固醇中的一种或多种的培养基互换使用。在某些实施方案中，术语“补料T-细胞扩充组合物”或“T-细胞扩充组合物”可与包含浓度为约63.75μmol/kg的辛酸、浓度为约7.27μmol/kg的棕榈酸、浓度为约7.57μmol/kg的亚油酸、浓度为7.56μmol/kg的油酸和浓度为2.61μmol/kg的固醇中的一种或多种的培养基互换使用。
在本公开内容的产生修饰的T细胞(例如干细胞样T细胞、TSCM和/或TCM)的方法的某些实施方案中，方法包括使修饰的T细胞与P13K-Akt-mTOR途径的抑制剂接触。本公开内容的修饰的T-细胞，包括本公开内容的修饰的干细胞样T细胞、TSCM和/或TCM，可以用包含PI3K途径的组分的一种或多种抑制剂的生长培养基进行温育、培养、生长、贮存或在程序的方法的任何步骤中按另一种方式组合。PI3K途径的组分的示例性抑制剂包括，但不限于，GSK3β的抑制剂，例如TWS119(也称为GSK 3B抑制剂XII；具有化学式C18H14N4O2的CAS编号601514-19-6)。PI3K途径的组分的示例性抑制剂包括，但不限于，bb007(BLUEBIRDBIOTM)。PI3K途径的组分的额外的示例性抑制剂包括，但不限于，别构Akt抑制剂VIII(也称为具有化合物编号10196499的Akti-1/2)、ATP竞争性抑制剂(靶向蛋白激酶B(Akt)的ATP-结合口袋的正构(Orthosteric)抑制剂)、异喹啉-5-氨磺酰(H-8、H-89和NL-71-101)、环己亚胺(Azepane)衍生物(衍生自(-)-balanol的一系列结构)、氨基呋咱(Aminofurazans)(GSK690693)、杂环环(7-氮杂吲哚、6-苯基嘌呤衍生物、吡咯并[2，3-d]嘧啶衍生物、CCT128930、3-氨基吡咯烷、苯胺基三唑衍生物、螺二氢吲哚(spiroindoline)衍生物、AZD5363、依帕他塞(ipatasertib)(GDC-0068、RG7440)、A-674563和A-443654)、苯基吡唑衍生物(AT7867和AT13148)、噻吩羧酰胺衍生物(Afuresertib(GSK2110183)、2-嘧啶基-5-酰胺基噻吩衍生物(DC120)、uprosertib(GSK2141795))、别构抑制剂(优于正构抑制剂，提供更高的特异性、降低的副作用和更小的毒性)、2，3-二苯基喹喔啉类似物(2，3-二苯基喹喔啉衍生物、三唑并[3，4-f][1，6]萘啶-3(2H)-酮衍生物(MK-2206))、烷基磷脂(依地福新(Edelfosine)(1-O-十八烷基-2-O-甲基-外消旋-甘油-3-磷酸胆碱，ET-18-OCH3)伊莫佛新(ilmofosine)(BM41.440)、米替福星(miltefosine)(十六烷基磷酸胆碱，HePC)、哌立福新(perifosine)(D-21266)、瓢儿菜基磷酸胆碱(erucylphosphocholine)(ErPC)、erufosine(ErPC3，瓢儿菜基磷酸高胆碱(erucylphosphohomocholine))、吲哚-3-甲醇类似物(吲哚-3-甲醇、3-氯乙酰吲哚、二吲哚基甲烷、6-甲氧基-5，7-二氢吲哚并[2，3-b]咔唑-2，10-二羧酸二乙酯(SR13668)、OSU-A9)、氨磺酰衍生物(PH-316和PHT-427)、硫脲衍生物(PIT-1、PIT-2、DM-PIT-1、N-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)羰基]-N′-(3-溴苯基])-硫脲)、嘌呤衍生物(曲西瑞宾(Triciribine)(TCN、NSC 154020)、一磷酸曲西瑞宾活性类似物(TCN-P)、4-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶衍生物API-1、3-苯基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶衍生物、ARQ 092)、BAY1125976、3-甲基-黄嘌呤，喹啉-4-羧酰胺和2-[4-(环己-1，3-二烯-1-基)-1H-吡唑-3-基]酚、3-氧代-甘遂酸、3α-和3β-乙酸基-甘遂酸、乙酸基-甘遂酸和不可逆抑制剂(抗生素、乳醌霉素、富伦菌素B、卡拉真菌素、梅德霉素、Boc-Phe-乙烯基酮、4-羟基壬烯醛(4-HNE)、1，6-萘啶酮衍生物和咪唑并-1，2-吡啶衍生物)。
在本公开内容的产生修饰的T细胞(例如干细胞样T细胞、TSCM和/或TCM)的方法的某些实施方案中，方法包括使修饰的T细胞与T细胞效应子分化(T cell effectordifferentiation)的抑制剂接触。T细胞效应子分化的示例性抑制剂包括，但不限于，BET抑制剂(例如JQ1，噻吩并三唑并二氮杂
Figure BPA0000288251470001151
(hienotriazolodiazepine))和/或BET蛋白家族的抑制剂(例如BRD2、BRD3、BRD4和BRDT)。
在本公开内容的产生修饰的T细胞(例如干细胞样T细胞、TSCM和/或TCM)的方法的某些实施方案中，方法包括使修饰的T细胞与减少核质乙酰辅酶A的试剂接触。减少核质乙酰辅酶A的示例性试剂包括，但不限于，2-羟基柠檬酸酯(2-HC)以及增加Acss1表达的试剂。
在本公开内容的产生修饰的T细胞(例如干细胞样T细胞、TSCM和/或TCM)的方法的某些实施方案中，方法包括使修饰的T细胞与包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂的组合物接触。在一些实施方案中，包含HDAC抑制剂的组合物包含丙戊酸(valproic acid)、苯基丁酸钠(NaPB)或其组合或由其组成。在一些实施方案中，包含HDAC抑制剂的组合物包含丙戊酸或由其组成。在一些实施方案中，包含HDAC抑制剂的组合物包含苯基丁酸钠(NaPB)或由其组成。
在本公开内容的产生修饰的T细胞(例如干细胞样T细胞、TSCM和/或TCM)的方法的某些实施方案中，活化添加物可以包含一种或多种细胞因子。一种或多种细胞因子可包括任何细胞因子，包括但不限于，淋巴因子。示例性的淋巴因子包括，但不限于，白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-21(IL-21)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干扰素-γ(INFγ)。一种或多种细胞因子可以包括IL-2。
在本公开内容的产生修饰的T细胞(例如干细胞样T细胞、TSCM和/或TCM)的方法的某些实施方案中，活化添加物可以包含一种或多种激活蛋白复合体。示例性和非限制性激活蛋白复合体可以包括结合CD3、CD28和CD2中的一种或多种的单体、二聚、三聚或四聚抗体复合体。在一些实施方案中，活化添加物包含激活蛋白复合体或由其组成，所述激活蛋白复合体包含人抗体、人源化抗体或重组抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，活化添加物包含结合CD3和CD28的激活蛋白复合体或由其组成。在一些实施方案中，活化添加物包含结合CD3、CD28和CD2的激活蛋白复合体或由其组成，
天然杀伤(NK)细胞
在某些实施方案中，本公开内容的修饰的免疫或免疫前体细胞是天然杀伤(NK)细胞。在某些实施方案中，NK细胞是从淋巴祖细胞分化的细胞毒性淋巴细胞。
本公开内容的修饰的NK细胞可以衍生自修饰的造血干祖细胞(HSPCs)或修饰的HSCs。
在某些实施方案中，非活化的NK细胞衍生自排除CD3的白细胞分离法(leukopheresis)(含有CD14/CD19/CD56+细胞)。
在某些实施方案中，使用Lonza 4D核转染仪(nucleofector)或BTX ECM 830(500V，700usec脉冲持续时间，0.2mm电极隙，一个脉冲)电穿孔NK细胞。所有的Lonza 4D核转染仪程序都被预期在本公开内容的方法范围内。
在某些实施方案中，在杯中于100μL P3缓冲液中每次电穿孔对5x10E6细胞进行电穿孔。然而，对于商业制造方法，这个按体积计细胞的比例是可改变比例的。
在某些实施方案中，通过与额外的细胞系共培养来刺激NK细胞。在某些实施方案中，额外的细胞系包括人工抗原呈递细胞(aAPCs)。在某些实施方案中，刺激在电穿孔后的第1、2、3、4、5、6或7天发生。在某些实施方案中，刺激在电穿孔后的第2天发生。
在某些实施方案中，NK细胞表达CD56。
B细胞
在某些实施方案中，本公开内容的修饰的免疫或免疫前体细胞是B细胞。B细胞是在细胞表面表达B细胞受体的一种类型的淋巴细胞。B细胞受体与特定抗原结合。
本公开内容的修饰的B细胞可以衍生自修饰的造血干祖细胞(HSPCs)或修饰的HSCs。
在某些实施方案中，使用本公开内容的方法修饰HSPCs，且然后将其在有人IL-3、Flt3L、TPO、SCF和G-CSF的情况下引发用于B细胞分化达至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天。在某些实施方案中，使用本公开内容的方法修饰HSPCs，且然后将其在有人IL-3、Flt3L、TPO、SCF和G-CSF的情况下引发用于B细胞分化达5天。
在某些实施方案中，在引发后，将修饰的HSPC细胞转移至饲养细胞层并每两周流加一次，以及每周转移至新鲜的饲养层一次。在某些实施方案中，饲养细胞为MS-5饲养细胞。
在某些实施方案中，将修饰的HSPC细胞用MS-5饲养细胞培养至少7、14、21、28、30、33、35、42或48天。在某些实施方案中，将修饰的HSPC细胞用MS-5饲养细胞培养33天。
细胞修饰方法
在本公开内容的方法的一些实施方案中，在递送或引入步骤期间，组合物包含可改变比例的每毫升缓冲液或其他培养基250x106的原代人T细胞。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，通过电穿孔或核转染将组合物递送或引入到细胞。在一些实施方案中，递送或引入步骤包括电穿孔或核转染。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，通过除电穿孔或核转染以外的方法将组合物递送或引入到细胞。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，通过局部递送、吸附、吸收、电穿孔、旋转感染(spin-fection)、共培养、转染、机械递送、声波递送、振动递送、磁转染(magnetofection)或通过纳米颗粒介导的递送中的一种或多种递送或引入组合物。在一些实施方案中，递送或引入步骤包括局部递送、吸附、吸收、电穿孔、旋转感染、共培养、转染、机械递送、声波递送、振动递送、磁转染或通过纳米颗粒介导的递送中的一种或多种。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，通过脂质体转染、磷酸钙转染，fugene转染和树状聚体介导的转染递送或引入组合物。在一些实施方案中，递送或引入步骤包括脂质体转染、磷酸钙转染，fugene转染和树状聚体介导的转染中的一种或多种。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，通过机械转染递送或引入组合物，所述机械转染包括细胞挤压、细胞轰击或基因枪技术。在一些实施方案中，递送或引入步骤包括一种或多种机械转染，所述机械转染包括细胞挤压、细胞轰击或基因枪技术。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，通过纳米颗粒介导的转染递送或引入组合物，所述纳米颗粒介导的转染包括脂质体递送、通过微团的递送和通过聚合物囊泡(polymerosomes)的递送。在一些实施方案中，递送或引入步骤包括脂质体递送、通过微团的递送和通过聚合物囊泡的递送中的一种或多种。
递送的非转座方法
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，可以通过将序列引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中来产生本公开内容的修饰的细胞。引入步骤可以包括经由非转座递送系统递送序列和/或基因编辑组合物。引入步骤可以先体外后体内、体内、体外或原位进行。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中包括局部递送、吸附、吸收、电穿孔、旋转感染、共培养、转染、机械递送、声波递送、振动递送、磁转染和纳米颗粒介导的递送中的一种或多种。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将核酸序列和/或基因编辑构建体引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中包括脂质体转染、磷酸钙转染，fugene转染和树状聚体介导的转染。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，通过机械转染将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中包括细胞挤压、细胞轰击或基因枪技术。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，通过纳米颗粒介导的转染将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中包括脂质体、微团、聚合物和聚合物囊泡中的一种或多种。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中包括非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体包含序列和/或基因编辑组合物。在一些实施方案中，非病毒载体包括质粒DNA、线性双链DNA(dsDNA)、线性单链DNA(ssDNA)、DoggyBoneTMDNA、纳米质粒、小环DNA、单链寡脱氧核苷酸(ssODN)、DDNA寡核苷酸、单链mRNA(ssRNA)和双链mRNA(dsRNA)。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中包括病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是非整合型和/或非染色体载体。示例性的非整合型非染色体载体包括，但不限于，腺伴随病毒(AAV)、腺病毒和疱疹病毒。在一些实施方案中，病毒载体是整合型染色体载体。整合型染色体载体包括，但不限于，腺伴随载体(AAV)、慢病毒和γ-反转录病毒。在一些实施方案中，病毒载体包含序列和/或基因编辑组合物。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中包括本公开内容的载体的组合。示例性的非限制性载体组合包括：病毒和非病毒载体、许多非病毒载体或许多病毒载体。示例性但非限制性的载体组合包括：DNA-衍生的和RNA-衍生的载体的组合、非病毒表达载体和病毒递送载体的组合、非病毒表达载体和纳米颗粒递送载体的组合、两种不同的非病毒表达载体的组合、非病毒表达载体和机械或化学转染方法的组合。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中稳定地整合序列、瞬时地整合序列、产生序列的位点特异性整合或产生序列的偏倚整合。在一些实施方案中，序列是核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列包含转基因。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中稳定地整合序列。在一些实施方案中，序列是核酸序列。在一些实施方案中，稳定的染色体整合可以是随机整合、位点特异性整合或偏倚整合。在一些实施方案中，位点特异性整合可以是非辅助的或辅助的。在一些实施方案中，辅助的位点特异性整合与位点定向核酸酶共递送。在一些实施方案中，位点定向核酸酶包含转基因，所述转基因具有5’和3’核苷酸序列延伸，其含有与基因组整合位点的上游和下游区域的百分比同源性。在一些实施方案中，具有同源核苷酸延伸的转基因使得能够通过同源重组、微同源性(microhomology)介导的末端联接或非同源末端联接进行基因组整合。在一些实施方案中，位点特异性整合发生在安全港位点(safe harborsite)。基因组安全港位点能够以确保新插入的遗传元件可靠地起作用(例如，以治疗有效的表达水平表达)并且不给宿主基因组带来使宿主生物发生危险的有害改变的方式适应新遗传物质的整合。潜在的基因组安全港包括，但不限于，人清蛋白基因的内含子序列、腺伴随病毒位点1(AAVS1)、AAV病毒在19号染色体上的天然存在的整合位点、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因的位点和小鼠Rosa26基因座的人直向同源物的位点。
在一些实施方案中，位点特异性转基因整合发生在破坏靶基因表达的位点。在一些实施方案中，靶基因表达的破坏通过在内含子、外显子、启动子、遗传元件、增强子、阻抑基因、起始密码子、终止密码子和应答元件处的位点特异性整合发生。在一些实施方案中，通过位点特异性整合靶向的示例性靶基因包括但不限于TRAC、TRAB、PDI、任何免疫抑制基因和与同种异体排斥(allo-rejection)有关的基因。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，位点特异性转基因整合发生在导致增强的靶基因表达的位点。在一些实施方案中，靶基因表达的增强通过在内含子、外显子、启动子、遗传元件、增强子、阻抑基因、起始密码子、终止密码子和应答元件处的位点特异性整合发生。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，可以使用酶来在宿主基因组中产生链断裂，以促进转基因的递送或整合。在一些实施方案中，酶产生单链断裂。在一些实施方案中，酶产生双链断裂。在一些实施方案中，诱导断裂的酶的实例包括但不限于：转座酶、整合酶、内切核酸酶、CRISPR-Cas9、转录激活蛋白样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、Cas-CLOVERTM和CPF1。在一些实施方案中，诱导断裂的酶可以编码在DNA中、编码在mRNA中、作为蛋白质、作为与指导RNA(gRNA)的核蛋白复合体递送至细胞。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，位点特异性转基因整合是由载体介导的整合位点偏倚控制的。在一些实施方案中，载体介导的整合位点偏倚由所选择的慢病毒载体控制。在一些实施方案中，载体介导的整合位点偏倚由所选择的γ-反转录病毒载体控制。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，位点特异性转基因整合是不稳定的染色体插入。在一些实施方案中，整合的转基因可以变得沉默、去除、切除或进一步修饰。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，基因组修饰包括不稳定的转基因整合。在一些实施方案中，不稳定的整合可以是瞬时非染色体整合、半稳定非染色体整合、半持久非染色体插入或不稳定的染色体插入。在一些实施方式中，瞬时非染色体插入可以是染色体外的(epi-chromosomal)或细胞质的。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，转基因的瞬时非染色体插入不整合到染色体中，并且修饰的遗传物质不在细胞分裂过程中复制。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，基因组修饰包括半稳定的或持久的转基因的非染色体整合。在一些实施方案中，DNA载体编码支架/基质附着区(S-MAR)组件，其与核基质蛋白结合用于非病毒载体的附加型保持，从而允许在分裂细胞的细胞核中自主复制。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，基因组修饰是不稳定的转基因的染色体整合。在一些实施方案中，整合的转基因可以变得沉默、去除、切除或进一步修饰。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中，通过转基因插入对基因组的修饰可通过同源重组(HR)、微同源性介导的末端联接(MMEJ)、非同源末端联接(NHEJ)、转座酶介导的修饰、整合酶介导的修饰、内切核酸酶介导的修饰或重组酶介导的修饰经由宿主细胞定向双链断裂修复(同源性-定向修复)发生。在一些实施方案中，通过转基因插入对基因组的修饰可以经由CRISPR-Cas9、TALEN、ZFNs、Cas-CLOVER和cpf1发生。
纳米颗粒递送
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，将序列和/或基因编辑组合物引入本公开内容的HSC、HSC后代细胞、免疫细胞或免疫前体细胞中包括纳米颗粒(nanparticle)载体。纳米颗粒载体可以包封本公开内容的组合物。另一方面或此外，纳米颗粒载体的表面可以包含本公开内容的组合物。在一些实施方案中，表面是内表面。在一些实施方案中，表面是外表面。在一些实施方案中，表面包含整合在其中或在其上的本公开内容的组合物。
本公开内容的纳米颗粒载体的非限制性实例可包括亲水嵌段、疏水嵌段和带电嵌段中的一种或多种。在一些实施方案中，亲水嵌段可以是聚环氧乙烷(PEO)，并且带电嵌段可以是聚(L-组氨酸)。
本公开内容提供了包含二嵌段和三嵌段共聚物的纳米颗粒载体。示例性的二嵌段共聚物可包括亲水嵌段、疏水嵌段和带电嵌段中的一种或多种。在一些实施方案中，亲水嵌段可以是聚环氧乙烷(PEO)，并且带电嵌段可以是聚(L-组氨酸)。示例性的三嵌段共聚物可包括亲水嵌段、疏水嵌段和带电嵌段中的一种或多种。在一些实施方案中，亲水嵌段可以是聚环氧乙烷(PEO)，并且带电嵌段可以是聚(L-组氨酸)。
可以在各种实施方案中使用的示例性三嵌段共聚物是PEO-b-PLA-b-PHIS，具有根据设计而变化的每个嵌段中可变数目的重复单元。
聚(组氨酸)(即，聚(L-组氨酸))是一种pH-敏感聚合物，由于咪唑环而在不饱和氮上提供了孤电子对。也就是说，聚(组氨酸)通过质子化-脱质子化具有兼性性质。各种实施方案使得能够通过例如与基于聚(组氨酸)的微团复合而进行本公开内容的组合物(包括基因编辑组合物)的细胞内递送。
可用作制备实施方案微团的三嵌段共聚物的中间体的二嵌段共聚物可具有与PEG在化学上同义的亲水生物相容性聚环氧乙烷(PEO)，其与各种疏水脂族聚酐、聚核酸、聚酯、聚原酸酯、聚肽、聚磷腈和多糖偶联，包括但不限于聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PLGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚ε-己内酯(PCL)和聚亚丙基碳酸酯(PTMC)。
包含100％聚乙二醇化(PEGylated)表面的聚合物微团具有改善的体外化学稳定性、增加的体内生物利用率和延长的血液循环半衰期。例如，构成聚合物微团的膜部分的脂族聚酯在诸如人体内的生理条件下通过其酯键的水解而降解。由于其可生物降解的特性，脂族聚酯对于作为药物递送设备中的可植入生物材料、可生物再吸收的缝合线、粘附阻挡层(adhesion barrier)以及作为用于通过组织工程修复损伤的支架的用途而得到了相当多的注意。
在不希望受特定理论束缚的情况下，据信在由各种实施方案三嵌段共聚物形成的微团中，疏水嵌段聚集以形成核心，从而使末端的亲水嵌段和聚(组氨酸)嵌段形成一个或多个周围层。
支架蛋白
本公开内容的蛋白支架可以衍生自纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白、编码或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、组合、制剂、设备以及制备和使用它们的方法。在优选的实施方案中，蛋白支架包含来自人生腱蛋白-C(在下文为“生腱蛋白”)的多种FN3结构域的共有序列。在进一步优选的实施方案中，本公开内容的蛋白支架是15种FN3结构域的共有序列。可以设计本公开内容的蛋白支架以结合各种分子，例如，细胞靶蛋白。在优选的实施方案中，本公开内容的蛋白支架可以被设计为结合配体或抗原的野生型和/或变体形式的表位。
本公开内容的蛋白支架可包括额外的分子或部分，例如，抗体的Fc区、清蛋白结合结构域或影响半衰期的其他部分。在进一步的实施方案中，本公开内容的蛋白支架可以与可以编码所述蛋白支架的核酸分子结合。
本公开内容提供了用于在宿主细胞中表达基于多种FN3结构域的共有序列的至少一种蛋白支架的至少一种方法，其包括在其中至少一种蛋白支架以可检测的和/或可回收的量表达的条件下培养如本文所述的宿主细胞。
本公开内容提供了至少一种组合物，其包含(a)如本文所述的基于多种FN3结构域的共有序列的蛋白支架和/或编码核酸；和(b)合适的和/或药学上可接受的载体或稀释剂。
本公开内容提供了产生基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白，优选地，多种FN3结构域的共有序列，并且更优选地，来自人生腱蛋白的多种FN3结构域的共有序列的蛋白支架文库的方法。所述文库是由通过改变(通过突变)支架的部分中的特定位置例如环区域中的分子中的氨基酸或氨基酸数目来连续产生支架而形成的。可以通过改变单个环的氨基酸组成或同时改变多个环或支架分子的额外位置来产生文库。改变的环可以相应地延长或缩短。可以产生这种文库以包括在每个位置所有可能的氨基酸，或设计的氨基酸亚群。文库成员可用于通过展示进行筛选，例如体外或CIS展示(DNA、RNA、核糖体展示等)、酵母、细菌和噬菌体展示。
本公开内容的蛋白支架提供增强的生物物理性质，例如在还原条件下的稳定性和在高浓度下的溶解度；它们可以在原核系统如大肠杆菌(E.coli)中，在真核系统如酵母中，以及在体外转录/翻译系统如兔网织红细胞裂解物系统中表达和折叠。
本公开内容提供了通过用靶淘选本发明的支架文库并检测结合物(binder)来产生与特定靶结合的支架分子的方法。在其他相关方面，本公开内容包括筛选方法，其可以用于产生或亲和力成熟具有所期望的活性，例如，能够以一定亲和力结合靶蛋白的蛋白支架。亲和力成熟可以通过重复轮次的使用系统(例如噬菌体展示或体外展示)的诱变和选择来完成。这个过程中的诱变可能是对特定支架残基的位点定向诱变、由于倾向差错PCR的随机诱变、DNA混编和/或这些技术的组合的结果。
本公开内容提供了基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白的共有序列的分离的、重组的和/或合成的蛋白支架，包括，但不限于，哺乳动物衍生的支架，以及包含至少一种编码基于共有FN3序列的蛋白支架的多核苷酸的组合物和编码核酸分子。本公开内容进一步包括，但不限于，制备和使用这种核酸和蛋白支架的方法，包括诊断和治疗组合物、方法和设备。
本公开内容的蛋白支架提供了胜过常规治疗的优点，例如局部、口服或穿过血脑-屏障施用的能力，在大肠杆菌中表达的能力，从而允许与哺乳动物细胞表达比较随资源而变增加的蛋白质表达，被改造成可与多个靶或相同靶的多个表位结合的双特异性或串联分子的能力，与药物、聚合物和探针缀合的能力，被配制为高浓度的能力，以及这种分子有效穿透患病组织和肿瘤的能力。
此外，蛋白支架具有许多与其模仿抗体可变区的折叠有关的抗体性质。这个取向使得FN3环能够类似于抗体互补性决定区(CDRs)被暴露。它们应该能够结合细胞靶，并且环可以被改变，例如，亲和力成熟，以改善某些结合或相关性质。
本公开内容的蛋白支架的六个环中的三个在拓扑学上对应于抗体的互补性决定区(CDRs 1-3)，即，抗原结合区，而剩余的三个环以类似于抗体CDRs的方式进行表面暴露。这些环跨越于共有序列的残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81或周围。优选地，为了结合特异性和亲和力改变残基22-28、51-54和75-81或周围的环区域。这些环区域中的一个或多个与其他环区域和/或其他维持其序列作为主链部分的链随机化以提供文库，并且可以从对特定蛋白靶具有高亲和力的文库中选择有效的结合物。环区域中的一个或多个可以与靶蛋白相互作用，类似于抗体CDR与所述蛋白的相互作用。
抗原/配体识别区序列的发现
本公开内容提供了产生用于结合本公开内容的抗原和/或配体的抗原/配体识别区(ARR/LRR)序列的文库的方法。所述文库是由通过改变(通过突变)ARR/LRR的特定位置的序列中的氨基酸或氨基酸数目来连续产生ARR/LRR序列而形成的。在一些实施方案中，ARR/LRR包括本公开内容的蛋白支架、抗体模拟物、Centyrin、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、VHH和VH中的一种或多种。在一些实施方案中，所述文库是由通过改变(通过突变)抗体、ScFv、VHH或VH的特定位置的序列(例如，可变结构域的一个或多个互补性决定区(CDR)和/或构架区)中的氨基酸或氨基酸数目来连续产生ARR/LRR序列而形成的。
可以通过改变单个CDR的氨基酸组成或同时改变多个CDRs或抗体、scFv、VHH或VH的额外位置(例如，可变区的构架序列)来产生文库。改变的可变结构域的CDR和/或构架序列可以相应地延长或缩短。
可以通过改变支架蛋白或Centyrin的环的氨基酸组成来产生文库。改变的环序列可以相应地延长或缩短。
可以通过改变抗体模拟物的抗原或配体结合或特异性决定区的氨基酸组成来产生文库。
可以产生这种文库以包括在每个位置所有可能的氨基酸，或设计的氨基酸亚群。文库成员可用于通过展示进行筛选，例如体外或CIS展示(DNA、RNA、核糖体展示等)、酵母、细菌和噬菌体展示。
本公开内容的ARRs/LRRs提供增强的生物物理性质，例如在还原条件下的稳定性和在高浓度下的溶解度；它们可以在原核系统如大肠杆菌中，在真核系统如酵母中，以及在体外转录/翻译系统如兔网织红细胞裂解物系统中表达和折叠。
本公开内容提供了通过用靶淘选本发明的文库并检测结合物来产生与特定靶结合的ARR/LRR或其部分的方法。在其他相关方面，本公开内容包括筛选方法，其可以用于产生或亲和力成熟具有所期望的活性，例如，能够以一定亲和力结合靶蛋白的ARRs/LRRs。亲和力成熟可以通过重复轮次的使用系统(例如噬菌体展示或体外展示)的诱变和选择来完成。这个过程中的诱变可能是对特定蛋白残基的位点定向诱变、由于倾向差错PCR的随机诱变、DNA混编和/或这些技术的组合的结果。
本公开内容提供了包括至少一种VHH的分离的、重组的和/或合成的蛋白支架。本公开内容进一步包括，但不限于，制备和使用这种核酸和蛋白支架的方法，包括诊断和治疗组合物、方法和设备。
本公开内容的组合物提供了胜过常规治疗的优点，例如局部、口服或穿过血脑-屏障施用的能力，在大肠杆菌中表达的能力，从而允许与哺乳动物细胞表达比较随资源而变增加的蛋白质表达，被改造成可与多个靶或相同靶的多个表位结合的双特异性或串联分子的能力，与药物、聚合物和探针缀合的能力，被配制为高浓度的能力，以及这种分子有效穿透患病组织和肿瘤的能力。
蛋白的生产和产生
如本领域众所周知的，本公开内容的蛋白质可以任选地由细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化细胞的克隆群体产生。参见，例如，Ausubel等人，编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，NY，N.Y.(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Colligan等人，编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，JohnWiley&Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)。
可以改变、添加和/或缺失编码蛋白的氨基酸，以降低免疫原性或降低、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、稳定性、溶解度或任何其他合适的特征，如本领域中已知的。
可以在保留对抗原或配体的高亲和力以及其他有利生物学性质的情况下改造蛋白。为了实现这个目的，可以通过使用亲本和改造的序列的三维模型对亲本序列和各种概念上改造的产品的分析过程，任选地制备蛋白。三维模型是普遍可获得的，并且是本领域技术人员熟悉的。举例说明并展示所选择的候选序列的可能的三维构象结构，并且可以测量可能的免疫原性的计算机程序是可获得的(例如，Monrovia，Calif.的Xencor，Inc.的Immunofilter程序)。对这些展示的检查允许分析残基在候选序列的功能发挥中的可能作用，即，分析影响蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从亲本和参考序列中选择残基并将其组合，从而获得所期望的特征，例如对一种或多种靶抗原/配体的亲和力。另一方面，或除上述程序以外，可以使用其他合适的改造方法。
ARRs/LRRs的筛选
可以使用核苷酸(DNA或RNA展示)或肽展示文库，例如，体外展示，方便地实现筛选蛋白ARRs/LRRs或其任何部分与相似蛋白或片段的特异性结合。这个方法涉及针对具有所期望的功能或结构的个别成员筛选一大批肽。展示的核苷酸或肽序列的长度可以是3至5000个或更多个核苷酸或氨基酸，常常长5-100个氨基酸，并且经常长约8-25个氨基酸。除了用于产生肽文库的直接化学合成方法以外，已经描述了几种重组DNA方法。一种类型涉及在噬菌体或细胞表面上展示肽序列。每个噬菌体或细胞均含有编码特定展示的肽序列的核苷酸序列。这种方法在PCT专利公开Nos.91/17271、91/18980、91/19818和93/08278中进行了描述，
用于产生肽文库的其他系统具有体外化学合成和重组方法两者的情况。参见，PCT专利公开Nos.92/05258、92/14843和96/19256。也参见美国专利Nos.5,658,754和5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒可从诸如Invitrogen(Carlsbad，Calif.)和CambridgeAntibody Technologies(Cambridgeshire，UK)的供应厂商商购获得。参见，例如，美国专利Nos.4,704,692，4,939,666，4,946,778，5,260,203，5,455,030，5,518,889，5,534,621，5,656,730，5,763,733，5,767,260，5856456，转让给Enzon；5,223,409，5,403,484，5,571,698，5,837,500，转让给Dyax，5,427,908，5,580,717，转让给Affymax；5,885,793，转让给Cambridge Antibody Technologies；5,750,373，转让给Genentech，5,618,920，5,595,898，5,576,195，5,698,435，5,693,493，5,698,417，转让给Xoma，Colligan，上述；Ausubel，上述；或Sambrook，上述。
包括本公开内容的蛋白支架、抗体、ScFv、Centyrin、单结构域抗体、VHH或VH中的一种或多种的本公开内容的ARRs/LRRs可以以各式各样的亲和力(KD)结合人或其他哺乳动物蛋白。在优选的实施方案中，至少一种ARR/LRR可任选地以高亲和力结合靶蛋白，例如，其KD等于或小于约10-7M，例如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或值)X 10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中的任何范围或值，如通过表面等离振子共振或Kinexa方法所测定的，如本领域技术人员所实践的。在优选的实施方案中，本公开内容的至少一种蛋白支架、抗体、ScFv、Centyrin、单结构域抗体、VHH或VH可以任选地以高亲和力结合靶蛋白，例如，其KD等于或小于约10-7M，例如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或值)X 10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中的任何范围或值，如通过表面等离振子共振或Kinexa方法所测定的，如本领域技术人员所实践的。
本公开内容的蛋白支架、抗体、ScFv、Centyrin、单结构域抗体、VHH或VH对抗原/配体的亲和力或亲合力可以使用任何合适的方法通过实验测定。(参见，例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions，”In Fundamental Immunology，Paul，W.E.，编辑，Raven Press：New York，N.Y.(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman andCompany：New York，N.Y.(1992)；和本文所述的方法)。如果在不同条件下(例如，盐浓度、pH)进行测量，则特定的蛋白-抗原/配体相互作用的测量的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量优选地用蛋白支架(例如VHH)和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液例如本文所述的缓冲液进行。
可以用本公开内容的蛋白支架、抗体、ScFv、Centyrin、单结构域抗体、VHH或VH进行竞争性测定，以确定什么蛋白、抗体和其他拮抗剂竞争与靶蛋白的结合和/或共享表位区域。如本领域普通技术人员容易知道的，这些测定评价拮抗剂或配体之间对蛋白上有限数目的结合位点的竞争。在竞争之前或之后，将蛋白质和/或抗体固定或使其不溶解，并且将与靶蛋白结合的样品与未结合的样品分开，例如，通过倾析(在使蛋白/抗体预先不溶解的场合)或通过离心(在蛋白/抗体在竞争性反应后沉淀的场合)。同样地，竞争性结合可以通过蛋白支架、抗体、ScFv、Centyrin、单结构域抗体、VHH或VH与靶蛋白的结合或不结合是否改变功能来确定，例如，蛋白支架、抗体、ScFv、Centyrin、单结构域抗体、VHH或VH是否抑制或增强例如标记的酶促活性。如本领域众所周知的，可以使用ELISA和其他功能测定。
治疗用蛋白
在本公开内容的某些实施方案中，修饰T细胞以表达治疗用蛋白，包括分泌的人蛋白。这些分泌的蛋白可以作为单一疗法或与另一疗法组合用于治疗或预防任何疾病或病症。这些分泌的蛋白可以作为单一疗法或与另一疗法组合用于酶置换和/或生物治疗的施用。可以在proteinatlas.org/search/protein_class：Predicted％20secreted％20proteins找到人分泌的蛋白的数据库，其内容引入本文作为参考。可以找到示例性的人治疗用蛋白，但不限于表1中的人蛋白。
表1.示例性的治疗用蛋白(和增强CAR-T功效的蛋白)。本公开内容的组合物可以包含驱动本公开内容的任何序列表达的表1的一种或多种蛋白的启动子。
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细胞标记的表达
在本公开内容的某些实施方案中，修饰T细胞以表达可检测的标记或指示物。在一些实施方案中，这些可检测的标记包括，但不限于，荧光蛋白。荧光蛋白的非限制性实例包括TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midorishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、单体Kusabira Orange、mKok、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagFRP-T、mApple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NiRFP、TagRFP657、IFP1.4、mRFP、mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2、mBeRFP及其谱移变体。在本公开内容的一些实施方案中，可检测的标记或指示物包括萤光素酶。在一些实施方案中，可检测的标记或指示物被密码子优化以用于在人中表达。在一些实施方案中，可检测的标记或指示物是细胞内标记或指示物。在一些实施方案中，可检测的标记或指示物是胞质标记或指示物。在一些实施方案中，可检测的标记或指示物是核标记或指示物。在一些实施方案中，可检测的标记或指示物是线粒体标记或指示物。在一些实施方案中，可检测的标记或指示物是细胞表面标记。在一些实施方案中，特别是其中标记或指示物是细胞表面标记的那些实施方案，标记或指示物可以束缚在细胞膜上。用本公开内容的组合物和方法修饰以表达标记的细胞可以在体内、先体外后体内、体外和原位用作指示细胞。在本公开内容的某些实施方案中，标记或指示物在本公开内容的诱导型启动子的控制下，从而使得当靶向所述诱导型启动子时，所述启动子诱导标记或指示物的表达。
诱导型启动子
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包含编码NFκB启动子的序列。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包含编码干扰素(IFN)启动子的序列或编码白细胞介素-2启动子的序列。在某些实施方案中，干扰素(IFN)启动子是IFNγ启动子，在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自细胞因子或趋化因子的启动子。在某些实施方案中，细胞因子或趋化因子包括IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A/F、IL21、IL22、IL23、转化生长因子β(TGFβ)、集落刺激因子2(GM-CSF)、干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子(TNFα)、LTα、穿孔蛋白、粒酶C(Gzmc)、粒酶B(Gzmb)、C-C基序趋化因子配体5(CCL5)、C-C基序趋化因子配体4(Ccl4)、C-C基序趋化因子配体3(Ccl3)、X-C基序趋化因子配体1(Xcl1)和LIF白细胞介素6家族细胞因子(Lif)。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自包含与细胞分化、激活、衰竭和功能有关的表面蛋白的基因的启动子。在某些实施方案中，所述基因包括CD69、CD71、CTLA4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM-3、GITR、MHCII、COX-2、FASL和4-1BB。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自与CD代谢和分化有关的基因的启动子。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自Nr4a1、Nr4a3、Tnfrsf9(4-1BB)、Sema7a、Zfp36l2、Gadd45b、Dusp5、Dusp6和Neto2的启动子。
核酸分子
编码蛋白支架的本公开内容的核酸分子可以是RNA的形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或者可以是DNA的形式，包括，但不限于，通过克隆获得或合成产生或其任何组合的cDNA和基因组DNA。DNA可以是三链的、双链的或单链的或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分都可以是编码链，也称为有义链，或者其可以是非编码链，也称为反义链。
本公开内容的分离的核酸分子可包括核酸分子，其包含任选地具有一个或多个内含子的可读框(ORF)，例如，但不限于，至少一种蛋白支架的至少一个指定部分；核酸分子，其包含与靶蛋白结合的蛋白支架或环区域的编码序列；和核酸分子，其包含与上述核苷酸序列显著不同的核苷酸序列，但是由于遗传密码的简并性，其仍编码如本文所述和/或如本领域已知的蛋白支架。当然，遗传密码是本领域众所周知的。因此，产生这种编码本发明的特定蛋白支架的简并核酸变体对于本领域技术人员而言将是常规的。参见，例如，Ausubel等人，上述，并且这种核酸变体包括在本发明中。
如本文所示的，包含编码蛋白支架的核酸的本公开内容的核酸分子可以包括，但不限于，独立编码蛋白支架片段的氨基酸序列的那些；整个蛋白支架或其一部分的编码序列；蛋白支架、片段或部分以及额外序列的编码序列，例如至少一种信号前导序列或融合肽的编码序列，带有或不带有前述的额外编码序列，例如至少一个内含子，连同额外的非编码序列，包括但不限于非编码5′和3′序列，例如在转录，mRNA加工，包括剪接和多腺苷酸化信号(例如，mRNA的核糖体结合和稳定性)中起作用的转录的非翻译序列；编码额外氨基酸的额外编码序列，例如提供额外功能性的那些。因此，可以将编码蛋白支架的序列与标记序列融合，例如编码促进包含蛋白支架片段或部分的融合的蛋白支架纯化的肽的序列。
与如本文所述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
本公开内容提供了在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，这个实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量包含这种多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于鉴定、分离或扩增保藏的文库中的部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸是分离自来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA或以其他方式与其互补的基因组或cDNA序列。
优选地，cDNA文库包含至少80％的全长序列，优选地，至少85％或90％的全长序列，并且，更优选地，至少95％的全长序列。可以将cDNA文库规范化以增加稀有序列的表现度。低或中等严格性杂交条件一般但不排他地与相对于互补序列具有降低的序列同一性的序列一起使用。对于更高同一性的序列，可以任选使用中等和高严格条件。低严格条件允许具有约70％序列同一性的序列的选择性杂交，并可用于鉴定直系同源或旁系同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸将编码由本文所述的多核苷酸编码的蛋白支架的至少一部分。本发明的多核苷酸包括可用于与编码本发明的蛋白支架的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见，例如，Ausubel，上述；Colligan，上述，各自整体引入本文作为参考。
核酸的构建
可以使用如本领域众所众所周知的(a)重组方法，(b)合成技术，(c)纯化技术和/或(d)其组合来制备本公开内容的分离的核酸。
核酸可以方便地包含除本发明的多核苷酸以外的序列。例如，可以将包含一个或多个内切核酸酶限制酶切位点的多克隆位点插入核酸中以帮助分离多核苷酸。同样地，可插入可翻译序列以帮助分离本公开内容的翻译的多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本公开内容的蛋白的便利手段。除去编码序列，本公开内容的核酸任选地是用于克隆和/或表达本公开内容的多核苷酸的载体、衔接头或接头。
可以将额外的序列添加到这种克隆和/或表达序列中，以最优化其在克隆和/或表达中的功能，以帮助多核苷酸的分离，或改善多核苷酸向细胞中的引入。克隆载体、表达载体、衔接头和接头的使用是本领域众所周知的。(参见，例如，Ausubel，上述；或Sambrook，上述)。
用于构建核酸的重组方法
可以使用本领域技术人员已知的许多克隆方法从生物学来源获得本公开内容的分离的核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。在一些实施方案中，在严格条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所期望的序列。RNA的分离以及cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员众所周知的。(参见，例如，Ausubel，上述；或Sambrook，上述)。
核酸筛选和分离方法
可以基于本公开内容的多核苷酸的序列，使用探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同生物中的同源基因。本领域技术人员将理解，可以在测定中采用各种程度的杂交严格性；且杂交或洗涤介质可以是严格的。随着杂交条件变得更加严格，探针和靶之间必须存在更大程度的互补性，以发生双链体形成。严格性程度可以通过温度、离子强度、pH和部分变性溶剂例如甲酰胺的存在中的一种或多种来控制。例如，可通过例如由在0％至50％范围内操纵甲酰胺的浓度改变反应物溶液的极性来方便地改变杂交的严格性。可检测的结合所需的互补性(序列同一性)程度将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而变化。互补性程度将最佳为100％或70-100％，或其中的任何范围或值。然而，应该理解，可以通过降低杂交和/或洗涤介质的严格性来补偿探针和引物中较小的序列变化。
RNA或DNA的扩增方法在本领域中是众所周知的，并且可以基于本文给出的教导和指导，在没有过度的实验的情况下根据本公开内容使用。
DNA或RNA扩增的已知方法包括，但不限于，聚合酶链反应(PCR)和相关的扩增方法(参见，例如，美国专利Nos.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188，授予Mullis等人；4,795,699和4,921,794，授予Tabor等人；5,142,033，授予Innis；5,122,464，授予Wilson等人；5,091,310，授予Innis；5,066,584，授予Gyllensten等人；4,889,818，授予Gelfand等人；4,994,370，授予Silver等人；4,766,067，授予Biswas；4,656,134，授予Ringold)和RNA介导性扩增，其使用针对靶序列的反义RNA作为双链DNA合成的模板(美国专利No.5,130,238，授予Malek等人，商品名为NASBA)，所述参考文献的全部内容引入本文作为参考。(参见，例如，Ausubel，上述；或Sambrook，上述。)
例如，聚合酶链反应(PCR)技术可用于直接从基因组DNA或cDNA文库扩增本公开内容的多核苷酸和相关基因的序列。PCR和其他体外扩增方法也可能对例如克隆编码待表达的蛋白的核酸序列有用处，以使核酸用作探针，用于检测样品中所期望的mRNA的存在、用于核酸测序或用于其他目的。足以以体外扩增方法指导技术人员的技术的实例在Berger，上述，Sambrook，上述，和Ausubel，上述，以及Mullis等人，美国专利No.4,683,202(1987)；和Innis等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications，Eds.，AcademicPress Inc.，San Diego，Calif.(1990)中找到。用于基因组PCR扩增的可商购获得的试剂盒是本领域已知的。参见，例如，Advantage-GC基因组PCR试剂盒(Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可用于提高长PCR产物的得率。
用于构建核酸的合成方法
还可以通过已知方法通过直接化学合成来制备本公开内容的分离的核酸(参见，例如，Ausubel等人，上述)。化学合成通常产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶聚合而转变为双链DNA。本领域技术人员将认识到，尽管DNA的化学合成可以限于约100个或更多个碱基的序列，但是通过连接较短的序列可以获得较长的序列。
重组表达盒
本公开内容进一步提供了包含本公开内容的核酸的重组表达盒。本公开内容的核酸序列，例如编码本公开内容的蛋白支架的cDNA或基因组序列，可以用于构建重组表达盒，其可以被引入至少一种所期望的宿主细胞中。重组表达盒一般将包含可操作地连接至转录起始调节序列的本公开内容的多核苷酸，所述转录起始调节序列将指导所述多核苷酸在预期宿主细胞中的转录。异源和非异源(即，内源)启动子两者均可用于指导本公开内容的核酸的表达。
在一些实施方案中，可以将用作启动子、增强子或其他元件的分离的核酸引入本公开内容的多核苷酸的非异源形式的适当位置(上游、下游或内含子中)，以便上调或下调本公开内容的多核苷酸的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代体内或体外改变内源启动子。
载体和宿主细胞
本公开内容还涉及包括本公开内容的分离的核酸分子的载体，用重组载体基因工程改造的宿主细胞，以及至少一种蛋白支架通过重组技术的生产，如本领域所众所周知的。参见，例如，Sambrook等人，上述；Ausubel等人，上述，各自整体引入本文作为参考。
例如，可以使用PB-EF1a载体。载体包含以下核苷酸序列：
Figure BPA0000288251470002531
Figure BPA0000288251470002541
可以将多核苷酸任选地连接至用于在宿主中繁殖的含有选择标记的载体。通常，将质粒或纳米质粒载体引入沉淀物中，例如磷酸钙沉淀物中，或与荷电脂的复合体中。如果载体是病毒，则其可以使用适当的包装细胞系体外包装，且然后转导到宿主细胞中。
DNA插入片段应与适当的启动子可操作地连接。表达构建体将进一步含有用于转录起始、终止的位点，和在转录的区域中，用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选包括在开始处的翻译起始和在待翻译的mRNA的末端适当地定位的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，而UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞表达。
表达载体将优选但任选地包括至少一种选择标记。这种标记包括，例如，但不限于，用于真核细胞培养的氨苄青霉素，zeocin(Sh bla基因)，嘌呤霉素(pac基因)，潮霉素B(hygB基因)，G418/遗传霉素(neo基因)，霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利Nos.5,122,464；5,770,359；5,827,739)，杀稻瘟素(bsd基因)，抗性基因以及用于在大肠杆菌和其他细菌或原核生物中培养的氨苄青霉素，zeocin(Sh bla基因)，嘌呤霉素(pac基因)，潮霉素B(hygB基因)，G418/遗传霉素(neo基因)，卡那霉素，壮观霉素，链霉素，羧苄青霉素，博来霉素，红霉素，多黏菌素B或四环素抗性基因(上述专利特此整体引入作为参考)。用于上述宿主细胞的合适的培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对技术人员将是显而易见的。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知方法实现载体构建体到宿主细胞中的引入。这种方法在本领域中进行了描述，例如Sambrook，上述，第1-4章和第16-18章；Ausubel，上述，第1、9、13、15、16章。
表达载体将优选但任选地包括至少一种选择性细胞表面标记，用于分离被本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的选择性细胞表面标记包括表面蛋白、糖蛋白或蛋白质组，其将细胞或细胞亚群与另一种确定的细胞亚群区别开。优选地，选择性细胞表面标记将通过本公开内容的组合物或方法修饰的那些细胞与未通过本公开内容的组合物或方法修饰的那些细胞区别开。这种细胞表面标记包括，例如，但不限于，“抗原分化簇(cluster of designation)”或“分类决定簇(classification determinant)”蛋白(经常缩写为“CD”)，例如截短或全长形式的CD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52或其任何组合。细胞表面标记进一步包括“自杀”基因标记RQR8(Philip B等人，Blood.2014年8月21日；124(8)：1277-87)。
表达载体将优选但任选地包括至少一种选择性抗药性标记，用于分离被本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的选择性抗药性标记可以包括野生型或突变的Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2或其任何组合。
本公开内容的至少一种蛋白支架可以以修饰的形式表达，例如融合蛋白，并且不仅可以包括分泌信号，而且可以包括额外的异源功能区。例如，可以向蛋白支架的N-末端添加额外的氨基酸特别是荷电氨基酸的区域，以改善在纯化过程中或在后来的处理和贮藏过程中在宿主细胞中的稳定性和持久性。同样地，可以将肽部分添加到本公开内容的蛋白支架中以促进纯化。可以在最终配制蛋白支架或其至少一种片段之前除去这种区域。这种方法在许多标准实验室手册中进行了描述，例如Sambrook，上述，第17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，上述，第16、17和18章。
本领域普通技术人员在可用于表达编码本公开内容的蛋白的核酸的众多表达系统中是知识丰富的。另一方面，可以通过在含有编码本公开内容的蛋白支架的内源DNA的宿主细胞中开动(通过操纵)来在宿主细胞中表达本公开内容的核酸。这种方法在本领域中是众所周知的，例如，如整体引入本文作为参考的美国专利Nos.5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述的。
用于生产蛋白支架、其指定部分或变体的细胞培养物的例证是如本领域所已知的细菌、酵母和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统经常将以细胞的单层形式存在，尽管也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。在本领域中已经开发了许多能够表达完整糖基化蛋白的合适宿主细胞系，并包括COS-1(例如，ATCC CRL 1650)、COS-7(例如，ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如，ATCC CRL-10)、CHO(例如，ATCC CRL 1610)和BSC-1(例如，ATCCCRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，其容易从例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，Manassas，Va.(www.atcc.org)获得。优选的宿主细胞包括淋巴样起源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC检索号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC检索号CRL-1851)。在特别优选的实施方案中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
用于这些细胞的表达载体可以包括一种或多种以下表达控制序列，例如，但不限于，复制起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利Nos.5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利No.5,266,491)、至少一种人启动子；增强子，和/或加工信息位点，例如核糖体结合位点，RNA剪接位点，聚腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag加poly A位点)和转录终止序列。参见，例如，Ausubel等人，上述；Sambrook等人，上述。可用于产生本发明的核酸或蛋白的其他细胞是已知的和/或可获得的，例如，从美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(AmericanType Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas)(www.atcc.org)或其他已知或商业来源获得。
当使用真核宿主细胞时，一般将聚腺苷酸化或转录终止序列并入载体中。终止序列的实例是来自牛生长素基因的聚腺苷酸化序列。还可以包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J.Virol.45：773-781(1983))。另外，如本领域中已知的，可以将控制在宿主细胞中复制的基因序列并入载体中。
氨基酸代码
形成本公开内容的蛋白支架的氨基酸经常是缩写的。可以通过由其单字母代码、其三字母代码、名称或一种或多种三核苷酸密码子表示氨基酸来显示氨基酸名称，如本领域中所众所周知的(参见Alberts，B.等人，Molecular Biology of The Cell，第三版，Garland Publishing，Inc.，New York，1994)。如本文所规定的，本公开内容的蛋白支架可包含一种或多种来自自然突变或人类操作的氨基酸取代、缺失或添加。可以通过本领域已知的方法，例如位点定向诱变或丙氨酸分区诱变法来鉴定本公开内容的蛋白支架中对于功能来说必不可少的氨基酸(例如，Ausubel，上述，第8、15章；Cunningham和Wells，Science244：1081-1085(1989))。后一种方法在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所得到的突变分子的生物活性，例如，但不限于，至少一种中和活性。对蛋白支架结合关键性的位点也可以通过结构分析来鉴定，例如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith等人，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)和de Vos等人，Science 255：306-312(1992))。
如本领域技术人员将理解的，本发明包括至少一种本公开内容的生物活性蛋白支架。生物活性蛋白支架具有的比活性为天然(非合成)、内源或相关和已知蛋白支架的比活性的至少20％、30％或40％，且优选至少50％、60％或70％，且最优选至少80％、90％或95％-99％或更高。测定和定量酶促活性和底物特异性量度的方法是本领域技术人员众所周知的。
在另一方面，本公开内容涉及如本文所述的蛋白支架和片段，其通过有机部分的共价附着进行修饰。这种修饰可以产生具有改善的药物代谢动力学性质(例如，增加的体内血清半衰期)的蛋白支架片段。有机部分可以是线型或支化亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定的实施方案中，亲水聚合物基团可以具有约800至约120,000道尔顿的分子量，并且可以是聚链烷二醇(polyalkane glycol)(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8至约40个碳原子。
从白细胞分离法(Leukapheresis)产物分离T细胞
可以使用封闭式系统和标准方法(例如，COBE Spectra Apheresis System)在临床地点从主体收集白细胞分离法产物或血液。优选地，根据标准医院或规定的白细胞分离法程序在标准白细胞分离法收集袋中收集产物。例如，在本公开内容的方法的优选实施方案中，除了在白细胞分离法过程中通常使用的那些以外不包括额外的抗凝剂或血液添加剂(肝素等)。
另一方面，可以直接从全血分离白细胞(WBC)/外周血单核细胞(PBMC)(使用Biosafe Sepax 2(封闭式/自动(Closed/Automated)))或T细胞(使用
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Prodigy(封闭式/自动(Closed/Automated)))。然而，在某些主体(例如，对于癌症进行诊断和/或治疗的那些)中，当从全血分离时，WBC/PBMC得率可能比当通过白细胞分离法分离时显著更低。
白细胞分离法程序和/或直接细胞分离程序可以用于本公开内容的任何主体。
白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物应包装在保温容器中，并应根据批准供临床规程使用的规定的血液收集程序的标准医院，保持于受控的室温(+19℃到+25℃)。白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物不应冷藏。
在运输过程中，白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的细胞浓度不应超过0.2x109个细胞/mL。应当避免白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的强烈混合。
如果白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物必须贮藏例如过夜，则应将其保持于受控的室温(与上述相同)。在贮藏期间，白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的浓度应永远不超过0.2x109个细胞/mL。
优选地，白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的细胞应贮藏在自体血浆中。在某些实施方案中，如果白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物的细胞浓度高于0.2x109个细胞/mL，则所述产物应用自体血浆稀释。
优选地，当开始标记和分离程序时，白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物应不老于24小时。可以使用封闭式和/或自动系统(例如，CliniMACSProdigy)处理和/或制备白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物，以用于进行细胞标记。
自动系统可以进行额外的血沉棕黄层分离，可能通过菲可化(ficolation)和/或洗涤细胞产物(例如，白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T细胞组合物)。
封闭式和/或自动系统可以用于制备和标记用于T-细胞分离的细胞(来自例如白细胞分离法产物、血液、WBC/PBMC组合物和/或T-细胞组合物)。
尽管WBC/PBMCs可以被直接核转染(这更容易并且节省额外的步骤)，但是本公开内容的方法可以包括在核转染之前首先分离T细胞。直接对PBMC进行核转染的更容易的策略要求通过CAR信号传导介导的CAR+细胞的选择性扩充，其独立地被证明是劣等的扩充方法，所述扩充方法通过使T细胞功能性耗尽而直接降低了产物的体内效率。产物可以是CAR+细胞的异质组合物，包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞或其任何组合，这增加了从一个患者到另一个患者的产物的变异性，并使给药和CRS管理更加困难。由于T细胞被认为是肿瘤抑制和杀伤的主要效应物，所以用于生产自体产物的T细胞分离可能导致比起其他更异质的组合物来显著的益处。
T细胞可以在单向标记程序中通过富集标记的细胞或排除标记的细胞来直接分离，或在两步标记程序中间接分离。根据本公开内容的某些富集策略，可以将T细胞收集在细胞收集袋(Cell Collection Bag)中，并将非标记的细胞(非靶细胞)收集在阴性级分袋(Negative Fraction Bag)中。与本公开内容的富集策略相反，分别将非标记的细胞(靶细胞)收集在细胞收集袋中，并将标记的细胞(非靶细胞)收集在阴性级分袋或非靶细胞袋中。选择试剂可以包括，但不限于，抗体包被的珠。抗体包被的珠可以在修饰和/或扩充步骤之前除去，或者在修饰和/或扩充步骤之前保持在细胞上。细胞标记的以下非限制性实例中的一种或多种可用于分离T-细胞：CD3、CD4、CD8、CD25、抗生物素、CD1c、CD3/CD19、CD3/CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-γ、TCRα/β和/或其任何组合。用于分离T-细胞的方法可以包括一种或多种特异性结合和/或可检测地标记可用于分离T-细胞的细胞标记的以下非限制性实例中的一种或多种的试剂：CD3、CD4、CD8、CD25、抗生物素、CD1c、CD3/CD19、CD3/CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-γ、TCRα/β和/或其任何组合。这些试剂可能是或可能不是“优质生产规范”(“GMP”)级的。试剂可能包括，但不限于Thermo DynaBeads和MiltenyiCliniMACS产品。本公开内容的分离T-细胞的方法可以包括标记和/或分离步骤的多次重复。在本公开内容的分离T-细胞的方法中的任何时刻，可以通过正选择或负选择不需要的细胞和/或不需要的细胞类型来从本公开内容的T细胞产物组合物排除不需要的细胞和/或不需要的细胞类型。本公开内容的T细胞产物组合物可以含有可以表达CD4、CD8和/或一种或多种别的T细胞标记的额外的细胞类型。
本公开内容的用于T细胞核转染的方法可以通过例如在WBC/PBMCs的群体或组合物中的T细胞核转染的过程来消除T细胞分离的步骤，该过程在核转染后包括通过TCR信号传导的分离步骤或选择性扩充步骤。
在T细胞富集和/或分选之前或之后，可以通过正选择或负选择来排除某些细胞群体。可从细胞产物组合物排除的细胞组合物的实例可包括髓样细胞、CD25+调节T细胞(TRegs)、树突细胞、巨噬细胞、红细胞、肥大细胞、γ-δT细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)样细胞(例如细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞)、诱导的天然杀伤(iNK)T细胞、NK T细胞、B细胞或其任何组合。
本公开内容的T细胞产物组合物可以包括CD4+和CD8+ T-细胞。在分离或选择程序期间，可以将CD4+和CD8+ T-细胞分离到单独的收集袋中。CD4+ T细胞和CD8+ T细胞可以分别进行进一步处理，或在以特定比例重构(组合到相同组合物中)后进行处理。
可以重构CD4+ T细胞和CD8+ T细胞所处的特定比例取决于所用扩充技术的类型和功效、细胞培养基和/或用于扩充T-细胞产物组合物的生长条件。可能的CD4+∶CD8+比例的实例包括，但不限于，50％∶50％、60％∶40％、40％∶60％75％∶25％和25％∶75％。
CD8+ T细胞表现了强有力的肿瘤细胞杀伤能力，而CD4+ T细胞提供支持CD8+ T细胞增殖能力和功能所需的许多细胞因子。因为从正常供体分离的T细胞主要是CD4+，所以在体外就CD4+∶CD8+比例而论人工调整T-细胞产品组合物，以对在其他情况下将存在于体内的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比例加以改良。最优化的比例也可用于自体T-细胞产物组合物的先体外后体内扩充。考虑到T-细胞产物组合物的人工调整的CD4+∶CD8+比例，重要的是要注意，本公开内容的产物组合物与任何内源存在的T-细胞群体相比可以显著不同，且提供显著更大的利益。
用于T细胞分离的优选方法可以包括用于产生未受损伤的全T细胞的负选择策略，从而意味着作为结果而产生的T-细胞组合物包括尚未被操作并且含有内源存在的T-细胞变种/比例的T-细胞。
可以用于正选择或负选择的试剂包括，但不限于，磁性细胞分离珠。磁性细胞分离珠可能会或可能不会在进行本公开内容的T-细胞分离方法的下一个步骤前从选择的CD4+T细胞、CD8+ T细胞群体或CD4+和CD8+ T细胞两者的混合群体中去除或耗尽。
可以制备T细胞组合物和T细胞产物组合物用于深低温保藏、在标准T细胞培养基中贮藏和/或遗传修饰。
T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分可以使用对于贮藏和回收具有高回收率、生存力、表型和/或功能能力的人细胞进行最优化的标准深低温保藏方法进行深低温保藏。可以使用可商购获得的深低温保藏介质和/或规程。本公开内容的深低温保藏方法可以包括不含DMSO的深低温保藏剂(cryopreservant)(例如，CryoSOfreeTM不含DMSO的深低温保藏介质)降低与冷冻相关的毒性。
T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分可以贮藏在培养基中。可以对于细胞贮藏、细胞遗传修饰、细胞表型和/或细胞扩充来最优化本公开内容的T细胞培养基。本公开内容的T细胞培养基可以包含一种或多种抗生素。因为在通过核转染进行遗传修饰后，细胞培养基中包含抗生素可能会降低转染效率和/或细胞得率，所以对于在通过核转染进行遗传修饰后最优的转染效率和/或细胞得率可以改变特定的抗生素(或其组合)及一种或多种其各自的浓度。
本公开内容的T细胞培养基可以包含血清，并且此外，对于最优的细胞结果可以改变血清组成和浓度。对于T细胞培养，人AB血清比起FBS/FCS来是优选的，这是因为尽管预期供在本公开内容的T细胞培养基里使用，但FBS/FCS可引入异种蛋白(xeno-proteins)。血清可以从打算对其施用培养物中的T-细胞组合物的主体的血液中分离，因此，本公开内容的T细胞培养基可以包含自体血清。无血清培养基或血清取代物也可用于本公开内容的T-细胞培养基中。在本公开内容的T-细胞培养基和方法的某些实施方案中，无血清培养基或血清取代物可以提供比起用异种血清(xeno-serum)补加培养基来的利益，包括，但不限于，具有更大的生存力、以更高效率核转染、在核转染后表现更大的生存力、显示更期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快地扩充的更健康的细胞。
T细胞培养基可包括可商购获得的细胞生长培养基。示例性的可商购获得的细胞生长培养基包括，但不限于，PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩充SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩充培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩充培养基或其任何组合。
可以制备T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分用于遗传修饰。用于遗传修饰的T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分的制备可包括在期望的核转染缓冲液中的细胞洗涤和/或重悬浮。可将深低温保藏的T-细胞组合物解冻，并制备用于通过核转染进行遗传修饰。可以根据标准或已知规程解冻深低温保藏的细胞。深低温保藏的细胞的解冻和制备可以被最优化以产生具有更大的生存力、以更高效率核转染、在核转染后表现更大的生存力、显示更期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快地扩充的细胞。例如，Grifols Albutein(25％人清蛋白)可用于解冻和/或制备过程。
自体T细胞产物组合物的遗传修饰
T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分可以使用例如核转染策略例如电穿孔进行遗传修饰。可以最优化待核转染的细胞总数目、核转染反应的总体积以及样品制备的精确时间控制，以产生具有更大的生存力、以更高效率核转染、在核转染后表现更大的生存力、显示更期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快地扩充的细胞。
可以使用例如Lonza Amaxa、MaxCyte PulseAgile、Harvard Apparatus BTX和/或Invitrogen Neon来完成核转染和/或电穿孔。包括但不限于塑料聚合物电极的非金属电极系统对于核转染可能是优选的。
在通过核转染进行遗传修饰之前，可以将T细胞组合物、T细胞产物组合物、未刺激的T细胞组合物、静息T细胞组合物或其任何部分重悬浮在核转染缓冲液中。本公开内容的核转染缓冲液包括可商购获得的核转染缓冲液。可以最优化本公开内容的核转染缓冲液以产生具有更大的生存力、以更高效率核转染、在核转染后表现更大的生存力、显示更期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快地扩充的细胞。本公开内容的核转染缓冲液可包括，但不限于，PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa核转染仪(Nucleofector)、人T细胞核转染缓冲液及其任何组合。本公开内容的核转染缓冲液可包含一种或多种补加因子(supplemental factor)，以产生具有更大的生存力、以更高效率核转染、在核转染后表现更大的生存力、显示更期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快地扩充的细胞。示例性补加因子包括，但不限于，重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素及其任何组合。示例性的细胞因子、趋化因子和白细胞介素包括，但不限于，IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12p70、IL-12/IL-35p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP(TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L及其任何组合。示例性补加因子包括，但不限于，盐、矿物质、代谢物或其任何组合。示例性的盐、矿物质和代谢物包括，但不限于，HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清取代物、抗生素、pH调节剂(adjuster)、Earle氏盐(Earle’s Salts)、2-巯基乙醇、人运铁蛋白、重组人胰岛素、人血清清蛋白、核转染仪PLUS添加物(Nucleofector PLUS Supplement)、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露糖醇(Manitol)、琥珀酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚氮丙啶(Polyethylenimine)、聚乙二醇、泊洛沙姆(Poloxamer)188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5和其任何组合。示例性补加因子包括，但不限于，诸如PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTSOpTimizer T细胞扩充SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩充培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩充培养基及其任何组合的培养基。示例性补加因子包括，但不限于，细胞DNA信号感觉(sensing)、代谢、分化、信号转导、凋亡途径及其组合的抑制剂。示例性抑制剂包括，但不限于，TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、胱天蛋白酶1(Caspase1)、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的抑制剂(例如TWS119)，巴弗洛霉素，氯喹，喹吖因，AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK及其任何组合。示例性补加因子包括，但不限于，以增强细胞递送、增强核递送或转运、增强核酸向细胞核内的易化转运、增强染色体外核酸的降解和/或降低DNA-介导的毒性的方式修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。示例性的修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包括，但不限于，pH调节物、DNA结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、具有或不具有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶及其任何组合。
可以在向核转染缓冲液(任选地，包含在核转染反应小瓶或杯中)中添加细胞之前、同时或之后，将包括转座子和转座酶的转座试剂添加到本公开内容的核转染反应中。本公开内容的转座子可包含质粒DNA、纳米质粒、线性化质粒DNA、PCR产物、DOGGYBONETM DNA、mRNA模板、单链或双链DNA、蛋白-核酸组合或其任何组合。本公开内容的转座子可以包含一种或多种编码一个或多个TTAA位点、一种或多种反向末端重复(ITRs)、一种或多种长末端重复序列(LTRs)、一种或多种绝缘子、一种或多种启动子、一种或多种全长或截短的基因、一种或多种polyA信号、一种或多种自切割2A肽切割位点、一种或多种内部核糖体进入位点(IRES)、一种或多种增强子、一种或多种调节子、一种或多种复制起点及其任何组合的序列。
本公开内容的转座子可以包含编码一种或多种全长或截短的基因的一种或多种序列。由本公开内容的转座子引入的一种或多种全长和/或截短的基因可以编码信号肽、Centyrin、单链可变区片段(scFv)、铰链、跨膜结构域、共刺激结构域、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T-细胞受体(CAR-T)、CARTyrin(包含Centyrin的CAR-T)、受体、配体、细胞因子、抗药基因、肿瘤抗原、同种异体或自身抗原、酶、蛋白、肽、多肽、荧光蛋白、突变蛋白或其任何组合中的一种或多种。
本公开内容的转座子可以在水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培养基、本公开内容的补加因子或其任何组合中制备。
本公开内容的转座子可被进行设计以最优化临床安全性和/或改善可制造性。作为非限制性实例，本公开内容的转座子可被进行设计以通过消除不必要的序列或区域和/或包括非抗生素选择标记来最优化临床安全性和/或改善可制造性。本公开内容的转座子可能是或可能不是GMP级的。
本公开内容的转座酶可以由质粒DNA、纳米质粒DNA、mRNA、蛋白、蛋白-核酸组合或其任何组合的一种或多种序列编码。
本公开内容的转座酶可以在水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培养基、本公开内容的补加因子或其任何组合中制备。本公开内容的转座酶或编码或递送它们的序列/构建体可能是或可能不是GMP级的。
本公开内容的转座子和转座酶可以以任何手段递送至细胞。
尽管本公开内容的组合物和方法包括通过质粒DNA(pDNA)或纳米质粒DNA将本公开内容的转座子和/或转座酶递送至细胞，但使用质粒或纳米质粒用于进行递送可能使转座子和/或转座酶整合到细胞的染色体DNA中，这可能导致连续的转座酶表达。因此，本公开内容的转座子和/或转座酶可以作为mRNA或蛋白被递送至细胞，以消除染色体整合的任何可能性。
在将转座子和/或转座酶引入核转染反应中之前，可以将本公开内容的转座子和转座酶单独或相互组合进行预温育。可以最优化转座子和转座酶各自的绝对量，以及相对量，例如，转座子与转座酶的比例。
制备核转染反应后，任选地，在小瓶或杯中，可将反应装载到核转染仪装置中，并根据制造商的规程进行激活以用于递送电脉冲。可以最优化用于将本公开内容的转座子和/或转座酶(或编码本公开内容的转座子和/或转座酶的序列)递送至细胞的电脉冲条件，以产生具有增强的生存力、更高核转染效率、在核转染后更大的生存力、期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快的扩充的细胞。当使用Amaxa核转染仪技术时，预期Amaxa 2B或4D核转染仪的各种核转染程序的每一种。
在本公开内容的核转染反应之后，可以将细胞轻轻地添加到细胞培养基中。例如，当T细胞经历核转染反应时，可以将T细胞添加到T细胞培养基中。本公开内容的核转染后细胞培养基可包括任何一种或多种可商购获得的培养基。可以最优化本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)以产生具有更大的生存力、更高核转染效率、在核转染后表现更大的生存力、显示更期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快地扩充的细胞。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)可以包括PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGroDC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩充SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩充培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩充培养基及其任何组合。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)可以包含一种或多种本公开内容的补加因子，以增强生存力、核转染效率、核转染后的生存力、细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快的扩充。示例性补加因子包括，但不限于，重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素及其任何组合。示例性的细胞因子、趋化因子和白细胞介素包括，但不限于，IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP(TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L及其任何组合。示例性补加因子包括，但不限于，盐、矿物质、代谢物或其任何组合。示例性的盐、矿物质和代谢物包括，但不限于，HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清取代物、抗生素、pH调节剂、Earle氏盐、2-巯基乙醇、人运铁蛋白、重组人胰岛素、人血清清蛋白、核转染仪PLUS添加物、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露糖醇、琥珀酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚氮丙啶、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5和其任何组合。示例性补加因子包括，但不限于，诸如PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩充SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩充培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩充培养基及其任何组合的培养基。示例性补加因子包括，但不限于，细胞DNA信号感觉、代谢、分化、信号转导、凋亡途径及其组合的抑制剂。示例性抑制剂包括，但不限于，TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNApol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、胱天蛋白酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的抑制剂(例如TWS119)，巴弗洛霉素，氯喹，喹吖因，AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK及其任何组合。示例性补加因子包括，但不限于，以增强细胞递送、增强核递送或转运、增强核酸向细胞核内的易化转运、增强染色体外核酸的降解和/或降低DNA-介导的毒性的方式修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。示例性的修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包括，但不限于，pH调节物、DNA结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、具有或不具有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶及其任何组合。
本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)可以于室温使用或预热至例如32℃-37℃(连端点在内)。可将本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)预热至维持或增强细胞生存力和/或本公开内容的转座子或其部分的表达的任何温度。
本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后T细胞培养基)可以包含在组织培养瓶或皿、G-Rex瓶、生物反应器或细胞培养袋或任何其他标准贮器中。本公开内容的核转染后细胞培养物(包括本公开内容的核转染后T细胞培养物)可以保持静止，或者另一方面它们可以被扰动(例如，摇动、回荡或振动)。
核转染后细胞培养物可包含基因修饰细胞。核转染后T细胞培养物可包含基因修饰T细胞。本公开内容的基因修饰细胞可以静息确定的时间段或通过例如添加T细胞扩充剂(Expander)技术来刺激用于扩充。在某些实施方案中，本公开内容的基因修饰细胞可以静息确定的时间段或立即通过例如添加T细胞扩充剂技术来刺激用于扩充。可以使本公开内容的基因修饰细胞静息以向其提供足够的进行顺应的时间、用于发生转座的时间和/或用于进行正选择或负选择的时间，从而结果产生具有增强的生存力、更高核转染效率、在核转染后更大的生存力、期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快的扩充的细胞。本公开内容的基因修饰细胞可以静息例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多小时。在某些实施方案中，本公开内容的基因修饰细胞可以静息例如过夜。在某些方面，过夜是约12小时。本公开内容的基因修饰细胞可以静息例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
本公开内容的基因修饰细胞可以在核转染反应后和添加扩充剂技术之前进行选择。对于基因修饰细胞的最优选择，可以允许细胞在核转染后细胞培养基中静息至少2-14天，以促进修饰的细胞的鉴定(例如，将修饰的细胞与非修饰的细胞区别开)。
在本公开内容的转座子成功进行核转染时，早在核转染后24小时，就可在修饰的T细胞中检测到本公开内容的CAR/CARTyrin和选择标记的表达。由于转座子的染色体外表达，单独选择标记的表达可能不能将修饰的T细胞(已成功整合转座子的那些细胞)与未修饰的T细胞(未成功整合转座子的那些细胞)区别开。当转座子的染色体外表达使通过选择标记对修饰的细胞的检测模糊不清时，核转染的细胞(修饰的和未修饰的细胞)可以静息一段时间(例如2-14天)以允许细胞停止表达或丧失所有染色体外转座子表达。在这个延长的静息时间段后，只有修饰的T细胞对于选择标记的表达应保持阳性。对于每个核转染反应和选择过程，可以最优化这个延长的静息时间段的长度。当转座子的染色体外表达使通过选择标记对修饰的细胞的检测模糊不清时，可以在没有这个延长的静息时间段的情况下进行选择，然而，可以在较后的时间点(例如，在扩充阶段期间或之后)包括额外的选择步骤。
本公开内容的基因修饰细胞的选择可以通过任何手段进行。在本公开内容的方法的某些实施方案中，可以通过分离表达特定选择标记的细胞来进行本公开内容的基因修饰细胞的选择。本公开内容的选择标记可以由转座子中的一种或多种序列编码。作为成功转座的结果，可以由修饰的细胞表达本公开内容的选择标记(即，不是由转座子中的一种或多种序列序列编码)。在某些实施方案中，本公开内容的基因修饰细胞包含赋予对核转染后细胞培养基的有害化合物的抗性的选择标记。有害化合物可包括，例如，抗生素或药物，其在没有由选择标记赋予修饰细胞的抗性的情况下将导致细胞死亡。示例性选择标记包括，但不限于，一种或多种以下基因的野生型(WT)或突变形式：neo、DHFR、TYMS、ALDH、MDR1、MGMT、FANCF、RAD51C、GCS和NKX2.2。示例性选择标记包括，但不限于，表面表达的选择标记或表面表达的标签，可以分别通过Ab-包被的磁珠技术或柱选择来靶向。可将诸如在蛋白纯化中使用的那些的可切割标签添加至本公开内容的选择标记，以用于有效的柱选择、洗涤和洗脱。在某些实施方案中，本公开内容的选择标记不是由修饰的细胞(包括修饰的T细胞)内源表达的，且因此可能在物理分离修饰的细胞中有用(通过例如细胞分选技术)。示例性的不由修饰的细胞(包括修饰的T细胞)内源表达的本公开内容的选择标记包括，但不限于，全长、突变或截短形式的CD271、CD19 CD52、CD34、RQR8、CD22、CD20、CD33及其任何组合。
本公开内容的基因修饰细胞可在核转染反应后选择性扩充。在某些实施方案中，包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞可通过CAR/CARTyrin刺激选择性扩充。可以通过与靶覆盖的试剂(例如表达靶的肿瘤系或正常细胞系或覆盖满靶的扩充剂珠)接触来刺激包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞。另一方面，可以通过与照射的肿瘤细胞、照射的同种异体正常细胞、照射的自体PBMC接触来刺激包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞。为了使本公开内容的细胞产物组合物被用于刺激的表达靶的细胞的污染减至最小，例如，当可以将细胞产物组合物直接施用于主体时，可以使用包被有CAR/CARTyrin靶蛋白的扩充剂珠进行刺激。可以最优化通过CAR/CARTyrin刺激的包含CAR/CARTyrin的修饰的T细胞的选择性扩充，以避免功能上耗尽修饰的T-细胞。
本公开内容的选择的基因修饰细胞可以深低温保藏、静息确定的时间段或通过添加细胞扩充剂技术来刺激用于扩充。本公开内容的选择的基因修饰细胞可以深低温保藏、静息确定的时间段或立即通过添加细胞扩充剂技术来刺激用于扩充。当选择的基因修饰细胞是T细胞时，可以通过添加T-细胞扩充剂技术来刺激T细胞用于扩充。本公开内容的选择的基因修饰细胞可以静息例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多小时。在某些实施方案中，本公开内容的选择的基因修饰细胞可以静息例如过夜。在某些方面，过夜是约12小时。本公开内容的选择的基因修饰细胞可以静息例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。可以使本公开内容的选择的基因修饰细胞静息结果产生具有增强的生存力、更高核转染效率、在核转染后更大的生存力、期望的细胞表型和/或在添加扩充技术时更大/更快的扩充的细胞的任何时间段。
选择的基因修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因修饰T细胞)可以使用任何标准深低温保藏方法进行深低温保藏，所述标准深低温保藏方法可以对于贮藏和/或回收具有高回收率、生存力、表型和/或功能能力的人细胞进行进行最优化。本公开内容的深低温保藏方法可以包括可商购获得的深低温保藏介质和/或规程。
可以通过任何手段评估选择的基因修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因修饰T细胞)的转座效率。例如，在应用扩充剂技术之前，可以通过荧光激活细胞分选术(FACS)来测量选择的基因修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因修饰T细胞)对转座子的表达。确定选择的基因修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因修饰T细胞)的转座效率可以包括确定表达转座子(例如CAR)的选择的细胞的百分比。另一方面或此外，可以通过任何手段评估T细胞的纯度、转座子表达(例如CAR表达)的平均荧光强度(MFI)、CAR(在转座子中递送的)介导表达CAR配体的靶细胞脱粒和/或杀伤的能力和/或选择的基因修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因修饰T细胞)的表型。
在满足某些交付(release)标准时，本公开内容的细胞产物组合物可以被交付用于施用于主体。示例性交付标准可以包括，但不限于，特定百分比的在细胞表面表达可检测水平的CAR的修饰的、选择的和/或扩充的T细胞。
自体T细胞产物组合物的遗传修饰
本公开内容的基因修饰细胞(包括基因修饰T细胞)可以使用扩充剂技术进行扩充。本公开内容的扩充剂技术可以包括可商购获得的扩充剂技术。示例性的本公开内容的扩充剂技术包括通过TCR刺激本公开内容的基因修饰T细胞。尽管预期用于刺激本公开内容的基因修饰T细胞的所有手段，但通过TCR刺激本公开内容的基因修饰T细胞是优选的方法，从而产生具有优越杀伤能力水平的产品。
为了通过TCR刺激本公开内容的基因修饰T细胞，可以以3∶1的珠与T细胞比使用Thermo Expander DynaBeads。如果扩充剂珠不是生物可降解的，则可以从扩充剂组合物中除去珠。例如，可以在约5天后从扩充剂组合物中除去珠。为了通过TCR刺激本公开内容的基因修饰T细胞，可以使用Miltenyi T细胞激活/扩充试剂(Miltenyi T Cell Activation/Expansion Reagent)。为了经由TCR刺激本公开内容的基因修饰T细胞，可以使用StemCellTechnologies的ImmunoCult人CD3/CD28或CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂试剂。这个技术可能是优选的，这是因为可溶的四聚体抗体复合体将在一段时间后降解，并且将不需要从工艺中除去。
人工抗原呈递细胞(APCs)可以被改造以共表达靶抗原，并且可以用于通过本公开内容的TCR和/或CAR来刺激本公开内容的细胞或T-细胞。人工APCs可包含或可衍生自肿瘤细胞系(包括，例如，无限增殖化的髓细胞性白血病系K562)，并可进行改造以共表达多种共刺激分子或技术(例如CD28、4-1BBL、CD64、mbIL-21、mbIL-15、CAR靶分子等)。当本公开内容的人工APCs与共刺激分子组合时，可以最优化条件以预防不期望的表型和功能能力即终末分化的效应T细胞的发展或出现。
照射的PBMCs(自身或同种异体)可以表达一些靶抗原，例如CD19，并且可以用于通过本公开内容的TCR和/或CAR来刺激本公开内容的细胞或T-细胞。另一方面或此外，照射的肿瘤细胞可以表达一些靶抗原，并且可以用于通过本公开内容的TCR和/或CAR来刺激本公开内容的细胞或T-细胞。
板结合的和/或可溶的抗-CD3、抗-CD2和/或抗-CD28刺激可以用于通过本公开内容的TCR和/或CAR来刺激本公开内容的细胞或T-细胞。
抗原包被的珠可以展示靶蛋白，并且可以用于通过本公开内容的TCR和/或CAR来刺激本公开内容的细胞或T-细胞。另一方面或此外，用CAR/CARTyrin靶蛋白包被的扩充剂珠可以用于通过本公开内容的TCR和/或CAR来刺激本公开内容的细胞或T-细胞。
扩充方法被引导通过TCR或CAR/CARTyrin并通过基因修饰T细胞上表面表达的CD2、CD3、CD28、4-1BB和/或其他标记刺激本公开内容的细胞或T-细胞。
可以在核转染后立即将扩充技术应用于本公开内容的细胞，直到核转染后约24小时为止。尽管在扩充程序过程中可以使用各种细胞培养基，但是本公开内容的期望的T细胞扩充培养基可以产生具有例如更高的生存力、细胞表型、总扩充或更高的用于体内持久性、移入和/或CAR-介导的杀伤的能力的细胞。可以最优化本公开内容的细胞培养基以改善/增强本公开内容的基因修饰细胞的扩充、表型和功能。扩充的T细胞的优选表型可以包括T干细胞记忆、T中央和T效应记忆细胞的混合物。扩充剂Dynabeads可能主要产生可能导致在临床上优越表现的中央记忆T细胞。
本公开内容的示例性T细胞扩充培养基可以部分或全部包括PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩充SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩充培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩充培养基或其任何组合。本公开内容的T细胞扩充培养基可进一步包含一种或多种补加因子。可以包含在本公开内容的T细胞扩充培养基中的补加因子增强生存力、细胞表型、总扩充或增加用于体内持久性、移入和/或CAR-介导的杀伤的能力。可以包含在本公开内容的T细胞扩充培养基中的补加因子包括，但不限于，重组人细胞因子、趋化因子和/或白细胞介素，例如，IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP(TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。可以包含在本公开内容的T细胞扩充培养基中的补加因子包括，但不限于，盐、矿物质和/或代谢物，例如，HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清取代物、抗生素、pH调节剂、Earle氏盐、2-巯基乙醇、人运铁蛋白、重组人胰岛素、人血清清蛋白、核转染仪PLUS添加物、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露糖醇、琥珀酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚氮丙啶、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、Crown-5或其任何组合。可以包含在本公开内容的T细胞扩充培养基中的补加因子包括，但不限于，细胞DNA信号感觉、代谢、分化、信号转导和/或凋亡途径的抑制剂，例如，TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、胱天蛋白酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的抑制剂(例如TWS119)，巴弗洛霉素，氯喹，喹吖因，AC-YVAD-CMK、z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。
可以包含在本公开内容的T细胞扩充培养基中的补加因子包括，但不限于，以增强细胞递送、增强核递送或转运、增强核酸向细胞核内的易化转运、增强染色体外核酸的降解和/或降低DNA-介导的毒性的方式修饰或稳定核酸的试剂，例如，pH调节物、DNA结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、具有或不具有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
可以在扩充过程期间通过使用选择性药物或化合物来选择本公开内容的基因修饰细胞。例如，在某些实施方案中，当本公开内容的转座子可以编码赋予基因修饰细胞对添加到培养基的药物的抗性的选择标记时，选择可以在扩充过程期间发生并且可能需要约1-14天培养用于发生选择。可以用作由本公开内容的转座子编码的选择标记的抗药基因的实例包括，但不限于，基因neo、DHFR、TYMS、ALDH、MDR1、MGMT、FANCF、RAD51C、GCS、NKX2.2或其任何组合的野生型(WT)或突变形式。选择标记可赋予其抗性的可以添加至培养基中的相应药物或化合物的实例包括，但不限于，G418、嘌呤霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、氨甲蝶呤、马法兰(Mephalan)、替莫唑胺、长春新碱、依托泊苷、阿霉素、宾达氮芥、氟达拉滨、阿可达(帕米膦酸钠)、卡氮芥(卡莫司汀)、BiCNU(卡莫司汀)、硼替佐米(Bortezomib)、卡非佐米(Carfilzomib)、亚硝脲氮芥(卡莫司汀)、卡莫司汀、环磷氮芥(环磷酰胺)、环磷酰胺、安道生(环磷酰胺)、达雷木单抗(Daratumumab)、Darzalex(达雷木单抗)、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、Empliciti(埃罗妥珠单抗)、Evacet(盐酸阿霉素脂质体)、Farydak(帕比司他(Panobinostat))、柠檬酸艾沙佐米(Ixazomib Citrate)、Kyprolis(卡非佐米)、来那度胺(Lenalidomide)、LipoDox(盐酸阿霉素脂质体)、Mozobil(普乐沙福(Plerixafor))、Neosar(环磷酰胺)、Ninlaro(柠檬酸艾沙佐米)、帕米膦酸钠、帕比司他、普乐沙福、泊马度胺(Pomalidomide)、Pomalyst(泊马度胺)、Revlimid(来那度胺)、Synovir(沙立度胺)、沙立度胺、酞胺哌啶酮(沙立度胺)、Velcade(硼替佐米)、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、Zometa(唑来膦酸)或其任何组合。
本公开内容的T细胞扩充过程可以在WAVE生物反应器、G-Rex瓶中或在任何其他合适的容器和/或反应器中在细胞培养袋中发生。
本公开内容的细胞或T-细胞培养物可以保持稳定、摇动、回荡或振动。
本公开内容的细胞或T-细胞扩充过程可以最优化某些条件，包括，但不限于，培养持续时间、细胞浓度、T细胞培养基添加/去除的时间表、细胞大小、总细胞数目、细胞表型、细胞群体的纯度、基因修饰细胞在生长中的细胞群体中的百分比、添加物的使用和组成、扩充剂技术的添加/去除或其任何组合。
在配制作为结果而产生的扩充的细胞群体之前，可以继续本公开内容的细胞或T-细胞扩充过程，直到预定终点为止。例如，本公开内容的细胞或T-细胞扩充过程可以继续预定的时间量：至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周；至少1、2、3、4、5、6个月或至少1年。本公开内容的细胞或T-细胞扩充过程可以继续，直到作为结果而产生的培养物达到预定的总细胞密度为止：每体积(μl、ml、L)1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010个细胞或其间任何密度。本公开内容的细胞或T-细胞扩充过程可以继续，直到作为结果而产生的培养物的基因修饰细胞显示本公开内容的转座子的预定水平的表达为止：1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或其间任何百分比的阈值表达水平(表明作为结果而产生的基因修饰细胞在临床上有效的最低、最高或平均表达水平)。本公开内容的细胞或T-细胞扩充过程可以继续，直到作为结果而产生的培养物的基因修饰细胞与未修饰的细胞部分的比例达到预定阈值为止：至少1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、2∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1 10∶1或其间的任何比例。
用于交付的基因修饰自体T细胞的分析
可以在本公开内容的扩充过程期间或之后评估基因修饰细胞的百分比。可以通过荧光激活细胞分选术(FACS)来测量本公开内容的基因修饰细胞对转座子的细胞表达。例如，FACS可用于确定表达本公开内容的CAR的细胞或T细胞的百分比。另一方面或此外，可以评估基因修饰细胞或T细胞的纯度、由本公开内容的基因修饰细胞或T细胞表达的CAR的平均荧光强度(MFI)、CAR介导表达CAR配体的靶细胞脱粒和/或杀伤的能力和/或CAR+ T细胞的表型。
预定给主体施用的本公开内容的组合物可能需要满足一个或多个“交付标准”，所述“交付标准”表明所述组合物对于配制成药物产品和/或施用给主体是安全和有效的。交付标准可包括要求本公开内容的组合物(例如本公开内容的T-细胞产物)包含特定百分比的在其细胞表面上表达可检测水平的本公开内容的CAR的T细胞。
扩充过程应该继续，直到已满足特定标准为止(例如，达到一定的总细胞数目、达到特定的记忆细胞群体、达到特定大小的群体)。
一定标准发信号通知扩充过程应终止的点。例如，一旦细胞达到300fL的细胞大小，就应该对其进行配制、再活化或深低温保藏(否则，达到这个阈值以上大小的细胞可能开始死亡)。一旦细胞群体达到小于300fL的平均细胞大小就立即进行的深低温保藏在解冻和培养时可产生更好的细胞回收，这是因为细胞在深低温保藏之前尚未达到完全静止的状态(完全静止的大小为约180fL)。在扩充之前，本公开内容的T细胞可具有约180fL的细胞大小，但是在扩充后3天时可将其细胞大小成为不止四倍至约900fL。在接下来的6-12天期间，T-细胞群体将慢慢减小细胞大小至在180fL时的完全静止。
用于使细胞群体为配制作好准备的方法可包括，但不限于，以下步骤：浓缩细胞群体的细胞，洗涤细胞，和/或通过抗药性或针对特定的表面表达的标记的磁珠分选进一步选择细胞。用于使细胞群体为配制作好准备的方法可以进一步包括分选步骤，以确保最终产品的安全性和纯度。例如，如果来自患者的肿瘤细胞已被用于刺激本公开内容的基因修饰T细胞或已经被基因修饰以刺激正在为配制作好准备的本公开内容的基因修饰T细胞，关键的是最终产品中不包含来自患者的肿瘤细胞。
细胞产物输注和/或深低温保藏用于输注
本公开内容的药物制剂可以被分配到用于输注、深低温保藏和/或贮藏的袋中。
可以使用标准规程和任选地可输注的深低温保藏介质将本公开内容的药物制剂深低温保藏。例如，不含DMSO的深低温保藏剂(例如，CryoSOfreeTM不含DMSO的深低温保藏介质)可用于降低与冷冻相关的毒性。本公开内容的深低温保藏的药物制剂可以被贮藏以用于在较后的日期输注给患者。有效的治疗可能需要多次施用本公开内容的药物制剂，且因此，药物制剂可以以可以冷冻贮藏但被分开以用于解冻各个剂量的预先等分的“剂量”包装。
本公开内容的药物制剂可以于室温贮藏。有效的治疗可能需要多次施用本公开内容的药物制剂，且因此，药物制剂可以以可以一起贮藏但被分开以用于施用各个剂量的预先等分的“剂量”包装。
本公开内容的药物制剂可以被归档用于随后的再扩充和/或选择，以用于给在同种异体疗法的情况下的相同患者产生额外的剂量，所述患者可能需要在例如状况缓和复发后的将来的日期的施用。
制剂
如上文所指出的，本公开内容提供了稳定的制剂，其优选包含具有盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液，以及保存的溶液，和含有防腐剂的制剂以及适合于药物或兽医用途的多种用途保存的制剂，包含在药学上可接受的制剂中的至少一种蛋白支架。保存的制剂含有至少一种已知的防腐剂或任选选自至少一种酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯代丁醇、氯化镁(例如，六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，聚合物，或它们在水性稀释剂中的混合物。如本领域中已知的，可以使用任何合适的浓度或混合物，例如约0.0015％，或其中的任何范围、值或分数。非限制性实例包括，无防腐剂、约0.1-2％间甲酚(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、约0.1-3％苄醇(例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、约0.001-0.5％硫柳汞(例如，0.005、0.01)、约0.001-2.0％酚(例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、一种或多种0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上文所指出的，本发明提供了一种制品，其包括包装材料和至少一个小瓶，所述小瓶包含具有规定的缓冲液和/或防腐剂的至少一种蛋白支架的溶液，任选地在水性稀释剂中，其中所述包装材料包括表明这种溶液可以在1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长时间段期间保存的标签。本发明进一步包含一种制品，其包括包装材料，包含冻干的至少一种蛋白支架的第一小瓶和包含规定的缓冲液或防腐剂的水性稀释剂的第二小瓶，其中所述包装材料包括标签，所述标签指示患者在水性稀释剂中重构所述至少一种蛋白支架以形成溶液，所述溶液可以在二十四小时或更长时间段期间保存。
如本文所述或如本领域所已知的，根据本发明使用的至少一种蛋白支架可以通过重组手段产生，包括从哺乳动物细胞或转基因制剂产生，或者可以从其他生物来源纯化。
本发明产品中至少一种蛋白支架的范围包括在重构时(如果在湿/干系统中)产生约1.0μg/ml至约1000mg/ml的浓度的量，尽管更低和更高的浓度是切实可行的并且取决于预期的递送载体，例如，溶液制剂将不同于经皮贴剂(patch)、肺、跨黏膜或渗透或微量泵方法。
优选地，水性稀释剂任选地进一步包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括选自酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞的那些或其混合物。制剂中使用的防腐剂的浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。这种浓度取决于所选择的防腐剂，并且是本领域技术人员容易确定的。
其他赋形剂，例如，等渗性试剂、缓冲液、抗氧化剂和防腐增强剂(enhancer)可以任选地和优选地添加至稀释剂中。等渗性试剂，例如甘油，通常于已知浓度使用。优选添加生理耐受的缓冲液以提供改善的pH控制。所述制剂可以包含宽范围的pHs，例如约pH 4至约pH 10，和约pH 5至约pH 9的优选范围，和约6.0至约8.0的最优选范围。优选地，本发明的制剂具有约6.8至约7.8的pH。优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，最优选磷酸钠，特别是磷酸缓冲盐水(PBS)。
其他添加剂，例如药学上可接受的加溶剂，例如吐温20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、吐温80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188，
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polyls，其他嵌段共聚物，和螯合剂(例如EDTA和EGTA)可以任选地添加到制剂或组合物中以减少聚集。如果使用泵或塑料容器来施用制剂，则这些添加剂特别有用。药学上可接受的表面活性剂的存在减轻了蛋白质聚集的倾向。
本发明的制剂可以通过包括将至少一种蛋白支架和选自酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞的防腐剂或它们在水性稀释剂中的混合物混合的方法制备。使用常规的溶解和混合程序进行至少一种蛋白支架和防腐剂在水性稀释剂中的混合。为了制备合适的制剂，例如，将在缓冲的溶液中的测量量的至少一种蛋白支架与在缓冲的溶液中的所期望的防腐剂以足以提供所期望的浓度的蛋白和防腐剂的量组合。本领域普通技术人员将认识到这种方法的变化形式。例如，组分的添加顺序、是否使用额外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可以对于所使用的浓度和施用方式进行最优化的因素。
所请求保护的制剂可以作为透明溶液或作为双重小瓶提供给患者，所述双重小瓶包括用第二小瓶重构的冻干的至少一种蛋白支架的小瓶，所述第二小瓶含有在水性稀释剂中的水、防腐剂和/或赋形剂，优选磷酸盐缓冲液和/或盐水和选择的盐。单溶液小瓶或需要重构的双重小瓶都可以多次重复使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，且因此可以提供比目前可用的更方便的治疗方案。
本发明请求保护的制品可用于在从立即一直到24小时或更长时间段期间施用。因此，本发明请求保护的制品为患者提供了显著的优点。本发明的制剂可以任选地安全地于约2℃至约40℃的温度贮藏，并保持蛋白的生物活性达延长的时间段，从而允许指示可以在6、12、18、24、36、48、72或96个小时或更长时间段期间保存和/或使用溶液的包装标签。如果使用了保存的稀释剂，则这种标签可以包括最多到1-12个月、半年、一年半和/或两年的使用。
本发明的至少一种蛋白支架的溶液可以通过包括将至少一种蛋白支架在水性稀释剂中混合的方法来制备。使用常规的溶解和混合程序进行混合。为了制备合适的稀释剂，例如，将在水或缓冲液中的测量量的至少一种蛋白支架以足以提供所期望的浓度的蛋白和任选防腐剂或缓冲液的量组合。本领域普通技术人员将认识到这种方法的变化形式。例如，组分的添加顺序、是否使用额外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可以对于所使用的浓度和施用方式进行最优化的因素。
所请求保护的产品可以作为透明溶液或作为双重小瓶提供给患者，所述双重小瓶包括用含有水性稀释剂的第二小瓶重构的冻干的至少一种蛋白支架的小瓶。单溶液小瓶或需要重构的双重小瓶都可以多次重复使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，且因此提供比目前可用的更方便的治疗方案。
可以通过向药房、诊所或其他这种公共设施和机构提供透明溶液或包括用含有水性稀释剂的第二小瓶重构的冻干的至少一种蛋白支架的小瓶的双重小瓶来间接地向患者提供所请求保护的产品。在这种情况下，透明溶液可以最多到一升或甚至更大的大小，从而提供大的储存器，从中可以一次或多次提取所述至少一种蛋白支架溶液的较小部分用于转移到较小的小瓶中，并由药房或诊所提供给其顾客和/或患者。
公认的包括单小瓶系统的设备包括用于递送溶液的笔式注射器(pen-injector)设备，例如BD Pens，BD
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和
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Genotronorm
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Humatro
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Roferon
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J-tipNeedle-Free
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例如，如由Becton Dickinson(Franklin Lakes，N.J.，www.bectondickenson.com)，Disetronic(Burgdorf，瑞士，www.disetronic.com；Bioject，Portland，Oreg.(www.bioject.com)；National MedicalProducts，Weston Medical(Peterborough，UK，www.weston-medical.com)，Medi-JectCorp(Minneapolis，Minn.，www.mediject.com)制造或开发的，以及类似的合适设备。公认的包括双重小瓶系统的设备包括用于在用于递送重构的溶液的药筒中重构冻干的药物的那些笔式注射器系统，例如
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其他合适的设备的实例包括预装填的注射器、自动注射器、无针注射器和无针IV输注器具。
本发明请求保护的产品包括包装材料。除了管理机构要求的信息以外，包装材料还提供了可以使用产品的条件。本发明的包装材料向患者提供了对于两小瓶湿/干产品在水性稀释剂中重构至少一种蛋白支架以形成溶液并且在2-24小时或更长时间段期间使用所述溶液的说明书。对于单小瓶溶液产品，标签表明这种溶液可以在2-24小时或更长时间段期间使用。本发明请求保护的产品可用于人药物产品用途。
本发明的制剂可以通过包括将至少一种蛋白支架和选择的缓冲液，优选地，含有盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液混合的方法制备。使用常规的溶解和混合程序进行至少一种蛋白支架和缓冲液在水性稀释剂中的混合。为了制备合适的制剂，例如，将在水或缓冲液中的测量量的至少一种蛋白支架与在水中的所期望的缓冲剂以足以提供所期望的浓度的蛋白和缓冲液的量组合。本领域普通技术人员将认识到这种方法的变化形式。例如，组分的添加顺序、是否使用额外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可以对于所使用的浓度和施用方式进行最优化的因素。
所请求保护的稳定或保存的制剂可以作为透明溶液或作为双重小瓶提供给患者，所述双重小瓶包括用第二小瓶重构的冻干的蛋白支架的小瓶，所述第二小瓶含有在水性稀释剂中的防腐剂或缓冲液和赋形剂。单溶液小瓶或需要重构的双重小瓶都可以多次重复使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，且因此提供比目前可用的更方便的治疗方案。
稳定蛋白支架的其他制剂或方法可以结果产生除包含蛋白支架的冻干粉末的透明溶液以外的。在非透明溶液中有包含颗粒悬浮液的制剂，所述颗粒是具有可变尺寸的结构并被不同地称为小球体、微粒、纳米颗粒、纳米球(nanosphere)或脂质体的含有蛋白支架的组合物。可以通过使含有活性剂和聚合物的水相与非水相接触继之以蒸发非水相以引起颗粒从水相中聚结来形成这种含有活性剂的相对同质的、基本上球形的颗粒制剂，如在美国专利No.4,589,330中所教导的。多孔微粒可以使用含有分散在连续溶剂中的活性剂和聚合物的第一相并通过冷冻干燥或稀释-提取-沉淀从悬浮液中除去所述溶剂来制备，如美国专利No.4,818,542中所教导的。用于这种制剂的优选聚合物是选自下述的天然或合成共聚物或聚合物：明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、清蛋白、胶原、聚乙醇酸(polyglycolicacid)、聚乳酸(polylactic aced)、乙交酯-L(-)丙交酯聚ε-己内酯、聚(ε-己内酯-CO-乳酸)、聚(ε-己内酯-CO-乙醇酸)、聚β-羟基丁酸、聚环氧乙烷、聚乙烯、聚烷基-2-氰基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚2-羟乙基DL-天冬酰胺、聚酯脲、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/1，6-二异氰酸己烷)(poly(L-phenylalanine/ethyleneglycol/1，6-diisocyanatohexane))和聚甲基丙烯酸甲酯。特别优选的聚合物是聚酯，例如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚ε-己内酯、聚(ε-己内酯-CO-乳酸)和聚(ε-己内酯-CO-乙醇酸。可用于溶解聚合物和/或活性物质(active)的溶剂包括：水、六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、己烷、苯或六氟丙酮倍半水合物(sesquihydrate)。将含有活性物质的相用第二相分散的过程可包括强制所述第一相通过喷嘴中的小孔以影响液滴形成的压力。
干燥粉末制剂可以由除冻干以外的方法产生，例如通过喷雾干燥或通过蒸发或通过结晶组合物的沉淀继之以一个或多个步骤以除去水性或非水性溶剂的溶剂萃取。喷雾干燥的蛋白支架制剂的制备在美国专利No.6,019,968中教导。基于蛋白支架的干燥粉末组合物可以通过在提供可以呼吸的干燥粉末的条件下，在溶剂中喷雾干燥蛋白支架和任选地赋形剂的溶液或浆液来生产。溶剂可以包括可能容易干燥的极性化合物，例如水和乙醇。可以通过在没有氧的情况下进行喷雾干燥程序来增强蛋白支架稳定性，例如在氮气层下或通过使用氮作为干燥气体。另一种相对干燥的制剂是分散在悬浮介质中的许多有孔微观结构的分散体，所述悬浮介质一般包含氢氟代烷(hydrofluoroalkane)推进剂，如WO 9916419中所教导的。可以使用计量剂量吸入器将稳定的分散体施用于患者的肺。可用于商业生产喷雾干燥的药物的设备由Buchi Ltd.或Niro Corp.制造。
本文所述的稳定或保存的制剂或溶液中的至少一种蛋白支架可以通过多种递送方法根据本发明施用于患者，包括SC或IM注射；经皮、肺、跨黏膜、植入、渗透泵、药筒、微量泵或本领域技术人员知道的其他方式，如本领域中众所周知的。
治疗应用
本发明还提供了使用本发明的至少一种蛋白支架调节或治疗如本领域中所已知或如本文所述的细胞、组织、器官、动物或患者中的疾病的方法，例如，将治疗有效量的蛋白支架施用于所述细胞、组织、器官、动物或患者或使所述细胞、组织、器官、动物或患者与治疗有效量的蛋白支架接触。本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的疾病的方法。
本发明的任何方法可包括将有效量的包含至少一种蛋白支架的组合物或药物组合物施用于需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。这种方法可以任选地进一步包括用于治疗这种疾病或病症的同时施用(co-administration)或联合治疗，其中所述至少一种蛋白支架、其指定部分或变体的施用进一步包括在之前、同时和/或之后施用选自至少一种烷化剂、有丝分裂抑制剂和放射性药物的至少一种。合适的剂量是本领域众所周知的。参见，例如，Wells等人，编辑，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appletonand Lange，Stamford，Conn.(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon PocketPharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，Calif.(2000)；Nursing 2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，Pa.，2001；Health Professional′s Drug Guide 2001，ed.，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，N.J.，所述参考文献各自整体引入本文作为参考。
优选的剂量可以任选地包括约0.1-99和/或100-500mg/kg/施用，或其任何范围、值或分数，或达到每次单次或多次施用的约0.1-5000μg/ml血清浓度的血清浓度，或其任何范围、值或分数。本发明的蛋白支架的优选剂量范围是从约1mg/kg患者体重最多到约3、约6或约12mg/kg患者体重。
另一方面，施用的剂量可以取决于已知因素而变，例如特定试剂的药物动力学特征及其施用方式和途径；接受者的年龄、健康状况和重量；症状的特性和程度，同时治疗的种类，治疗的频率，和所期望的效果。通常活性成分的剂量可以是每千克体重约0.1至100毫克。通常每次施用或持续释放形式的每千克0.1至50且优选0.1至10毫克对于获得期望的结果是有效的。
作为非限制性实例，可以在第1-40天的至少一天，或，另一方面或另外，第1-52周的至少一周，或，另一方面或另外，1-20年的至少一年，或其任何组合，使用单一，输注或重复的剂量，作为每天约0.1至100mg/kg或其任何范围、值或分数的本发明的至少一种蛋白支架的一次或周期性剂量提供人或动物的治疗。
适合于内部施用的剂量形式(组合物)通常每单位或容器包含约0.001毫克至约500毫克活性成分。在这些药物组合物中，活性成分通常将以基于组合物的总重量约0.5-99.999重量％的量存在。
对于肠胃外施用，可以将蛋白支架与药学上可接受的肠胃外载体结合配制为溶液、悬浮液、乳剂、颗粒、粉末或冻干的粉末或单独提供。这种载体的实例是水、盐水、林格液、葡萄糖溶液和约1-10％的人血清清蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定油。载体或冻干的粉剂可以含有保持等渗性(例如，氯化钠、甘露糖醇)和化学稳定性(例如，缓冲液和防腐剂)的添加剂。通过已知或合适的技术对制剂进行灭菌。
合适的药物载体在最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences，A.Osol(这个领域的标准参考教科书)中描述。
备择的施用
可以根据本发明使用许多已知的和改进的方式用于施用根据本发明的药学有效量的至少一种蛋白支架。尽管在下面的描述中使用肺施用，但是可以在有合适的结果的情况下根据本发明使用其他施用方式。本发明的蛋白支架可以使用适合于通过吸入或本文所述或本领域已知的其他方式施用的多种设备和方法中的任何一种，在载体中，作为溶液、乳剂、胶体或悬浮液，或作为干燥粉末递送。
肠胃外制剂和施用
用于肠胃外施用的制剂的可以含有无菌水或盐水，聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇，植物起源的油，氢化萘等作为常见的赋形剂。可以根据已知方法通过使用适当的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备用于注射的水性或油性悬浮液。用于注射的试剂可以是无毒性的，非口服的稀释剂，例如在溶剂中的水性溶液，无菌可注射溶液或悬浮液。作为可用的载体或溶剂，水、林格液、等渗盐水等是允许的；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可以使用无菌的不挥发性油。为了这些目的，可以使用任何种类的不挥发性油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的单酰或二酰或三酰甘油。肠胃外施用是本领域已知的，且包括，但不限于，常规注射方式，如美国专利No.5,851,198中所述的气体加压无针注射设备和如整体引入本文作为参考的美国专利No.5,839,446中所述的激光穿孔器设备。
备择的递送
本发明进一步涉及通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内(intrarticular)、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内(intralesional)、快速灌注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内或经皮方式施用至少一种蛋白支架。可以制备至少一种蛋白支架组合物以用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其他施用，特别是以液体溶液或悬浮液的形式；用于阴道或直肠施用，特别是以半固体形式，例如，但不限于，乳膏和栓剂；用于口腔含化或舌下施用，例如，但不限于，以片剂或胶囊形式；或鼻内，例如，但不限于粉末、滴鼻剂或气溶胶或某些试剂的形式；或经皮地，例如但不限于凝胶、软膏，洗剂、悬浮液或贴剂输送系统，其具有化学增强剂(例如二甲基亚砜)来修饰皮肤结构或增加经皮贴剂中的药物浓度(Junginger等人在“Drug Permeation Enhancement；”中Hsieh，D.S.，编辑，第59-90页(Marcel Dekker，Inc.New York 1994，整体引入本文作为参考)，或具有使得能够将含有蛋白和肽的制剂应用到皮肤上的氧化剂(WO 98/53847)，或电场的应用来产生瞬时转运途径，例如电穿孔，或增加荷电药物通过皮肤的迁移率，例如离子电渗疗法，或超声波的应用，例如超声导入(sonophoresis)(美国专利Nos.4,309,989和4,767,402)(上述出版物和专利整体引入本文作为参考)。
作为过继细胞治疗的修饰细胞的输注
本公开内容提供了表达一种或多种本公开内容的CARs和/或CARTyrins的修饰细胞，其已被选择和/或扩充用于施用于需要其的主体。可以配制本公开内容的修饰细胞用于在包括室温和体温的任何温度贮藏。可以配制本公开内容的修饰细胞用于深低温保藏和后来的解冻。可以在药学上可接受的载体中配制本公开内容的修饰细胞，用于从无菌包装直接施用于主体。可以在具有细胞生存力和/或CAR/CARTyrin表达水平指示物的情况下在药学上可接受的载体中配制本公开内容的修饰细胞，以确保最低水平的细胞功能和CAR/CARTyrin表达。可以在具有一种或多种试剂以抑制进一步的扩充和/或预防细胞死亡的情况下于规定的密度在药学上可接受的载体中配制本公开内容的修饰细胞。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重2x105至5x108个细胞，或其任何范围、值或分数。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重0.2x106至20x106个细胞。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重0.2x106个细胞、每次施用每kg患者体重2x106个细胞、每次施用每kg患者体重20x106个细胞或其间每次施用每kg患者体重任何个细胞。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重1x106或约1x106个细胞。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重3x106或约3x106个细胞。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重0.7x106至6.7x106个细胞。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重0.7x106个细胞、每次施用每kg患者体重6.7x106个细胞或其间每次施用每kg患者体重任何个细胞。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重0.7x106至16x106个细胞。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重0.7x106个细胞、每次施用每kg患者体重2x106个细胞、每次施用每kg患者体重6x106个细胞、每次施用每kg患者体重10.7x106个细胞、每次施用每kg患者体重16x106个细胞或其间每次施用每kg患者体重任何个细胞。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重1.2x106至7.1x106个细胞。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重1.2x106个细胞、每次施用每kg患者体重7.1x106个细胞或每次施用每kg患者体重任何数目个细胞。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重2x106至3x106个细胞。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重1106x106至2106x106个细胞。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重1106x106个细胞、每次施用每kg患者体重2106x106个细胞或其间每次施用每kg患者体重任何数目个细胞。在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重0.7x106至1.3x106个细胞。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括每次施用每kg患者体重0.7x106个细胞、每次施用每kg患者体重1.3x106个细胞或其间每次施用每kg患者体重任何数目个细胞。
在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的修饰细胞通过注射或静脉内输注递送至患者。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括单次剂量或倍剂量(multiple doses)。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括分割剂量(split dose)。在某些实施方案中，本公开内容的组合物或包含本公开内容的修饰细胞的组合物的治疗有效剂量包括初始剂量和维持剂量。
在本公开内容的某些实施方案中，修饰细胞是T细胞，并且所述T细胞可以在体外扩充或用药学上可接受的载体配制之前根据T细胞标记进行分选。在一些实施方案中，可以使用CD8+和/或CD4+标记对修饰T细胞进行分选。
诱导型促凋亡多肽
本公开内容的诱导型促凋亡多肽优于现有的诱导型多肽，这是因为本公开内容的诱导型促凋亡多肽的免疫原性少得多。尽管本公开内容的诱导型促凋亡多肽是重组多肽，且因此是非天然存在的，但是进行重组以产生本公开内容的诱导型促凋亡多肽的序列不包含宿主人免疫系统可以识别为“非自身”的，且因此在接受本公开内容的诱导型促凋亡多肽、包含所述诱导型促凋亡多肽的细胞或包含所述诱导型促凋亡多肽或包含所述诱导型促凋亡多肽的细胞的组合物的主体中诱导免疫应答的非人序列。
本公开内容提供了包含配体结合区、接头和促凋亡肽的诱导型促凋亡多肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在某些实施方案中，非人序列包含限制酶切位点。在某些实施方案中，促凋亡肽是胱天蛋白酶多肽。在某些实施方案中，胱天蛋白酶多肽是胱天蛋白酶9多肽。在某些实施方案中，胱天蛋白酶9多肽是截短的胱天蛋白酶9多肽。本公开内容的诱导型促凋亡多肽可以是非天然存在的。
本公开内容的胱天蛋白酶多肽包括，但不限于，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶11、胱天蛋白酶12和胱天蛋白酶14。本公开内容的胱天蛋白酶多肽包括，但不限于，那些与凋亡有关的胱天蛋白酶多肽，包括胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶10。本公开内容的胱天蛋白酶多肽包括，但不限于，那些起始凋亡的胱天蛋白酶多肽，包括胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶10。本公开内容的胱天蛋白酶多肽包括，但不限于，那些执行凋亡的胱天蛋白酶多肽，包括胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6和胱天蛋白酶7。
与野生型氨基酸或核酸序列相比，本公开内容的胱天蛋白酶多肽可由具有一种或多种修饰的氨基酸或核酸序列编码。编码本公开内容的胱天蛋白酶多肽的核酸序列可以被密码子优化。与野生型氨基酸或核酸序列相比，对本公开内容的胱天蛋白酶多肽的氨基酸和/或核酸序列的一种或多种修饰可以增加本公开内容的胱天蛋白酶多肽的相互作用、交联、交叉激活或激活。另一方面或此外，与野生型氨基酸或核酸序列相比，对本公开内容的胱天蛋白酶多肽的氨基酸和/或核酸序列的一种或多种修饰可以降低本公开内容的胱天蛋白酶多肽的免疫原性。
与野生型胱天蛋白酶多肽相比，本公开内容的胱天蛋白酶多肽可以被截短。例如，可以将胱天蛋白酶多肽截短以消除编码胱天蛋白酶激活和募集结构域(CARD)的序列，以消除或最小化除了起始包含本公开内容中的诱导型胱天蛋白酶多肽的细胞中的凋亡之外激活局部炎症反应的可能性。与野生型胱天蛋白酶多肽相比，编码本公开内容的胱天蛋白酶多肽的核酸序列可以被剪接以形成本公开内容的胱天蛋白酶多肽的变体氨基酸序列。本公开内容的胱天蛋白酶多肽可由重组和/或嵌合序列编码。本公开内容的重组和/或嵌合胱天蛋白酶多肽可包含来自一种或多种不同胱天蛋白酶多肽的序列。另一方面或此外，本公开内容的重组和/或嵌合胱天蛋白酶多肽可包含来自一个或多个物种的序列(例如人序列和非人序列)。本公开内容的胱天蛋白酶多肽可以是非天然存在的。
本公开内容的诱导型促凋亡多肽的配体结合区可以包括便于或促进本公开内容的第一诱导型促凋亡多肽与本公开内容的第二诱导型促凋亡多肽二聚化的任何多肽序列，其二聚化激活或诱导促凋亡多肽的交联和细胞中凋亡的起始。
配体结合(“二聚化”)区可包括任何多肽或其功能性结构域，其将允许使用内源或非天然存在的配体(即和诱导剂)例如非天然存在的合成配体进行诱导。取决于诱导型促凋亡多肽的特性和配体(即诱导剂)的选择，配体结合区可以在细胞膜的内部或外部。各种各样的配体结合多肽及其功能性结构域，包括受体，是已知的。本公开内容的配体结合区可以包括来自受体的一种或多种序列。特别令人感兴趣的是这样的配体结合区，其配体(例如，小的有机配体)是已知的或可容易产生的。这些配体结合区或受体可以包括，但不限于，FKBPs和亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体等，以及“非天然存在的”受体，其可以获得自抗体，特别是重链或轻链亚基，其突变序列，通过随机程序获得的随机氨基酸序列，组合合成等。在某些实施方案中，配体结合区选自FKBP配体结合区、亲环蛋白受体配体结合区、类固醇受体配体结合区、亲环蛋白受体配体结合区和四环素受体配体结合区。
作为其内源结构域或其截短的活性部分，包含一个或多个受体结构域的配体结合区可以是至少约50个氨基酸，并且少于约350个氨基酸，通常少于200个氨基酸。结合区域可以是例如小的(＜25kDa，以允许在病毒载体中有效转染)，单体的，非免疫原性的，具有合成可及的，细胞可渗透的，无毒性的配体，其可以被配置用于二聚化。
取决于诱导型促凋亡多肽的设计和合适的配体(即诱导剂)的可用性，包含一个或多个受体结构域的配体结合区可以是细胞内或细胞外的。对于疏水配体，结合区可以在膜的任一侧，但是对于亲水配体，特别是蛋白配体，结合区通常将在细胞膜的外部，除非存在以其可用于结合的形式将配体内在化的转运系统。对于细胞内受体，诱导型促凋亡多肽或包含诱导型促凋亡多肽的转座子或载体可编码受体结构域序列5′或3′的信号肽和跨膜结构域，或可具有受体结构域序列5′的脂质附着信号序列。在受体结构域在信号肽和跨膜结构域之间的场合，受体结构域将是细胞外的。
抗体和抗体亚基，例如，重链或轻链，特别是片段，更特别地是可变区的全部或部分，或产生高亲和力结合的重链和轻链的融合，可以用作本公开内容的配体结合区。所预期的抗体包括作为异位表达的人产物的那些，例如将不触发免疫应答并且通常不在外周表达(即，在CNS/脑区域之外)的细胞外结构域。这种实例包括，但不限于，低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)和胚胎表面蛋白(即，癌胚抗原)。还进一步地，可以制备针对生理可接受的半抗原分子的抗体，并针对结合亲和力筛选各个抗体亚基。可以通过恒定区的缺失、可变区的部分、可变区的诱变等来分离和修饰编码亚基的cDNA，以获得对配体具有适当亲和力的结合蛋白结构域。这样，几乎任何生理可接受的半抗原化合物都可以用作配体或提供配体的表位。代替抗体单位，可以使用内源受体，其中结合区或结构域是已知的，并且存在用于结合的有用或已知的配体。
为了使受体多聚化，诱导型促凋亡多肽的配体结合区/受体结构域的配体在配体可以具有至少两个结合位点的意义上可以是多聚体的，而每个结合位点都能够结合配体受体区(即，具有能够结合第一诱导型促凋亡多肽的配体结合区的第一结合位点和能够结合第二诱导型促凋亡多肽的配体结合区的第二结合位点的配体，其中所述第一和第二诱导型促凋亡多肽的配体结合区相同或不同)。因此，如本文所用的，术语“多聚体的配体结合区”是指与多聚体配体结合的本公开内容的诱导型促凋亡多肽配体结合区。本公开内容的多聚体配体包括二聚体配体。本公开内容的二聚配体可以具有两个能够结合至配体受体结构域的结合位点。在某些实施方案中，本公开内容的多聚体配体是小的合成有机分子的二聚体或更高级的寡聚体，通常不大于约四聚体，各个分子一般为至少约150Da且小于约5kDa，通常小于约3kDa。可以使用多种合成配体和受体对。例如，在涉及内源受体的实施方案中，二聚体FK506可以与FKBP12受体一起使用，二聚化环孢菌素A可以与亲环蛋白受体一起使用，二聚化雌激素与雌激素受体一起，二聚化糖皮质激素与糖皮质激素受体一起，二聚化四环素与四环素受体一起，二聚化维生素D与维生素D受体一起，等。另一方面，可以使用高级的配体，例如三聚体。对于涉及非天然存在的受体的实施方案，例如，抗体亚基，修饰的抗体亚基，包含由柔性接头隔开的串联的重链和轻链可变区的单链抗体，或修饰的受体，及其突变序列等，可以使用各种各样化合物中的任何一种。包含本公开内容的多聚体配体的单位的显著特征是每个结合位点都能够以高亲和力结合受体，并且优选地，它们能够被化学二聚化。同样地，这样的方法是可用的，以平衡配体的疏水性/亲水性，从而使得它们能够以功能性水平溶解在血清中，又通过质膜扩散以用于大多数应用中。
本公开内容的诱导型促凋亡多肽的活化可以通过例如由诱导剂介导的化学诱导的二聚化(CID)来完成，以产生条件控制的蛋白或多肽。由于不稳定的二聚化剂的降解或单体竞争性抑制剂的施用，本公开内容的促凋亡多肽不仅是诱导型的，而且这些多肽的诱导也是可逆的。
在某些实施方案中，配体结合区包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽。在某些实施方案中，配体结合区包含具有在位置36处的缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代(F36V)的FKBP12多肽。在某些实施方案中，其中配体结合区包含具有在位置36处的缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代(F36V)的FKBP12多肽，诱导剂可包括AP1903，合成药物(CAS索引名称：2-哌啶羧酸(2-Piperidinecarboxylic acid)，1-[(2S)-1-氧代-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)丁基]-，1，2-乙二基双[亚氨基(2-氧代-2，1-乙二基)氧基-3，1-亚苯基[(1R)-3-(3，4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯，[2S-[1(R*)，2R*[S*[S*[1(R*)，2R*]]]]]-(9Cl)CAS登记号：195514-63-7；分子式：C78H98N4O20；分子量：1411.65))。在某些实施方案中，其中配体结合区包含具有在位置36处的缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代(F36V)的FKBP12多肽，诱导剂可包括AP20187(CAS登记号：195514-80-8和分子式：C82H107N5O20)。在某些实施方案中，诱导剂是AP20187类似物，如例如AP1510。如本文所用的，诱导剂AP20187、AP1903和AP1510可以互换使用。
AP1903 API由Alphora Research Inc.生产，且用于注射的AP1903药物产品由Formatech Inc.制备。其被配制为在25％非离子型加溶剂Solutol HS 15溶液(250mg/mL，BASF)中的5mg/mL AP1903溶液。在室温，这个制剂是透明的稍微黄色的溶液。冷冻时，这个制剂经历可逆的相变，结果产生乳状溶液。重新加热至室温时，这个相变逆转。装填为在3mL玻璃小瓶中2.33mL(约每个小瓶总计10mg用于注射的AP1903)。在确定施用AP1903的需要时，可以例如使用非-DEHP，非环氧乙烷灭菌的输注器具，在2小时期间通过静脉内(IV)输注向患者施用单个固定剂量的用于注射的AP1903(0.4mg/kg)。AP1903的剂量是对于所有患者个别计算的，且除非体重波动≥10％，否则不重新计算。在输注之前，将计算的剂量在0.9％生理盐水中在100mL中稀释。在以前的AP1903的I期研究中，在2小时期间以静脉内输注的0.01、0.05、0.1、0.5和1.0mg/kg的剂量水平用单剂用于注射的AP1903治疗24名健康志愿者。在0.01-1.0mg/kg的剂量范围内，AP1903血浆水平与剂量成正比，而平均Cmax值范围为约10-1275ng/mL。在起始输注阶段后，血液浓度显示出快速分布阶段，在给药后(post-dose)0.5、2和10小时，血浆水平分别降至最大浓度的约18％、7％和1％。用于注射的AP1903在所有剂量水平均显示是安全和良好耐受的，并显示出有利的药物代谢动力学概况。Iuliucci J D等人，J Clin Pharmacol.41：870-9，2001。
使用的用于注射的AP1903的固定剂量例如可以是在2小时期间静脉内输注的0.4mg/kg。体外用于有效的细胞信号传导所需的AP1903的量为10-100nM(1600Da MW)。这等于16-160μg/L或～0.016-1.6μg/kg(1.6-160μg/kg)。在上述AP1903的I期研究中，最多到1mg kg的剂量是良好耐受的。因此，0.4mg/kg可能是与治疗用细胞组合的对于这个I期研究的AP1903的安全且有效剂量。
与野生型氨基酸或核酸序列相比，本公开内容的编码配体结合的氨基酸和/或核酸序列可含有序列一种或多种修饰。例如，本公开内容的编码配体结合区的氨基酸和/或核酸序列可以是密码子优化的序列。与野生型多肽相比，一种或多种修饰可以增加配体(例如，诱导剂)对本公开内容的配体结合区域的结合亲和力。另一方面或此外，与野生型多肽相比，所述一种或多种修饰可以降低本公开内容的配体结合区的免疫原性。本公开内容的配体结合区和/或本公开内容的诱导剂可以是非天然存在的。
本公开内容的诱导型促凋亡多肽包含配体结合区、接头和促凋亡肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在某些实施方案中，非人序列包含限制酶切位点。接头可包含任何有机或无机材料，其在配体结合区二聚化时允许促凋亡多肽的相互作用、交联、交叉激活或激活，从而使得促凋亡多肽的相互作用或激活起始细胞中的凋亡。在某些实施方案中，接头是多肽。在某些实施方案中，接头是包含富含G/S的氨基酸序列的多肽(“GS”接头)。在某些实施方案中，接头是包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：17014)的多肽。在优选的实施方案中，接头是多肽，并且编码所述多肽的核酸不含有限制性内切核酸酶的限制酶切位点。本公开内容的接头可以是非天然存在的。
可以在任何能够在该细胞中起始和/或调节本公开内容的诱导型促凋亡多肽表达的启动子的转录调节下，在细胞中表达本公开内容的诱导型促凋亡多肽。如本文所用的术语“启动子”是指充当RNA聚合酶的起始结合位点以转录基因的启动子。例如，可以在能够起始和/或调节本公开内容的诱导型促凋亡多肽在哺乳动物细胞中的表达的任何启动子的转录调节下，包括，但不限于，天然、内源、外源和异源启动子，在哺乳动物细胞中表达本公开内容的诱导型促凋亡多肽。优选的哺乳动物细胞包括人细胞。因此，可以在能够起始和/或调节本公开内容的诱导型促凋亡多肽在人细胞中的表达的任何启动子的转录调节下，包括，但不限于，人启动子或病毒启动子，在人细胞中表达本公开内容的诱导型促凋亡多肽。用于在人细胞中表达的示例性启动子包括，但不限于，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、β-肌动蛋白启动子、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，它们各自都可用于获得本公开内容的诱导型促凋亡多肽的高水平表达。也预期了本领域中众所周知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子的使用以实现本公开内容的诱导型促凋亡多肽的表达，只要所述表达水平足以起始细胞中的凋亡。通过使用具有众所周知的性质的启动子，可以最优化转染或转化后感兴趣的蛋白表达的水平和模式。
响应特定的生理或合成信号来调节的启动子的选择可以允许本公开内容的诱导型促凋亡多肽的诱导型表达。蜕皮激素系统(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)就是一种这样的系统。设计这种系统以允许在哺乳动物细胞中感兴趣的基因的调节的表达。它由紧密调节的表达机制组成，所述机制实际上不允许转基因的基础水平表达，但允许超过200-倍的诱导性。所述系统基于果蝇属的异二聚体蜕皮激素受体，且当蜕皮激素或类似物如米乐甾酮A(muristerone A)与受体结合时，所述受体激活启动子以打开下游转基因的表达，获得高水平的mRNA转录物。在这个系统中，异二聚体受体的两个单体都从一个载体组成型表达，而驱动感兴趣的基因表达的蜕皮激素响应性启动子在另一个质粒上。因此，将这种类型的系统改造到感兴趣的载体中可能是有用的。另一个可能有用的诱导型系统是最初由Gossen和Bujard开发的Tet-OffTM或Tet-OnTM系统(Clontech，Palo Alto，Calif.)(Gossen和Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551，1992；Gossen等人，Science，268：1766-1769，1995)。这个系统还允许响应四环素或四环素衍生物(例如多西环素)来调节的高水平的基因表达。在Tet-OnTM系统中，在有多西环素的情况下打开基因表达，而在Tet-OffTM系统中，在没有多西环素的情况下打开基因表达。这些系统基于衍生自大肠杆菌的四环素抗性操纵子的两个调节元件：四环素操纵基因序列(四环素阻遏物与其结合)和四环素阻遏物蛋白。将感兴趣的基因在其中存在四环素响应性元件的启动子后克隆到质粒中。第二质粒含有称为四环素控制的反式激活蛋白的调节元件，其在Tet-OffTM系统中由来自单纯疱疹病毒的VP16结构域和野生型四环素阻遏物组成。因此，在没有多西环素的情况下，转录是组成型地开着。在Tet-OnTM系统中，四环素阻遏物不是野生型的，且在有多西环素的情况下激活转录。对于基因治疗载体生产，可以使用Tet-OffTM系统，从而使得生产细胞可以在有四环素或多西环素的情况下生长并阻止潜在毒性的转基因的表达，但是当将载体引入患者时，基因表达将组成型地开着。
在一些情况下，期望调节基因治疗载体中转基因的表达。例如，取决于所期望的表达水平，利用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中，CMV立即早期启动子经常用于提供强的转录激活。CMV启动子于Donnelly，J.J.等人，1997.Annu.Rev.Immunol.15：617-48中进行综述。当期望降低的转基因表达水平时，也已使用了效力较低的CMV启动子的修饰形式。当期望在造血细胞中表达转基因时，经常使用反转录病毒启动子，例如来自MLV或MMTV的LTRs。取决于所期望的效果使用的其他病毒启动子包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2 LTR、腺病毒启动子(例如来自E1A、E2A或MLP区)、AAV LTR、HSV-TK和禽肉瘤病毒。
在其他实例中，可以选择发育调节的并且在特定分化的细胞中有活性的启动子。因此，例如，启动子在多潜能干细胞中可能没有活性，但是，例如，在多潜能干细胞分化成更成熟的细胞的场合，所述启动子于是可以被激活。
类似地，组织特异性启动子用于在特定组织或细胞中实现转录，从而减少对非靶向的组织的潜在毒性或不期望的影响。与诸如CMV启动子的更强启动子相比，这些启动子可能导致降低的表达，但也可能导致更有限的表达和免疫原性(Bojak，A.等人，2002.Vaccine.20：1975-79；Cazeaux，N.等人，2002.Vaccine 20：3322-31)。例如，在适当的场合，可以使用组织特异性启动子，例如PSA相关启动子或前列腺特异性腺激肽释放酶、或肌肉肌酸激酶基因。
组织特异性或分化特异性启动子的实例包括，但不限于，以下：B29(B细胞)；CD14(单核细胞)；CD43(白细胞和血小板)；CD45(造血细胞)；CD68(巨噬细胞)；结蛋白(肌肉)；弹性蛋白酶-1(胰腺腺泡细胞)；内皮糖蛋白(内皮细胞)；纤连蛋白(分化中的细胞，愈合中的组织)；和Flt-1(内皮细胞)；GFAP(星形胶质细胞)。
在某些适应症中，期望在施用基因治疗载体后的特定时间激活转录。这是用像那些激素或细胞因子可调节的这样的启动子完成的。可以使用的细胞因子和炎症蛋白响应性启动子包括K和T激肽原(Kageyama等人，(1987)J.Biol.Chem.，262，2345-2351)、c-fos、TNF-α、C反应蛋白(Arcone等人，(1988)Nucl.Acids Res.，16(8)，3195-3207)、触珠蛋白(Oliviero等人，(1987)EMBO J.，6，1905-1912)、血清淀粉样A2、C/EBPα、IL-1、IL-6(Poli和Cortese，(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，86，8202-8206)、补体C3(Wilson等人，(1990)Mol.Cell.Biol.，6181-6191)、1L-8、α-1酸性糖蛋白(Prowse和Baumann，(1988)Mol CellBiol，8，42-51)、α-1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂肪酶(Zechner等人，Mol.Cell.Biol.，2394-2401，1988)、血管紧张肽原(Ron等人，(1991)Mol.Cell.Biol.，2887-2895)、血纤蛋白原、c-jun(可由佛波酯、TNF-α、紫外线、视黄酸和过氧化氢诱导的)、胶原酶(由佛波酯和视黄酸诱导的)、金属硫蛋白(重金属和糖皮质激素可诱导的)、溶基质蛋白酶(可由佛波酯、白细胞介素-1和EGF诱导的)、α-2巨球蛋白和α-1抗胰凝乳蛋白酶。其他启动子包括，例如，SV40、MMTV、人免疫缺陷病毒(MV)、莫洛尼病毒、ALV、EB病毒、劳斯肉瘤病毒、人肌动蛋白、肌球蛋白、血红蛋白和肌酸。
预计取决于所期望的作用，单独或与另一种组合的任何上述启动子都可以是有用的。选择启动子和其他调节元件，从而使得它们在所期望的细胞或组织中有功能。另外，这个启动子清单不应被解释为穷举或限制性的；连同本文公开的启动子和方法一起使用的其他启动子。
装甲的T细胞“击倒”策略
可以对本公开内容的T-细胞进行基因修饰以增强其治疗潜力。另一方面或此外，可以修饰本公开内容的T-细胞以使它们对免疫和/或代谢限制点较不敏感。这种类型的修饰“装甲”本公开内容的T细胞，其在修饰之后在本文中可以称为“装甲的”T细胞。可以通过例如阻断和/或稀化例如在肿瘤免疫抑制微环境内递送至T-细胞的特定内源限制点信号(即限制点抑制)来产生本公开内容的装甲的T细胞。
在一些实施方案中，本公开内容的装甲的T-细胞衍生自T细胞、NK细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞(包括分离或衍生自G-CSF-动员的外周血的T细胞)或脐带血(UCB)衍生的T细胞。在一些实施方案中，本公开内容的装甲的T-细胞包含本公开内容的嵌合配体受体(包含蛋白支架、抗体、ScFv或抗体模拟物的CLR)/嵌合抗原受体(包含蛋白支架、抗体、ScFv或抗体模拟物的CAR)、CARTyrin(包含Centyrin的CAR)和/或VCAR(包含骆驼科动物VHH或单结构域VH的CAR)中的一种或多种。在一些实施方案中，本公开内容的装甲的T-细胞包含诱导型促凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头和(c)截短的胱天蛋白酶9多肽，其中所述诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在一些实施方案中，非人序列是限制酶切位点。在一些实施方案中，配体结合区诱导型胱天蛋白酶多肽包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽。在一些实施方案中，FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽的氨基酸序列包含在序列的位置36处的修饰。在一些实施方案中，修饰是在位置36处缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代(F36V)。在一些实施方案中，本公开内容的装甲的T-细胞包含外源序列。在一些实施方案中，外源序列包含编码治疗用蛋白的序列。示例性治疗用蛋白可以是核内蛋白、胞质蛋白、细胞内蛋白、跨膜蛋白、细胞表面结合的蛋白或分泌的蛋白。由装甲的T细胞表达的示例性治疗用蛋白可以修饰装甲的T细胞的活性或可以修饰第二细胞的活性。在一些实施方案中，本公开内容的装甲的T-细胞包含选择基因或选择标记。在一些实施方案中，本公开内容的装甲的T-细胞包含合成基因表达盒(本文也称为诱导型转基因构建体)。
在一些实施方案中，本公开内容的T-细胞被修饰以沉默或降低编码抑制性限制点信号的一种或多种受体的一种或多种基因的表达，以产生本公开内容的装甲的T-细胞。抑制性限制点信号的实例包括，但不限于，与本公开内容的CAR-T细胞上的PD-1受体结合的PD-L1配体或与CAR-T细胞上的TGFβRII受体结合的TGFβ细胞因子。抑制性限制点信号的受体在T-细胞的细胞表面上或胞质内表达。沉默或降低编码抑制性限制点信号的受体的基因的表达导致抑制性限制点受体在本公开内容的装甲的T-细胞的表面上或胞质内的蛋白表达的丧失。因此，具有沉默或降低的一种或多种编码抑制性限制点受体的基因的表达的本公开内容的装甲的T细胞对限制点信号具有抗性、非接受或不敏感。在有这些抑制性限制点信号的情况下，装甲的T细胞对抑制性限制点信号的抗性或降低的敏感性增强装甲的T细胞的治疗潜力。抑制性限制点信号包括但不限于表2中列出的示例。可以在本公开内容的装甲的T细胞中沉默的示例性抑制性限制点信号包括，但不限于，PD-1和TGFβRII。
表2.示例性抑制性限制点信号(以及诱导免疫抑制的蛋白)。
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在一些实施方案中，修饰本公开内容的T-细胞以沉默或降低编码与限制点信号传导有关的细胞内蛋白的一种或多种基因的表达，以产生本公开内容的装甲的T-细胞。本公开内容的T-细胞的活性可以通过靶向与限制点信号传导途径有关的任何细胞内信号传导蛋白来增强，从而实现对一个或多个限制点途径的限制点抑制或干扰。与限制点信号传导有关的细胞内信号传导蛋白包括，但不限于，表3中列出的示例性细胞内信号传导蛋白。
表3.示例性细胞内信号传导蛋白。
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在一些实施方案中，修饰本公开内容的T-细胞以沉默或降低编码妨碍治疗功效的转录因子的一种或多种基因的表达，以产生本公开内容的装甲的T-细胞。可以通过沉默或降低妨碍治疗功效的转录因子的表达(或阻抑功能)来增强或调节装甲的T-细胞的活性。可被修饰以沉默或降低表达或阻抑其功能的示例性转录因子包括，但不限于，表4中列出的示例性转录因子。例如，可在本公开内容的装甲的T细胞中沉默或降低FOXP3基因的表达，以防止或减少T调节CAR-T细胞(CAR-Treg细胞)的形成，其表达或活性可能降低治疗功效。
表4.示例性转录因子。
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在一些实施方案中，修饰本公开内容的T-细胞以沉默或降低编码细胞死亡或细胞凋亡受体的一种或多种基因的表达，以产生本公开内容的装甲的T-细胞。死亡受体与其内源配体的相互作用导致凋亡的起始。细胞死亡和/或细胞凋亡受体和/或配体的表达、活性或相互作用的破坏使得本公开内容的装甲的T-细胞较不接受死亡信号，因此，使得本公开内容的装甲的T-细胞在肿瘤环境中更有效。可以在本公开内容的装甲的T细胞中修饰的示例性细胞死亡受体是Fas(CD95)。本公开内容的示例性细胞死亡和/或细胞凋亡受体和配体包括，但不限于，表5中提供的示例性受体和配体。
表5.示例性细胞死亡和/或细胞凋亡受体和配体。
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在一些实施方案中，修饰本公开内容的T-细胞以沉默或降低编码代谢信号感觉蛋白(metabolic sensing protein)的一种或多种基因的表达，以产生本公开内容的装甲的T-细胞。通过本公开内容的装甲的T-细胞对免疫抑制肿瘤微环境(特征在于低水平的氧、pH、葡萄糖和其他分子)的代谢信号感觉的破坏导致T-细胞功能的延长维持，以及因此，每个装甲的T细胞更多杀伤的肿瘤细胞。例如，当在低氧环境中时，HIF1a和VHL在T-细胞功能中起作用。本公开内容的装甲的T-细胞可能已沉默或降低一种或多种编码HIF1a或VHL的基因的表达。与代谢信号感觉有关的基因和蛋白包括，但不限于，表6中提供的示例性基因和蛋白。
表6.示例性的代谢信号感觉基因(和编码的蛋白)。
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在一些实施方案中，修饰本公开内容的T-细胞以沉默或降低编码蛋白的一种或多种基因的表达，所述蛋白赋予对癌症疗法的敏感性，包括单克隆抗体，以产生本公开内容的装甲的T-细胞。因此，在存在癌症疗法(例如化学疗法、单克隆抗体疗法或另一种抗肿瘤治疗)时，本公开内容的装甲的T-细胞可以起作用并且可以表现出优越的功能或功效。与赋予对癌症疗法的敏感性有关的蛋白包括，但不限于，表7中提供的示例性蛋白。
表7.赋予对癌症治疗的敏感性的示例性蛋白。
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在一些实施方案中，修饰本公开内容的T-细胞以沉默或降低编码生长优势因子(growth advantage factor)的一种或多种基因的表达，以产生装甲的T-细胞。沉默或降低癌基因的表达对于本公开内容的装甲的T-细胞可赋予生长优势。例如，在CAR-T制造过程中沉默或降低TET2基因的表达(例如破坏表达)导致了装甲的CAR-T的产生，其当与缺乏这种用于扩充的能力的非装甲的CAR-T相比时，具有显著的扩充和随后根除肿瘤的能力。这个策略可以与安全开关(safety switch)(例如，本公开内容的iC9安全开关)偶联，所述安全开关允许万一有来自主体的不利反应或装甲的CAR-T的不受控制的生长时装甲的CAR-T的定向破坏。示例性的生长优势因子包括，但不限于，表8中提供的因子。
表8.示例性的生长优势因子。
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装甲的T-细胞“无效或转换受体”策略
在一些实施方案中，修饰本公开内容的T-细胞以表达修饰的/嵌合的限制点受体以产生本公开内容的装甲的T-细胞。
在一些实施方案中，修饰的/嵌合的限制点受体包括无效受体、诱饵受体或显性失活受体。本公开内容的无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以是修饰的/嵌合的受体/蛋白。本公开内容的无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以被截短以用于细胞内信号传导结构域的表达。另一方面或此外，本公开内容的无效受体、诱饵受体或显性失活受体可以在细胞内信号传导结构域内在一个或多个对于有效信号传导而言有决定作用的或需要的氨基酸位置处突变。本公开内容的无效受体、诱饵受体或显性失活受体的截短或突变可能导致受体向细胞或在细胞内传递或转导限制点信号的能力丧失。
例如，可以通过在本公开内容的装甲的T-细胞表面上表达修饰的/嵌合的PD-1无效受体来实现来自在肿瘤细胞表面上表达的PD-L1受体的免疫抑制限制点信号的稀化或阻断，所述修饰的/嵌合的PD-1无效受体有效地与也在装甲的T-细胞表面上表达的内源(非修饰的)PD-1受体竞争，以减少或抑制通过装甲的T-细胞的内源PD-1受体的免疫抑制限制点信号的转导。在这个示例性实施方案中，在用于结合肿瘤细胞上表达的PD-L1的两种不同的受体之间的竞争降低或减小了有效限制点信号传导的水平，从而增强了表达PD-1无效受体的装甲的T-细胞的治疗潜力。
在一些实施方案中，修饰的/嵌合的限制点受体包含作为跨膜受体的无效受体、诱饵受体或显性失活受体。
在一些实施方案中，修饰的/嵌合的限制点受体包括作为膜结合的或膜连接的受体/蛋白的无效受体、诱饵受体或显性失活受体。
在一些实施方案中，修饰的/嵌合的限制点受体包括作为细胞内受体/蛋白质的无效受体、诱饵受体或显性失活受体。
在一些实施方案中，修饰的/嵌合的限制点受体包括作为细胞内受体/蛋白质的无效受体、诱饵受体或显性失活受体。本公开内容的示例性无效、诱饵或显性失活细胞内受体/蛋白包括，但不限于，抑制性限制点信号(如，例如在表2和3中所提供的)，转录因子(如，例如在表4中提供的)，细胞因子或细胞因子受体，趋化因子或趋化因子受体，细胞死亡或凋亡受体/配体(如，例如在表5中提供的)，代谢信号感觉分子(如，例如在表6中提供的)，赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白(如，例如在表7中提供的)，和癌基因或抑癌基因(如，例如在表8中提供的)下游的信号传导组分。本公开内容的示例性细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和趋化因子受体包括，但不限于，表9中提供的细胞因子和细胞因子受体以及趋化因子和趋化因子受体。
表9.示例性的细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和趋化因子受体。
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在一些实施方案中，修饰的/嵌合的限制点受体包含转换受体。示例性的转换受体可包括本公开内容的修饰的/嵌合的受体/蛋白，其中天然或野生型细胞内信号传导结构域被转换或置换为对于所述蛋白非天然的和/或不是野生型结构域的不同细胞内信号传导结构域。例如，用刺激性信号传导结构域置换抑制性信号传导结构域将把免疫抑制信号转换为免疫刺激信号。另一方面，用不同的抑制性结构域置换抑制性信号传导结构域可以降低或增强抑制性信号传导的水平。转换受体的表达或超表达可通过与内源野生型限制点受体(不是转换受体)竞争结合在免疫抑制肿瘤微环境中表达的关联限制点受体而导致关联限制点信号的稀化和/或阻断。本公开内容的装甲的T细胞可包含编码本公开内容的转换受体的序列，从而导致表达本公开内容的一种或多种转换受体，并因此改变本公开内容的装甲的T-细胞的活性。本公开内容的装甲的T-细胞可表达本公开内容的转换受体，所述转换受体靶向本公开内容的限制点受体、转录因子、细胞因子受体、死亡受体、代谢信号感觉分子、癌症疗法、癌基因和/或抑癌蛋白或基因下游的细胞内表达的蛋白。
本公开内容的示例性转换受体可以包括或衍生自包括，但不限于下述的蛋白：抑制性限制点信号(如，例如在表2和3中所提供的)，转录因子(如，例如在表4中提供的)，细胞因子或细胞因子受体，趋化因子或趋化因子受体，细胞死亡或凋亡受体/配体(如，例如在表5中提供的)，代谢信号感觉分子(如，例如在表6中提供的)，赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白(如，例如在表7中提供的)，和癌基因或抑癌基因(如，例如在表8中提供的)下游的信号传导组分。本公开内容的示例性细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和趋化因子受体包括，但不限于，表9中提供的细胞因子和细胞因子受体以及趋化因子和趋化因子受体。
装甲的T-细胞“合成基因表达”策略
在一些实施方案中，修饰本公开内容的T-细胞以表达介导条件性基因表达的嵌合配体受体(CLR)或嵌合抗原受体(CAR)，以产生本公开内容的装甲的T-细胞。CLR/CAR和条件性基因表达系统在装甲的T细胞核中的组合构成了合成基因表达系统，在一种或多种关联配体与CLR或一种或多种关联抗原与CAR结合时，所述合成基因表达系统被条件性地激活。这个系统可通过减少或限制例如在肿瘤环境处或之内的配体或抗原结合部位的合成基因表达来帮助“装甲”或增强修饰的T细胞的治疗潜力。
外源受体
在一些实施方案中，装甲的T-细胞包含组合物，所述组合物包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，和(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体的序列，例如CLR或CAR，其中，在将(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列中时，表达外源受体，并且其中所述外源受体在结合配体或抗原时转导细胞内信号，所述细胞内信号直接或间接靶向调节诱导型转基因(a)的表达的诱导型启动子以修饰基因表达。
在本公开内容的合成基因表达系统的一些实施方案中，所述组合物通过降低基因表达来修饰基因表达。在一些实施方案中，所述组合物通过瞬时修饰基因表达(例如，达配体与外源受体结合的持续时间)来修饰基因表达。在一些实施方案中，所述组合物急相修饰基因表达(例如，配体可逆地结合外源受体)。在一些实施方案中，所述组合物长效修饰基因表达(例如，配体不可逆地结合外源受体)。
在本公开内容的组合物的一些实施方案中，(b)的外源受体包括就细胞的基因组序列而论的内源受体。示例性受体包括但不限于细胞内受体、细胞表面受体、跨膜受体、配体门控型离子通道和G蛋白偶联受体。
在本公开内容的组合物的一些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在一些实施方案中，非天然存在的受体是合成的、修饰的、重组的、突变的或嵌合的受体。在一些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自T-细胞受体(TCR)的一个或多个序列。在一些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自支架蛋白的一个或多个序列。在一些实施方案中，包括其中非天然存在的受体不包含跨膜结构域的那些，非天然存在的受体与第二跨膜、膜结合的和/或细胞内受体相互作用，所述第二跨膜、膜结合的和/或细胞内受体在与非天然存在的受体接触后转导细胞内信号。
在本公开内容的组合物的一些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在一些实施方案中，非天然存在的受体是合成的、修饰的、重组的、突变的或嵌合的受体。在一些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自T-细胞受体(TCR)的一个或多个序列。在一些实施方案中，非天然存在的受体包含分离或衍生自支架蛋白的一个或多个序列。在一些实施方案中，非天然存在的受体包含跨膜结构域。在一些实施方案中，非天然存在的受体与转导细胞内信号的细胞内受体相互作用。在一些实施方案中，非天然存在的受体包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，非天然存在的受体是嵌合配体受体(CLR)。在一些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体(CAR)。
在本公开内容的组合物的一些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在一些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，嵌合配体受体包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含支架蛋白；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。在一些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含信号肽。在一些实施方案中，(a)的胞外域进一步包含在所述配体识别区和所述跨膜结构域之间的铰链。
在本公开内容的CLR/CARs的一些实施方案中，信号肽包括编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。在一些实施方案中，信号肽包括编码人CD8α信号肽的序列。在一些实施方案中，信号肽包含包含MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：17000)的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽由包含atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca(SEQ IDNO：17001)的核酸序列编码。
在本公开内容的CLR/CARs的一些实施方案中，跨膜结构域包括编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包括编码人CD8α跨膜结构域的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：17002)的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域由包含atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc(SEQ ID NO：17003)的核酸序列编码。
在本公开内容的CLR/CARs的一些实施方案中，所述胞内域包括人CD3ζ胞内域。在一些实施方案中，所述至少一个共刺激结构域包括人4-1BB、CD28、CD3ζ、CD40、ICOS、MyD88、OX-40细胞内区段或其任何组合。在一些实施方案中，所述至少一个共刺激结构域包括人CD3ζ和/或4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CD3ζ共刺激结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含
Figure BPA0000288251470003711
在一些实施方案中，所述CD3ζ共刺激结构域由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470003712
在一些实施方案中，所述4-1BB共刺激结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：17006)。在一些实施方案中，所述4-1BB共刺激结构域由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470003713
在一些实施方案中，所述4-1BB共刺激结构域位于跨膜结构域和CD3ζ共刺激结构域之间。
在本公开内容的CLR/CARs的一些实施方案中，铰链包括衍生自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。在一些实施方案中，铰链包括衍生自人CD8α序列的序列。在一些实施方案中，铰链包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含
Figure BPA0000288251470003714
在一些实施方案中，铰链由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470003715
在一些实施方案中，铰链由包含以下序列的核酸序列编码
Figure BPA0000288251470003716
在一些实施方案中，所述至少一种蛋白支架特异性结合所述配体。
在本公开内容的组合物的一些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在一些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，嵌合配体受体包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含支架蛋白；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白支架包括抗体、抗体片段、单结构域抗体、单链抗体、抗体模拟物或Centyrin(在本文中称为CARTyrin)。在一些实施方案中，配体识别区包括抗体、抗体片段、单结构域抗体、单链抗体、抗体模拟物和Centyrin中的一种或多种。在一些实施方案中，单结构域抗体包括VHH或VH(在本文中称为VCAR)或由其组成。在一些实施方案中，单结构域抗体包括包含人互补性决定区(CDRs)的VHH或VH或由其组成。在一些实施方案中，VH是重组或嵌合蛋白。在一些实施方案中，VH是重组或嵌合人蛋白。在一些实施方案中，抗体模拟物包括affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer，Kunitz结构域肽或monobody或由其组成。在一些实施方案中，Centyrin包含至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列或由其组成。
在本公开内容的组合物的一些实施方案中，(b)的外源受体包括非天然存在的受体。在一些实施方案中，CLR是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，嵌合配体受体包含：(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含支架蛋白；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。在一些实施方案中，Centyrin包含至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列或由其组成。在一些实施方案中，所述至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域衍生自人蛋白。在一些实施方案中，所述人蛋白是生腱蛋白-C。在一些实施方案中，所述共有序列包含
Figure BPA0000288251470003721
在一些实施方案中，所述共有序列包含
Figure BPA0000288251470003731
在一些实施方案中，所述共有序列在以下内的一个或多个位置处被修饰：(a)包含在共有序列的位置13-16处的氨基酸残基TEDS或由其组成的A-B环；(b)包含在共有序列的位置22-28处的氨基酸残基TAPDAAF或由其组成的B-C环；(c)包含在共有序列的位置38-43处的氨基酸残基SEKVGE或由其组成的C-D环；(d)包含在共有序列的位置51-54处的氨基酸残基GSER或由其组成的D-E环；(e)包含在共有序列的位置60-64处的氨基酸残基GLKPG或由其组成的E-F环；(f)包含在共有序列的位置75-81处的氨基酸残基KGGHRSN或由其组成的F-G环；或(g)(a)-(f)的任何组合。在一些实施方案中，Centyrin包含至少5种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。在一些实施方案中，Centyrin包含至少10种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。在一些实施方案中，Centyrin包含至少15种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。在一些实施方案中，支架以选自小于或等于10-9M、小于或等于10-10M、小于或等于10-11M、小于或等于10-12M、小于或等于10-13M、小于或等于10-14M和小于或等于10-15M的KD的至少一种亲和力结合抗原。在一些实施方案中，所述KD由表面等离振子共振测定。
诱导型启动子
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码NFκB启动子的序列。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码干扰素(IFN)启动子的序列或编码白细胞介素-2启动子的序列。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码核受体亚家族4A组成员1(NR4A1；也称为NUR77)启动子的序列或编码NR4A1启动子的序列。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码T-细胞表面糖蛋白CD5(CD5)启动子的序列或编码CD5启动子的序列。在某些实施方案中，干扰素(IFN)启动子是IFNγ启动子。在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自细胞因子或趋化因子的启动子。在某些实施方案中，细胞因子或趋化因子包括IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A/F、IL21、IL22、IL23、转化生长因子β(TGFβ)、集落刺激因子2(GM-CSF)、干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子(TNFα)、LTα、穿孔蛋白、粒酶C(Gzmc)、粒酶B(Gzmb)、C-C基序趋化因子配体5(CCL5)、C-C基序趋化因子配体4(CCL4)、C-C基序趋化因子配体3(CCL3)、X-C基序趋化因子配体1(XCL1)和LIF白细胞介素6家族细胞因子(Lif)。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，包括其中(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码NR4A1启动子的序列或编码NR4A1启动子的序列的那些，NR4A1启动子通过T细胞中的T-细胞受体(TCR)刺激和通过B细胞中的B-细胞受体(BCR)刺激被激活，因此，在本公开内容的T-细胞或B-细胞分别通过TCR或BCR激活时诱导任何在NR4A1启动子控制下的序列的表达。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，包括其中(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码CD5启动子的序列或编码CD5启动子的序列的那些，CD5启动子通过T细胞中的T-细胞受体(TCR)刺激被激活，因此，在本公开内容的T-细胞通过TCR激活时诱导任何在CD5启动子控制下的序列的表达。
在本公开内容的组合物的某些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自包含与细胞分化、激活、衰竭和功能有关的表面蛋白的基因的启动子。在某些实施方案中，所述基因包括CD69、CD71、CTLA4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM-3、GITR、MHCII、COX-2、FASL和4-1BB。
在本公开内容的组合物的一些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自与CD代谢和分化有关的基因的启动子。在本公开内容的组合物的一些实施方案中，诱导型启动子分离或衍生自Nr4a1、Nr4a3、Tnfrsf9(4-1BB)、Sema7a、Zfp36l2、Gadd45b、Dusp5、Dusp6和Neto2的启动子。
诱导型转基因
在一些实施方案中，诱导型转基因构建体包含或驱动抑制性限制点信号(如，例如在表2和3中所提供的)，转录因子(如，例如在表4中提供的)，细胞因子或细胞因子受体，趋化因子或趋化因子受体，细胞死亡或凋亡受体/配体(如，例如在表5中提供的)，代谢信号感觉分子(如，例如在表6中提供的)，赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白(如，例如在表7和/或表1中提供的)，和癌基因或抑癌基因(如，例如在表8中提供的)下游的信号传导组分的表达。本公开内容的示例性细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和趋化因子受体包括，但不限于，表9中提供的细胞因子和细胞因子受体以及趋化因子和趋化因子受体
Cas-Clover
本公开内容提供了包含指导RNA和融合蛋白或编码融合蛋白的序列的组合物，其中所述融合蛋白包含dCas9和Clo051内切核酸酶或其核酸酶结构域。
小的Cas9(SaCas9)
本公开内容提供了包含可操作地连接至效应物的小的，Cas9(Cas9)的组合物。在某些实施方案中，本公开内容提供了一种融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含小的，Cas9(Cas9)。在某些实施方案中，本公开内容的小的Cas9构建体可包含包含IIS型内切核酸酶的效应物。
具有活性催化位点的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9的氨基酸序列。
Figure BPA0000288251470003751
失活的，小的，Cas9(dSaCas9)
本公开内容提供了包含可操作地连接至效应物的失活的，小的，Cas9(dSaCas9)的组合物。在某些实施方案中，本公开内容提供了一种融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含小的，失活的Cas9(dSaCas9)。在某些实施方案中，本公开内容的小的，失活的Cas9(dSaCas9)构建体可包含包含IIS型内切核酸酶的效应物。
dSaCas9序列：D10A和N580A突变(黑体、用大写字母开头和加下划线)使催化位点失活。
Figure BPA0000288251470003761
失活的Cas9(dCas9)
本公开内容提供了包含可操作地连接至效应物的失活的Cas9(dCas9)的组合物。在某些实施方案中，本公开内容提供了一种融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应分子、基本上由其组成或由其组成，其中所述效应物包含失活的Cas9(dCas9)。在某些实施方案中，本公开内容的失活的Cas9(dCas9)构建体可包含包含IIS型内切核酸酶的效应物。
在某些实施方案中，本公开内容的dCas9包含分离或衍生自化脓性葡萄球菌(Staphyloccocus pyogenes)的dCas9。在某些实施方案中，dCas9包括具有使催化位点失活的在dCas9的氨基酸序列的位置10和840处的取代的dCas9。在某些实施方案中，这些取代是D10A和H840A。在某些实施方案中，dCas9的氨基酸序列包含以下序列：
Figure BPA0000288251470003771
在某些实施方案中，dCas9的氨基酸序列包含以下序列：
Figure BPA0000288251470003781
Clo051内切核酸酶
示例性的Clo051核酸酶结构域可以包含以下氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：
Figure BPA0000288251470003782
Cas-Clover融合蛋白
在某些实施方案中，示例性的dCas9-Clo051融合蛋白(实施方案1)可包含以下氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成(Clo051序列加下划线，接头黑体斜体，dCas9序列(酿脓链球菌(Streptoccocus pyogenes))斜体)：
Figure BPA0000288251470003791
在某些实施方案中，示例性的dCas9-Clo051融合蛋白(实施方案1)可包含以下核酸序列、基本上由其组成或由其组成(衍生自酿脓链球菌的dCas9序列)：
Figure BPA0000288251470003792
Figure BPA0000288251470003801
Figure BPA0000288251470003811
在某些实施方案中，编码本公开内容的dCas9-Clo051融合蛋白(实施方案1)的核酸序列可以包括DNA。在某些实施方案中，编码本公开内容的dCas9-Clo051融合蛋白(实施方案1)的核酸序列可以包括RNA。
在某些实施方案中，示例性的dCas9-Clo051融合蛋白(实施方案2)可包含以下氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成(Clo051序列加下划线，接头黑体斜体，dCas9序列(酿脓链球菌)斜体)：
Figure BPA0000288251470003812
Figure BPA0000288251470003821
在某些实施方案中，示例性的dCas9-Clo051融合蛋白(实施方案2)可包含以下核酸序列、基本上由其组成或由其组成(衍生自酿脓链球菌的dCas9序列)：
Figure BPA0000288251470003822
Figure BPA0000288251470003831
在某些实施方案中，编码本公开内容的dCas9-Clo051融合蛋白(实施方案2)的核酸序列可以包括DNA。在某些实施方案中，编码本公开内容的dCas9-Clo051融合蛋白(实施方案2)的核酸序列可以包括RNA。
实施例
实施例1：用于在修饰的T-细胞中表达的NF-KB诱导型载体的设计
开发了两种T细胞活化NF-KB诱导型载体(图1A和B)；一种具有在正向取向(A)的基因表达系统(GES)，且另一种在互补方向(B)，两者都在组成型EF1a启动子之前。这些载体还指导由T2A序列分开的CAR分子和DHFR选择基因的表达。条件性NF-KB诱导型系统和EF1a指导的基因两者都是可以使用EP永久整合到T细胞中的piggyBac转座子的一部分。一旦整合到基因组中，T细胞就组成型表达膜表面上的CAR和细胞内的DHFR，而NF-KB诱导型基因GFP的表达仅在T细胞活化时才将表达到最高水平。
实施例2：用于在修饰的T-细胞中的GFP表达的NF-KB诱导型载体
用表达在EF1a启动子控制下的抗-BCMA CAR和DHFR突变蛋白基因的piggyBac载体以及不存在(无基因表达系统(GES)对照)或存在驱动正向取向(pNFKB-GFP正向)或反向取向(pNFKB-GFP反向)的GFP表达的NF-KB诱导型表达系统对T细胞进行核转染。在有氨甲蝶呤选择的情况下培养细胞，直到细胞几乎完全静息(第19天)为止，并在第5天和第19天评估GFP表达。在第5天，所有T细胞均增殖并被高度刺激，而带有NFKB诱导型表达盒的细胞由于强的NFκB活性而产生高水平的GFP(参见图2)。无GES对照细胞不表达可检测水平的GFP。截止第19天，GES T细胞几乎完全静息，且GFP表达显著低于第5天(～1/8MFI)，这是因为NFκB活性较低。在第19天仍观察到GFP表达，这可能是由于GFP蛋白的长半衰期(～30小时)，或通过例如TCR、CAR、细胞因子受体或生长因子受体信号的NFκB活性的基础水平。
实施例3：用于在修饰的T-细胞中的抗-BCMA CAR-介导的GFP表达的NF-KB诱导型 载体
T细胞是未修饰的(模拟T细胞)或用表达在EF1a启动子控制下的抗-BCMA CAR和DHFR突变蛋白基因的piggyBac载体以及不存在(无基因表达系统(GES)对照)或存在驱动正向取向(pNFKB-GFP正向)或反向取向(pNFKB-GFP反向)的GFP表达的NF-KB诱导型表达系统进行核转染。在具有或不具有氨甲蝶呤选择(模拟T细胞)的情况下，将所有细胞培养22天，直到细胞几乎完全静息为止。然后在不存在(无刺激)或存在BCMA-(K562)、BMCA+(RPMI8226)或阳性对照抗-CD3抗-CD28活化试剂(CD3/28刺激)的情况下刺激细胞3天。在所有条件下由无GES对照或模拟T细胞都不可检测GFP表达。然而，虽然当与BCMA-K562细胞一起培养时，pNFKB-GFP正向和反向转座的细胞比起无刺激对照来显示少量GFP表达，但它们均在有BCMA+肿瘤细胞的情况下或在阳性对照条件下显示了基因表达的引人注目的上调(图3)。在与BCMA+肿瘤细胞共培养的pNFKB-GFP正向和反向转座的细胞之间几乎没有观察到GFP表达中的差异。
实施例4：在修饰的T-细胞中的抗-BCMA CAR-介导的表达的控制
诱导型基因的表达水平可以通过在诱导型启动子上游或之前的应答元件的数目来调节。T细胞用piggyBac载体进行核转染，所述piggyBac载体编码抗-BCMA CARTyrin再加上选择基因，两者均在人EF1a启动子控制下(图4)。进一步地，载体另外编码驱动截短的CD19蛋白(dCD19)表达的条件性NF-KB诱导型基因表达系统，并包括从0到5不等的许多NFKB应答元件(RE)，无GES(无GES)，或接受电穿孔脉冲但没有piggyBac核酸(模拟)。仅显示了关于反向(相反)方向/取向的GES的数据。所有细胞培养18天，并包括使用氨甲蝶呤添加对于piggyBac-修饰的T细胞的选择。然后使用抗-CD3抗-CD28珠活化试剂刺激细胞3天，并在第0、3和18天通过FACS评估dCD19表面表达，并且将数据显示为FACS直方图和靶蛋白染色的MFI。在第0天，在用编码GES的载体转座的所有T细胞中都检测到了低水平的表面dCD19表达。在刺激后3天，对于所有表达GES的T细胞，观察到dCD19表达的引人注目的上调，而在具有更高数目的REs的那些中，表面表达的增加倍数更大。因此，表面dCD19表达与GES中编码的REs的数目成正比。在不带有GES的T细胞表面未检测到dCD19：无GES和模拟对照。
实施例5：人因子IX在修饰的T-细胞中的表达
因子IX中的遗传缺陷(图5)导致了一种称为血友病B的威胁生命的疾病。血友病B是一种罕见的疾病，其影响1/25,000-1/30,000的人。在本公开内容的组合物和方法的开发之前，对于血友病B的标准治疗包括以每年约$250,000为代价每2-3天输注重组因子IX蛋白。
T细胞在人中维持几十年，且因此是分泌因子IX的理想载体，从而在无需频繁输血的情况下供应血友病B患者中失去的因子IX。用PiggyBac转座T细胞以分泌因子IX。使用FACS检查编码人因子IX转基因的转基因T细胞的T细胞标记时(图6)。这些修饰的T细胞能够分泌人因子IX(图7A)，并且这种分泌的因子IX提供了凝固活性(图7B)。
实施例6：装甲的T-细胞上的限制点信号传导蛋白的击倒效率
产生装甲的T-细胞的另一种策略是通过表达具有改变的或不存在的细胞内信号传导结构域的各种修饰的/嵌合的限制点受体来降低或抑制内源限制点信号传导。产生装甲的T-细胞的一种机制是抑制限制点信号传导是敲除各种限制点受体。Cas-CLOVERTM平台用于靶向和敲除静息(或静止)原代全T细胞中的限制点受体PD-1、TGFβR2、LAG-3、Tim-3和CTLA-4。如通过流式细胞术所测量的，基因编辑导致在细胞表面的蛋白表达的30-70％丧失(图10)。这些结果表明，Cas-CLOVERTM能够有效靶向这些基因的敲除，从而导致T-细胞表面上靶蛋白表达的丧失。通过进一步最优化指导RNA对，或通过使用靶向相同基因和/或靶基因的调节子或启动子的额外的指导RNA对，可显著提高敲除效率。
实施例7：用于在装甲的T-细胞上表达无效或转换细胞内信号传导蛋白的策略
产生装甲的T-细胞的另一种策略是通过表达具有改变的或不存在的细胞内信号传导结构域的各种修饰的/嵌合的限制点受体来降低或抑制内源限制点信号传导。可以使用这个策略靶向的限制点信号包括T-细胞的PD-1或TGFβRII，其分别结合PD-L1配体和TGFβ细胞因子。图11显示了用于产生两种不同抑制性受体(PD-1(上图)和TGFβRII(下图))的诱饵/无效/显性失活受体(无效受体)的各种策略的示意图。为了设计无效受体，可以将PD1或TGFβRII的细胞内结构域(ICD)突变(突变的无效)或缺失(截短的无效)。结果，无效受体的一种或多种关联配体的结合不导致限制点信号至T-细胞的递送。此外，因为无效受体与野生型受体竞争与一种或多种内源配体的结合，所以任何由所述无效受体的结合都将掩蔽一种或多种内源配体与野生型受体结合。这导致有效递送至T-细胞的限制点信号传导的总水平稀化，从而因此降低或阻断限制点抑制。图11也显示了抑制性受体PD-1(上图)和TGFβRII(下图)的转换受体设计策略。在转换受体中，野生型ICD被来自免疫刺激分子(共刺激转换)或不同的抑制性分子(抑制性转换)的ICD置换。免疫刺激分子包括但不限于CD3z、CD28、4-1BB和表2中列出的实例。抑制性分子包括但不限于CTLA4、PD1、Lag3和表2中列出的实例。在前一种情况下，由修饰的转换受体对内源配体的结合导致阳性信号向T-细胞的递送，从而有助于增强T-细胞的刺激，从而促进肿瘤靶向和杀伤的继续。在后一种情况下，由修饰的转换受体对内源配体的结合导致阴性信号向T-细胞的递送，从而有助于降低T-细胞的刺激和活性。
实施例8：增强PD1和TGFβRII无效或转换细胞内信号传导蛋白在装甲的T-细胞上 的表面表达
为了产生装甲的T-细胞，设计了许多截短的表达替换的信号肽(SP)和跨膜结构域(TM)的无效受体，并测试了它们在修饰T-细胞表面上的最大表达。图12显示了PD-1(上图)和TGFβRII(下图)的几种无效受体构建体的示意图。修饰这些蛋白的细胞外结构域(ECD)，从而使得野生型信号肽(SP)和/或跨膜结构域(TM)被置换为来自人T细胞CD8a受体的结构域(红色箭标)。图12所示的六个截短的无效构建体的每一个被DNA合成，且然后亚克隆到mRNA IVT DNA载体(pRT)中。对于每一个都通过IVT产生了高质量的mRNA。使用电穿孔(EP)递送到原代人T细胞中进行编码六种分子中的每一种的mRNA的转染，并在EP后24小时进行FACS分析，以评价每种构建体在细胞表面上的表达水平(图13)。通过流式细胞术，用替换的CD8a置换WT SP(02.8aSP-PD-1和02.8aSP-TGFβRII)导致在T细胞表面的最高水平表达。02.8aSP-PD-1无效受体表现出43,680的MFI，其是内源T细胞PD-1表达的177-倍和WT PD-1无效受体的2.8-倍。02.8aSP-TGFβRII无效受体表现出13,809的MFI，其是内源T细胞TGFβRII表达的102-倍和WT TGFβRII无效受体的1.8-倍。这些结果表明，对于PD1和TGFβRII抑制性蛋白两者，用替换的CD8a SP置换野生型SP导致无效或转换受体增强的表面表达。这本身又将分别使在结合一种或多种天然配体时限制点抑制或共刺激达到最大。
引入作为参考
除非明确地排除或以其他方式限制，否则本文引用的每个文件，包括任何相互参照的或相关的专利或申请，均特此整体引入本文作为参考。任何文件的引用并非承认其是相对于本文公开或请求保护的任何发明的现有技术，或者其单独或与任何其他一种或多种参考文件组合教导、提示或公开了任何这种发明。进一步地，在这个文件中术语的任何含义或定义与引入作为参考的文件中相同术语的任何含义或定义冲突的意义上，以在这个文件中赋予给那个术语的含义或定义为准。
其他实施方案
尽管已经举例说明和描述了本公开内容的特定实施方案，但是在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以做出各种其他改变和修改。所附权利要求的范围包括在本公开内容的范围内的所有这种改变和修改。

Claims (132)

1.组合物，其包含
(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，和
(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体的序列，
其中，在将(a)的构建体和(b)的构建体整合到细胞的基因组序列中时，表达所述外源受体，并且
其中所述外源受体在结合配体时转导细胞内信号，所述细胞内信号靶向(a)的诱导型启动子以修饰基因表达。
2.权利要求1的组合物，其中所述(b)的外源受体包括非天然存在的受体。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述非天然存在的受体是合成的、修饰的、重组的、突变的或嵌合的受体。
4.权利要求1-3任一项的组合物，其中所述非天然存在的受体包含分离或衍生自T-细胞受体(TCR)的一个或多个序列。
5.权利要求1-4任一项的组合物，其中所述非天然存在的受体包含分离或衍生自支架蛋白的一个或多个序列。
6.权利要求1-5任一项的组合物，其中所述非天然存在的受体包含跨膜结构域。
7.权利要求1-6任一项的组合物，其中所述非天然存在的受体与转导细胞内信号的细胞内受体相互作用。
8.权利要求1-6任一项的组合物，其中所述非天然存在的受体包含细胞内信号传导结构域。
9.权利要求1-8任一项的组合物，其中所述非天然存在的受体是嵌合配体受体(CLR)。
10.权利要求9的组合物，其中所述CLR是嵌合抗原受体。
11.权利要求9或10的组合物，其中所述嵌合配体受体包含：
(a)包含配体识别区的胞外域，其中所述配体识别区至少包含支架蛋白；
(b)跨膜结构域，和
(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内域。
12.权利要求11的组合物，其中所述(a)的胞外域进一步包含信号肽。
13.权利要求11或12的组合物，其中所述(a)的胞外域进一步包含在所述配体识别区和所述跨膜结构域之间的铰链。
14.权利要求12或13的组合物，其中所述信号肽包括编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR信号肽的序列。
15.权利要求12或13的组合物，其中所述信号肽包括编码人CD8α信号肽的序列。
16.权利要求15的组合物，其中所述信号肽包含包含MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ IDNO：17000)的氨基酸序列。
17.权利要求15或16的组合物，其中所述信号肽由包含atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca(SEQ ID NO：17001)的核酸序列编码。
18.权利要求11-17任一项的组合物，其中所述跨膜结构域包括编码人CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR跨膜结构域的序列。
19.权利要求11-17任一项的组合物，其中所述跨膜结构域包括编码人CD8α跨膜结构域的序列。
20.权利要求19的组合物，其中所述跨膜结构域包含包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：17002)的氨基酸序列。
21.权利要求19或20的组合物，其中所述跨膜结构域由包含atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc(SEQ ID NO：17003)的核酸序列编码。
22.权利要求11-21任一项的组合物，其中所述所述胞内域包括人CD3ζ胞内域。
23.权利要求11-22任一项的组合物，其中所述至少一个共刺激结构域包括人4-1BB、CD28、CD3ζ、CD40、ICOS、MyD88、OX-40细胞内区段或其任何组合。
24.权利要求11-22任一项的组合物，其中所述至少一个共刺激结构域包括人CD3ζ和/或4-1BB共刺激结构域。
25.权利要求23或24的组合物，其中所述所述CD3ζ共刺激结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含
Figure FPA0000288251460000031
26.权利要求25的组合物，其中所述CD3ζ共刺激结构域由包含以下序列的核酸序列编码
Figure FPA0000288251460000032
27.权利要求23或24的组合物，其中所述4-1BB共刺激结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含
Figure FPA0000288251460000033
28.权利要求27的组合物，其中所述4-1BB共刺激结构域由包含以下序列的核酸序列编码
Figure FPA0000288251460000034
29.权利要求24-28任一项的组合物，其中所述4-1BB共刺激结构域位于跨膜结构域和CD3ζ共刺激结构域之间。
30.权利要求11-29任一项的组合物，其中所述铰链包括衍生自人CD8α、IgG4和/或CD4序列的序列。
31.权利要求11-29任一项的组合物，其中所述铰链包括衍生自人CD8α序列的序列。
32.权利要求30或31的组合物，其中所述铰链包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含
Figure FPA0000288251460000035
33.权利要求32的组合物，其中所述铰链由包含以下序列的核酸序列
Figure FPA0000288251460000041
或包含以下序列的核酸序列
Figure FPA0000288251460000042
编码。
34.权利要求11-33任一项的组合物，其中所述至少一种蛋白支架特异性结合所述配体。
35.权利要求11-33任一项的组合物，其中所述至少一种蛋白支架包括抗体、抗体片段、单结构域抗体、单链抗体、抗体模拟物或Centyrin。
36.权利要求11-33任一项的组合物，其中所述配体识别区包括抗体、抗体片段、单结构域抗体、单链抗体、抗体模拟物和Centyrin中的一种或多种。
37.权利要求35或36的组合物，其中所述单结构域抗体包括VHH或由VHH组成。
38.权利要求35或36的组合物，其中所述抗体模拟物包括affibody、affiilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer，Kunitz结构域肽或monobody或由其组成。
39.权利要求35或36的组合物，其中所述Centyrin包含至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列或由其组成。
40.权利要求39的组合物，其中所述至少一种纤连蛋白III型(FN3)结构域衍生自人蛋白。
41.权利要求40的组合物，其中所述人蛋白是生腱蛋白-C。
42.权利要求39-41任一项的组合物，其中所述共有序列包含
Figure FPA0000288251460000043
43.权利要求39-41任一项的组合物，其中所述共有序列包含
Figure FPA0000288251460000044
44.权利要求39-43任一项的组合物，其中所述共有序列在以下内的一个或多个位置处被修饰：
(a)包含在共有序列的位置13-16处的氨基酸残基TEDS或由其组成的A-B环；
(b)包含在共有序列的位置22-28处的氨基酸残基TAPDAAF或由其组成的B-C环；
(c)包含在共有序列的位置38-43处的氨基酸残基SEKVGE或由其组成的C-D环；
(d)包含在共有序列的位置51-54处的氨基酸残基GSER或由其组成的D-E环；
(e)包含在共有序列的位置60-64处的氨基酸残基GLKPG或由其组成的E-F环；
(f)包含在共有序列的位置75-81处的氨基酸残基KGGHRSN或由其组成的F-G环；或
(g)(a)-(f)的任何组合。
45.权利要求39-44任一项的组合物，其包含至少5种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
46.权利要求39-44任一项的组合物，其包含至少10种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
47.权利要求39-44任一项的组合物，其包含至少15种纤连蛋白III型(FN3)结构域的共有序列。
48.权利要求39-47任一项的组合物，其中所述支架以选自小于或等于10-9M、小于或等于10-10M、小于或等于10-11M、小于或等于10-12M、小于或等于10-13M、小于或等于10-14M和小于或等于10-15M的KD的至少一种亲和力结合抗原。
49.权利要求48的CAR，其中所述KD由表面等离振子共振测定。
50.权利要求1-49任一项的组合物，其中所述(b)的编码组成型启动子的序列包括编码EF1α启动子的序列。
51.权利要求1-49任一项的组合物，其中所述(b)的编码组成型启动子的序列包括编码CMV启动子、U6启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、人β肌动蛋白启动子、CAG启动子或EF1α启动子的序列。
52.权利要求1-51任一项的组合物，其中所述(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码NFKB启动子的序列。
53.权利要求1-51任一项的组合物，其中所述(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码干扰素(IFN)启动子的序列或编码白细胞介素-2启动子的序列。
54.权利要求53的组合物，其中所述干扰素(IFN)启动子是IFNγ启动子。
55.权利要求1-51任一项的组合物，其中所述(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码NR4A1启动子的序列或编码NR4A1启动子的序列。
56.权利要求1-51任一项的组合物，其中所述(a)的编码诱导型启动子的序列包括编码CD5启动子的序列或编码CD5启动子的序列。
57.权利要求1-56任一项的组合物，其中所述转基因包含就细胞的基因组序列而论内源的序列。
58.权利要求1-56任一项的组合物，其中所述转基因包含就细胞的基因组序列而论外源的序列。
59.权利要求58的组合物，其中所述外源序列是细胞基因组内的内源序列的序列变体。
60.权利要求58的组合物，其中所述外源序列是细胞中完全或部分不存在的基因的野生型序列，并且其中所述基因完全存在于健康细胞的基因组中。
61.权利要求58的组合物，其中所述外源序列是就细胞的基因组而论合成的、修饰的、重组的、嵌合的或非天然存在的序列。
62.权利要求57-61任一项的组合物，其中所述转基因编码分泌的蛋白。
63.权利要求62的组合物，其中所述分泌的蛋白以治疗有效的水平从细胞中产生和/或分泌以在需要其的主体中治疗疾病或病症。
64.权利要求1-63任一项的组合物，其中第一转座子包含所述(a)的诱导型转基因构建体，且第二转座子包含所述(b)的受体构建体。
65.权利要求64的组合物，其中第一载体包含所述第一转座子，且第二载体包含所述第二转座子。
66.权利要求1-63任一项的组合物，其中载体包含所述第一转座子和所述第二转座子。
67.权利要求1-61任一项的组合物，其中转座子包含所述(a)的诱导型转基因构建体和所述(b)的受体构建体。
68.权利要求67的组合物，其中载体包含所述转座子。
69.权利要求67或68的组合物，其中所述(a)的诱导型转基因构建体和所述(b)的受体构建体以相同方向取向。
70.权利要求65或66的组合物，其中所述(a)的诱导型转基因构建体和所述(b)的受体构建体不以相同方向取向。
71.权利要求70的组合物，其中所述(a)的诱导型转基因构建体和所述(b)的受体构建体以相反方向取向。
72.权利要求65-71任一项的组合物，其中所述载体是质粒或纳米质粒。
73.权利要求65-72任一项的组合物，其中所述转座子是piggyBac、Sleeping Beauty、Helraiser或Tol2转座子。
74.权利要求65-72任一项的组合物，其中所述转座子是piggyBac转座子。
75.权利要求64-74任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含质粒或纳米质粒，其包含编码转座酶的序列。
76.权利要求75的组合物，其中所述编码转座酶的序列是mRNA序列。
77.权利要求76的组合物，其中所述转座酶是piggyBac转座酶。
78.权利要求77的组合物，其中所述piggyBac转座酶包含包含SEQ ID NO：17029的氨基酸序列。
79.权利要求77或78的组合物，其中所述piggyBac转座酶是高活性变体，并且其中所述高活性变体包含在SEQ ID NO：17029的位置30、165、282和538中的一个或多个处的氨基酸取代。
80.权利要求79的组合物，其中在SEQ ID NO：17029的位置30处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对异亮氨酸(I)的取代(I30V)。
81.权利要求79的组合物，其中在SEQ ID NO：17029的位置165处的氨基酸取代是丝氨酸(S)对甘氨酸(G)的取代(G165S)。
82.权利要求79的组合物，其中在SEQ ID NO：17029的位置282处的氨基酸取代是缬氨酸(V)对甲硫氨酸(M)的取代(M282V)。
83.权利要求79的组合物，其中在SEQ ID NO：17029的位置538处的氨基酸取代是赖氨酸(K)对天冬酰胺(N)的取代(N538K)。
84.权利要求78-83任一项的组合物，其中所述转座酶是Super piggyBac(SPB)转座酶。
85.权利要求84的组合物，其中所述Super piggyBac(SPB)转座酶包含包含SEQ ID NO：17030的氨基酸序列。
86.权利要求64-85任一项的组合物，其中所述第一转座子和/或第二转座子进一步包含选择基因。
87.权利要求86的组合物，其中所述选择基因包括neo、DHFR(二氢叶酸还原酶)、TYMS(胸苷酸合成酶)、MGMT(O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、广谱抗药基因(MDR1)、ALDH1(醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C(RAD51种内同源基因C)、GCS(葡糖神经酰胺合酶)、NKX2.2(NK2同源异型框2)或其任何组合。
88.权利要求86的组合物，其中所述选择基因包括DHFR。
89.权利要求64-88任一项的组合物，其中所述第一转座子和或第二转座子包含诱导型胱天蛋白酶多肽，其包含
(a)配体结合区，
(b)接头，和
(c)截短的胱天蛋白酶9多肽，
其中所述诱导型胱天蛋白酶多肽不包含非人序列。
90.权利要求89的组合物，其中所述非人序列是限制酶切位点。
91.权利要求89或90的组合物，其中所述配体结合区诱导型胱天蛋白酶多肽包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽。
92.权利要求91的组合物，其中所述FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽的氨基酸序列包含在序列的位置36处的修饰。
93.权利要求91的组合物，其中所述修饰是在位置36处缬氨酸(V)对苯丙氨酸(F)的取代(F36V)。
94.权利要求91-93任一项的组合物，其中所述FKBP12多肽由包含以下的氨基酸序列编码：
Figure FPA0000288251460000091
95.权利要求94的组合物，其中所述FKBP12多肽由包含以下的核酸序列编码：
Figure FPA0000288251460000092
96.权利要求89-95任一项的组合物，其中所述诱导型促凋亡多肽的接头区由包含GGGGS(SEQ ID NO：17014)的氨基酸编码。
97.权利要求96的组合物，其中所述诱导型促凋亡多肽的接头区由包含GGAGGAGGAGGATCC(SEQ ID NO：17015)的核酸序列编码。
98.权利要求89-97任一项的组合物，其中所述诱导型促凋亡多肽的截短的胱天蛋白酶9多肽由不包含在序列的位置87处的精氨酸(R)的氨基酸序列编码。
99.权利要求89-98任一项的组合物，其中所述诱导型促凋亡多肽的截短的胱天蛋白酶9多肽由不包含在序列的位置282处的丙氨酸(A)的氨基酸序列编码。
100.权利要求89-99任一项的组合物，其中所述诱导型促凋亡多肽的截短的胱天蛋白酶9多肽由包含以下的氨基酸编码：
Figure FPA0000288251460000093
101.权利要求100的组合物，其中所述诱导型促凋亡多肽的截短的胱天蛋白酶9多肽由包含以下的核酸序列编码：
Figure FPA0000288251460000101
102.权利要求89-101任一项的组合物，其中所述诱导型促凋亡多肽由包含以下的氨基酸序列编码
Figure FPA0000288251460000102
103.权利要求102的组合物，其中所述诱导型促凋亡多肽由包含以下的核酸序列编码
Figure FPA0000288251460000103
Figure FPA0000288251460000111
104.权利要求64-103任一项的组合物，其中所述第一转座子和/或第二转座子包含至少一种自切割肽。
105.权利要求104的组合物，其中所述至少一种自切割肽包括T2A肽、GSG-T2A肽、E2A肽、GSG-E2A肽、F2A肽、GSG-F2A肽、P2A肽或GSG-P2A肽。
106.权利要求105的组合物，其中所述至少一种自切割肽包括T2A肽。
107.权利要求105或106的组合物，其中所述T2A肽包含包含EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQID NO：17020)的氨基酸序列。
108.权利要求105或106的组合物，其中所述GSG-T2A肽包含包含GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：17021)的氨基酸序列。
109.权利要求105或106的组合物，其中所述E2A肽包含包含QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：17022)的氨基酸序列。
110.权利要求105或106的组合物，其中所述GSG-E2A肽包含包含GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：17023)的氨基酸序列。
111.权利要求105或106的组合物，其中所述F2A肽包含包含VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：17024)的氨基酸序列。
112.权利要求105或106的组合物，其中所述GSG-F2A肽包含包含GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：17025)的氨基酸序列。
113.权利要求105或106的组合物，其中所述P2A肽包含包含ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQID NO：17026)的氨基酸序列。在
114.权利要求105或106的组合物，其中所述GSG-P2A肽包含包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：17027)的氨基酸序列。
115.权利要求104-114任一项的组合物，其中，所述至少一种自切割肽放在
(a)选择基因和诱导型转基因构建体或
(b)诱导型转基因构建体和诱导型胱天蛋白酶多肽之间的位置。
116.权利要求104-115任一项的组合物，其中，所述至少一种自切割肽放在
(a)选择基因和报道分子构建体或
(b)报道分子构建体和诱导型胱天蛋白酶多肽之间的位置。
117.包含权利要求1-116任一项的组合物的细胞。
118.在细胞中诱导条件性基因表达的方法，包括：
(a)在适合于允许将诱导型转基因构建体整合到细胞基因组中和表达外源报道分子的条件下，使所述细胞与权利要求1-117任一项的组合物接触，和
(b)使外源受体和与其特异性结合的配体接触，以转导靶向诱导型启动子的细胞内信号，从而修饰基因表达。
119.权利要求118的方法，其中所述细胞是体内、先体外后体内、体外或原位的。
120.权利要求118或119的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
121.权利要求120的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤(NK)样细胞、造血祖细胞、外周血(PB)衍生的T细胞或脐带血(UCB)衍生的T细胞。
122.权利要求121的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。
123.权利要求118-122任一项的方法，其中所述细胞是自体的。
124.权利要求118-122任一项的方法，其中所述细胞是同种异体的。
125.权利要求118-122任一项的方法，其中适合于允许将诱导型转基因构建体整合到细胞基因组中和表达外源报道分子的条件包括体内条件。
126.权利要求118-122任一项的方法，其中适合于允许将诱导型转基因构建体整合到细胞基因组中和表达外源报道分子的条件包括基本类似于人体内部温度的温度、基本类似于人体内部CO2水平的CO2水平、基本类似于人体内部O2水平的O2水平、具有基本类似于人体内部电解质水平的电解质水平的水或盐环境。
127.权利要求118-122任一项的方法，其中所述配体是非天然存在的。
128.在有此需要的主体中治疗疾病或病症的方法，包括
在适合于允许将诱导型转基因构建体整合到细胞基因组中和表达外源报道分子的条件下向所述主体施用权利要求1-115任一项的组合物，和
施用外源受体所选择性结合的配体，
其中所述配体与所述外源受体的结合转导细胞内信号，以靶向控制所述转基因的诱导型启动子，其中所述转基因被表达，且其中所述转基因的产物对治疗所述疾病或病症是治疗有效的。
129.权利要求128的方法，其中所述转基因的产物是分泌的蛋白。
130.权利要求129的方法，其中所述分泌的蛋白是凝血因子。
131.权利要求130的方法，其中所述凝血因子是因子IX。
132.权利要求128-131任一项的方法，其中所述疾病或病症是凝固病症。
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