CN101195657B - 一个i型细胞因子受体样分子及其编码基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个I型细胞因子受体样分子及其编码基因。该I型细胞因子受体样分子是下述氨基酸残基序列之一:1)序列表中的SEQ ID NO:1;2)将序列表中SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有将细胞阻抑于G0/G1期,降低S期细胞比例功能的蛋白质。本发明的I型细胞因子受体样分子及其编码基因既可作为潜在的肿瘤诊断标记使用,也可以其为活性成分制备成I型神经纤维瘤、胰腺肿瘤及其它相关肿瘤的治疗性药物,将在医学及制药领域发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞因子受体样分子及其编码基因与应用,特别是涉及一个I型细胞因子受体样分子及其编码基因与其在制备抑制细胞增殖的治疗性基因药物中的应用。
背景技术
纤维结合素III型(FNIII)结构域是许多蛋白分子(如细胞黏附与迁移分子、细胞受体分子、生长因子受体分子、蛋白酪氨酸磷酸酶等)的重要结构域(C.W.Ward,Members of the insul in receptor fami ly contain three fibronect in typeIIIdomains,Growth Factors16(1999)315-322)。FNIII结构域最早是在牛的纤维结合素中发现的(T.E.Petersen,H.C.Thogersen,K.Skorstengaard,K.Vibe-Pedersen,P.Sahl,L.Sottrup-Jensen,S.Magnusson,Partial primarystructure of bovine plasma fibronect in:three types of internal homology,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80(1983)137-141)。该结构域在典型的纤维结合素分子中是一个长约100个氨基酸残基、有15次重复的同源单位。纤维结合素蛋白与其异源二聚体形式的整合素受体的特异性结合主要依赖于靠近纤维结合素蛋白羧基端的第10个FNIII结构域(FNIII10)内的细胞黏附基序,即精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸结构域(RGD),及其附近的FNIII9结构域中的协同位点(M.A.Arnaout,S.L.Goodman,J.P.Xiong,Coming to grips with integrin binding toligands,Curr.Opin.Cell.Biol.14(2002)641-651)。RGD结构域不仅存在于纤维结合素中,它也存在于许多整合素受体家族蛋白的特异性配体中,其中包括纤维蛋白原、胶原、玻璃体结合蛋白、冯威特布兰特因子、内动蛋白、韧粘素、外加某些黏附蛋白等(E.Ruoslahti,RGD and other recognition sequences for integrins,Annu.Rev.CellDev.Biol.12(1996)697-715)。虽然如此,目前估计仅有5-6%的RGD蛋白属于膜蛋白或分泌型蛋白,而自然界存在的大多数RGD蛋白主要分布在细胞内(G.K.Papadopoulos,C.Ouzounis,E.El iopoulos,RGD sequences in several receptorproteins:novel cell adhesion function of receptors,Int.J.Biol.Macromol.22(1998)51-57)。
I型细胞因子受体超家族蛋白的特点是受体的胞外区分布有一个细胞受体同源区(CRH)。典型的CRH结构由两个反向平行的FNIII结构域组成,每个FNIII结构域又 由7个β折叠片构成桶状结构。在第一个FNIII结构域靠近蛋白氨基末端的位置通常会有四个半光氨酸残基,而保守的WSXWS基序位于第二个FNIII结构域的羧基端,即靠近细胞膜的区域。通常认为,CRH的功能主要是参与受体的二聚化,与特异性配体的相互作用,以及受体跨膜区的信号转导等。
发明内容
本发明的目的是提供一种可将细胞阻抑于G0/G1期,降低S期细胞比例的I型细胞因子受体样分子。
本发明所提供的I型细胞因子受体样分子,名称为CRLF-p48(简称p48或h-p48),来源于人属人(Homo sapiens),是下述氨基酸残基序列之一:
1)序列表中的SEQ ID NO:1;
2)将序列表中SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有将细胞阻抑于G0/G1期,降低S期细胞比例功能的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO:1由438个氨基酸残基组成,自氨基端(N端)第76-261位氨基酸残基为纤维结合素III型(FNIII)结构域,自氨基端第255-259位氨基酸残基为WSPWS基序,自氨基端第249-253位氨基酸残基为RGD回文序列,自氨基端第216-230位氨基酸残基为酪氨酸硫化位点(N-snhfedvYvgsetef-C),自氨基端第292-295位氨基酸残基为单一的N糖基化位点。
所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基,其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
编码本发明I型细胞因子受体样分子的基因(CRLF-p48,简称p48或h-p48),其cDNA是下述核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQ ID NO:2的DNA序列;
2)编码序列表中SEQ ID NO:1的DNA序列;
3)与序列表中SEQ ID NO:2限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有将细胞阻抑于G0/G1期,降低S期细胞比例功能的核苷酸序列;
4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO:2由1317个碱基组成,其编码序列为自5’端第1-1317位碱基,编码具有序列表中SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列的蛋白质,自5’端第226-783位碱基编码纤维结合素III型(FNIII)结构域,自5’端第763-777位碱基编 码WSPWS基序,自5’端第745-759位碱基编码RGD回文序列,自5’端第646-690位碱基编码酪氨酸硫化位点(N-snhfedvYvgsetef-C),自5’端第874-885位碱基编码N糖基化位点。
含有本发明基因的各种表达载体、稳定细胞系、转基因动物及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增CRLF-p48中任一片段的引物对也是本发明要保护的。
本发明的另一个目的是提供一种在细胞水平调控细胞从G1期进入到S期的方法。
本发明所提供的在细胞水平调控细胞从G1期进入到S期的方法,是将所述I型细胞因子受体样分子基因CRLF-p48或将该基因小干扰RNA的编码基因导入宿主细胞,导致宿主细胞被阻抑于G0/G1期或G0/G1期阻抑被解救,细胞进入到S期。
所述I型细胞因子受体样分子基因CRLF-p48的小干扰RNA,是正义链为序列表中SEQ ID NO:3的核苷酸序列,反义链为序列表中SEQ ID NO:4的双链RNA序列。
将上述双链RNA序列命名为si-p48。si-p48的反义链与CRLF-p48mRNA第836-856位置序列5’-gguacagucugagcagucgaa-3’互补,序列表中SEQID NO:3由21个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端,序列表中SEQ ID NO:4由21个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端。
所述I型细胞因子受体样分子基因小干扰RNA的编码基因,其有义链(正义链)(不做模板的DNA链)可为序列表中的SEQ ID NO:5或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO:5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列;反义链(做模板的DNA链)可为序列表中的SEQ ID NO:6或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO:6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC),0.1%SDS的溶液中,在65℃下杂交并洗膜。
序列表中SEQ ID NO:5由53个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端;序列表中SEQ ID NO:6由57个碱基组成,序列的方向从左至右为3′端→5′端。
所述宿主细胞可为(但不仅限于)293T细胞、CAP1、Cos7、CAM、BEL-7402或HepG2细胞等。
所述I型细胞因子受体样分子基因CRLF-p48可通过各种转染及重组病毒感染的方法导入宿主细胞。
本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的药物。
本发明所提供的抑制肿瘤细胞增殖的药物,其活性成分为所述I型细胞因子受体样蛋白分子CRLF-p48或其编码基因CRLF-p48。
所述CRLF-p48可存在于真核表达载体中。
需要的时候,在上述药物中还可以加入一种或多种基因药物可接受的载体。所述基因药物载体包括(但不仅限于)携带基因的载体,如脂质体、重组病毒载体等;携带蛋白质的载体,如(但不仅限于)其它的蛋白或多肽成分,也包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明的药物可以与抗生素、免疫刺激剂等进行组合治疗。
上述药物的用量一般为10-50μg CRLF-p48(或200-1200μg携带CRLF-p48的质粒/kg体重/day,疗程为7-20天。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为人p48基因的染色体定位及基因结构
图2为人p48基因编码蛋白的生物信息学分析结果
图3为人p48蛋白的跨膜区分析结果
图4为人p48及其主要同源蛋白的序列比对分析结果
图5为人p48及其主要同源蛋白的进化树分析结果
图6为人p48蛋白的亚细胞器定位结果
图7为人p48基因在肿瘤细胞系及正常组织中表达情况的RT-PCR检测结果
图8为检测过量表达p48基因对G0/G1期和S期细胞比例的影响
图9为检测过量表达EGFP-p48融合基因对G0/G1期和S期细胞比例的影响
图10为Western Blotting及RT-PCR检测si-p48对p48基因的抑制效应
图11为用特异性siRNA(si-p48)抑制内源性p48基因表达后细胞周期变化的检测结果
图12为p48基因表达水平与G1-S期相关调控基因表达水平的关系的RT-PCR检测结果
图13为p48介导的cyclin D1上调与STAT3和RAS/MAPK信号通路关系的检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,具体步骤可参见:《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W., Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rdedition,2001,NY,Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工合成。
实施例1、I型细胞因子受体样分子基因CRLF-p48cDNA的克隆
收集约5×106个人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞,用1mL TRIzol(Invitrogen公司)处理,再加入150μl氯仿,混合后离心取上清,加入等量的异丙醇沉淀,得到人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞的总RNA。取1μg K562细胞的总RNA为模板,在引物P1(上游引物):5′-tatagtcgaccatggagctggagcctgagct-3′和P2(下游引物):5′-tatactcgagctaaaacactaacactttcc-3′的引导下,用一步法反转录-聚合酶链式反应(one step RT-PCR)试剂盒(Takara公司)反转录合成CRLF-p48(简称p48或h-p48)的全长cDNA,反转录反应条件为:先50℃45分钟;然后94℃30秒,58℃30秒,72℃90秒,共35个循环,最后72℃10分钟。反应结束后,对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度约1317bp的目的片段并对其进行纯化,将回收片段连接入到T-A载体pGEM-Teasy(Promega公司)中,再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提质粒,得到含有回收片段的重组质粒,命名为pGEM-T-p48,对其进行测序,测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO:2的核苷酸序列,由1317个碱基组成,其编码序列为自5’端第1-1317位碱基,编码具有序列表中SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列的蛋白质。
实施例2、p48基因组基因及其编码蛋白的生物信息学及同源性分析
一、p48基因组基因的生物信息学分析
将本发明的p48基因在NCBI基因组序列数据库中进行序列比对分析,分析结果表明p48基因位于人17号染色体的q11.2区域,与I型神经纤维瘤病的NF1基因比邻(见图1中的图A),并且,p48的基因组基因存在两种剪接异构体形式p48-1和p48-2(GenBank号分别为:AF120151和AF046059)。为了揭示p48基因的基因组结构,用这两种剪接异构体的mRNA构建了一个共同的cDNA序列,该共同序列包含两种剪接异构体mRNA的所有序列信息。用该共同的cDNA序列在NCBI人基因组数据库中进行BLAST比对分析,得到了p48基因组基因在染色体17q11.2上外显子与内含子的分布与结构,如图1中的图B所示,p48的基因组基因至少由13个外显子组成,分布于长约73kb的染色体区域,在p48基因组基因的5’端所进行的选择性剪接可产生两种不同的剪接异构体,即p48-1和p48-2。p48-1和p48-2编码蛋白序列基本相同,差异仅为p48-2的氨基端较p48-1多出4个氨基酸残基(MRGA)。在外显子1和外显子5 上各有一个蛋白质翻译的ATG起始位点,选择性剪接使p48-1使用第二个ATG起始位点,而p48-2则使用第一个位点。
二、p48蛋白的生物信息学分析
将p48的氨基酸残基序列在NCBI蛋白质数据库中进行同源性比对分析,分析结果如图2所示,p48氨基酸序列自氨基端(N端)第76位的精氨酸(Arg176)至261位的脯氨酸(Pro261)为一个典型的纤维结合素III型(FNIII)结构域,该结构域与瘦素(leptin)受体、催乳素(prolactin)受体和白细胞介素23受体具有显著的同源性。在FNIII结构域的羧基端,即从255位的色氨酸(Trp255)到259位的丝氨酸(Ser259),有一个典型的WSPWS基序,该基序为I类细胞因子受体超家族成员胞外区常见的结构。在WSPWS基序的上游存在一个旋转对称的RGD回文序列。PROSITE分析结果显示自氨基端第216位的丝氨酸(Ser216)至第230位的苯丙氨酸(Phe230)的序列为一个典型的酪氨酸硫化位点(N-snhfedvYvgsetef-C),自氨基端第292位的天冬氨酸(Asn292)到295位的谷氨酸(Glu295)是一个单一的N糖基化位点。用Dense Alignment Surface(DAS)软件未预测出p48蛋白具有跨膜结构,说明该蛋白是一个在胞内表达的蛋白质(结果见图3,纵坐标为:跨膜区分值,横坐标为:氨基酸的相对位置;loose cutoff表示:宽松的域值,strict cutoff表示:严谨的域值)。
三、p48及其同源蛋白的序列分析
利用BLASTP程序在NCBI蛋白质数据库中搜索出数个本发明人源p48(h-p48)蛋白的同源蛋白,包括鼠源p48(m-p48),人源CRLF3(hCRLF3),鼠源CRLF3(mCRLF3),非洲爪蟾CRLF3-prov蛋白,斑马鱼LOC550515蛋白及黑青斑河豚的I型细胞因子受体,这些蛋白的Genbank号依次为AAD31759.1、NP_057070、NP_061246、AAH45226、AAH92800和AAR25665.1。用ClustalW程序对以上蛋白序列进行比对分析,结果如图4所示,h-p48分别与m-p48、hCRLF3、mCRLF3、非洲爪蟾CRLF3-prov(Xenopus laevis)、斑马鱼LOC550515(Danio rerio)及黑青斑河豚(Tetraodon nigrovridis)的I型细胞因子受体在氨基酸水平上有93%、99%、92%、70%、66%和60%的序列一致性,并且这些蛋白的FNIII结构域,RGD、WSXWS基序,以及酪氨酸硫化位点均呈现较高的保守性,预示该类蛋白质在脊椎动物中很有可能行使相似的功能。用TreeTop软件对h-p48及其相关蛋白进行进化树分析,结果如图5所示,h-p48与两栖类动物(如非洲爪蟾)的同源蛋白在进化上的亲缘关系要比与水生鱼类的近。
实施例3、p48基因的亚细胞器定位及组织细胞的表达与分布情况检测
一、p48基因的亚细胞器定位及其在细胞内的分布情况检测
1、含有p48与GFP融合基因的真核表达载体的构建
用限制性内切酶Sal I和Xho I对实施例1构建的含有p48的重组质粒pGEM-T-p48进行双酶切,将酶切后释放的438bp的p48全长cDNA片段亚克隆到经SalI单酶切的线性化载体pCMV-Myc(购自Clontech公司)中,得到含有p48的真核表达载体,命名为pCMV-Myc-p48。以pCMV-Myc-p48为模板,在引物P3:
5′-tatagtcgaccatggagctggagcctgagct-3′和P4:5′-taggtaccgtaaacactaacactttcc-3′的引导下,PCR扩增不含终止密码子的p48基因。反应结束后,对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收目的片段并对其进行纯化,将回收片段用限制性内切酶SalI和Kpn I双酶切后与经XhoI和Kpn I双酶切的载体pEGFP-N1(购自Clontech公司)连接,得到含有p48与GFP(绿色荧光蛋白)融合基因(EGFP-p48)的真核表达载体,命名为pEGFP-p48。
2、p48基因的亚细胞定位及其在细胞内的分布情况检测
用下述两种方法观察p48在细胞内的表达及分布情况,具体方法如下:
1)采用共聚焦显微镜直接观察p48与GFP融合基因在活细胞中的表达情况
将人胚肾细胞系293T、人肝癌细胞系BEL-7402、和人乳腺癌细胞系CAM均按5×106/mL的接种量铺于35mm培养皿中,待细胞覆盖80%时,采用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)将2μg的pEGFP-p48质粒DNA转入培养的单层细胞中,以pEGFP-N1空载体为对照,转染48小时后,在共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果如图6中的图A所示(b,d,f为对照),EGFP-p48融合蛋白主要在293T、BEL-7402和CAM的细胞浆中表达。
2)采用免疫染色方法观察p48在细胞内定位
将5×106/mL的Cos7细胞铺于35mm培养皿中,待细胞覆盖80%时,采用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将2μg的pCMV-Myc-p48质粒DNA转入Cos7细胞,转染48小时后,用4%甲醛固定20分钟,然后用0.5%的TritonX-100孵育15分钟,再加入鼠源抗Myc单克隆抗体(购自Santa Crutz公司),洗脱后,加入TRITC标记的山羊抗鼠抗体(购自Santa Crutz公司)孵育至少35min,最后,在激发波长为568nm的条件下用共聚焦显微镜观察Cos7细胞中p48蛋白的表达情况。结果如图6中的图B所示(DAPI为:4-6-二氨基-2-苯基吲哚,anti-Myc为:抗Myc标签抗体,Merged为:重叠),p48蛋白不仅在细胞浆中分布,在细胞核中也大量表达。
二、半定量RT-PCR法检测p48基因在不同细胞系及正常组织中的分布情况
用半定量RT-PCR法检测p48基因在不同细胞系及正常组织中的分布情况,具体方法为:共使用11种细胞系,即人胚肾细胞系293T、人胰腺癌细胞系CAP1、人肝癌 细胞系HepG2、鼠髓性瘤细胞系J558、人慢性粒细胞白血病细胞系K562、人喉癌细胞系Hep2、人肺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系CAM、人胃腺癌细胞系SGC-7901、EB病毒转化的B细胞系3D5和人肝癌细胞系BEL-7402(均购自中国医学科学院基础医学研究所的细胞中心)。正常人血单个核细胞(PBMC)经淋巴细胞分离液(鼎国生物公司)分离获得。上述每种细胞各收集约5×106个,分别进行如下处理:用1mL TRIzol处理,加入150μl氯仿,混合后离心取上清,加入等量的异丙醇沉淀,得到总RNA。正常人组织(包括肾[kid]、脑[bra]、脾[spl]和肺[lung])的总RNA购自陕西超英生物公司。取1μg总RNA并以此为模板,在引物P5(上游引物):
5′-AACGTTGATTACCAGTTCAG-3′和P6(下游引物):5′-CTGAGGACAGCTACGTTAGA-3′的引导下,用一步法反转录-聚合酶链式反应试剂盒反转录合成p48基因的cDNA片段,以β-actin基因为内参(扩增引物序列为5’-cacactgtgcccatctacga-3’和5’-ctgcttgctgatccacatct-3’),反转录反应条件为:先50℃45分钟;然后94℃30秒,58℃30秒,72℃90秒,共35个循环,最后72℃10分钟。反应结束后,对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图7所示(泳道M为DNA Marker),除了CAP1和J558细胞外,p48基因在其它所有受检的组织和细胞中均有表达,说明p48在多种组织细胞中具有普遍表达的趋势。
实施例4、检测过量表达p48基因对细胞周期的影响
用不同量(0μg、1μg、3μg)的pCMV-Myc-p48质粒瞬式转染293T细胞。转染剂量不足3μg的,用pCMV-Myc质粒补足到3μg。转染48小时后,用胰酶消化所转染的细胞单层,并制备单细胞悬液。将1×107细胞用70%乙醇-20℃固定至少1小时,用0.5μg/mLRNaseA酶消化15分钟,加入50μg/mL的碘化丙啶(PI)染色10分钟,用流式细胞仪对处于不同细胞周期的细胞数量进行分析。结果如图8所示,随着pCMV-Myc-p48转染剂量的增加,被阻抑在G0/G1期的细胞数目也在增加,而进入S期的细胞数目则显著减少。具体来讲,将转染剂量由0μg增加到1μg,再增加到3μg,相对应的G0/G1期细胞比例则从58.5±4.16%增加到64.3±2.81%(P>0.05),再增加到68.2±1.88%(P<0.05);而S期细胞比例则显著下降,从35.4±2.56%降到31.2±1.16%(P<0.05),再降到21.1±4.29%(P<0.01)。上述结果说明,p48基因产物在G1-S期转换过程中发挥抑制作用。因此,p48基因很有可能是一个新型的抑癌基因,通过调控细胞周期特别是G1-S期,来达到阻抑细胞过度增殖的目的。
为进一步核实p48基因将细胞阻抑于G0/G1期以及对S期细胞比例下降的作用,将pEGFP和pEGFP-p48分别转染293T细胞。转染48小时后,收获细胞,PI染色,用 流式细胞仪检测PI及绿色荧光蛋白(EGFP)双阳性细胞的细胞周期变化。结果如图9所示,过量表达pEGFP-p48可使细胞在G0/G1期发生阻抑,同时显著抑制S细胞比例(将图9中的图A)。与转染pEGFP的细胞相比,过量表达pEGFP-p48可使G0/G1期细胞比例由29.5±1.77%(EGFP)显著增加到40.9±1.37%(EGFP-p48);而S期细胞比例则由69.4±2.55%(EGFP)下降到52±1.85%(EGFP-p48)(将图9中的图B)。该结果进一步证明p48基因确实对细胞的G0/G1期有明显的阻抑作用。
实施例5、检测用p48特异性RNA干扰载体抑制内源性p48表达对S期细胞比例的影响
一、p48特异性RNA干扰载体的构建
1、p48特异性小RNA干扰的设计
根据p48mRNA序列以及pBS/U6载体(Sui GC et al.PNAS.2002April;99(8):5515-5520)中U6启动子的特殊要求,得到一对抑制p48表达的小干扰RNA,命名为si-p48,作用于p48mRNA的第836-856核苷酸位置序列
5’-gguacagucugagcagucgaa-3’。
2、根据所设计的siDNA1和siDNA2序列合成4条寡核苷酸,序列如下(下划线碱基序列为针对p48mRNA的靶序列):
O1a:5’-ggtacagtctgagcagtcgaa-3’
O1b:5’-agctttcgactgctcagactgtacc-3’;
O2a:5’-agctttcgactgctcagactgtaccctttttg-3’
O2b:5’-aattcaaaaagggtacagtctgagcagtcgaa-3’。
ggtacagtct gagcagtcga aagctttcga ctgctcagac tgtacccttt ttg
将上述2对寡核苷酸片段两两之间进行退火:即O1a与O1b,O2a与O2b互混合,沸水煮5min,然后自然冷却至室温。用限制性内切酶ApaI充分消化pBS/U6,以酚/氯仿抽提纯化DNA后,加入Klenow及四种dNTP在37℃下作用约1h,补平粘性末端,跑1.0%琼脂糖凝胶电泳回收并纯化质粒DNA,再以过量HindIII酶切消化质粒DNA,再次跑1.0%琼脂糖凝胶电泳回收并纯化质粒DNA。将酶切处理的pBS/U6与退火的寡核苷酸双链1a1b按一定比例(1:20或1:40)室温连接过夜(12-24小时),得到含有1a1b的重组载体,命名为pBS/U6-si-p48-1a1b。再用Hind III和EcoRI双酶切载体pBS/U6-si-p48-1a1b,跑1.0%琼脂糖凝胶电泳回收并纯化大片段的载体DNA,将回收的载体片段与退火的寡核苷酸双链DNA2a2b按1:20比例室温连接过夜,得到p48特异性RNA干扰载体,命名为pBS/U6-si-p48。
二、检测用p48特异性RNA干扰载体抑制内源性p48表达对S期细胞比例的影响
将pBS/U6-si-p48瞬式转染293T细胞,检测在抑制内源性p48基因表达后,细胞周期的变化,方法如下:
1、检测si-p48对p48基因的抑制效应
1)Western Blotting检测si-p48对p48基因的抑制效应
首先用Western Blotting法检测si-p48对p48基因的抑制效应,具体方法为:将不同剂量的pBS/U6-si-p48(0μg,0.5μg,4.5μg)分别与等量的pCMV-Myc-p48质粒(2μg)共转染293T细胞,48小时后,收取细胞裂解液,每个剂量的转染细胞取10μg总蛋白质,跑10%SDS-PAGE分离后转到硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences)上,然后分别以鼠源抗Myc标签的单克隆抗体为一抗(购自Santa Cruz公司)进行杂交,以荧光素标记的羊源抗鼠抗体(Amersham Biosciences UK Limited)为二抗,最后用ECL化学发光的底物(Amersham Biosciences)进行杂交信号放大,同时以β-actin为内参(检测用一抗为抗β-actin(α-β-actin)的单克隆抗体(购自Santa Cruz公司),二抗为荧光素标记的羊源抗鼠抗体(Amersham Biosciences UK Limited))。检测结果如图10中的图A所示(“+”表示添加,“—”表示未添加),si-p48对过量转染的p48基因的具有明显的剂量抑制效应。
2)RT-PCR检测si-p48对p48基因的抑制效应
将不同剂量的pBS/U6-si-p48(0μg,1μg,3μg)转染293T细胞,转染48小时后,收获细胞总RNA,采用RT-PCR方法(引物P5和P6(见实施例3))检测内源性p48基因的表达情况,同时以β-actin基因为内参。检测结果如图10中的图B所示(泳道1和2为未转染pBS/U6-si-p48的细胞内p48基因的表达水平,泳道3-5为pBS/U6-si-p48转染量为1μg的细胞内p48基因的表达水平,泳道6-8为pBS/U6-si-p48转染量为3μg的细胞内p48基因的表达水平),结果表明过量转染pBS/U6-si-p48可显著抑制内源性p48基因的表达水平,并且这种抑制作用呈现剂量依赖性,且si-p48对p48基因表达的抑制是具有基因特异性的。
2、检测在抑制内源性p48基因表达后细胞周期的变化
用不同剂量的pBS/U6-si-p48(0μg,1μg,3μg)转染293T细胞以抑制内源性p48基因表达,转染48小时后用与实施例4相同的方法对处于不同细胞周期的细胞数量进行分析,以检测抑制内源性p48基因表达后细胞周期的变化。细胞周期分析结果如图11所示,抑制内源性p48基因表达后,G0/G1期细胞比例明显降低,同时S期细胞比例增加(见图11中的图A)。细胞比例的统计学分析结果见图11中的图B,用低剂量si-p48(1μg)抑制内源性p48基因表达可显著增加S期细胞比例,可从45.5±1.79 %(0μg)提升到51.4±1.50%(1μg,P<0.01),但高剂量si-p48(3μg)对S期细胞比例的影响不明显,即从45.5±1.79%(0μg)到48.0±3.63%(3μg,P>0.05);但是G0/G1期细胞比例却随si-p48转染剂量的增加而显著降低,即从49.6±1.22%(0μg)降到42.3±2.94%(1μg,P<0.01),或降到44.8±2.09%(3μg,P<0.01)。上述检测结果表明,用si-p48抑制内源性p48基因的表达可在一定程度上解除p48介导的G0/G1期阻抑,导致进入S期的细胞比例增加。
实施例6、RT-PCR检测过量p48基因表达水平与G1-S期相关调控基因表达水平的关系
1)首先,用RT-PCR方法检测G1-S期的调控基因Cycl inD1(GenBank号:BC014078),CyclinD2(GenBank号:BC089384)和CyclinD3(GenBank号:NM_001760)在CAP1和293T细胞中的表达水平,方法为:每种细胞各收集约5×106个,用1mLTRIzol(Invitrogen公司)处理,加入150μl氯仿,混合后离心取上清,加入等量的异丙醇沉淀,得到总RNA。然后以总RNA为模板,用与实施例3中相同的RT-PCR的方法检测两种细胞中p48基因,CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3基因的表达水平,其中,检测CyclinD1基因的引物序列为5’-atggaacaccagctcct-3’和5’-aggaagttgttggggct-3’,检测CyclinD2基因的引物序列为5’-atggagctgctgtgcca-3’和5’-tctttcggcccaactgg-3’,检测Cyc l inD3基因的引物序列为5’-atggagctgctgtgttg-3’和5’-agtccacttcagtgcca-3’,同时以β-actin基因为内参。检测结果见图12中的图A,在Capl细胞内检测不到p48基因的表达,也检测不到CyclinD1,CyclinD2和CyclinD3基因的表达;相反,在293T细胞中有较高水平内源性p48基因的表达,同时,在293T细胞中,内源性CyclinD1,CyclinD2和CyclinD3基因也呈高表达的趋势。
2)将pCMV-Myc-p48过量转染CAP1,以pCMV-Myc空载体转染的CAP1细胞为对照,用RT-PCR方法检测转染前后细胞G1-S期相关基因CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3、CDK4(GenBank号:NM_000075)、CDK6(GenBank号:BC052264)、P21(GenBank号:S67388)和P27(GenBank号:AY004255)基因的表达水平,其中,检测CDK4基因的引物序列为5’-tctcccttgatctgagaatg-3’和5’-agatacagccaacactccac-3’,检测CDK6基因的引物序列为5’-tcaggttgtttgatgtgtgc-3’和5’-tcagaagtaggtctttgcct-3’,检测P21基因的引物序列为5’-aaggtcagttccttgtgga-3’和5’-ttagggcttcctcttggaga-3’,检测P27基因的引物序列为5’-agatgtcaaacgtgcgagtg-3’和5’-gtgcttatacaggatgtcca-3’,同 时以β-actin基因为内参。检测结果见图12中的图B和图C(泳道Myc为pCMV-Myc空载体转染的CAP1细胞),在pCMV-Myc空载体转染的CAP1细胞中,除仅有CyclinD2基因微弱表达外,控制G1-S转换的诸多基因,如CyclinD1,CyclinD3,CDK4,CDK6,P21和P27均没有明显表达;而在p48基因过量表达的CAP1细胞中,CyclinD1、CyclinD3和CDK6基因均上调表达。上述检测结果表明p48介导的G0/G1期阻抑及S期细胞比例的下降是与CyclinD1等基因的上调表达而非下调相关的。
实施例7、检测p48介导的cyclin D1上调与STAT3和RAS/MAPK信号通路的关系
p48介导的cyclin D1上调有可能受以下两种信号通路控制:即RAS/MAPK信号通路与STAT3信号通路。为增加检测的灵敏性,将0、1、3、6微克的pCMV-Myc-p48分别与等量的Ras显性正(RasG12V)质粒(120ng,Terada K et al.,J Biol Chem.1995Nov17;270(46):27880-6.)混合后共转染293T细胞。转染48小时后,裂解细胞,收取细胞裂解液。每个剂量的转染细胞总蛋白各取10μg,跑10%SDS-PAGE分离后转到硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences)上,然后分别以鼠源抗Myc标签(α-Myc)、抗ERK(α-ERK)、抗磷酸化ERK(α-p-ERK)、抗CyclinD1(α-CyclinD1)、抗STAT3(α-Stat3)、抗磷酸化STAT3(α-p-Stat3)及抗β-actin(α-β-actin)的单克隆抗体为一抗(购自Santa Cruz公司)进行杂交,以荧光素标记的羊源抗鼠抗体(Amersham Biosciences UK Limited)为二抗,最后用ECL化学发光的底物(AmershamBiosciences)进行杂交信号放大。检测结果如图13所示(“+”表示添加,“—”表示未添加),p48介导的cyclin D1上调不影响细胞内ERK的磷酸化水平,说明cyclinD1的上调不受RAS/MAPK信号通路的控制;与此相反,在细胞内过量表达p48基因,可显著激活STAT3蛋白,并且,增加p48的转染量,STAT3磷酸化水平呈现递增的趋势,说明p48可通过激活STAT3信号通路上调cyclin D1的表达。
以上通过实施例具体说明了本发明。本领域技术人员从中还可以了解,通过在核酸序列中造成核苷酸的适当的改变,或通过体外合成所需的多肽,可以制备本发明蛋白p48的氨基酸序列突变体。此类突变体包括序列中的氨基酸残基的缺失、插入或替代。所得的治疗性突变体蛋白质的活性可比野生型p48蛋白高,也可以降低。在合成过程中或合成后被不同修饰的多肽同样属于本发明的范围,例如,通过(但不局限于)生物素化、泛素化、苄化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行衍生化、蛋白水解裂解、连接抗体分子或其它细胞配体等。这些修饰可以增强或降低本发明的蛋白质的稳定性和/或生物学活性。
本发明提供了一个I型细胞因子受体样分子CRLF-p48及其编码基因。该I型细胞因子受体样分子自氨基端第176位精氨酸(Arg176)至261位的脯氨酸(Pro261)区域含有一个典型的纤维结合素III型(FNIII)结构域,并且在该结构域的羧基端呈现一个旋转对称的RGD回文序列和一个WSXWS基序。同源性分析结果表明,该蛋白及其编码基因在不同脊椎动物中呈现高度保守的趋势。此外,CRLF-p48在多种正常组织及肿瘤细胞系中均普遍表达,并很有可能是一个新型的抑癌基因,通过抑制G1-S期的转换来调控细胞的增殖。实验证明,在人胚肾细胞系293T中过量表达CRLF-p48,可使细胞阻止在G0/G1期,导致S期细胞比例显著下降;利用RNA干扰技术抑制内源性CRLF-p48基因的表达可显著降低G0/G1期细胞的比例;CRLF-p48介导的G1-S期阻抑与周期素CyclinD1、CyclinD3和CDK6的上调有关,并且,周期素CyclinD1的上调很有可能是由于STAT3信号通路而非RAS/MAPK信号通路的激活所致。本发明的I型细胞因子受体样分子CRLF-p48及其编码基因既可作为潜在的肿瘤诊断标记使用,也可以其为活性成分制备成I型神经纤维瘤、胰腺肿瘤及其它相关肿瘤的治疗性基因或重组蛋白药物,将在医学及制药领域发挥重要作用,应用前景广阔。此外,抑制本发明I型细胞因子受体样分子基因表达的小干扰RNA也可作为针对野生型或突变衍生型p48基因表达的抑制剂,可将细胞阻抑于G0/G1期,降低S期细胞比例,或解救G0/G1期阻抑,使进入S期的细胞比例增加,用于制备正反两方面的治疗肿瘤的核酸药物,或用于商业性(如生物公司出售的)的研究细胞周期及肿瘤治疗的试剂与研究工具。
序列表
<160>6
<210>1
<211>438
<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>1317
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>2
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
<210>5
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
<210>6
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
Claims (3)
1.序列表中SEQ ID NO:1表示的I型细胞因子受体样分子的编码基因在制备具有将细胞阻抑于G0/G1期,降低S期细胞比例功能的活性物质中的应用。
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述基因为序列表中SEQ ID NO:2的DNA序列。
3.一种体外抑制细胞由G1期进入到S期转换的方法,是将权利要求2所述的DNA序列导入宿主细胞,宿主细胞被阻抑于G0/G1期或G0/G1期。
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PIANTADOSI S.等.A model of tumor growth based on cell cycle kinetics.MATHEMATICAL BIOSCIENCES第66卷.1983,第66卷第283-306页,见全文. * |
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