CN104372021A - 人白细胞介素-2蛋白质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种人白细胞介素2(IL-2)蛋白质的制备方法，通过在人类胚肾细胞293F细胞内表达重组人类白细胞介素-2(IL-2)基因进行制备，其步骤如下：IL-2基因的克隆、IL-2蛋白表达筛选、IL-2蛋白质纯化以及IL-2内毒素检测。本发明的方法可以大剂量提纯精制其表达的融合蛋白产物，可进行严格的质量控制且有着非常强的实用性。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种白细胞介素-2蛋白质的制备方法，该方法采用在人类胚肾细胞293F细胞内表达重组人类DNA制备蛋白的技术，具有通用性，特别是表达的质粒设计。
背景技术
人白细胞介素-2，简称人白介素-2，英文简称IL-2，又名T细胞生长因子，英文简写为TCGF。人白介素-2早在1976年就被发现在激活的淋巴细胞的培养液中，人的蛋白序列的在1983年得以确定，是由153个氨基酸构成，其中含有20的氨基酸的信号肽在N端。T淋巴细胞受到抗原或有丝分裂原的刺激释放由133个氨基酸组成的分子量为16kDa的糖基化白介素-2蛋白，历经三十多年的研究，人白介素-2分子通过它的受体调节T淋巴细胞的形成和平衡，在肿瘤治疗中起着非常关键的作用。目前的蛋白质制备，在全球范围内多数是把重组人类DNA表达在细菌内，然后从细菌里制备其表达的蛋白。其好处是成本低方法简单容易，但缺点是制备的蛋白有诸多方面的缺欠。人类蛋白应该在人类细胞中制备以符合人类自身的需求，但方法难、产量低一直困扰着人们对它的渴求，本方法可以大量制备在人类细胞中表达的IL-2人类蛋白，可以进行质量控制，有着极强的实用性。
发明内容
本发明突破了重组人类DNA在人类细胞中表达制备蛋白质产量低的技术瓶颈，提供了质粒结构的设计和制备方法。通常的方法在1升的培养液中只能制备出不到1毫克的IL-2蛋白，本发明可高达57.6毫克，方法可行，质量可控，实用性极强。
因此，本发明的目的是提供一种可进行严格的质量控制且有非常强的实用性的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法。
为了实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，包括如下步骤：
1)IL-2基因的克隆
先通过PCR扩增连接物(KSS)和IL-2片段，然后利用琼脂糖凝胶回收PCR片段KSS和IL-2，与pTT5连接、转染到细菌内，经培养挑取菌落做PCR，根据PCR结果测序，最后将正确的pTT5-KSS-IL-2进行克隆，提取质粒；
2)IL-2蛋白质表达筛选
先进行人类胚肾细胞293F细胞瞬时转染优化实验，通过测定其蛋白在瞬时转染293F细胞中的表达量，筛选出高表达的条件，进行IL-2蛋白的表达；
3)IL-2蛋白质的纯化精制
对目标IL-2蛋白质进行分离纯化，并对其进行定量分析；
4)IL-2内毒素检测
将步骤3)中纯化后的IL-2进行内毒素含量的检测。
进一步地，所述步骤1)中PCR扩增KSS片段和IL-2片段所用的引物为：IL-2-1F，序列如SEQ ID NO：1所示，IL-2-1R，序列如SEQ ID NO：2所示，IL-2-2F，序列如SEQ ID NO：3所示，IL-2-2R，序列如SEQ ID NO：4所示以及表达质粒的设计中引物为：人工序列pTT5-KSS-IL-2，序列如SEQID NO：5所示。
进一步地，所述步骤1)中所述PCR反应条件为：在体系1中98℃预变性3min后进行98℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于16℃。
进一步地，步骤1)中连接和转化pTT5-KSS-IL-2的步骤是将pTT5、KSS、IL-2、5X Enzyme Buffer以及10X Enzyme Mix的连接反应体系混匀，在室温下放置30min，将感受态细胞置于冰上溶化后加入8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混匀，冰上孵育30min；然后在42℃下准确热激30s，立刻立即转移至冰上放置2min；再加入250ul室温的SOC培养基，在37℃，200rpm的条件下孵育1h；最后取100ul细胞均匀涂布于LB平板(100ug/ml Amp)上，在37℃培养箱中培养过夜，观察平板上细胞生长情况。
进一步地，步骤1)中琼脂糖凝胶电泳检测菌落通过PCR结果进行显示，所用引物为pTT5-F和pTT5-R，所述的PCR反应条件为：在体系1中94℃预变性10min后进行94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，进入体系2中进行30个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于16℃。
进一步地，所述步骤2)中以最佳IL-2蛋白进行表达的步骤是先对人类胚肾细胞293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须≥90％；然后将所述的293F细胞密度调整至1×106，接种到玻璃三角细胞培养瓶内；再进行细胞的瞬时转染实验，具体为分别取相应量的质粒与聚乙烯亚胺(PEI)混匀，室温孵育5min，加入接种293F细胞的三角细胞培养；最后将转染后的细胞放置在二氧化碳培养箱中培养，在37℃，二氧化碳浓度8％，摇床转速170rpm/min的条件下，培养7天，收细胞悬液，进行蛋白纯化。
进一步地，步骤3)中所述的分离纯化步骤是先将层析系统和层析柱处理好，然后再进行层析纯化，通过电泳检测纯化结果，纯化中的条件为离心样品速度4700rpm/min，在4℃条件下离心40min，采用0.22um滤膜进行无菌过滤，上样流速5ml/min。
进一步地，步骤4)中所述的内毒素检测步骤是先取100ul准备好的标准品和样品用加到去内毒素的管中，加100ul的鲎试剂到每个管中，盖上盖子，混匀，放入37℃恒温孵箱中45min；然后加100ul显色基质到每个管中，混匀，放入37℃恒温孵箱中6min；再加不同的500ul颜色稳定剂到每个管中，混匀；最后从每个管中取100ul液体加到酶标板中，用读板机在545nm的波长下读板，利用内毒素标准曲线，计算出样品内毒素含量。
由于采用以上技术方案，本发明的有益效果包括：
本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法是可以在人类胚肾细胞(HEK293)内表达重组人类白细胞介素-2基因并可以大剂量提纯精制其表达产物(融合蛋白质)的一种方法，其可进行严格的质量控制且有着非常强的实用性。
附图说明
图1为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中PCR扩增KSS和IL-2片段的结果显示图，其中M表明DNA片段分子量的大小，泳道1-2是KSS的PCR产物，泳道3为IL-2的PCR产物；
图2为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中pTT5-KSS-IL-2连接鉴定的PCR结果显示图，其中M表明DNA片段分子量的大小，泳道1-6为pTT5-KSS-IL-2的PCR产物；
图3为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中琼脂糖凝胶电泳检测菌落实验1#菌液(pTT5-KSS-IL-2#1)测序比对结果；
图4为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中蛋白在瞬时转染293F细胞中表达量检测实验电泳检测图，其中M表示蛋白质分子量大小，C是对照组，泳道左1-6表示细胞培养液的上清液，泳道右1-6表示通过Nickel浓缩的细胞培养液的上清液，B表示白蛋白；
图5为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中IL-2蛋白质纯化中的层析图谱；
图6为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中电泳检测纯化的电泳检测图，其中M表示蛋白质分子量大小，泳道1-14表示从层析柱流出的精制蛋白质；
图7为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中SDS-Page电泳检测蛋白纯度的电泳检测图；以及
图8为本发明提供的人白细胞介素-2蛋白质的制备方法中内毒素标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面通过具体的实验来对本发明进行解释。
实施例1：人白细胞介素-2(IL-2)目的基因的克隆
1)连接物(KSS)、人白细胞介素-2(IL-2)片段的扩增
所用材料如下：
引物(生工生物工程(上海)股份有限公司，北京合成部)：
IL-2-1F，序列如SEQ ID NO：1所示，IL-2-1R，序列如SEQ ID NO：2所示，IL-2-2F，序列如SEQ ID NO：3所示以及IL-2-2R，序列如SEQ ID NO：4所示
超保真PCR Master Mix
dNTP(2.5mM)(TaKaRa)
PCR扩增KSS片段的实验步骤是：先按照反应体系，配制PCR反应液：PCR混合液100ul、H2O 64ul、5X HF buffer 20ul、dNTP(2.5mM)6ul、IL-2-1F(10umol)4ul、IL-2-1R(10umol)4ul、Phusion超保真DNA聚合酶1ul、Template：KSS-IL-2(100ng/ul)1ul，然后进行PCR扩增，反应条件为：在体系1中98℃预变性3min后进行98℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于16℃；
PCR扩增IL-2片段的实验步骤是：先按照反应体系，配制PCR反应液PCR混合液100ul、H2O 64ul、5X HF buffer 20ul、dNTP(2.5mM)6ul、IL-2-2F(10umol)4ul、IL-2-2R(10umol)4ul、Phusion超保真DNA聚合酶1ul、Template：IL-2(100ng/ul)1ul，然后进行PCR扩增，反应条件为：在体系1中98℃预变性3min后进行98℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸45s，进入体系2中进行30个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于16℃。
通过上述实验操作，成功的完成了KSS片段和IL-2片段的扩增，结果见图1。
2)琼脂糖凝胶回收PCR片段KSS、IL-2
采用琼脂糖1*TAE buffer琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收操作，所得琼脂糖凝胶回收片段浓度：
KSS浓度:15.2ng/ul OD260/OD280:1.95
KSS-IL-2浓度:6.8ng/ul OD260/OD280:1.87
3)连接和转染pTT5-KSS-IL-2
所用材料如下：
琼脂糖凝胶回收载体片段pTT5
琼脂糖凝胶回收片段KSS
琼脂糖凝胶回收片段IL-2
SOC培养基
LB平板(Amp)
Seamless Cloning and Assembly Kit(Invitrogen)
步骤如下：
先准备连接反应体系：pTT5(79.9ng/ul)1.50ul、KSS(15.2ng/ul)2.75ul、IL-2(14.9ng/ul)2.75ul、5X Enzyme Buffer 2.00ul、10X Enzyme Mix 1.00ul；轻轻混匀上述连接体系，在室温下放置30min，将OneTOP10感受态细胞置于冰上溶化后加入8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混匀，冰上孵育30min；然后在42℃下准确热激30s，立即转移至冰上放置2min；再加入250ul室温的SOC培养基，在37℃，200rpm的条件下孵育1h；最后取100ul细胞均匀涂布于LB平板(100ug/ml Amp)上，在37℃培养箱中培养过夜，观察平板上细胞生长情况。
通过上述实验，平板生长情况次日可见。
4)通过PCR检测连接和转染，并挑取菌落制备质粒DNA测序和克隆
LB液体培养基(100ug/ml Amp)
引物pTT5-F(生工生物工程(上海)股份有限公司，北京合成部)
pTT5-R(生工生物工程(上海)股份有限公司，北京合成部)
2*Taq MasterMix(北京康为世纪生物技术有限公司)
步骤如下：
先在每个平板挑取6个单菌落进行菌落PCR，同时接入1.5ml环氧树脂(EP)管中，在37℃，200rpm的条件下培养6h；然后进行菌落PCR，鉴定载体pTT5与DNA片段KSS-IL-2的连接，其中PCR反应体系为：菌落、2*Taq MasterMix 10ul、引物pTT5-F 1ul、引物pTT5-R 1ul、ddH2O 8ul，反应条件为：在体系1中94℃预变性10min后进行94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，进入体系2中进行30个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于16℃。
如图2所述，通过上述琼脂糖凝胶电泳检测菌落实验，PCR结果1-6显示载体pTT5与DNA片段KSS-IL-2全部连接到位。pTT5-KSS-IL-2正确序列如SEQ ID NO：5所示。选取上述pTT5-KSS-IL-2#1菌液进行测序，结果如图3所示。
5)正确的pTT5-KSS-IL-2进行克隆，提取质粒
在150ml LB液体培养基(100ug/ml Amp)中分别接入pTT5-KSS-IL-2克隆的甘油菌，在37℃，200rpm条件下过夜培养；采用PureYieldTMPlasmidMindi Systern试剂盒进行提取质粒，所得pTT5-KSS-IL-2浓度为：
128.8ng/ul OD260/OD280:1.93
实施例2：IL-2蛋白表达筛选
1)293F细胞瞬时转染条件的优化实验
所用材料如下：
质粒样品经0.22um过滤器过滤除菌，用Nanodrop 2000测定浓度；
Freestyle 293F细胞，Invitrogen，Cat#R790-07；
Freestyle 293F细胞表达培养基，Invitrogen，Cat#2338-02；
Polyethylenimine(PEI)，Polysciences，Cat#23966,1mg/ml:将500mg的PEI粉末溶于450mL DDH2O中，用HCL将其pH值调至7.0，加入DDH2O定容体积至500mL，0.22um过滤器过滤除菌，分装成每管10mL，-80℃冻存备用；
0.22um过滤器，Sartorius，17597；
6孔细胞培养板，NUNU，Cat#，140675；
二氧化碳培养箱，SANYO，MCO-20AIC，ID#为BINC010；
托盘摇床，IKA，KS260basic，ID#为BOSC015；
pH计，梅特勒-托利多，FE20，ID#为BPHM001；
Nanodrop 2000，Thermo，ID#为BNOP001。
步骤如下：
先对人类胚肾细胞293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须≥90％；然后将293F细胞密度调整至1×106/ml，接种6孔细胞培养板，4ml/孔；按下表1的优化方案进行细胞瞬时转染实验，具体操作为分别取相应量的质粒与聚乙烯亚胺(PEI)混匀，室温孵育5min，再取相应的体积加入到6孔细胞培养板对应的孔内将转染后的细胞放置在二氧化碳培养箱中培养，37℃，二氧化碳浓度8％，摇床转速170rpm/min的条件下，培养7天，收细胞悬液，待检测目的蛋白的表达量。
表1 IL-2蛋白的表达优化条件
| 样品号 | DNA剂量(ug/ml) | DNA:PEI比例 | 转染后收获时间(天) | 细胞密度 |
| 1 | 0.5 | 1:3 | 7 | 1×106/ml |
| 2 | 1 | 1:3 | 7 | 1×106/ml |
| 3 | 1.5 | 1:3 | 7 | 1×106/ml |
| 4 | 0.5 | 1:4 | 7 | 1×106/ml |
| 5 | 1 | 1:4 | 7 | 1×106/ml |
| 6 | 1.5 | 1:4 | 7 | 1×106/ml |
2)蛋白在瞬时转染293F细胞中的表达量检测实验
所用药品如下：
待检测细胞悬液；
Protein G-agarose,Roche,Cat#，H243233001；
电泳上样缓冲液，北京赛驰公司，Cat#，370009-S1；
30％Acrglamide，北京莱宝科技有限公司，Cat#，A1010；
TEMED，Sigam-Aldrich，T22500；
Tris，Amresco，0497；
过硫酸铵，Amresco，0191；
甘氨酸，Amresco，0167；
十二烷基硫酸钠(SDS)，Amresco，0227；
考马斯亮蓝，Amresco，0449；
EDTA，Amresco，0322；
乙酸，北京化工厂；
乙醇，北京化工厂；
磷酸三钠，北京化工厂；
所用仪器如下：
离心机，Thermo scientific，Legend RT，ID#,BCEN002；
pH计，梅特勒-托利多，FE20，ID#为BPHM001；
托盘摇床，智诚，ZHWY-304，ID#，BOSC021；
电泳装置，北京六一仪器厂，DYY-TC，ID#，BTR0003；
凝胶成像系统，BINTA，2020D，ID#，BGEL001；
微波炉，格兰仕，CH218，ID#，BOVE003；
纯水系统，PALL CascadaTM Bio，综合型，ID#，BUPW001；
电子天平，精天，JA10002，ID#，BBAL003。
试剂配制如下：
洗涤缓冲液(50mM Na3PO4，0.3M NaCL，10mM咪唑，pH 8.0)：称取8.19g Na3PO4，17.5g NaCL，0.68g咪唑，溶于950ml纯水中，用HCL将pH值调节到8.0，加水定容至1000ml，备用。
1.5M Tris，pH8.8：称取Tris 90.75g，溶于400ml纯水中，用HCL将pH值调节到8.8，加水定容至500ml。
1.0M Tris，pH6.8：称取Tris 121.1g，溶于400ml纯水中，用HCL将pH值调节到6.8，加水定容至500ml。
10％SDS溶液：称取10g SDS溶于100ml纯水中，备用。
10％过硫酸铵：称取10g SDS溶于100ml纯水中，分装-20℃保存备用。
10X电泳缓冲液：30g Tris，144g甘氨酸，10g SDS，溶于1000ml纯水中，室温保存备用，使用时取100ml稀释到1000ml，备用。
考马斯蓝染色液：2g考马斯亮蓝，400ml甲醇，100ml乙酸，加纯水定容至1000ml，备用。
脱色液：100ml乙醇，100ml乙酸，加800ml纯水，混匀备用。
12％分离胶：3.3ml纯水，4.0ml 30％Acrglamide，2.5ml 1.5MTris(pH8.8)，0.1ml 10％SDS溶液，0.1ml 10％过硫酸铵，0.04ml TEMED，灌胶至凝固。
浓缩胶：2.7ml纯水，0.67ml 30％Acrglamide，0.5ml 1.0M Tris(pH6.8)，0.05ml 10％SDS溶液，0.05ml 10％过硫酸铵，0.002ml TEMED，灌胶至凝固。
步骤如下：
从6孔细胞培养板的每个孔内收集293F细胞悬液，分别转移至15ml的离心管中进行离心，转速为4000rpm/min，时间为5min，弃细胞沉淀，留细胞培养上清液；取每种细胞培养上清各60ul，再分别加入15ul的5X电泳上样缓冲液，沸水中加热5min，待测；向余下的每种细胞培养上清液中分别加入30ul protein G-agarose，4℃孵育1h；孵育后离心，转速为4000rpm/min，时间5min，弃上清液，留沉淀；向每个沉淀样品中加3ml洗涤缓冲液，混匀后离心，转速为4000rpm/min，时间5min，弃上清液，留沉淀；向每个沉淀样品中分别加2X入电泳上样缓冲液，沸水中加热5min；离心每个加热后的样品，取上清液作为待测样品进行SDS-PAGE检测；将预先配置好的蛋白凝胶放入电泳槽中，加入1X电泳缓冲液后，将每个待测样品加到凝胶的孔内，接通电源，电压调至150伏特，恒压进行电泳；电泳结束后，加入适量染色液对蛋白凝胶进行染色，微波炉加热2min，转移脱色摇床上摇10min；倒掉染色液，加入脱色液，微波炉加热2min，放置在摇床上摇动15min，更换脱色液重复脱色过程直至蛋白条带清晰可见；将脱色好的蛋白凝胶放在凝胶成像系统的曝光室，进行图片扫描，存储照片以备实验结果分析。
上述实验结果如图4所示，从结果可以看出，5号条件表达量最高(62.5mg/L)，取5号条件进行表达。
3)IL-2表达实验
所用材料如下：
质粒样品经0.22um过滤器过滤除菌，用Nanodrop 2000测定浓度；
Freestyle 293F细胞，Invitrogen，Cat#R790-07；
Freestyle 293F细胞表达培养基，Invitrogen，Cat#2338-02；
Polyethylenimine(PEI)，Polysciences，Cat#23966，1mg/ml：将500mg的PEI粉末溶于450mL DDH2O中，用HCL将其pH值调至7.0，加入DDH2O定容体积至500mL，0.22um过滤器过滤除菌，分装成每管10mL，-80℃冻存备用；
0.22um过滤器，Sartorius，17597；
高压灭菌过的玻璃三角瓶；
二氧化碳培养箱，SANYO，MCO-20AIC，ID#为BINC010；
托盘摇床，IKA，KS260basic，ID#为BOSC015；
pH计，梅特勒-托利多，FE20，ID#为BPHM001；
Nanodrop 2000，Thermo，ID#为BNOP001。
步骤如下：
先对人类胚肾细胞293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须≥90％；然后将所述的293F细胞密度调整至1×106，接种到玻璃三角细胞培养瓶内；再进行细胞的瞬时转染实验，具体为分别取相应量的质粒与聚乙烯亚胺(PEI)混匀，室温孵育5min，加入接种293F细胞的三角细胞培养；最后将转染后的细胞放置在二氧化碳培养箱中培养，在37℃，二氧化碳浓度8％，摇床转速170rpm/min的条件下，培养7天，收细胞悬液，进行蛋白纯化。
实施例3：IL-2蛋白质的纯化精制
所用材料和仪器如下：
离心机，Thermo，ID：BCEN009
瓶口滤器，Sartorius
超净台，北京亚泰科隆试验开发中心，型号：YT-CJ-IND,ID:BCLB002
真空泵，天津津腾试验设备有限公司，型号：CG-0.5A
0.22um滤膜,九鼎高科过滤设备有限公司，
PH计，梅特勒，型号：FE20 ID:BPHM001
AKTA purifier 100，GE，ID：BANA006
Ni-FF层析预装柱(5ml GE)
NaOH，北京化工厂，lot：20120928
NaCl，北京化工厂，lot：20121021
Tris，Amresco，0497
KCl，西陇化工股份有限公司，lot：121009
KH2PO4，西陇化工股份有限公司，lot：121004
Na2HPO4，西陇化工股份有限公司，lot：121004
EDTA Amresco，0322；
0.22um针头滤器，Sartorius,minisart,lot:20685103
Ni2SO4，北京化工厂，lot：20130212
咪唑，北京化工厂，lot：20130324
试剂配制如下：
Buffer A:(20mM Tris，0.3M NaCL，pH 8.0)：称取2.4g Tris，17.5gNaCl,溶于950ml纯水中，用HCL将pH值调节到8.0，加水定容至1000ml，无菌过滤。
Buffer B:(20mM Tris，0.3M NaCL，0.4M咪唑，pH 8.0)：称取2.4gTris，17.5g NacL，27.5g咪唑溶于950ml纯水中，用HCL将pH值调节到8.0，加水定容至1000ml，无菌过滤。
PBS，称取KH2PO40.27g，Na2HPO41.42g，KCl 0.2g，NaCl 8g，加双蒸水，至1L，无菌过滤。
1M NaOH，称取40g固体，用双蒸水定溶1L，0.45um的滤膜过滤。
0.1M Ni2SO4，称取26.28g固体，用双蒸水定溶至1L，无菌过滤。
0.1M EDTA，称取37.22g固体，用双蒸水定溶至1L，无菌过滤。
步骤如下：
先将层析系统和层析柱处理好，然后再进行层析纯化，通过电泳检测纯化结果，纯化中的条件为离心样品速度4700rpm/min，在4℃条件下离心40min，采用0.22um滤膜进行无菌过滤，上样流速5ml/min。用QC进行定量分析。
实验结果如图5、图6和图7所示。通过上述实验可以从500ml的培养液中得到28.8mg IL-2融合蛋白，且SDS-Page电泳显示蛋白纯度高于95％。
实施例4：IL-2内毒素检测
所用材料和仪器如下：
显色基质鲎试剂试剂盒，genscript,L00350
读板机，BIORAD；型号：FE20
生物安全柜，阿尔泰仪器厂，BHK-A2
37℃恒温孵箱,
试剂配制如下：
用1.7ml LAL水溶解鲎试剂。混匀30秒。
用1.7ml LAL水溶显色基质。混匀30秒。
用10ml试剂盒带的溶液S溶颜色稳定剂#1。
用10ml LAL水溶颜色稳定剂#2，#3。
用2ml LAL水溶内毒素标品，准备4个标准品点0.01，0.025，0.05，0.1EU/ml。
用LAL水稀释样品100倍。
步骤如下：
先取100ul准备好的标准品和样品用加到去内毒素的管中，加100ul的鲎试剂到每个管中，盖上盖子，混匀，放入37℃恒温孵箱中45min；然后加100ul显色基质到每个管中，混匀，放入37℃恒温孵箱中6min；再加不同的500ul颜色稳定剂到每个管中，混匀；最后从每个管中取100ul液体加到酶标板中，用读板机在545nm的波长下读板，利用内毒素标准曲线，计算出样品内毒素含量。
上述实验结果数据见表2。
表2 实验结果数据
| 标准品梯度(EU/ml) | 吸光度545(OD545) |
| 0.000 | 0 |
| 0.010 | 0.0361 |
| 0.025 | 0.0688 |
| 0.050 | 0.1555 |
| 0.100 | 0.4475 |
根据上述表2标准品数据作图，得到如图8所述的内毒素标准曲线图。
根据图8的标准曲线，取直线部分带入样品吸收值，计算得到样品内毒素含量，计算结果见表3。
表3 计算结果数据
从表3计算结果可以得到，白细胞介素-2的内毒素含量：3.07EU/mg。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
Claims (8)
1.一种人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，通过在人类胚肾细胞293F细胞内表达重组人类IL-2基因进行制备，其特征在于如下步骤：
1)IL-2基因的克隆
先通过PCR扩增连接物(KSS)和IL-2片段，然后利用琼脂糖凝胶回收PCR产物KSS和IL-2，将琼脂糖凝胶回收载体片段(pTT5)与琼脂糖凝胶回收产物KSS及IL-2连接并转染入菌，经培养挑取菌落做PCR，根据PCR结果测序，最后将正确的pTT5-KSS-IL-2进行克隆，提取质粒；
2)IL-2蛋白表达筛选
先进行人类胚肾细胞293F细胞瞬时转染优化实验，通过测定其蛋白在瞬时转染293F细胞中的表达量，筛选出高表达的最佳条件，进行IL-2蛋白的表达；
3)IL-2蛋白质的纯化精制
对目标IL-2蛋白质进行分离纯化，并对其进行定量分析；
4)IL-2内毒素检测
将步骤(3)中纯化后的IL-2进行内毒素含量的检测。
2.根据权利要求1所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增KSS片段和IL-2片段所用的引物为：IL-2-1F，序列如SEQ ID NO：1所示，IL-2-1R，序列如SEQ IDNO：2所示，IL-2-2F，序列如SEQ ID NO：3所示，IL-2-2R，序列如SEQID NO：4所示以及表达的质粒设计中引物为：人工序列pTT5-KSS-IL-2，序列如SEQ ID NO：5所示。
3.根据权利要求2所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中所述PCR反应条件为：在体系1中98℃预变性3min后进行98℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸45s，进入体系2中进行的30个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于16℃。
4.根据权利要求2或3所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤1)中连接和转化pTT5-KSS-IL-2的步骤包括：将pTT5、KSS、IL-2、5X Enzyme Buffer以及10X Enzyme Mix的连接反应体系混匀，在室温下放置30min，将感受态细胞置于冰上溶化后加入8ul连接产物到50ul感受态细胞中并轻轻混匀，冰上孵育30min；然后在42℃下准确热激30s，立即转移至冰上放置2min；再加入250ul室温的SOC培养基，在37℃，200rpm的条件下孵育1h；最后取100ul细胞均匀涂布于LB平板(100ug/ml Amp)上，在37℃培养箱中培养过夜，观察平板上细胞生长情况。
5.根据权利要求4所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤1)中琼脂糖凝胶电泳检测菌落通过PCR结果进行显示，所用引物为pTT5-F和pTT5-R，所述的PCR反应条件为：在体系1中94℃预变性10min后进行94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，进入体系2中进行30个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于16℃。
6.根据权利要求1所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中以最佳IL-2蛋白进行表达的步骤是先对人类胚肾细胞293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率，细胞活率必须≥90％；然后将所述的293F细胞密度调整至1×106，接种到玻璃三角细胞培养瓶内；再进行细胞的瞬时转染实验，具体为分别取相应量的质粒与聚乙烯亚胺(PEI)混匀，室温孵育5min，加入接种293F细胞的三角细胞培养；最后将转染后的细胞放置在二氧化碳培养箱中培养，在37℃，二氧化碳浓度8％，摇床转速170rpm/min的条件下，培养7天，收细胞悬液，进行蛋白纯化。
7.根据权利要求1所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的分离纯化步骤是先将层析系统和层析柱处理好，然后再进行层析纯化，通过电泳检测纯化结果，纯化中的条件为离心样品速度4700rpm/min，在4℃条件下离心40min，采用0.22um滤膜进行无菌过滤，上样流速5ml/min。
8.根据权利要求1所述的人白细胞介素-2(IL-2)蛋白质的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述的内毒素检测步骤是先取100ul准备好的标准品和样品用加到去内毒素的管中，加100ul的鲎试剂到每个管中，盖上盖子，混匀，放入37℃恒温孵箱中45min；然后加100ul显色基质到每个管中，混匀，放入37℃恒温孵箱中6min；再加不同的500ul颜色稳定剂到每个管中，混匀；最后从每个管中取100ul液体加到酶标板中，用读板机在545nm的波长下读板，利用内毒素标准曲线，计算出样品内毒素含量。
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| CN108138150A (zh) * | 2015-07-27 | 2018-06-08 | 塞里维瑞疗法公司 | 细胞透性改善的（iCP）帕金重组蛋白及其用途 |
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