CN103467584A

CN103467584A - 一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽cc的获得及其发酵方法

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Publication number: CN103467584A
Application number: CN2013104094408A
Authority: CN
Inventors: 张爱忠; 姜宁; 蔡鹏�; 王志强; 孙艳发; 赵平森; 任文; 张晨雪; 王法明; 朱双; 刘晓明
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2013-09-03
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-03
Also published as: CN103467584B

Abstract

本发明公开了一种重组杂合阳离子抗菌肽CC的大肠杆菌基因工程菌的获得方法。本发明的原理为，通过生物信息学与分子生物学技术相结合的方法，选取有医疗潜力的天然抗菌肽，进行抗菌肽的分子设计，翻译后合成基因序列，经过克隆载体构建、表达载体构建等技术程序构建杂合抗菌肽CC大肠杆菌基因工程菌。通过在GST标签与抗菌肽之间设置DPP三肽序列，表达后进行纯化。通过乳糖诱导代替IPTG诱导转化来降低成本，优化培养条件和培养基组成，与发酵相结合。对其进行的生物学活性鉴定结果表明，其高效的抗菌活性、对热和pH稳定以及极微弱的溶血活性使其在食品、饲料以及养殖业上具有广阔的应用前景。

Description

一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得及其发酵方法

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域，尤其是涉及一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得与发酵方法。

背景技术

抗菌肽是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，在机体受到病毒、细菌等攻击时被诱导产生。抗菌肽具有广谱抗菌作用，尤其是对一些产生抗生素耐药性的病原菌的杀灭作用更引起了人们对它的兴趣。抗菌肽在农业、医疗、食品等领域的应用潜力巨大。迄今为止，已经发现了上千种天然抗菌肽，但是具有较好的医疗选择指数的种类却比较少，因此，人们希望通过分子上的重新设计，例如，杂合肽的设计等方式从丰富的天然抗菌肽资源中获得理想的新型人工抗菌肽。

杂合抗菌肽的设计特点是集两个(或以上)天然肽的优点于一身，经过适当的人工修饰后，可以扬长避短，最大程度上发挥抗菌活性，并不引起溶血。天蚕素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蝇天蚕素抗菌肽(Cec Md)是本实验室经诱导家蝇幼虫，然后克隆得到的(同源性81％)。而Chensirin是近年来发现的中国东北林蛙皮肤上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有较高的溶血活性。通过对两者进行杂合设计，获得了低溶血，高抗菌活性的新型杂合肽，与天然肽相比具有很大的优势。

人们为了得到抗菌肽主要采用了三种方法：1.直接从生物体中提取天然肽，但含量非常少，且提取工艺复杂，成本较高，难以满足大规模生产的要求；2.化学方法合成。这种方法只适用于非常短的抗菌肽，但大多数抗菌肽分子量都比较大，不适合化学和成；3.分子量比较大的抗菌肽大多都采用基因工程的方法，该方法研究的比较透彻，而且是生产抗菌肽的有效途径。如果采用基因工程学的方法生产抗菌肽，就要得到高效表达的发酵菌株，并建立其纯化和发酵的条件和方法。通过对诱导方式、诱导条件、培养基组成的优化以及建立发酵体系等进而为规模生产奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供了一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得及其发酵方法，得到高效表达的发酵菌株，并建立了其纯化和发酵的最优条件。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC，其特征是，所述抗菌肽CC包括两对引物，其核苷酸序列如序列表序列3-6所示；

所述抗菌肽CC是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的抗菌肽；

所述抗菌肽CC的核苷酸序列如序列表中序列1所示或如下序列所示；

CGC

G

ATCCGCCGGG

TTGGCTGAAA

AAACTGGGCA

AGCTGAAGGC

CCATAAGGCC

ACCATCCAAA

CCACTGGCGC

CGCCCAACAA

GCCGCCAACG

TTGCCGCCAC

CCTGAAGGGT

C

GCA

其中，序列前端加入了DPP三肽序列的密码子，所述DPP三肽序列的密码子为波浪线部分；

两端各加入了BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，所述BamH I和Sal I限制性内切酶位点为方框内的部分，所述保护性碱基为两尾端部分；

末端加上终止密码子，所述终止密码子为TAA，下划线部分为家蝇天蚕素抗菌肽的部分成熟肽基因序列，未划线部分为蛙防御素部分成熟肽基因序列；

所述抗菌肽CC的分子量、电荷数、等电点、疏水力矩分别为：

3487.15，+6.5，11.49，1.02。

本发明还提供了一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，包括以下步骤：

S1.合成CC融合蛋白基因；

S2.构建杂合抗菌肽CC重组大肠杆菌基因工程菌；

S3.CC融合蛋白的诱导表达；

S4.CC的纯化；

S5.CC的生物学活性鉴定；

S6.CC融合蛋白诱导表达方式的转变；

S7.CC重组基因工程菌的发酵培养。

优选的，所述S1过程包括：根据家蝇cecropin基因(GenBank：DQ232774)并应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和三级结构和抗菌活性，设计出具有医疗潜力的杂合抗菌肽CC，在其基因序列前端引入三肽序列(Asp-pro-pro，DPP)；根据大肠杆菌对密码子的偏爱性将杂合抗菌肽的基因序列翻译成核酸序列，在其两端加上BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，合成两对引物F1、R1，F2、R2，应用重叠PCR技术合成杂合抗菌肽CC的基因；所述两对引物的核苷酸序列如序列表中序列3-6所示。

优选的，所述S2过程包括：构建CC克隆质粒pMD18-T/CC并测序鉴定，构建表达质粒pGEX-6p-1/CC并测序鉴定，构建基因工程菌株pGEX-6P-1/CC/BL21(DE3)并测序鉴定，所述测序鉴定为：测序结果使用NCBI Blast与所设计的基因进行对比，选取两者结果一致的重组菌为测序结果正确的重组菌。

优选的，所述S3过程中包括：将步骤S2中测序结果正确的重组菌和含有空载体的对照菌进行平板培养、种子培养，将发酵液中菌体生长到对数期后分别加入IPTG诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析和western blot分析，选取表达成功的杂合抗菌肽CC，进行下一步的纯化。

优选的，所述S4过程包括：将基因工程菌pGEX-6P-1/CC/BL21(DE3)大量培养、诱导，收集菌体并获得融合蛋白包涵体，经变性、复性后进行亲和层析纯化，纯化后的融合蛋白经甲酸切割后去除标签，然后进行定量，纯化样品保留。

优选的，所述S6过程包括：表达质粒pGEX-6p-1/CC所带有的tac启动子，受乳糖操纵子调控，乳糖天然具有乳糖操纵子诱导功能，利用乳糖来诱导杂合抗菌肽CC融合蛋白的表达，并将其结果与IPTG诱导表达效果来进行比较；在确定具有可行性的基础上，应用单因素试验设计对基因工程菌pGEX-6P-1/CC/BL21(DE3)的诱导时间、诱导温度和转速进行了优化；应用正交试验设计对乳糖的诱导浓度、碳源、磷酸盐和氯化钠的添加量进行了较大范围的初步优化；应用均匀试验设计对培养基组成的碳源、氮源、氯化钠、磷酸盐以及微量元素铁的添加量进行了优化，并进行回归建模。

优选的，所述S7过程中包括：应用均匀设计的回归模型Y＝183.501+22.376X₁+0.710X₃-44.483X₄-872.168X₅+4.416X₄ ²+4673.818X₅ ²-59.618X₆ ²来预测结果，通过回归模型对发酵过程的控制和调整，获得高效表达、质粒稳定的发酵方法和条件。例如：使用20L发酵罐，以10L/20L的培养基添加量进行发酵，确定其乳糖诱导表达在中试条件下的表达量均值为40.02％及OD₆₀₀均值为3.515，通过对发酵过程的控制和调整，获得了高效表达、质粒稳定的发酵方法和条件为葡萄糖添加量为1g/L，氮源为36g/L，氯化钠为3g/L，磷酸盐添加量为0.01mol/L，氯化铁0.05mmol/L。

采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：采用本发明的一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得及其发酵方法生产抗菌肽，得到了高效表达的发酵菌株，并建立其纯化和发酵的条件和方法，通过对诱导方式、诱导条件、培养基组成的优化以及建立发酵体系等可以为规模生产奠定基础。

附图说明

附图1片段F1R1、F2R2琼脂糖凝胶电泳图；

附图2全长基因扩增后琼脂糖凝胶电泳图；

附图3胶回收后的全长基因琼脂糖凝胶电泳图；

附图4质粒为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

附图5双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；

附图6重组克隆载体的双酶切凝胶电泳图；

附图7表达载体的双酶切凝胶电泳图；

附图8重组表达载体的质粒的PCR鉴定；

附图9重组质粒的酶切鉴定图；

附图10重组载体原核表达产物的SDS-PAGE分析；

附图11杂合抗菌肽融合蛋白的Western blot检测；

附图12纯化的杂合抗菌肽CC融合蛋白的SDS-PAGE分析；

附图13杂合抗菌肽CC Tricine-SDS-PAGE分析；

附图14诱导时间对pGEX6p-1/CC表达量的影响；

附图15IPTG浓度对pGEX6p-1/CC表达量的影响；

附图16温度对pGEX6p-1/CC表达量的影响；

附图17培养基对pGEX6p-1/CC表达量的影响；

附图18杂合抗菌肽CC对致病菌的抑菌效应；

其中：

附图1中，1DNA标准分子量；2片段F1R1；3片段F2R2；

附图2中，1DNA标准分子量；2杂合抗菌肽基因CC；

附图3中，1DNA标准分子量；2杂合抗菌肽基因CC；

附图4中，1DNA标准分子量；2杂合抗菌肽基因CC；

附图5中，1DNA标准分子量；2pMD18-T的双酶切产物；3pMD18-T/CC的双酶切产物；

附图6中，1DNA标准分子量；2CC的双酶切产物；

附图7中，1DNA标准分子量；2pGEX6p-1；3酶切后的pGEX6p-1；

附图8中，1DNA标准分子量；2阴性对照(pGEX6p-1)；3pGEX6p-1/CC的PCR产物；

附图9中，1DNA标准分子量；2双酶切后的pGEX6p-1；3双酶切后的pGEX6p-1/CC；

附图10中，1未诱导的pGEX6p-1/CC/BL21(DE3)；2诱导2h的pGEX6p-1/CC/BL21(DE3)；3诱导4h的pGEX6p-1/CC/BL21(DE3)；4Fermetas蛋白Marker；5未诱导的pGEX6p-1/BL21(DE3)；6诱导2h的pGEX6p-1/BL21(DE3)；7诱导4h的pGEX6p-1/BL21(DE3)；

附图11中，1诱导2h的GST；2诱导4h的GST；3诱导4h的CC-GST；4未诱导的CC-GST；

附图12中，1破碎后上清； 2破碎后沉淀； 3PBS洗后上清； 4破碎后沉淀； 5洗涤后上清； 6蛋白marker； 7洗涤后沉淀； 8溶解后上清；9PBS溶解后沉淀；

附图14中，1未诱导的pGEX6p-1；2诱导4h的pGEX6p-1；3蛋白marker；4未诱导的PGEX6p-1/CC；5诱导1h的PGEX6p-1/CC；6诱导2h的PGEX6p-1/CC；7诱导4h的PGEX6p-1/CC；8诱导6h的PGEX6p-1/CC；9诱导8h的PGEX6p-1/CC；10诱导10h的PGEX6p-1/CC；

附图15中，1未诱导的pGEX6p-1；2诱导4h的pGEX6p-1；3蛋白Marker；4IPTG浓度为0mmol/L；5IPTG浓度为0.2mmol/L；6IPTG浓度为0.4mmol/L；7IPTG浓度为0.6mmol/L；8IPTG浓度为0.8mmol/L；9IPTG浓度为10mmol/L；10IPTG浓度为10mmol/L；

附图16中，1温度为25℃；2温度为30℃；3温度为33℃；4蛋白Marker；5未诱导的pGEX6p-1；6诱导4h后的pGEX6p-1；7温度为35℃；8温度为37℃；9温度为40℃；10温度为45℃；

附图17中，1LB培养基(pGEX6p-1/CC)；2SOC培养基(pGEX6p-1/CC)；3TB培养基(pGEX6p-1/CC)；4蛋白Marker；5未诱导的pGEX6p-1；6诱导4h的pGEX6p-1；

附图18中，平板1为大肠杆菌，2为金黄色葡萄球菌，3为沙门氏菌，4为停乳链球菌；A，C代表水，B为杂合抗菌肽，D为杂合抗菌肽融合蛋白。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1

抗菌肽的制备

杂合抗菌肽CC所含有的核苷酸序列：

CGC

GATCCGCCGGGTTGGCTGAAAAAACTGGGCAAGCTGAAG GCCCATAAGGCCACCATCCAAACCACTGGCGCCGCCCAACAAGCCGCCAACGTTGCCGCCACCCTGAAGGGT

CGCA

其中序列前端加入了DPP三肽序列的密码子(波浪线部分)，两端各加入了BamH I和Sal I限制性内切酶位点(方框内)和保护性碱基(两尾端)，末端加上终止密码子(TAA)，下划线部分为家蝇天蚕素抗菌肽的部分成熟肽基因序列，未划线部分为蛙防御素部分成熟肽基因序列。

其编码的氨基酸序列、分子量、电荷数、等电点、疏水力矩为：

GWLKKLGKLKAHKATIQT IGAAQQAANVAATLKG，3487.15，＋6.5，11.49，1.02。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种上述工程菌的构建方法。技术方案如下：

本发明通过重叠PCR技术合成杂合抗菌肽CC的基因序列，它的两对引物序列为：

F1

5’-CGCGGATCCGATCCGCCGGGTTGGCTGAAAAAACTGGGCAAGCTGAAGGC-3’

R1

5’-GGTTTGGATGGTGGCCTTATGGGCCTTCAGCTTGCCCAGTTTTTTC-3’

F2

5’-CCATAAGGCCACCATCCAAACCACTGGCGCCGCCCAACAAGCCGCCAACGTTGC-3’

R2

5’-TGCGCAGCTGTTAACCCTTCAGGGTGCGGCAACGTTGGCGGTTGTT-3’

F1与R1，F2与R2分别进行延伸，得到延伸液F1R1、F2R2，PCR反应体系为双蒸馏水(ddH₂O)40.75μL、10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)5μL、dNTPMixture(各2.5mmol/L)2μL、引物F1与R1、F2与R2各1μL、TaKaRa Taq(5/μL)0.25μL，共计50μL。在PCR反应管中加入上述组分，混匀后瞬时离心，使液体聚积在PCR反应管底部，放入PCR仪中，反应条件为95℃预变性5min，67℃退火20min，72℃延伸10min。

然后进行第二次PCR延伸，此时延伸液F1R1与F2R2互为模板与引物。反应体系为ddH₂O38.75μL、10×PCR Buffer(Mg^2＋Plus)5μL、dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4μL、延伸液F1R1与F2R2各加1μL、TaKaRa Taq(5/μL)0.25μL，共计50μL。在PCR反应管中加入上述组分，混匀后瞬时离心，使液体聚积在PCR反应管底部，放入PCR仪中，PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30sec，67℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃延伸10min。

PCR结束后，取5μL PCR产物在含有EB的2％Agarose gel电泳检测。如附图1与附图2所示。其余产物-20℃保存备用。

实施例2

构建杂合抗菌肽CC大肠杆菌基因工程菌

(1)构建克隆载体

将杂合抗菌肽的基因胶回收后，与pMD18-T Vector连接，转化到大肠杆菌TG-1的感受态细胞中，并验证试验结果的正确性。

①PCR产物的胶回收

具体方法参照柱式小量胶回收试剂盒的说明书步骤。完成后取5μL回收产物在含有EB的2％Agarose gel电泳检测。结果如附图3所示。

②感受态细胞的制备

具体方法参照TaKaRa Competent Cell Preparation Kit(200次量)的说明书步骤。

③重组载体的构建

将杂合抗菌肽基因CC与克隆载体pMD18-T Vector连接，形成重组载pMD18-T/CC。试验步骤如下：

在微量离心管中，加入pMD18-T Vector1μL，杂合抗菌肽基因CC3μL，ddH₂O1μL，共5μL。同时设置空白对照，以ddH₂O代替杂合抗菌肽基因。

加入冰上融化的Solution I5μL，混匀后瞬时离心。

放入连接仪中，16℃反应过夜。

将-80℃保存的100μL大肠杆菌感受态细胞TG-1于冰中融化10min，放入新离心管后与过夜反应的重组载体(全量10μL)混合，冰中放置30min。

42℃加热45s，再在冰中放置1min。

加入890μL37℃预热的SOC培养基，37℃震荡60min。

在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养过夜直至形成单菌落。

挑选白色菌落，使用PCR方法和双酶切方法进行鉴定，并送上海生物技术公司测序。

④重组载体的鉴定

质粒的提取步骤参考AxyPrep质粒DNA小量试剂盒的步骤。

重组质粒的PCR鉴定：以质粒为模板进行PCR，反应体系为ddH₂O19μL，10×PCR Buffer(Mg^2＋Plus)2.5μL、dNTP Mixture(各2.5mmol/L)2μL，模板(pMD18-T/CC34与空质粒pMD18-T)0.4μL，上游引物F1、下游引物R2或R3各0.5μL，Taq酶0.1μL，总体积为25μL。上述组分加入PCR反应管中，混匀后瞬时离心，放入预热的PCR仪中。反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30sec，67℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃延伸10min。PCR反应结束后，取5μL PCR产物在含有EB的2％Agarose gel上进行电泳检测。结果如附图4所示，其余产物-20℃保存备用。

重组质粒的双酶切鉴定：重组质粒用限制内切酶BamH I和Sal I进行双酶切。在3个PCR反应管中加入重组质粒pMD18-T/CC与空质粒pMD18-T8μL、10×Buffer Tango^TM2μL，限制性内切酶BamH I和Sal I各0.5μL，总体积为11μL。用手指轻弹PCR反应管壁，使溶液混匀后瞬时离心，使溶液集中在管底部。37℃水浴3h，使酶切反应完全。取全部反应液与1μL10×PCR上样缓冲液混合终止反应，并在含有EB的2％Agarose gel电泳检测，其结果如附图5所示。

重组质粒的测序鉴定：将PCR和酶切鉴定正确含有重组质粒的大肠杆菌菌液送上海生物技术有限公司鉴定。测序结果使用NCBI Blast与所设计的基因进行比对。

实施例3

构建表达载体和基因工程菌

①杂合抗菌肽基因的克隆载体、表达载体pGEX-6P-1双酶切

挑取大肠杆菌pMD18-T/CC/TG-1以及含有表达载体pGEX-6p-1大肠杆菌的单菌落，接种到5mL LB/AMP液体培养基中震荡培养过夜后，提取质粒。分别用NEB的限制性内切酶BamH I和Sal I对重组克隆载体和表达载体进行双酶切，酶切反应体系为：10×NEB buffer32μL，质粒16.0μL，100×BSA0.2μL，BamH I0.8μL和Sal I1.0μL，总体积20μL。在PCR反应管加入上述组分，封口膜密封后，用手指轻弹PCR反应管壁，使溶液混匀后瞬时离心，使溶液集中在管底部。37℃水浴4-5h后，使酶切反应完全。取全部反应液与2μL10×PCR上样缓冲液混合终止反应，取10μL在含有EB的2％Agarose gel电泳检测，其结果如附图6与附图7所示。将酶切产物进行胶回收，回收pMD18-T/CC小片段(杂合抗菌肽基因)与表达载体pGEX-6P-1的大片段。

②杂合抗菌肽基因与表达载体pGEX-6P-1的连接

将杂合抗菌肽CC基因与表达载体进行连接。在无菌PCR反应管中按插入DNA片段与载体片段摩尔比约为3∶1-12∶1依次加入下列成份：pGEX-6P-1载体片段2μL，杂合抗菌肽基因片段CC6μL，10×T4DNA Ligase Buffer1μL，T4DNALigase1μL，总体积为10μL，混匀后瞬时离心，16℃水浴过夜。

③连接产物的转化

将②步骤获得的连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，加入890μL37℃预热的SOC培养基，37℃震荡60min。在含有Amp的L-琼脂平板培养基上培养过夜直至形成单菌落。同时，将空载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中做阴性对照。

④重组表达载体鉴定

质粒的小量抽提：挑取单菌落，无菌接种至5mL LB/Amp+液体培养基中(含氨苄青霉素60μg/mL)，37℃200rpm振荡培养过夜，提取质粒。提取后的重组载体命名为pGEX-6P-1/CC34。

PCR鉴定：以重组质粒为模板进行PCR鉴定。反应体系为ddH₂O19μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)2.5μL、dNTP Mixture(各2.5mmol/L)2μL，模板(包括重组质粒pGEX-6P+1/CC以及空质粒pGEX-6P-1)0.4μL，上游引物F1、下游引物R2各0.5μL，Taq酶0.1μL，体积共计25μL。上述组分加入PCR反应管中，混匀后瞬时离心，放入预热的PCR仪中。反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30sec67℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃延伸10min。PCR反应结束后，取5μLPCR产物在含有EB的2％Agarose gel上进行电泳检测，其结果如附图8所示。

重组表达质粒酶切鉴定：依据设计在引物两端的限制性内切酶位点用BamH I和Sal I切割所提取的质粒DNA，鉴定重组表达质粒正确与否。所用质粒为重组质粒pGEX-6P-1/CC以及空质粒pGEX-6P-1，酶切体系和反应条件同上。反应结束后，取全部反应液与2μL10×PCR上样缓冲液混合终止反应，取10μL在含有EB的2％Agarose gel电泳检测，其酶切结果如附图9所示。

重组表达质粒的测序鉴定：取鉴定为阳性的重组菌菌液加入等体积无菌40％甘油(装至1.5mL离心管中混匀后，用封口膜封口，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果使用NCBI Blast与所设计的基因进行比对。

实施例4

杂合抗菌肽CC融合蛋白的IPTG诱导表达和乳糖诱导表达

将测序结果正确的重组菌和含有空载体的对照菌按1％的接种量接种于LB/Amp液体培养基中，37℃200rpm过夜培养后，以1％接种量接种于10mLLB/Amp液体培养基，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.5-0.6时(大约需2.5h)，分别取1.0mL菌液作为诱导前对照(0h)，然后分别加入IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导表达，37℃继续培养，并于诱导后2h和4h分别取1.0mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，加入1×蛋白上样缓冲液180μL与20μL DTT重悬菌体，沸水浴5min后，12000rpm离心1min，上清于-20℃保存备用。

乳糖诱导方法同上。并于诱导后2h、4h、6h、8h、10h取菌液，样品相同处理。应用SDS-PAGE技术检测目的蛋白表达情况，并对两者的诱导表达效果进行比较。使用凝胶分析软件Quantity one进行杂合抗菌肽CC融合蛋白占细菌总蛋白含量的计算，结果以百分比的形式表示。

实施例5杂合抗菌肽的纯化

杂合抗菌肽CC在大肠杆菌中以包涵体形势表达。将包涵体经变性和复性处理后，采用亲和层析对含有GST标签的目的蛋白进行纯化。

①重组工程菌的大量培养与融合蛋白的收集

挑取阳性单克隆pGEX-6P-1/CC接种于约15mL LB/Amp培养基中，37℃200rmp振荡培养过夜。

按照1∶100稀释到1000mL新鲜的LB/Amp培养基中，37℃200rmp继续培养3h，振荡培养到OD₆₀₀为0.6左右。

取1mL菌液于1.5mL离心管中，12000rpm离心5min，弃上清，将收集到的菌体沉淀作为诱导前对照。

剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导6h。

8000rmp，4℃离心10min，收集菌体。

用PBS缓冲液8000rmp，4℃离心10min反复洗涤菌体沉淀两次，于-80℃冰箱保存1h。

加20mL PBS重悬沉淀，使菌体完全溶解，按1∶500加入PMSF，溶菌酶加至1mg/mL。

超声波破碎菌体(工作时间：3s；间歇时间：3s；功率：400w；定时次数：120次)。

加20％Triton X-100至终浓度为1％，冰上放置30min。

8000rmp4℃离心10min，转上清至新管，用50μL洗涤液/mL原菌液重悬菌体沉淀。

8000rmp4℃离心10min，转上清至新管，用50μL溶解液/mL原菌液重悬菌体沉淀。

8000rmp4℃离心10min，转上清至新管，用50μL1×PBS/mL原菌液重悬菌体沉淀。

SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的分布，其结果如附图10所示。

②杂合抗菌肽融合蛋白的Western blot分析

杂合抗菌肽的融合表达产物，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，以湿转法进行Western Blot鉴定。具体步骤如下：

SDS-PAGE电泳后的凝胶经适当剪切，利用转移缓冲液平衡凝胶3次，每次5～10min。同时需要准备6张Whatman滤纸和一张PVDF膜，浸入转移缓冲液中作用5～10min，进行膜的前期处理。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜，PVDF膜比凝胶和滤纸稍大些为好。

将电转移的夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

切好的凝胶盖于三层滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。

将夹子放入转移槽槽中，使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。60V电压转移1h。

将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

另一个平皿加入30mL封闭液和20μL的Rabbit Anti-GST-tag polyclonalAntibody。从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于一抗封闭液中。室温下孵育2h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min。

将膜转移至适量的1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG中孵育2h。TBST洗膜3次，每次10min。

采用DBA染色试剂盒进行染色。B显色液用去离子水(1∶25)稀释后，然后用此液将A显色液(1∶25)稀释。混匀后立即使用。显色3～10min，并在本底较浅且达到适当显色强度时以流水冲洗以终止显色反应。滤纸吸干膜上的水分，避光干燥保存，其结果如附图11所示。

③融合蛋白的复性与纯化

离心后得到的上清中加入还原型谷胱甘肽，终浓度至1％。两杂合肽上清装入透析袋中于4℃分别将8、6、4、2moL/L尿素和PBS中放置数小时后，8000rmp4℃离心10min缓慢透析离心，沉淀用裂解液重悬。

取GenScript High-Affinity GST Resin纯化试剂，轻轻晃动装有谷胱甘肽吸附介质小瓶使填料重悬。

取2只纯化柱，每只柱中注入填料原浆4mL，轻轻敲打柱子驱赶填料中的气泡，放置使填料沉淀，打开下端的盖，让柱子流干，以去除20％的酒精保存液。

用20mL，4℃预冷的1×PBS洗脱，以去掉防腐剂。

用6mL1×PBS和1％Triton X-100平衡柱床。

把离心后得到的上清用0.22μm滤器过滤后加于柱床上，25℃吸附30min，期间要不断晃动柱床。

打开下盖，使液体自然流过胶床。

用20mL，1×PBS洗脱3次，使柱床流干。

加2mL还原型的谷胱甘肽洗脱液，在22℃-25℃下，保温10min，期间要不断晃动柱床。

打开下盖，收集洗脱液，重复3次，汇集3次得到的洗脱液。

用高盐洗脱液洗脱柱床，使柱床再生。用60mL1×PBS洗脱，20％乙醇保存于4℃。

SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化效率，其结果如附图12所示。

④杂合抗菌肽的切割

将纯化洗脱液0.22μm孔径除菌滤膜过滤，经截流留分子量为8000～14000Da的透析袋于0.1mol/L PBS(pH7.4)透析过夜，经PEG8000浓缩。向处理后的杂合抗菌肽CC融合蛋白中，每毫升加入60μL88％的甲酸，至终浓度为5％，在40℃水浴中反应48h。对切割后的杂合抗菌肽进行处理后，Tricine-SDS-PAGE检测蛋白质的切割效果，其结果如附图13所示。

⑤浓度的测定

采用BCA蛋白定量试剂盒(96孔酶标板法)测定纯化后杂合抗菌肽的浓度。

表1BCA蛋白定量标准曲线绘制的加样方法

孔号	A	B	C	D	E	F	G	H
									蛋白标准(μL)	0	1	2	4	8	12	16	20
去离子水(μL)	20	19	18	16	12	8	4	0
									BCA工作液(μL)	200	200	200	200	200	200	200	200
蛋白质含量(μg)	0	1	2	4	8	12	16	20
									最终体积(μL)	220	220	220	220	220	220	220	220

将杂合抗菌肽样品用去离子水稀释至适当浓度，取20μL样品，加入200μL BCA工作液，混匀后37℃放置30min，然后以A号孔为对照，测定样品吸收值562nm处的吸光值。

根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。

实施例6

杂合抗菌肽的生物学活性鉴定

(1)杂合抗菌肽抑菌活性的检测

①抑菌圈法检测杂合抗菌肽抑菌活性

采用琼脂孔穴扩散法检测目的蛋白的抗菌活性，所采用的致病菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球杆菌和沙门氏菌。将上述致病菌在LB固体培养基上划线培养，待长出单菌落后，于LB液体培养基中37℃200rpm空气振荡培养。使用平板稀释法将上述四种处于对数生长期的菌株悬浮液稀释为10⁸个/μL，取15μL与15mL的55℃LB液体培养基混匀后铺平板，待凝固后，用高压灭菌处理的打孔器(直径3mm)打孔，向每孔中分别滴加20μL液体(CC融合蛋白、甲酸切割后的CC融合蛋白；灭菌双蒸水)。37℃在生化培养箱中培养24h后，观察杂合抗菌肽的抑菌活性。

②最小抑菌浓度(MIC)的测定，结果见表2

挑平板中致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球杆菌和沙门氏菌的单菌落于37℃，200rpm空气震荡培养过夜。将杂合抗菌肽CC用1×PBS为稀释为：4000、200、1000、500、250、125、62.5和31.25μM共计8个梯度。将过夜培养菌稀释至2×10⁵-7×10⁵CFU/mL，将稀释好的4种测试菌液滴加到96孔培养板中，每行1～12孔，每孔60μL，然后每孔滴加20μL的杂合抗菌肽，每孔加120μL培养基。每行3个重复以不含测试菌的阴性对照；于37℃，恒温培养，转速为100rpm，培养24h；490nm下用酶标仪测定其吸光度。

表2杂合抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)

(2)抗菌肽溶血活性检测，结果见表3

通过血红素的释放量来测定杂合抗菌肽的溶血活性。使用新鲜绵羊血红细胞悬浮液(浓度为2％)，将其与0.1mL测试杂合抗菌肽混合。测试抗菌肽混合后浓度分别为100、50、25、12.5、6.25μM。混合体系在37℃保温1h。在保温后，以2000转，离心10min。上清转移至96空板，使用酶标仪在570nm下测定吸光值。溶血百分比0％和100％的值分别使用10mmol/L PBS和0.1％(v/v)Triton X-100在相同条件下同步测得。每个测试平行设定三个样品，取测定值的平均值。

表3抗菌肽对绵羊红细胞的溶血活性

(3)水浴和pH值缓冲液对杂合抗菌肽生物活性的影响，结果见表4和表5.

使用不同水浴时间和pH值缓冲液对杂合抗菌肽CC进行处理。

杂合肽抗菌肽的处理温度：将纯化浓缩后的杂合抗菌肽用PBS缓冲液(pH为7.4)稀释成为1500μM，分别于100℃水浴2min、5min、10min、30min和60min；结果见表4.

表4100℃水浴对抗菌肽活性的影响

杂合抗菌肽CC不同pH值缓冲液的处理：将纯化浓缩后的杂合抗菌肽分别用pH值为1、2、5、7、10、12和14的PBS缓冲液稀释成为1500μM。

测定方法：以沙门氏杆菌为指示菌。从LB平板挑取沙门氏杆菌的单菌落接种到装有100mL新鲜无菌LB培养基的三角瓶中。37℃，180rpm振荡培养过夜。用无菌的LB培养基将沙门氏杆菌的过夜培养物稀释至OD值为0.01。于96孔细胞培养板中，每孔加入95μL的菌液和20μL上述处理的杂合抗菌肽CC。对照组为：培养基；未处理的抗菌肽(用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释)+菌液，每组为4个重复。100rpm振荡培养24h，使用酶标仪在550nm下测定OD值。通过与对照组OD值相比，检测经温度和不同pH值缓冲液处理对杂合抗菌肽CC生物活性的影响，结果见表5。

表5pH对抗菌肽活性的影响

(4)杂合抗菌肽对大鼠/绵羊血液淋巴细胞转化率的影响，结果见表6。

①实验动物的饲养

SD大鼠：选择30只健康成年SD大鼠，体重为300g，饲喂颗粒料，自由采食和饮水，室温饲养。

绵羊：选择12只健康的东北细毛羊×德国肉用美利奴的杂交肉羊羯羊，体重为32～35kg，饲喂玉米-豆粕-青干草型日粮为基础日粮，自由采食和饮水。

②淋巴细胞的收集

随机选取12只SD大鼠和12绵羊，在无菌状态下进行全部操作。大鼠采用心脏采血3～4mL，绵羊颈静脉采血5mL，肝素抗凝(25U/mL。移取4mL淋巴细胞分离液于10mL无菌离心管中，然后沿管壁缓慢加入3mL抗凝血，2500rpm室温离心30min。用1mL无菌的加样器吸取第二层的淋巴细胞层约1mL，加入5mL的Hank’s液，洗涤3次，每次2000rpm室温离心10min，弃上清。吸取100μL淋巴细胞原液悬浮于RPMI-1640完全培养液，用台盼蓝染色，用血球计数板在显微镜下计数活细胞数(死细胞染成蓝色)，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，4℃贮存备用。

③淋巴细胞培养与测定

使用96孔细胞培养板培养细胞。其中PHA和LPS分别做为T淋巴细胞和B淋巴细胞的刺激原。将淋巴细胞悬液100μL加入96孔细胞培养板，再加入含50μL PHA或LPS、75μL的RPMI-1640完全营养液以及25μL的杂合抗菌肽CC，培养体系每孔共200μL，3个重复。同时设不加刺激原的阴性对照和不加淋巴细胞的空白对照。于5％CO₂，37℃下培养48h。在培养结束前4h，每孔加入5mg/mL的MTT10μL，继续培养。

使用酶标仪于550nm波长下测定OD值。淋巴细胞转化率通常以刺激指数(SI)表示，计算公式为：

SI=丝裂原刺激孔OD₅₅₀/对照孔OD₅₅₀

(5)统计分析

试验数据采用SAS9.0软件包进行统计分析，使用MEANS过程计算均数和标准差，ANOVA程序进行单因素方差分析，SNK法进行组间多重比较。结果见表6。

表6抗菌肽对大鼠和绵羊血液外周淋巴细胞转化率的影响

实施例7

杂合抗菌肽CC重组基因工程菌的诱导表达条件、培养基组成的优化

(1)转速的优化

挑取平板上培养好的基因工程菌pGEX-6P-1/CC/BL21(DE3)，接种于装有2mL LB液体培养基(含Ampicillin100μg/mL)的试管中，150℃水浴振荡培养8～12h作为种子，次日将2mL种子接种于50mL/250mL TB液体培养基(含Ampicillin100μg/mL)中，33℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8(约需要2h)，加入乳糖至终浓度为11.1mmol/L，分别以160rmp/min、180rmp/min以及200rmp/min的转速，以及33℃继续诱导5h，取样测定OD₆₀₀及进行SDS-PAGE。空载体对照组相同条件培养，同样于OD₆₀₀=0.6～0.8时添加11.1mmol/L乳糖进行诱导培养5h。

(2)基因工程菌诱导表达融合蛋白时间的确定

取培养至对数期的二级种子，按4％接种量分别接种于每个50mL/250mL的TB／Amp液体培养基中，培养至对数期后，各组及空载体对照组分别加入终浓度为11.1mmol／L的乳糖进行诱导培养。空载体对照组诱导培养5h。为避免培养过程中取样造成的溶氧改变、时间差、温度差以及可能进入的杂菌等环境变化所带来的试验结果的变动，其余各组分别培养2h、4h、6h、8h、10h后结束，并取样测定菌体密度及进行SDS-PAGE，其结果如附图14所示。

(3)IPTG浓度对杂合抗菌肽重组工程表达菌株表达的影响

取pGEX-6P-1／BL21(DE3)、pGEX-6P-1／CC31／BL21(DE3)和pGEX-6P-1／CC34／BL21(DE3)菌株按1：500接种于15mL LB／Amp+培养基中，37℃200rpm空气震荡摇菌过夜。次日以1：100稀释到20mL新鲜的LB／Amp+培养基中，37℃200rpm继续培养至OD600值约为0.6(约3h)。分别加入浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mM的IPTG进行诱导。于适宜表达时间取样用于SDS-PAGE分析，其结果如附图15所示。

(4)诱导温度的优化

挑取平板上培养好的基因工程菌pGEX-6P-1／CC／BL21(DE3)，接种于2mL LB／Amp液体培养基的试管中，次日作为一级种子接种于50mL／250mL的LB／Amp液体培养基中，培养至对数期作为二级种子。按4％的接种量接种于50mL／250mL的TB／Amp液体培养基中，33℃水浴150rmp／min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，分别加入11.1mmol／L乳糖，空载体对照相同条件培养，分别以29℃、33℃和37℃继续诱导培养5h，然后取样测定OD₆₀₀及进行SDS-PAGE，其结果如附图16所示。

(4)培养基组成的优化

①葡萄糖添加量的单因素筛选，结果见表7。

为了获得由适合的葡萄糖添加量控制的自诱导培养基，使用单因素试验设计进行葡萄糖添加量的优化。试验各组均使用TB／Amp为基础培养基。萄糖添加量分别为0.5g／L，1g／L，2g／L，4g／L，8g／L，自诱导时间为12h，诱导时机为OD₆₀₀＝0.6～0.8，初始pH＝7.0，接种量为4％，装瓶量为1／5(50mL／250mL)，乳糖诱导浓度为11.1mmol／L。试验步骤为：a.配制各实验组培养基，以4％的接种量接种二级种子，然后按上述添加量梯度添加葡萄糖；b.直接添加乳糖至终浓度为11.1mmol／L，水浴振荡，200rmp／min培养12小时；c.取样测定菌体密度并进行SDS-PAGE，其结果如附图17所示。

表7葡萄糖添加量试验结果

②L₉(3⁴)正交试验设计

乳糖、NaCl、甘油、磷酸盐的添加量为本次试验优化的对象，正交设计表及试验结果分析如下表8所示：

表8币交试验设计表及试验结果分析

③6因素5水平均匀试验设计

葡萄糖、甘油、氮源、NaCl、磷酸盐、Fe³⁺的添加量为本次优化的对象，均匀设计表如下表10：

表10 6因素5水平均匀试验设计表

上表因素X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆的水平次序做了平滑移动。原均匀设计表中的字码次序不能随意改动，而只能依照原次序平滑，避免在试验中出现都是各因素高水平组合的情况。为提高试验精度、均匀度、可靠性，选U₁₀*(10⁸)表，并运用拟合水平法({1，6}-＞1；{2，7}-＞2；{3，8}-＞3；{4，9}-＞4；{5，10}-＞5)来安排试验。在实际工作中，除氮源外，其余各因素均要配制储备液，配制培养基时直接加储备液即可。储备液如下：(1)葡萄糖储备液：0.25g/ml；(2)甘油储备液：体积分数为60％的甘油、水混合液；(3)NaCl储备液：0.3g／ml；(4)磷酸盐储备液：4mol／L，其中K₂HPO₄·H₂O与KH₂PO₄均为4mol／L，混合时的体积比为61.5∶38.5，pH＝7.0。所有储备液用前高压灭菌。

实施例8

杂合抗菌肽CC重组基因工程菌的发酵培养

挑取经氨苄青霉素压力下培养的重组大肠杆菌基因工程菌菌落于含有2mL LB培养基的试管中，150rmp／min摇菌过夜，作为一级种子接种于50mLLB／Amp培养基中，150rmp／min摇菌至对数期(约6h)。以4％的接种量接种于500ml LB／Amp中，培养至对数期，作为发酵种子备用。发酵罐发酵时，发酵体积为10L／20L，以4％接种量接种。

发酵液各组分及其添加量如下表11所示：

表11发酵液各组分和添加量

将培养基组分中的磷酸盐缓冲液单独配置和灭菌，其他组分于发酵罐中灭菌，灭菌完毕后，使用循环冷凝水系统降温，并控制温度在33℃，同时使罐内压力为正，0.05Mpa，点燃接种口灭菌环，罐内有无菌空气流出，调节各相关阀门控制气流不能太大，将配制好的Amp溶液和磷酸盐缓冲液以及种子液倒入发酵罐内灭菌的培养基中，整个过程注意尽可能降低染杂菌的机会。发酵过程中的条件设置为：温度33℃、罐压0.05Mpa、空气流量10L／min、转速290rmp／min，初始pH＝6.61，接种量4％，乳糖作为诱导剂在培养基中的初始添加量为0.5mmol／L，以后每3h以相同添加量添加一次(0.22μm膜过滤除菌)。发酵时间为12h。每1h取样一次，用以测定菌体密度和表达量，并每3h划平板(含Amp100μg／mL和不含Amp平板各一个)，观察质粒的稳定性变化(含Amp平板划菌长势好说明质粒稳定)，其结果如附图18所示。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC，其特征是，所述抗菌肽CC包括两对引物，其核苷酸序列如序列表序列3-6所示；

CGC G

ATCCGCCGGG

TTGGCTGAAA

AAACTGGGCA

AGCTGAAGGC

CCATAAGGCC

ACCATCCAAA

CCACTGGCGC

CGCCCAACAA

GCCGCCAACG

TTGCCGCCAC

CCTGAAGGGT

GCA

3487.15，+6.5，11.49，1.02。

2.根据权利要求1所述的一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，包括以下步骤：

S1.合成CC融合蛋白基因；

S2.构建杂合抗菌肽CC重组大肠杆菌基因工程菌；

S3.CC融合蛋白的诱导表达；

S4.CC的纯化；

S5.CC的生物学活性鉴定；

S6.CC融合蛋白诱导表达方式的转变；

S7.CC重组基因工程菌的发酵培养。

3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S1过程包括：根据家蝇cecropin基因(GenBank：DQ232774)并应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和三级结构和抗菌活性，设计出具有医疗潜力的杂合抗菌肽CC，在其基因序列前端引入三肽序列(Asp-pro-pro，DPP)；根据大肠杆菌对密码子的偏爱性将杂合抗菌肽的基因序列翻译成核酸序列，在其两端加上BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，合成两对引物F1、R1，F2、R2，应用重叠PCR技术合成杂合抗菌肽CC的基因；所述两对引物的核苷酸序列如序列表中序列3-6所示。

4.如权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S2过程包括：构建CC克隆质粒pMD18-T／CC并测序鉴定，构建表达质粒pGEX-6p-1／CC并测序鉴定，构建基因工程菌株pGEX-6P-1／CC／BL21(DE3)并测序鉴定，所述测序鉴定为：测序结果使用NCBI Blast与所设计的基因进行对比，选取两者结果一致的重组菌为测序结果正确的重组菌。

5.如权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S3过程中包括：将步骤S2中测序结果正确的重组菌和含有空载体的对照菌进行平板培养、种子培养，将发酵液中菌体生长到对数期后分别加入IPTG诱导表达，然后进行SDS-PAGE分析和western blot分析，选取表达成功的杂合抗菌肽CC。

6.如权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S4过程包括：将基因工程菌pGEX-6P-1／CC／BL21(DE3)大量培养、诱导，收集菌体并获得融合蛋白包涵体，经变性、复性后进行亲和层析纯化，纯化后的融合蛋白经甲酸切割后去除标签，然后进行定量，纯化样品保留。

7.如权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S6过程包括：利用乳糖来诱导杂合抗菌肽CC融合蛋白的表达，并将其与IPTG诱导的表达效果进行比较；在确定具有可行性的基础上，应用单因素试验设计对基因工程菌pGEX-6P-1／CC／BL21(DE3)的诱导时间、诱导温度和转速进行了优化；应用正交试验设计对乳糖的诱导浓度、碳源、磷酸盐和氯化钠的添加量进行了较大范围的初步优化；应用均匀试验设计对培养基组成的碳源、氮源、氯化钠、磷酸盐以及微量元素铁的添加量进行了优化，并进行回归建模。

8.如权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程杂合阳离子抗菌肽CC的获得方法，其特征是，所述S7过程中包括：应用均匀设计的回归模型Y=183.501+22.376X₁+0.710X₃-44.483X₄-872.168X₅+4.416X₄ ²+4673.818X₅ ²-59.618X₆ ²来预测结果，通过回归模型对发酵过程的控制和调整，获得高效表达、质粒稳定的发酵方法和条件。