CN114686550A

CN114686550A - 一种用于生产黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法

Info

Publication number: CN114686550A
Application number: CN202210474703.2A
Authority: CN
Inventors: 刘忠渊; 毛新芳
Original assignee: Chengdu Bofeng Zhiyu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Bofeng Zhiyu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-07-01

Abstract

本发明公开了一种用于黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，通过选用最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合的优化筛选基础上进行了培养基成分响应面试验，最终确定了发酵培养基的最佳组成。在确定了最佳培养基的配方组成后进一步对显著影响发酵产物中基因工程菌活菌数及发酵周期的培养温度、初始pH值、接种量的参数进行了优化。本发明采用优化后最佳培养基以及所优选的最适发酵培养条件对基因工程菌进行发酵培养，与常规方法相比较，本申请提供的用于黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法发酵后获得的黄粉虫抗菌肽与常规方法相比较提升了2.2倍。

Description

一种用于生产黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体的涉及抗菌肽的发酵制备的技术领域，更具体的涉及于生产黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法的技术领域。

技术背景

目前，全球抗生素药物的滥用，越来越多的细菌可能发展成为对传统抗生素耐药的菌株，因此，人们迫切地寻找能够代替传统抗生素的药物，致使抗菌肽的研究受到广泛重视。全球许多科研人员都在致力于抗菌肽作用机制、药物疗效、安全性等的研究。昆虫是地球上种类最多、数量最大的生物类群，其防御系统独特，当受到某些物理刺激或微生物感染后，会引起免疫反应，产生一系列抗菌物质，其中最重要的是抗菌肽。昆虫抗菌肽种类繁多，不同的诱导和分离方法均有可能获得不同的抗菌肽。另外，昆虫抗菌肽还能选择性地迅速杀灭耐药性细菌，并且在动物机体的免疫反应和维持稳态中发挥着多种功能。

黄粉虫(Tenebrio molitor Linnaeus)，别名黄粉甲、大黄粉虫，俗称面包虫，属于鞘翅目拟步甲科拟步甲属，是目前饲养量较大的一种资源性昆虫，饲养简单，抗病力强，作为优质蛋白替换鱼粉添加到饲料中不仅能促进动物生长而且还增强抗病能力和提高免疫力等。

近年来，国内针对黄粉虫抗菌肽的诱导条件、分离纯化、对靶细胞的作用机制及其基因克隆等方面已经有一些研究，但目前的现有技术对于黄粉虫抗菌肽的制备多停留在实验室阶段，但是采用现有的发酵培养基和发酵条件对相关工程菌株进行发酵培养，发酵产物中活菌数较低，对如何采用适当的发酵条件获得活菌数高，诱导产生高浓度、高活性抗菌肽的相关技术方案未见报道，

发明内容

针对现有技术中黄粉虫抗菌肽的制备批量化生产过程中的发酵不稳定，扩大化培养制备获得的抗菌肽活性较低的技术问题。本发明旨在提供用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，采用黄粉虫抗菌肽制备最佳适配发酵培养基和发酵条件，能够非常显著的提高基因工程菌的活菌数及黄粉虫抗菌肽制备效率，为今后昆虫抗菌肽部分或者完全替代抗生素应用奠定坚实的基础，从而为其作为新型的绿色抗生素提供新的思路和科学依据。

为了实现本发明的目的,本发明的技术方案如下：

本申请提供一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，所述方法中，将基因工程菌接种到发酵培养基中进行发酵培养，即得。

所述发酵培养基的总重量计，包括碳源0.1-10％；氮源0.1-10％；无机盐和微量元素0.01-5％。

优选的，所述发酵培养基中的碳源为甘油。

优选的，所述发酵培养基中的氮源为花生饼粉和玉米浆。

优选的，所述发酵培养基中的无机盐组合是氯化钙，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。

优选的，所述发酵培养基的组成为：甘油15g/L，花生饼粉15g/L，玉米浆15g/L，氯化钙5g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二钠5g/L，余量是水。

优选的，所述发酵培养温度为22℃-37℃。

优选的，所述发酵培养温度为34℃。

优选的，所述发酵培养基的pH为7.0。

所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法中，将基因工程菌按照0.5-10％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养。

优选的，所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法中，将基因工程菌按照1-3％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养。

更优选的，所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法中，将基因工程菌按照2％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养。

通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果∶

(1)本发明提供一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，本发明采用优化后最佳培养基以及所优选的最适发酵培养条件对黄粉虫抗菌肽基因工程菌进行发酵培养，结果发现优化后活菌数为9.6×10⁹cfu/mL，是采用优化前的初始培养基及初始发酵条件下培养的发酵液的2.6倍，发酵周期缩短4小时。

(2)采用本发明优化的最佳培养基以及最适的发酵培养基条件能够极其显著的提高基因工程菌的发酵效率，本发明采用优化后最佳培养基以及所优选的最适发酵培养条件对基因工程菌进行发酵培养，与常规方法相比较，本申请提供的用于黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法发酵后获得的黄粉虫抗菌肽与常规方法相比较提升了2.2倍。为今后昆虫抗菌肽部分或者完全替代抗生素应用奠定坚实的基础，从而为其作为新型的绿色抗生素提供新的思路和科学依据。

附图说明

图1所示为发酵过程中黄粉虫抗菌肽产量变化影响情况图。

图2所示为不同接种量对黄粉虫抗菌肽产量变化影响情况图。

图3所示为不同发酵温度对黄粉虫抗菌肽产量变化影响情况图。

图4所示为不同pH对黄粉虫抗菌肽产量变化影响情况图。

图5所示为不同碳源对黄粉虫抗菌肽产量变化影响情况图。

图6所示为不同氮源对黄粉虫抗菌肽产量变化影响情况图。

图7所示为不同无机盐对黄粉虫抗菌肽产量变化影响情况图。

图8所示为花生饼粉与甘油对黄粉虫抗菌肽产量变化交互影响曲面与等高线图。

图9所示为甘油与玉米浆对黄粉虫抗菌肽产量变化交互影响曲面与等高线图。

图10所示为花生饼粉与玉米浆对黄粉虫抗菌肽产量变化交互影响曲面与等高线图。

具体实施方式：

以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：

主要试剂：Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNAMarker、蛋白质Marker、蛋白胨、酵母浸出粉、丙烯酰胺、甲叉双丙稀酰胺、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等。

主要仪器：PCR仪、高压灭菌锅、气浴恒温振荡器、电子天平、微波炉、超纯水仪、超净工作台、恒温培养箱、热空气消毒柜、台式冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像仪等。

本申请中制备获得的E.coli BL21转基因工程菌在专利“一种重组突变的黄粉虫抗菌肽的高效表达及其应用”。其专利申请号为：201110009913.6中有详细的记载与披露，是本课题组前期制备获得。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一：一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法

优选的，所述发酵培养基中的碳源为甘油。

优选的，所述发酵培养基中的氮源为花生饼粉和玉米浆。

优选的，所述发酵培养温度为22℃-37℃。

优选的，所述发酵培养温度为34℃。

优选的，所述发酵培养基的pH为7.0。

实施例二：工程菌株的构建

1、黄粉虫总RNA的提取

操作前实验台用紫外灯照射30min后，取一条大约5龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，粉末移入装有1mLTrizol试剂的Eppendorf管中，盖紧盖激烈震荡15s，15～30℃室温放置3～5min，4℃、12000r/min离心15min，小心的将上清移入干净Eppendorf管中，加入氯仿0.22mL抽提蛋白质，震荡15s，15～30℃室温放置3～5min，4℃、12000rpm离心10min，溶液分成上、中、下三层，其中无色上层即为含RNA层。将此层移入洁净的1.5mL的Eppendorf管中，加入异丙醇0.5mL，15～30℃室温放置10min，4℃、12000rpm离心10min。弃上清，沉淀部分加入75％乙醇溶液(无RNA酶水配置)1mL，洗涤，4℃、7500r/min离心5min。弃上清，待沉淀干燥后，加入无RNA酶水，轻轻混匀，使其充分溶解，A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测，其余-70℃保存。

2、反转录合成cDNA

EP管中配制下列模板RNA/引物混合液：10μL总RNA，10μLOligodT-Adaptor引物，31.5μL无RNase的水，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。离心数秒使模板RNA/引物的变性液聚集于管底。再加入51.5μL上述RNA/引物变性溶液，20μL 5×M-MLV缓冲液，20μL dNTP，2.5μL RNase抑制剂，6μL RNase M-MLV(RNase H-)。42℃保温1h，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。

3、突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的PCR扩增

克隆突变的成熟肽基因序列引物：

上游引物MF1：CGCGGATCCTTCCCTCTTAGGAGAGCGGCAACAGCTG

下游引物MR1：CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTCPCR反应体系：13.9μL dd H₂O，2μL 10×Taq缓冲液，1.6μL dNTPs，0.6μLMg²⁺，0.4μLPrimer(M F1)，0.4μL Primer(MF2)，1μL cDNA

PCR反应条件：95℃预变性1min，95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环。最后72℃温育10min。测序分析结果证明约195bp大小的基因片段是突变的黄粉虫抗菌肽基因TmAMP1m序列。

4、原核表达载体的构建

将回收的PCR产物TmAMP1m基因与表达载体pET30a分别进行双酶切，轻弹管壁，混匀并离心，37℃酶切6小时。在一微量离心管中分别依次加入10×KBuffer 15μL；TmAMP1m55μL；BamHI 6μL；XhoI 6μL；双蒸水70μL；总体系150μL。采用TIANGEN生物公司的PCR产物回收试剂盒，对双酶切的TmAMP1m，pET30a进行回收，然后进行连接反应；在一个微量离心管中依次加入10×连接缓冲液1μL；TmAMP1m 7μL；pET30a 0.7μL；T4DNA连接酶1μL；双蒸水0.3μL；总体积10μL。16℃，过夜连接。

5、重组质粒pET30a-TmAMP1m的转化与鉴定

将连接产物与35μL感受态细胞E.coli DH5α混匀，冰浴30min，然后42℃水浴热休克45s，迅速取出冰浴3min。在每管中加入800μLLB培养液，混匀，37℃温和振荡培养1h。4℃，3000rpm，离心1min，吸弃600μL上清，轻轻吹打混匀剩余菌液，在准备好的固体LB培养基(含卡那霉素)上均匀的涂布，37℃过夜培养。将过夜长出的阳性克隆挑取到6mL LB培养基(含卡那霉素)中培养12-16h。菌液PCR方法鉴定重组质粒正确。按照碱裂解法提取质粒DNA。

6、重组质粒pET30a-TmAMP1m的原核表达

将提取的质粒pET30a-TmAMP1m5μL转化感受态细胞E.coli BL21，卡那霉素筛选获得阳性克隆。

实施例三：一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法

基于实施例一至实施例二，温度22℃，接种量0.5％，培养液初始pH4，最适培养基组成为：玉米粉15.4g/L、玉米浆14.6g/L、酵母浸粉14.8g/L、K₂HPO₄5g/L、KH₂PO₄5g/L、MgSO₄5g/L对E.coliBL21基因工程菌进行培养获得黄粉虫抗菌肽。

实施例四：一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法

基于实施例一至实施例二，温度25℃，接种量1％，培养液初始pH5，最适培养基组成为：麦芽糖15.4g/L、豆粉饼14.6g/L、蛋白胨14.8g/L、K₂HPO₄5g/L、KH₂PO₄5g/L、MgSO₄5g/L对E.coli BL21基因工程菌进行培养获得黄粉虫抗菌肽。

实施例五：一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法基于实施例一至实施例二，温度28℃，接种量5％，培养液初始pH6。最适培养基组成为：葡萄糖15.4g/L、花生饼粉14.6g/L、玉米浆14.8g/L、K₂HPO₄5g/L、KH₂PO₄5g/L、KCl5g/L。对E.coli BL21基因工程菌进行培养获得黄粉虫抗菌肽。

实施例六：一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法

基于实施例一至实施例二，温度34℃，接种量2％，培养液初始pH7。最适培养基组成为：甘油15.4g/L、花生饼粉14.6g/L、玉米浆14.8g/L、K₂HPO₄5g/L、KH₂PO₄5g/L、CaCl₂5g/L。对E.coli BL21基因工程菌进行培养获得黄粉虫抗菌肽。

实施例七：一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法

基于实施例一至实施例二，温度37℃，接种量10％，培养液初始pH9。最适培养基组成为：可溶新淀粉15.4g/L、豆粕粉14.6g/L、蛋白胨14.8g/L、K₂HPO₄5g/L、KH₂PO₄5g/L、CaCl₂5g/L。对E.coliBL21基因工程菌进行培养获得黄粉虫抗菌肽。

实施例八：发酵培养工艺优化

基于上述实施例三至实施例七，进行发酵培养工艺优化。

1、种子液制备将冻干管保藏的E.coli BL21基因工程菌使用无菌水适当稀释后，于LB平板上划线，并置于34℃恒温培养箱内培养24h。用接种环从平板上挑取单菌落，接种于装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，34℃、220r/min摇床培养12～14h，即为E.coli BL21基因工程菌种子液。

2、培养过程中黄粉虫抗菌肽含量检测将E.coliBL21基因工程菌种子液以2％(V/V)接种量接入优化后的发酵培养基中，按照基础培养条件34℃、220r/min摇床培养，设置3个重复，每隔3h取样并测定发酵液中黄粉虫抗菌肽含量。采用高效液相色谱法检测E.coliBL21基因工程菌发酵液中黄粉虫抗菌肽浓度。以时间为横坐标，枯草芽孢杆菌含量为纵坐标，绘制曲线图。

3、摇瓶发酵条件与培养基单因素优化

3.1摇瓶发酵条件优化设置0.5％、1％、2％、3％、5％、10％等6个接种量梯度，22、25、28、31、34、37℃共6个培养温度，使用HCL(9.1mol/L)和NaOH(9.1mol/L)将发酵液体培养基的pH分别调至4、5、6、7、8、9。以上发酵条件优化时，除试验单因素为变量外。

3.2碳源、氮源的优化：碳源包括10g/L的葡萄糖、麦芽糖、甘油、玉米粉、可溶性淀粉；氮源包括20g/L的豆饼粉、花生饼粉、玉米浆(干物质≥50％)、酵母浸粉、豆粕粉。除以上单因素为变量外，其余培养基成分不变，接入3.1中筛选的最佳接种量的E.coli BL21基因工程菌种子液。34℃、220r/min摇床培养24h，设置3个重复，测定发酵液中黄粉虫抗菌肽含量。

3.3无机盐的优化：在初始培养基LB中添加含量均为99％的K₂HPO₄、KH₂PO₄、CaCl₂、KCl、MgSO₄等5种无机盐作为对照组，在无机盐种类筛选试验中，每次去除1种无机盐，考察其对黄粉虫抗菌肽产量的影响，培养基中的氮源和碳源为3.2中筛选的最佳成份。灭菌后接入最佳接种量E.coli BL21基因工程菌种子液，34℃、220r/min摇床培养24h，测定发酵液中黄粉虫抗菌肽含量，设置3个重复。根据无机盐去除试验结果，选取重要的3种无机盐，按照L⁹(33)正交表设计正交试验，对正交试验的结果进行DOE分析，确定最佳无机盐组合。

表1：无机盐正交试验设计

4、培养基组分筛选

4.1最陡爬坡试验根据单因素优化结果，选取最适的3种培养基成分进行最陡爬坡试验，试验设计见表2，发酵结束后测定各试验组黄粉虫抗菌肽含量。

表2：最陡爬坡试验设计

4.2Box-Behnken响应面设计根据最陡爬坡试验结果，选定花生饼粉15g/L、甘油15g/L、玉米浆15g/L，用Design-expert软件进行Box-Behnken响应面试验设计，各因素编码见表3。每组试验3个平行，结果取平均值。

表3：响应面试验因素及水平表

5、摇瓶验证试验在获得的最佳发酵条件下，用优化后的培养基与培养条件进行摇瓶发酵验证试验，与优化前做对比，取3次重复试验的平均值，验证新工艺的发酵效果。

6、实验结果

6.1发酵过程中黄粉虫抗菌肽含量测定与产量变化结果

发酵过程中黄粉虫抗菌肽含量测定采用高效液相色谱法检测E.coli BL21基因工程菌发酵液中黄粉虫抗菌肽含量，对照品和发酵液均在9min左右出现目的峰，因此可采用此方法开展后续黄粉虫抗菌肽含量测定。结果发现优化后培养活菌数为9.6×10⁹cfu/mL，是采用优化前的初始培养基及初始发酵条件下培养的发酵液的2.6倍，发酵周期缩短4小时。

发酵过程中黄粉虫抗菌肽产量变化情况参见附图1可知，随着培养时间延长，黄粉虫抗菌肽的产量呈现先上升后下降的趋势，24h达到最大值526μg/mL。因此，在后续培养条件和培养基优化过程中，均培养24h再取样测定黄粉虫抗菌肽含量。并以黄粉虫抗菌肽最高含量526μg/mL作为基础，对比后续优化效果。

6.2摇瓶发酵条件与培养基单因素优化

摇瓶发酵条件优化由附图2、附图3、附图4可知，随着接种量和培养温度及pH的增加，黄粉虫抗菌肽的产量均呈现先上升后下降的趋势。当接种量为2％时，黄粉虫抗菌肽产量最高，达到516μg/mL，与其他接种量相比，差异显著(P＜0.05)；当接种量为0.5％，黄粉虫抗菌肽产量最低，为120μg/mL。培养温度为34℃时，产量最高，达到520μg/mL，与其他温度组相比，差异显著(P＜0.05)。当初始pH为7.0时，黄粉虫抗菌肽产量最高，为514μg/mL，与其他各组相比，差异显著(P＜0.05)。因此，后续优化试验的发酵条件均选择2％的接种量、34℃的培养温度和初始pH7.0。

6.3碳源、氮源的优化

由附图5、附图6可知，6种碳源中甘油组黄粉虫抗菌肽产量最高，为534μg/mL，与其他各组相比，差异显著(P＜0.05)；在6种氮源中，花生饼粉作氮源时，黄粉虫抗菌肽产量较高，为525μg/mL，和其他组相比，差异显著(P＜0.05)。在无机盐优化试验中，暂时选用甘油作氮源，后续响应面优化中，将考察花生饼粉和玉米浆的交互作用。

6.3无机盐筛选优化

由附图7可知，5种无机盐中CaCl₂对E.coli BL21基因工程菌产黄粉虫抗菌肽影响最大，其次为K₂HPO₄和KH₂PO₄。去除无机盐CaCl₂的培养基，黄粉虫抗菌肽产量仅为201μg/mL，比全盐培养基(452μg/mL)显著降低(P＜0.05)。去除MgSO₄或KCl培养基，发酵液黄粉虫抗菌肽产量与全盐培养基相比，差异不显著(P＞0.05)。因此，在后续培养基中不再添加MgSO₄和KCl，而CaCl₂(A)、K₂HPO₄(B)、KH₂PO₄(C)的添加量将通过正交试验确定。正交试验结果见表4，由R值可知，3种无机盐中，影响E.coli BL21基因工程菌产黄粉虫抗菌肽的主要因素排序是：A＞C＞B(即CaCl₂＞KH₂PO₄＞K₂HPO₄)；由K值可知，因素间最佳水平组合是A₂B₂C₂，即无机盐的最佳组合是：CaCl₂5g/L、K₂HPO₄5g/L、KH₂PO₄5g/L。

表4：无机盐正交试验结果

6.4培养基组分筛选

最陡爬坡试验由表5可知，不同培养基成分发酵后，第3组黄粉虫抗菌肽产量最高，与其他组相比，差异显著(P＜0.05)。因此，下一步以该组培养基成分用量(花生饼粉15g/L、甘油15g/L、玉米浆15g/L)作为Box-Behnken试验的中心参考点。

表5：最陡爬坡试验结果

响应面优化以黄粉虫抗菌肽产量为响应值，响应面结果见表6。

表6：响应面设计及优化结果

表7：方差分析表

对结果进行回归分析，得到如下方程：Y＝463.3+38.34A+55.12B+4.32C+29AB－36.35AC－56.21BC－75.3A²－84.1B²－49.12C²，相关系数R²＝0.993，说明得到的方程拟合度好，可以用该方程对试验结果进行预测。式中，Y为黄粉虫抗菌肽的产量，μg/mL；A为甘油添加量，g/L；B为花生饼粉添加量，g/L；C为玉米浆添加量，g/L。根据表7方差分析结果可知，一次项A、B对响应值具有显著的影响，交互项和二次项对响应值具有显著的影响。模型P值＜0.05，失拟项0.2588＞0.05，说明模型具有显著性。通过对模型进行求解，达到极点值甘油、花生饼粉、蛋白胨、玉米浆分别为15.4、14.9、14.8g/L时，黄粉虫抗菌肽产量预测值最大，理论值可达525μg/mL。为了更加清晰地描述甘油、花生饼粉、玉米浆3个因素对响应值的影响，对模型的响应面做出了立体分析图参见附图。由附图8、附图9、附图10可知，花生饼粉与甘油、甘油与玉米浆、花生饼粉与玉米浆各个因素的等高线都近似为圆形，说明各因素之间的相互作用较小。

本研究最终确定最适发酵条件：温度34℃，接种量2％，培养液初始pH7。最适培养基组成为：甘油15.4g/L、花生饼粉14.6g/L、玉米浆14.8g/L、K₂HPO₄5g/L、KH₂PO₄5g/L、CaCl₂5g/L。对配方和优化工艺参数进行验证的结果表明，E.coli BL21基因工程菌抗菌肽的平均产量为526μg/mL，是优化前产量(239μg/mL)的2.2倍。

本发明公开了一种用于黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，通过选用最适碳源、最适氮源、最适无机盐以及最适无机盐组合的优化筛选基础上进行了培养基成分响应面试验，最终确定了LD培养基的最佳组成。在确定了最佳培养基的配方组成后进一步对显著影响发酵产物中基因工程菌活菌数及发酵周期的培养温度、初始pH值、接种量的参数进行了优化。本发明采用优化后最佳培养基以及所优选的最适发酵培养条件对基因工程菌进行发酵培养，与常规方法相比较，本申请提供的用于黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法发酵后获得的黄粉虫抗菌肽与常规方法相比较提升了2.2倍。为今后昆虫抗菌肽部分或者完全替代抗生素应用奠定坚实的基础，从而为其作为新型的绿色抗生素提供新的思路和科学依据。

Claims

1.一种用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，包括：将基因工程菌接种到发酵培养基中进行发酵培养，即得。

2.如照权利要求1所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的总重量计，包括碳源0.1-10％；氮源0.1-10％；无机盐和微量元素0.01-5％。

3.如照权利要求1所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中的碳源为甘油。

4.如照权利要求1所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中的氮源为花生饼粉和玉米浆。

5.如照权利要求1所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中的无机盐组合是氯化钙，磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。

6.如照权利要求1所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：甘油15g/L，花生饼粉15g/L，玉米浆15g/L，氯化钙5g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二钠5g/L，余量是水。

7.如照权利要求1所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养温度为22℃-37℃。

8.如照权利要求7所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养温度为34℃。

9.如照权利要求1所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH为7.0。

10.如照权利要求1所述的用于制备黄粉虫抗菌肽的发酵制备方法，其特征在于，将基因工程菌按照0.5-10％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养。