CN102879589A - 一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法，以及能高产量重组表达人NT-proBNP的方法，具体涉及利用大肠杆菌表达系统生产制备重组人B型利钠肽前体（NT-proBNP），通过制备过程和条件的优化，获得了一个能高产量表达人NT-proBNP的制备工艺，通过加入稳定保护剂获得了能够稳定保存的人NT-proBNP制剂。本发明加入稳定保护剂后制备的天然人NT-proBNP制剂能在-20℃和-80℃条件下稳定存在，生物活性没有降低。为NT-proBNP作为临床诊断试剂标准品及抗体制备提供了稳定的原料来源。

Description

一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法，以及能高产量重组表达人NT-proBNP的方法，属于医药生物技术领域。

【背景技术】

利钠肽（NP）家族现在越来越受到重视，大多数人类利钠肽家族是由心脏分泌的，并起到控制水盐平衡、维持压力调节稳态等作用。心血管利钠肽内分泌组分包括ANP、BNP、CNP、DNP和VNP。尽管分型各不相同，但是大多数种类的利钠肽在相同种属间的进化是相当保守的。在种属内存在差异的（哺乳动物）只有BNP及其氨基末端前体BNP（NT-proBNP）。

B型利钠肽除了具有利钠肽共有的那些功能外，还可能具有抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、抗心肌纤维化、强松弛性等作用。BNP主要在心脏表达，尤以心房表达更加丰富。另外，BNP的释放受到压力和容量两种因素调节，进而能预示出心室容积扩大、左室舒张末期压增大，心室超负荷以及心脏损伤程度等一系列心血管异常情况。

NT-proBNP是在BNP前体（proBNP）形成BNP过程中产生的一种无生物活性的蛋白，在代谢过程中，产生的BNP与NT-proBNP含量相同，所以NT-proBNP与BNP同样可以作为一种心脏标志物。但是NT-proBNP缺乏主动清除机制，NT-proBNP在体液中的半衰期要长，浓度更大，更容易检测，并且检测样本更容易获得，因此其已经成为一种主要的心脏检测指标。

2011年9月29日，世界心脏联盟在第12个“世界心脏日”上提到心血管病是威胁人类健康的“第一杀手”，每年全球有1710万人死于心血管疾病，约占全球死亡人数的1/3。2010年中国心血管病报告指出，我国人群心血管病（心脏病、脑卒中）的发病和死亡率呈持续上升阶段。估计全国心血管病2.3亿人，全年死于心血管病300万人，占总死亡原因的41%，居各种死因的首位。大多数的心血管病都是可以通过减少诱因，早期诊断等手段进行预防的。

1991年DzauV等提出的心血管病时间链，自此，人们开始认识到心血管病不是一种独立的突然发生的病症，而是许多相互联系的因素不断发展的过程。心力衰竭处于心血管事件链的末期，早期诊断对于心衰来说，尤为重要。目前心衰常用的诊断方法主要有几种，但是都有各自的局限性。症状判断如呼吸困难、水钠潴留等在诊断时不能特异性诊断。辅助检查如心电图、胸片、肺功能等缺乏标准化的判断标准，因此对结果的阐述具有主观性。实验室检查如血小板计数，甘油三酯等，虽然客观但不便于检测心衰的预后和治疗。影像学检查如心脏超声是心衰诊断的“金标准”，但不同中心检查的结果没有可比性，而且价格高不便于实时监测及常规检查。

自2006年11月12-15日在伊利诺伊州芝加哥举办的美国心脏协会科学会议上许多新生物标记检测带头人进行讲座并阐述了NT-proBNP的临床意义后，NT-proBNP检测在世界范围内推广起来，许多医院实验室被要求进行NT-proBNP的检测。NT-proBNP免疫检测的问世，解决了以上诊断方法的很多问题。NT-proBNP检测客观、能够实现定量、重复性好、特异性高、敏感快速，所以该诊断检测自问世以来，被誉为“划时代的心衰标志物”。NT-proBNP不仅可以用于心衰治疗，目前许多文献报道NT-proBNP可以用于心肌损伤、血栓、炎症、血脂状态、2型糖尿病等其他疾病诊断，未来具有良好的应用前景。

2000年11月22日，美国FDA首次批准了Biosite Diagnostics公司的BNP辅助诊断试剂盒。2002年11月19日，首个NT-proBNP免疫检测试剂盒由罗氏诊断公司制造并上市。虽然NT-proBNP检测已经广泛应用，但是目前并没有统一的标准品。NT-proBNP标准品是目前国内诊断市场亟待解决的一个问题。

由于NT-proBNP目前已经作为生化检验中重要的一种检测指标，因此NT-proBNP标准品目前在临床应用广泛，NT-proBNP标准品的用量非常大，目前常用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、毕氏酵母表达系统、真核细胞表达系统等。然而，真核表达系统投资巨大，表达周期长，生产条件要求高。并且NT-proBNP氨基酸结构简单，并没有复杂的翻译后加工过程，所以选择大肠杆菌表达系统是经济实用，表达产率高，纯化工艺简单的一种生产策略。目前，市面上的NT-proBNP标准品大多是采用大肠杆菌表达系统表达后再纯化的产品。因其需求量大，因此需要能高产量重组表达NT-proBNP的方法。

NT-proBNP标准品的瓶颈在于其稳定性，要做到一级标准品要求NT-proBNP要稳定两年以上，而天然的NT-proBNP具有73个氨基酸，分子量小，易降解，半衰期仅为24小时。随着生物技术在诊断领域的发展，引进了许多新的多肽获得方法。本发明则利用了基因工程的方法表达NT-proBNP，并在前期基因设计综合考虑NT-proBNP的结构特性，得到了重组的NT-proBNP多肽。重组NT-proBNP与天然的NT-proBNP具有相同的氨基酸，并且具有相同的免疫原性。本发明获得的NT-proBNP与之前国内授权的专利（一种用作NT-proBNP免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用，申请号200810069299.0）及与易维京等报道的《人NT-proBNP的高效原核表达及免疫学检测标准品的研究》（第三军医大学学报第30卷第6期）相比，本发明制备的NT-ProBNP，为完全天然构象的重组人NT-ProBNP，而易维京等制备的重组NT-ProBNP是非天然的83个氨基酸构象的NT-proBNP，其中存在的多余氨基酸可能会影响蛋白的构象、免疫原性及蛋白的生化物理性质等。

因此提供能高产量重组表达人NT-proBNP的方法和稳定的人NT-proBNP制剂具有广泛的社会需求。本发明在采用大肠杆菌表达天然构象的重组人NT-ProBNP时，首先对重组表达条件进行了优化，例如选择了大肠杆菌偏好的密码子，对大肠杆菌的培养条件，例如培养过程中所采用的碳源、氮源、无机盐和手菌时间等进行了筛选和优化。采用经过筛选优化的条件进行发酵培养时，大肠杆菌表达系统每升菌可以收获60g菌体，最终可获得50-60mg目的蛋白。与目前文献报道相比，本发明的重组表达方法大大提高了NT-proBNP的产量。在将NT-proBNP纯化后，为了保持NT-proBNP的稳定性，防止NT-proBNP降解，本发明对保存NT-proBNP蛋白的条件进行了筛选和优化，筛选发现含0.1%BSA，20%甘油和10%甘露醇的PH7.4的PBS缓冲液能够稳定保护NT-proBNP，防止其发生降解。目的蛋白保存在稳定保护剂中，分别在三种不同温度下，采用罗氏公司的NT-proBNP检测试剂盒监测其活性，加入保存缓冲液的NT-proBNP生物活性100天下降了12.7%，储存在-20℃和-80℃，在100天内，生物活性没有降解，仍然维持在原水平。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的在于提供一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法，以及能高产量重组表达人NT-proBNP的方法。

[技术方案]

本发明的一个目的是提供一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂，其特征在于，其中的NT-proBNP保存在含0.1%BSA，20%甘油和10%甘露醇的PH7.4的PBS缓冲液中，NT-proBNP的氨基酸序列如SEQ No.1。

在本发明中，表示浓度的“%”如无特殊说明，均指质量体积分数，例如“含0.1%BSA，20%甘油和10%甘露醇的PH7.4的PBS缓冲液”是指“PH7.4的总量为100ml的PBS缓冲液中含有0.1g BSA、20g甘油和10g甘露醇”。

本发明的另一目的是提供制备能稳定保存的人NT-proBNP制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：在大肠杆菌中重组表达人NT-proBNP，分离和纯化得到人NT-proBNP后，将人NT-proBNP加入到含0.1%BSA，20%甘油和10%甘露醇的PH7.4的PBS缓冲液中，制备得到能稳定保存的人NT-proBNP制剂，在表达人NT-proBNP时，采用大肠杆菌偏好的密码子，其中编码人NT-proBNP的核苷酸序列如SEQ No.2。在表达人NT-proBNP时，培养大肠杆菌采用的碳源是1%甘油，氮源是0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨和1%NH₄Cl，无机盐添加物为5mM硫酸镁，收菌时间为4小时。

本发明的NT-proBNP稳定制剂的制备保存方法，可以获得稳定的NT-proBNP重组蛋白。其与天然NT-proBNP具有相同的氨基酸序列并具有生物学活性，可以用现有的诊断试剂盒检测，重组蛋白可用作NT-proBNP检测试剂盒的标准品。

根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中表达序列的优化是指按照大肠杆菌密码子偏好性对人NT-proBNP核苷酸序列进行优化；其中表达载体是指pET32a载体，并保留pET32a载体中自带的组氨酸标签、硫氧还蛋白和肠激酶切位点部分，故菌体表达的融合蛋白为Trx-NT-proBNP；其中表达方式是指高效融合蛋白可溶表达；其中表达菌种是指大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌。

根据这一发明目的的一个优选方案，其中纯化方法是指通过镍柱亲和层析（HisTrap FF）可将融合蛋白纯化出来。融合蛋白通过超滤浓缩更换酶切缓冲液，带标签的肠激酶在常温酶切16小时，可完全切开。酶切结束后立即加入缓冲液A和10mM咪唑，在此环境下，过镍柱亲和层析，流下来的组分即为NT-proBNP。通过超滤浓缩，浓缩NT-proBNP后保存在PH6-8的保存缓冲液B中。其中缓冲液A系统指的是在tris、磷酸盐及醋酸盐缓冲液中，最终确定采用醋酸盐缓冲系统（PH7.4）。

根据这一发明目的的一个优选方案，其中保存缓冲液B是指在多种稳定保护剂中筛选得到的能够使NT-proBNP保持稳定而不发生降解的配方。经过筛选确定的稳定保护剂配方为以质量体积比计含0.1%BSA，20%甘油和10%甘露醇的PBS缓冲液（PH7.4）。未添加保护剂的重组NT-proBNP储存在4℃半衰期为4天，加入保存缓冲液B的NT-proBNP生物活性100天下降了12.7%，储存在-20℃和-80℃，在100天内，生物活性没有降解，仍然维持在原水平。这也充分表明本发明中的重组NT-proBNP制剂能够作为免疫诊断试剂盒标准品使用的广泛应用前景。

本发明的另一目的是提供一种在大肠杆菌中重组表达制备人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于，在表达人NT-proBNP时，采用大肠杆菌偏好的密码子，使用的编码人NT-proBNP的核苷酸序列如SEQNo.2。培养大肠杆菌培养大肠杆菌采用的碳源是1%甘油，氮源是0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨，1%NH4Cl，无机盐添加物为5mM硫酸镁，收菌时间为6小时。

本发明的NT-proBNP重组蛋白与天然NT-proBNP具有相同的氨基端序列，编码NT-proBNP重组蛋白的核苷酸序列是采用大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化的核苷酸序列。

依据这一发明目的，本发明提供了一种NT-proBNP重组蛋白的发酵工艺研究方法及发酵工艺，主要包含以下步骤:

菌种生长曲线的确定，选择生长对数期，获得最佳接种时间；

蔗糖、葡萄糖、甘油三种常用碳源在三个水平上进行表达优化，确定发酵碳源；

有机氮源酵母粉、蛋白胨与无机氮源氯化铵不同比例组合优化表达，确定发酵氮源；

硫酸镁、磷酸盐两种常用无机盐表达优化，确定发酵无机盐成分；

将菌种接种至优化好的培养基中，做出生长曲线，确定发酵培养时间；

选择不同浓度的IPTG表达优化，确定诱导剂浓度；

诱导不同时间表达优化，确定诱导时间；

在不同温度下诱导进行表达优化，确定诱导温度；

NT-proBNP发酵工艺；

NT-proBNP重组蛋白表达量的鉴定。

上述发酵工艺研究方法中，在2YT基础培养基基础上，先确定菌种生长曲线，分别对碳源、氮源、无机盐、发酵时间、诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度进行优化进而确定NT-proBNP发酵工艺。

所述的2YT基础培养基是现有产品，例如常州普洛立德生物科技有限公司销售的2YT培养基产品。

上述发酵工艺中，主要包括以下步骤：

①NT-proBNP菌种以0.1%接种量接种至2YT培养基中，37℃，200rpm过夜培养作为种子；

②接种至以质量体积比计含1%甘油、1.5%酵母粉、0.5%蛋白胨，1%氯化铵、0.5%氯化钠、5mM硫酸镁、50ug/ml氨苄的基础培养基中，在37℃、PH6.7-7.1菌体生长阶段通过调节搅拌转速、罐压和通气量控制溶氧不低于30%，使菌体密度达到30左右时开始降温；

③在发酵过程中，补料大约为基础培养基的1/3，补料培养基成分为15%酵母粉、15%甘油、0.3%氯化铵、5mM硫50ug/ml酸酸镁；补料速度在菌体生长阶段分两个阶段补，生长1h复苏后慢速补料补1/3，生长对数期快速补料1/2，诱导时期慢速补料1/6；

④待温度降至30℃，加入终浓度0.2mM的IPTG进行诱导表达4-6h后，放罐离心收集菌体。

上述重组蛋白表达量鉴定中，主要利用菌体收集后，超声破菌提出总蛋白，通过SDS-PAGE电泳跑出电泳图，再通过IMAGE软件进行图片灰度分析，得到重组蛋白的表达量。

[有益效果]

本发明得到的NT-proBNP制剂中的重组人NT-ProBNP具有天然构象，活性高，在稳定保护制剂中稳定性强，有利于其作为免疫诊断标准品的应用。而且，本发明所采用的重组表达方法的表达产量高，为大量获得重组人NT-ProBNP提供了有力保障。稳定抗原的获得为下一步制备特异性抗体提供了可能，也为组装一个新的NT-proBNP免疫诊断试剂盒提供了一个广阔的前景。

【附图说明】

图1：转化后的BL21（DE3）表达菌株中提取的质粒的酶切图谱；

图2：采用不同碳源培养大肠杆菌后，收获的总蛋白的电泳图谱；

图3：采用不同氮源培养大肠杆菌后，收获的总蛋白的电泳图谱；

图4：采用不同无机盐培养大肠杆菌后，收获的总蛋白的电泳图谱；

图5：培养大肠杆菌时，采用不同的培养时间，收获的总蛋白的电泳图谱；

图6：重组表达人NT-proBNP蛋白时，不同菌体部分的电泳图谱；

图7：纯化人NT-proBNP蛋白时，收集的多个不同阶段的组分的电泳图谱；

图8：第一次镍柱纯化后的人NT-proBNP蛋白在多个不同酶切条件下的酶切图谱；

图9：第二次镍柱纯化后，得到的纯的NT-proBNP的电泳图谱。

图10：包含稳定保护剂的NT-proBNP制剂在不同条件下的活性变化。图中横坐标轴表示检测的天数，纵坐标表示测出的样品中NT-proBNP的含量。

图11：不同纯化方案表达目的蛋白后的活性比较。

【具体实施方式】

实施例一目的基因的合成及克隆、转化、双酶切鉴定

优化好的如上所述的编码人NT-proBNP的核苷酸序列由上基因海生工生物工程技术服务有限公司合成，在合成得到核苷酸序列后将序列克隆至pET32a载体中。

转化BL21（DE3）表达菌株：将感受态自-80℃冰箱中取出，放置于冰上解冻。解冻后加入1μg合成好的质粒，冰浴30min，42℃热击60-90s，冰上放置2min（此过程不要移动），加入900ul LB培养基，37℃160rpm摇45min后，取出100μl涂布于氨苄抗性的LB平板，37℃倒置培养过夜，待长出单克隆菌落后，调取单克隆培养，保存菌种。

双酶切鉴定：接种部分菌种进行扩大培养，收获菌体并从菌体中提取质粒。将提取出来的质粒用NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切进行鉴定，应该在300bp和5000bp左右时分别出现两个条带。通过凝胶电泳显示的结果与理论推断结果相一致，表明优化后的如上所述的编码人NT-proBNP的核苷酸序列已经成功插入pET32a载体中。结果如图1所示。

实施例二转化了NT-proBNP的BL21（DE3）菌株的发酵条件优化

菌种生长曲线的确定：分别按1%和0.1%的甘油菌于LB培养基中，每隔一段时间测定OD₆₀₀，分别做出生长曲线，以确定合适的接种量。最终选用0.1%作为最佳接种量，种子过夜振荡培养。

碳源的确定：0.1%的甘油菌接入LB培养基（Amp100μg/ml），37℃，210rpm过夜震荡培养。以1%的接种量分别接入15ml培养基中（在2YT培养基的基础上分别取蔗糖，葡萄糖，甘油三因素的两个浓度0.5%和1%，Amp100μg/ml，摇床震荡培养37℃，220rpm。培养至OD600>0.8（约3-4h），加入1mM的IPTG进行诱导。4h后收集菌体测定收菌OD值。并破菌取总蛋白进行电泳检测。结果如图2所示，从左至右按照电泳图顺序用Bandscan软件进行表达量分析，有明显表达条带的泳道3、5、7、9、12、14表达量分别为74.2%、70.6%、72.6%、74%、74.4%、72.7%。

图2所示的电泳图中上样顺序从左至右分别为：marker、空白孔、2YT基础培养基中未诱导、2YT基础培养基中加诱导剂、在基础培养基基础上添加0.5%葡萄糖时未诱导、添加0.5%葡萄糖时加诱导剂、添加1%葡萄糖时未诱导、添加1%葡萄糖时加诱导剂、添加0.5%蔗糖时未诱导、添加0.5%蔗糖时加诱导剂、添加1%蔗糖时诱导、添加0.5%甘油时未诱导、添加0.5%甘油时加诱导剂、添加1%甘油时未诱导、添加1%甘油时加诱导剂。可以看出NT-proBNP在1%甘油作为发酵碳源时表达量最高，故最终确定以1%甘油作为发酵碳源。

氮源的确定：接种培养方式同2，培养基以1%甘油作为发酵碳源，其中所含有的氮源分别按照以下组分做组合：（1）0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.5%NH₄Cl；（2）0.5%酵母粉，1%蛋白胨，0.5%NH₄Cl；（3）1%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.5%NH₄Cl；（4）1%酵母粉，1%蛋白胨，0.5%NH₄Cl；（5）0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨，1%NH₄Cl；（6）0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1%NH₄Cl；（7）1%酵母粉，0.5%蛋白胨，1%NH4Cl；（8）1%酵母粉，1%蛋白胨，1%NH₄Cl。电泳结果如图3所示，从左至右按照电泳图顺序用Bandscan软件进行表达量分析，有明显表达条带的泳道2、4、6、8、10、12、13、14表达量分别为79.1%、75.8%、74.5%、77%、79.2%、76.4%、75.1%、74.3%。

图3所示的电泳结果上样顺序从左至右分别为：Marker、采用1号培养基时诱导前、采用1号培养基诱导后、2号诱导前、2号诱导后、3号诱导前、3号诱导后、4号诱导前、4号诱导后、5号诱导前、5号诱导后、6号诱导前、6号诱导后、7号诱导后、8号诱导后。可以看出确定（5）0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨，1%NH₄Cl为氮源最佳。

无机盐的确定：接种方式同2，培养基在通过碳源和氮源筛选已确定的培养基的基础上添加入无机盐，其中添加的无机盐分别为硫酸镁（MgSO₄）和磷酸盐（PB），其中MgSO₄终浓度为1mM，3mM和5mM。PB（pH7.2）的终浓度为10mM，30mM和50mM。电泳结果如图4所示，从左至右按照电泳图顺序用Bandscan软件进行表达量分析，各泳道表达量分别为77.6%、45.1%、81.2%、69.2%、79.4%、73.8%。

图4A电泳图上样顺序从左至右为：Marker、含1mM MgSO₄时诱导产物、含3mM MgSO₄时诱导产物、含5mM MgSO₄时诱导产物、含10mMPB时诱导产物、含30mM PB时诱导产物。

图4B电泳图上样顺序从左至右为：Marker、含50mM PB时诱导产物。

可以看出最终确定5mM硫酸镁作为无机盐添加物最佳。

培养条件优化：接种方式同2，采用通过上述筛选已确定的发酵培养基来进行培养。测发酵培养基中生长曲线，确定发酵培养时间为6-8小时；设置IPTG诱导浓度为0.2、0.5、1mM，最终确定0.2mM作为诱导浓度。时间设定为4、5、6小时，最终确定6小时作为收菌时间。结果如图5所示，从左至右按照电泳图顺序用Bandscan软件进行表达量分析，各泳道表达量分别为79.6%、84.3%、83.5%、83.1%、81.9%、82.8%、89.8%、75.1%、83.7%。

图5所示的电泳结果上样顺序从左至右分别为：Marker、0.2mM IPTG诱导4小时、0.2mM IPTG诱导5小时、0.2mM IPTG诱导6小时、0.5mMIPTG诱导4小时、0.5mM IPTG诱导5小时、0.5mM IPTG诱导6小时、1mM IPTG诱导4小时、1mM IPTG诱导5小时、1mM IPTG诱导6小时。可以看出6小时作为收菌时间最佳。

实施例三重组人NT-proBNP蛋白的表达和纯化

采用经过实施例2筛选优化后的培养条件来培养包含人NT-proBNP序列的载体pET32a转化的表达菌株BL21（DE3）。在培养过程中以1%的接种量进行接种，以1%甘油作为发酵碳源，氮源是0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨，1%NH₄Cl，无机盐添加物为5mM硫酸镁，收菌时间为6小时。表达后的菌体高压均质破菌离心，电泳结果显示，该菌株及载体组合实现了目的蛋白的高效可溶表达，结果如图6所示。

电泳结果上样顺序从左至右依次为：菌体破碎上清、菌体破碎沉淀、菌体总蛋白、Marker。

取上清过镍亲和层析柱（HisTrap Fast Flow），采用缓冲液A系统（10-20mMPBS、100-800mM Nacl、10-30mM咪唑，PH6-7.4）作为平衡缓冲液，梯度洗脱16%，40%，100%线性洗脱，目的重组蛋白在40%咪唑时被完全洗脱下来，结果如图7。

电泳结果上样顺序从左至右依次为：500mM咪唑洗脱组分、200mM咪唑洗脱组分3、200mM咪唑洗脱组分2、200mM咪唑洗脱组分1、80mM咪唑洗脱组分、上样过程中的穿透液、上样总蛋白。

得到的融合蛋白通过超滤膜包换到酶切缓冲液中，按照比例加入肠激酶，酶切条件也是通过摸索得出，选择3个温度梯度，6个时间梯度摸索酶切条件，最终确定室温酶切16小时。酶切结果如图8所示，酶切结束后立即加入保存缓冲液B，并准备上镍柱。

电泳结果上样顺序从左至右依次为：Marker、酶切结果1、2、3。

第二次镍柱纯化，与第一次所用缓冲液相同，采用10%、30%、80%、500%梯度洗脱，30%之前均能洗脱下目的蛋白，电泳结果如图9所示，可以得到纯的NT-proBNP。发酵表达，每升菌可以获得60g菌体，每升菌体可获得50-60mgNT-proBNP。

超滤浓缩去除咪唑，将NT-proBNP保存在含0.1%BSA，20%甘油和10%甘露醇的PBS缓冲液（PH7.4）中。该条件的选择是在多次不同组合条件下选出的最有稳定性保护作用的，采用Roche全自动免疫分析仪检测NT-proBNP的生物活性，具体数据见下表，未添加保护剂的重组NT-proBNP储存在4℃半衰期为4天，加入保护缓冲液B的NT-proBNP储存在4℃生物活性100天下降了12.7%，储存在-20℃和-80℃，100天内，生物活性没有变化，还是维持在原水平。此外，本申请还将带标签蛋白、不带标签蛋白进行表达，以及加入保护剂和不加保护剂的稳定性进行了对比分析研究。图11显示了不同表达纯化保存方案对NT-proBNP的稳定性影响，其中方法1是直接表达NT-proBNP，不加保护剂，表达出来的蛋白很快就降解了；方法2是在连接标签蛋白的情况下表达NT-proBNP，表达出来的蛋白不加保护剂；方法3：直接表达NT-proBNP，表达纯化后加入保护剂之后的情况；方法4：融合标签蛋白的情况下表达NT-proBNP，表达出来的蛋白加入保护剂之后的情况。

Claims (10)

1.一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂，其特征在于，其中的NT-proBNP保存在含0.1-1%BSA，20-50%甘油和5-20%甘露醇的PH7.0-8.0的PBS缓冲液中，其中的NT-proBNP是与标签蛋白进行融合表达后经酶切去除标签蛋白后得到的纯NT-proBNP，其氨基酸序列如SEQ No.1。

2.权利要求1所述的能稳定保存的人NT-proBNP制剂用于制备检测NT-proBNP的标准品的用途。

3.权利要求1所述的能稳定保存的人NT-proBNP制剂的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：在大肠杆菌中重组表达人NT-proBNP，其中NT-proBNP与标签蛋白融合表达，经分离、酶切和纯化得到人NT-proBNP后，将人NT-proBNP加入到以质量体积比计含0.1-1%BSA，20-50%甘油和5-20%甘露醇的PH7.0-8.0的PBS缓冲液中，制备得到能稳定保存的人NT-proBNP制剂。

4.根据权利要求3所述的能稳定保存的人NT-proBNP制剂的制备方法，其特征在于在表达人NT-proBNP时，采用大肠杆菌偏好的密码子，其中编码人NT-proBNP的核苷酸序列如SEQ No.2。

5.根据权利要求4所述的能稳定保存的人NT-proBNP制剂的制备方法，其特征在于在表达人NT-proBNP时，培养大肠杆菌采用的碳源是以质量体积比计1%甘油，氮源是以质量体积比计0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨和1%NH₄Cl，无机盐添加物是5mM硫酸镁，收菌时间为6小时。

6.一种在大肠杆菌中重组表达制备人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于在表达人NT-proBNP时，采用大肠杆菌偏好的密码子，将NT-proBNP与标签蛋白一起融合表达，使用的编码人NT-proBNP的核苷酸序列如SEQNo.2。

7.根据权利要求7所述的在大肠杆菌中重组表达人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于培养大肠杆菌采用的碳源是以质量体积比计1%甘油，收菌时间为6小时。

8.根据权利要求6所述的在大肠杆菌中重组表达人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于培养大肠杆菌采用的氮源是以质量体积比计0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨和1%NH₄Cl。

9.根据权利要求6所述的在大肠杆菌中重组表达人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于培养大肠杆菌采用的无机盐添加物为5mM硫酸镁。

10.根据权利要求6所述的在大肠杆菌中重组表达人NT-proBNP蛋白的方法，其特征在于培养大肠杆菌采用的碳源是以质量体积比计1%甘油，氮源是0.5%酵母粉，0.5%蛋白胨，1%NH₄Cl，无机盐添加物为5mM硫酸镁，收菌时间为6小时。

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