CN102334031A

CN102334031A - 组合的尿钠肽检测

Info

Publication number: CN102334031A
Application number: CN2009801456216A
Authority: CN
Inventors: 李席元
Original assignee: Alere San Diego Inc
Current assignee: Alere San Diego Inc
Priority date: 2008-12-08
Filing date: 2009-12-08
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2029-12-08
Also published as: WO2010077654A1; CN102334031B; EP2376919A4; EP2376919B1; EP2376919A1; CN104198739A; US20110270530A1

Abstract

本发明涉及诊断和评估与BNP相关的疾病的方法。特别的，用患者的样本为了分析是否存在多种尿钠肽或尿钠肽的含量和组合的尿钠肽结果作为一个诊断标记物质。

Description

组合的尿钠肽检测

技术领域

本发明涉及用尿钠肽作为诊断和预后的标记物质。

交叉引用

本申请主张于2008年12月8日申请的美国临时申请，号码61/120,795的优选权，在此作为全文引用成本本发明的一部分。

背景技术

以下关于发明背景技术的讨论仅仅为了帮助阅读者更好的理解本发明，而不是对本发明的描述，也不能被认为是对本发明的现有技术的描述。

尿钠肽是一组自然产生的物质，他们存在于身体内来对抗身体内的肾脏-血管紧张素系统的活动。在最近几年，尿钠肽的测量已经引人注目地改变了心脏病的诊断和管理，包括心衰和急性冠状综合症。特别的，B型尿钠肽(BNP-human precursor Swiss-Prot人蛋白数据库P 16860)以及来源于人类前-BNP(Pro-BNP)的一些多肽都被用来诊断心衰，检测心衰的严重性和用来评估心衰的预后症状。

存在三种尿钠肽：心房尿钠肽(ANP)，B型尿钠肽(BNP)和C型尿钠肽(CNP)。成熟的人类的B型尿钠肽(BNP)(又称为脑钠肽)具有32个氨基酸，分子量为4千道尔顿(4kDa)的氨基酸序列，它主要参于尿钠肽系统中来调节血压和体液平衡(Bonow，R.O.，Circulation 93：1946-1950，1996)。BNP的前体由108个氨基酸分子的合成，称为前体BNP(Pro-BNP)，它可以被水解成带有氮末端的76个氨基酸(氨基酸1-76)，称为″NT-proBNP″，和32个成熟32-氨基酸，称为尿钠肽(BNP-32)或尿钠肽32(氨基酸77-108)。已经表明NT-pro-BNP，BNP-32，和BNP前体(pre-pro-BNP)以及它们的一些片段可以在人类的血清中循环。参见(Tateyama et ah，Biochem.Biophys.Res.Commun.185：760-7，1992；Hunt et ah，Biochem.Biophys.Res.Commun.214：1175-83，1995)；以及国际专利公开号码WO04/094459和WO04094460，它们中的每一个都被全部引入到本申请作为本发明的一部分。另外，BNP1-108和BNP77-108的第一位置的2个残基可以通过水解或蛋白水解去掉，从BNP的前体(proBNP)生成BNP3-108分子，从NT-proBNP生成BNP3-76分子，从BNP生成BNP79-108分子。检测和可以特异结合这些断列的构体的抗体可以被产生；例如，检测可以测定BNP3-108，而不能测定proBNP(BNP1-108)；检测可以测定BNP3-76但是不能测定NT-proBNP(BNP1-76)；和检测可以测定BNP79-108，而不能测定BNP77-108。

人类108个氨基酸的BNP前体proBNP(BNP1-108)的序列如下，下画线为成熟的BNP(BNP77-108)序列

HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV 50 WKSREVATEG

IRGHRKMVLY TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL 100

GCKVLRRH 108

(序列1).

BNP1-108由更大的前体pre-pro-BNP合成，该前体的序列如下(“前体”的学列序列为粗体字母表示)：

HPLG SPGSASDLET SGLQEQRNHL 50

QGKLSELQVE QTSLEPLQES PRPTGVWKSR EVATEGIRGH RKMVLYTLRA 100

PRSPKMVQGS GCFGRKMDRI SSSSGLGCKV LRRH 134

(序列2).

另外，尿钠肽在患者中的水平可能被认为与肾功能障碍相关。为了响应心室的舒张而被释放的BNP可以引起血管舒张、阻止肾上腺皮质分泌醛固酮，和阻止肾脏分泌肾素(或高血压蛋白原酶或血管紧张肽原酶)。术语“心肾综合征”是指心脏与肾脏之间的生理关系，当主体遭受心脏衰竭的时候，这种生理关系表现出肾脏与心脏的紧密关系。虽然这些综合征仍然还不被完全理解，反馈回路循环已经被包含在神经系统(和，这些特殊的尿钠肽)，炎症反应、结构和功能的肖弱组织器官中，同时产生的回路循环使对心脏和肾脏的功能更为恶化。最近关于心肾综合征的讨论可以在法国发表的文章中找到，题目：剧烈代谢失调的心衰：心肾综合征“列副临床期刊，2006年73期(S2)8-13页(“Acutedecompensated heart failure：The cardiorenal syndrome，”Clev.Clinic J.Med.73(S2)：S8-S13，2006)。

另外，在患有静脉血栓栓塞疾病(VTED)的患者中尿钠肽的水平也可能会被改变。静脉血栓栓塞疾病(VTED)表现出系列的型谱特征，他包括严重的静脉血栓症(DVT)和肺栓塞(PE)。通过年度跟踪调查，预计每年在10万人中有117人可能患有静脉血栓栓塞疾病。年发病率在60岁或者更老的人群中更高，这些年龄阶段的年发病率与年纪在85岁左右的人的发病率一样高，其中，85岁年纪的年发病率为10万人中有900人患有静脉血栓栓塞疾病。思里沃尔泰等，国际医药期刊，1998年，158期，583-93页(Silversteinet ah，Arch.Intern.Med.158：585-93，1998)。导致静脉血栓栓塞疾病(VTED)发病的危险因素包括：年纪的增长，长期卧床不起，手术，恶性肿瘤、怀孕、含有雌性激素药物治疗(例如口服的口服避孕药物，激素治疗和三苯氧胺，它莫西芬(一种抗雌激素，用于治疗妇女乳腺癌或不育症)等)，冲血性心脏衰竭、同型半胱氨酸、以及改变血液粘性的一些疾病(比如红血球增多(症)，镰状细胞(贫血)病或镰刀形红细胞(贫血)病(sickle cell disease)，多发性骨髓瘤)、遗传性血栓形成缺陷。大约有75％的VTED患者被确定具有以上至少一个危险因素。海特等，国际医药期刊，2002年，162期，1245-48页(Heit et al，Arch.Intern.Med.162：1245-48，2002)。

发明内容

本发明关于使用尿钠肽的检测从肺栓患者中区分出肾功能障碍和/或心衰患者。具有这些情况或疾病的人常常具有类似的明显症状，例如都有呼吸困难、心痛、咳嗽、水肿等。通过组合检测不同群体的与BNP相关的多肽获得的两个或更多的检测结果，可以让包括肾功能障碍和肺栓在内的疾病进行初步的鉴别诊断更为明确和清楚。

本发明的第一方面，至少选自于由免疫检测组成的检测群体中的两个对来自主题样本的免疫检测，该检测群体包括以下免疫检测：被配置检测BNP79-108和可选的检测BNP本身(就是BNP77-108)的免疫检测；被配置检测BNP3-76和可选的检测BNP1-76本身，但是不检测BNP，的免疫检测；被配置检测BNP3-108和可选的检测BNP1-108，但是不检测BNP，的免疫检测。这些免疫检测的结果被组合计算，组合计算的结果被用来诊断是否存在肾功能障碍，和/或是否存在肺栓，和/或是否存在心衰，和/或从心衰和/或肺栓的主体中区别出肾功能障碍。

在以下更详细的描述中，检测是“被配置测试“一个特异的感兴趣的标记物质，如果哪个检测产生一个可以被测试的信号来表示与生理学相关联的标记物质浓度是否存在或者存在的量。这样的检测，可以是但不一定就必须是，特定检测某一种尿钠肽。因为一种抗体的抗原决定部位位于8个氨基酸上，所以免疫检测可以测试其它的多肽(例如相关的标记物质)，只要这些其它的多肽包括有结合到抗体上的位点。那也就是说，检测BNP79-108的检测也可以检测BNP，proBNP，和BNP3-108。

在一个具体的实施例子中，检测BNP79-I08可以被配置为用两个抗体来结合BNP79-108序列上位点的三明治的免疫检测。一种这样的检测可以利用特异结合从BNP分子上脱落残基77和78位点后形成的构体的第一抗体，利用既结合BNP又结合BNP79-108的第二抗体，这样的分析检测将不能检测前体BNP(proBNP)，BNP3-108和BNP3-76，在这里定义为“BNP79-108检测”。第二检测可以利用两个抗体，每一个抗体都结合BNP和BNP79-108；这样的检测也可以检测前体BNP和BNP3-108，这样的检测在这里定义为“BNP检测”。

在另一个具体的实施例子中，针对BNP3-76而不是BNP的检测也为两个抗体来结合BNP3-76序列上位点的三明治的免疫检测。一种检测利用特异结合从NT-proBNP分子上脱落残基1和2位点后形成的构体的第一抗体，可以同时结合NT-proBNP和BNP-76的第二抗体；这样的检测将不会检测proBNP，BNP，BNP79-I08，和NT-proBNP，这样的检测被定义为“BNP3-76检测”。第二中检测利用两个抗体，每一个抗体都可以结合NT-proBNP和BNP3-76，这样的检测也可以检测proBNP and BNP3-108，这样的检测被定义为“NT-proBNP检测”。

在另一个具体的实施方式中，针对BNP3-108而不是BNP的检测也为两个抗体来结合BNP3-108序列上位点的三明治的免疫检测，其中至少其中一个抗体不会结合BNP。一种这样的检测利用特异结合从proBNP分子上脱落残基1和2位点后形成的构体的第一抗体，第二抗体可以同时结合proBNP和BNP3-108；这样的检测将不会检测proBNP，BNP，BNP79-I08，和NT-proBNP，这样的检测被定义为“BNP3-108检测”。第二中检测利用两个抗体，每一个抗体都可以结合proBNP和BNP-108，这样的检测将不会检测BNP，这样的检测被定义为“proBNP检测”。

这样的检测按照这样选择，这样一个结果至少可以从以下两个检测结果的浓度而计算获得：可以实质表明BNP或BNP79-108的浓度(每一个浓度在这里被定义为“BNP浓度”)；可以实质表明proBNP或BNP3-108的浓度(每一个浓度在这里被定义为“proBNP浓度”)或者度可以实质表明NT-proBNP或BNP3-76的浓度(每一个浓度在这里被定义为“NT-proBNP浓度”)。

使用的BNP或BNP79-108的“实质表明”浓度意思是指这个浓度已经通过去除proBNP或BNP3-108，和NT-proBNP或BNP3-76对该浓度贡献而被去卷积化(Deconvoluted)而得来的。在一个例子中，“BNP79-108的检测”的结果可以直接使用，这是因为proBNP，BNP3-108，NT-proBNP和BNP3-76不再对这样分析结果做作贡献。在另一个例子中，“BNP检测”的结果可以通过减去“proBNP的检测”结果而被使用，同样，这也可以做proBNP贡献给BNP分析结果的校正。

同样，使用的proBNP或BNP3-108的“实质表明”浓度意思在这里是指这个浓度已经通过去除BNP或BNP79-108，和NT-proBNP或BNP3-76对该浓度贡献而被去卷积化(Deconvoluted)而得来的。使用的NT-proBNP或BNP3-76的“实质表明”浓度意思是这个浓度已经通过去除proBNP或BNP3-108和BNP79-108对浓度的贡献而被去卷积化(Deconvoluted)而得来的。

然后，这些实质浓度被组合来确定一个“组合的尿钠肽结果”，它至少具有以下两个实质浓度的函数关系值：一个“BNP浓度”，一个“proBNP浓度”和一个“NT-proBNP浓度”。在一个优选的例子中，一个函数关系值为：proBNP比BNP的比率，BNP比proBNP的比率，BNP比NT-proBNP的比率，NT-proBNP比BNP的比率，proBNP比NT-proBNP的比率，或者NT-proBNP比proBNP的比率。这个比率，例如可以用来诊断是否存在PE，是否存在肾脏功能障碍，是否存在心衰，和/或者，从肾脏功能障碍中区分出心衰和/或PE。

对本领域的人来讲，这种组合的尿钠肽结果可以通过多种方式被分析出来。例如，被获得的结果可以被用来与“正常”值的比较，或者与表示具有特种疾病或结果的值进行比较。特殊的诊断或预后可以基于每一个检测结果与这样的值比较，这样的值它可以代表诊断或预后的“极限值”。对诊断或/预后的灵敏度和特异性的检测不仅依靠每个检测的“质量”如何，他们也依靠什么是非正常结果的定义。实际上，可接受的工作特征(ReceiverOperating Characteristic)曲线或″ROC″曲线是通过绘制可变的值相对于处于“正常”和“生病”人群的频率而获得的。对于一些特殊的标记物质，对于主题存在或不存在疾病的标记物质水平的分布将可能重叠。在这种情况下，一个检测将不可能具有100％的准确率来区分是否是正常或是否具有疾病。在重叠的地方就表明测试不能区分开正常和疾病。一个极限值就被选择，高于极限值(或低于极限值，这也依靠一个标记物质如何随着疾病而改变)的测试被认为是不正常的，同时，低于极限值的测试结果被认为是正常的。位于ROC曲线下的区域用来衡量这种可能性，这样该可接受的衡量将用来对一种情况的鉴别做出校正。这种方法是公知的方法，参见亨利等，X射线科学，1982年，143期，29-36页(Hanleyet al.，Radiology 143：29-36(1982))。

一个可能的阳性比率、可能的阴性比率、比值比或者风险比可以被作为预报危险或诊断疾病的一个测试能力的衡量。在可能为阳性比率的情况下，值为1表示阳性结果在“患病”和“控制”人群中具有均等的机会出现，值大于1表示阳性结果更有可能存在于患病群体中，和值小于1表示阳性结果更有可能存在于控制群体中。在可能为阴性比率的情况下，值为1表示阴性结果在“患病”和“控制”人群中具有均等的机会存在，值大于1表示阴性结果更有可能存在于测试群体中，和值小于1表示阴性结果更有可能存在于控制群体中。在一个优选的方式中，一个极限值被选择用来从肾脏功能障碍中区分PE和或心衰，该极限值可以是：阳性或阴性可能比率至少大约为1.5或更大，或者大约为0.67或更小；更优选的，至少大约为2或更大，或者大约为0.5或更少；更优选的，至少大约为5或更大，或者大约为0.2或更小；更优选的，至少大约为10或更大，或者大约为0.1或更小；最优选的，至少大约为20或更大，或大约为0.005或更小。术语“大约”在本申请中指给定值的上下％5的范围内浮动。

在比值比(odds ratio)的情况下，值为1表示阳性结果在“患病”和“控制”人群中具有均等的机会出现，值大于1表示阳性结果更有可能存在于患病群体中，和值小于1表示阳性结果更有可能存在于控制群体中。在一个优选的方式中，一个极限值被选择用来从肾脏功能障碍中区分PE和/或心衰，该比值比可以是至少大约为2或更大，或者大约为0.5或更少，更优选的，至少大约为3或更大，或者大约为0.33或更少，更优选的，至少大约为4或更大，或者大约为0.25或更少，更优选的，至少大约为5或更大，或者大约为0.2或更少。术语“大约”在本申请中指给定值的上下％5的范围内浮动。

在危险比值(Hazard ratio)的情况下，值为1表示相对危险的终点(例如死亡点)在“患病”和“控制”人群中具有均等的机会出现，值大于1表示风险更有可能存在于患病群体中，和值小于1表示风险更有可能存在于控制群体中。在一个优选的方式中，一个极限值被选择来从肾脏功能障碍中区分PE和/或心衰，该危险比值可以是至少大约为1.1或更大，或者大约为0.91或更少，更优选的，至少大约为1.25或更大，或者大约为0.8或更少，更优选的，至少大约为1.5或更大，或者大约为0.67或更少，更优选的，至少大约为2.5或更大，或者大约为0.4或更少。术语“大约”在本申请中指给定值的上下％5的范围内浮动。

一般技术人员能够明白，诊断或预后的指示与诊断，或者与将来临床结果的预后或诊断风险是一个统计学的分析。例如，相对于那些标记物质的水平等于X或小于X的病人来讲，标记物质的水平大于X可的患者可以提示更有可能遭受不利的结果，这些由统计水平的显著性来决定。另外，标记物质浓度从基准水平的改变可能反应患者的预后，标记物质水平改变的程度可能与不利情况的严重程度相关。显著性统计经常通过比较两个或更多的人群来确定，并且确定一个置信区间(confidence interval)或者a p值。参见多瓦德和威尔顿，统计学研究，约汉·威力&孙，纽约，1983(Dowdy and Wearden，Statistics forResearch，John Wiley&；Sons，New York，1983)。本发明的最好的置信区间为90％，95％，97.5％，98％，99％，99.5％，99.9％和99.99％，同时最好的p值为0.1，0.05，0.025，0.02，0.01，0.005，0.001，和0.0001。

另一方面，本发明涉及一种选择治疗方案的方法。该方法优选的包括：执行本发明描述的诊断或预后方法，通过减少与诊断联系的一些不利后果来选择一个或多个治疗方案来提高患者的预后水平。本方法也可以被用来筛选一些可以如上描述提高患者预后水平的药物试剂。

另一方面，本发明关于一种测试亚临床动脉硬化症和或主体遭受亚临床动脉硬化症的预后的试剂盒子或装置。试剂盒子包括执行本发明描述的这些检测方法的装置和试剂，和操作说明来指导如何检测。同样，试剂盒子可以包括转换对于诊断或预后的标记物质的水平方式的一个或多个方式，比如一个参考的极限值来表示特殊的诊断或预后。这样的盒子最好包括足够的试剂来执行一个或多个这样的测定，和/或FDA批准的标签。

附图说明

图1.1A和1B描述的从个体尿钠肽(proBNP，BNP，和NT-proBNP)检测结果，和在正常和患病人群中计算出来的组合尿钠肽检测结果的ROC数据。

图1.2A-2E描述的从个体尿钠肽(proBNP，BNP，和NT-proBNP)的检测，和在正常和患病人群中计算出来的组合尿钠肽检测结果从获得的柱状图。在图2A，2B，和2C中，在Y轴上的数字为单位为pg/ml的proBNP的浓度。在图2D和2E，Y轴上的数字表示BNP比proBNP的比值(图2D)和NT-proBNP比proBNP的比值(图2E)。

本发明的详细描述

根据本发明的描述，提供方法和试剂来进行鉴别和使用与诊断、预后相关的标记物质，或者与BNP相关联的不同情况的区分。至少两种免疫检测从以下检测群中选择，该检测群包括：配置检测BNP79-108的免疫检测；配置检测BNP3-76，但是不检测BNP的免疫检测；和配置检测BNP3-108，但是不检测BNP的免疫检测；这些检测可以在来自主体的样本上进行。这些免疫检测的结果被组合计算，和这些组合计算的结果被用来进行是否存在肾脏功能障碍的诊断、和/或被用来进行是否存在PE的诊断，和/或，被用来从PE的主体中区分出肾脏功能障碍的诊断。

通过这里的描述，测试BNP79-108的检测，例如用两种结合存在于BNP79-108分子序列上的抗原决定位点的抗体的三明治免疫检测，这种三明治免疫检测方法也可以测试其他与BNP79-108相关的标记物质。一抗体的抗原决定基/决定位点位于8个氨基酸上，因此，免疫测定将可以测试其它的多肽(比如相关的标记物质)，只要该其它的多肽具有必须结合用来检测的抗体上的抗原决定位点。因此，这样的测试也可以，但不一定必须是，测试BNP，proBNP，BNP3-108以及一些可以提供抗体结合位点特性的片段。例如，一种检测，可以利用特异结合从BNP上脱落的77和78位点的残基的第一抗体，和可以既结合BNP有又结合BNP79-108的第二抗体，但是这种检测将不测试proBNP，BNP3-108，NT-proBNP和BNP3-76。利用两种抗体的检测，其中每一种抗体既结合BNP又结合BNP79-108，这种检测也可以测试proBNP和BNP3-108。每一个检测就是“检测BNP79-108的检测”。

同样，测试BNP3-76，但不是BNP的检测，例如，用两种结合存在于BNP3-76序列上的位点的抗体的三明治免疫方法，也可以，但并不是必须的，测试其他与BNP3-76相关的，可以提供抗体结合位点的标记物质。在一个例子中，一种检测，用一种可以特异结合从NT-proBNP上脱落的1和2位点的残基的第一抗体，用可以结合NT-proBNP和BNP3-76的第二种抗体；这样的检测不可以测试proBNP，BNP，BNP79-108和NT-proBNP。在另一个例子中，利用两种抗体的检测，其中每一种抗体可以结合NT-proBNP和BNP3-76，这样的检测也可以测试proBNP和BNP3-108。每一个检测就是“测试BNP3-76而不是BNP的检测”。

同样，测试BNP3-108，但不是BNP的检测，例如，用两种结合存在于BNP3-108序列上的位点的抗体的三明治免疫方法，但是至少有一种抗体不结合BNP，这种抗体也可以，但并不是必须的，测试其他与BNP3-108相关的，可以提供抗体结合位点的标记物质。在一个这样的检测中，用一种可以特异结合从proBNP分子上脱落的1和2位点的残基的第一抗体，用可以同时结合NT-proBNP和BNP3-76的第二抗体；但是这样的检测可以不测试BNP，BNP79-108和NT-proBNP。在第二种检测中，利用两种抗体来测试，其中每一种抗体可以结合proBNP和BNP3-108，但是这样的检测不可以测试BNP和BNP79-108。每一个检测就是“测试BNP3-108而不是BNP的检测”。

用这样的这些检测，一个“实质表示”BNP或者BNP79-108的浓度可以被计算出。在一个例子中，“BNP79-108的检测”结果可以被直接使用，因为proBNP，BNP3-108，NT-proBNP和BNP3-76的浓度不会对该检测结果有贡献。在另一例子中，包括了proBNP和BNP3-108的浓度贡献的“BNP的检测”结果可以通过减去检测BNP3-108而不是BNP的检测结果，同样，这样可以做与proBNP关联的对BNP检测结果的贡献的校正，这样就是“去卷积化”的BNP检测。在这里，“实质表示”BNP或者BNP79-108检测结果被定义为“BNP的浓度”。

同样，一个“实质表示”proBNP或者BNP3-108的浓度可以被计算出。在一个例子中，“BNP3-108的检测”结果可以被直接使用，因为BNP，BNP79-108，NT-proBNP和BNP3-76的浓度不会对该检测结果有贡献。在另一例子中，包括了NT-proBNP和BNP3-76的浓度贡献的“BNP1-108的检测”的结果可以通过减去检测BNP3-76而不是BNP的检测结果，同样，这样可以做与NTproBNP关联的对BNP1-108检测结果的贡献的校正。在这种方式中，“实质表示”proBNP或者BNP3-108检测结果被定义为“proBNP的浓度”。和，一个“实质表示”NT-proBNP或者BNP3-76的浓度可以被直接测量或通过从检测每一个尿钠肽形式的检测结果中去除proBNP或BNP3-108，和BNP或BNP79-108对该检测结果的贡献而计算出来。在这种方式中，“实质表示”NTproBNP或者BNP3-76检测结果被定义为“NTproBNP的浓度”。

这些实质浓度然后被用来成为一个“组合的尿钠肽结果”，它为以下至少两个浓度的函数值：一个“BNP的浓度”，一个“proBNP浓度”和一个“NTproBNP浓度”。在一些优选的方式中，这样的函数值可以是proBNP比BNP的一个比率，BNP比proBNP的一个比率，BNP比NT-proBNP的一个比率，NT-proBNP比BNP的一个比率，proBNP比NT-proBNP的一个比率，或者NT-proBNP比proBNP的一个比率.同本领域内至少的标准化方法学一样，这些组合的尿钠肽结果可以作为诊断或预后的标记物质。

定义

术语“标记物质”在这里指蛋白，多肽，磷脂或者从主体上获得样本中的目的小分子。在本发明中，作为标记物质的“蛋白或多肽”可以包括任何他们的片段，特别的，可以用免疫分析方法分析的，可被检测的任何片段。例如在“组合尿钠肽结果”的情况下，“标记物质”可以起源于对一些单独的标记物质的测量。

术语“关联标记物质”在这里是指某个特殊标记物质的一个或多个片段，或者生物合成某个特殊标记物质的父母物质，这些父母物质可以作为该标记物质本身的替代物，或者作为单独的标记物质。例如，人类BNP是起源于前体108个氨基酸蛋白分子水解而来的，在以下都指BNP1-108。成熟的BNP或者“BNP尿钠肽”或“BNP32”为32个氨基酸，代表前体蛋白分子上77-108位点之间的氨基酸序列，它可以表示为BNP77-108。这些剩余的1-76在这些被称为BNP1-76。这里大部分标记物质都是由更大的前体分子合成的，这些分子又被处理来提供成熟的标记物质，和/或在循环中以标记物质的片段的形式存在。这样，与这里描述的标记物质的“关联标记物质”可以被区分识别，也可以与上面描述的BNP的类似物质使用。另外，关联的标记物质可以是母标记物质经过共价修饰的结果，例如通过蛋氨酸，甲硫氨酸残基，泛素化(ubiquitination)等的氧化作用。

术语“样本”在这里是指为了诊断、预后或评估使用而从主体，例如病人，上获得的体液样本。在一些实施方式中，样本可以为了测定正在发生的情况或针对情况进行治疗的结果为目的而被获得。优选的样本为全血，血清，血浆，脑脊髓液，尿液体，唾液，谈液，胸腔积水。另外，任何一个本领域的一般技术人员都可以认识到，一些样本都可以经过分离，纯化过程而被获得，例如从全血中分析血浆或血清。

在这里使用的“多数”是指至少两个。优选的，多数是指至少3个或，更优选的为至少5，甚至更多为至少10，甚至至少为15，最优选的为至少20。在一个更优选的方式中，多数代表更大的数量，例如至少为100。

术语“主体”在这里是指人类或非人类的有机体。这样，本发明的方法和试剂都可以在人类或动物疾病中运用。进一步，尽管一个优选的方式中的主体最好为活体有机体，当然本发明也可以被使用在死后的尸体检测中。优选的“主体”为病人或患者，例如活着的接受药物治疗的人类。这也包括为了病理学信息而被调查的没有明显疾病的人。在本发明的一个案例中，优选的主体为了评估是否存在亚临床的动脉硬化症一些个体，他们并不表现出临床症状，最优选的，这些个体不表现出胸痛或EGG改变，没有稳定的绞痛反应，不稳定的绞痛反应和/或心肌梗塞。优选的主体为了那些为了预兆性评估的个体，他们不表现出临床症状，最优选的不具有胸痛或EGG改变，不表现出稳定的绞痛，不稳定的绞痛和/或不表现心肌梗塞，但是他们可以被用来进行亚临床的动脉硬化症诊断。

术语“诊断”在这里是指一些方法，普通的一般技术人员可以通过该方法来进行评估或决定一个患者是否遭受给定的疾病或情况。该熟练的技术人员经常安排一些针对一个或多个诊断指示剂的诊断，例如标记物质，存在，不存在，数量或数量的变化，这些可以反应该情况是否存在，以及严重程度。

同样，“预后”指一种给定的结果或过程发生的可能性。这经常通过检查一个或多个预后指示试剂来测定。这些标记物质，在患者中(从患者中的样本上)存在的数量或是否存在，提供一个信号的可能性来表示给定的过程或结构是否会发生。例如，当一个或多个从患者中取出的样本中的预后指示试剂达到一个足够高的水平的时候，该信号特征指示该患者，相对于那些底水平的患者来讲，有更大的可能性来体验将来的打击。预后指示试剂的水平或水平的改变，它又反过来与不健康或死亡的可能性联系，是指作为“对于不利结果具有更容易患病的体质相联系”。

术语“校正”，作为诊断或预后标记物质的参考，在这里指把患者的标记物质的存在或数量与那些已经知道遭受给定情况，或已经知道处于危险的人进行比较，或者与那些已经知道没有给定情况的人进行比较。如上面的讨论，在一个患者样本中的标记物质的水平可以与已经知道与特殊诊断标记物质的水平进行比较，也就是，普通的技术人员可以使用该标记物质的水平来确定患者是否需要特殊方式的诊断，以及响应的反应。可选的，该样本中的标记物质的水平可以与已经知道具有好的情况(例如不存在疾病等)的标记物质的水平进行比较。

术语“决定诊断”在这里指普通的技术人员通过这些方法可以决定患者是否存在某种疾病。术语“诊断”不是指100％的准确决定是否存在某种疾病的能力，或者也不是指一个给定的过程或结果相对没有的情况下更有可能发生的能力。相反，普通的技术人员可以理解该术语“诊断”是指某种疾病是否存在患者中的增加的可能性。一个优选的方式中，诊断表示一种疾病被增加了5％的机会存在，大约10％的机会，大约15％的机会，大约20％的机会，大约25％的机会，大约30％的机会，大约40％的机会，大约50％的机会，大约60％的机会，大约75％的机会，大约90％的机会和大约95％的机会存在。术语“大约”在本发明中指正负2％的范围内变化。

同样，术语“决定预后”在这里指普通的技术人员通过这些方法可以决定患者在将来可能出现一个或多个临床结果的可能性。普通的技术人员可以理解该术语“预后”是指某种临床结果在将来某天发生的被增加的可能性。一个优选的方式中，预后表示一种临床结果，相对于“控制”人群来讲，被增加了5％的机会，大约10％的机会，大约15％的机会，大约20％的机会，大约25％的机会，大约30％的机会，大约40％的机会，大约50％的机会，大约60％的机会，大约75％的机会，大约90％的机会和大约95％的机会。术语“大约”在本发明中指正负2％的范围内变化。

术语“肾衰竭”在这里指主体属于或者在48小时内有增加的危险性具有剧烈的肾伤害程度的等级划分，在梅思特等中(Mehta et al.，Crit.Care 11：R31(doi：10.1186.cc5713)，2007)中有具体的描述，再次作为全部引用：

“阶段1”：血清中肌氨酸酐增加到等于或大于0.3mg/dL(＞；26.4微摩尔/升26.4μmol/L)，或者血清中肌氨酸酐增加到等于或大于基线尿液的150％(1.5倍)以上，基线尿液输出量一般在6小时内少于0.5毫升/小时。

“阶段II”：血清中肌氨酸酐增加到等于或大于基线尿液的200％(2倍)以上，基线尿液输出量一般在12小时内少于0.5毫升/小时。。

“阶段III”：血清中肌氨酸酐增加到等于或大于基线尿液的300％(3倍)以上，基线尿液输出量一般在24小时内少于0.5毫升/小时或者无尿液达12小时。

术语“心力衰竭”在这里是指一个主题属于美国心脏病学院/美国心脏心力衰竭组织在关于它的分级表(亨式等人在“ACC/AHS2005”上发表的关于诊断和管理心力衰竭中)(Chronic Heart Failure in the Adult，″Circulation 112(12)：el54-235(doi：10.1161/CIRCULATIONAHA.105.167586)，2005：)

阶段A：患者在将来具有发生心力衰竭的高危险性，但是没有功能或结构的失调。

阶段B：心脏结构失调，但是在任何阶段没有征兆出现。

阶段C：在具有心脏结果问题下具有早期的或当前的心力衰竭征兆，但是还是可以通过药物治疗。

阶段D：更高级的需要医院基础支持，心脏移植或减轻痛苦的疾病。

术语“肺塞“这里所用的一个主题是指患了肺动脉或者他的一个分之发生血管堵塞，通常发生时(血液从静脉血栓)静脉血栓成为赶出其形成和血栓化从而在肺部的一动脉的血液供应。

所谓“不连续或离散“，在这里是指不连续表面的区域。也就是说，两个区域是彼此分离开的，如果不属于任何一个领域的一部分的边界完全围绕着这两个区域。所谓“可以独立寻址“这里所用的指的是从离散的表面区域可以获得一个特定的信号。

所谓“抗体“，是指在这里是指模仿或实质上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因编码的肽或多肽，以及他们的片段，这些抗体具有特异性结合抗原或抗原表位的能力。参见以下参考文献：W·E·鲍威尔等的《基础免疫学》(第3版本)，纽约1993年Raven出版(Fundamental Immunology，3rd Edition，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993))；威尔旬等的1994年的《免疫方法》175卷：267-273(Wilson(1994J J.Immunol.Methods175：267-273)；亚麻式的《生物生理学方法杂志》，1992年，25卷，85-97页(Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25：85-97.)。术语“抗体”包括抗原-结合部分，例如“抗原结合位点”(例如一些片段，或者子序列或一些具有结合抗原能力的互补决定区(CDRs))，包括(i)Fab片段，一个由VL，VH，CL and CHl区组成但价片段；(ii)2个F(ab′)片段，一个二价的片段包括在铰链区域通过二硫化合物连接的两个片段；(iii)包括VH和CHl区域的Fd片段；(iv)包括抗体单个臂状VL和VH区域的Fv片段；(v)包括有VH区域的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)和(vi)单独的互补决定区(CDR).单链抗体物质也被包括在本发明的术语所定义的“抗体”中。

术语“特异性结合”没有任何意图表示一个抗体专有地结合目标物质。更合适的，如果抗体对于目标物质的亲和力大约为5-4倍于该抗体与非目标物质的之间的亲和力就认为该抗体为“特异性地结合”。优选的，相对与抗体与非目标物质的亲和力而言，抗体与目标物质的亲和力至少为5倍，优选的为10倍，更优选的为25倍，甚至更优选的为50倍，最优选的为100倍或更大。在有些优选的方式中，抗体或其它结合物质和抗原之间的特异结合意思是指他们之间至少为10⁶M^-1结合亲和力，优选的大约为10⁸M^-1与大约10⁹M^-1之间；大约10⁹M^-1与大约10¹⁰M^-1之间，或者大约10¹⁰M^-1与大约10¹¹M^-1之间。

亲和力通过如下公式计算：K_d＝k_off/k_on(k_off为分裂速度常数，k_on为结合速度常数和K_d为平衡常数).亲和力可以通过在平衡状态下测定不同浓度情况下被标记的配合基的小片段结合数。该数据通过斯卡恰特(Scatchard equation)方程式做图：r/c＝K(n-r)：

r＝在平衡状态下，被结合的配合基的摩尔数/接受体的摩尔数；

c＝在平衡状态下的自由的配合基的浓度浓度；

K＝平衡常数；

n＝每一个接受分子所结合的配合基的数量

通过作图分析，r/c的值被绘制在Y轴上，r被绘制在X轴上，这样就形成了斯卡恰特图。亲和力就是所做图线条的负斜率(negative slope of the line)，k_off可以通过结合的标记的配合基与非标记的过量的配合基的竞争而测试到(参见例如美国专利号码6,316,409)。对于目标分子的目标试剂的亲和力至少为1x10^-6摩尔/升，更优选的为至少大约1x10^-7摩尔/升，更优选的为至少大约为1x10^-8摩尔/升。甚至更优选的为至少大约1x10^-9摩尔/升和更优选的为至少大约1x10^-10摩尔/升。通过斯卡恰特(Scatchard equation)方程式来测定抗体的亲和力是本领域已知道的技术。参见皖易科等，免疫杂志，1991年，12期：425-43(van Erp et al.，J.Immunoassay 12：425-43，1991；)和纳尔逊和勾威沃特，生物群计算机程序方法，1988年，27期65-8，(Nelson and Griswold，Comput.MethodsPrograms Biomed.27：65-8)。

衡量测试的准确性可以参照非稀尔等的《重病特别护理》，2003年29期1043-51页(Fischer et al.，Intensive Care Med.29：1043-51，2003)上具体详细的的方法和使用他来测试一个给定的标记物质或多个标记物质的效果。这些衡量包括特异性，灵敏性，先兆性预测价值以及相似的比率，诊断比值比和ROC曲线区域。正如上面的描述，最好的测试和检测表现出一个或多个以下描述的结果：

至少有75％的灵敏度，同时具有75％的特异性；

至少0.6的ROC曲线区域，优选的为0.7，更优选的为0.8，更优选的为至少0.9，更优选的为至少0.9和最优选的为0.95的ROC曲线区域；和/或阳性可能比率(灵敏度/(1-特异性))至少为5，更优选的至少为10，最优选的至少为20，和阴性可能比率((1-灵敏度)/特异性)小于或等于0.3，最好的为小于或等于0.2，和最优选的为小于或等于0.1。

分析测量策略

各种各样的方法和装置都可以被运用到本发明中来测试和分析标记物质。对于患者样品中的多肽或蛋白，免疫分析装置和方法被经常使用到。这些参见美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524；和5,480,792，以上所列举的每个在这里包括所有的表，图和权利要求被全部引用并与本发明构成一体。这些装置和方法可以利用标记的分子进行三明治、竞争或非竞争检测模式，产生一个与感兴趣的被分析物质存在或数量相关的信号。另外，这样的方法和装置，例如生物传感器、光学免疫分析也可以被用来测试被分析物质的存在或数量而不需要标记分析。见美国专利5,631,171和5,955,377，以上所列举的每个专利的全部，包括所有的表，图和权利要求，在这里被全部引用并与本发明构成一体。本技术领域的一般技术人员可以认识到，一些自动设备，包括但不局限于，贝壳曼设备(BECKMAN)，雅陪的AxSYM，罗式的ElecSys，宝林曼状态系统(Stratus systems)都属于免疫分析仪器，他们也可以实现本发明所教导的免疫检测。

更好的，利用免疫法分析本发明的标记物质和方法，更优选的使用三明治方法，尽管其他的方法也是本领域知晓的(例如分析RNA水平的分析)。通常，一个标记物质的存在或数量使用特异结合每一个标记物质的抗体来测试特异的结合而检测。任何合适的免疫分析都可以被使用，例如酶联免疫(ELISA)，放射免疫方法(RLAs)，竞争结合分析以及类似的方法。特异结合抗体的免疫可以被直接或检测的测试。直接的标记包括荧光、发光元件，金属，颜料，放射性核酸以及类似的直接与抗体连接。非直接的标记包括本领域熟悉的酶类，例如碱性的磷酸酶，辣根过氧化酶以及类似的。

使用固定的特异结合抗体的方法在本发明也是可行的。这些抗体可以被固定在很多种支撑介质，例如磁性或层析矩阵微粒，测试盘子的表面(例如微孔)，或者固体基体材料上或膜上(例如塑料，尼龙或纸上)或者与他们类似的材料上。一分析试剂条可以通过处理抗体或多个抗体在固体表面上而被准备。该试剂条然后可以被插入到样本中，进行快速的冲洗和检测步骤来产生一个信号，例如一个带有颜色的点。

为了分开或连续检测标记物质，合适的设备包括临床使用的分析仪，例如ElecSys(罗式)，the AxSym(雅培)，the Access(Beckman)，以及商标为ADVIA

CENTAUR

(Bayer)的免疫分析系统，商标为NICHOLS ADVANTAGE

(Nichols Institute)的免疫分析系统等等。更优选的设备使用单个检测装置来执行多个标记物质的分析。特别的，使用具有不连续的，可以地址化的物理格式表面来进行多种不同被分析物质的检测。这样的设备可以包括蛋白微分析仪或“蛋白芯片“(例如参见Ng and Hag，J.Cell MoI.Med.6：329-340(2002))和这样的毛细装置(见美国专利6,019,944)。在这些实施方式中，每一个不同的位置上的独立的表面可以包括固定一个或多个被分析物质(例如一标记物质)的抗体来在每个位置上进行测试。表面也可选的包括一个或多个不同的微粒(例如微粒子或纳米粒子)，他们被固定在表面上的不同位置，这样包括有抗体的微粒子可以为了测试而固定一个被分析物质(例如标记物质)。

为了一个或多个检测，本发明的检测装置也包括被共扼到固体相上的第一抗体和被共扼有信号发生元件的第二抗体。如此的检测装置被利用来进行三明治免疫分析一个或多个被分析物质。这些装置可以还包括一个样本施加区域和从样本施加区域流动到第二个检测装置区域的流动路径，第二个检测装置区域包括被共扼到固体相上的第一抗体。

随着样本沿着流动路径被驱使而被动的流动(例如通过毛细压力，流体静力学或其他的一旦样本被施加就不需要再操作的压力)，主动的流动(例如通过机械泵产生的压力，电子泵，地心引力，被增加的空气压力等等)，或者被动或主动方式的结合的驱使压力。更优选的，样本被施加到样本施加区域上，沿着流体路径将接触被共扼到固体相上的第一抗体和被共扼有信号发生元件的第二抗体(三明治检测模式)。另外的，装置还可以包括从全血中过滤分离血清或血浆，包括混合腔体等等，或者由于工艺要求而被包括到装置上。更优选的装置包括在《免疫测定手册》的第41章，题目为“近患者测试：商标为Triage

的心脏病系统，作者戴维等等，自然出版集团，2001(Near Patient Tests：Triage

CardiacSystem，”in The Immunoassay Handbook，2^nd ed.，David Wild，ed.，Nature Publishing Group，2001)。该文章的全部作为本发明的一部分被引用。

标记物质的分析可以通过不同的物理模式被检测分析。例如，使用微量盘或者自动控制可以被使用来加快检测大量样本的进程。可选的，单个样本的模式也可以发展而被用来进行快速治疗或诊断，例如在紧急运输或急诊室里。

在另一个方式中，本发明也提供一个分析标记物质的试剂盒子。这样的盒子包括装置和为了分析至少一个测试样本的试剂以及如何进行检测的说明书。当然，该盒子也可以包括利用这些从标记物质面板上的免疫检测而获得的信息进行某种治疗的一个或多个手段。或者其他的可以执行本发明所描述方法的测定策略，包括层析(例如高效液相色谱分析HPLC)，质谱测量，基于受体的检测和以上方式的结合。

检测的临床灵敏度被定义为这种检测可以正确预测具有某种疾病的百分数，特异性被定义为这种检测可以正确预测不具有某种疾病的百分数(Tietz Textbook ofClinicalChemistry，2nd edition，Carl Burtis and Edward Ashwood eds.，W.B.Saunders and Company，p.496)。衡量测试的准确性可以参见《重病特别护理》(Fischer et al.，Intensive Care Med.29：1043-51，2003)所描述的方法而得到，也被用于来测定一个给定标记物质或多个标记物质的效力。这种测定包括灵敏度，特异性，先兆性值，可能的比率，诊断让步比(diagnosticodds ratios)，和ROC曲线区域。正如上面的讨论，优选的测试和检测表现出一个或多个如下不同测试的结果：

从主体具有肾功能衰竭从区分肺栓的能力，具有阳性或阴性让步比分别为至少1.5或者更大，或者大约0.67或更小；优选的，至少为2或更大；或大约0.5或更小；仍然更优选的，至少为5或更大；或大约0.2或更小；甚至更优选的为至少10或更大；或大约0.1或更小；最优选的为至少20或更大；或大约0.05或更小。术语“大约”在这里指正负给定测量值的5％上下浮动。

从主体具有肾功能衰竭从区分肺栓的能力，具有让步比至少为2或者更大，或者大约0.5或更小；优选的，至少为3或更大；或大约0.33或更小；仍然更优选的，至少为4或更大；或大约0.25或更小；甚至更优选的为至少5或更大；或大约0.2或更小；最优选的为至少10或更大；或大约0.1或更小。术语“大约”在这里指正负给定测量值的5％上下浮动。

从主体具有肾功能衰竭从区分肺栓的能力，具有危险率至少为1.1或者更大，或者大约0.91或更小；优选的，至少为1.25或更大；或大约0.8或更小；仍然更优选的，至少为1.5或更大；或大约0.67或更小；甚至更优选的为至少2或更大；或大约0.5或更小；最优选的为至少2.5或更大；或大约0.4或更小。术语“大约”在这里指正负给定测量值的5％上下浮动。

抗体的选择

抗体的选择和产生可以采用多种方法。例如，一种方法就是纯化感兴趣的多肽或者合成感兴趣的多肽。例如利用本领域知晓的固相氨基酸合成方法，例如参见M·D谢尔河等的《蛋白纯化指南》，酶联免疫方法(1990)，182卷(Guide to Protein Purification，MurrayP.Deutcher，ed.，Meth.Enzymol.VoI 182(1990))；G·B菲尔德等的《氨基酸固相合成》，酶联免疫方法(1997)，289卷(Solid Phase Peptide Synthesis，Greg B.Fields ed.，Meth.Enzymol.VoI 289(1997))；科所等的《医药化学杂志》(日本东京)(1990)，38：1192-99(Kiso etal，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)38：1192-99，1990)；莫思多等的《生物多肽，蛋白，核酸》(1995)1：255-60(Mostafavi et al，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids 1：255-60，1995)；富基瓦等的《医药化学杂志》(日本东京)(1990)，38：1192-99(Fujiwara et al，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)44：1326-31，1996)。选择的多肽可以被注射到例如老鼠或兔子中去产生多克隆的或单克隆抗体。任何本领域的技术人员都可以知道很多公知的方法可以产生抗体，例如在爱底华·哈落，大卫·兰顿编写的《抗体·实验手册》(1998)，冷春海港，纽约(Antibodies，A Laboratory Manual，Ed Harlow and David Lane，Cold Spring HarborLaboratory(1988)，Cold Spring Harbor，N.Y.)。本领域的一般技术人员可以知道抗体的结合片段或Fab片段的模仿也可以通过基因信息等制造(例如丽巴等的《抗体工程》：牛津大学出版(1995)的实际操作指南：免疫杂志，149，3914-3920)(Borrebaeck，C，ed.)，1995，Oxford University Press，Oxford；J.Immunol.149，3914-3920(1992))。

另外，也有很多种报告使用抗菌素显示技术来生产和识别多肽文库从而通过结合筛选出目标抗体(参见Cwirla et al.，Proc.Natl.Acad.ScL USA 87，6378-82，1990；Devlin et al.，Science 249，404-6，1990，Scott and Smith，Science 249，386-88，1990；and Ladner et al.，U.S.Pat.No.5,571,698.)。抗菌素显示技术的一个基本的理论就是建立编码被筛选的多肽的DNA和该多肽的物理学联系，这种物理联系被抗菌素粒子提供，它显示为作为衣壳部分的多肽，该衣壳又包括有编码该多肽的衣壳。多肽和他们的基因物质之间的物理关系允许同时大量筛选那些包括有不同多肽的抗菌素。显示一个与目标物质具有亲和力的多肽的抗菌素通过与目标物质的亲和力而浓缩。从这些抗菌素显示而鉴别的多肽可以从他们各自的特殊基因测定。使用这些方法，具有对设计特定目标的结合亲和力的多肽然后可以根据传统的方法大量合成，参见美国专利号o.6,057,098的描述，该专利的所有图表，权利要求等全部内容与本发明内容结合而为本发明的一部分。

如果有必要，通过这些方法产生的这些抗体然后可以通过感兴趣的纯化的多肽进行首次亲和力和特异性筛选，然后与带有用来排除结合多肽的抗体进行亲和力和特异性比较。筛选的方法可以固定纯化的多肽在微孔板上。含有潜在的抗体或抗体群溶液被添加到每一个微孔板上，然后孵育30分钟到2小时。然后，该微孔板被洗脱，标记的第二抗体(例如带有碱性磷酸酶的抗老鼠抗体的抗体，如果该抗体是由老鼠免疫产生的)被添加这些孔中，然后再孵育30分钟，最后再次洗脱。底物被加入到孔中，如果具有与固定的多肽结合的抗体存在，将会发生颜色反应。

这些被筛选的抗体还可以进一步的分析他们的亲和力和特异性。在为了产生目标蛋白的抗体免疫分析过程中，纯化的目标蛋白作为一个标准，通过该标准来调节被选择的抗体在免疫分析中的特异性和灵敏性。因为多种具有亲和力的抗体可能也不同，这些抗体对(在三明治检测中)可能在空间结构上相互影响等，执行检测的抗体可能需要更重要的测量，相对纯粹的亲和力和特异性的抗体而言。

任何本领域的一般技术人员都可以认识到很多方法可以用来生产抗体或结合片段，以及为了亲和力和特异性来筛选和选择可以结合各种多肽的抗体，但是这些方法并不能改变本发明的范围。

例子

如下描述的例子只是举例说明本发明。这些例子没有任何企图来限制本发明的范围。

例1：患者人群的描述

正常

这类人权群由明显健康，正常的主体组成并作为新诊断测试的“控制”主体。正常人的标准包括(1)在登记注册时为18-65岁和(2)有能力书写书面知情同意书的人群。但不包括以下人群：(1)具有急性或慢性疾病(例如高血压，糖尿病，艾兹)；(2)从登记注册30天内需要抗体治疗的急性(尿路感染)，(3)当前有喝酒或吸毒证明的，(4)5年内得过急性肿瘤，恶性皮肤癌除外，(5)最近3个月内作过大型手术和(6)通过调查被认为不合适的人群。

心脏舒张功能障碍(DD)

这类人群的标准为：年纪大于18岁并具有中间或低可能性的胸痛，他们承认到医院胸痛科室去过(CPU)。为了更好的为了研究，那些具有心肌梗塞(myocardial infarction(MI))和曾经作为CPU部分的心脏超声波的负应力病人也被排除在外。压力回声作为一个左心房(left ventricular(LV))喷门运动的一个客观的证据，LV的厚度和心室舒张功能不良的多谱参数(Doppler parameters)。同时，排除的标准也包括：具有初级评估/诊断表明具有心膜冠心疾病((CAD)或心肌梗塞，以及由于历史心室舒张功能不良而导致的充血性心脏衰竭(CHF)。在超声波检测中具有心室舒张功能不良的患者也被排除在外。

肺栓(PE)

年纪包括大于或包括18岁的患者的人群被要求进行PE的诊断，存在PE的标准为：(1)肺部血管造影为阳性，或(2)用高可能性的V/Q扫描，或者(3)较低级的极端双阳性研究和高怀疑为PE(基于以下历史性，身体检查，动脉血管空气，胸片和心电图(ECG)组合中的之一的临床调查来确定在临床上有接近80％的概率可能患有PE)，或(4)在不存在慢性肺病中具有不正常的超声波心电图的患者具有高临床怀疑性，或(5)阳性的螺旋CT血管造影。那些具有左心脏衰竭，和冠心病症状，或者肾脏功能衰竭(肌氨酸酐大于1.5mg/dl)的患者被排除在外。

HF(心力衰竭)

这一部分人群包括年纪大于18岁以上的并需要心力衰竭治疗的患者。患者具有(1)当前具有心肌梗塞(MI(myocardial infarction))或具有1毫米的或更大的ST分离的ACS(严重的冠心病症状)，(2)需要透析的肾脏衰竭；(3)最近过去一月的血液透析，(4)登记入册(基线)Triage

BNP检测浓度＝100pg/ml or或更小，(5)或者其他为了治疗HF而进行药物治疗和实验性的治疗都被排除在外。包括年纪在18或以上的人群，他们进行过HF治疗后处于稳定时期的病人的人群也被排除在外。对亚人群的排除标准也包括那些不能给出正常的承诺，具有严重的肺炎病历史，为了COPD而进行长时间的氧气治疗，原发性肺高血压，要求透析的肾病历史，具有肝病历史，使用左心室辅助设备(LVADs)，撞击过，MI，PTCA(percutaneous transluminal coronary artery angioplasty)，CABG(coronaryartery bypass graft)，或者最近1个月有咽绞痛，严重的主动脉狭窄病历史，严重的二尖瓣狭窄病历史，压缩性心包炎历史的病人，具有心脏移植，阶段1的心脏移植，最近1月具有非Q值波动的MI的ICD or DRG的病人，和具有轻微肺病的病人。

RD(肾脏衰竭)

这类人群具有血液透析的病人。这群病人包括年纪在18-96岁之间的男性或女性。在这里也可以指“RF”或肾脏衰竭。

例子2检测

血液样本被经过培训的人收集在带有作为抗凝试剂EDTA的标准血液收集试管中。通过离心从细胞中分离获得血清，并冷冻并储存在-20℃或者冷藏直到分析。血清被冷冻1小时。检测通过标准的免疫检测技术：微流装置。这种装置实质和《免疫测定手册》的第41章，题目为“近患者测试：商标为Triage的心脏病系统所描述的装置一样，作者戴维等等，自然出版集团，2001(Near Patient Tests：Triage

Cardiac System，”in TheImmunoassay Handbook，2^nd ed.，David Wild，ed.，Nature Publishing Group，2001)。

BNP检测1：两个结合BNP79-108序列上位点的抗体的BNP三明治免疫方法。除了BNP外，该检测也可以测试BNP79-108，proBNP和BNP3-108.

BNP检测2：两个结合BNP79-108序列上位点的抗体的BNP三明治免疫方法，其中一种特异结合从BNP上脱落77和78残基后形成的构体的抗体。这种抗体通过抗菌素显示来筛选，在该方法中，老鼠被BNP79-108序列免疫后，产生的抗体在过量存在BNP的情况下筛选BNP79-108的抗体。过量的BNP可以竞争结合那些不特异结合BNP79-108的任何抗体。该检测不测试BNP79-108，proBNP和BNP3-108.

BNP前体(proBNP)检测1：BNP前体检测通过这样来检测：使用一种特异结合BNP79-108序列上位点的抗体，另一种特异结合BNP3-76序列上位点的抗体。除了检测BNP前体外，该检测还检测BNP3-108。

BNP前体(proBNP)检测2：BNP前体检测通过这样来检测：使用一种特异结合BNP79-108序列上位点的抗体，另一种特异结合从BNP上脱落1和2位点残基后形成的构体的抗体。这种抗体通过抗菌素显示来筛选，在该方法中，老鼠被BNP3-108序列免疫后，产生的抗体在过量存在BNP前体的情况下筛选BNP3-108的抗体。过量的BNP前体可以竞争结合那些不特异结合BNP3-108的任何抗体。该检测不测试BNP，NT-proBNP，proBNP和BNP3-76.

NT-BNP前体检测1：NT-BNP前体检测通过这样来检测：使用结合BNP3-76序列上位点的两种抗体。除了检测NT-BNP前体外，该检测还检测BNP前体，BNP3-108和BNP3-76。

NT-BNP前体(NT-proBNP)检测2：NT-BNP前体检测通过这样来检测：使用一种特异结合BNP3-76序列上位点的抗体，另一种特异结合从BNP前体上脱落1和2位点残基后形成构体的抗体。这种抗体通过抗菌素显示来筛选，在该方法中，老鼠被BNP3-108序列免疫后，产生的抗体在过量存在BNP前体的情况下筛选BNP3-108的抗体。过量的BNP前体可以竞争结合那些不特异结合BNP3-108的任何抗体。该检测不测试BNP，NT-proBNP，proBNP和BNP3-108.

例子3：从肾功能障碍人群中区分出肺栓人群

为了同时测量NT-proBNP和proBNP，一结合NT-proBNP中间位置的位点的抗体与一个可以被检测的标记(荧光能量转移乳胶或者“FETL”)共扼连接，两种抗体，一种为特异结合来自从proBNP上脱落1和2残基后形成构体的抗体，另一种结合BNP的抗体，他们沿着微流检测装置的测试通道被固定在分离的捕获区域上，该微流检测装置实质如《免疫测定手册》的第41章，题目为“近患者测试：商标为Triage

的心脏病系统所描述的装置一样，作者戴维等等，自然出版集团，2001(Near Patient Tests：Triage

CardiacSystem，”in The Immunoassay Handbook，2^nd ed.，David Wild，ed.，Nature Publishing Group，2001)。“NT-proBNP”的分析检测结果可以测试BNP3-76和BNP3-108，然而“proBNP”的检测结果可以测量BNP3-108，但是不能测量BNP3-76。

在通道上的两个免疫检测分析结果被同时用纯化的重组proBNP，并且用含有EDTA人血清稀释的溶液进行校准。这对来自哺乳动物细胞表达的proBNP抗体的结果，在质量浓度上，大约有4-5倍的特异性于来自细菌细胞表达的proBNP抗体。一旦样本被检测，检测分析结果被转换成浓度值对proBNP的结果进行校准。NT-proBNP(BNP3-76)的浓度通过从NT-proBNP的检测结果减去proBNP的浓度而获得。

为了同时测量BNP和proBNP，一结合BNP的抗体与一个可以被检测的FETL共扼连接。两种抗体，一种为结合BNP的抗体，另一种结合proBNP的抗体，他们沿着微流检测装置的测试通道被固定在分离的捕获区域上。“BNP”检测分析结果能够测试BNP，proBNP和BNP3-108，然而“proBNP“的检测结果能够测量proBNP和BNP3-108，但是不能测量BNP。

免疫检测分析结果被同时用纯化的重组proBNP，并且用含有EDTA人血清稀释的溶液进行校准。这对来自哺乳动物细胞表达的proBNP抗体的结果，在质量浓度上，大约有4-5倍的特异性于来自细菌细胞表达的proBNP抗体。一旦样本被检测，检测分析结果被转换成浓度值对proBNP的结果进行校准。

NT-proBNP(BNP3-76)的浓度通过从NT-proBNP的检测结果减去proBNP的检测结果而获得。BNP的浓度通过从BNP的检测结果减去proBNP的检测结果而获得BNP的检测中分离出来。在第二个检测装置上的“proBNP“检测可以和在第一个检测装置上的“proBNP“检测很好的相关性(秩相关系数(Spearman correlation)R＝0.98，同时p＜0.0001)，通过巴步克拉衰退分析(p＜0.01)(Passing-Bablok regression analysis)，同时产生一个更轻微大的结果：BNP面板1上的proBN P检测＝1.46[NT-proBNP面板1上的proBNP检测]-41.28pg/ml。95％的置信区间为1.41-1.52。测试结果的不同可以归因于不同抗体的特异性不同。

以下的统计描述是使用这些分析而获得的：测试值作为pg/mL proBNP而被报告：

BNP检测	正常	DD	PE	HF	RD
						计数	77	81	84	133	442
5th百分点	0.00	0.00	0.00	457.94	87.11
						25th百分点	6.47	4.31	14.98	1610.88	473.33
50th百分点	22.03	24.16	195.30	4184.45	2014.85
						75th百分点	89.59	147.55	876.71	8365.82	5394.15
95th百分点	632.00	437.74	5342.40	16631.64	16018.50

proBNP检测	正常	DD	PE	HF	RF
						计数	77	81	84	133	442
5th百分点	0.00	0.00	0.00	255.46	108.28
						25th百分点	7.46	4.98	12.18	1001.28	404.32
50th百分点	25.93	21.33	91.65	2287.90	1031.93
						75th百分点	57.23	67.08	525.52	4030.23	2724.97
95th百分点	402.41	202.38	2946.52	9634.88	6348.33

使用这些数据，ROC分析被执行用来比较不同的人群(图1和2)。SPSS 15.0为“窗口”(SPSS，Chicago，IL)被用来进行ROC分析。在从RD区分HF，从RD区分PE(ROC的区域接近0.95)中，NT-proBNP对proBNP的比率优于其他任何生物标记物质，同时，在也测试proBNP的传统的BNP和NT-proBNP检测中，很难从RD中区分PE和HF(ROC的区域＝＝～0.50)。

尽快本发明已经通过足够详细描述和作为例子来进行足够详细的说明，以至本领域于的一般技术人员都可以根据本发明进行制造和使用。没有超出本发明的精神和精髓下对本发明的各种改变，修改和改进应该是显然的。本发明在这里提供的例子仅仅是本发明的最佳实施方式，是可以实施和仿效的，但他们不是对本发明的范围做出任何限制。在这里的这些修改和其他用途对于本领域的人是显然的。这些修改也被包括在本发明的精髓里也被本发明的权利要求范围所限定。

对于本领域的一般技术人员来讲，没有超出本发明的精神和精髓下各种对本发明揭示的内容进行替换方式的改变和改变也是显然的。

本发明所列举的所有的专利和出版物都作为本发明所属的本领域一般技术人员的指示。所有的专利和出版物当他们各个出版物被特别作为参考被本发明引用的时候也可以和本发明构成本发明的所揭示的一部分。

本发明一些例子性的说明在用的时候可以缺少在本发明没有特别揭示的一些任何技术元素，任何限制。这样，例如，在每一个例子中，任何技术术语“包括”，“实质由…组成”和“由…组成”也可以被其它一个或两个元素替代。那些被本发明使用的作为术语描述的这些术语以及解释并不是对本发明的限制，也没有任何企图使用这些术语来排除任何作为本发明一部分描述的等价的替换，但是可以认识到在本明的精髓下可以对本发明做各种各样的变化以及修正。因此，应该清楚，尽管本发明已经通过最佳的实施方式和任选特征来进行描述，修改和变化本发明的核心概念应该是本发明领域内一般技术人员所能做的，以及这些更改和修正也应该被认为是属于本发明的权利要求范围内。

其他的实施方式也因该被以下的权利要求所定义。

Claims

1.一种实施对主体诊断的方法，包括：实施选自免疫检测群中的至少两个免疫检测，其中，基于从主体上获取的一个或多个样本进行的所述免疫检测群包括：

测试BNP79-108的免疫检测；测试BNP3-76，但是不测试BNP的免疫检测；和测试BNP3-108，但是不测试BNP的免疫检测；

从免疫检测的结果获得至少两个浓度值；其中免疫检测结果选自：实质指示BNP或BNP79-108的NBP浓度；实质指示proBNP或BNP3-108的proBNP浓度；和实质指示NT-proBNP或BNP3-76的NT-proBNP浓度；

获得一个组合的尿钠肽结果，该结果为以下至少两种所属浓度的函数：BNP浓度，proBNP浓度和NT-proBNP浓度；

对主体诊断进行组合的尿钠肽结果的校正，其中诊断主体包括存在肾脏功能障碍的诊断，不存在肾脏功能障碍的诊断，存在肺栓的诊断和不存在肺栓的诊断。

2.如权利要求1的方法，其中所述的方法包括区分肾脏功能障碍和肺栓的诊断。

3.如权利要求1的方法，其中用于测试BNP79-108的免疫检测为用一特异结合从BNP分子上脱落残基77和78后形成的构体的第一抗体和结合BNP和BNP79-108的第二抗体的三明治免疫检测。

4.如权利要求1的方法，其中用于测试BNP79-108的免疫检测为两种抗体的三明治免疫检测，其中每一种抗体都结合BNP和BNP3-108。

5.如权利要求1的方法，其中用于测试BNP3-108但不测试BNP的免疫检测为用一特异结合从proBNP分子上脱落残基1和2后形成构体的第一抗体和结合proBNP和BNP3-108的第二抗体的三明治免疫检测。

6.如权利要求1的方法，其中用于测试BNP3-108但不测试BNP的免疫检测用为两种抗体的三明治免疫检测，其中每一种抗体都结合proBNP和BNP3-108。

7.如权利要求1的方法，其中用于测试BNP3-76但不测试BNP的免疫检测为用一特异结合从proBNP分子上脱落残基1和2后形成的构体的第一抗体和结合proBNP和BNP3-76的第二抗体的三明治免疫检测。

8.如权利要求1的方法，其中用于测试BNP3-76但不测试BNP的免疫检测用为两种抗体的三明治免疫检测，其中每一种抗体都结合proBNP和BNP3-76。

9.如权利要求1的方法，其中BNP的浓度通过免疫检测BNP79-108所获得的浓度中去除一个或两个proBNP和BNP3-108对BNP79-108浓度的贡献而计算获得的。

10.如权利要求1的方法，其中proBNP的浓度通过免疫检测BNP3-108所获得的浓度中去除一个或多个BNP，BNP79-108，NP-proBNP和BNP3-76对BNP3-108浓度的贡献而计算获得的。

11.如权利要求1的方法，其中NP-proBNP的浓度通过免疫检测BNP3-76所获得的浓度中去除一个或两proBNP和BNP3-108对BNP3-76浓度的贡献而计算获得的。

12.如权利要求1的方法，其中该组合的尿钠肽结果是以下至少两个浓度的函数：BNP浓度，proBNP浓度和NT-proBNP浓度。

13.如权利要求12的方法，其中该函数选自以下的比值：ProBNP比BNP的比率，BNP比proBNP的比率，BNP比NT-proBNP的比率，NT-proBNP比BNP的比率，proBNP比NT-proBNP的比率，和NT-proBNP比proBNP的比率。

14.如权利要求9的方法，其中proBNP比BNP的比率通过BNP的浓度来划分proBNP的浓度计算获得来提供组合的尿钠肽结果。

15.如权利要求9的方法，其中NT-proBNP比proBNP的比率通过proBNP的浓度来划分NT-proBNP的浓度计算获得来提供组合的尿钠肽结果。

16.如权利要求2的方法，其中组合尿钠肽的结果为NTproBNP对于proBNP的比率，该比率用实质表示proBNP或BNP3-108的proBNP浓度和实质表示NT-proBNP或BNP3-768的NT-proBNP浓度计算获得的，其中校正步骤包括将组合尿钠肽的结果与选择可以从肾功能障碍区分心脏衰竭的临界值进行比较。

17.如权利要求2的方法，其中组合尿钠肽的结果为NTproBNP对于proBNP的比率，该比率用实质表示proBNP或BNP3-108的proBNP浓度和实质表示NT-proBNP或BNP3-76的NT-proBNP浓度计算获得的，其中校正步骤包括将组合尿钠肽的结果与选择的可以从肾功能障碍区分肺栓的临界值进行比较。

18.如权利要求2的方法，其中组合尿钠肽的结果为NTproBNP对于proBNP的比率，该比率用实质表示proBNP或BNP3-108的proBNP浓度和实质表示NT-proBNP或BNP3-76的NT-proBNP浓度计算获得的，其中校正步骤包括将组合尿钠肽的结果与选择的可以从肾功能障碍区分肺栓和心脏衰竭的临界值进行比较。