CN1278919A - Bnp的免疫测定法 - Google Patents

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Abstract

一种哺乳类γ－BNP衍生物特异的免疫测定方法,它包括应用与哺乳类α－BNP反应的第1抗体和与前BNP原或γ－BNP衍生物反应而与α－BNP不反应的第2抗体,其中至少一种抗体被可检测性标记或被固相化。

Description

BNP的免疫测定法
技术领域
本发明涉及钠尿肽家族之一的影响脑的钠尿肽(BNP)的免疫测定法，更详细地讲，涉及γ-BNP及其衍生物的免疫测定法。
背景技术
钠尿肽家族包含影响心房的(ANP)、影响脑的(BNP)和C型(CNP)钠尿肽3种，其中ANP和BNP主要在心脏中合成，是分泌出的心脏激素。ANP和BNP结构上相类似，ANP是由28个氨基酸构成的肽，它含有第7位和第23位半胱氨酸间通过二硫键而形成的链接部分。而BNP是由32个氨基酸构成的肽，它含有第10位和第26位半胱氨酸间通过二硫键形成的链接部分。由这些28和32个氨基酸构成的成熟肽，是在细胞内或从细胞中分泌的时候分别从其前体切除前导序列后生成的。即，人BNP在心肌细胞中以前激素原(以下称作前BNP原)的形式产生的，在分泌前或分泌时在Ser 26-His 27间断裂开，成为前BNP(以下称作γ-BNP)后，在Arg 102-Ser 103间断裂开，成为BNP32(以下叫做α-BNP)和BNP(1-76)，具报道，前者具有活性，以为其活性的表达至少链接部分是必要的。
因为心脏激素的分泌是接受由各种心脏疾病所产生的刺激引起的，所以它能很好地反映心功能的变化。ANP的分泌主要是在心房负荷的情况下亢进，BNP是在心室负荷下生成、分泌亢进的，所以ANP和BNP均可用作心脏疾病诊断的指标。随着它们在生物体内作用的明确，也就明确了BNP作为心脏疾病诊断指标的优点。例如，与正常的血中浓度相比，BNP的浓度不过ANP浓度的1／6，但当心功能不全的时候，它的血中浓度比ANP还高；心功能不全的病例，其血中BNP浓度与ANP浓度均上升，但重症病例中血浆BNP浓度多超过ANP浓度，在末梢血水平的血浆中，ANP，BNP浓度均伴随心功能不全的严重程度而增加，但BNP的增加率比ANP大。而且，心功能不全病例中，有时BNP的值能达到健康值的数十～数百倍，由于心功能不全时BNP的变动有其它激素所无法比拟的显著，这提示BNP的测定很有益(齐藤能彦等，Mebio，12(5)，28，(1995))。
这种状况下就公开了可用于心功能不全诊断的应用BNP抗体的免疫测定法。特表平7-507210公开了测定通过蛋白酶等在生物体内分解得到的γ-BNP(1-76)的方法，但是其方法的测定对象是γ-BNP(1-76)，由于它不包含BNP活性表达所必需的链接部分，所以不能直接测定BNP的激素活性。
作为测定具有钠利尿活性的α-BNP的方法，已有市售的应用多克隆抗体的测定试剂盒(“BNP-32”ペニンシユラ公司)。但是，这种测定测定了在血中分解缺失了C末端等丧失了活性的α-BNP的分解产物。考虑到BNP的血中浓度低，不能忽视对该分解产物的测定值，因此认为该方法做为正确诊断心功能不全的BNP测定法包含有不适宜的因素。
另一方面，市场有售非上述不合理的BNP测定试剂盒(シオノリ BNP：盐野义制药公司)，其特征在于它应用活性表达所必要的构造的识别抗体。但是，这种测定中，采血后α-BNP在血中不稳定，所以恐怕待检体的采血和保存方法等对结果有很大的影响。因此，为了得到可靠的数据，本方法中推荐对检测体进行特别处理，如向采血管中添加分解抑制剂，低温保存标本等。恐怕这样的处理会成为该BNP测定试剂盒广泛临床应用的障碍。
发明的公开
本发明人为了建立与BNP相关的心脏疾病的正确诊断方法而进行重复研究的过程中发现，血中BNP的存在形式不是象以往认为的以α-BNP为主，而是由γ-BNP和至少结构上包含α-BNP的γ-BNP分解产物(以下称之为γ-BNP衍生物)构成。另外发现，血中γ-BNP比α-BNP稳定，即，γ-BNP N末端结构的功能之一是使BNP分子稳定。这提示生物体内合成至少2种半衰期不同具有BNP活性的BNP分子。在这样的理论基础上，本发明人达成这样的见解，为了正确诊断心脏疾病，不仅α-BNP，而且有必要特异性测定γ-BNP衍生物，由此完成了本发明。
即，本发明提供哺乳类γ-BNP衍生物的特异性免疫测定方法，其特征在于，它应用与哺乳类的α-BNP反应的第1抗体和与前BNP原或γ-BNP衍生物反应而与α-BNP不反应的第2抗体。
本说明书中“哺乳类的α-BNP”是指哺乳类的前BNP原或γ-BNP从其加工信号序列的羧基末端开始进行加工，由N-末端的肽分离而生成的具有利尿活性的低分子量的肽。α-BNP在人中是由序列表的序列号1中羧基末端的32个氨基酸(第103～134位)构成的、具有环状结构的肽。前BNP原的加工信号序列的羧基末端位置因种属而有若干差异。例如，人的BNP时，序列表的序列号1中的氨基酸序列中第102位的氨基酸残基为Arg，相当于猪和狗的第100位氨基酸残基。
“哺乳类的γ-BNP”是指羧基末端有相当于α-BNP的32个氨基酸的肽部分，当指人时，它是由序列表的序列号1中氨基酸序列的27位His～134位His的108个氨基酸构成的前BNP原。“前BNP原”是指，当为人时，它是由序列表的序列号1记载的氨基酸序列中1位Met～134位His的134个氨基酸构成的肽。
“哺乳类的γ-BNP衍生物”是指由哺乳类的前BNP原或γ-BNP，主要在生物体内蛋白酶的作用下生成的、含有α-BNP而比该α-BNP大的肽片段。而通常情况下比γ-BNP小，但比它大的分子亦可。本说明书中若无特别限定，“γ-BNP衍生物”包含γ-BNP本身及其衍生物。
本说明书中与BNP相关的“稳定”是指，经蛋白酶分解后，至少羧基末端的连接结构和C末端残存保持钠利尿活性，采血后经过24小时，其钠利尿活性未见显着减少的状态。按照本定义，本发明的测定对象γ-BNP衍生物是稳定的。
另一方面，不稳定是指，经蛋白酶等作用C末端分解，采血后经24小时其钠利尿活性显著减低的状态。按照此定义，α-BNP不稳定。
附图简述图1：用α-BNP测定体系进行测定时血浆样品的Superdex 75凝胶过滤HPLC的色谱图。图中A表示α-BNP的洗脱位置。图2：用α-BNP测定体系进行检测时，与图1不同的血浆样品经Superdex 75凝胶过滤HPLC的色谱图。图中A表示α-BNP的洗脱位置。图3：用γ-BNP特异性免疫测定法进行测定时，与图2相同血浆样品经Superdex 75凝胶过滤HPLC的色谱图。图中A表示α-BNP的洗脱位置。图4：25℃保存人血浆中的γ-BNP时，保存时间与BNP免疫活性间的关系图。图5：4℃保存人血浆中的α-BNP时，保存时间与α-BNP免疫活性间的关系图。
实施本发明的最佳方式
本发明的第1方式涉及应用与哺乳类的α-BNP反应的第1抗体和与前BNP原或γ-BNP衍生物反应而与α-BNP不反应的第2抗体的方法。
该方法中所使用的抗体既可以是单克隆抗体又可以是多克隆抗体，第1抗体能以在市场上出售的。或者本领域技术人员用已知方法化学合成的人α-BNP或其部分肽作免疫原，用该领域中已知的方法制备出来。或者也可应用市售的α-BNP测定试剂盒(シオノリ BNP：盐野义制药公司)中应用的与α-BNP羧基末端部分进行反应的单克隆抗体。
第2抗体可应用满足上述条件的任意抗体，优选例如序列表的序列号1记载的氨基酸序列中氨基酸序号27-120所示的氨基酸序列及其代谢产物特异的抗体。本发明的测定对象γ-BNP衍生物，当为人时，优选至少包含序列号1的氨基酸序列中序号27-134所示的部分氨基酸序列。因此，作为优选方式，在制备本发明方法中应用的第2抗体时，有必要注意选择能制备识别序列号1的氨基酸序号27-102的抗体的抗原。可应用该领域中已知的方法来进行该抗体的制备。理论上认为γ-BNP能被蛋白酶酶切的可能部位包含该序列号1的第47位的Arg，53位的Lys和72位的Arg。因此，识别序号1中氨基酸序号73-102的抗体可用作第2抗体。
本发明的测定法既可用竞争法，亦可用夹心法，所用的抗体既可为单克隆抗体又可为多克隆抗体。
第1抗体和第2抗体中至少有一方进行可检测的标记，或固相化。
抗体的标记方法以及固相化方法是该领域人员已知的。可应用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物或粒子等进行标记，对此没有限定。抗体的标记方法也是已知的，例如可应用河野等(核医学技术，13(1)，2(1993))的方法进行标记。
本发明还提供哺乳类γ-BNP衍生物特异的免疫测定试剂盒，其特征在于，它包含与哺乳类的α-BNP反应的第1抗体和与前BNP原或γ-BNP衍生物反应而与α-BNP不反应的第2抗体。
本发明的试剂盒无论应用竞争法或夹心法均可，所用抗体既可为单克隆抗体又可为多克隆抗体。
第1抗体和第2抗体中至少一方进行可检测性标记，或进行固相化。再者，本发明的试剂盒亦可包含检测标记的手段。标记可应用放射性同位素、酶、荧光素、发光物或粒子等进行，但不限于此。
以下例举实施例和试验例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。实施例1用夹心IRMA法测定γ-BNP的衍生物
下面的实施例中，一般的试剂应用和光纯药或ナカライテスク公司的特级试剂，牛血清白蛋白(BSA)使用Sigma公司的。(1)血浆样品的制备
1)从心脏病患者或者健康的自愿者采取静脉血到添加有来源于牛肺的抑肽酶(Sigma公司生产)(500KIU／L)的EDTA采血管中，4℃、2000×g离心5分钟(コクサン公司H-107RGA)，分离血细胞。将所得血浆样品-80℃冻存，备用。
2)将上述1)中制备的来源于心脏病患者和健康人的血浆在凝胶过滤HPLC系统LC10A (岛津制作所)上用Superdex 75 10／30柱(Pharmacia)进行分级分离。用0．1M磷酸缓冲液(pH 7．5，0．3MNaCl、5mM EDTA)，以流速1ml／min平衡柱子后，注入1ml血浆样品，以1m1／份收集柱上的流出液。依照下面(2)-2)的α-BNP测定法和(2)-3)的γ-BNP测定法，分别测定各部分。(2)α-BNP测定体系及γ-BNP衍生物测定体系的构建
1)用以下的肽、抗体和试剂盒进行测定。·人α-BNP(肽研究所)·γ-hBNP氨基末端部分(序列号1中的氨基酸序号27-64)的抗体(肽研究所)·α-BNP羧基末端部分的单克隆抗体(BC203)。
BC203是シオノリア BNP试剂盒(盐野义制药公司)中附带的α-BNP羧基末端(129-134)的单克隆抗体，固化到珠上，作为固相抗体应用。α-BNP连接结构部分相对应的单克隆抗体(KY-BNPII)。
KY-BNPII是シオノリア BNP试剂盒(盐野义制药公司)中付带的与α-BNP连接结构(112-128)相对应的单克隆抗体，用125I标记的。
2)应用α-BNP测定系统测定血浆流份
应用市售的シオノリアBNP试剂盒(盐野义制药公司)测定α-BNP。该系统中应用α-BNP连接结构的单抗(KY-BNPII)和羧基端的单克隆抗体(BC203)，按照供给者的提示，用夹心I RMA(ImmunoRadioMetricAssay)法进行测定)。
即，将各待测样品和各种标准品100μl(α-BNP溶液；0，4，10，130，600，2000pg／ml)分别加到聚苯乙烯制的试管中，添加200μl碘化BNP抗体(125I)溶液加入1个BC203抗体固相化聚苯乙烯珠，搅拌后，4℃静置18小时，进行反应。用2ml洗涤液洗涤2次后，用γ计数仪ARC-600(アロカ公司生产)测定放射活性。结果如图1和图2所示。
3)用γ-BNP衍生物测定系统测定血浆级份
首先用125I标记γ-hBNP氨基末端部分(27-64位)的抗体。
应用MASPII试剂盒(BioRad公司生产)从与γ-hBNP氨基末端部分(序列号1的氨基酸序号27-64部分)相应的抗血清(肽公司生产)中纯化IgG，用セントリコン 30(アミコン公司生产)置换为0．5M磷酸缓冲液(pH 7．5)。用氯胺T法进行抗体标记。将纯化IgG溶液170μl(77．6μg IgG)分加到玻璃试管中，加入10μl(34．2MBq)Na125I溶液(アマシヤム公司生产)。加入0．1％氯胺T溶液20μl，室温剧烈搅拌30秒钟后，分别加入20μl的0．23％。焦亚硫酸钠溶液和5％碘化钾水溶液，终止反应。从Ampure SA柱(アマシヤム)上除去未反应的125I并进行脱盐，得到含有125I标记抗体的溶液。
接着，应用该抗体和将α-BNP羧基末端识别抗体(BC203)固相化的聚苯乙烯珠，对血浆的各部分进行夹心IRMA测定。
将各待测样品100μl分别加到聚苯乙烯试管中，加入200μl的0．1M磷酸缓冲液(pH 7．5 0．3M、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0．2％BSA，500KIU／L来源于牛肺的抑肽酶(Sigma公司生产)，加入1个BC203抗体固相化聚苯乙烯珠，搅拌后，4℃静置18小时，进行反应。用2ml的洗涤液洗涤2次后，加入125I标记抗体溶液300μl，搅拌，4℃静置18小时使之反应。用2ml的洗液洗涤2次后，用γ计数仪ARC-600(アロカ)测定放射活性。结果如图3所示。(3)结果
对患者血浆进行凝胶过滤HPLC色谱分析的测定结果如图1、图2和图3所示。这些图中，A为α-BNP的洗脱位置。
图1表示用上述(2)-2)的α-BNP测定试剂盒进行测定的结果。图中，纵轴是各部分中用シオノリアBNP测定出的BNP样物质的浓度，横轴表示从柱上洗脱出的重量。实心三角、空心正方形方框和空心菱形分别表示不同血浆样品的测定结果。
图2表示用上述(2)-2)的α-BNP测定系统测定与图1不同样品的结果。图中纵轴表示用シオノリア BNP测定出的各部分中BNP样物质的浓度，横轴表示从柱上洗脱下的容量。另外实心三角和实心正方形表示不同的血浆样品。
从图1和图2可以看出，心脏病患者的血浆中存在比α-BNP分子量大的BNP免疫活性样物质，它是具有BNP免疫活性的主要物质。
图3表示应用与图2相同的样品，用上述(3)-3)记载的本发明的γ-BNP测定系统进行检测的结果，纵轴表示用本发明的γ-BNP免疫测定系统测定出的放射活性，横轴表示从柱上洗脱出的容量。另外，实心圆圈表示α-BNP。图3中实心圆圈是将α-BNP溶液与血浆同样进行HPLC分级分离所测定的结果。
从图3中可以看出，本发明的γ-BNP衍生物特异的免疫测定法可检测出具有BNP免疫活性的主要物质，但完全不能检测出α-BNP。
以上结果表明，本发明的γ-BNP免疫测定方法不识别α-BNP，它是γ-BNP衍生物特异的测定方法。另外还表明具有BNP免疫活性的主要物质为γ-BNP。试验例1γ-BNP衍生物及α-BNP在血浆中的稳定性
根据上述实施例1中心脏病患者血浆样品凝胶过滤HPLC的结果。收集认为含有γ-BNP衍生物的部分。应用未添加来源于牛肺的抑肽酶的EDTA采血管，从健康自愿者采静脉血，按照与上述(1)-1)同样的操作得到血浆样品(未满α-BNP最小检出界限(4pg／ml)，添加上述级份后，室温(25℃)放置0、2、6、24小时，用测定α-BNP的シオノリアBNP试剂盒测定BNP免疫活性，检测γ-BNP衍生物的稳定性。
另一方面，向与上述同样的不包含来源于牛肺的抑肽酶的健康自愿者血浆中加入化学合成的α-BNP后4℃放置0、2、6、24小时，用同样的シオノリアBNP试剂盒测定BNP免疫活性，检测α-BNP稳定性。
γ-BNP衍生物及α-BNP在血浆样品中的免疫活性稳定性的结果分别示于图4和图5中。
从图4可以看出，γ-BNP衍生物即便在25℃放置24小时，与初始值的免疫活性相比较未见到显著性降低，与此相对，从图5可以看出，α-BNP 4℃放置24小时时，其免疫活性降低到初始值的40％左右。
以上结果提示α-BNP与γ-BNP衍生物相比，它在血液中极不稳定，对于心脏疾病的患者更适宜。
工业实用性
如上所述，在心功能不全的病例中，BNP值增加到健康者的数十倍～数百倍，由于在心功能不全中BNP的变动有其它激素类无法比拟的显著，提示了BNP测定的有用性。
本发明的免疫测定法不测定α-BNP，而是γ-BNP衍生物特异的测定方法。所以本发明的测定法能提供与以往通过BNP测定来判断的心功能不全的诊断及监测预后的判定不同的临床意义。
另外，本发明测定方法的测定对象γ-BNP，如本说明书开始阐明的那样在血中稳定。因此本发明的测定法可提供不受测定样品的采取法、保存法及到测定时的时间影响的、稳定、可靠的临床数据，而且，因为采血样品无需进行特殊处理，所以可简便地得到临床数据，为心脏疾病的正确诊断做出贡献。
序列表<110>Shionogi & Co Ltd．<120>BNP的免疫测定<130>660984<140><141><150>JP 246684／1997<151>1997-9-11<160>2<117>Word(MS-DOS文本)<210>1<211>436<212>DNA<213>人<400>1atg gat ccc cag aca gca cct tcc cgc gcg ctc ctg ctc ctg ctc ttc    48Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe1                5                  10                   15ttg cat ctg gct ttc ctg gga ggt cgt tcc cac ccg ctg ggc agc ccc    96Leu His Leu Ala Phe Lue Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro20                  25                  30ggt tca gcc tcg gac ttg gaa acg tcc ggg tta cag gag cag cgc aac   144Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn35                  40                   45cat ttg cag ggc aaa ctg tcg gag ctg cag gtg gac cag aca tcc ctg   196His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu50                  55                  60gag ccc ctc cag gag agc ccc cgt ccc aca ggt gtc tgg aag tcc cgg    244Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg65                  70                  75                  80gag gta gcc acc gag ggc atc cgt ggg cac cgc aaa atg gtc ctc tac    292Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Try85                  90                  95acc ctg cgg gca cca cga agc ccc aag atg gtg caa ggg tct ggc tgc    340Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys100                 105                 110ttt ggg agg aag atg gac cgg atc agc tcc tcc agt gcc ctg ggc tgc    388Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys115                 120                125aaa gtg ctg agg cgg cat                                            436Lys Val Leu Arg Arg His130             134<210>2<211>134<212>蛋白质<213>人<400>2Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe1                5                  10               15Leu His Leu Ala Phe Lue Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro20                  25                  30Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn35                  40                  45His Leu Gln gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu50                  55                  60Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg65                  70                  75                  80Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Try85                  90                  95Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys100                 105                 110Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys115                 120                125Lys Val Leu Arg Arg His130             134

Claims (8)

1．哺乳类γ-BNP衍生物特异的免疫测定方法，其特征在于，它应用与α-BNP反应的第1抗体和与前BNP原或γ-BNP衍生物反应而α-BNP不反应的第2抗体。
2．权利要求1的方法，其中γ-BNP衍生物包含序列表的序列号1记载的氨基酸序列中氨基酸序号27-102位的氨基酸序列。
3．权利要求1的方法，其中第2抗体是序列表的序列号1记载的氨基酸序列中27-102位氨基酸序列特异的抗体。
4．权利要求1～3中任一项的方法，其中特征在于，第1抗体和第2抗体中至少有一方被可检测性的标记或被固相化。
5．权利要求中1～3任一项的方法，其中可检测性标记为放射性同位素、酶、荧光素、发光物或粒子。
6．用于哺乳类的γ-BNP衍生物特异性免疫测定的试剂盒，其特征在于，它包含与哺乳类的α-BNP反应的第1抗体和与前BNP原或γ-BNP衍生物反应而不与α-BNP反应的第2抗体。
7．权利要求6的试剂盒，其特征在于，第1抗体和第2抗体中至少一方被可检测性标记或固相化。
8．权利要求7的试剂盒，其特征在于，它包含检测标记的手段。
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