WO1999013331A1

WO1999013331A1 - Procede de dosage immunologique pour bnp

Info

Publication number: WO1999013331A1
Application number: PCT/JP1998/004063
Authority: WO
Inventors: Hidehisa Asada; Hiroyuki Shimizu; Kazuaki Endou
Original assignee: Shionogi & Co., Ltd.
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1998-09-10
Publication date: 1999-03-18
Also published as: DE69833118T2; CN1278919A; EP1016867A4; NO325020B1; CN1161609C; KR100563358B1; CA2304263C; US6828107B2; AU9001098A; ES2256952T3; CA2304263A1; KR20010023853A; DK1016867T3; EP1016867B1; NO20001273D0; ATE315228T1; DE69833118D1; US20030157596A1; EP1016867A1; AU731858B2

Description

明細書 BNPの免疫測定法技術分野

本発明は、ナトリゥム利尿ぺプチドファミリーの 1つである脳性ナトリゥム禾 lj 尿ペプチド（BNP) の免疫測定法に関し、さらに詳しくはー BNPおよびその誘導体の免疫測定法に関する。背景技術

ナトリウム利尿ペプチドファミリーには心房性 (ANP) 、脳性（BNP) および Cタイプ（CNP) ナトリウム利尿ペプチドの 3種が含まれており、これらのうち、 AN Pおよび BNPは主として心臓で生合成され、分泌される心臓ホルモンである。 ΛΝΡと BN Pは構造上類似しており、 ANPは 28アミノ酸からなる、第 7および第 23位システィン間のジスルフイド結合により形成されるリング部分を有するペプチドであり、他方 BNPは 32アミノ酸からなる、第 10 および第 26位システィン間のジスルフィド結合によって形成されるリング部分を有するペプチドである。これら 28および 32アミノ酸からなる成熟ペプチドは、細胞内で、または細胞からの分泌に際してそれぞれの前駆体からリーダー配列が切り離されて生成すると考えられていた。即ち、ヒト BNPについては、心筋細胞中でプレプロホルモン（以下、プレプロ BNPという）として産生され、分泌前または分泌に際して S e r 26 -H i s 27間で開裂され、プロ B N P

(以下、 γ— BNPとレ、う）となった後、 A r g l 02— S e r l 03の間で開裂され、 BNP 32 (以下、ひ一 BNPとレヽう）と BNP (1— 76) になり、前者が活性を示すと報告されていた。これらの活性発現には、少なくともリング部分が必要であると考えられている。

心臓ホルモンの分泌は様々な心疾患により刺激を受けるため、心機能の変化を良好に反映できる。 AN Pの分泌は主に心房への負荷で亢進され、 BNPは心室への負荷で生合成、分泌が亢進され、従って AN Pおよび BNPは共に心疾患診断の指標として有用である。それぞれの生体内における役割が解明されるにつれ、 BNPを心疾患診断の指標とすることの利点が明らかにされてきた。例えば、正常な血中濃度を比較すると B N Pは A N Pの 6分の 1の濃度にすぎないが、心不全などの場合には、 ANPよりも血中濃度が高くなること；心不全の症例では血中 BNP濃度が AN P濃度とともに上昇するが、重症例ほど血漿 BNP濃度は AN P濃度を上回ることが多いこと：末梢血レベルでの血漿 AN P、 BNP濃度はともに心不全の重症度に伴い増加するが、その増加率は ANPよりも BNP のほうが大きいことなどである。しかも、心不全症例での BNP値は健常者の数十倍〜数百倍に増加することもあり、心不全における BNPの変動は他のホルモンに類を見ないほど顕著であることから、 B N P測定の有用性が示唆されている (斎藤能彦ほか、 Mebio, 12(5), 28, (1995)) 。

このような状況下、心不全の診断に利用できる、 BNP抗体を用いる免疫アツセィが開示されている。特表平 7— 50721◦はプロテア一ゼなどで生体内分解された γ— BNP (1— 76) を測定する方法を開示しているが、その方法の測定対象である 7— ΒΝΡ (1 -76) は ΒΝΡ活性発現に必要なリング部分などを含んでいないため、 Β Ν Ρのホルモン活性を直接に測定するものでない。ナトリゥム利尿活性を有する α— Β Ν Ρを測定する手法を提供するものとしてポリクローナル抗体を用いた測定キット（「ΒΝΡ— 32」：ぺニンシユラ社製）が市販されている。しかし、この測定では血中にて分解を受けて C末端などが欠損し活性を失った ct一 ΒΝΡ分解物をも測定してしまうおそれがある。 BN Pの血中濃度が低いことを勘案すると、この分解物に対する測定値は無視できないものであり、よつて本手法は心不全等を正確に診断するための B N P測定法としては不都合を内包すると思われる。

一方、上記の不都合のない BNP測定キット（「シオノリア BNP」：塩野義製薬社製）が市販されており、これは活性発現に必要な構造を認識する抗体を用いることを特徴としている。し力し、この測定では α— BNPが採血後、血中で極めて不安定であることから、検体の採血および保存方法などが測定結果に大きく影響することが危惧される。そのため、本手法において信頼性あるデータを得るために、検体に特別な処理、例えば採血管に分解抑制剤を添加したり、検体を低温に保つなどが推奨されている。このような処理は本件 B N P測定キッ卜の広範な臨床応用への障害となるおそれがあった。発明の開示

本発明者らは、 B N Pが関与する心疾患の正確な診断法を確立するために研究を重ねる過程で、血中での BNPの形態は、従来考えられていたような α_ΒΝ Ρが主ではなく、 γ— ΒΝΡおよび少なくとも構造上 α- ΒΝΡを含むツー ΒΝ Ρ分解物（以下、これらを γ— ΒΝΡ誘導体という）で構成されていることを見出した。また、血中において γ— ΒΝΡは α— ΒΝΡよりも安定であること、即ち、 γ— ΒΝΡの Ν—末端構造の役割の 1つが ΒΝΡ分子の安定化であることを見出した。これらのことは、生体が半減期の異なる少なくとも 2種類の ΒΝΡ活性を有する ΒΝΡ分子を生合成していることを示している。このような知見を得て、本発明者らは、心疾患の正確な診断のためには、ひ一 ΒΝΡのみならず、 γ

-ΒΝ Ρ誘導体を特異的に測定する必要があるとの見解に達し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、哺乳類の α— ΒΝΡに反応する第 1の抗体とプレプロ ΒΝΡ もしくは γ— ΒΝΡ誘導体に反応するが α— Β Ν Ρには反応しない第 2の抗体とを用いることを特徴とする哺乳類の V— Β Ν Ρ誘導体に特異的な免疫測定方法を提供するものである。

本明細書中、「哺乳類の α— ΒΝΡ」とは、哺乳類のプレプロ ΒΝΡまたは γ - Β Ν Ρがそのプロセッシングシグナル配列のカルボキシ末端からプロセスされ、 Ν—末端側のペプチドが分離されることにより生成されるナトリウム利尿活性を有する低分子量のペプチドを意味する。 α— ΒΝΡは、ヒトの場合、配列表の配列番号 1におけるカルボキシ末端側 32アミノ酸（第 103— 1 34位）力らなり、環状構造を有するペプチドである。プレプロ ΒΝΡのプロセッシングシグナル配列のカルボキシ末端の位置は種により若干異なり、例えばヒト Β Ν Ρの場合、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列における第 102位のァミノ酸残基 A rg、ブタおよびィヌでは第 100位のアミノ酸残基に相当する。

「哺乳類の γ— BNP」とは、カルボキシ末端に α— ΒΝΡに相当する 32ァミノ酸ペプチド部分を有し、ヒ卜の場合には、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 27位 Hisから 1 34位 Hisまでの 108アミノ酸からなるプロ B N

Pを意味する。「プレブ口 BNP」とはヒ卜の場合、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列の 1位 Metから 134位 Hisまでの 1 34アミノ酸からなるぺプチドを意味する。

「哺乳類の γ—BNP誘導体」とは、哺乳類のプレプロ ΒΝΡまたは γ— ΒΝ Ρから、主として生体内のプロテア一ゼ作用により生成される、 α— ΒΝΡを含み、該 α— ΒΝ Ρよりも大きいペプチド断片を指す。それは、通常、 γ— ΒΝΡ よりも小さいが、それよりも大きい分子であってもよレ、。本明細書中では、特記しない限り、「γ— ΒΝΡ誘導体」という場合、 γ— ΒΝΡ自身も該誘導体に包含される。

本発明において、 ΒΝΡに関して「安定である」とは、プロテアーゼによる分解を受けるものの、少なくともカルボキシ末端側のリング構造と C末端は残存してナトリゥム利尿活性を保持しており、採血後 24時間経過してもそのナトリゥム利尿活性に有意な減少が見られない状態であることを意味する。この定義に照らして、本発明の測定対象である "V— Β Ν Ρ誘導体は安定である。

一方、不安定であるとは、プロテア一ゼなどにより C末端が分解を受け、採血後 24時間経過すればナトリゥム利尿活性に有意な減少が見られる状態を意味し、この定義に照らして、 α— ΒΝΡは不安定である。図面の簡単な説明

図 1 : α— ΒΝΡ測定系で測定した、血漿検体の Superdex75によるゲルろ過 HP LCでのクロマトグラム。図中、 Aは α— BNPの溶出位置を示す。図 2 ： α -ΒΝΡ測定系で測定した、図 1と異なる血漿検体の S uperdex 7 5によるゲルろ過 HP LCでのクロマトグラム。図中、 Aはひ一 BNPの溶出位置を示す。

図 3 ： γ— BNP特異的免疫測定法で測定した、図 2と同じ血漿検体の S uperdex75によるゲルろ過 HP LCでのクロマトグラム。図中、 Aは α— BN Ρの溶出位置を示す。

図 4 ： γ—BNPをヒト血漿中、 25°Cで保存したときの保存時間と、 ΒΝ

Pの免疫活性との関係を示すグラフ。

図 5 : ひ一 BNPをヒト血漿中、 4 °Cで保存した時の保存時間と、 α— BN Ρの免疫活性との関係を示すダラフ。発明を実施するための最良の形態

本発明は第 1の態様として、哺乳類のひ一 ΒΝΡに反応する第 1の抗体とプレプロ ΒΝΡもしくはー ΒΝΡ誘導体に反応するが α— Β Ν Ρには反応しなレ、第 2の抗体とを用いる方法に関する。

この方法に使用する抗体は、モノクロ一ナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよく、第 1の抗体としては市販されている、または当業者に既知の方法により化学的に合成したヒ卜 α— Β ΝΡもしくはその部分ぺプチドを免疫原として当業者既知の方法で製造することができる。或いは、市販の α— ΒΝΡ測定キット「シオノリア ΒΝΡ」（塩野義製薬社製）に用いられている α— ΒΝΡ力ルポキシ末端部分に反応するモノクローナル抗体を用いることもできる。

第 2の抗体としては、上記の条件を満たす任意の抗体を用いることができるが、例えば配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列におけるァミノ酸番号 27一 1 02で示されるアミノ酸配列およびその代謝物に特異的な抗体であることが好ましい。本発明の測定対象である γ— ΒΝΡ誘導体は、ヒ卜の場合、少なくとも配列番号 1のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号 27- 134で示される部分アミノ酸配列を包含することが好ましい。よって、好ましい態様では、本発明方法に使用される第 2の抗体製造に際し、配列番号 1のァミノ酸番号 27— 102を認識する抗体が作製できるよう抗原を選定する等の注意が必要であろう。このような抗体の製造は当業者既知の方法で行うことができる。 γ— ΒΝΡはプロテア一ゼによる切断可能な部位として、該配列番号 1の第 4 7位の Arg、 5 3位の1^₃ および 7 2位の Argを含有すると理論上考えられる。よって、配列番号 1のアミノ酸番号 7 3— 1 0 2を認識する抗体を第 2の抗体として用いることもできる。本発明の測定法は競合法またはサンドィッチ法のいずれでもよく、用いる抗体はモノクローナル抗体またはポリクロ一ナル抗体のいずれでもよい。

第 1の抗体および第 2の抗体のうち、少なくとも一方は検出可能に標識されている力または固相化されていてもよい。

抗体の標識および固相化法は当業者に既知である。標識としては、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質または粒子等を用いることができるが、これらに限定されない。抗体の標識法も既知であり、例えば河野ら（核医学技術、 13 (1)，

2, ( 1993) ) の方法により標識することができる。

本発明はまた、哺乳類の α— B N Pに反応する第 1の抗体とプレプロ B N Pもしくは γ— Β Ν Ρ誘導体に反応するが α— Β Ν Ρには反応しない第 2の抗体とを含むことを特徴とする、哺乳類の γ— B N P誘導体に特異的な免疫測定のためのキットを提供する。

本発明のキットは競合法またはサンドイッチ法のいずれでもよく、用いる抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。

第 1の抗体および第 2の抗体のうち、少なくとも一方は検出可能に標識されていてよく、また固相化されていてよい。さらに、本発明キットは標識を検出する手段を含んでいてもよい。該標識としては、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質または粒子を用いることができるが、これらに限定されない。

以下に実施例およひ 1¾験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものではなレ、。実施例 1

サンドイッチ I RMA法による γ— Β Ν Ρ誘導体の測定

以下の実施例において、一般の試薬は和光純薬社またはナカライテスク社の特級試薬を使用した。牛血清アルブミン（B S A) はシグマ社製を使用した。 ( 1 ) 血娥検体の調製

1 ) 心疾患患者もしくは健常人ボランティアから牛肺由来ァプロチニン（シグマ社製）（50 OK I UZL) 添カ卩 EDTA採血管に静脈血を採取し、 4°C、

X 2000 gで 5分間遠心分離（コクサン社製 H— 107 RGA) し、血球分離を行つた。得られた血漿検体は使用するまで一 80 °Cで凍結保存した。

2) 上記 1) で調製した心疾患患者および健常人由来の血漿をゲルろ過 HP L Cシステム L C 1 OA (島津製作所社製）に S uperdex 75 10 30カラム

(フアルマシア社）を用いて分画した。 0. 1Mりん酸緩衝液（pH7. 5、 0. 3M Na Cl、 5 mM EDTA) を用い、流速 1 m 1 Zminでカラムを平衡ィヒした後、血漿検体 1 m 1を注入し、カラムからの溶出液 1 m 1づっを捕集する。各分画を用い、下記（2) — 2) のひ一 BNPの測定法および（2) —3) のー BN P測定法に従レ、、それぞれ測定を行つた。

(2) α-ΒΝΡ測定系および γ— Β Ν Ρ誘導体測定系の構築

1) 測定には、以下のペプチド、抗体およびキットを用いた。

· ヒト α— ΒΝΡ (ぺプチド研究所社製）

• γ— hBNPァミノ末端部分（配列番号 1におけるアミノ酸番号 27-64) に対する抗体（ペプチド研究所社製）

• α— BNPカルボキシ末端部分に対するモノクロ一ナル抗体（BC 203) 。

BC203はシオノリア ΒΝΡキット（塩野義製薬社製）に添付されている α 一 BNPのカルボキシ末端（1 29— 1 34) に対するモノクローナル抗体であり、ビーズに固定ィ匕されており、固定化抗体として用いる。

• α—BNPリング構造部分に対するモノクローナル抗体（ΚΥ— ΒΝΡ Ι I) 。

KY-BNP I Iはシオノリア ΒΝΡキット（塩野義製薬社製）に添付されている α— ΒΝΡのリング構造（1 1 2— 1 28) に対するモノクローナル抗体であり、 ¹²⁵ Iで標識されている。

2) α— ΒΝΡ測定系による血漿画分の測定

α-ΒΝΡ測定には市販の「シオノリア Β Ν Ρキット」（塩野義製薬社製）を用いた。この系では、 α— ΒΝΡのリング構造に対するモノクローナル抗体（Κ Y-BNP I I ) およびカルボキシ末端に対するモノクローナル抗体（BC 20 3) を用い、供給者の指示に従い、サンドイッチ I RMA(ImmunoRadioMetric Assay)法で測定する。

すなわち、各測定検体および各種標準物質（ひ一 B N P溶液； 0、 4、 1 0、 1 50、 600、 2000 p g/m 1 ) をポリスチレン製の試験管に 1 00 μ 1 分注し、 200 // 1のヨウ化 ΒΝΡ抗体（¹²⁵ I ) 溶液を添加し、 BC 20 3抗体固相化ポリスチレンビーズを 1個加えて撹拌後、 4 で 1 8時問静置して反応させた。 2 m 1の洗浄液で 2回洗浄を行つた後、放射活性を γカウンタ一 A R C 一 600 (ァロカ社製）で測定した。その結果を図 1および図 2に示す。

3) γ— BNP誘導 ίφ:測定系による血漿画分の測定

まず、 T _h ΒΝΡァミノ末端部分（27— 64位）に対する抗体の¹²⁵ Iによる標識を行った。

γ— h BNPァミノ末端部分（配列番号 1のァミノ酸番号 27— 64部分）に対する抗血清（ペプチド社製）から MAS P I Iキット（バイオラッド社製）を用いて I g Gを精製し、セン卜リコン 30 (アミコン社製）を用いて 0. 5Mりん酸緩衝液（ p H 7. 5 ) に置換した。抗体標識はクロラミン T法を用いて行つた。精製 I g G溶液 1 70 1 (7 7. 6 g I gG) をガラスチューブに分注し、 Na¹²⁵ I溶液（アマシャム社製）を Ι Ο μ Ι (34. 2MB q) 添カ卩した。 0. 1 %クロラミン T溶液 20 // 1を添加し、室温で 30秒間激しく攪拌した後、 0. 25 <½ピロ亜硫酸ナトリゥム溶液および 5 %ョゥ化カリゥム水溶液をそれぞれ 20 μ 1ずつ加えて反応を停止した。 Ampure SAカラム（アマシャム社製）により未反応の¹²⁵ Iの除去および脱塩を行い、 ¹²⁵ I標識抗体を含む溶液を得た。

次いで、この抗体および α— B N Pカルボキシ末端認識抗体（ B C 203 ) を固相したポリスチレンビーズを用い、血漿画分に対してサンドイッチ I RMA法で行った。

各測定検体 1 00 _M 1をポリスチレン製の試験管に分注し、 200 // 1の 0. 1Mりん酸緩衝液（ρΗ7. 5、 0. 3Μ、 5 mMエチレンジァミン四酢酸（E D TA) 、 0. 2%BSA、 500 K I 1牛肺由来ァプロチニン（シグマ社製）を添加し、 BC 203抗体固相ポリスチレンビーズを 1個加えて攪拌後、

4 °Cで 1 8時間静置して反応させた。 2mlの洗浄液で 2回洗浄を行った後、 ¹²

⁵ I標識抗体溶液 300 // 1を加えて攪拌し、 4°Cで 18時間静置して反応させた。 2mlの洗浄液で 2回洗浄を行った後、放射活性を yカウンター ARC— 6

00 (ァロカ社製）で測定した。その結果を図 3に示す。

(3) 結果

患者血漿のゲルろ過 HP LCによるクロマトグラムの測定結果を図 1、図 2および図 3に示している。これらの図において Λは《— BNPの溶出位置である。図 1は、上記（2) — 2) の α— BNP測定キットによる測定結果を示している。図中、縦軸は各分画中のシオノリア ΒΝΡで測定した ΒΝΡ様物質の濃度、横軸はカラムからの溶出容量を表す。黒三角、白四角および白菱形はそれぞれ異なる血検体の測定結果を示している。

図 2は、図 1と異なる検体を用いて、上記（2) -2) の α— ΒΝΡ測定系で測定した結果を示している。図中、縦軸は各分画中のシオノリア ΒΝΡで測定した ΒΝΡ様物質の濃度、横軸はカラムからの溶出容量を表す。また、黒三角および黒四角は異なる血漿検体を示す。

図 1および図 2から、心疾患患者血漿中には α— ΒΝΡよりも分子量の大きな Β Ν Ρ免疫活性様の物質が存在し、それが Β Ν Ρ免疫活性をもつ主要物質であることが分かる。

図 3は、図 2と同じ検体を用いて上記（2) -3) に記載の本発明の ΒΝ Ρ測定系による測定結果を示し、縦軸は本発明の γ— Β Ν Ρ免疫測定系で測定した放射活性を、横軸はカラムからの溶出容量を表している。また、黒丸は α— Β ΝΡを示す。図 3中、黒丸はヒト α— ΒΝΡ溶液を血漿の場合と同様に HPLC にって分画して測定された結果である。

図 3から、本発明の γ— Β Ν Ρ誘導体特異的免疫測定法では、 Β Ν Ρ免疫活性をもつ主要物質を検出することができるが、 α— Β Ν Ρは全く検出されないことが分かる。以上の結果は、本発明の V— B N P免疫測定法が α— B N Pを認識せず、 y― BNP誘導体に特異的な測定方法であることを示している。また、 BNP免疫活性をもつ主要物質が γ— BNPであることも明らかとなった。試験例 1

γ— ΒΝΡ誘導体および α— ΒΝΡの血漿中での安定性

上記実施例 1における心疾患患者由来の血娥検体のゲルろ過 H P L Cの結果から、 γ—ΒΝΡ誘導体を含むと思われる分画を採取した。牛肺由来ァプロチニン未添加の EDTA採血管を用い、健常人ボランティアから静脈血を採取し、上記 (1) 一 1) と同様の操作により血漿検体 — ΒΝΡ最小検出限界（ApgZm 1 ) 未満）を得、それに上記分画を添加後、室温（25°C) にて 0、 2、 6、 2 4時間放置し、 BNP免疫活性を、 α— BNPを測定するためのシオノリア BN Ρキットで測定し、 γ— Β Ν Ρ誘導体の安定性を調べた。

—方、上記と同様の牛肺由来のァプロチニンを含まない健常人ボランティア血漿に化学的に合成した _α— ΒΝΡを添加後、 4でで0、 2、 6、 24時間放置し、その ΒΝΡ免疫活性を同様にシオノリア ΒΝΡキットで測定し、ひ一 ΒΝΡの安定性を調べた。

7 -Β Ρ誘導体および α— ΒΝΡの血漿検体中での免疫活性の安定性の結果を図 4および図 5にそれぞれ示す。

図 4から、 γ— ΒΝ Ρ誘導体は 25 °Cで 24時間放置しても初期値の免疫活性に比較して有意な低下が見られないのに対し、図 5から、ひ一BNPは 4°Cで 2 4時間放置した場合、初期値の約 40%にまで免疫活性が低下することが分かる。以上から、 α— BNPは γ— BNP誘導体よりも血液中で著しく不安定であり、心疾患の診断には、後者が適することが示された。産業上の利用の可能性

上記のように心不全症例での Β Ν Ρ値は健常者の数十倍〜数百倍に増加することもあり、心不全における Β Ν Ρの変動は他のホルモンに類を見ないほど顕著であることから、 B N P測定の有用性が示唆されている。

本発明の免疫測定法は、 α— B N Pは測定せずに γ— Β Ν Ρ誘導体を特異的に測定できる方法である。よって本発明測定法によれば、従来の Β Ν Ρ測定により判断されていた心不全診断およびモニタリング予後の判定とは異なる臨床上の意義を提供できると考えられる。

また、本発明測定法の測定対象である γ— Β Ν Ρは本明細書にて初めて明らかにされたように血中にて安定である。よって本発明測定法は測定検体の採取法、保存法および測定までの時間による影響を受けることなく安定な信頼性ある臨床データを提供でき、しかも採血試料に特別な処理を施す必要がないので、簡便に臨床データが得られ、心疾患のさらなる正確な診断に貢献し得る。

Claims

請求の範囲

1. 哺乳類の ct一 BNPに反応する第 1の抗体とプレプロ BNPもしくは γ -ΒΝ Ρ誘導体に反応するが α— Β Ν Ρには反応しない第 2の抗体とを用いることを特徴とする哺乳類の γ— Β Ν Ρ誘導体に特異的な免疫測定方法。

2. y -BN P誘導体が、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列におけるアミノ酸番号 2 7- 1 0 2で示されるアミノ酸配列を包含するものである請求項 1記載の方法。

3. 第 2の抗体が、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列におけるアミノ酸番号 27— 1 02で示されるアミノ酸配列に特異的な抗体である請求項 1記載の方法。

4. 第 1の抗体および第 2の抗体のうち、少なくとも一方が検出可能に標識されている力、あるいは固相化されていることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれかに記載の方法。

5. 検出可能な標識が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質または粒子である請求項 1〜 3のいずれかに記載の方法。

6. 哺乳類のひ一 BNPに反応する第 1の抗体とプレプロ BNPもしくは γ 一 Β Ν Ρ誘導体に反応するが α— Β Ν Ρには反応しない第 2の抗体とを含むことを特徴とする、哺乳類の γ— ΒΝΡ誘導体に特異的な免疫測定のためのキット。

7. 第 1の抗体および第 2の抗体のうち、少なくとも一方が検出可能に標識されている力、固相化されていることを特徴とする請求項 6記載のキット。

8. 標識を検出する手段をさらに含むことを特徴とする請求項 7記載のキット。