JP2003270250A - 血液中の心不全マーカー定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 心不全マーカーを簡易に定量する方法を提供
する。 【解決手段】 血液担持担体から血液成分を抽出し、該
抽出血液成分から血液中の心不全マーカーを定量するこ
とを特徴とする血液中の心不全マーカー定量方法を用い
る。なお、心不全マーカーとしては、心房負荷、心室負
荷、心筋肥大、心筋虚血及び／又は心筋壊死に起因する
慢性心不全マーカーであることが好ましく、さらに好ま
しくは心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）及び／
又は脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である。ま
た血液担持担体としては、血液に対する抗凝固剤及び／
又は蛋白分解酵素の阻害剤を含有する吸収体に血液を担
持してなることが好ましく、また担体として濾紙が好ま
しい。また指先から採取した血液を担持させることが好
ましい。また、抽出液中の心不全マーカー濃度と、血液
成分の抽出率とから、血液中の心不全マーカー濃度を決
定することが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液中の心不全マ
ーカー定量方法に関する。さらに詳しくは、心房負荷、
心室負荷、心筋肥大、心筋虚血又は／及び心筋壊死に起
因する心不全の診断に用いられる血液中の心不全マーカ
ー定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、心不全マーカーの定量方法とし
て、採血用注射器を用いて、主に患者の肘正中静脈より
全血２ｍＬ以上を抗凝固剤入りの採血管に採取し、混和
後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心して
血漿部分と血球部分を分け、上清（血漿）部分を別の試
験管に分取し、これを測定検体として定量する方法等が
知られている（例えば、臨床検査マニュアル、１９８８
年、文光堂、３１１〜３１６頁）。さらに通常は測定を
効率的に実施するため、測定検体を凍結又は冷蔵保存し
て一定量の測定検体をまとめて定量する方法等が知られ
ている（例えば、イムノアッセイ、１９８４年、ジェイ
エムシー、１７３〜１７４頁）。この方法は、特に慢性
心不全の診断及び急性心不全の回復期の診断等に用いら
れている。急性心不全、例えば急性心筋梗塞などでは、
診断に緊急性が必要なため、上記血漿分離後に直ちに測
定を行う方法又は採血後ただちにイムノクロマト法等の
迅速測定（例えばバイオサイトダイアグノスティクス社
の製品「Ｔｒｉａｇｅ ＣＡＲＵＤＩＡＣ ＰＡＮＥ
Ｌ」を用いた測定）が実施されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来の方法において
は、健康診断等多数の被検者から採血し血液中の心不全
マーカーを測定する場合、多数の血液から上清を分離す
る操作が必要であり、分離した血漿を試験管で冷蔵又は
冷凍で輸送・保存する必要がある等コストが高くなる問
題があった。また、急性心不全の診断に用いられるイム
ノクロマト法等の迅速測定は、急性心不全発症時の診断
には有効であるが、回復期あるいは長期的なフォローア
ップにはコストが高くなる点、及び多数の検体測定に向
いていない点で問題があった。すなわち、本発明の目的
は、心不全マーカーを簡易に定量する方法を提供するこ
とである。特に診断に緊急性を要しない、慢性心不全の
心不全マーカーを簡易に定量する方法を提供することで
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成すべく鋭意検討した結果、特定の方法を用いること
により、心不全マーカーを簡易に定量できることを見い
だし本発明に到達した。すなわち、本発明の血液中の心
不全マーカーの定量方法の特徴は、血液担持担体から血
液成分を抽出し、該抽出血液成分から血液中の心不全マ
ーカーを定量する点を要旨とする。

【０００５】

【発明実施の形態】本発明における心不全マーカーは、
心房負荷、心室負荷、心筋肥大、心筋虚血又は／及び心
筋壊死等に起因する心不全を診断するための心不全マー
カーである。心不全としては、慢性心不全及び急性心不
全が挙げられ、これらのうち、特に慢性心不全に好適で
ある。心不全を診断するための心不全マーカーとして
は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナ
トリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿
ペプチド（ＣＮＰ）、心筋ミオシン軽鎖、トロポニンＴ
及び血清ミオグロビン等が挙げられる。これらのうち、
慢性心不全への特異性の高いという観点から、心房性ナ
トリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿
ペプチド（ＢＮＰ）及びＣ型ナトリウム利尿ペプチド
（ＣＮＰ）が好ましく、さらに好ましくは心房性ナトリ
ウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）及び脳性ナトリウム利尿ペ
プチド（ＢＮＰ）である。

【０００６】血液担持担体中の血液は、その採取部位及
び採取方法等に制限はなく、従来の採取部位及び採取方
法（例えば、採血用注射器を用いて、主に肘正中静脈よ
り全血２ｍＬ以上採取等）で得た血液の一部を本発明に
用いることも当然可能であるが、該血液は、被検者への
侵襲性の低減の観点から、抹消血管からの採取が好まし
く、抹消血管からの採取の中でも、被検者の侵襲性低減
の観点から耳朶又は指先を穿刺して採取した血液がより
好ましく、被検者が自分で血液を採取できる点、穿刺時
の痛感が少ない点及び血液が液滴として採取（滴下）し
易い点等の観点から指先を穿刺して採取した血液が特に
好ましい。

【０００７】末梢血液を採取する方法としては、血液を
採取できれば特に制限はないが、被検者自身で実施可能
であるという観点から、例えば、被検者の当該部位（例
えば、耳朶及び指先等）を穿刺前によくマッサージ及び
／又は暖めて充血させておき、消毒ガーゼで穿刺部位を
拭いて乾燥させ、ディスポーザブル・ランセット等で当
該部位を穿刺して血液を得る方法等が好ましい。

【０００８】血液担持担体中の担体としては、血液を保
持することが可能である限り、担体の材質、形状等は特
に制限されないが、吸着による血液の保持が容易であ
り、抽出により血液成分が溶出し易い材質・形状である
ことが好ましく、吸着による保持が容易という観点か
ら、吸収体であることがさらに好ましい。

【０００９】担体には、あらかじめ、血液に対する抗凝
固剤及び／又は蛋白分解酵素の阻害剤を含有しているこ
とが好ましい。血液に対する抗凝固剤としては、例えば
ヘパリンナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム塩、クエン酸
ナトリウム及びフッ化ナトリウム等が挙げられ、これら
のうち、ＥＤＴＡナトリウム塩が好ましい。蛋白分解酵
素の阻害剤としては、例えばアマスタチン、アンチパイ
ン、アンチスロンビンＩＩＩ、カルペプチン、ＰＭＳＦ
及びアプロチニン等が挙げられ、これらのうち、ＰＭＳ
Ｆ及びアプロチニンが好ましい。

【００１０】血液の抗凝固剤を使用する場合、抗凝固剤
の含有量は、多孔質材が保持できる体液量に応じて適宜
設定でき、体液１ｍＬ当たり、好ましくは０．１ｍｇ以
上、さらに好ましくは１ｍｇ以上、そして、好ましくは
１００ｍｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ以下となる
ように設定する。蛋白質分解酵素阻害剤の含有量は、多
孔質材が保持できる体液量に応じて適宜設定でき、体液
１ｍＬ当たり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、さらに好
ましくは０．１ｍｇ以上、そして、好ましくは１００ｍ
ｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ以下となるように設
定する。

【００１１】担体に、あらかじめ血液に対する抗凝固剤
及び／又は蛋白分解酵素の阻害剤とを含有させる方法
は、例えば抗凝固剤及び阻害剤を含む溶液を担体に噴霧
したのち乾燥させる方法、抗凝固剤及び阻害剤を含む溶
液に担体を浸積したのち乾燥する方法等が適用できる。
抗凝固剤及び／又は阻害剤を溶解する溶剤は、抗凝固剤
及び／又は阻害剤の溶解性により適宜選択できる。水溶
性の抗凝固剤及び／又は阻害剤の場合、蒸留水、脱イオ
ン水、生理食塩水、リン酸緩衝液及びグッドの緩衝液等
が使用でき、非水溶性の抗凝固剤及び／又は阻害剤の場
合、適当な有機溶剤、例えばＰＭＳＦの場合は、エタノ
ール及びアセトン等が使用できる。これらのうち、水溶
性の場合、蒸留水及び脱イオン水が好ましい。非水溶性
の場合は、好ましい溶剤は蛋白分解酵素阻害剤等の種類
により異なるが、ＰＭＳＦの場合、エタノールである。
溶液中の抗凝固剤の含有量（ｍｇ／ｍＬ）は、抗凝固剤
の種類により適宜設定できるが、溶液１ｍＬ当たり、
０．０１以上が好ましく、さらに好ましくは０．１以上
である。また１００以下が好ましく、さらに好ましくは
１０以下である。

【０００１２】溶液中の阻害剤の含有量（ｍｇ／ｍＬ）
は、阻害剤の種類により適宜設定できるが、溶液１ｍＬ
当たり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、さらに好ましく
は０．１ｍｇ以上、そして、好ましくは１００ｍｇ以
下、さらに好ましくは１０ｍｇ以下である。

【００１３】担体の材質としては、公知の天然高分子及
び合成高分子等が使用でき、例えば、綿、羊毛、セルロ
ース、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、
ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステ
ル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイ
ン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、
ゴム、ガラス、石英及びセラミックス等が挙げられる。
これらのうち、天然高分子が好ましく、さらに好ましく
はセルロース及び綿であり、特に好ましくはセルロース
である。

【００１４】担体としては、公知のものが使用でき、例
えば、上記の材質等からなる濾紙、不織布、織布又はシ
ート状発泡体等からなる吸収体が挙げられる。濾紙とし
ては、例えば、ＪＩＳ Ｐ３８０１（１９９５年）又は
ＴＡＰＰＩ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ ＰａｐｅｒＩ
ｎｄｕｓｔｒｙ）Ｔ２０５に規定される濾紙等が挙げら
れる。不織布としては、例えば、ポリオレフィン不織
布、ニトロセルロース不織布、セルソールアセテート不
織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不
織布及びセラミックス不織布等が挙げられる。織布とし
ては、例えば、綿布、羊毛布、セルロース布、ポリオレ
フィン布、ニトロセルロース布、セルロールアセテート
布、エポキシ布、ガラス布及びセラミックス布等が挙げ
られる。シート状発泡体としては、例えば、発泡ポリス
チレン、発泡ポリオレフィン、発泡ポリウレタン、発泡
ポリエステル、発泡エポキシ樹脂、発泡ガラス及び発泡
セラミックス等が挙げられる。これらのうち、単位体積
又は単位面積当たりに吸収する血液の量が一定になりや
すいという（定量精度向上）観点から、濾紙、不織布及
びシート状発泡体が好ましく、さらに好ましくは濾紙及
び不織布、特に好ましくは濾紙である。

【００１５】濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等
の厚さ（ｍｍ）は、適宜選択することができるが、０．
１以上が好ましく、さらに好ましくは０．２以上、特に
好ましくは０．３以上である。また３．０以下が好まし
く、さらに好ましくは１．０以下、特に好ましくは０．
６以下である。濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体
等の大きさ（面積ｃｍ²）は、採血、保管及び輸送時等
の操作性を考慮して自由に設定できるが、１以上が好ま
しく、さらに好ましくは１０以上、特に好ましく２５以
上である。また２００以下が好ましく、さらに好ましく
は１５０以下、特に好ましく１００以下である。吸収体
の孔径は自由に設定選択できるが、吸収体の平均孔径
（μｍ）は１以上が好ましく、さらに好ましくは２以
上、特に好ましくは５以上である。また１００以下が好
ましく、さらに好ましくは８０以下、特に好ましくは５
０以下である。

【００１６】血液の担体への担持は、血液が保持できれ
ば特に制限されず、担体と血液とを接触させることによ
り担体に血液を担持させることができる。担体と血液と
を接触させる方法としては、例えば、血液に担体を浸漬
する方法、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体
を押し付ける方法等が挙げられる。これらのうち、簡便
性の観点から、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に
担体を押しつける方法が好ましく、さらに好ましくは担
体に血液を滴下する方法である。

【００１７】血液に担体を浸漬する場合、血液の使用量
（ｍｌ）は担体が浸漬できる量であり、担体の大きさに
決定されるが、０．０５以上が好ましく、さらに好まし
くは０．１以上、特に好ましくは０．１５以上である。
また２以下が好ましく、さらに好ましくは１以下、特に
好ましくは０．５以下である。担体に血液を滴下する場
合、血液の使用量（ｍｌ）は担体の大きさに決定される
が、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは０．０
５以上、特に好ましくは０．１以上である。また０．５
以下が好ましく、さらに好ましくは０．３以下、特に好
ましくは０．２以下である。穿刺部に担体を押し付ける
場合、血液の使用量（ｍｌ）は担体の大きさに決定され
るが、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは０．
０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また０．
５以下が好ましく、さらに好ましくは０．３以下、特に
好ましくは０．２以下である。

【００１８】血液担持担体の血液担持部分を一定の大き
さに切り取る場合（後述）、切取られる担体が保持でき
る量以上の血液を滴下すればよく、滴下する血液量を正
確に制御する必要はない。例えば、ろ紙がワットマン社
製ＢＦＣ１８０（厚さ０．４９ｍｍ）の場合、滴下した
血液量が５０μＬであれば血液を保持した部分の大きさ
は直径約１２ｍｍである。１滴の液量は約４０〜６０μ
Ｌであるので、血液担持部分を直径６ｍｍの円形に打ち
ぬく場合、必要な血液の量は１〜２滴となる。

【００１９】さらに、血液の安定性及び定量の再現性の
観点から、血液を担体に保持させた後、乾燥させること
が好ましく、担体に保持された血液の重量が５０重量％
以下（好ましくは３０重量％以下）になるまで乾燥する
ことがさらに好ましい。乾燥方法としては、例えば、減
圧乾燥、冷凍減圧乾燥、微加熱乾燥及び単純乾燥（風
乾）等が適用でき、これらのうち、減圧乾燥、冷凍減圧
乾燥及び単純乾燥が好ましく、さらに好ましくは減圧乾
燥及び単純乾燥であり、特に好ましくは単純乾燥であ
る。

【００２０】乾燥は、心不全マーカーの免疫反応性が変
化しない条件で行うことが好ましく、４０℃以下の温度
で行うのがさらに好ましく、特に好ましくは３０℃以下
である。また０℃以上で行うことが好ましく、さらに好
ましくは１０℃以上である。減圧する場合は、圧力（Ｐ
ａ）は、０．０２以上が好ましく、さらに好ましくは
０．０５以上、特に好ましくは０．１以上である。また
１０以下が好ましく、さらに好ましくは２以下、特に好
ましくは１以下である。単純乾燥する場合の湿度（％Ｒ
Ｈ）は、特に制限はないが、１０以上が好ましく、さら
に好ましくは４０以上である。また９０以下が好まし
く、さらに好ましくは８０以下である。乾燥時間は、担
体の形状、保持した血液量により適宜設定できるが、担
体が濾紙の場合、２０分〜１時間程度である。

【００２１】血液保持担体を保存する場合、湿度（％Ｒ
Ｈ）は、８０が好ましく、さらに好ましくは６０以下、
特に好ましくは４０以下である。また５以上が好まし
く、さらに好ましくは１０以上、特に好ましくは２０以
上である。またこの場合、温度（℃）は、０以上が好ま
しく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは２以上
である。また４０以下が好ましく、さらに好ましくは３
０以下、特に好ましくは１０以下である。なお、湿度８
０％ＲＨ以下を保てる状態（密閉下、乾燥剤存在の密閉
下等）であれば郵便又は宅配便等により輸送することが
できる。

【００２２】血液成分の抽出の前に、血液担持担体の血
液担持部分を一定の大きさに切り取ってから行うことが
好ましい。例えば、均一な吸収体に血液を滴下し、過剰
な血液は周囲に拡散吸収させて乾燥した後、中心部を一
定の形状に切り取ったものを抽出に用いる方法が好まし
い。切り取る方法としては、一定直径のパンチで打ちぬ
く方法及び予め入れた切取線（ミシン目等）に沿って切
り出す方法等が適用できる。

【００２３】血液担持担体から血液成分の抽出は、血液
中の心不全マーカー（抗原）の免疫反応性が変化しない
限り特に制限なく行うことができ、例えば、抽出用溶液
に血液担持担体を浸漬し、その上清を抽出液として用い
ることができる。抽出用溶液として、ｐＨが中性領域の
緩衝液が使用でき、例えば、ｐＨ６〜８のグッド緩衝液
及びｐＨ６〜８のリン酸緩衝液等が好ましく使用され
る。

【００２４】また、抽出用溶液に、塩、界面活性剤、蛋
白質及び抗原安定化剤等を添加することもできる。塩と
しては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭
化リチウム等が挙げられる。界面活性剤としては、例え
ば、ソルビタンラウリン酸モノエステルエチレンオキシ
ド付加物（例えば、ツイーン２０及びツイーン４０（Ｉ
ＣＩアメリカ社））等のノニオン界面活性剤等が挙げら
れる。蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン及び
カゼイン等が挙げられる。抗原安定化剤としては、例え
ば、ＥＤＴＡ等のキレート剤及びプロテアーゼインヒビ
ター等が挙げられる。

【００２５】定量再現性の観点から、担体に対する抽出
用溶液の使用量及び抽出時間等の抽出条件を一定にする
必要がある。抽出用溶液の使用量（ｍｌ）としては、血
液担持担体１個当たり、０．０５以上が好ましく、さら
に好ましくは０．１以上、特に好ましくは０．２以上で
ある。また５以下が好ましく、さらに好ましくは１以
下、特に好ましくは０．５以下である。抽出時間（分）
としては、０．５以上が好ましく、さらに好ましくは１
以上、特に好ましくは５以上である。また４８０以下が
好ましく、さらに好ましくは１８０以下、特に好ましく
は６０以下である。撹拌は、ボルテックスミキサーのよ
うな装置を用いて、容器を震動して行うことが好まし
く、震動回数は１００〜２０００ｒｐｍが好ましい。

【００２６】例えば、血液担持担体から切り取った直径
６ｍｍ（厚さ０．４９ｍｍ）の濾紙（ワットマン社製Ｂ
ＦＣ１８０）の場合、以下の条件等で抽出できる。 抽出用溶液組成：塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（塩化ナトリウムの含有
量：緩衝液１００ｍＬ当たり０．８５ｇ、以下同じ。） 抽出用溶液の使用量：２００〜３００μＬ 抽出温度：室温（１５〜２５℃） 抽出時間：２０分〜１時間（攪拌後の放置時間） 抽出操作：担体に抽出用溶液を加えボルテックスミキサ
ーで攪拌後（５００ｒｐｍ、１分）、上記温度で上記時
間放置する。再度攪拌（ボルテックスミキサーで５００
ｒｐｍ、５秒）し、１分間静置し分散したろ紙繊維を沈
降させた後、上清液を採取し、心不全マーカー測定のた
めの検体（抽出液）として用いる。

【００２７】上記抽出液中の心不全マーカーの定量方法
は特に制限されないが、定量値の再現性及び測定感度の
観点から、免疫学的測定法が好ましい。免疫学的測定法
としては従来公知の方法が使用できるが、抽出液中の心
不全マーカー濃度が血液中の濃度より低いためより定量
感度の高い測定法が望ましく、例えば、放射免疫測定
（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定
（ＦＩＡ）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）が好ま
しい。放射免疫測定（ＲＩＡ）としては、固相抗体とＩ
１２５標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が
挙げられ、多数の測定試薬キットが市販されている。酵
素免疫測定法（ＥＩＡ）としては、固相抗体と酵素標識
抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、
酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いた種々の測定試薬
キットが市販されている。蛍光免疫測定（ＦＩＡ）とし
ては、固相抗体とユーロピウム標識抗体を用いた２部位
サンドイッチ測定法等が挙げられる。化学発光免疫測定
法（ＣＬＩＡ）としては、固相抗体とアクリジニウムエ
ステル標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が
挙げられ、種々の測定試薬キットが市販されている。こ
れらの免疫学的測定法の中で、好ましいのは酵素免疫測
定法（ＥＩＡ）であり、さらに好ましくは化学発光酵素
免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）である。

【００２８】抽出液中の心不全マーカー濃度から、血液
中の心不全マーカーの濃度を求める方法は、種々の方法
が適用でき、例えば、（１）心不全マーカーの濃度が既
知の血液を担持した血液担持担体を用いて作成した検量
線を用いる方法、及び（２）心不全マーカーの濃度が既
知の抽出液を用いて作成した検量線と心不全マーカーの
抽出率とを用いる方法等が挙げられる。

【００２９】（２）の方法において、抽出率は、既知濃
度の心不全マーカーを含む血液を用いて血液担持担体を
作成し、これから抽出された抽出液中の心不全マーカー
の含有量を定量して抽出液の心不全マーカーの濃度を求
め、次式から求められる。抽出率は、以上の操作を少な
くとも２回（好ましくは少なくとも３回）行い、それら
の平均値を用いることが好ましい。 抽出率＝（抽出液の心不全マーカーの濃度）／（血液の
心不全マーカーの濃度） 検体の血液中の心不全マーカー濃度は、検体から調製さ
れる抽出液中の心不全マーカー濃度を抽出率で除すこと
で求めることができるが、その際、血液担持担体の作成
及び抽出の条件は抽出率を求めた時と同じ条件である必
要がある。

【００３０】なお、本発明で定量される心不全マーカー
は、血液中に極低濃度で存在しているため、濃度の変動
による抽出率の変動は極わずかであり、例えば、ＡＮＰ
の場合、０．２〜１００ｐｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出
率が使用できる。１００ｐｇ／ｍＬを越える高濃度の検
体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能
性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すな
わち、ＡＮＰの場合、心不全の判断の境界濃度（心機能
が心不全状態であるとの判断をする境界濃度）が１０ｐ
ｇ／ｍＬであり、１００ｐｇ／ｍＬを越えていれば心不
全の判断において陽性である。）。

【００３１】また、ＢＮＰの場合、５〜４，０００ｐｇ
／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。４，０００
ｐｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率
と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判
断に影響することはない（すなわち、ＢＮＰの場合、心
不全の判断の境界濃度が４６ｐｇ／ｍＬであり、４，０
００ｐｇ／ｍＬを越えていれば心不全の判断において陽
性である。）。ＡＮＰ及びＢＮＰ以外の心不全マーカー
についても同様であり、心不全マーカーの濃度による抽
出率の差よって臨床的な判断に影響することはない。

【００３２】（１）及び（２）の方法の何れの場合も、
既知濃度の心不全マーカーを含む血液又は抽出液は、濃
度の異なる２種以上を用いることが好ましい。既知濃度
の心不全マーカーを含む血液又は抽出液の濃度は、測定
する心不全マーカーの種類により自由に設定できるが、
通常は健常人の範囲（正常域）と心不全である可能性が
高い範囲との境界濃度（カットオフ）を明確に測定でき
る濃度で設定することが好ましく、例えば、ＡＮＰの場
合、カットオフは通常１０ｐｇ／ｍＬ前後であるため、
（１）の方法の場合、既知濃度の心不全マーカーを含む
血液は、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例
えば、５ｐｇ／ｍＬ以上１０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と１
０ｐｇ／ｍＬ以上５０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）設定する
ことが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液
中の心不全マーカーの濃度であるので、１０ｐｇ／ｍＬ
を元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．
０２の場合、血液中濃度１０ｐｇ／ｍＬは抽出液中濃度
０．２ｐｇ／ｍＬに相当するので０．１ｐｇ／ｍＬ以上
０．２ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と０．２ｐｇ／ｍＬ以上１
ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。

【００３３】また、ＢＮＰの場合、カットオフは通常４
６ｐｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既
知濃度の心不全マーカーを含む血液は、少なくとも４６
ｐｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、１０ｐｇ／ｍＬ以
上４６ｐｇ／ｍＬ未満の濃度と４６ｐｇ／ｍＬ以上１０
０ｐｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。ま
た、（２）の方法の場合は、抽出液中の心不全マーカー
の濃度であるので、５ｐｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮し
た２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃
度４６ｐｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．９２ｐｇ／ｍＬに
相当するので０．２ｐｇ／ｍＬ以上０．９２ｐｇ／ｍＬ
未満の濃度と０．９２ｐｇ／ｍＬ以上２．０ｐｇ／ｍＬ
未満の濃度）に設定することが好ましい。

【００３４】ＡＮＰ、ＢＮＰ以外の心不全マーカーのカ
ットオフを列挙すると、例えば心筋ミオシン軽鎖：２．
５ｎｇ／ｍＬ、トロポニンＴ：０．２５ｎｇ／ｍＬ、血
清ミオグロビン：男性６０ｎｇ／ｍＬ，女性３５ｎｇ／
ｍＬである。

【００３５】（１）の方法では、検量線の作成に抽出操
作から行う必要がある点及び検量線作成用の血液は長期
間保存できないので測定の際に作成する煩わしさがある
が、抽出条件が変動しても正確な測定ができるという長
所がある。一方、（２）の方法は、あらかじめ抽出率を
求め、抽出操作等の条件を一定にすれば多量の検体を正
確かつ簡便に測定することができる。（１）及び（２）
の方法のうち、簡便さの観点から、（２）の方法が好ま
しい。

【００３６】本発明の定量方法は、被検者自身で採血、
担体に保持・乾燥、輸送（例えば、持参、郵便及び宅配
便等）することができ、心機能の健康診断等のように多
数の検体を広い地域から集めて定量する場合に最適であ
る。又、心機能検診のほか、遠隔地の患者に対する心不
全治療の経過観察等においても、適用できる。

【００３７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。 ＜実施例１＞本実施例は、血液担持担体を長期間保存し
ても正確に心不全マーカー（ＡＮＰ）を定量できること
を示したものである。 １．血液担持担体用濾紙の作成 精製水１ＬにＥＤＴＡ２ナトリウム塩１ｇ及びアプロチ
ニン５０００００ＫＩＵを溶解した。この溶液を採血用
濾紙（品番ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に濾
紙の平方センチメートル当たり５０μＬの量で噴霧し
た。この濾紙を室温で自然乾燥し血液担持担体用濾紙と
した。

【００３８】２．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾
紙）の作成 ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）の指先をよくマッサ
ージ及び暖めて充血させておき消毒用ガーゼで穿刺部位
を拭いて乾燥させてから、ディスポーザブル・ランセッ
ト（商品名「ヘモレット」、ミドリ十字株式会社製）で
穿刺し、最初の血滴を拭い去り、次の血滴２滴を被検者
１人当たり１０枚の血液担持担体用濾紙にぞれぞれに指
先から直接滴下し吸収させた。次いで、室内（２５±１
℃、６５±５％ＲＨ）で風乾し（風乾時間５，２０，４
０，６０又は１２０分）、血液担持担体（血乾燥濾紙）
を得た。風燥時間毎に血液担持担体（血液乾燥濾紙）の
重量を計測し、初期血液重量（濾紙重量を除いた値）に
対する比を乾燥度を求めた（血液担持担体２枚の平均
値）。この乾燥度を表１中に示した。次いで、血液担持
担体（血液乾燥濾紙）を表１記載の保存条件で保存した
（保存日数０，３，７，１４，２８日）。

【００３９】

【表１】

【００４０】３．抽出操作 以下の操作は温度２０〜２５℃の室内で実施した。表１
の条件で保存した各血液担持担体（血乾燥濾紙）の血液
担持部分の中心部を、直径６ｍｍの１穴パンチ（事務用
として市販されている物）で打ち抜いて濾紙片を得た。
試験管に打ち抜いた濾紙片及び塩化ナトリウム含有０．
０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（抽出用溶
液）２５０μＬを加え、３０秒間攪拌（ボルテックスミ
キサーで５００ｒｐｍ）した後、３０分間放置した。そ
の後、３０秒間同様に攪拌した後１分間静置し、上清を
分取して抽出液を調製し、これを心不全マーカーの定量
に供した。

【００４１】４．抽出液中の心不全マーカー（ＡＮＰ）
の定量 定量用試薬としては、臨床検査薬として和光純薬工業株
式会社より発売されている「α−ｈＡＮＰテストワコ
ー」を用いた。抽出液中の心不全マーカー量を決定する
ための標準溶液は、「α−ｈＡＮＰテストワコー」に付
属の標準α−ｈＡＮＰを用いた。本試薬は血漿中の心不
全マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、抽
出液中の心不全マーカーの定量の場合は測定感度が不足
するため、試薬添付の説明書記載の操作法を以下の通り
変更して測定した。特に説明のない試薬は「α−ｈＡＮ
Ｐテストワコー」の構成試薬を使用した。

【００４２】１）試験管に抗α−ＡＮＰ抗体ビーズ１
個、反応用緩衝液１５０μＬ及び検体１５０μＬを加
え、１０℃、２０時間反応した。 ２）反応液をアスピレーターで吸引除去し、試験管に洗
浄液５００μＬを入れ吸引することで洗浄した。この洗
浄を５回実施した。 ３）ＰＯＤ標識抗体液３００μＬを試験管に加え、１０
℃、２時間反応した。４）２）と同様に洗浄を行った。 ５）発光試薬Ａ［ルミノールナトリウム（和光純薬工業
（株）製）０．１８ｇと、４−（シアノメチルチオ）フ
ェノール０．１ｇとを、０．１Ｍ−Ｎ，Ｎ−ビス（２−
ヒドロキシエチル）メチル／水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．５）１Ｌに溶解して作成］１５０μＬ及び発
光試薬Ｂ［２００μｌの３５％過酸化水素水を脱イオン
水１リットルに溶解して作成］１５０μＬを試験管に加
え生じた発光量を計測（アロカ株式会社「ルミネッセン
トリーダーＢＬＲ−２０１」を使用）した。 ６）既知濃度のＡＮＰを測定した場合の発光量で検量線
を作成し、測定発光量を濃度値とした。

【００４３】５．定量結果 定量結果及び次式で求めた安定度（％）を表２〜１１に
示した。 （安定度）＝（所定保存期間後の定量値）×１００／
（初期定量値） なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽
出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して
定量したものであり、保存期間０日として示した。

【００４４】

【表２】

【００４５】

【表３】

【００４６】

【表４】

【００４７】

【表５】

【００４８】

【表６】

【００４９】

【表７】

【００５０】

【表８】

【００５１】

【表９】

【００５２】

【表１０】

【００５３】

【表１１】

【００５４】各条件で作成、保存した血液担持担体（血
液乾燥濾紙）から得た抽出液中の心不全マーカー（抗
原：ＡＮＰ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温
度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以
上の値を示した。従って、乾燥時間が２０分以上であれ
ば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の心不全マーカー
（抗原：ＡＮＰ）は安定であることが判った。

【００５５】＜実施例２＞本実施例は、血液担持担体を
長期間保存しても正確に心不全マーカー（ＢＮＰ）を定
量できることを示したものである。 １．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成 実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜
Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記
載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，
２８日）。 ２．抽出操作 実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを心不全
マーカーの定量に供した。ただし、抽出に用いる濾紙片
は３枚とした。

【００５６】３．抽出液中の心不全マーカー（ＢＮＰ）
の定量 測定試薬は臨床検査薬として塩野義製薬式会社より発売
されている「シオノリアＢＮＰ」を用いた。抽出液中の
心不全マーカー量を決定するための標準溶液は、「シオ
ノリアＢＮＰ」の構成試薬である標準ＢＮＰを用いた。
本試薬は血漿中の心不全マーカー濃度を測定するための
臨床検査薬であり、抽出液中の心不全マーカーの定量の
場合は測定感度が不足するため、試薬添付の説明書記載
の操作法を以下の通り変更して測定した。特に説明の無
い試薬は「シオノリアＢＮＰ」の構成試薬を使用した。

【００５７】１）試験管に抗体ビーズ、緩衝液（１ｍＬ
中にアプロチニン５００ＫＩＵ、カゼイン１０ｍｇを含
むリン酸緩衝液）１００μＬ及び検体２００μＬを加
え、５℃、２０時間反応した。 ２）反応液をアスピレーターで吸引除去し、試験管に洗
浄液５００μＬを入れ吸引することで洗浄した。この洗
浄を５回実施した。 ３）ヨウ化ＢＮＰ抗体溶液液３００μＬを試験管に加
え、５℃、２０時間反応した。 ４）２）と同様に洗浄を行った。 ５）γ−カウンターで放射能カウントを計測した。 ６）既知濃度のＢＮＰを測定した場合の放射能カウント
で検量線を作成し、測定カウントを濃度値とした。

【００５８】４．定量結果 定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表１
２〜２１に示した。なお、初期定量値は、血液担持担体
を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、
抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日
として示した。

【００５９】

【表１２】

【００６０】

【表１３】

【００６１】

【表１４】

【００６２】

【表１５】

【００６３】

【表１６】

【００６４】

【表１７】

【００６５】

【表１８】

【００６６】

【表１９】

【００６７】

【表２０】

【００６８】

【表２１】

【００６９】各条件で作成、保存した血液担持担体（血
液乾燥濾紙）から得た抽出液中の心不全マーカー（抗
原：ＢＮＰ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温
度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以
上の値を示した。従って、乾燥時間が２０分以上であれ
ば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の心不全マーカー
（抗原：ＢＮＰ）は安定であることが判った。

【００７０】＜実施例３＞本実施例は、本発明の方法に
よって求めたＡＮＰ濃度と従来の方法によるＡＮＰ濃度
とが良好な相関関係にあることを示すものである。 １．標準ＡＮＰ添加血液担持担体の作成 ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬ
を採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に
「α−ｈＡＮＰテストワコー」の標準ＡＮＰ（０又は１
０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ加えて、標準ＡＮＰ添
加血液（０又は１０００ｐｇ／ｍＬ）を調製した。実施
例１で作成した血液担持担体用濾紙に標準ＡＮＰ添加血
液（１０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温
（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＡＮＰ添加血液担
持担体を作成した。同様にして、他一方の標準ＡＮＰ
添加血液（０ｐｇ／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾
燥し、血液担持担体を作成した。

【００７１】２．抽出及び測定 実施例１記載の抽出方法と同様にして、標準ＡＮＰ添加
血液担持担体及び血液担持担体からそれぞれ抽出液
を調製して、抽出液中のＡＮＰ濃度を測定した。それら
の結果を表２２に示した。

【００７２】

【表２２】

【００７３】３．抽出率の設定 表２２に示した測定値から次式から抽出率を算出した。
それらの結果を表２２に示した。５名の血液での抽出率
の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率
（０．０２３６）として設定した。 抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ Ａ：血液担持担体から調製した抽出液中のＡＮＰ濃度 Ｂ：標準ＡＮＰ（１０００ｐｇ／ｍＬ）添加血液担持担
体から調製した抽出液中のＡＮＰ濃度 Ｃ：１００ｐｇ／ｍＬ（添加したＡＮＰ量）

【００７４】４．採血 心不全患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実
施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従
来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２
ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全
血２ｍＬをアプロチニン１０００ＫＩＵ及びＥＤＴＡ２
ナトリウム塩３ｍｇの入った試験管に入れ混和後、直ち
に冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更
に上清（血漿）部分を分取した。

【００７５】５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成 実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液
乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合
と同じ１時間とした。

【００７６】６．抽出及び定量 血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で
抽出及びＡＮＰ濃度測定を実施した。一方、従来の方法
で採取、分離した血漿については、実施例１記載の「α
−ｈＡＮＰテストワコー」で、測定試薬に添付された説
明書通りの条件で測定を実施した。

【００７７】７．血液中のＡＮＰ濃度の決定 血液担持担体から調製した抽出液中のＡＮＰ濃度を抽出
率（０．０２３６）で除し、血液中のＡＮＰ濃度を求め
た。従来の方法で求めた血清中のＡＮＰの濃度と本発明
の方法で求めた血液中のＡＮＰ濃度を表２３に示した。
また、これらの値を用いて本発明の方法によるＡＮＰ濃
度と従来法によるＡＮＰ濃度との相関図を図１に示し
た。図１から判るように、従来法での血漿中のＡＮＰ濃
度と本発明の方法による血液中ＡＮＰ濃度は、良好な相
関性を示した。図１中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＡ
ＮＰ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＡＮＰ濃度）、Ｒは相
関係数を示すものである。

【００７８】

【表２３】

【００７９】＜実施例４＞本実施例は、本発明の方法に
よって求めたＢＮＰ濃度と従来の方法によるＢＮＰ濃度
とが良好な相関関係にあることを示すものである。 １．標準ＢＮＰ添加血液担持担体の作成 ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬ
を採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に
「シオノリアＢＮＰ」の標準ＢＮＰ（０又は２０００ｐ
ｇ／ｍＬ）を１００μＬ加えて、標準ＢＮＰ添加血液を
調製した。実施例１で作成した血液担持担体用濾紙に標
準ＢＮＰ添加血液（２０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ
滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＢＮ
Ｐ添加血液担持担体を作成した。同様にして、他一方
の血液（０ｐｇ／ｍＬ）１００μＬｌを濾紙に滴下・乾
燥し、血液担持担体を作成した。

【００８０】２．抽出及び測定 実施例２記載の抽出方法と同様にして、標準ＢＮＰ添加
血液担持担体及び血液担持担体からそれぞれ抽出液
を調製して、抽出液中のＢＮＰ濃度を測定した。それら
の結果を表２４に示した。

【００８１】

【表２４】

【００８２】３．抽出率の設定 表２４に示した測定値から次式から抽出率を算出した。
それらの結果を表２４に示した。５名の血液での抽出率
の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率
（０．０９４３）として設定した。 抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ Ａ：血液担持担体から調製した抽出液中のＢＮＰ濃度 Ｂ：標準ＢＮＰ（２０００ｐｇ／ｍＬ）添加血液担持担
体から調製した抽出液中のＢＮＰ濃度 Ｃ：２００ｐｇ／ｍＬ（添加したＢＮＰ量）

【００８３】４．採血 心不全患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実
施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従
来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２
ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全
血２ｍＬをはアプロチニン１０００ＫＩＵ及びＥＤＴＡ
２ナトリウム塩３ｍｇの入った試験管に入れ混和後、直
ちに冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、
更に上清（血漿）部分を分取した。

【００８４】５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成 実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液
乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合
と同じ１時間とした。

【００８５】６．抽出及び定量 血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で
抽出及びＢＮＰ濃度測定を実施した。一方、従来の方法
で採取、分離した血漿については、実施例１記載の「シ
オノリアＢＮＰで、測定試薬に添付された説明書通りの
条件で測定を実施した。

【００８６】７．血液中のＢＮＰ濃度の決定 血液担持担体から調製した抽出液中のＢＮＰ濃度を抽出
率（０．０９４３）で除し、血液中のＢＮＰ濃度を求め
た。従来の方法で求めた血漿中のＢＮＰの濃度と本発明
の方法で求めた血液中のＢＮＰ濃度を表２５に示した。
また、これらの値を用いて本発明の方法によるＢＮＰ濃
度と従来法によるＢＮＰ濃度との相関図を図２に示し
た。図２から判るように、従来法での血漿中のＢＮＰ濃
度と本発明の方法による血液中ＢＮＰ濃度は、良好な相
関性を示した。図２中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＢ
ＮＰ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＢＮＰ濃度）、Ｒは相
関係数を示すものである。

【００８７】

【表２５】

【００８８】

【発明の効果】本発明の血液中の心不全マーカーの定量
方法によると、心不全マーカーを極めて簡易に定量する
ことができる。さらに、被検者自身で採血することがで
きるので採血のための熟練者等が不要であり、被検者が
採血のため病院等に出向く必要もないという簡便性も併
せもつものである。また、血液担持担体は、簡単に輸送
することができるので、多数の検体を一ヶ所に集めて測
定することができ輸送及び測定のコストを低減させるこ
とができる等の効果がある。従って、本発明の定量方法
は、心機能の健康診断等の多数の検体を広い地域から集
めて測定する場合に最適である。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来の方法による血漿中のＡＮＰ濃度と本発明
の方法による血液中のＡＮＰ濃度との相関を表すグラフ
である。

【図２】従来の方法による血漿中のＢＮＰ濃度と本発明
の方法による血液中のＡＮＰ濃度との相関を表すグラフ
である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血液担持担体から血液成分を抽出し、該
   抽出血液成分から血液中の心不全マーカーを定量するこ
   とを特徴とする血液中の心不全マーカー定量方法。
2. 【請求項２】 心不全マーカーが、心房負荷、心室負
   荷、心筋肥大、心筋虚血及び／又は心筋壊死に起因する
   慢性心不全マーカーである請求項１に記載の血液中の心
   不全マーカー定量方法。
3. 【請求項３】 心不全マーカーが、心房性ナトリウム利
   尿ペプチド（ＡＮＰ）及び／又は脳性ナトリウム利尿ペ
   プチド（ＢＮＰ）である請求項１に記載の血液中の心不
   全マーカー定量方法。
4. 【請求項４】 血液担持担体が、血液に対する抗凝固剤
   及び／又は蛋白分解酵素の阻害剤を含有する吸収体に血
   液を担持してなる請求項１〜３の何れかに記載の血液中
   の心不全マーカー定量方法。
5. 【請求項５】 血液担持担体が、濾紙を使用してなる吸
   収体に血液を担持してなる請求項１〜４の何れかに記載
   の血液中の心不全マーカー定量方法。
6. 【請求項６】 血液担持担体が、指先から採取した血液
   を担持してなる請求項１〜５の何れかに記載の血液中の
   心不全マーカー定量方法。
7. 【請求項７】 抽出液中の心不全マーカー濃度と、血液
   成分の抽出率とから、血液中の心不全マーカー濃度を決
   定する請求項１〜６の何れかに記載の血液中の心不全マ
   ーカー定量方法。