JPH03297392A - ｈＢＮＰを認識するモノクローナル抗体および該抗体を用いるｈＢＮＰの免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星呈上二上月上１ 本発明は、ｈＢＮＰを認識するモノクローナル抗体およ
び該抗体を用いるｈＢＮＰの免疫測定法に関する。

さらに詳細には、ｈＢＮＰのリング構造を認識し、１０
１１Ｍ−１以上の親和定数を有し、ｈＢＮＰのＣ末端断
片、ｒＢＮＰ、およびα−ｈＡＮＰを実質的に認識せず
、Ｉ　ｇ　Ｇ　ｌサブクラスに属するモノクローナル抗
体および該抗体を用いるｈＢＮＰのラジオイムノアッセ
イに関する。

立】Ｉｕｉ末 心房性ナトリウム利床ペプチド（ＡＮＰ）の心臓におけ
る発見、およびそれに続く脳における発見以来、ＡＮＰ
は、ホルモンおよび神経ペプチドとして、体液の恒常性
および血圧調節に関連するものとされてきた（　Ｎａｋ
ａｏ、に、ら、　Ｊ、　Ｈｙｐｅｒｔａｎｓｉｏｎ　４
［：５ｕｐｐ１６コ：５４９２−５４９６．１９８６　
）。本発明者らは既に、心臓におけるＡＮＰの合成およ
び分泌が、欝血性心臓疾患患者において、その重症度に
応じて増加することを示した（　Ｓｕｇａｗａｒａ、　
Ａ、ら。

Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８１：１９６２−
１９７０．１９８８）。

最近、豚の脳から、脳ナトリウム利床ペプチド（ＢＮＰ
）が単離された。これには、２６個のアミノ酸残基から
なる豚（ｐ）ＢＮｐ−ｓと、３２個のアミノ酸残基から
なるｐＢＮＰ−３２が存在する。また、これらは、ＡＮ
Ｐと顕著なアミノ酸配列相同性を有しており、ＡＮＰと
類似した末梢および中枢での作用を有している（　５ｕ
ｄｏｈ、　Ｔ。

ら、　Ｎｔｕｒｅ　３３２ニア８−８１．１９８８）。

本発明者らは、きらに、ＢＮＰは豚心臓でも合成され、
血流へ分泌されることを示した（　５ａｉｔｏ、　Ｙ、
ら、　ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏｍｍｕｎ、　１５８：３６０−３６８．１９８９）　
。

それに続き、ラット心臓から４５アミノ酸残基からなる
ラットＢＮＰ（ｒＢＮＰ）が単離きれた（Ｉｔｏｈ、　
Ｈら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ
、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１６１ニア３２−７３９．１９８
９）。しかし、現在なお、ヒトＢＮＰに関する報告は殆
ど無く、これは主に、ヒトＢＮＰ（ｈＢＮＰ）がｐＢＮ
Ｐ＋ｒＢＮＰに対する抗血清に交差反応性を有しないた
めである。

最近、ｈＢＮＰ前駆体をフードするｃＤＮＡ配列の解明
に絖き（５ｕｄｏｈ、　Ｔら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒａｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１５９
：１４２７−１４３４．１９８９）本発明者らは、ヒト
心房からｈＢＮＰを単離し、そのアミノ酸配列を決定し
た（　Ｋａｍｂａｙａｓｈｉ、　Ｙ。

ら、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２５９：３４１−３４５
．１９９０）。ｈＢＮＰは３２アミノ酸残基からなり、
ｈＢＮＰ前駆体の配列７７−１０８に一致する。

明が　　しようとする障 ｈＢＮＰを特異的に認識するモノクローナル抗体は未だ
得られておらず、また、上記の様にｈＢＮＰはｐＢＮＰ
＋ｒＢＮＰに対する抗血清に交差反応性を有しないため
、ｈＢＮＰに関する報告はほとんどなく、未解明の部分
が多く残されている。

従って、ｈＢＮＰを特異的に認識するモノクローナル抗
体が得られれば、ｈＢＮＰに関する研究の進歩に大いに
貢献するものとなり、ｈＢＮＰの医薬などとしての応用
が期待きれる。また、ｈＢＮＰの測定系が確立されれば
、ｈＢＮＰの増減を指標とする疾病の診断が可能になる
。

課　　　　するための　段 上記の状況に鑑みて、本発明者らは、鋭意研究を行なっ
た結果、ｈＢＮＰに対するモノクローナル抗体を調製し
、ｈＢＮＰに特異的なラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
を確立することに成功した。さらに、このＲＩＡを用い
ることにより、健常ヒト心臓および病的ヒト心臓におけ
るｈＢＮＰの合成と分泌を詳細に検討することができた
。

本発明は、ｈＢＮＰを認識するモノクローナル抗体を提
供する。該モノクローナル抗体は、以下のような性状を
有しているのが好ましい。

（１）ｈ　Ｂ　Ｎ　Ｐのリング構造を認識する（２）ｈ
ＢＮＰに対して１０１１Ｍ−１以上の親和定数を有する （３）ｈＢＮＰのＣ末端断片、ｒＢＮＰ、およびα−ｈ
ＡＮＰを実質的に認識しない （４）ＩｇＧ＋サブクラスに属する 詳細には、本発明においては、上記の性状を有するモノ
クローナル抗体ＫＹ−ｈＢＮＰ−ＩおよびＫＹ−ｈＢＮ
Ｐ−ｎが得られた。

本発明のモノクローナル抗体ＫＹ−ｈＢＮＰ−■または
ＫＹ−ｈＢＮＰ−１１を産生ずるハイブリドーマは、茨
城県つくば南東１丁目１番３号の微生物工業技術研究所
に、平成２（１９９０）年４月１１日から、Ｍｏｕｓｅ
　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＫＹ−ｈＢＮＰ−ＩおよびＭｏ
ｕｓｅ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＫＹ−ｈＢＮＰ−ＩＩ、
微工研条寄第２８６２号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８６２
）および微工研条寄第２８６３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
２８６３）として、それぞれブダペスト条約に基づき寄
託きれている。

本発明のハイブリドーマは、ｈＢＮＰ免疫活性を有する
ペプチドで免疫したマウスの肺臓細胞と、適切なマーカ
ーを有するミエローマ細胞との動台により得られたハイ
ブリドーマから、上記の様な性状を有するモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択することにより
得られる。

このハイブリドーマの調製は、実質的に、　Ｍｕｋｏｙ
ａｍａ、　Ｍ、ら、　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　ｔｚ
：ｔｔ７−ｔｚｔ、　１９８８に記載の方法に従えばよ
い、ｈＢＮＰ免疫活性を有するペプチドとしては、本来
のｈＢＮＰ（ｈＢＮＰ前駆体の７７−１０８アミノ酸配
列に対応）のみならず、例えばｈＢＮＰ前駆体の８３−
１０８７ミノ酸配列に対応するｈＢＮＰ−２６を使用し
てもよい。

得られたハイブリドーマはマウスの腹腔内で増殖許せ、
該腹腔内に蓄積きれた腹水からモノクローナル抗体を採
集する。ハイブリドーマを培養液中で培養し、該培養液
からモノクローナル抗体を採集することも可能であるが
、生産性の点で前者が好ましい。

本発明は、さらに、上記の性状を有するモノクローナル
抗体を用いるｈＢＮＰの免疫測定法を提供する。この免
疫測定法としては、ラジオイムノアッセイが好ましい０
本発明のＲＩＡは、上記の優れた性状を有するモノクロ
ーナル抗体を使用するので、最小検出濃度が０．３　ｆ
ｍｏ　１／ｌ　ｕ　ｂｅ、５０％結合阻害濃度が２．５
〜３　ｆｍｏ　１／１ｕｂｅと極めて高感度であり、か
つ、α−ｈＡＮ　Ｐ　＋ｒ　Ｂ　Ｎ　Ｐと実質的に交差
反応性を有さずｈＢＮＰに極めて特異的である。また、
本発明のＲＩＡは極めて高感度かつ特異的であるため、
例えば血漿からｈＢＮＰを抽出することなく、血漿サン
プル中のＢＮＰレヘルを直接測定することが可能である
。

さらに、このＲＩＡを用いることにより、健常ヒト心臓
および病的ヒト心臓におけるｈＢＮＰの合成と分泌を詳
細に検討することができた。

本発明においては、ＢＮＰがヒトの新規な心臓ホルモン
であることが示された。冠状静脈洞から採取きれた血漿
中のｈＢＮＰの濃度の上昇（表■）から、循環血液中の
ｈＢＮＰ源が心臓であることは明らかである。組織ｈＢ
ＮＰレヘルは、心房よりも心室のほうが低いが、Ｂ　Ｎ
　Ｐ／Ａ　Ｎ　Ｐ比は心房よりも心室のほうが遥かに高
く、心臓の全ｈＢＮＰ量に対する心室ｈＢＮＰの比率は
、心室ＡＮＰのそれと較べて、−桁高い値を示す（表Ｉ
）、これらの知見から、心室がかなりの量のｈＢＮＰを
産生分泌するので、心室は、循環血液中のｈＡＮＰより
も、循環血液中のｈＢＮＰにより大きな影響を及ぼすと
考えられる０以上の仮説は、心室の心臓細胞が、心房の
心臓細胞よりも迅速に、フンスティテユーティブ（ｃｏ
ｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）経路を介して分泌するという報
告にも支持きれる。

本発明においては、血漿ｈＢＮＰレベルが、ＣＨＦ患者
において、その重症度に比例して顕著に増加することが
示された。血漿ＢＮＰ−ＬＩレベルは、通常ではｌｆｍ
ｏｌ／ｍ１以下であるが、最も重篤な症例においては５
００　ｆｍｏ　ｌ／ｍ　１にまで達した（第４図）。こ
のように、ｈＢＮＰの血漿レベルの％増加率は、重篤な
症例では、ＡＮＰに比べて１桁以上も大きいものであっ
た（表■）。血漿ｈＢＮＰレベルのこのような上昇は、
表■に示されるように、病的心臓ではｈＢＮＰの分泌が
増加することによるものである０以上から、病的心臓に
おいては、ＡＮＰの合成分泌が心房のみならず心室にお
いても増加していることがわかる。従って、ＣＨＦに見
られるｈＢＮＰの血漿レベルの上昇は、ＡＮＰよりも格
段に高く、心室ｈＢＮＰによるものであると考えられる
。これは、病的心臓の心室のｈＢＮＰｍＲＮＡの総量が
心房よりもかなり多いという、本発明者らの知見とよく
一致した。

本発明におけるもうひとつの重要な知見は、ｈＢＮＰが
α−ｈＡＮＰよりも長く循環血液中に保持きれるという
ことであり、これはＢ　Ｎ　Ｐ／Ａ　ＮＰ比の増加の順
位が、冠状静脈洞く大動脈〈大腿静脈である（表■）こ
とから明らかである。またこの事実は、循環器系からの
ｈＢＮＰの代謝クリアランスが、α−ｈＡＮＰよりも低
いことを示している。従って、ＣＨＦ患者では、心臓か
らのｈＢＮＰの分泌の増加に加えて、ｈＢＮＰのクリア
ランスの低きが血漿ｈＢＮＰレベルの上昇をきらに増強
することになる。ナトリウム利尿ペプチド受容体は２つ
のカテゴリー、すなわち、クリアランス受容体と、裏型
グアニル酸シクラーゼに結合した生物学的に活性な受容
体に分類きれるという仮説がある。そこで本発明者らは
、ヒトおよび牛の肺から調製きれたクリアランス受容体
へのｈＢＮＰの結合活性と、培養ヒト糸球体間質細胞お
よび牛内皮ｓ胞でのｈＢＮＰのｅＧＭＰ産生能を調べた
。ｈＢＮＰおよびａ−ｈＡＮＰのｃＧＭＰ産生能は同等
であるが、ｈＢＮＰのクリアランス受容体への結合活性
はα−ｈＡＮＰの約７％であった。このことは、循環血
液からのｈＢＮＰのクリアランスが遅いという興味深い
事実と一致する。

ＢＮＰに比較的特異的な生物学的に活性な受容体の最近
の発見を考え合わせると、α−ｈＡＮＰと異なるｈＢＮ
Ｐの生物学的臨床的特徴は、ｈＢＮＰの生理学的病態生
理学的意義を解明する手がかりとなり、ＣＨＦのような
病的状態においては、ＡＮＰよりもｈＢＮＰが重要な役
割を果たしていることを示唆している。

ｈＢＮＰ前駆体の翻訳後の切断は、ヒトＡＮＰ前駆体と
は異なっている。ＡＮＰは前駆体７−ＡＮＰとして心臓
細胞に蓄積され、分泌の際にＰｒｏ’Ｙ−Ａｒｇ＃　１
間がタンパク質分解酵素に切断きれ、α−ｈＡＮＰとな
る。ｈＢＮＰ前駆体中には、ｈＢＮＰ配列の前に、同じ
切断シグナルＰｒｏ”−Ａｒｇ’　”が存在するが、ｈ
ＢＮＰが心臓における主な蓄積形態であり、かつ成熟ホ
ルモンとして体内を循環する。このｈＢＮＰの切断様式
は、ｒＢＮＰと同じであるが、ＡＮＰ様式をとるｐ　Ｂ
ＮＰとは異なる。ＡＮＰ＋ＢＮＰなどのナトリウム利尿
ペプチドの異なる切断様式のメカニズムや意義を解明す
るためには、さらなる研究が必要であろう。

本発明は、ＢＮＰが新規なヒトの心臓ホルモンであり、
ＣＨＦ患者においてＢＮＰの循環血液中への分泌および
蓄積がＡＮＰよりも顕著に増加することを明らかにした
。受容体の多様性に関する最近の報告を考慮すると、こ
れらの知見は、巧妙な２つのナトリウム利尿ペプチド系
において、ＢＮＰがＡＮＰとは異なる生理学的病態生理
学的役割を果たしていることを示唆している。

以上の検討結果から、本発明のＲＩＡが、心臓病を含む
循環器疾患の診断に市川であることは明らかであり、ま
たＡＮＰの測定と組み合わせることにより、循環器疾患
の詳細な診断が可能になる。

本明細書中で用いられる略号は、以下の通り。

ＢＮＰ：脳性ナトリウム利ズペブチド ｈＢＮＰ、ヒトＢＮＰ １）ＢＮＰ：豚ＢＮＰ ｒ　ＢＮＰ　：ラットＢＮＰ ＡＮＰ　：心房性ナトリウム利尿ペプチド−Ｌｌニー様
免疫反応性 ＣＨＦ　：欝血性心疾患 Ｎ　Ｙ　ＨＡ　：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｈｅａｒｔ　Ａ
ｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ２．３ｍｇのｈＢＮＰ−２６（ｈ
ＢＮＰ［８３−１０８］）を、カルボジイミドを用いて
、牛テログロブリン（９，１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）に結合
許せた（　Ｎａｋａｏ、　Ｋ、らｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　１２４：８１５−８２１．１９８４）
。フロイントの完全アジュバントに乳ａｔせた２０μｇ
のｈＢＮＰ−２６を有する上記結合物を、２〜３週間隔
で２ケ月にわたり、ＢＡＩ、Ｂ／（：マウスに皮下投与
して、免疫する。２匹のマウスにおいて抗体価が上昇し
たので、より高い反応性を示した１匹を、細胞融合に用
いた。肺臓細胞とマウスミエローマ細ＪＤ　Ｘ６３−Ａ
ｇ３．６５３との融合は、Ｍｕｋｏｙａｍａ、　Ｍら。

Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　１２：１１７（２１１９８
８に記載の方法に従った。得られたハイブリドーマは、
ｈＢＮＰのＲＩＡにより抗体産生能に基づき選択し、限
界希釈法によりり０−ン化して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの
腹腔内で増殖させた。モノクローナル抗体のアイソタイ
プは、マウスモノクローナルタイピングキット（Ｍｉｌ
ｅｓ社製）を用いて、オフタロニー法により決定した。

結合親和性は、ｈＢＮＰのＲＩＡを用いるスキャッチャ
ードプロットにより求めた。

里１１Ｊ霞世 心臓組織は、心臓の合併症を有しない患者から剖検によ
り得、またＣＨＦ患者から剖検または心臓外科手術によ
り得た。サンプルは、液体窒素中で直ちに凍結し、抽出
まで一７０℃で保存した。

組織からのＢＮＰの抽出は、Ｓｕｇａｗａｒａ、　Ａら
、ＪＣｌｉｎ、　Ｉｎｖａｓｔ、　８１：１９６２−１
９７０．１９８８に記載の方法で行なった。

血漿サンプル 血漿サンプルは、通常の塩摂取量（１６３±１５　ｍ　
Ｅ　ｑ　／　ｄ　）の１１人の健常者（２５−３３歳、
平均２９．６歳）、および３９人の心臓病患者（１６−
７８歳、平均５４．５歳）から採取した。その患者のう
ち、１２人は冠不全、９人は心臓弁膜症、７人は肥大性
心筋症、７人は高血圧性心疾患、２人は先天性心疾患、
１人は肥大性閉塑性心筋症、１人は心筋炎であった。Ｎ
ｅｗ　ＹｏｒｋＨｅａｒｔ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　
（ＮＹＨＡ）の分類に従えば、８人がクラス１１１０人
がクラス■、１６人がクラス■、５人がクラス■に分類
きれる。腎臓疾患はいずれも有していなかった。血液は
、−夜絶食後仰臥位で前肘静脈から午前９時に採集し、
ＮａｚＥＤＴＡ　（１ｍｇ／ｍｌ）とアプロチニン（１
，０００にＩＵ／ｍｌ）を含む冷却したガラスチューブ
に直ちに移し、４°Ｃで遠心した。心臓カテーテルを挿
入している６人の患者では、血漿サンプルは、冠状静脈
洞、大動脈、大腿静脈を含む種々の部位から採集した。

血漿は直ちに凍結し、アッセイまで一２０℃で保存した
。

ｈＢＮＰのＲＩＡ ［１ｙｒ６コーｈＢＮＰ−２６（１μｇ）を、クロラミ
ンＴ法（Ｎａｋａｏ、　Ｋら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

１２４：８１５−８２１．１９８４）により、放射性ヨ
ウ素で標識した。［＋ｔ＄１］［ＴＹｒｅコーｈＢＮＰ
−２６の比活性は、５０ｏ−９００μＣｉ／μｇであっ
た。モノクローナル抗体（腹水最終希釈率、１：５Ｘ１
０’）は、０　、２　ｍｌのアッセイバッフｙ−（０，
１％ゼラチン、０．　ＩＸＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，
１ｍＭ　Ｎａ、ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ　Ｌ−ｃｙｓｔｉ
ｎｅ、および０．１χＮａＮ。

を含む５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７，４）中で、
標準ｈ　ＢＮＰまたはサンプルのいずれかと共に、２４
時間４℃でインキュベートする。次いで、Ｏ，０５ｍ１
の［”’Ｉ］［Ｔｙｒ’］−ｈＢＮＰ−２６（１０，０
００ｃｐｍ）を加え、その混合物をさらに２４時間４℃
でインキュベートする。結合リガンドと遊離リガンドは
、デキストランフ−テッドチャコール法（Ｎａｋａｏ、
　Ｋ。

ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、
　Ｃｏｍｍｕｎ、　１２４：８１５−８２１、１９８４
）により分離した。

血漿ＢＮＰ様免疫活性（ＢＮＰ−ＬＩ’）は、抽出後ま
たは抽出無しで測定した。抽出無しのＲＩＡでは、２５
μｍの血漿をインキュベーション混合物に加えた。無ホ
ルモン血漿（Ｓｕｇａｗａｒａ、　Ａ、ら。

Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　　８［５ｕｐｐｌ　　Ｉコ
ニｌ−１５１−１５５，１９８６）を、標準曲線の構築
および血漿サンプルの希釈に用いた。抽出を行なうアッ
セイでは、５〜１０ｍ１のサンプルを５ｅｐ−Ｐａｋ　
Ｃ１ｍカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ　）で処理した（　
５ａｉｔｏ、　Ｙ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓＲｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１５８：３６０−３
６８．１９８９　）。血漿に添加した３〜１５ｆｍｏｌ
／ｍｌのｈＢＮＰの平均回収率は、７０ｙ、たった。抽
出後の血漿中のＢＮＰ−ＬＩの最小検出量は０，４ｆｍ
ｏｌ／ｍｌであり、抽出無しの血漿中のＢＮＰ−ＬＩの
最ノ」〜検出量は１０ｆｍｏｌ／ｍｌだった。

ＡＮＰのＲＩＡ ＡＮＰのＲＩＡは、Ｎａｋａｏ、　Ｋ、ら、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍａ＋ｕ
ｎ、　１２４：８１５−８２１．１９８４に記載の方法
に従った。このＲＩＡは、α−ｈＡＮＰのＣ末端部位（
α−ｈＡＮＰ［１７−２８コ）を認識する。ｈＢＮＰと
の交差反応性は、分子レベルで０．０１％未満だった。

高速ゲル浸透クロマトグラフィー ＨＰ−ＧＰＣ ＨＰ−ＧＰＣは、５ｎｇａｗａｒａ、　Ａ、ら、　Ｊ、
　Ｃ１１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　８１：１９６２−１９７０．１９８８
に記載の方法で、ＴＳＫ−ＧＥＬ　　Ｇ２０００　　Ｓ
Ｗカラム（７，５Ｘ６００ｍｍ、東洋曹達）を用いて行
なった。

逆相高速液体クロマトグラフィー ＲＰ−）ＩＰＬＣ ＲＰ−ＨＰＬＣは、Ｎｕｃｌａｏｓｉｌ　５Ｃ＋ｓカラ
ム（４、６Ｘ　１５０　ｍｍ、　Ｎａｇａｌ）を用いて
行ない、０゜１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル
濃度勾配置５％→３０％により溶出した（　Ｋａｍｂａ
ｙａｓｈｉ。

Ｙ、ら、　Ｂｉｏｃｈａｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒａ
ｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１６３：２３３−２４０．１９
８９）。

級肚士■ データは、平均上標準偏差（ＳＥ）で示した。統計分析
は、スチューデント検定、ダンカンマルチプルレンジ検
定またはウイルコクソン検定を適宜用いて行なった。直
線回帰分析を用し）で、結果の相関性を決定した。

モノクローナル抗体の調製およヒ性化 細胞融合の後、２８８ウエルのうち３つのクローンが抗
体反応陽性を示した。これらをきらに培養し、クローン
化して、強い反応性を有するクローンを２つ選択した。

このようにして確立されたモノクローナル抗体の１つを
、ＫＹ−ｈＢＮＰ−■と命名した。このモノクローナル
抗体は、ＩｇＧ、サブクラスに属し、ｈＢＮＰに対して
親和定数１．０Ｘ１０”ｔ’を有する。ｈＢＮＰのＲＩ
Ａにおけるこのモノクローナル抗体の特異性を第１図Ａ
に示す、ｈＢＮＰ−２６は、ｈＢＮＰと同一の交差反応
性を示したが、ｈＢＮＰのＣ末端断片であるｈＢＮＰ［
１０３−１０８コは交差反応性を示きなかった（　０．
００１％未満）、これらの結果は、本発明のモノクロー
ナル抗体がｈＢＮＰのリング構造を認識することを示し
ている。

もう一方の抗体は、ＫＹ−ｈＢＮＰ−ｎと命名した。こ
れは、Ｉ　ｇ　Ｇ　、サブクラスに属し、ｈＢＮＰに対
して親和定数１．８８１０　”Ｍ−’を有する。ｈＢＮ
ＰのＲＩＡにおけるこのモノクローナル抗体の特異性を
第１図Ｃに示す。ｈＢＮＰ−２６は、ｈＢＮＰと同一の
交差反応性を示したが、ｈＢＮＰのＣ末端断片であるｈ
ＢＮＰ［１０３−１０８］は交差反応性を示きなかった
（　０．００１％未満）、これらの結果は、本発明のモ
ノクローナル抗体がｈＢＮＰのリング構造を認識するこ
とを示している。

ｈＢＮＰのＲＩＡ ＫＹ−ｈＢＮＰ−１を用いるｈＢＮＰのＲＩＡではその
標準曲線（第１図Ａ）から明らかなように、最小検出量
は０．３　ｆｍｏ　Ｉ／ｌ　ｕｂｅであり、５０％結合
阻害濃度は３ｆｍｏｌ／１ｕｂｅであった。α−ｈＡＮ
Ｐやｒ　ＢＮＰとの交差反応性はｏ、ｏ　ｏ　ｓ％未満
であった。ｐＢＮＰ−３２は分子レベルで０．１％の交
差反応性を示した。

測定内および測定量誤差は、それぞれ８．４％（ｎ−８
）および６．４％（ｎ＝８）であった。

ＫＹ−ｈＢＮＰ−１［を用いるｈＢＮＰのＲＩＡではそ
の標準曲線（第１図Ｃ）から明らかなように、最小検出
量は０．３　ｆ’ｍｏ　Ｉ／　ｔ　ｕ　ｂ　ｅであり、
５０％結合阻害濃度は２．５　ｆｍｏ　１／　ｔ　ｕｂ
ｅであった。α−ｈＡＮＰ＋ｒＢＮＰとの交差反応性は
、それぞれ０．１４％および０．０１％であった。ｐＢ
ＮＰ−３２は分子レベルで３．０％の交差反応性を示し
た。

心　　　のＢＮＰ−Ｌｌ ヒト心房および心室抽出物の段階希釈曲線は、第１図Ｂ
に示きれるように、標準曲線と平行であった。健常心房
および心室中のＢＮＰ−ＬＩの組織レベルおよび含有量
を、表Ｉに示す。心房中のＢＮＰ−ＬＩの平均濃度は２
５０ｐｍｏｌ／ｇであり、かなりの量のＢＮＰ−ＬＩ（
１８±３ｐｍｏ１／ｇ）が心室で検出きれた。組織重量
を考慮すると、心室中のＢＮＰ−Ｌ　Ｉ総量（４，５ｎ
　ｍｏｆ）は、全心臓中の総量（１５，３ｎｍｏ　Ｉ　
）の約３０％に匹敵した。Ｂ　Ｎ　Ｐ／Ａ　Ｎ　Ｐ比は
、心房ニオイて（２，６％）よりも、心室において（４
９％）かなり高かった。

第２図Ａは、健常ヒト心房からの抽出物の典型的なＨＰ
−ＧＰＣプロファイルを示す、ＢＮＰ−ＬＩは、心房に
おいて１２にと３にダルトンの２つの成分からなるが、
３にのほうが主成分であった。３にのＢＮＰ−ＬＩの溶
出位置は、合成ｈＢＮＰと一致した。１２に成分は、ｈ
ＢＮＰ前駆体と一致した。心室からの抽出は、第２図Ａ
に示されるように、実質的に同一のＨＰ−ＧＰＣプロフ
ァイルを示した。対照的に、健常心臓中のＡＮＰ−ＬＩ
は、α−ｈＡＮＰの前駆体である７−ｈＡＮＰであった
（第２図Ａ）。３にのＢＮＰ−ＬＩをきらに解析するた
めに、心房抽出物のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを分析
した。第２図Ｂに示されるように、３に０′）ＢＮＰ−
ＬＩの保持時間は合成ｈＢＮＰと一致した。

常人の血　ＢＮＰ−ＬＩ 血漿抽出物の段階希釈曲線はｈＢＮＰの標準曲線と平行
であった（第１図Ｂ）。１１人の健常人の血漿ＢＮＰ−
Ｌ１１ｚべ４は０．９０±０．０７ｆ’ｍｏｌ／ｍｌで
あり、一方そのＡＮＰ−Ｌルベルは６．４±０．９ｆ’
ｍｏｌ／ｍｌであった。血漿ＢＮＰ／ＡＮＰ比は１６±
２％であった。

病的心臓におけるＢＮＰ−ＬＩ 病的心臓におけるＢＮＰ−ＬＩレベルは表１に示す。正
常心臓のレベルと比較すると、心房におけるＢＮＰ−Ｌ
Ｉレベルは差がないが、心室のレベルは２倍以上高かっ
た。すなわち、心室のＢＮＰ−ＬＩレベルは、心房の２
２％にまで達した。

組織重量を考慮すると、心室内の全ＢＮＰ−ＬＩ量は、
心房内の量を越える。ＡＮＰ−ＬＩの組織レベルは、病
的心臓の心房と心室の両方で上昇しており、心室内の全
ＡＮＰ−ＬＩ量は、心臓全体の１２％であった。

第３図ＡおよびＢは、それぞれ病的ヒト心房および心室
からの抽出物の代表的ＨＰ−ＧＰＣプロファイルを示す
。病的心臓の心房抽出物中のＢＮＰ−Ｌｌは２つの成分
からなり、ひとつは主成分のｈＢＮＰであり、一方は少
量の前駆体であった。これは、正常心房におけるプロフ
ァイルと一致した（第２図Ａ）。病的心室のＢＮＰ−Ｌ
ｌも実質的に同一のＨＰ−ＧＰＣプロファイルを示した
（第３図Ｂ）。ＡＮＰ−ＬＩに関しては、健常心臓では
ほとんど検出できないα−ｈＡＮＰが病的心房内で増加
しており（第３図Ａ）、また心室内ではｙ−ｈＡＮＰが
ほとんどであった（第３図Ｂ）。

ＣＨＦの血　ＢＮＰ−ＬＩ 血漿の段階希釈曲線はｈＢＮＰの標準曲線と平行であっ
た（第１図Ｂ）。第４図は、健常人と３９人の心疾患患
者における血漿ＢＮＰ−ＬＩレベルを示す。ＣＨＦを有
しない８人の患者（ＮＹＨＡクラスＩ）のうち、４人の
患者で血漿ＢＮＰ−ＬＩレベルは１０ｆｍｏｌ／ｍｌ以
下であり、他４人の患者で僅かに上昇した（１４〜２２
ｆｍ。

１　／　ｍ　＋、平均上標準偏差、１４．３±１．８　
ｆ’ｍｏ１／ｍｌ）。ＮＹＨＡクラスＴｉの１ｏ人の患
者のうち、４人ではＢＮＰ−ＬＩレベルが１０ｆｍｏ１
／ｍ１以下であったが、６人のＢＮＰ−ＬＩレベルが上
昇しく　１２〜３９９　ｆ’ｍｏ　Ｉ／ｍ　＋）、全体
では６８．９±３７．９ｆｍｏｌ／ｍｌであった。重篤
なＣＨＦを有する２１人の患者（ＮＹＨＡクラス■また
は■）では、血漿ＢＮＰ−Ｌルベルは顕著に増加したＣ
ＮＹＨＡクラス■、１５〜５３９　ｆ’ｍｏ　１／ｍ　
１．１５５．４±３９゜１　ｆｍｏ　Ｉ／ｍｌ　；クラ
ス■、１１９〜５６３ｆ’ｍｏｌ／ｍｌ、２６７．３±
７９．９ｆ’ｍｏｌ／ｍｌ）、このように、血漿ＢＮＰ
−ＬＩレベルの累進的増加は、ＣＨＦの重症度に比例し
ていた。

血漿ＡＮＰ−ＬＩレヘルは病気の重症度に従って明らか
に増加しＣＮＹＨＡクラス■、２４．９士７．２　ｆｍ
ｏ　ｌ／ｍ　ｌ　；クラス■、５２４±１９．４　ｆｍ
ｏ　１７ｍ　］　；クラス■、１０９．３±２１．８ｆ
ｍｏ１／ｍｌ；クラス■、１６４．４±２０．３ｆ’ｍ
ｏ　１／ｍ　１　）、血漿ＢＮＰ−Ｌルベルと相関性が
高かった（ｒ＝０．７４７、ｐ＜０．０１）、しかし、
血漿中のＢＮＰ−Ｌ　Ｉ／ＡＮＰ−ＬＩ比は、ＣＨＦの
重症度に応して、著しく変化した。健常人では血漿ＢＮ
Ｐ−ＬＩレベルがＡＮＰ−ＬＩニレベル１６％であるの
に対して、重篤なＣＨＦ（ＮＹＨＡクラス■および■）
を有する患者の平均血漿ＢＮＰ−ＬＩレヘルはＡＮＰ−
Ｉ。

ニレベルよりもずっと高かった。血漿内のＢＮＰ−Ｌｌ
とＡＮＰ−ＬＩの関連をきらに分析するために、対象を
その血漿ＡＮＰ−Ｌルベルに従って４つのグループに分
類した（表■）０通常の血漿ＡＮＰ−Ｌ　ルベルを有す
るグループＡでは、血漿ＢＮＰ−ＬＩレヘルはかなり低
かった。グループＢでは、ＢＮＰ−ＬニレベルはＡＮＰ
−Ｌ　Ｉのレベル付近まで上昇した。グループＣでは、
ＢＮＰ−ＬＩニレベルＡＮＰ−ＬＩしベルとほとんど同
しであった。はとんとの患者がＮＹＨＡクラス■および
■に分類きれるグループＤでは、ＢＮＰ−ＬＩニレベル
上昇はさらに増大し、ＡＮＰ−Ｌｌニレベル越えた。グ
ループＡのレベルと比較すると、グループＤのＢＮＰ−
ＬＩの増加は２００〜３００倍であり、２０〜３０倍の
増加であるＡＮＰ−ＬＩとくらべて遥かに高い価を示し
た。

第３図ＣはＣＨＦ患者の血漿抽出物の典型的なＨＰ−Ｇ
ＰＣプロファイルを示す。血漿ＢＮＰ−ＬＩは主にｈＢ
ＮＰからなるが、その前駆体が微量成分として存在した
。

心臓カテーテル中の血、ＢＮＰ−ＬＩ 表■は、心臓カテーテルを施された６人の患者の種々の
部位から採集きれた血漿中のＢＮＰ−ＬＩおよびＡＮＰ
−ＬＩニレベル示す。冠状静脈側の血漿ＢＮＰ−ＬＩレ
ヘルと、冠状動脈口付近の上行大動脈のレベルとを比較
すると、全ケースにおいて冠状静脈側の血漿ＢＮＰ−Ｌ
ｌレヘルが２〜３倍高かった。これは、ＢＮＰ−Ｌｌは
、心臓から冠状静脈側を通して循環血液へ分泌きれるこ
とを示している。

冠状静脈側のＢＮＰ−ＬＩニレベルＣＨＦの重症度に比
例して増加した。さらに、冠状静脈側と大動脈間のＢＮ
Ｐ−Ｌ　Ｉの差、すなわちその分泌率の指標となる△（
Ｃ５−Ａｏ　）ＢＮＰにおいても、同様の増加が見られ
、これはＢＮＰ−ＬＩの分泌が重篤なＣＨＦにおいて増
加していることを示している。冠状静脈側のＡＮＰ−Ｌ
Ｉニレベル△（Ｃ５−ＡＯ）ＡＮＰは、重篤な症例にお
いて上昇する傾向が見られたが、その上昇はＢＮＰ−Ｌ
Ｉニレベル較べてかなり小さなものであった。従って、
△（Ｃ５−Ａｏ）に関するＢ　Ｎ　Ｐ／Ａ　Ｎ　Ｐ比は
重篤な症例において増大し、ＢＮＰの分泌が重篤なＣＨ
ＦにおいてＡＮＰの分泌と較べてより顕著に増加するこ
とを示している。

血漿Ｂ　Ｎ　Ｐ／Ａ　Ｎ　Ｐ比は、いずれの症例におい
ても、冠状静脈側よりも大動脈のほうが大きい。

この比率は、大腿静脈できらに増加する。このＢＮ　Ｐ
／Ａ　Ｎ　Ｐ比の上昇は、△（Ｃ５−Ａｏ）に関する比
率の上昇と比較しても注目される。これらの結果は、Ｂ
ＮＰは、分泌後循環血液中において、ＡＮＰよりも長く
保持きれることを示している。

褒ｙしγ夾朱 ＢＮＰは、豚およびラットにおいて、心臓で合成きれ分
泌されることが、既に報告されていたが、ヒトにおける
ＢＮＰについてはほとんど何も知られていなかった。本
発明は、ｈＢＮＰに対するモノクローナル抗体ＫＹ−ｈ
ＢＮＰ−１およびＫＹ−ｈＢＮＰ−ＩＩとｈＢＮＰの特
異的で高感度なＲＩＡを提供する。ＫＹ−ｈＢＮＰ−１
およびＫＹ−ｈＢＮＰ−１１は、ｈＥＮＰの、ナトリウ
ム利尿ペプチドの生物学的作用に必須なリング構造を認
、識するので、本発明のＲＩＡはｈＢＮＰのみならずＮ
末端やＣ末端が修ｆｉ（付加や削除）きれた形態のｈＢ
ＮＰ、例えば、前駆体をも検出することができ、ｈＢＮ
Ｐの生合成、細胞内修飾および代謝を研究する上で有用
である。

（１ゾ下ａ台ン

【図面の簡単な説明】

第１図ＡおよびＢは、それぞれ、モノクローナル抗体Ｋ
Ｙ−ｈＢＮＰ−ＩによるｈＢＮＰのＲＩＡにおける、ｈ
ＢＮＰの標準曲線と関連ペプチドとの交差反応性および
試料の希釈曲線を示す、第１図Ｃは、モノクローナル抗
体ＫＹ−ｈＢＮＰ−■によるｈＢＮＰのＲＩＡにおける
、ｈＢＮＰの標準曲線と関連ペプチドとの交差反応性を
示す。 第２図は、健常心房抽出物のＨＰ−ＧＰＣプロファイル
（Ａ）およびＲＰ−ＨＰＬＣプロファイル（Ｂ）を示す
、（Ａ）における矢印は、ポリペプデド分子量較正キ・
７ト（ＰｈａｒｍａＣｉａ　）の一連のミオグロビンの
溶出位置と、ボイド体積（Ｖｏ）および全体積（Ｖｔ）
を示す、さらに、７−ｈＡＮＰ、合成ｈＢＮＰおよびα
−ｈＡＮＰの溶出位置も示す。（Ｂ）における矢印は、
合成ｈＢＮＰとα−ｈＡＮＰの保持時間を示す。 第３図は、病的心臓の心房（Ａ）および心室（Ｂ）の抽
出物、およびＣＨＦ患者から採取した血漿のＨＰ−ＧＰ
Ｃプロファイルを示す、矢印は第２図Ａと同義である。 第４図は、１１人の健常人と３９人の心疾患患者の血漿
ＢＮＰ−Ｌｌレヘルを示す。患者は、ＮＹＨＡの機能的
分類に従い分類し、それぞれの群のＢＮＰ−Ｌｌレヘル
の平均上標準偏差で示した。”Ｐ＜０．０５と”Ｐ＜０
．０１は健常人群の値との比較。“Ｐ＜０．０５と：ｐ
＜０．０１はＮＹＨＡクラスＩ群との比較。６Ｆ＜０．
０５はＮＹＨＡクラス！群との比較。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｈＢＮＰを認識するモノクローナル抗体。
2. （２）ｈＢＮＰのリング構造を認識する請求項１に記載
   のモノクローナル抗体。
3. （３）ｈＢＮＰに対して１０＾１＾１Ｍ＾−＾１以上の
   親和定数を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体
   。
4. （４）ｈＢＮＰのＣ末端断片、ｒＢＮＰ、およびα−ｈ
   ＡＮＰを実質的に認識しない請求項１に記載のモノクロ
   ーナル抗体。
5. （５）ＩｇＧ＿１サブクラスに属する請求項１に記載の
   モノクローナル抗体。
6. （６）モノクローナル抗体ＫＹ−ｈＢＮＰ−ＩまたはＫ
   Ｙ−ｈＢＮＰ−IIである請求項１に記載のモノクローナ
   ル抗体。
7. （７）請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル
   抗体を産生するハイブリドーマ。
8. （８）ハイブリドーマＫＹ−ｈＢＮＰ−ＩまたはＫＹ−
   ｈＢＮＰ−IIである請求項７に記載のハイブリドーマ。
9. （９）請求項７または８に記載のハイブリドーマをマウ
   スの腹腔内で増殖させ、該腹腔内に蓄積された腹水から
   請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を
   採集することを特徴とする該モノクローナル抗体の製造
   方法。
10. （１０）請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナ
    ル抗体を用いるｈＢＮＰの免疫測定法。
11. （１１）ラジオイムノアッセイである請求項１０に記載
    の免疫測定法。