KR20010023853A

KR20010023853A - 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드의 면역 측정법

Info

Publication number: KR20010023853A
Application number: KR1020007002530A
Authority: KR
Inventors: 아사다히데히사; 시미즈히로유키; 엔도우가즈아키
Original assignee: 요시히코 시오노; 시오노기 앤드 컴파니, 리미티드
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1998-09-10
Publication date: 2001-03-26
Also published as: DE69833118T2; CN1278919A; EP1016867A4; NO325020B1; CN1161609C; KR100563358B1; CA2304263C; US6828107B2; AU9001098A; ES2256952T3; CA2304263A1; DK1016867T3; EP1016867B1; NO20001273D0; ATE315228T1; DE69833118D1; US20030157596A1; EP1016867A1; WO1999013331A1; AU731858B2

Abstract

본 발명은 포유류의 γ-BNP 유도체에 특이적인 면역 측정 방법으로서, 포유류의 α-BNP에 반응하는 제 1 항체와 preproBNP 또는 γ-BNP 유도체에 반응하지만 α-BNP에는 반응하지 않는 제 2 항체를 이용하며, 이중 한쪽 이상은 검출가능하게 표지되거나, 또는 고형화되어 있는 방법에 관한 것이다.

Description

뇌성 나트륨 이뇨 펩티드의 면역 측정법{IMMUNOASSAY METHOD FOR BNP}

＜110＞ Shionogi ＆ Co., Ltd.

＜120＞ Immunoassay for BNP

＜130＞ 12

＜150＞ JP 97246684

＜151＞ 1997-09-11

＜160＞ 2

＜170＞ KOPATIN 1.5

＜210＞ 1

＜211＞ 402

＜212＞ DNA

＜213＞ human

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (1)..(402)

＜400＞ 1

atg gat ccc cag aca gca cct tcc cgc gcg ctc ctg ctc ctg ctc ttc 48

Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

ttg cat ctg gct ttc ctg gga ggt cgt tcc cac ccg ctg ggc agc ccc 96

Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro

20 25 30

ggt tca gcc tcg gac ttg gaa acg tcc ggg tta cag gag cag cgc aac 144

Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn

35 40 45

cat ttg cag ggc aaa ctg tcg gag ctg cag gtg gag cag aca tcc ctg 192

His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu

50 55 60

gag ccc ctc cag gag agc ccc cgt ccc aca ggt gtc tgg aag tcc cgg 240

Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg

65 70 75 80

gag gta gccacc gag ggc atc cgt ggg cac cgc aaa atg gtc ctc tac 288

Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr

85 90 95

acc ctg cgg gca cca cga agc ccc aag atg gtg caa ggg tct ggc tgc 336

Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys

100 105 110

ttt ggg agg aag atg gac cgg atc agc tcc tcc agt ggc ctg ggc tgc 384

Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys

115 120 125

aaa gtg ctg agg cgg cat 402

Lys Val Leu Arg Arg His

130

＜210＞ 2

＜211＞ 134

＜212＞ PRT

＜213＞ human

＜400＞ 2

Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro

20 25 30

Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn

35 40 45

His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu

50 55 60

Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg

65 70 75 80

Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr

85 90 95

Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys

100 105 110

Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys

115 120 125

Lys Val Leu Arg Arg His

130

나트륨 이뇨 펩티드 계열에는 심방성(ANP), 뇌성(BNP) 및 C 타입(CNP) 나트륨 이뇨 펩티드의 3종이 포함되고, 이들 중, ANP 및 BNP는 주로 심장에서 생합성되고 분비되는 심장 호르몬이다. ANP와 BNP는 구조상 유사하며, ANP는 28개의 아미노산으로 이루어진, 제7위 및 제23위 시스테인 간의 디설파이드 결합에 의해 형성되는 링 부분을 갖는 펩티드이고, BNP는 32개의 아미노산으로 이루어진, 제10위 및 제26위 시스테인 간의 디설파이드 결합에 의해 형성되는 링 부분을 갖는 펩티드이다. 이들 28개 및 32개 아미노산으로 이루어진 성숙 펩티드는 세포 내에서, 또는 세포로부터의 분비에 있어서 각각의 전구체로부터 리더 서열이 분리되어 생성된다고 여겨지고 있었다. 즉, 인간 BNP는 심근 세포중에서 프리프로호르몬(이하, preproBNP라 함)으로서 생산되고, 분비전 또는 분비시에 Ser26-His27 사이에서 절단되고, proBNP(이하, γ-BNP라 함)로 된 후, Arg102-Serl03 사이에서 절단되고, BNP32(이하, α-BNP라 함)와 BNP(1-76)가 되고, 전자가 활성을 나타낸다고 보고되어 있다. 이들 활성 발현에는 적어도 링 부분이 필요하다고 여겨지고 있다.

심장 호르몬의 분비는 다양한 심질환에 의해 자극을 받기 때문에, 심 기능의 변화를 양호하게 반영할 수 있다. ANP의 분비는 주로 심방으로의 부하로 항진되고, BNP는 심실로의 부하로 생합성, 분비가 항진되며, 따라서 ANP 및 BNP는 모두 심질환 진단의 지표로서 유용하다. 각각의 생체 내에서의 역할이 해명됨에 따라서, BNP를 심질환 진단의 지표로 하는 방식의 이점이 분명해졌다. 예를 들면, 정상적인 혈중 농도를 비교하면 BNP는 ANP의 6분의 1의 농도에 지나지 않지만 심부전 등의 경우에는 ANP보다도 혈중 농도가 높아진다는 점; 심부전 증상의 예에서는 혈중 BNP 농도가 ANP 농도와 함께 상승하지만, 중증일수록 혈장 BNP 농도가 ANP 농도를 상회하는 경우가 많다는 점: 말초혈 레벨에서의 혈장 ANP, BNP 농도는 모두 심부전의 중증도에 따라 증가하지만, 그 증가율은 ANP보다도 BNP 쪽이 크다는 점 등이다. 더구나, 심부전증에서의 BNP 값은 건강한 사람의 수십배 내지 수백배로 증가하는 수가 있고, 심부전에 있어서의 BNP의 변동은 다른 호르몬에서는 보지 못할 정도로 현저하다는 점에서 BNP 측정의 유용성이 시사되어 있다(후지 노리히코 외, Mebio, 12(5), 28, (1995)).

이와 같은 상황하에서, 심부전 진단에 이용할 수 있는 BNP 항체를 이용하는 면역 분석법이 개시되어 있다. 일본 특허 제 95-507210 호는 프로테아제 등으로 생체내 분해된 γ-BNP(1-76)를 측정하는 방법을 개시하고 있지만, 그 방법의 측정 대상인 γ-BNP(1-76)는 BNP 활성 발현에 필요한 링 부분 등을 포함하지 않기 때문에, BNP의 호르몬 활성을 직접적으로 측정하는 것은 아니다.

나트륨 이뇨 활성을 갖는 α-BNP를 측정하는 방법을 제공하는 것으로서 다클론성 항체를 사용한 측정 키트(「BNP-32」 :페닌슐라사 제조)가 시판되고 있다. 그러나, 이 측정으로는 혈중에서 분해되어 C 말단 등이 결손되어 활성을 잃은 α-BNP 분해물도 측정해 버릴 우려가 있다. BNP의 혈중농도가 낮은 점을 감안하면, 이 분해물에 대한 측정값은 무시할 수 없는 것이고, 따라서 이러한 방법은 심부전 등을 정확히 진단하기 위한 BNP 측정법으로서는 문제가 있다.

한편, 상기 단점이 없는 BNP 측정 키트(「시오노리아 BNP」: 시오노기세이야쿠가부시키가이샤 제조)가 시판되고 있고, 이는 활성 발현에 필요한 구조를 인식하는 항체를 이용하는 것을 특징으로 한다. 그러나, 이러한 측정에 따르면, α-BNP가 채혈 후, 혈중에서 매우 불안정하다는 점에서, 검체의 채혈 및 보존 방법 등이 측정 결과에 크게 영향을 미칠 우려가 있다. 그 때문에, 이러한 방법으로 신뢰성 있는 데이터를 얻기 위해서, 검체에 특별한 처리, 예를 들면 채혈관에 분해 억제제를 첨가하거나, 검체를 저온으로 유지하는 등의 처리가 제안되고 있다. 이러한 처리는 BNP 측정 키트의 광범위한 임상 응용에 장해가 될 우려가 있다.

발명의 요약

본 발명자들은 BNP가 관여하는 심질환의 정확한 진단법을 확립하기 위해서 연구를 거듭하는 과정에서, 혈중에서의 BNP의 형태는, 종래 생각되고 있었던 것 같이 α-BNP가 주가 아니라, γ-BNP 및 적어도 구조상 α-BNP를 포함하는 γ-BNP 분해물(이하, 이들을 γ-BNP 유도체라 함)로 구성되어 있다는 것을 발견하였다. 또한, 혈중에서 γ-BNP는 α-BNP보다도 안정하다는 점, 즉, γ-BNP의 N-말단 구조의 역할중 하나가 BNP 분자의 안정화인 점을 발견하였다. 이것은 생체가, 반감기가 다른 2 종류 이상의 BNP 활성을 갖는 BNP 분자를 생합성하고 있는 것을 나타내고 있다. 이러한 지견을 얻어, 본 발명자들은 심질환의 정확한 진단을 위해서는 α-BNP 뿐만 아니라, γ-BNP 유도체를 특이적으로 측정할 필요가 있다는 견해에 달해 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 포유류의 α-BNP에 반응하는 제 1 항체와 preproBNP 또는 γ-BNP 유도체에 반응하지만 α-BNP에는 반응하지 않는 제 2 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는, 포유류의 γ-BNP 유도체에 특이적인 면역측정 방법을 제공하는 것이다.

본원에서, 「포유류의 α-BNP」란, 포유류의 preproBNP 또는 γ-BNP가 그 프로세싱 시그널 서열의 카복시 말단으로부터 프로세싱되고, N-말단측의 펩티드가 분리됨으로써 생성되는 나트륨 이뇨 활성을 갖는 저분자량의 펩티드를 의미한다. α-BNP는 사람의 경우, 서열목록의 서열번호:1에 있어서의 카복시 말단측 32 아미노산(제103-134위)으로 이루어지고, 환상 구조를 갖는 펩티드이다. preproBNP의 프로세싱 시그널 서열의 카복시 말단의 위치는 종류에 따라 약간 다르고, 예를 들면 인간 BNP의 경우, 서열목록의 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 제102위의 아미노산 잔기 Arg, 돼지, 개에서는 제100위의 아미노산 잔기에 상응한다.

「포유류의 γ-BNP」란, 카복시 말단에 α-BNP에 상당하는 32 아미노산 펩티드 부분을 가지며, 인간의 경우에는 서열목록의 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열의 제27위 His로부터 제134위 His까지의 108 아미노산으로 이루어진 proBNP를 의미한다. 「preproBNP」란 인간의 경우, 서열목록의 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열의 제1위 Met로부터 제134위 His까지의 134 아미노산으로 이루어진 펩티드를 의미한다.

「포유류의 γ-BNP 유도체」란, 포유류의 preproBNP 또는 γ-BNP로부터, 주로 생체내의 프로테아제 작용에 의해 생성되는 α-BNP를 포함하고, 이 α-BNP 보다도 큰 펩티드 단편을 가리킨다. 이것은 통상, γ-BNP보다도 작지만, 그 보다도 큰 분자일 수도 있다. 본원에서 특별히 기재하지 않는 한, 「γ-BNP 유도체」라고 하는 경우, γ-BNP 자신도 이 유도체에 포함된다.

본 발명에 있어서, BNP에 관해서 「안정하다」란, 프로테아제에 의한 분해를 받지만, 적어도 카복시 말단측의 링 구조와 C 말단은 잔존하여 나트륨 이뇨 활성을 유지하고 있고, 채혈 후 24 시간이 경과하여도 그 나트륨 이뇨 활성에 특별한 감소가 보이지 않는 상태임을 의미한다. 이 정의에 비추어 본 발명의 측정 대상인 γ-BNP 유도체는 안정하다.

한편, 불안정하다라는 것은, 프로테아제 등에 의해 C 말단이 분해되어, 채혈 후 24시간 경과하면 나트륨 이뇨 활성에 특별한 감소를 보이는 상태를 의미하며, 이 정의에 비추어 α-BNP는 불안정하다.

본 발명은 나트륨 이뇨 펩티드 계열의 하나인 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드(BNP)의 면역 측정법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 γ-BNP 및 그 유도체의 면역 측정법에 관한 것이다.

도 1은 α-BNP 측정계에서 측정한 혈장 검체의 수퍼덱스 75(Superdex 75)를 사용하는 겔 투과 HPLC에서의 크로마토그램이다. 도 1에서, A는 α-BNP의 용출 위치를 나타낸다.

도 2는 α-BNP 측정계에서 측정한 도 1과 다른 혈장 검체의 수퍼덱스 75를 사용하는 겔 투과 HPLC에서의 크로마토그램이다. 도 2에서, A는 α-BNP의 용출 위치를 나타낸다.

도 3은 γ-BNP 특이적 면역 측정법으로 측정한 도 2와 같은 혈장 검체의 수퍼덱스 75를 사용하는 겔 투과 HPLC에서의 크로마토그램이다. 도 3에서, A는 α-BNP의 용출 위치를 나타낸다.

도 4는 γ-BNP를 인간 혈장중 25℃에서 보존했을 때, 보존 시간과 BNP의 면역 활성과의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 5는 α-BNP를 인간 혈장중 4℃에서 보존하였을 때, 보존 시간과 α-BNP의 면역 활성과의 관계를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 제 1 실시양태로서, 포유류의 α-BNP에 반응하는 제 1 항체와 preproBNP 또는 γ-BNP 유도체에 반응하지만 α-BNP에는 반응하지 않는 제 2 항체를 이용하는 방법에 관한 것이다.

이 방법에 사용하는 항체는, 단클론성 항체 또는 다클론성 항체중 임의의 것이고, 제 1 항체는 시판되고 있거나, 당업자에게 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성한 인간 α-BNP 또는 그 부분 펩티드를 면역원으로서 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 또는, 시판되는 α-BNP 측정 키트「시오노리아 BNP」(시오노기세이야쿠가부시키가이샤 제조)에 사용되고 있는 α-BNP 카복시 말단 부분에 반응하는 단클론성 항체를 사용할 수도 있다.

제 2 항체로서는, 상기 조건을 만족시키는 임의의 항체를 이용할 수 있지만, 예를 들면 서열목록의 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 번호 27 내지 102로 표시되는 아미노산 서열 및 그 대사물에 특이적인 항체인 것이 바람직하다. 본 발명의 측정 대상인 γ-BNP 유도체는, 인간의 경우, 적어도 서열번호:1의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 번호 27 내지 134로 표시되는 부분 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따르는 방법에 사용되는 제 2 항체 제조시에, 서열번호:1의 아미노산 번호 27 내지 102를 인식하는 항체를 제조할 수 있도록 항원을 선정하는 등의 주의가 필요할 것이다. 이와 같은 항체의 제조는 당업자에게 공지된 방법으로 실행할 수 있다. γ-BNP는 프로테아제에 의한 절단가능한 부위로서, 이 서열번호:1의 제47위의 Arg, 제53위의 Lys 및 제72위의 Arg를 함유한다고 이론상 생각된다. 따라서, 서열번호:1의 아미노산 번호 73 내지 102를 인식하는 항체를 제 2 항체로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 측정법은 경합법 또는 샌드위치법중 어느 것이어도 좋고, 사용하는 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체중 어느 것이어도 좋다.

제 1 항체 및 제 2 항체중, 적어도 한쪽은 검출가능하게 표지되어 있거나, 또는 고형화될 수도 있다.

항체의 표지 및 고형화법은 당업자에게 주지되어 있다. 표지로서는, 방사성 동위체, 효소, 형광물질, 발광물질 또는 입자 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 항체의 표지법도 주지되어 있으며, 예를 들면, 고노 등(핵의학 기술, 13(1), 2, (1993))의 방법에 의해 표지할 수 있다.

본 발명은 또한, 포유류의 α-BNP에 반응하는 제 1 항체와 preproBNP 또는 γ-BNP 유도체에 반응하지만 α-BNP에는 반응하지 않는 제 2 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유류의 γ-BNP 유도체에 특이적인 면역측정을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 경합법 또는 샌드위치법중 어느 것이어도 좋고, 사용하는 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체중 어느 것이어도 좋다.

제 1 항체 및 제 2 항체 중, 한쪽 이상은 검출 가능하게 표지되어 있을 수 있거나, 또는 고형화될 수도 있다. 또한, 본 발명의 키트는 표지를 검출하는 수단을 포함할 수 있다. 이 표지로서는, 방사성 동위체, 효소, 형광 물질, 발광 물질 또는 입자를 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

이하에 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 이들은 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

샌드위치 IRMA(Immuno Radio Metric Assay)법에 의한 γ-BNP 유도체의 측정

이하의 실시예에 있어서, 일반적인 시약은 와코 쥰야쿠사 또는 나카라이테스크사의 특급 시약을 사용하였다. 소 혈청 알부민(BSA)은 시그마사제를 사용하였다.

(1) 혈장 검체의 제조

1) 심질환 환자 또는 건강한 자원 봉사자로부터 소의 폐로부터 유래한 아프로티닌(시그마사 제조) (500 KIU/L) 첨가 EDTA 채혈관에 정맥혈을 채취하고, 4℃ × 2000g에서 5분간 원심분리(고쿠산사 제 H-107 RGA)하여 혈구분리를 하였다. 얻어진 혈장 검체는 사용할 때까지 -80℃에서 동결보존하였다.

2) 상기 1)에서 조제한 심질환 환자 및 건강한 사람 유래의 혈장을 겔 투과 HPLC 시스템 LC10A(시마즈 제작소사 제조)에 수퍼덱스 75 10/30 칼럼(파마시아사)를 이용하여 분획화하였다. 0.1M 인산 완충액(pH7.5, 0.3M NaCl, 5mM EDTA)을 사용하여 유속 1ml/min에서 칼럼을 평형화한 후, 혈장 검체 1ml를 주입하고, 칼럼으로부터의 용출액 1ml를 주입하고, 칼럼부터의 용출액 1m1씩을 포집하였다. 각 분획을 사용하여 하기 (2)-2)의 α-BNP의 측정법 및 (2)-3)의 γ-BNP 측정법에 따라서, 각각 측정하였다.

(2) α-BNP 측정계 및 γ-BNP 유도체 측정계의 구축

1) 측정에는, 이하의 펩티드, 항체 및 키트를 사용하였다.

·인간 α-BNP(펩티드 연구소사 제조)

·γ-hBNP 아미노 말단 부분(서열번호:1에 있어서의 아미노산 번호 27-64)에 대한 항체(펩티드 연구소사 제조)

·α-BNP 카복시 말단 부분에 대한 단클론성 항체(BC203).

BC203은 시오노리아 BNP 키트(시오노기세이야쿠가부시키가이샤 제조)에 첨부되어 있는 α-BNP의 카복시 말단(129-l34)에 대한 단클론성 항체이며, 비이드에 고정되어 있어 고정화 항체로 사용한다.

·α-BNP 링 구조 부분에 대한 단클론성 항체(KY-BNPII).

KY-BNPII는 시오노리아 BNP 키트(시오노기세이야쿠사 제조)에 첨부되어 있는 α-BNP의 링 구조(112-128)에 대한 단클론성 항체이며,¹²⁵I로 표지되어 있다.

2) α-BNP 측정계에 의한 혈장 분획의 측정

α-BNP 측정에는 시판되는 「시오노리아 BNP 키트」 (시오노기세이야쿠가부시키가이샤 제조)를 사용하였다. 이 계에서는, α-BNP의 링 구조에 대한 단클론성 항체(KY-BNPII) 및 카복시 말단에 대한 단클론성 항체(BC 203)을 사용하여 공급자의 지시에 따라 샌드위치 IRMA법으로 측정한다.

즉, 각 측정 검체 및 각종 표준 물질(α-BNP 용액; 0, 4, 10, 150, 600, 2000pg/ml)을 폴리스티렌제의 시험관에 100㎕ 나누어 주입하고, 200㎕의 요오드화 BNP 항체(¹²⁵I)용액을 첨가하고, BC203 항체 고형화 폴리스티렌 비이드를 1개 가하여 교반한 후, 4℃에서 18 시간 정치하여 반응시켰다. 2m1의 세정액으로 2회 세정을 한 후, 방사 활성을 γ 카운터 ARC-600 (아로카사 제조)로 측정하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타낸다.

3) γ-BNP 유도체 측정계에 의한 혈장 분획의 측정

우선, γ-hBNP 아미노 말단 부분(27-64위)에 대한 항체를¹²⁵I에 의해 표지하였다.

γ-hBNP 아미노 말단 부분(서열번호:1의 아미노산 번호 27-64 부분)에 대한 항혈청(펩티드사 제조)으로부터 MASPII 킷트(바이오래드사 제조)를 사용하여 IgG를 정제하고, 센트리콘 30(아미콘사 제조)을 사용하여 0.5 M 인산 완충액(pH7.5)으로 치환하였다. 항체 표지는 클로라민 T법을 사용하여 행하였다. 정제 IgG 용액 170㎕(77.6μg IgG)을 유리 튜브에 나누어 주입하고, Na¹²⁵I 용액(아마샴사 제조)을 10㎕(34.2 MBq) 첨가하였다. 0.1% 클로라민 T 용액 20㎕을 첨가하고, 실온에서 30초간 심하게 교반한 후, 0.25% 피로아황산나트륨 용액 및 5% 요오드화 칼륨 수용액을 각각 20㎕씩 가하여 반응을 정지하였다. 앰퓨어 SA(Ampure SA) 칼럼(아마샴사 제조)에 의해 미반응의¹²⁵I의 제거 및 탈염하여,¹²⁵I 표지 항체를 포함하는 용액을 수득하였다.

이어서, 이 항체 및 α-BNP 카복시 말단 인식 항체(BC203)를 고형화한 폴리스티렌 비이드를 사용하여 혈장 분획에 대하여 샌드위치 IRMA 법으로 행하였다.

각 측정검체 100㎕를 폴리스티렌 제조의 시험관에 나누어 주입하고, 200㎕의 0.1M 인산 완충액(pH 7.5, 0.3 M), 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.2% BSA, 500 KIU/1 소의 폐로부터 유래한 아프로티닌(시그마사 제조)를 첨가하고, BC203항체 고체상 폴리스티렌 비이드를 1개 가하여 교반한 후, 4℃에서 18시간 정치하여 반응시켰다. 2ml의 세정액으로 2회 세정한 후,¹²⁵I 표지 항체 용액 300㎕를 가하여 교반하고, 4℃에서 18시간 정치하여 반응시켰다. 2m1의 세정액으로 2회 세정을 한 후, 방사 활성을 γ 카운터 ARC-600(아로카사 제조)으로 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.

(3) 결과

환자 혈장의 겔 투과 HPLC에 의한 크로마토그램의 측정 결과를 도 1, 도 2 및 도 3에 도시하고 있다. 이들 도면에 있어서 A는 α-BNP의 용출 위치이다.

도 1은 상기 (2)-2)의 α-BNP 측정 키트에 의한 측정 결과를 나타내고 있다. 도 1에서, 종축은 각 분획 중의 시오노리아 BNP로 측정한 BNP성 물질의 농도, 횡축은 칼럼으로부터의 용출 용량을 나타낸다. 검은 삼각형, 흰 사각형 및 흰 마름모꼴은 각각 다른 혈장 검체의 측정 결과를 나타내고 있다.

도 2는 도 1과 다른 검체를 사용하여, 상기 (2)-2)의 α-BNP 측정계로 측정한 결과를 나타내고 있다. 도 2에서, 종축은 각 분획중의 시오노리아 BNP로 측정한 BNP성 물질의 농도, 횡축은 칼럼으로부터의 용출 용량을 나타낸다. 또한, 검은 삼각형 및 검은 사각형은 다른 혈장 검체를 나타낸다.

도 1 및 도 2로부터, 심질환 환자 혈청 중에는 α-BNP 보다 분자량이 큰 BNP 면역 활성 물질이 존재하고, 그것이 BNP 면역 활성을 갖는 주요 물질임을 알 수 있다.

도 3은 도 2와 같은 검체를 사용하여 상기 (2)-3)에 기재된 본 발명의 γ-BNP 측정계에 의한 측정 결과를 나타내며, 종축은 본 발명의 γ-BNP 면역 측정계에서 측정한 방사 활성을, 횡축은 칼럼으로부터의 용출 용량을 나타내고 있다. 또한, 검은 동그라미는 α-BNP를 나타낸다. 도 3중, 검은 동그라미는 인간 α-BNP 용액을 혈장의 경우와 마찬가지로 HPLC에 의해 분획하여 측정된 결과이다.

도 3으로부터, 본 발명의 γ-BNP 유도체 특이적 면역 측정법에서는 BNP 면역 활성을 갖는 주요 물질을 검출할 수 있지만, α-BNP는 전혀 점출되지 않았음을 알 수 있다.

이상의 결과는, 본 발명의 γ-BNP 면역 측정법이 α-BNP를 인식하지 않고, γ-BNP 유도체에 특이적인 측정 방법임을 나타내고 있다. 또한, BNP 면역 활성을 갖는 주요물질이 γ-BNP인 것도 분명해졌다.

시험예 1

γ-BNP 유도체 및 α-BNP의 혈장 중에서의 안정성

상기 실시예 1에 있어서의 심질환 환자 유래 혈장 검체의 겔 투과 HPLC의 결과로부터, γ-BNP 유도체를 포함한다고 생각되는 분획을 채취하였다. 소의 폐로부터 유래한 아프로티닌을 첨가하지 않은 EDTA 채혈관을 사용하여 건강한 자원 봉사자로부터 정맥혈을 채취하여, 상기 (1)-1)과 같은 조작에 의해 혈장 검체(α-BNP 최소 검출한계(4pg/ml 미만))을 수득하고, 또한 여기에 상기 분획을 첨가한 후, 실온 25℃에서 0, 2, 6, 24시간 방치하고, BNP 면역 활성을, α-BNP를 측정하기 위한 시오노리아 BNP 키트로 측정하여 γ-BNP 유도체의 안정성을 조사하였다.

한편, 상기와 마찬가지의 소의 폐로부터 유래한 아프로티닌을 포함하지 않는 건강한 자원 봉사자 혈장에 화학적으로 합성한 α-BNP를 첨가한 후, 4℃에서 0, 2, 6, 24 시간 방치하고, 그 BNP 면역 활성을 마찬가지로 시오노리아 BNP 키트로 측정하여, α-BNP의 안정성을 조사하였다.

γ-BNP 유도체 및 α-BNP의 혈장 검체중에서의 면역 활성의 안정성의 결과를 도 4 및 도 5에 각각 나타낸다.

도 4로부터, γ-BNP 유도체는 25℃에서 24 시간 방치하여도 초기값의 면역 활성에 비해 특별한 저하가 보이지 않음에 비해, 도 5로부터, α-BNP는 4℃에서 24시간 방치했을 경우, 초기값의 약 40%까지 면역 활성이 저하됨을 알 수 있다.

이상으로부터, α-BNP는 γ-BNP 유도체보다도 혈액중에서 현저히 불안정하고, 심질환의 진단에는 후자가 적합하다는 것이 밝혀졌다.

상기와 같이 심부전증에서의 BNP 값은 건강한 사람의 수십내 내지 수백배로 증가할 수가 있고, 심부전에 있어서의 BNP의 변동은 다른 호르몬에서는 보지 못할 정도로 현저하다는 점에서 BNP 측정의 유용성이 시사되어 있다.

본 발명의 면역 측정법은 α-BNP는 측정하지 않고서 γ-BNP 유도체를 특이적으로 측정할 수 있는 방법이다. 따라서, 본 발명의 측정법에 따르면, 종래의 BNP 측정에 의해 판단되었던 심부전 진단 및 모니터링 전후의 판정과는 다른 임상상의 의의를 제공할 수 있다고 생각된다.

또한, 본 발명에 따른 측정법의 측정 대상인 γ-BNP는 본원에서 처음으로 밝혀진 바와 같이 혈중에서 안정하다. 따라서, 본 발명에 따르는 측정법은 측정 검체의 채취법, 보존법 및 측정까지의 시간에 따른 영향을 받는 일 없이 안정한 신뢰성을 갖는 임상 데이터를 제공할 수 있고, 게다가 채혈 시료에 특별한 처리를 실시할 필요가 없기 때문에, 간편하게 임상 데이터를 얻을 수 있어, 심질환을 한층 더 정확하게 진단하는 데에 공헌할 수 있다.

Claims

포유류의 α-뇌성 나트륨 이뇨 펩티드(BNP)에 반응하는 제 1 항체와 preproBNP 또는 γ-BNP 유도체에 반응하지만 α-BNP에는 반응하지 않는 제 2 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는, 포유류의 γ-BNP 유도체에 특이적인 면역측정 방법.
제 1 항에 있어서,

γ-BNP 유도체가 서열목록의 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 번호 27 내지 102로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

제 2 항체가 서열목록의 서열번호:1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 번호 27 내지 102로 표시되는 아미노산 서열에 특이적인 항체인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,

제 1 항체 및 제 2 항체중, 한쪽 이상이 검출가능하게 표지되어 있거나, 또는 고형화되어 있음을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,

검출가능한 표지가 방사성 동위체, 효소, 형광물질, 발광 물질 또는 입자인 방법.
포유류의 α-BNP에 반응하는 제 1 항체와 preproBNP 또는 γ-BNP 유도체에 반응하지만 α-BNP에는 반응하지 않는 제 2 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유류의 γ-BNP 유도체에 특이적인 면역 측정을 위한 키트.
제 6 항에 있어서,

제 1 항체 및 제 2 항체중, 한쪽 이상이 검출가능하게 표지되어 있거나, 또는 고형화되어 있음을 특징으로 하는 키트.
제 7 항에 있어서,

표지를 검출하는 수단을 추가로 포함함을 특징으로 하는 키트.