JP3155626B2 - 抗β２−ミクログロブリン由来物質抗体及びそれを用いるβ２−ミクログロブリン由来物質の免疫測定方法 - Google Patents
抗β２−ミクログロブリン由来物質抗体及びそれを用いるβ２−ミクログロブリン由来物質の免疫測定方法Info
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- JP3155626B2 JP3155626B2 JP25071192A JP25071192A JP3155626B2 JP 3155626 B2 JP3155626 B2 JP 3155626B2 JP 25071192 A JP25071192 A JP 25071192A JP 25071192 A JP25071192 A JP 25071192A JP 3155626 B2 JP3155626 B2 JP 3155626B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト体液中のβ2 −ミク
ログロブリンに由来する物質を、通常のβ2−ミクログ
ロブリンの影響を受けずに、これとは独立に高感度に免
疫学的に測定する方法及びそれに用いられる抗体に関す
る。
ログロブリンに由来する物質を、通常のβ2−ミクログ
ロブリンの影響を受けずに、これとは独立に高感度に免
疫学的に測定する方法及びそれに用いられる抗体に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】長期血液透析患者にはアミロイドーシス
による手根管症候群などの骨関節症状が高頻度に出現す
ることが知られている。最近、この骨関節障害はβ2 −
ミクログロブリンを前駆蛋白とするアミロイド沈着と密
接に関連して起こることが明らかにされた(Gejyo,F. e
t.al. Kidney Int.30.pp385-390,1986)。長期透析患者
血液中にβ2 −ミクログロブリンが蓄積し、アミロイド
化することが推測されている。しかし、臨床的には血液
中のβ2 −ミクログロブリン濃度と透析アミロイドーシ
スの発生頻度には相関関係が認められないことが知られ
ている(Gejyo,F.et.al. N.Engl.J.Med.314.pp585-586,1
986)。また、透析アミロイド−シスの患者血清とアミロ
イド組織を二次元電気泳動とイムノブロツテイングによ
り分析した結果、通常のβ2 −ミクログロブリンと比較
して、等電点が酸性側にあり、分子量が僅かに小さいβ
2 −ミクログロブリン類似物質を検出したことが報告さ
れている(Ogawa,H. et.al. Clinical Nephrology.30.p
p.158-163,1988)。このβ2 −ミクログロブリン類似物
質はＮ末端から17番目のアスパラギン残基がアスパラギ
ン酸にアミド分解したものであることが明らかにされた
(Odani,H. et al. Biochem.Biophys. Res. Commun. 16
8,pp1223-1229,1990)。さらに、アミロイド腎結石を分
析した結果、通常のβ2 −ミクログロブリンのみなら
ず、リジン残基で切断を受けたβ2 −ミクログロブリン
の断片の存在が報告された(Linke,R.P. et al. Kidoney
Int. 36,pp675-681,1989)。またさらには、慢性関節リ
ュウマチ、全身性エリテマトーデス、小細胞性肺癌の患
者血清中より正常のβ2-ミクログロブリンのＮ末端より
５５番目のセリンまたは６０番目のトリプトファンの間
のいずれかの位置で切断をうけたβ2-ミクログロブリン
の存在及び測定方法が報告されている。（モゲンス ホ
ルスト ニツセンら、特開昭62-246596 ）。
による手根管症候群などの骨関節症状が高頻度に出現す
ることが知られている。最近、この骨関節障害はβ2 −
ミクログロブリンを前駆蛋白とするアミロイド沈着と密
接に関連して起こることが明らかにされた(Gejyo,F. e
t.al. Kidney Int.30.pp385-390,1986)。長期透析患者
血液中にβ2 −ミクログロブリンが蓄積し、アミロイド
化することが推測されている。しかし、臨床的には血液
中のβ2 −ミクログロブリン濃度と透析アミロイドーシ
スの発生頻度には相関関係が認められないことが知られ
ている(Gejyo,F.et.al. N.Engl.J.Med.314.pp585-586,1
986)。また、透析アミロイド−シスの患者血清とアミロ
イド組織を二次元電気泳動とイムノブロツテイングによ
り分析した結果、通常のβ2 −ミクログロブリンと比較
して、等電点が酸性側にあり、分子量が僅かに小さいβ
2 −ミクログロブリン類似物質を検出したことが報告さ
れている(Ogawa,H. et.al. Clinical Nephrology.30.p
p.158-163,1988)。このβ2 −ミクログロブリン類似物
質はＮ末端から17番目のアスパラギン残基がアスパラギ
ン酸にアミド分解したものであることが明らかにされた
(Odani,H. et al. Biochem.Biophys. Res. Commun. 16
8,pp1223-1229,1990)。さらに、アミロイド腎結石を分
析した結果、通常のβ2 −ミクログロブリンのみなら
ず、リジン残基で切断を受けたβ2 −ミクログロブリン
の断片の存在が報告された(Linke,R.P. et al. Kidoney
Int. 36,pp675-681,1989)。またさらには、慢性関節リ
ュウマチ、全身性エリテマトーデス、小細胞性肺癌の患
者血清中より正常のβ2-ミクログロブリンのＮ末端より
５５番目のセリンまたは６０番目のトリプトファンの間
のいずれかの位置で切断をうけたβ2-ミクログロブリン
の存在及び測定方法が報告されている。（モゲンス ホ
ルスト ニツセンら、特開昭62-246596 ）。
【０００３】以上の報告のように、長期透析患者あるい
は免疫異常、肺癌などの患者の血液中には、通常のβ2
−ミクログロブリン以外に、切断等の何らかの修飾を受
けたβ2 −ミクログロブリン類似物質が存在することが
示唆されている。
は免疫異常、肺癌などの患者の血液中には、通常のβ2
−ミクログロブリン以外に、切断等の何らかの修飾を受
けたβ2 −ミクログロブリン類似物質が存在することが
示唆されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来、β2 −ミクログ
ロブリンの測定方法としては、ヒト由来のβ2 −ミクロ
グロブリンを未変性のまま宿主となる動物の体内に投与
し、この宿主より採取した抗体を用いる免疫学的測定法
によっていた。しかしながら、この方法によると、用い
る抗体が完全なβ2 −ミクログロブリンを免疫原として
作製されたものであるので、当然のことながら通常の完
全なβ2 −ミクログロブリンとも特異的に反応するた
め、β2 −ミクログロブリン由来物質、すなわちβ2 −
ミクログロブリン分解物のみを特異的に測定することは
できない。
ロブリンの測定方法としては、ヒト由来のβ2 −ミクロ
グロブリンを未変性のまま宿主となる動物の体内に投与
し、この宿主より採取した抗体を用いる免疫学的測定法
によっていた。しかしながら、この方法によると、用い
る抗体が完全なβ2 −ミクログロブリンを免疫原として
作製されたものであるので、当然のことながら通常の完
全なβ2 −ミクログロブリンとも特異的に反応するた
め、β2 −ミクログロブリン由来物質、すなわちβ2 −
ミクログロブリン分解物のみを特異的に測定することは
できない。
【０００５】従って、本発明の目的は、通常のβ2 −ミ
クログロブリンとは反応せず、β2−ミクログロブリン
由来物質のみと反応する抗体を提供し、それによってβ
2 −ミクログロブリン由来物質のみを特異的に測定する
方法を提供することである。
クログロブリンとは反応せず、β2−ミクログロブリン
由来物質のみと反応する抗体を提供し、それによってβ
2 −ミクログロブリン由来物質のみを特異的に測定する
方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、β2 −ミクログロブリンを免疫原として作製さ
れた従来の抗体はすべて、β2 −ミクログロブリンのＣ
末端側領域をエピトープとするものであり、Ｎ末端領域
をエピトープとするものは上記従来方法によっては得ら
れないことを見出した。そして、β2 −ミクログロブリ
ンのＮ末端領域をエピトープとする抗体を初めて提供し
た。さらに、β2 −ミクログロブリンのＮ末端領域をエ
ピトープとする抗体は、通常のβ2 −ミクログロブリン
とは反応せず、従って、この抗体を用いればβ2 −ミク
ログロブリン由来物質のみを特異的に測定することがで
きることを見出し本発明を完成した。
の結果、β2 −ミクログロブリンを免疫原として作製さ
れた従来の抗体はすべて、β2 −ミクログロブリンのＣ
末端側領域をエピトープとするものであり、Ｎ末端領域
をエピトープとするものは上記従来方法によっては得ら
れないことを見出した。そして、β2 −ミクログロブリ
ンのＮ末端領域をエピトープとする抗体を初めて提供し
た。さらに、β2 −ミクログロブリンのＮ末端領域をエ
ピトープとする抗体は、通常のβ2 −ミクログロブリン
とは反応せず、従って、この抗体を用いればβ2 −ミク
ログロブリン由来物質のみを特異的に測定することがで
きることを見出し本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、通常のβ2 −ミクロ
グロブリンとは反応せず、β2 −ミクログロブリンのＮ
末端側１番目より１９番目のアミノ酸配列の全体または
その一部分に特異的に反応する抗体を提供する。また、
本発明は、該本発明の抗体とβ2 −ミクログロブリン由
来物質との特異的反応を利用して該β2 −ミクログロブ
リン由来物質を測定することから成るβ2 −ミクログロ
ブリン由来物質の免疫測定方法を提供する。
グロブリンとは反応せず、β2 −ミクログロブリンのＮ
末端側１番目より１９番目のアミノ酸配列の全体または
その一部分に特異的に反応する抗体を提供する。また、
本発明は、該本発明の抗体とβ2 −ミクログロブリン由
来物質との特異的反応を利用して該β2 −ミクログロブ
リン由来物質を測定することから成るβ2 −ミクログロ
ブリン由来物質の免疫測定方法を提供する。
【０００８】この発明により、透析アミロイドーシスに
よる骨関節障害の原因を明らかにし、予知する方法を見
いだすため、正常なβ2 −ミクログロブリンとは異なっ
たβ2 −ミクログロブリン由来物質の検出が可能とな
る。また、この発明で得た抗体より、透析アミロイドー
シス以外の多くの疾患における血清、髄液、尿、腹水、
胸水中におけるβ2 −ミクログロブリン由来物質を検出
することが出来、各病態の解析が可能となる。
よる骨関節障害の原因を明らかにし、予知する方法を見
いだすため、正常なβ2 −ミクログロブリンとは異なっ
たβ2 −ミクログロブリン由来物質の検出が可能とな
る。また、この発明で得た抗体より、透析アミロイドー
シス以外の多くの疾患における血清、髄液、尿、腹水、
胸水中におけるβ2 −ミクログロブリン由来物質を検出
することが出来、各病態の解析が可能となる。
【０００９】β2 −ミクログロブリンを免疫原として作
製された抗体がいずれもβ2 −ミクログロブリンのＣ末
端側領域をエピトープとするものであることは次のよう
にして確認した。すなわち、次に示すβ2 −ミクログロ
ブリンのアミノ酸配列に相当するペプチドを化学合成に
より調製した。 ペプチド１；Ｎ末端より１番目から６番目までのアミノ
酸配列に相当するペプチド。すなわち、Ile-Gln-Arg-Th
r-Pro-Lys ペプチド２；Ｎ末端より１０番目から１９番目までのア
ミノ酸配列に相当するペプチド。すなわち、Tyr-Ser-Ar
g-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys ペプチド３；Ｎ末端より９１番目から９８番目までつま
りＣ末端より２番目から９番目までのアミノ酸配列に相
当するペプチド。すなわち、Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-
Arg-Asp ペプチド４；Ｎ末端より１番目から１０番目までのアミ
ノ酸配列に相当するペプチド。すなわち、Ile-Gln-Arg-
Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr 上記のペプチドをそれぞれボルトン−ハンター試薬を用
いて、ヨウ素１２５にてラジオアイソトープ標識をし
た。これらの標識ペプチドを各々、ウサギ抗β2 −ミク
ログロブリン抗体と混合し、さらに抗ウサギ抗体を固相
化した磁性微粒子と反応させた。この後磁性粒子を磁石
にて分離し磁性粒子に結合しているヨウ素１２５の放射
活性を測定することで、抗β2 −ミクログロブリン抗体
と抗原ペプチドの反応性を検討した。
製された抗体がいずれもβ2 −ミクログロブリンのＣ末
端側領域をエピトープとするものであることは次のよう
にして確認した。すなわち、次に示すβ2 −ミクログロ
ブリンのアミノ酸配列に相当するペプチドを化学合成に
より調製した。 ペプチド１；Ｎ末端より１番目から６番目までのアミノ
酸配列に相当するペプチド。すなわち、Ile-Gln-Arg-Th
r-Pro-Lys ペプチド２；Ｎ末端より１０番目から１９番目までのア
ミノ酸配列に相当するペプチド。すなわち、Tyr-Ser-Ar
g-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys ペプチド３；Ｎ末端より９１番目から９８番目までつま
りＣ末端より２番目から９番目までのアミノ酸配列に相
当するペプチド。すなわち、Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-
Arg-Asp ペプチド４；Ｎ末端より１番目から１０番目までのアミ
ノ酸配列に相当するペプチド。すなわち、Ile-Gln-Arg-
Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr 上記のペプチドをそれぞれボルトン−ハンター試薬を用
いて、ヨウ素１２５にてラジオアイソトープ標識をし
た。これらの標識ペプチドを各々、ウサギ抗β2 −ミク
ログロブリン抗体と混合し、さらに抗ウサギ抗体を固相
化した磁性微粒子と反応させた。この後磁性粒子を磁石
にて分離し磁性粒子に結合しているヨウ素１２５の放射
活性を測定することで、抗β2 −ミクログロブリン抗体
と抗原ペプチドの反応性を検討した。
【００１０】本発明者らは、市販の抗体２０種類のβ2
−ミクログロブリンの抗体反応部位をこの方法で解析し
た。その結果、全ての抗β2 −ミクログロブリン抗体は
ペプチド３すなわちＮ末端より９１番目から９８番目ま
でのＣ末端側のペプチドには反応するが、そのほかのペ
プチド１およびペプチド２およびペプチド４のＮ末端側
のペプチドに対する反応は検出されなかった。
−ミクログロブリンの抗体反応部位をこの方法で解析し
た。その結果、全ての抗β2 −ミクログロブリン抗体は
ペプチド３すなわちＮ末端より９１番目から９８番目ま
でのＣ末端側のペプチドには反応するが、そのほかのペ
プチド１およびペプチド２およびペプチド４のＮ末端側
のペプチドに対する反応は検出されなかった。
【００１１】上記の結果は、通常のβ2 −ミクログロブ
リンを免疫原として得られた抗体は、β2 −ミクログロ
ブリンが修飾を受けて生じたβ2 −ミクログロブリン由
来物質、とくにＮ末端部分のみが呈示されているような
物質を抗原として認識しない可能性を示唆している。従
って、従来のβ2 −ミクログロブリン測定法では、これ
らのβ2 −ミクログロブリン由来物質は検出できない。
リンを免疫原として得られた抗体は、β2 −ミクログロ
ブリンが修飾を受けて生じたβ2 −ミクログロブリン由
来物質、とくにＮ末端部分のみが呈示されているような
物質を抗原として認識しない可能性を示唆している。従
って、従来のβ2 −ミクログロブリン測定法では、これ
らのβ2 −ミクログロブリン由来物質は検出できない。
【００１２】β2 −ミクログロブリンのＮ末端側のアミ
ノ酸配列が、通常のβ2 −ミクログロブリンを抗原とし
て得られた抗体により認識されないことは、この部分が
立体構造的にタンパクの内部領域に位置しており抗体と
接触し得ない状態にあるか、または、通常のβ2 −ミク
ログロブリンのＮ末端配列は免疫原になることのできな
い可能性を示している。そして、後述の実施例において
証明されるように、β2 −ミクログロブリンのＮ末端領
域を免疫原として作製された本発明の抗体は正常なβ2
−ミクログロブリンと反応しない。このため通常のβ2
−ミクログロブリンに対する抗体を用いてもβ2 −ミク
ログロブリンのＮ末端側配列の検出は不可能であり、ま
たさらに、該Ｎ末端配列検出による臨床的意義も期待で
きない。
ノ酸配列が、通常のβ2 −ミクログロブリンを抗原とし
て得られた抗体により認識されないことは、この部分が
立体構造的にタンパクの内部領域に位置しており抗体と
接触し得ない状態にあるか、または、通常のβ2 −ミク
ログロブリンのＮ末端配列は免疫原になることのできな
い可能性を示している。そして、後述の実施例において
証明されるように、β2 −ミクログロブリンのＮ末端領
域を免疫原として作製された本発明の抗体は正常なβ2
−ミクログロブリンと反応しない。このため通常のβ2
−ミクログロブリンに対する抗体を用いてもβ2 −ミク
ログロブリンのＮ末端側配列の検出は不可能であり、ま
たさらに、該Ｎ末端配列検出による臨床的意義も期待で
きない。
【００１３】本発明の抗体は、β2 −ミクログロブリン
のＮ末端領域１番目から１９番目のアミノ酸配列、すな
わち、Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-
Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys から成るペプチド又
はその一部分を免疫原として用いることにより得ること
ができる。該アミノ酸配列の一部分を免疫原として用い
る場合、アミノ酸を５個以上含むペプチドであればいか
なる部分をも用いることができる。下記の実施例では１
番目から６番目のアミノ酸を有するペプチド及び１０番
目から１９番目のアミノ酸を有するペプチドを免疫原と
して用いて本発明の抗体を作製したがこれに限られるも
のではなく、例えば１番目から１０番目のアミノ酸を有
するペプチド等、その他の部分を免疫原として用いるこ
ともできる。なお、免疫原性を高めるために、ペプチド
をウシ血清アルブミン等の高分子物質に結合させたもの
を動物に免疫することが好ましい。抗体の作製方法自体
はこの分野において周知であり、下記の実施例にも具体
的に記載されている。
のＮ末端領域１番目から１９番目のアミノ酸配列、すな
わち、Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-
Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys から成るペプチド又
はその一部分を免疫原として用いることにより得ること
ができる。該アミノ酸配列の一部分を免疫原として用い
る場合、アミノ酸を５個以上含むペプチドであればいか
なる部分をも用いることができる。下記の実施例では１
番目から６番目のアミノ酸を有するペプチド及び１０番
目から１９番目のアミノ酸を有するペプチドを免疫原と
して用いて本発明の抗体を作製したがこれに限られるも
のではなく、例えば１番目から１０番目のアミノ酸を有
するペプチド等、その他の部分を免疫原として用いるこ
ともできる。なお、免疫原性を高めるために、ペプチド
をウシ血清アルブミン等の高分子物質に結合させたもの
を動物に免疫することが好ましい。抗体の作製方法自体
はこの分野において周知であり、下記の実施例にも具体
的に記載されている。
【００１４】本発明の抗体はポリクローナル抗体であっ
てもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。モノ
クローナル抗体の作製方法も既に確立されており、上記
免疫原を用いて容易に作製することができる。
てもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。モノ
クローナル抗体の作製方法も既に確立されており、上記
免疫原を用いて容易に作製することができる。
【００１５】本発明の抗体を用いることにより、正常な
β2 −ミクログロブリンを測定することなくβ2 −ミク
ログロブリンの分解物のみを特異的に免疫測定すること
ができる。抗原抗体反応を利用した免疫測定方法はこの
分野において周知であり、本発明において、従来のいず
れの方法をも採用することができる。例えば、標識に基
づいて分類すれば、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光
免疫分析及びビオチンを用いる方法、並びに、反応様式
で分類すればサンドイッチ法及び競合法のいずれをも採
用することができ、これらは全て周知である。
β2 −ミクログロブリンを測定することなくβ2 −ミク
ログロブリンの分解物のみを特異的に免疫測定すること
ができる。抗原抗体反応を利用した免疫測定方法はこの
分野において周知であり、本発明において、従来のいず
れの方法をも採用することができる。例えば、標識に基
づいて分類すれば、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光
免疫分析及びビオチンを用いる方法、並びに、反応様式
で分類すればサンドイッチ法及び競合法のいずれをも採
用することができ、これらは全て周知である。
【００１６】本発明の免疫測定方法を適用できる試料
は、β2 −ミクログロブリン由来物質を測定することが
望まれるいずれのものであってもよく、例えば、長期透
析患者あるいは免疫異常、肺癌などの患者の血液、血
清、髄液、尿、腹水、胸水等を挙げることができる。
は、β2 −ミクログロブリン由来物質を測定することが
望まれるいずれのものであってもよく、例えば、長期透
析患者あるいは免疫異常、肺癌などの患者の血液、血
清、髄液、尿、腹水、胸水等を挙げることができる。
【００１７】以下、本発明を実施例に基づきより詳細に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１８】
【実施例】実施例１ Ｎ末端ペプチドに対する抗血清の調製 以下に示すＮ末端側のペプチドを化学合成した。 ペプチド１；Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys ペプチド２；Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Ly
s 次に、これらのペプチドをウシ血清アルブミン対し重量
比で１対２にグルタルアルデヒドを用いて結合させた。
この複合体を生理食塩水に1mg/mlの濃度で溶解した。こ
の溶液をFreund Complete Adjuvant と等量混合し、ウ
サギに１匹当り総蛋白量として0.8mg を皮内注射により
投与した。一ヶ月後に追加免疫を行いさらにその２週間
後から採血を行い、分採を繰り返して、抗血清を得た。
s 次に、これらのペプチドをウシ血清アルブミン対し重量
比で１対２にグルタルアルデヒドを用いて結合させた。
この複合体を生理食塩水に1mg/mlの濃度で溶解した。こ
の溶液をFreund Complete Adjuvant と等量混合し、ウ
サギに１匹当り総蛋白量として0.8mg を皮内注射により
投与した。一ヶ月後に追加免疫を行いさらにその２週間
後から採血を行い、分採を繰り返して、抗血清を得た。
【００１９】実施例２ ラジオイムノアッセイによる
ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質の定量 ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質濃度を、ヨウ
素１２５標識したペプチドを用いる競合法ラジオイムノ
アツセイにより測定した。
ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質の定量 ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質濃度を、ヨウ
素１２５標識したペプチドを用いる競合法ラジオイムノ
アツセイにより測定した。
【００２０】標識ペプチドの調製 合成ペプチド２すなわち、Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Gl
u-Asn-Gly-Lys を１.０mg/ml の濃度でホウ酸緩衝液（p
H8.5 ）に溶解し、9.25MBq のヨウ素１２５及びBOLTON-
HUNTER 試薬（第一化学薬品株式会社製）を混合、４
℃、１時間インキュベートしたのち、セフアデツクスＧ
−２５（PHARMACIA 、SWEDEN）カラムで単純ゲル濾過を
行って、未反応のヨウ素を除去した後用いた。
u-Asn-Gly-Lys を１.０mg/ml の濃度でホウ酸緩衝液（p
H8.5 ）に溶解し、9.25MBq のヨウ素１２５及びBOLTON-
HUNTER 試薬（第一化学薬品株式会社製）を混合、４
℃、１時間インキュベートしたのち、セフアデツクスＧ
−２５（PHARMACIA 、SWEDEN）カラムで単純ゲル濾過を
行って、未反応のヨウ素を除去した後用いた。
【００２１】ラジオイムノアツセイ測定方法 サンプルとしてヒト血清または尿または多発性腎嚢胞症
の長期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液
などを用いる。サンプル量は１００μｌを用いた。サン
プルに標識ペプチドを１００μｌ混合した後、0.3%ウシ
血清アルブミン含有ＰＢＳで3000倍希釈した抗ペプチド
２抗体を混合し24時間インキュベートした。さらに抗ウ
サギイムノグロブリン抗体をコートした磁性粒子（商標
名アマレックス−Ｍ、ダイナボツト）を混合し１２時間
放置したのち、磁石によりBOUND/FREE分離を行った。ガ
ンマカウンター（ＡＬＯＫＡ）により磁性粒子に結合し
た標識ペプチドを定量した。標準物質としては、Ｎ末端
側１０番目より１９番目のアミノ酸配列に相当する合成
ペプチド２を用いて検量線を作成した（図１）。また、
この系では、Ｃ末端側のアミノ酸配列に相当する合成ペ
プチド３及び通常のβ2 −ミクログロブリンには反応を
示さない。
の長期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液
などを用いる。サンプル量は１００μｌを用いた。サン
プルに標識ペプチドを１００μｌ混合した後、0.3%ウシ
血清アルブミン含有ＰＢＳで3000倍希釈した抗ペプチド
２抗体を混合し24時間インキュベートした。さらに抗ウ
サギイムノグロブリン抗体をコートした磁性粒子（商標
名アマレックス−Ｍ、ダイナボツト）を混合し１２時間
放置したのち、磁石によりBOUND/FREE分離を行った。ガ
ンマカウンター（ＡＬＯＫＡ）により磁性粒子に結合し
た標識ペプチドを定量した。標準物質としては、Ｎ末端
側１０番目より１９番目のアミノ酸配列に相当する合成
ペプチド２を用いて検量線を作成した（図１）。また、
この系では、Ｃ末端側のアミノ酸配列に相当する合成ペ
プチド３及び通常のβ2 −ミクログロブリンには反応を
示さない。
【００２２】サンプルの測定結果は表１に示した。
【表１】 表１ サンプル β2-ミクログロブリン由来物質濃度 ──────────────────────────── 正 常 者 尿 １〜 ３１ ng/ml 腎 嚢 胞 液 ２５０ ng/ml ────────────────────────────
【００２３】測定の結果、多発性腎嚢胞症を発症した長
期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液では
２５０ng/ml のβ2-ミクログロブリン由来物質が検出さ
れたが、正常人の尿中には１〜３１ng/ml と腎嚢胞液に
比較して非常に低い濃度であった。さらには、本測定系
は通常のβ2-ミクログロブリンには全く反応を示さなか
った。
期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液では
２５０ng/ml のβ2-ミクログロブリン由来物質が検出さ
れたが、正常人の尿中には１〜３１ng/ml と腎嚢胞液に
比較して非常に低い濃度であった。さらには、本測定系
は通常のβ2-ミクログロブリンには全く反応を示さなか
った。
【００２４】実施例３ 競合法のエンザイムノイムノ
アツセイによるヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物
質の定量 ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質濃度を、ビオ
チン標識したペプチドを用いる競合法エンザイムノイム
ノアツセイにより測定した。
アツセイによるヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物
質の定量 ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質濃度を、ビオ
チン標識したペプチドを用いる競合法エンザイムノイム
ノアツセイにより測定した。
【００２５】アッセイキットの作製 アツセイキツトは次の構成部分より成る。 ビオチン標識ペプチド 抗ペプチド２抗体固相マイクロタイタープレート 試薬A ；反応緩衝液；0.005%TWEEN-80および0.5%ウシ血
清アルブミン含有リン酸緩衝液(pH7.5) 試薬B ：洗浄液；0.005%TWEEN-80含有リン酸緩衝液(pH
7.5) 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビオチン複合
体（VECTASTAIN) オルトフエニレンジアミン溶液; オルトフエニレンジア
ミン(SIGMA) １錠を希釈緩衝液（0.1Mリン酸ナトリウム
-50mM クエン酸-0.05%フエリオックス（pH5.0）10mlに
溶解し、300 μｌの0.6%過酸化水素水を混合する。使用
直前に調製する1.5 規定 硫酸
清アルブミン含有リン酸緩衝液(pH7.5) 試薬B ：洗浄液；0.005%TWEEN-80含有リン酸緩衝液(pH
7.5) 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビオチン複合
体（VECTASTAIN) オルトフエニレンジアミン溶液; オルトフエニレンジア
ミン(SIGMA) １錠を希釈緩衝液（0.1Mリン酸ナトリウム
-50mM クエン酸-0.05%フエリオックス（pH5.0）10mlに
溶解し、300 μｌの0.6%過酸化水素水を混合する。使用
直前に調製する1.5 規定 硫酸
【００２６】標識ペプチドの調製 合成ペプチド２すなわちTyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-
Asn-Gly-Lys を3.5mg/mlの濃度で100mM 炭酸ナトリウム
緩衝液(pH8.5) に溶解し、1/10量のビオチン化試薬（Su
lfosuccinimidyl 6-(biotinamido) Hexanoate ,PIRCE
製）を混合、室温で２時間インキュベートしたのちグリ
シン2.7mg で反応を停止させた。精製はODS120T （東ソ
−）を用いた逆相クロマトグラフイ−により行った。カ
ラムを0.1%トリフルオロ酢酸、1%アセトニトリルで平衡
化した後標識ペプチド混合物を添加した。0.1%トリフル
オロ酢酸、80% アセトニトリルの直線的濃度勾配により
溶出をおこない、220nm の吸光度を指標にして、ピーク
を分取した。
Asn-Gly-Lys を3.5mg/mlの濃度で100mM 炭酸ナトリウム
緩衝液(pH8.5) に溶解し、1/10量のビオチン化試薬（Su
lfosuccinimidyl 6-(biotinamido) Hexanoate ,PIRCE
製）を混合、室温で２時間インキュベートしたのちグリ
シン2.7mg で反応を停止させた。精製はODS120T （東ソ
−）を用いた逆相クロマトグラフイ−により行った。カ
ラムを0.1%トリフルオロ酢酸、1%アセトニトリルで平衡
化した後標識ペプチド混合物を添加した。0.1%トリフル
オロ酢酸、80% アセトニトリルの直線的濃度勾配により
溶出をおこない、220nm の吸光度を指標にして、ピーク
を分取した。
【００２７】抗ペプチド２抗体固相マイクロタイタープ
レートの作製 抗ペプチド２抗血清を硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ
−セフアロ−スによるイオン交換クロマトグラフイーに
より免疫グロブリンＧ分画にしたのち、抗ウシ血清アル
ブミン抗体成分を固相吸収した。炭酸ナトリウム緩衝液
(pH8.5) を用いて、３μｇ／ｍｌに希釈し、96穴マイク
ロタイタ−プレ−ト（NUNC) に１００μｌ添加し、一晩
４度でインキユベ−トした。試薬Ｂで洗浄後試薬Ａでブ
ロッキングを行った。使用直前に試薬Ｂで洗浄して用い
た。
レートの作製 抗ペプチド２抗血清を硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ
−セフアロ−スによるイオン交換クロマトグラフイーに
より免疫グロブリンＧ分画にしたのち、抗ウシ血清アル
ブミン抗体成分を固相吸収した。炭酸ナトリウム緩衝液
(pH8.5) を用いて、３μｇ／ｍｌに希釈し、96穴マイク
ロタイタ−プレ−ト（NUNC) に１００μｌ添加し、一晩
４度でインキユベ−トした。試薬Ｂで洗浄後試薬Ａでブ
ロッキングを行った。使用直前に試薬Ｂで洗浄して用い
た。
【００２８】エンザイムノイムノアツセイ サンプルとしてヒト血清または尿または多発性腎嚢胞症
の長期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液
などを用いた。サンプルは試薬A で希釈して用いた。抗
ペプチド２抗体固相マイクロタイタープレートに希釈し
たサンプルを１００μｌ添加し、室温10分インキユベー
ト後、試薬A で2000倍希釈したビオチン標識ペプチドを
１００μｌ添加、混合した。３７度３０分反応後、試薬
Ｂで洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジ
ンビオチン複合体（VECTASTAIN)を試薬Ｂで1000倍希釈
し、１００μｌ添加する。３７度３０分インキユベート
後、試薬Ｂにて洗浄した。オルトフエニレンジアミン溶
液を１００μｌ添加後室温で３０分インキユベートし、
1.5 規定硫酸にて反応を停止した。各ウエルの吸光度を
主波長492nm 、副波長630nm で測定した。検量線は非標
識のペプチド２を用いて、作成した（図２）。
の長期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液
などを用いた。サンプルは試薬A で希釈して用いた。抗
ペプチド２抗体固相マイクロタイタープレートに希釈し
たサンプルを１００μｌ添加し、室温10分インキユベー
ト後、試薬A で2000倍希釈したビオチン標識ペプチドを
１００μｌ添加、混合した。３７度３０分反応後、試薬
Ｂで洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジ
ンビオチン複合体（VECTASTAIN)を試薬Ｂで1000倍希釈
し、１００μｌ添加する。３７度３０分インキユベート
後、試薬Ｂにて洗浄した。オルトフエニレンジアミン溶
液を１００μｌ添加後室温で３０分インキユベートし、
1.5 規定硫酸にて反応を停止した。各ウエルの吸光度を
主波長492nm 、副波長630nm で測定した。検量線は非標
識のペプチド２を用いて、作成した（図２）。
【００２９】検体を測定した結果は表２に示した。
【表２】 表２ サンプル β2-ミクログロブリン由来物質濃度 ──────────────────────────── 正常者尿 ０〜 ２ ng/ml 腎嚢胞液 ２０００ ng/ml 正常者血清 ２ ng/ml ──────────────────────────── 測定の結果、多発性腎嚢胞症を発症した長期透析患者の
腎より手術によって採取した腎嚢胞液では2000ng/ml の
β2-ミクログロブリン由来物質が検出されたが、正常人
の尿及び血清中には当該物質は非常に低い濃度でしか検
出されなかった。さらには、本測定系は通常のβ2-ミク
ログロブリンには全く反応を示さなかった。
腎より手術によって採取した腎嚢胞液では2000ng/ml の
β2-ミクログロブリン由来物質が検出されたが、正常人
の尿及び血清中には当該物質は非常に低い濃度でしか検
出されなかった。さらには、本測定系は通常のβ2-ミク
ログロブリンには全く反応を示さなかった。
【００３０】実施例４ サンドイツチ法エンザイムノ
イムノアツセイによるヒト由来β2 −ミクログロブリン
由来物質の定量 （その１） ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質濃度を、抗ペ
プチド２抗体を固相化し、同じ抗体をビオチン標識して
二次抗体として用いるサンドイッチ法エンザイムノイム
ノアツセイにより測定した。
イムノアツセイによるヒト由来β2 −ミクログロブリン
由来物質の定量 （その１） ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質濃度を、抗ペ
プチド２抗体を固相化し、同じ抗体をビオチン標識して
二次抗体として用いるサンドイッチ法エンザイムノイム
ノアツセイにより測定した。
【００３１】アッセイキットの作製 アツセイキツトは次の構成部分より成る。 標準物質、ペプチド５；β2 −ミクログロブリンのアミ
ノ酸配列のＮ末端より１番目から１９番目までのペプチ
ド。すなわちIle-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Ty
r-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys 抗ペプチド２抗体固相マイクロタイタープレート ビオチン標識抗ペプチド２抗体 試薬A ；反応緩衝液；0.005%TWEEN-80および0.15% ゼラ
チン含有リン酸緩衝液(pH7.5) 試薬B ：洗浄液；0.005%TWEEN-80含有リン酸緩衝液(pH
7.5) 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビオチン複合
体（VECTASTAIN） オルトフエニレンジアミン溶液; 実施例３に同じ。 1.5 規定 硫酸
ノ酸配列のＮ末端より１番目から１９番目までのペプチ
ド。すなわちIle-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Ty
r-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys 抗ペプチド２抗体固相マイクロタイタープレート ビオチン標識抗ペプチド２抗体 試薬A ；反応緩衝液；0.005%TWEEN-80および0.15% ゼラ
チン含有リン酸緩衝液(pH7.5) 試薬B ：洗浄液；0.005%TWEEN-80含有リン酸緩衝液(pH
7.5) 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビオチン複合
体（VECTASTAIN） オルトフエニレンジアミン溶液; 実施例３に同じ。 1.5 規定 硫酸
【００３２】抗ペプチド２抗体固相マイクロタイタープ
レートの作製 抗ペプチド２抗血清を硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ
ーセフアロースによるイオン交換クロマトグラフイーに
より免疫グロブリンＧ分画にしたのち、抗ウシ血清アル
ブミン抗体成分を固相吸収した。炭酸ナトリウム緩衝液
(pH8.5) を用いて、３μｇ／ｍｌに希釈し、96穴マイク
ロタイタ−プレ−ト（NUNC) に100μｇ添加し、一晩４
度でインキユベ−トした。試薬Ｂで洗浄後試薬Ａでブロ
ッキングを行った。使用直前に試薬Ｂで洗浄して用い
た。
レートの作製 抗ペプチド２抗血清を硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ
ーセフアロースによるイオン交換クロマトグラフイーに
より免疫グロブリンＧ分画にしたのち、抗ウシ血清アル
ブミン抗体成分を固相吸収した。炭酸ナトリウム緩衝液
(pH8.5) を用いて、３μｇ／ｍｌに希釈し、96穴マイク
ロタイタ−プレ−ト（NUNC) に100μｇ添加し、一晩４
度でインキユベ−トした。試薬Ｂで洗浄後試薬Ａでブロ
ッキングを行った。使用直前に試薬Ｂで洗浄して用い
た。
【００３３】ビオチン標識抗ペプチド２抗体の作製 抗ペプチド２抗血清を硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ
−セフアロ−スによるイオン交換クロマトグラフイーに
より免疫グロブリンＧ分画にしたのち、抗ウシ血清アル
ブミン抗体成分を固相吸収した。炭酸緩衝液(pH8.5) に
透析した後、Sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido) Hexa
noate を５分の１量を添加し室温で２時間インキュベー
トする。１７倍量のグリシン10mgで反応を停止した後20
mMトリスー塩酸、150mM 塩化ナトリウムー0.1%アジ化ナ
トリウム（pH7.5 ）に対して透析した。
−セフアロ−スによるイオン交換クロマトグラフイーに
より免疫グロブリンＧ分画にしたのち、抗ウシ血清アル
ブミン抗体成分を固相吸収した。炭酸緩衝液(pH8.5) に
透析した後、Sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido) Hexa
noate を５分の１量を添加し室温で２時間インキュベー
トする。１７倍量のグリシン10mgで反応を停止した後20
mMトリスー塩酸、150mM 塩化ナトリウムー0.1%アジ化ナ
トリウム（pH7.5 ）に対して透析した。
【００３４】エンザイムノイムノアツセイ サンプルとしてヒト血清または尿または多発性腎嚢胞症
の長期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液
などを用いた。サンプルは試薬A で希釈して用いた。抗
ペプチド２抗体固相マイクロタイタープレートに試薬A
で希釈したサンプルまたは標準液を１００μｌ添加し、
４℃で一晩インキユベート後、試薬B で洗浄する。試薬
A で1000倍希釈したビオチン標識抗ペプチド２抗体を１
００μｌ添加、混合する。３７℃３０分反応後、試薬Ｂ
で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジン
ビオチン複合体（VECTASTAIN）を試薬Ｂで1000倍希釈
し、１００μｌ添加した。３７度３０分インキユベート
後、試薬Ｂにて洗浄する。オルトフエニレンジアミン溶
液を１００μｌ添加後室温で１０分インキユベートし、
1.5 規定硫酸にて反応を停止する。各ウエルの吸光度を
主波長492nm 、副波長630nm で測定した。
の長期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液
などを用いた。サンプルは試薬A で希釈して用いた。抗
ペプチド２抗体固相マイクロタイタープレートに試薬A
で希釈したサンプルまたは標準液を１００μｌ添加し、
４℃で一晩インキユベート後、試薬B で洗浄する。試薬
A で1000倍希釈したビオチン標識抗ペプチド２抗体を１
００μｌ添加、混合する。３７℃３０分反応後、試薬Ｂ
で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジン
ビオチン複合体（VECTASTAIN）を試薬Ｂで1000倍希釈
し、１００μｌ添加した。３７度３０分インキユベート
後、試薬Ｂにて洗浄する。オルトフエニレンジアミン溶
液を１００μｌ添加後室温で１０分インキユベートし、
1.5 規定硫酸にて反応を停止する。各ウエルの吸光度を
主波長492nm 、副波長630nm で測定した。
【００３５】検量線は、標準物質としてペプチド５；β
2 −ミクログロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より１番
目から１９番目までのペプチドを用いて作成した（図
３）。また、この測定系はペプチド２（β2 −ミクログ
ロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より１０番目から１９
番目）に対して反応したが、通常のβ2 −ミクログロブ
リンに対しての反応は検出されなかった。
2 −ミクログロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より１番
目から１９番目までのペプチドを用いて作成した（図
３）。また、この測定系はペプチド２（β2 −ミクログ
ロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より１０番目から１９
番目）に対して反応したが、通常のβ2 −ミクログロブ
リンに対しての反応は検出されなかった。
【００３６】サンプルとしてヒト血清または尿または多
発性腎嚢胞症の長期透析患者の腎より手術によって採取
した腎嚢胞液及び透析アミロイドーシス患者血清などを
測定した結果は表３に示した。
発性腎嚢胞症の長期透析患者の腎より手術によって採取
した腎嚢胞液及び透析アミロイドーシス患者血清などを
測定した結果は表３に示した。
【表３】 表３ サンプル β2-ミクログロブリン由来物質濃度 ──────────────────────────── 正 常 者 尿 ０〜１ ng/ml 腎 嚢 胞 液 １００００ ng/ml 正常者血清 ０〜１ ng/ml 透析アミロイドーシス 患者血清 １３０ ng/ml ──────────────────────────── 測定の結果、多発性腎嚢胞症を発症した長期透析患者の
腎より手術によって採取した腎嚢胞液では 10000ng/ml
のβ2-ミクログロブリン由来物質が検出された。また、
透析アミロイドーシス患者血清中には130ng/mlのβ2 −
ミクログロブリン由来物質が検出された。しかし、正常
人の尿及び血清中には当該物質は非常に低い濃度でしか
検出されなかった。
腎より手術によって採取した腎嚢胞液では 10000ng/ml
のβ2-ミクログロブリン由来物質が検出された。また、
透析アミロイドーシス患者血清中には130ng/mlのβ2 −
ミクログロブリン由来物質が検出された。しかし、正常
人の尿及び血清中には当該物質は非常に低い濃度でしか
検出されなかった。
【００３７】実施例５ サンドイツチ法エンザイムノ
イムノアツセイによるヒト由来β2 −ミクログロブリン
由来物質の定量（その２） ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質濃度を、抗ペ
プチド１抗体を固相化し、ビオチン標識抗ペプチド２抗
体を二次抗体として用いるサンドイッチ法エンザイムノ
イムノアツセイにより測定した。
イムノアツセイによるヒト由来β2 −ミクログロブリン
由来物質の定量（その２） ヒト由来β2 −ミクログロブリン由来物質濃度を、抗ペ
プチド１抗体を固相化し、ビオチン標識抗ペプチド２抗
体を二次抗体として用いるサンドイッチ法エンザイムノ
イムノアツセイにより測定した。
【００３８】アッセイキットの作製 アツセイキツトは次の構成部分より成る。 標準物質、ペプチド５；β2 −ミクログロブリンのアミ
ノ酸配列のＮ末端より１番目から１９番目までのペプチ
ド。 抗ペプチド１抗体固相マイクロタイタープレート ビオチン標識抗ペプチド２抗体 試薬A ；反応緩衝液；0.005%TWEEN-80および0.15% ゼラ
チン含有リン酸緩衝液(pH7.5) 試薬B ：洗浄液；0.005%TWEEN-80含有リン酸緩衝液(pH
7.5) 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビオチン複合
体（VECTASTAIN） オルトフエニレンジアミン溶液; 実施例３に同じ。1.5
規定硫酸
ノ酸配列のＮ末端より１番目から１９番目までのペプチ
ド。 抗ペプチド１抗体固相マイクロタイタープレート ビオチン標識抗ペプチド２抗体 試薬A ；反応緩衝液；0.005%TWEEN-80および0.15% ゼラ
チン含有リン酸緩衝液(pH7.5) 試薬B ：洗浄液；0.005%TWEEN-80含有リン酸緩衝液(pH
7.5) 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビオチン複合
体（VECTASTAIN） オルトフエニレンジアミン溶液; 実施例３に同じ。1.5
規定硫酸
【００３９】抗ペプチド１抗体固相マイクロタイタープ
レートの作製 抗ペプチド１抗血清を硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ
−セフアロ−スによるイオン交換クロマトグラフイーに
より免疫グロブリンＧ分画にしたのち、抗ウシ血清アル
ブミン抗体成分を固相吸収した。炭酸ナトリウム緩衝液
(pH8.5) を用いて、５μｇ／ｍｌに希釈し、96穴マイク
ロタイタ−プレ−ト（NUNC) に１００μｌ添加し、一晩
４度でインキユベ−トした。試薬Ｂで洗浄後試薬Ａでブ
ロッキングを行った。使用直前に試薬Ｂで洗浄して用い
た。
レートの作製 抗ペプチド１抗血清を硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ
−セフアロ−スによるイオン交換クロマトグラフイーに
より免疫グロブリンＧ分画にしたのち、抗ウシ血清アル
ブミン抗体成分を固相吸収した。炭酸ナトリウム緩衝液
(pH8.5) を用いて、５μｇ／ｍｌに希釈し、96穴マイク
ロタイタ−プレ−ト（NUNC) に１００μｌ添加し、一晩
４度でインキユベ−トした。試薬Ｂで洗浄後試薬Ａでブ
ロッキングを行った。使用直前に試薬Ｂで洗浄して用い
た。
【００４０】ビオチン標識抗ペプチド２抗体の作製 実施例４と同様にして作製した。
【００４１】エンザイムノイムノアツセイ サンプルとしてヒト血清または尿または多発性腎嚢胞症
の長期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液
などを用いた。サンプルは試薬A で希釈して用いた。抗
ペプチド１抗体固相マイクロタイタープレートに試薬A
で希釈したサンプルまたは標準液を１００μｌ添加し、
４℃で一晩インキユベート後、試薬B で洗浄した。試薬
A で1000倍希釈したビオチン標識抗ペプチド２抗体を10
0ul 添加、混合した。３７℃、３０分反応後、試薬Ｂで
洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビ
オチン複合体（VECTASTAIN）を試薬Ｂで1000倍希釈し、
１００μｌ添加する。３７℃、３０分インキユベート
後、試薬Ｂにて洗浄した。オルトフエニレンジアミン溶
液を１００μｌ添加後室温で３０分インキユベートし、
1.5 規定硫酸にて反応を停止した。各ウエルの吸光度を
主波長492nm 、副波長630nm で測定した。
の長期透析患者の腎より手術によって採取した腎嚢胞液
などを用いた。サンプルは試薬A で希釈して用いた。抗
ペプチド１抗体固相マイクロタイタープレートに試薬A
で希釈したサンプルまたは標準液を１００μｌ添加し、
４℃で一晩インキユベート後、試薬B で洗浄した。試薬
A で1000倍希釈したビオチン標識抗ペプチド２抗体を10
0ul 添加、混合した。３７℃、３０分反応後、試薬Ｂで
洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビ
オチン複合体（VECTASTAIN）を試薬Ｂで1000倍希釈し、
１００μｌ添加する。３７℃、３０分インキユベート
後、試薬Ｂにて洗浄した。オルトフエニレンジアミン溶
液を１００μｌ添加後室温で３０分インキユベートし、
1.5 規定硫酸にて反応を停止した。各ウエルの吸光度を
主波長492nm 、副波長630nm で測定した。
【００４２】検量線は、標準物質としてペプチド５；β
2 −ミクログロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より１番
目から１９番目までのペプチドを用いて作成した。（図
４）また、この測定系では通常のβ2 −ミクログロブリ
ンに対しての反応は検出されなかった。
2 −ミクログロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より１番
目から１９番目までのペプチドを用いて作成した。（図
４）また、この測定系では通常のβ2 −ミクログロブリ
ンに対しての反応は検出されなかった。
【００４３】サンプルとしてヒト血清または尿または多
発性腎嚢胞症の長期透析患者の腎より手術によって採取
した腎嚢胞液などを測定した結果は表４に示した。
発性腎嚢胞症の長期透析患者の腎より手術によって採取
した腎嚢胞液などを測定した結果は表４に示した。
【表４】 表４ サンプル β2-ミクログロブリン由来物質濃度 正 常 者 尿 ０〜１ ng/ml 腎 嚢 胞 液 ５２００ ng/ml 正常者血清 ７ ng/ml 透析アミロイドーシス 患者血清 ２０ ng/ml 測定の結果、多発性腎嚢胞症を発症した長期透析患者の
腎より手術によって採取した腎嚢胞液では5200ng/ml の
β2-ミクログロブリン由来物質が検出された。また、透
析アミロイドーシス患者血清中には 20ｎｇ／ｍｌのβ
2 −ミクログロブリン由来物質が検出された。しかし、
正常人の尿中には当該物質はほとんど検出されなかっ
た。また、正常人の血清から検出されたβ2-ミクログロ
ブリン由来物質濃度は7ng/mlと低い濃度を示した。
腎より手術によって採取した腎嚢胞液では5200ng/ml の
β2-ミクログロブリン由来物質が検出された。また、透
析アミロイドーシス患者血清中には 20ｎｇ／ｍｌのβ
2 −ミクログロブリン由来物質が検出された。しかし、
正常人の尿中には当該物質はほとんど検出されなかっ
た。また、正常人の血清から検出されたβ2-ミクログロ
ブリン由来物質濃度は7ng/mlと低い濃度を示した。
【００４４】
【発明の効果】本発明はヒト体液等に含まれるβ2-ミク
ログロブリン由来物質を通常のβ2-ミクログロブリンの
影響を受けることなく迅速かつ定量的に測定することを
可能とするものである。特に長期透析患者の体液成分を
測定することにより、アミロイドーシスによる手根管症
候群などの骨関節症状の発症のマーカーとして、また、
他の疾患の病態把握をする為に従来行われているβ2-ミ
クログロブリンの測定と比較してより正確に行うことが
可能となる
ログロブリン由来物質を通常のβ2-ミクログロブリンの
影響を受けることなく迅速かつ定量的に測定することを
可能とするものである。特に長期透析患者の体液成分を
測定することにより、アミロイドーシスによる手根管症
候群などの骨関節症状の発症のマーカーとして、また、
他の疾患の病態把握をする為に従来行われているβ2-ミ
クログロブリンの測定と比較してより正確に行うことが
可能となる
【図１】抗ペプチド２抗体を用いた競合法によるラジオ
イムノアツセイ法の検量線を示した図である。
イムノアツセイ法の検量線を示した図である。
【図２】抗ペプチド２抗体を用いた競合法によるエンザ
イムノイムノアツセイ法の検量線を示した図である。
イムノイムノアツセイ法の検量線を示した図である。
【図３】 固相抗体として抗ペプチド２抗体、ま
た標識抗体として同じ抗ペプチド２抗体を用いたサンド
イッチ法によるエンザイムノイムノアツセイ法の検量線
を示した図である。
た標識抗体として同じ抗ペプチド２抗体を用いたサンド
イッチ法によるエンザイムノイムノアツセイ法の検量線
を示した図である。
【図４】固相抗体として抗ペプチド１抗体、また標識抗
体として抗ペプチド２抗体を用いたサンドイッチ法によ
るエンザイムノイムノアツセイ法の検量線を示した図で
ある。
体として抗ペプチド２抗体を用いたサンドイッチ法によ
るエンザイムノイムノアツセイ法の検量線を示した図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−299767（ＪＰ，Ａ) Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ，Ｖｏｌ．36，Ｎｏ．４，Ｐ. 675−681（1989) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．168, Ｎｏ．３，Ｐ．1223−1229（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 C07K 16/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 通常のβ2 −ミクログロブリンとは反応
せず、β2 −ミクログロブリンのＮ末端側１番目より１
９番目のアミノ酸配列の全体またはその一部分に特異的
に反応する抗体。 - 【請求項２】 β2 −ミクログロブリンのＮ末端側１番
目より１０番目のアミノ酸配列の全体またはその一部分
に特異的に反応する請求項１記載の抗体。 - 【請求項３】 β2 −ミクログロブリンのＮ末端側１０
番目より１９番目のアミノ酸配列の全体またはその一部
分に特異的に反応する請求項１記載の抗体。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の抗体とβ2 −ミクログロブリン由来物質との特異的反
応を利用して該β2 −ミクログロブリン由来物質を測定
することから成るβ2 −ミクログロブリン由来物質の免
疫測定方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP25071192A JP3155626B2 (ja) | 1992-08-26 | 1992-08-26 | 抗β２−ミクログロブリン由来物質抗体及びそれを用いるβ２−ミクログロブリン由来物質の免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25071192A JP3155626B2 (ja) | 1992-08-26 | 1992-08-26 | 抗β２−ミクログロブリン由来物質抗体及びそれを用いるβ２−ミクログロブリン由来物質の免疫測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0674954A JPH0674954A (ja) | 1994-03-18 |
| JP3155626B2 true JP3155626B2 (ja) | 2001-04-16 |
Family
ID=17211919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25071192A Expired - Fee Related JP3155626B2 (ja) | 1992-08-26 | 1992-08-26 | 抗β２−ミクログロブリン由来物質抗体及びそれを用いるβ２−ミクログロブリン由来物質の免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3155626B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003161732A (ja) * | 2001-11-28 | 2003-06-06 | Itoham Foods Inc | 神経ペプチドの定量方法 |
-
1992
- 1992-08-26 JP JP25071192A patent/JP3155626B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１６８，Ｎｏ．３，Ｐ．１２２３−１２２９（１９９０） |
| Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．４，Ｐ．６７５−６８１（１９８９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0674954A (ja) | 1994-03-18 |
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