JPH05500111A

JPH05500111A - 還元的にグリコシル化されたｎ―末端アミノ酸に向けられた抗原を使用するグリコシル化されたタンパクの免疫学的測定法

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Publication number: JPH05500111A
Application number: JP2512516A
Authority: JP
Inventors: アンダーソン　バイロン　イー; ディヴィス　ライマン　イー
Original assignee: ノースウェスターン　ユニヴァーシティ
Priority date: 1989-08-23
Filing date: 1990-08-17
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2016-01-15
Also published as: DE69028784D1; EP0487621B1; EP0487621A1; AU6346690A; JP3124028B2; EP0487621A4; ATE143673T1; WO1991002978A1; DE69028784T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、グリコジル化されたタンパクを検出及び定量する方法に関する。更に詳しくは、本発明は、そのアミノ末端（Ｎ−末端）アミノ酸上でグリコジル化されたタンパクを検出及び定量するための免疫学的測定法に関する。かかるタンパクの１つは、ヘモグロビンＡ、、（ＨｂＡ、Ｃ）であって、本発明は、特にＨｂＡｌｃを検出及び定量するだめの免疫学的測定法に向けられている。本発明は、また、本発明の免疫学的測定法で使用される還元されたグリコジル化Ｎ−末端アミノ酸に特異的な抗体及びこれら抗体を作るための免疫原及び方法に関する。

生体内でのタンパクのグリコジル化（「グリケーション」ともいう）は、酵素的かまたは非酵素的かのいずれかで起こり得る。非酵素的なグリコジル化においては、糖は、タンパクの中の有効なりジン残基のε−アミノ基または近づき易いアミノ末端（Ｎ−末端）アミノ酸のα−アミノ基と共有結合でカップリングする。

タンパクのグルコースとの非酵素的なグリコジル化は２段階で進行する。まず、グルコースがリジンまたはＮ−末端アミノ酸のアミノ基と結合して、アルジミン化合物（１種のシッフ塩基）を形成する。この反応は可逆反応であり、容易に未修飾タンパクとグルコースに解離する。次に、アルジミン中間体は、アマトリ転位によって安定なケトアミン誘導体（１−デオキシフルクトース）に転化する。

最終的に、数週間を要してケトアミン誘導体のフリーのカルボニルがグリコジル化タンパク及び隣接タンパクの間に架橋を形成し、得られた凝集塊が高グリコジル化生成物と呼ばれる。

非酵素的なグリコジル化は、通常の畷乳類で起こり、糖尿病患者において広範囲に起こる。糖尿病に苦しむ患者は通常の方法でグルコースを代謝することができないので、血中及び尿中においてグルコースの量が増加する。かかるグリコジル化は正常個体においてよりも糖尿病個体において広範囲に起こるとはいえ、糖尿病個体及び正常個体において、グルコースは、ヘモグロビン、コラーゲン、アルブミン、水晶体、フィブリノーゲン、リポタンパク、フェリチン、ミニリン、トランスフェリン、及びイムノグロブリンを包む多くのタンパクのアミノ基に非酵素的に結合することが分かってきた。

糖尿病患者におけるグリコジル化タンパクの定量的測定は２つの理由で臨床的に重要である。第１に、グリコジル化タンパク濃度の測定は長期間にわたる血中グルコース濃度のモニタリングを可能にし、かつ、糖尿病患者の代謝コントロールの評価を可能にする。平均血中グルコース濃度を決める期間は、所定の被分析タンパクが正常に血液循環中に存在している期間の長さに大きく拘束される。通常、トランスフェリン及びヒト血清アルブミンは、短期間から中期間、血液循環中に存在しくトランスフェリンの半減期は約８日で、アルブミンの半減期は約１０〜１４日である）、そのグリコジル化体の測定は短期開城血症から中間期間糖血症を評価する手段を提供する。通常、ヘモグロビンは血液循環中に長期間存在しくヘモグロビンの半減期は約２〜３カ月である）、グリコジル化ヘモグロビンの測定は、長期間糖血症を評価する手段を提供する。

第２に、非酵素的なグリコジル化は、加速性白内障形成（水晶体タンパクの増進したグリコジル化生成物による）及び心臓、脳、眼、腎臓、及び抹消の血管を狭くする一因であるアテローム発生（動脈血管壁上でのりボタンパクエンラップメントによる）を含む慢性糖尿病合併症の発生と関わってきた。従って、グリコジル化タンパク及びそれらの増進した生成物の測定は、慢性高血糖症に包含される病理学的続発症における予後徴候評価法の一部であるということができる。

ヒトヘモグロビンの主成分（総ヘモグロビンの約８０〜９０％）はＨｂＡ、である。それは２つのα鎮及び２つのβ鎖を含む４部分構造を有する。Ｈｂ　Ａ　ｏはそのＮ−末端アミノ酸でグリコジル化されない。イオン交換クロマトグラフィーで単離したＨｂＡＯ試料は、リジンの有効なε−アミノ基上でグリコジル化されたＨｂＡｏ分子が小さな割合で含まれていることを示している。

ＨｂＡ、、Ｉ　、ＨｂＡｌ、２　、ＨｂＡ、、及びＨｂＡ、ｃは、β鎖のＮ−末端バリン残基と共有結合している糖残基の存在を除いては、ＨｂＡｏと構造上同一性のあるヒトヘモグロビンの微量成分である。ＨｂＡｌ、＋　、ＨｂＡｌ−ｉ及びＨｂＡ、ｃのバリン残基と結合している糖残基は、それぞれ、フルクトース・ジホスフェート、グルコース−６−ホスフェート及び１−デオキシフルクトースである。Ｈｂ　Ａ　１ｂにおいてバリンと結合している糖は知られていない。

正常人にお０ては、総ヘモグロビンの約４〜５％がＨｂＡｌｃであるが、糖尿病患者においてはその量は実質的に高く、一般には約８〜１０％であるが時には２０％になることもある。また、その濃度は糖尿病コントロールとの関連で幅広く変化する。

ＨｂＡ、ｃは、臨床上の目的で最も頻繁に測定されるグリコジル化タンパクであり、それを測定するため多くの試験方法が開発されてきた。例えば、ファース（Ｆ２９、６９２号を参照のこと。しかしながら、今では４つの方法だけが臨床的に使用されていると思われる：（１）ｍ−アミノフェニルボロネートカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー法：（２）陽イオン交換クロマトグラフィー法：（３）電気泳動法；及び（４）等電点電気泳動法である。

現在、臨床的に使用されているこの４つ測定技術の各々は、次の不都合を１つまたはそれ以上有している：測定サンプル当たり比較的コストが高いこと：測定される分析対象物に対する特異性が欠けていること；イオン強度、ｐＨ及び温度の如き条件の僅かな変化に敏感であること；標準化が難しいこと；再現性が欠けていること；時間を消耗し重労働であること；自動化ができないこと；及び多くのサンプルを同時に分析するのが困難なことである。米国特許第４．６２９．６９２号：ファース；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７５．３４７−６０　（１９８８）；　ビーコ、ツク、ＬＣｌｉｎ、　Ｐａｔｈｏ、、　３７．８４１−５１　（１９８４）を参照のこと。

グリコジル化タンパク、特にＨｂＡ、ｃを測定する免疫学的測定法は知られている。しかしながら、ＨｂＡｌ　ｃの測定のために臨床的に使用されているものはないと思われる。これから、これら多様な免疫学的測定技術、及びそれらに使用する抗原及び抗体について議論する。

まず、ヨーロッパ特許出願第２０１．１８７号は、精製したＨｂＡ、ｃを使用するモノクローナル抗体の調製を記載している。特に、咳出願は、ＨｂＡｌｅのβ 鎖のＮ−末端バリン残基のそれの如き、ヘモグロビンのグリコジル化されたアミン基に優先的に結合するモノクローナル抗体の調製を報告している。特に、その配列がＨｂＡｌｃのβ鎖のＮ−末端の配列と一致しているグリコジル化されたヘプタペプチドは、これらモノクローナル抗体のうちの１つのＨｂＡ、ｃに対する結合を阻害した。これに反して、非グリコジル化へブタペプチド及び還元されたグリコジル化へブタペプチドはこの結合を阻害しなかった。該特許は、これらモノクローナル抗体がＨｂＡ、ｃを定量する公知の免疫学的測定法において使用できることを教示している。３２０のハイブリドーマのうち２つじかＨｂＡ、ｃと優先的に反応するモノクローナル抗体を産生じないということは注目すべきであり、このことは、ＨｂＡｌｃに特異的な抗体は、通常、免疫された動物によっては僅かしか産生されないことを示唆している。

米国特許第４．６２９．６９２号（ディーン）は、体液中の非酵素的にグリコジル化された総タンパク及び総タンパクフラグメントを決定する免疫学的測定法を教示している。該免疫学的測定法は、アマドリー転位グルコース残基（即ち、１ −デオキシ−Ｄ−フルクトシル残基）を選択的に認識し結合する抗体を使用している。

咳抗体を調製するために使用する免疫原は、キャリアー分子と共有結合しているアマドリー転位グルコースである。ポリリジンは好ましいキャリアーであり、アマドリー転位グルコースは好ましくはりジン残基のε−アミノ基に結合している。

免疫原は、生体外で非酵素的にキャリアーをグリコジル化することによって調製される。アマドリー転位グルコースとキャリアーの間に連結基を使用することができる。好ましい連結基はリジンである。オルニチン及びヒドロキシルリジンの如きリジン類似物及びアミノ−機能化されたアミノ酸を含む他の連結基を使用してもよい。

上記の如くして調製した抗体を、血清の如き体液中のグリコジル化された総タンパクを定量するため通常の免疫学的測定法で使用して、血清の如き体液中のグリコジル化タンパクを定量することができる。ＨｂＡｌｃの如き特定のグリコジル化タンパクの濃度を決定するには、最初にそれを他の非酵素的にグリコジル化されたタンパクから分離しなければならない。例えば、ディーン特許は、ＨｂＡｌｃはフェニルボロネートアフィニティークロマトグラフィーで分離し、次いで、開示された抗体を使用して定量できると教示している。

米国特許第４．６５８．０２２号（’　０２２特許）は、タンパクの線状ペプチド・エピトープに対する抗体の調製を開示している。該線状ペプチド・エピトープは、タンパク配列の何らかの部分の２〜１５のアミノ酸（Ｎ−末端、Ｃ−末端または他の部分）を含んでおり、炭水化物の如き非ペプチド基で修飾されていてもよい。該線状ペプチド・エピトープは、動物を免疫するために免疫原キャリアーと力、ツブリングしている。免疫学的測定を行うため、該抗体を、該抗体の調製に使用した線状ペプチド・エピトープを露出するようまたはその露出を増加するよう充分に変性したタンパクと接触させる。モノクローナル抗体を使用するのが好ましＬ）。

゛０２２特許及び米国特許第４．６４７．６５４号（’　６５４特許）は、上記の系において、免疫原キャリアーとカップリングしているヘモグロビンのＮ−末端配列の少なくとも２つのアミノ酸、好ましくは５〜１５のアミノ酸を含有するグリコジル化されたペプチドを使用して、抗体を調製することを教示している。

°６５４特許は、抗原性及びカップリング特性をできるだけ効率的にする連結基を該ペプチド・エピトープと該キャリアーの間に使用し得ることを教示している。該連結基は、ヘモグロビンの正常配列には見出されていない１またはそれ以上のアミノ酸を含んでもよい。両特許は、ＨｂＡ＋ｃ分子がエピトープを露出するよう変性されたときに、この方法で、グリコジル化された合成ペプチド及び対応するＨｂＡ、ｅ分子上のエピトープに特異的なモノクローナル抗体を産生じ得ることを教示している。これら抗体は、ＨｂＡｏまたはグリコジル化されていないペプチドとは交差反応をしない。使用する免疫学的測定法はヘモグロビンの変性を除いては通常の方法である。２００のハイブリドーマのうち９しか）（ｂＡ＋ｅと優先的に反応するモノクローナル抗体を産生じないということは注目すべきであり、このことはＨｂＡｌｃに特異的な抗体は免疫された動物によっては通常は僅かしか産生されなし）ことを示唆している。

米国特許第４．４７８．７４４号（メゼイら）は、ペプチド抗原を使用するタンノ＜り１こ対する抗体の調製法を教示しており、そのアミノ酸配列は該タンパクのアミノ酸配列のある部分と一致している。ヘモグロビンに関して、この特許は、４〜１０、好ましくは７のアミノ酸からなるペプチドを使用する、グリコジル化されたヘモグロビン、特にＨｂＡ、ｃに対する抗体の調製法を教示しており、そのアミノ酸配列はヘモグロビンのβ鎖のＮ−末端配列と一致している。該ペプチドは、免疫原性キャリアータンパクまたはポリペプチドとカップリングする前または後にグリコジル化される。該ペプチドキャリアーの結合は、動物、好ましくは、通常ＨｂＡ　Ｉ＋−を産生じない動物を免疫するために使用される。メゼイらは、産生じた抗体がＨｂＡｌ、、に特異的であり、ＨｂＡ、。を定量するための通常の免疫学的測定に使用できることを教示している。しかしながら、上で議論した゛６５４特許は、メゼイらの方法で産生じたポリクローナル・ヒツジ抗血清は、アフイテイー精製された場合でさえ、ＥＬＩＳＡ測定法にふいてＨｂ　Ａ　＋　ｅに対する検出可能な特異性を有さないということを示す実験を記載している（’　６５４特許の実施例８を参照のこと）。

また、上で議論したヨーロッパ特許出願第２０１．１８７も参照のこと。

米国特許第４．２４７．５３３号（セラミら）及びジャピッド（Ｊａｖｉｄ）ら、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅａｍａむｏｌｏｇｙ、　３８．３２９　（１９７８）は、ＨｂＡｌｃに対する抗体の調製法を教示している。該抗体は、動物、好ましくは、通常）ｉｂＡ＋ｅを産生じない動物をカラム精製したヒトＨｂＡ＋　ｃで免疫することによって産生される。産生じた抗体は、等しくＨｂＡＯ及びＨｂＡＩｃａよく反応し、従って、ＨｂＡｏで繰り返し吸着された。吸着された抗体は、ＨｂＡｏをそのグリコジル化された誘導体から明確に区別したが、依然として、ヒトＨｂＡ１．及びＨｂＡｌｂａびにイヌ及びマウスＨｂＡｔｅと僅かに交差反応した。それは、また、ＮａＢＨ−還元されたＨｂＡｌ、、について未還元のＨｂＡｌｃよりも著しく低い反応性しか示さなかった。また、還元されたグリコジル化バリル−ヒスチジンを含む一定の還元されたグリコジペプチドは、吸着された抗体のＨｂＡｌ　ｃとの反応を阻害することができなかった。該吸着された抗体は親和性が低く力価も低かった。この問題を克服するため、特別に変更した放射性免疫学的測定法（ＲＩＡ）を採用した。上で議論した゛６５４特許は、この方法の再現性は未解決であることを教示しているぐ６５４特許の第２欄第３８〜４１行参照）。

カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）及びウィッツタム（Ｉｌｉｔｚｔｕｍ）　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　７２．１４２７　（１９８３）は、還元されたグリコジル化ヒト血漿リポタンパクに結合するが、非グリコジル化または未還元グリコジル化血漿リポタンパクとは反応しない６マウスのモノクローナル抗体の生成及び特徴を記載している。該抗体は、グルコース及びナトリウムシアノボロハイドライドの存在下で還元的にグリコジル化された同種の低密度リポタンパク（ＬＤＬ）を３回投与し、続いて、膵臓細胞を採取する直前に、還元的にグリコジル化されたヒ）ＬＤＬを１回投与してマウスを免疫し、ハイブリドーマを調製することによって調製された。競合阻害ＲＩＡにおいて、還元されたグリコジル化ＬＤＬ上で、これら抗体によってＤｉされた優性エピトープが、グルシド− ルーリジン、即ち、リジンのε−アミノ基と共役したグルコースの還元されたヘキソースアルコール型として同定されたくグルシド−ルーリジンは還元されたグリコジル化ＬＤＬに対するそれぞれの抗体の結合を完全に阻害した）。６つの各抗体は、高密度リポタンパク、アルブミン、ヘモグロビン及びトランスフェリンを含む検討した全ての還元されたグリコジル化タンパクと反応した。該抗体は、また、総血漿タンパク上のグルシド−ルーリジン残基及び正常個体及び糖尿病個体の単離されたりボタンバクを、ＮａＢＨ，でのタンパクの還元後に同定及び定量することもできた。

ウィッツタムら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０．２７５７　（１９８３）は、モルモットを同種のグリコジル化されたまたは還元的にグリコジル化されたＬＤＬで免疫することによるポリクロナール抗体の調製を記載している。還元的にグリコジル化されたＬＤＬでの免疫は、還元的にグリコジル化されたモルモッ）ＬＤＬと反応するが未還元グリコジル化ＬＤＬとは反応しない高力価抗血清を産生じた。

グルシド−ルーリジンは、ヘモグロビン、アルブミン及びトランスフェリンを含む他の還元的にグリコジル化されたヒトタンパクと同じく、還元的にグリコジル化されたＬＤＬに対するこの抗体の結合の高度に効果的な阻害因子であった。還元剤を存在させないでグリコジル化したＬＤＬも、その抗血清は低力価で低親和性であるけれども、免疫原性である。還元的にグリコジル化された同種のアルブミンも免疫原性であり、この化合物での免疫は、還元的にグリコジル化されたアルブミンと反応するが未還元グリコジル化アルブミンまたは還元的にグリコジル化されたＬＤＬとは反応しない抗血清を産生した。全ての抗体の活性は固相ＲＩＡで測定した。

ナカヤマら、　（：ｌ１ｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　１５８．２９３−９９　（１９８６）は、モルモットを還元的にグリコジル化されたヒトアルブミンで免疫することによって得られた抗血清を使用する、グリコリル化ヒト血清タンパクのためのＲＩＡを記載している。

該抗血清は、未変性ヒト血清アルブミンのカラム上にアフィニティー吸着さへ該吸着された抗血清は還元的にグリコジル化されたアルブミン及びグルシド−ルーリジンを認識したが、非還元的にグリコジル化されたアルブミン、未変性ヒトアルブミン、リジン、ソルビトールまたはマンニトールを認識しなかった。該抗血清は、また、未変性ヒト血清アルブミン及び非還元的にグリコジル化されたアルブミンを、ＮａＢＨａでのタンパクの還元後に同定及び定量することもできた。

ゴ（Ｇｏ）ら、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　１６３．６３−７３　（１９８７）は、還元的にグリコジル化された同種の高密度及び低密度リポタンパク（ＨＤＬ及びＬＤＬ）を免疫原として使用して調製したポリクローナル抗血清を使用するグリコジル化タンパクのための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬ　ｒ　ＳＡ）の開発を報告している。該論文は、該抗血清がグルコース− リジン結合に特異的であること、及びそれが供与量に依存して、アルブミン、フィブリノーゲン、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ポリリジン及びヘモグロビンを含む、試験された全ての還元グリコジル化タンパクを認識することを教示している。該抗血清は、未変性タンパクまたは未還元グリコジル化タンパクについて親和性を有しなかった。ＥＬＩＳＡ測定法は、感度がよく、比較的短い時間で膨大な数のサンプルを測定できると報告されているが、該論文は、測定の条件は臨界的であり、記載された実験記録から大きくずれると、感度及び再現性の損失を起こすことを教示している。ゴらの６６頁を参照のこと。

発明の要旨本発明は、そのＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基上で非酵素的にグリコジル化されたＨｂＡｌｃの如きタンパクについての免疫学的測定法を提供する。Ｇｌｃ− ｏＩＸに対する特異性を存する高力価、高親和性抗体を以下に記載するようにして調製し、免疫学的測定に使用した。式Ｇｌｃ−ｏ１Ｘにおいて、Ｘはグリコジル化タンパクのＮ−末端アミノ酸であり、以下に詳細に記載した理由によって、Ｘはリジンを除くほかはいかなるアミノ酸であってもよい。Ｇｌｃ−ｏｌはグリコジル化タンパク上のＸに結合した糖の還元型である。

本発明の一部でもある抗体は、式（Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌ）ｎ−キャリアーの免疫原で動物を免疫することによって調製される。ここで：Ｘ及びＧｌｃ−ｏｆは上記で定義した通りであり、Ｇｌｃ−ｏｌはＸのα−アミノ基に結合してふり；Ｌは結合手または連結基であり；キャリアーは該グリコジル化タンパク以外の免疫原性化合物であり：そしてｎは１からキャリアー上の有効な結合部位の数までの数字である。

免疫学的測定を行うため、測定に付されるグリコジル化タンパクを抗原と接触させる前に、還元剤と処理しなければならない。この処理は、タンパクのグリコジル化されたＮ−末端アミノ酸をＧｌｃ−ｏｌ−Ｘ型に転化するのに必要である。

この方法では、本発明の抗体はグリコジル化タンパクを認識し、それど結合するであろう。該抗体は、非グリコジル化タンパク、リジンのε−アミノ基上でグリコジル化されたタンパク及び他のＮ−末端アミノ酸上でグリコジル化されたタンパクの存在下で、選択的に該グリコジル化タンパクを認識する。しかしながら、試験サンプル中に、同じグリコジル化されたＮ−末端アミノ酸を有する複数のタンパクが存在するならば、興味の対象であるタンパクをｆｉｔ１認し分離する幾つかの方法を使用しなければならない。

本発明は、更に、該抗体を調製するために抗原として使用される（Ｇｌｃ−。

１−Ｘ−Ｌ）ｎ−キャリアー化合物及びこの化合物を作る方法を含む。これらの方法は、還元的にＸまたはＸ−Ｌをグリコジル化してＧＩＣ−０１−ＸまたはＧｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌを生成すルコトヲ含ム。次イテ、該Ｇｌｃ−ｏ１−Ｘ及びＧｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌは免疫原性キャリアーと直接カップリングするか、または、該Ｇｌｃ−ｏ１−Ｘはそのキャリアーとカップリングする前にＬとカップリングしてもよい。

また、本発明は、グリコジル化タンパクを検出または定量するためのキットを提供する。該キットは、Ｇｌｃ〜ｏｌ−Ｘに向けられた抗体の入った容器を含む。

該キットは、次の１つまたは両方も含む：１）グリコジル化タンパクのＮ−末端アミノ酸上の糖残基を還元するための還元剤の入った容器、または、２）該抗体に結合したグリコジル化タンパクを検出または定量するために有用な標Ｍ分の入った容器。

図面の簡単な説明一部は、グルシド−ルーＶＧＧセファロースのカラム上でアフィニティー精製された抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体を利用する直接結合−酵素結合蛍光測定法（ＥＬＦＡ）を行うことによって得られた。抗原は示されている通りである。

阻：回帰分析結果の典型的グラフ。一方の軸は、糖尿病患者由来の赤血球（ＲＢＣ）の溶解産物中の電気泳動によって検出されたＨｂＡ、ｃの量であり、他方の軸は、グルシド−ルーＶＧＧセファロースのカラム上でアフィニティー精製された抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体を利用する直接結合−ＥＬＦＡによって検出された量である。

ｌＺ５　：　ＲＦＵ　ＶＳ、抗体の希釈度のグラフ。グラフのデータは、グルシド−ルーバリンセファロースのカラム上でアフィニティー精製された抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体を利用するＥＬＦＡを行うことによって得られた。

抗原は示されている通りである。

図６〜７　：　ＲＦＵ　ＶＳ、抗体の希釈度のグラフ。グラフのデータは、架橋ヒトへモグラビンでアフィニティー吸着された抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体を利用するＥＬＦＡを行うことによって得られた。抗原は示されている通りである。

至旦：還元されたＨｂＡ＋　Ｃに対するアフィニティー精製された抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体の結合の、還元されたＨ　ｂ　Ａ　＋　ｅによる阻害を示すグラフ。

該抗体は、グルシド−ルーＶＧＧセファロースのカラム上でアフィニティー精製ルーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体の結合の、糖尿病患者由来のＲＢＣの還元された溶解産物による阻害を示すグラフ。該抗体は、グルシド−ルーＶＧＧセファロースのカラム上でアフィニティー精製された。

阻１旦：回帰分析結果のグラフ。一方の軸は、糖尿病患者由来のＲＢＣの溶解産物中の電気泳動によって検出されたＨｂＡｌｃの量であり、他方の軸は、阻害ＥＬＦＡ測定法における、還元されたＨｂＡ、Ｃに対するアフィニティー精製された抗−グルシト−ルーＶＧＧ−ＢＳＡの結合の５０％阻害を起こすのに必要な阻害因子の濃度である。該阻害因子は還元されたＲＢＣ溶解産物であった。該抗体は、グルシド−ルーＶＧＧセファロースのカラム上でアフィニティー精製された。

図１１：還元されたＨｂＡ、ｃに対するアフィニティー吸着された抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体の結合のグルシド−ルーＶＧＧによる阻害を示すグラフ。該抗体は、架橋ヒトヘモグロビンでアフィニティー吸着された。

図１２＝回帰分析結果のグラフ。一方の軸は、糖尿病患者由来のＲＢＣの溶解産物中の電気泳動によって検出されたＨｂＡ、ｃの量であり、他方の軸は、ＤＥ− ５２精製抗−グルシト−ルーＶＧＧ−ＢＳＡ及び同じ糖尿病患者由来の還元された全血溶解産物を利用して、直接結合Ｅ　１．、　Ｆ　Ａによって検出された吸光度である。

図１３：ＤＥ−５２精製抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体の還元されたＨｂＡｌｃに対する結合の還元された全血溶解産物による阻害を示す典型的グラフ。

図１４−回帰分析結果のグラフ。一方の軸には、糖尿病患者由来のＲＢＣの溶解産物中の電気泳動によって検出された）（ｂＡ＋ｃの量が示されており、他方の軸には、還元されたＨｂＡｌｃに対するＤＥ−５２精製抗−グルシト−ルーＶＧＧ−ＢＳＡの結合の５０％阻害を与えるのに必要な同じ糖尿病患者由来の還元された全血溶解産物の量（該溶解産物中の総ヘモグロビン濃度として表された）が示さ解産物中のアミノフェニルボロネートカラム法によって検出された）（ｂＡ＋ｃの量が示されてふり、他方の軸には、ＤＥ−５２精製抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体を利用して、直接結合ＥＬＩＳＡによって同じ患者由来の全血溶解産物中で検出された１（ｂＡ＋ｅの量が示されている。

発明の詳細な説明本発明の抗体の刺激産生（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ口）に使用する免疫原は、免疫原性キャリアーとカップリングした１またはそれ以上のＧｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌ残基を含む。Ｘは、そのＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基上でグリコジル化されたタンパクのＮ−末端アミノ酸である。Ｘは、リジン以外のいかなるアミノ酸であってもよく、該グリコジル化されたタンパクは、Ｎ−末端アミノ酸としてリジンを有するもの以外で、抗体を産生ずるのに望ましいいかなるタンパクであってもよい。

Ｘがリジンであってはならない理由は以下の通りである。グリコジル化タン１＜りは、通常、そのε−アミノ基上でグリコジル化さねたりジン残基を含有する。

Ｇ　Ｉ　ｃ　−ｏ　Ｉ　−リジンに対して形成された抗体（Ｇ　Ｉ　ｃ　−ｏ　ｌはα−アミノ基上に存在する）は、それらのε−アミノ基に結合した糖残基を有するより多くの一般のグリコジル化リジンと交差反応するであろうと予測される。従って、かかる抗体は、非特異的に多くの異なるグリコジル化タンパクと反応するであろう。本発明の目的は、多数のグリコジル化タンパクとのかかる広汎な非特異的な反応を回避することにある。

（Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌ）ｎ−＋＋’）７−中のＬは、Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘをキャリアーに連結している１本の結合手であってもよい。Ｌが結合手である場合には、Ｘは、キャリアー分子中の適当な基とのカップリング反応に活性なカルボキシルチオールまたはヒドロキシルの如き官能基で終結していなければならない。

Ｌは、また、いかなる公知の連結基であってもよい。例えば、Ｌは、水素を除く約１〜約２０原子からなる脂肪族鎖であってもよい。通常、該連結基は、キャリアー分子中の適当な基とのカップリング反応に活性なアミノ、力ＪレボキシＪし、チオール、ヒドロキシルまたはマレイミドの如き官能基で終結しているであろう。

アミノまたはカルボキシル誘導体を形成し、通常のペプチド縮合反応によってそれらをキャリアー中の相応しいカルボキシル及びアミノ基に連結するのが最も一般的である。

好ましい連結基は、アミノ酸または１０未満のアミノ酸、好ましくは２つのアミノ酸を含有するペプチドである。Ｘと連結基のアミノ酸の結合は、抗体を産生するのに望ましいグリコジル化タンパクのＮ−末端配列と同一ではない。また、連結基のアミノ酸及び連結基全体は、比較的非免疫原性であるのが好ましい。この理由のため、アミノ酸であるグリシン及びジペプチドであるグリシン−グリシンが特に好ましい連結基である。

Ｌがアミノ酸またはペプチドである場合は、公知のペプチド合成法によってＸと連結できる。例えば、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄｌ　ＪＡ竪，　８５．　２１４９　（１９６３）；ディビス（Ｄａｖｉｓ）ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　１０．　３９４−４１４　（１９８５）；スチュワード（Ｓｔｅｗａｒｔ）及びヤング（Ｙｏｕｎｇ）、　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）　：米国特許第３．　９４１７６３号；フィン（Ｆｉｎｎ）ら、　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．第３版。

第２巻．　２５７−５２７　［ノイラス（Ｎｅｕｒａｔｈ）ら編，　１９７６年〕；及びエリツクソ７（Ｐ．ｒｉｃｋｓｏｎ）ら、　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．第３版，第２巻，　２５７−５２７　［ノイラス（Ｎｅｕｒａｔｈ）ら編，　１９７６年］に記載されているような固相ペプチド合成法が使用できる。これらの方法は、Ｌがペプチドである場合のその調製にも使用できる。ｘ１ペプチドである場合のＬｌまたはＬがアミノ酸若しくはペプチドである場合のＸ−Ｌに使用することができる好適な合成ペプチドは、シグマ・ケミカル社，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　Ｍｉｓｓｏｕｒ　ｉ．、ペニンスラ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ）　・ラボラトリーズ、　Ｂｅｌｍｏｎｔ．　Ｃａｌｆｏｒｎｉａ、ノくケム（Ｂａｃｈｅｍ＞社．　Ｔｏｒｒａｎｃｅ，　Ｃａｌｆｏｒｎｉａ　、及び、ベガ・）＜イオケミカルズ，　Ｔｕｃｓｏｎ，　Ａｒｉｚｏｎａを含む種々の供給業者から商業的に購入することができる。

Ｘは、干渉的または非特異的抗体を産生ずるかも知れないＧｌｃ−ｏｌ−ＩＪリジン基または他のＧｌｃ−ｏ１残基の形成を防止するために、キャリアーとカップリングする前に還元的にグリコジル化されるのが好ましい。更に、Ｌがε−アミノ基を有するアミノ酸またはペプチドである場合には、ＸがＬと結合する前にＸを還元的にグリコジル化するのが好ましい。

（単独にまたはＬと結合した後に）Ｘを還元的にグリコジル化するには、興味の対象であるグリコジル化タンパクのＮ−末端アミノ酸上に見出される糖と同じ糖の過剰量を、ナトリウムシアノボロノ＼イドライド〔カーチス及びウイツツタム。

ラムボロハイドライド〔ミーンズ（Ｍｅａｎｓ）及びフィーネイ　（Ｆａｅｎｅｙ）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　７．　２１９］．−２２００及びゴら，　Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔ’　Ｉ，　Ａｃａｄ，　Ｓｃｉ，　ＵＳＡ，　８０．　２７５１|２７６１（１９８３）を参照〕の如き炭水化物還元剤の存在下でＸまたはＸ−Ｌと反応させる。

還元的にグリコジル化されたＸまたはＸ−Ｌを炭水化物還元剤及びそのグＩＪコシル化されていない片割れと分離する。これは通常の手段で行うこと力（できるが、好ましくはモレキュラーシーブ・クロマトグラフィー及び、必要ならイオン交換クロマトグラフィーを使用して行ってもよい。

好適なキャリアーは、宿主動物中で、該キャリアーとカップリングした７％ブテンに対する抗体の産生を刺激することのできる化合物である。そのようなキャＩＪアーは従来から存在しており公知である。それらは一般に高分子量化合物である。

殆どの場合、キャリアーはタンパクまたはポリペプチド′である。しかし、充分な大きさと免疫原性を有する、炭水化物、ボリサ・ツカライド、ＩＪボポ１ノサ・ツカライド、核酸等の如き他の物質を使用することができる。

好適な免疫原性キャリアータン、＜り及びポリペプチドＣま、一般１こ４．　Ｏ　Ｏ　Ｏと１　０、　０　０　０．　Ｏ　Ｏ　Ｏの間の分子量、好ましくは、１　５．　０　０　０より太き一１分子量を有するであろう。かかる好適なキャリアーは、アルブミン（例え＋ｆ，ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン）、イムノグロブＩＪン、チログロブリン（例えば、ウシチログロブリン）、ヘモシアニン（例え番ｆ，キーホールリンベットヘモシアニン）の如きタンパク及び、ポリＩＪジンまたｉｔポ１ノアラニンリジンの如きポリペプチドを含む。

次いで、Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌは該キャリアーとカップリングされる。このカップリングを行う方法はよく知られている。例えば、Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌ残基は、グルタルアノげヒト、１−（３−ジメチルアミノプロピルルボジイミド・塩酸塩（ＥＣＤＩ）の如き水溶性カル４ｆジイミド、Ｎ−Ｎ−カルボニルジイミダゾール、１−ヒドロキシベンゾトリア′ノ゛−Ｊし１水化物、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ｎ−トリフルオロアセチルイミダソ゛−ル　シアノーゲンブロマイド、３−（２”−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオネート　コノλり酸イミドエステル、ヒドラジドの如き接合剤、また＋ｉアフイニテイーラベ【Ｊフグ法でキャリアーとがカップリングすることができる。可能なカップ１ノング剤のＩＪストについて、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｃａｔａｌｏｇ　（］９８９）も参照のこと。

通常の免疫原性キャリアー物質及びそれにノ１ブテンをカップリングする技術（こついての追加の参照例は：エルランガー（Ｅｒｌａｎｇｅｒ）　、　ＭｅｔｈｏｄΣ上＋　Ｅｎｚｙｍｏｌｏσ。

７０、８５−１．０４　（１９８０）；マケラ（Ｍａｋｅｒａ）及びセソバラ（Ｓｅｐｐａｌａ＞　、　ｔｌａｎｄｂｏｏｋ　０ｆｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　（ＰｒｅｎｔｉｃｅＪＩａｌｌ　１９７６）　G　ノイトラ −（Ｂｕｔｌｅｒ）　、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、、７−、　］− ２４（１９７４）；　１ｌｅｉｎｒｙｂ及び５ｈｒｏｆｆ。

式（Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌ）ｎ−キャリアーにおいて、ｎはキャリアーに結合しているＧｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌ残基の数である。キャリアー分子上のかかる残基の数（エピトープ密度）は、１からキャリアー分子上の有効なカップリング基の数までの数字であろう。個々のキャリアー上のエピトープ密度は、キャリアーの分子量、その密度及びカップリング部位の有効性に依存するだろう。最適なエピトープ密度は、キャリアー分子上の有効なカップリング基の約１０％〜５０％になる。

Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌ−キャリアーを合成した後、それを使用して抗体を調製する。抗体を調製する方法は、よく知られており従来からのものである。例えば、本発明の抗体は、好適な宿主動物（ウサギ、ヤギ、ウマまたは他の哺乳類の如きもの）にアジュバントとの混合物として本発明の免疫原を投与することによって調製することができる。免疫原の投与は、好適な力価の抗血清が得られるまで継続する。該抗血清を採取し、もし必要であるか望ましいのであれば、公知の技術を使用して更に精製してもよい。例えば、該抗体をアフィニティー精製するかまたはＤＥ−５２クロマトグラフイーの如きものによって分別してもよい。

また、本発明の抗体は、免疫された動物（ラット、１１ムスター、マウスまたは他の哺乳類の如きもの）由来の細胞をミエローマ細胞の如ぎ不滅セルラインと融合させることによる体細胞雑種形成法によって調製することができる。融合細胞をクローニングし、該クローニングした融合細胞をスクリーニングすることによって適当な特異性を有するモノクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を調製する技術はよく知られている。

従って、本発明で使用するのに好適な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、抗血清またはその精製フラクション（ＤＥ−５２アフイニテイー精製またはアフィニティー吸着した抗体の如きもの）であってもよく、いかなる公知のアイソタイプまたはサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ等の如きもの）であってもよく、または抗原と結合できる抗体のフラグメントｌ：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）またはＦ（ａｂ’）２の如きもの〕であってもよい。唯一の要件は、最終の抗体試料がＧｌｃ−ｏＩＸエピトープに対する特異性を有し、かつ、測定が望まれる還元されたグリコジル化タンパク上のこのエピトープに結合できることである。

本発明の抗体は、生体物質中の非酵素的にグリコジル化されたタンパクの検出または定量を行ういかなる免疫学的測定法においても使用することができる。そのような多くの技術は公知である。

唯一の必要な変更は、この免疫学的測定を行うため、測定されるグリコジル化タンパクが、該タンパクを抗体と接触させる前に還元剤で処理されなければならないことである。この処理は、該タンパクのグリコジル化されたＮ−アミノ酸をＧｌｃ−ｏｉＸ型に転化させるのに必要である。このようにして、Ｑｌｃ−。

ＩＸに特異的な本発明の抗体は、グリコジル化タンパクを認識し、それと結合するのであろう。他の特別な条件は必要ではない。特に、一定の先行測定技術に要求されるような種々の変性条件で、グリコジル化タンパクを処理する必要がない。

く、イムノメトリック測定法で行ってもよい。それは、均一系測定法であっても不均一系測定法であってもよい。好適な均一系技術は、蛍光消光及び蛍光増強、疫学的測定法である。

１つの好ましい免疫学的測定方式は、赤血球（ＲＢＣ）溶解産物の如きサンプル中の還元されたグリコジル化タンパクが固体表面上で不動化された直接結合測定法である。好適な固体表面は、よく知られており、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、及びアガロースである。不動化された抗原は、Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ（第一抗体ンに特異的な抗体き接触される。該第−抗体は、不動化された抗原に結合した抗体が検出または定量できるように標識されていてもよい。未結合物質を洗い落とした後に固体表面に結合している標識の量は、サンプル中に存在する抗原の量に比例するので、サンプル中の抗原（そのＮ〜末端アミノ酸上がグリコジル化されたタンパク）の量が定量され得る。また、未結合の第一抗体を洗い落とした後に、サンプル中に存在する興味の対象であるグリコジル化タンパクを検出及び定量するための手段として、第一抗体に特異的に結合する標識された第二抗体を添加してもよい。

特に好ましい直接結合免疫学的測定法は、実施例１０．１３及び１５に詳しく記載した測定法である。特に、実施例１３及び１５に記載した直接結合測定法は全血の溶解産物を採用するが、これは該測定を行うのを非常に簡単にする。それらは比色検出システムも利用する。かかるシステムはグリコジル化タンパクを定量するのに使用できるが、そのエンドポイントを肉眼で観察することができるので、定性分析または早足性分析にも使用することができる。従って、かかる測定法は、医師のオフィス、患者の自宅または世界の低開発地域の如き、高価な装置を入手できず及び熟練した実験職員を採用できない環境において特に価値がある。

第一抗体または第二抗体のいずれかに適した標識は当該分野でよく知られている。それらには：１）酵素（例えば、ホースラディツシュペルオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、イーストアルコール脱水素酵素、α−グリセロホスフェート脱水素酵素、トリオースホスフェートイソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼ）　；２）蛍光体〔フルオレセインイソチオシアネート、ローダニン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタルアルデヒド及びフルオレサミン（ｆ　ＩｕｏｒｅｓｃａＬｌｉｎｅ＞の如きもの〕　：３）ラジオヌクレオチド（”’Ｔの如きもの）　：４）バイオ発光種１ｓｉｌｋ　（ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンの如きもの）；５）化学発光種：ｆａ（ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルの如きもの）；及び６）ビオチンが含まれる。これら標識の結合及び検出は、当該技術分野の熟練者に知られた標準的技術を使用して行うことができる。

代用できかつ好ましくもある免疫学的測定法は、阻害測定法である。このタイプの測定法は、ＲＢＣまたは全血溶解産物中の還元されたＨｂＡ＋　ｃの如き液相還元されたグリコジル化タンパクの量を阻害因子として使用し、これを変化させるものである。阻害因子は、固体表面（上記した如きものン上に不動化された固定量の還元グリコジル化タンパクと混合さＬ抗−Ｇｌｃ−ｏ１Ｘ抗体（第一抗体）上の制限された数の有効な結合部位を競う。既知の阻害因子濃度について得られた第一抗体結合の阻害量を生体サンプルと比較するこさによって、該生体サンプル中のグリコジル化タンパクの量を決定することができる。この第一抗体は標識してもよく、また、標識した第二抗体を使用してもよい。該標識は、上記の通りである。特に好ましい阻害測定法は、実施例１１に記載した阻害ＥＬＦＡである。

サンドイッチ（２捕捉部位）測定法も可能である。この測定法においては、抗− Ｇｌｃ−ｏＩＸ抗体は、上記した如き固体表面上に不動化される。次いで、測定されるべき還元されたグリコジル化タンパクは、不動化された抗−Ｇｌｃ−ｏｌ −Ｘ抗体と接触される。未結合物質を洗い落とした後、グリコジル化タンパクに対する標識抗体が添加さね、結合した標識抗体の量は、当初のサンプル中のグリコジル化タンパクの量に比例する。該ａは上記と同様である。二次標識抗体は、Ｇｌｃ−ｏＩＸに対する活性を有しないが、グリコジル化タンパク上の他のエピトープに向けられている。従って、この技術は、該グリコジル化タンパクが、同じＮ−末端アミノ酸上でグリコジル化されている他のタンパクとの混合物である場合に、それを検出または定量するのに特に適している。また、標識抗体は、Ｇｌｃ−ｏｌに対する抗体であってもよく、不動化抗体は、グリコジル化タンパクの他のエピトープに向けられていてもよい。

最後に、均一蛍光分極測定法が可能である。かかる測定法においては、還元されたグリコジル化タンパクは、蛍光標識低分子量キャリアー分子（３６００の分子量を有するポリーＬ−リジンの如きもの）にカップリングしたＧｌｃ−ｏｌ−Ｘ −ＬまたはＧＩＣ−０１−Ｘと、抗　Ｇｌｃ−ｏ！−Ｘ抗体を競う。蛍光分極の量は、試験サンプル中の還元されたグリ」シル化タンパクの量に反比例する。

具体的な濃度、温度及びインキュベーションの時間、並びに、他の測定条件は、使用されるいかなる免疫学的測定法においても、サンプル中の抗原の濃度、サンプルの性質等の要因に依存して変化してもよい。当該技術分野の熟練者は、口面の実地から、各測定のために有効な及び最善の測定条件を決定できるであろう。

本発明で測定される生体物質は、興味の対象であるグリフンル化タンパクを含有する如何なる体液であってもよい。通常は、血液、または、ＲＢＣ溶解産物、血清または血漿の如き血液成分であろうが、唾液の如き他の適当な体液であ、ってもよい。

また、本発明は、そのＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基上で非酵素的にグリコジル化されたタンパクを検出または定量するだめのキットも含む。該キットは、本発明の免疫学的測定法を行うのに役に立つ試薬の入った１またはそれ以上の容器の包装した組み合わせである。該キットの試薬の好適な容器は、ビン、バイアル、試験管及びマイクロタイタープレートである。

該キットは、Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘに向けられた抗体の入った容器を含むであろう。

抗体は上記したものであり、それらがグリコジル化タンパクの検出または定量に使用されるのであれば、標識されていてもよい。抗体は溶液であっても、ａ結乾燥されていても、または、上記したような固体表面に結合されていてもよい。

該キットは、更に、グリコジル化タンパクのＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基上の糖残基を還元するだめの還元剤の入った容器を含んでもよい。これら還元剤は公知、かつ、通常のものであり、上記したものを含むものである。

また、該キットは、抗体に結合したグリコジル化タンパクの量を検出または定量するのに有用な標識成分の入った容器を含んでもよい。この標識成分は、抗−Ｇｌｃ−ｏｉＸ抗体に特異的な標識抗体であっても、標識された還元グリコジル化タンパクまたはペプチドであっても、または、蛍光分極測定法のためのポリーＬ −リジンにカップリングしたＧｌｃ−ｏｆ−ＸまたはＧｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌの如ぎ標識Ｇｌｃ−ｏ１−Ｘまたは標識Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｔ−であってもよい。

最後に、該キットは、緩衝液、酵素基質、希釈剤、スタンダード等の如き当該分野で公知の他の物質並びに商業的及びユーザ゛−の観点から望ましい他の物質を含有してもよい。該キットは、また、免疫学的測定を行うための試験管及びマイクロタイタープレートの如き容器も含んでよい。

本発明は、特に、グリコジル化されたヘモグロビンのための免疫学的測定法に向けられている。より詳しくは、それは、ＨｂＡ、Ｃの免疫学的測定法に向けられており、本発明は、グルシトールーバリンと特異的に反応する、高力価かつ高親和性の抗体を提供する。そのような抗体を調製するのに好ましい方法及びＨｂＡｉｃを検出または定量するのに使用できる好ましい免疫学的測定技術の説明は、以下の実施例に記載されているが、他の免疫原、抗体産生技術及び免疫学的測定方法も、上記の一般的用語で説明されている如くして使用することができる。

即ち、以下に記載した好ましい態様において、該抗体は、免疫原グルシド−ルーバリン−グリシン−グリシン−ＢＳＡで動物を免疫することによって調製できた。得られた抗血清は、１：４０．０００〜１：１００，０００の希釈度で存在するグルシド−ルーバリン・エピトープを有する免疫原との１／２極大結合（ｈａＩｆ−ｍａｘｉｍａｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ）で高い力価であった。

得られた抗血清のＩｇＧフラクションをｍ製し、グルシド−ルーバリン−セファロースまたはグルシド−ルーバリン−グリシン−グリシン−セファロースのいずれかを使用してアフィニティー精製した。得られたアフィニティー精製した抗体は、実施例１０〜１２における結果によって示されるように該グルシド−ルーバリン・エピトープを特異的に検出した。特に、アフィニティー精製した抗体の還元したＨｂＡｉｃに対する結合は、還元的にグリコジル化されたＨｂＡｉｃによって、還元されたＲＢＣ溶解産物によて、及びグルシド−ルーバリン−グリシン −グリシンによって、特異的に阻害された。ＨｂＡ、Ｃについての抗体の凡その結合定数（機能的親和力）は、１．５〜３．４ｎＭである。

グルシド−ルーバリン・エピトープと特異的に反応する抗体試料を得るのにアフィニティー精製及び吸着は必要ではないことも確認された。実施例１３〜１５を参照のこと。

最後に、ＲＢＣ溶解産物及び全血溶解産物中のＨｂＡｌｅの定量的測定は、標準的技術によって得られた結果さ相互によく関連している。実施例１０．１１及び１３〜１５を参照のこと。

実施例実施例１：グルシトールーバリンーグリシンーグリシンの調製８０ｍＭグルコース（フィッシャー・サイエンティフィック社、　Ｆａｉｒ　Ｌａｗｎ、　ＮＪ。

１１ｓＡ）と蒸留水中で調製した１　２．５ｍｇ／ｍｌの新たに溶解したＮａＣＮＢＩ（ａ　（ジグ７−ケミカル社、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）との水溶液１０ω１中に１０ｍｇのバリン−グリシン−グリシン（ＶＧＧ）ペプチド（シグマ・ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）を溶解させることによって、反応溶液を調製した。該新たに調製した反応溶液を０．２　ｕｍアクロディスクフィルター（ゲルマン・サイエン入Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ。

ＭＬ　ＵＳＡ）を使用して無菌ねじ込みキャップ付き１５ｍ１ポリスチレン管（コーニング・グラス・ウアークス、ＣＯ「旧ｎｇ、　ＮＹ、　ｌｌ５Ａ）中に濾過滅菌した。比較のために、グルコースを除く全反応原料からなる偽反応を行った。

該滅菌反応液を室温で７〜２０日間インキュベートした。その後、総容量が４０ｍ１のバイオ−ゲルＰ−２，４００メツシユ（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）を含有する、脱気蒸留水で予め平衡にしたｌＸ５０ｃｍＸ５０ｃｍ低圧エコノルカラムラッド・ラボラトリーズ、　Ｒｉｃｔ＋ｍｏｎｄ、　ＣＡ、　ｌｌ５Ａ）を使用してゲル濾過クロマトグラフィーを行うことによって、還元的にグリコジル化されたＶＧＧペプチドが単離された。分別は、周囲温度で、カラムに１〜２ｍｌの反応溶液をチャージすることによって行った。カラムを流速４＋＋＋ｌ／ｈｒで流し、溶離溶媒として蒸留水を使用して流分１ｉｌずつを捕集した。

続いて、捕集した流分をペプチドにつき、ビンンコニミン酸（ＢＣＡ）　［スミれらについて、フェノール−硫酸〔ディッレｘ　（Ｄｉｓｃｈｅ）ら、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ）　ＩＪ　：　）　ロヘ７ゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）　［フイールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）　、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　２５ｂ：　４６４−４６８　（１９７２）：ｌを使用してフリーのアミノ基も分析した。アミノ酸を含まず（ＴＮＢＳと反応しない）及びヘキソースを含まない（フェノール−硫酸き反応しない）ペプチド含有流分をプールし、凍結乾燥し、蒸留水１ｍｌで再溶解し、ＢＣＡ、ＴＮＢＳ及びフェノール−硫酸法で再分析した。

該濃縮物質は、ＢＣＡ反応性は維持したが、ＴＮＢＳ及びフェノール−硫酸とは反応しなかった。このことは、該単離した物質がフリーのグルコースとＮａＣＮＢＨ，を欠いているグルシド−ルーＮ−末端−遮断ＶＧＧペプチドからなることを示唆している。アミノ酸分析は、グリシンの存在を示したが、全ての有効なバリン残基が還元的にグリコジル化されている場合に期待されるｉ＜リンの存在は示さなかった。続いて、精製した該物質をタンパクキャリアー及びセファロース４Ｂ（実施例３〜５を参照）にカップリングさせた。

実施例２ニゲルシト−ルーヒトヘモグロビンの調製ＶＧＧについて上に記載したのと同じ方法で、ヒトヘモグロビン（シグマケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）をグルコースで還元的にグリコジル化した。約１２〜１４にの平均分子量を有するスペクトロボア・セルロース透析チュービングはフリカン・サイエンティフィック・プロダクツ、　ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、　ＩＬ、　ＵＳＡ）を使用した、水に対する徹底的透析によ−、て、Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈｓ、原料グルコース及び低分子量反応生成物から還元的にグリコジル化されたヘモグロビンを分離した。

アミノ基修飾の程度は、全有効へモグロビンアミノ基の尺度として、グルコースの不存在下で還元したヒトヘモグロビンのコントロール（ＣＮＢＨ３コントロール）を使用して、フィールズ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　２５ｂ：　４６４−４６８　（１９７２）〕のＴＮＢＳ法によって決定した。この方法を使用して、還元的にグリコジル化されたヘモグロビンが２６％のグルシトールで修飾された有効アミノ基を有することを確認した。そのように調製されたグルシトールーヒトヘモグロビンを、抗体特異性の特性表示のための直接結合−酵素結合蛍光測定法（ＥＬＦＡ）に使用した（実施例１０参照）。

実施例１に記載した如くして調製したグルシド−ルーバリン−グリシン−グリシン（グルシド−ルーＶＧＧ）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）　（シグマ・ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，［ｌ５Ａ）及びＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（スルホ−ＮＨ３）　［パース（Ｐｉｅｒｃｅ）ケミカル社、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ、　ＵＳＡ）を使用して、スタロス（Ｓｔａｒｏｓ）ら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５６．２２０−２２２　（１９８６）の方法の変法によって、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　（シグマ−ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＬＩＳＡ）とカップリングさせた。即ち、全ての反応原料を氷上で予備冷却した後、スルホ−ＮＨ３の１０ｍｇ／ｍｌ水溶液の２２８ｕｌをグルシド−ルーＶＧＧの２．４ｍｇ／ｍｌ水溶液の５００ｕｌに加え、混合した。次いで、蒸留水中で新たに調製したＥＤＣＩの２０ｍｇ／ｍｌ溶液の１．５ｍｌを加え、即座に混合し、氷上で１５分間反応させた。次いで、５ｍｇ／ｍｌ水溶液の１１６０ｕｌとしてＢＳＡを添加した。この反応溶液を混合し、カップリング反応を４℃で一夜継続した。次いで、約１２〜１４にの平均分子量を有するスペクトロボア・セルロース透析チュービング（アメリカン・サイエンティフィック・プロダクツ、　ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、　Ｉ！５．　ｌｌ５Ａ）を使用して、該反応混合液を４℃で蒸留水に対して徹底的に透析した。接合の程度及び抗体の特異性の両方を評価するために、ペプチド、またはペプチドとカルボジイミド、またはペプチドとカルボジイミドとスルホ−ＮＨ３を蒸留水で置換したコントロールを含めた。

実施例１に記載した如くして行った、グルシド−ルーＶＧＧ−ＢＳＡ複合体及びＢＳＡ複合体コントロール（グルシド−ルーＶＧＧＳＥＤＣＩまたはスルホ−ＮＨ５なし）のＴＮＢＳアミノ基測定は、６０の有効ＢＳＡアミノ基のうち４２％が、接合後にグルシトール＝ＶＧＧに置換されたことを示した（即ち、２５のグルシド−ルーＶＧＧペプチド／ＢＳＡキャリアー分子が存在した）。

同様にして、グルシド−ルーＶＧＧ　（実施例１に記載した如くして調製した）を、ウシ・チログロブリン（シグマ・ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）　トｈツブリングさせた。水溶性カルボジイミドとして等モル量の１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）　−カルボジイミド・メト −１）−）ルエンスルホネ−）　（ＣＭＣ）をＥＤＣＩに置換した以外は、反応原料のモル比は、Ｆ記の実施例３に記載したグルシト−ルーＶＧＧのＢＳＡに対するカップリングに使用したのと同一であった。

実施例１に記載した如くして行った、グルシド−ルーＶＧＧ−チロ複合体及びチログロブリン複合体コントロール（グルシド−ルーＶＧＧ、ＣＭＣまたはスルホ −ＮＨ３なし）のＴＮＢＳアミノ基測定は、１９４の有効チログロブリンアミノ基のうち２６％が、接合後にグルシド−ルーＶＧＧに置換されたことを示した。

実施例５：グルシトールーバリンーグリシンーグリシン−セファロースの調製２５４ｍｇのＣＭＣを５３３ｕｌのグルシド−ルーＶＧＧ　（８，６７ｍｇ／ｍ＋水）に添加することによってグルシド−ルーＶＧＧ−セファロース免疫吸着剤を調製した。

カルボジイミドを混合して溶解させた後、該ペプチド−カルボジイミド溶液を２ｍｌのＡＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢ、　ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）　（メーカーの説明書に従って予備洗浄した）に添加し、該混合物を、４ｍｌ　（１５Ｘｂメリカン・サイエンティフィック・プロダクツ、　ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、　ＩＬ、　ＵＳＡ）中で室温下で一夜逆転震盪することによって混合した。該免疫吸着剤を使用前に０．０２％ＮａＮ５の存在下で４℃で保存した。該免疫吸着剤は、実施例７に記載した如くしてアフィニティー精製に使用した。

実施例６：グルシト−ルーバリン−セフ７０−スの調製グルシド−ルーＶＧＧの代わりｌ；５９５ｕｌのグルシド−ルーバリン（１０ｍｇ／ｍｌ水）を使用した以外は、実施例５に記載したのと同様にして、グルシド−ルーバリン−セファロース免疫吸着剤を調製した。該グルシド−ルーバリンは、ＶＧＧについて実施例１に記載したのと同様にして調製した。

この免疫吸着剤も、使用前に０．０２％ＮａＮ３の存在下、４℃で保存した。咳、免疫吸着剤は、実施例７に記載した如くしてアフィニティー精製に使用した。

実施例７：グルシト−ルーバリン反応性抗体の調製複数のニューシーラント・ホワイト・雌ウサギ〔ラングショウ・ファームス（Ｌａｎｇｓｈａｗ　Ｆａｒｍｓ）　、　Ａｕｇｕｓｔａ、　Ｍｌ、　ＵＳＡＩをパイタカイチス（Ｖａ　ｉ　ｔａｋａ　ｉ　ｔ　ｉｓ）らB して調製したグルシド−ルーＶＧＧ−ＢＳＡ５００ｕｇを含有する完全フロインドアジュバントからなる乳化物２ｍｌで初回免疫した。後続の免疫をグルシド− ルーＶＧＧ−ＢＳＡ２００ｕｇを含有するフロイント不完全アジュバントの乳化物で行った。これら後続の免疫は、初回免疫の後５週間行い、その後は２〜８週間の間隔をあけて行った。

各免疫の後７〜１０日間、ネーレンベルグ（Ｎｅｒｅｎｂｅｒｇ）ら、　Ｊ、　［ｍｍｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、、　２４．１９　（］、９７８）の方法によって、耳から採血した。抗体の反応性に関し、３回目の免疫後金ての採取血液について、実施例１０に記載した如くして行った直接結合−酵素結合蛍光測定法（ＥＬＦＡ）によって、各ウサギからの血清サンプルを試験した。得られた血清は使用するまで一２０℃で凍結して保存した。

望ましい抗体の精製は、リーフ（Ｒｅｉｆ）　、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　６．７２３　（１９６９）の方法によるＤＥ−５２セルロース（ワットマン社、　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ　Ｍｉｌｌ　Ｍａｉｄｓｔ。

ｎｅ　Ｋｅｎｔ、　Ｅｎｇｋａｎｄ）上でのバッチ式イオン交換クロマトグラフィーを使用して、該血清をＩｇＧ分別することによって行った。続いて、選択された抗血清と共に、該ＩｇＧフラクションを、グルシド−ルーバリン−セファロース（実施例６に記載した如くして調製したもの）またはグルシド−ルーＶＧＧ −セファロース（実施例５に記載した如くして調製したもの）のいずれかでのアフィニティークロマトグラフィーによって更に精製するか、または、グルタルアルデヒド架橋ヒトヘモグロビンを使用してアフィニティー吸着した。

抗−グルシト−ルーＶＧＧ−ＢＳＡのアフィニティー精製は、グルシド−ルーＶＧＧ−セファロースまたはグルシド−ルーバリン−セファロースのいずれかの１ｉｌをパイオーラッド・ディスポーザブル・ポリプロピレン・エコノーカラム（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　（Ａ　ｌｌ５Ａ）中に加えることによって行った。次いで、該マトリックスを、５０ｍ１のＰＢＳ　（０，Ｏ１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ溶液）、ｐＨ７，３に続いて、３ｍｌのヨウ化カリウム（ＫＩ）を加えたＰＢＳ、ｐＨ８，０で洗浄し、次いで、５０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７，３で洗浄した。続いて、洗浄したマトリックスを、抗血清のＤＥ−５２１ｇＧフラクション１４ａ＋Ｉと共に、３７℃で２時間、回転しながらインキュベートした。結合しなかった試料を集め、その後、マ１−ＩＪックスを１０１１のＰＢＳ、ｐＨ７，３で２回洗浄し、結合した抗体を３ｍｌの２Ｍ　ＫＩ　ＰＢＳ、ｐＨ８，０で溶離させることによって集め、すぐに該溶離物を４℃で一夜２リッターのＰＢＳ、ｐＨ７，３で透析した。得られた透析アフィニティー精製抗体を直接結合及び阻害ＥＬＦＡ測定に使用した（実施例１０〜１１を参照）。

還元されていないヒトヘモグロビンと反応するおそれのある抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ試料中の抗体の除去を、以下のようにして調製した、変性したグルタルアルデヒド−不溶化ヒトヘモグロビンで抗血清のＤＥ−５２ＩｇＧフラクションをアフィニティー吸着することによって行った。ＩＭＫＩ　を含有する１　０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７，３中に溶解した２００ｏ＋ｇのヒトヘモグロビン（シグマ・ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）を、アブラミース（Ａｖｒａｍｅａｓ）及びテリンク（Ｔｅｒｙｎｃｋ）　、　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　６．５３　（１９６９＞の変法を使用して、最終グルタルアルデヒド濃度０．５％で水中で架橋した。３日間の反応の後、遠心分離法により不溶性ヘモグロビンが得られ、コールスーバックナ−（［：ｏｏｒｓ−Ｂｕｃｋｎｅｒ）ロート（アメリカン・サイエンティフィック・プロダクツ、ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、ＩＬ、ＵＳＡ＞を使用した減圧濾過によってワットマンＮ０１１濾紙（ワットマン社、　ＳｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄＭｉｌｌ　Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ　Ｋｅｎｔ、　Ｅｎｇｋａｎｄ）上に集めた。濾紙上の架橋したヘモグロビンを１リツターのＰＢＳ、ｐＨ７，３で洗浄した。次いで、それを５００ｆｆｉｌの０．０５ＭＮＨ，ＣＩと共に室温で１５分間インキュベートし、減圧濾過によって分離した。次に、該不溶化ヘモグロビンを４００ｉｌのＰＢＳ、ｐＨ７，３で洗浄し、再度、減圧濾過によって分離した。

１０牝のグルタルアノげヒト架橋ヒトヘモグロビンを２ｍｌの抗血清のＤＥ−５２フラクシヨンと共に３７℃で３．５時間回転機上で端から端まで混合しながらインキュベートすることによって、抗−グルシト−ルーＶＧＧ−ＢＳＡ　ＩｇＧフラクションから何らかの可能なヘモグロビン反応性抗体を除去するために、該洗浄した架橋ヘモグロビンを使用した。ヘモグロビン吸着した、不溶化ヘモグロビンに結合しなかったＤＥ−５２ｒｇＧ抗体を、パスツールピペットを使用して不溶化ヘモグロビン及びそれに結合したあらゆる物質から分離し、直接結合ＥＬＦＡ測定法において使用した（実施例１０参照）。

実施例８：ヒトヘモグロビンＡ　ｌｃ　（Ｈｂ　Ａ　ｌｃ）及びヒトヘモグロビンＡ０（Ｈｂ　Ａｏ）の調製ヒトＨｂＡ、ｃ及びＨｂ　Ａ　ｏを地元の血液バンクからの古い血液から精製した。

遠心分離して得た赤血球（ＲＢＣ）をＰＢＳ、ｐＨ７，３で洗浄し、２０部の蒸留水で溶血させた。残ったストロマ及び細胞を遠心分離して除去し、得られた溶解産物をラウレイ　（Ｌｏｗｒｅｙ）及びソエルナ−（Ｓｏｅｌｄｎｅｒ）　、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１５４、４２４−４３０　（１９８６）のイオン交換−ゲルｌ法の変法かまたはマツクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５３．２３２７−２３３２　＜１９８７）のイオン交換法のいずれかに付した。ラウレイ及びソエルナーの方法は、カラム容量を増加しく２．５×４２ｃｍ）、充填した溶解産物中の塩濃度を増加しく１．００ｍＭ　ＮａＣ１）　、流速を落としく１．５ｍｌ／ｈｒ）　、そして、充填したヘムタンパクの容量を減じること（０，５＋ｎｌの１０倍濃縮した溶解産物）によって変更した。混合床操作（ｍｉｘｅｄ　ｂｅｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって高純度のＨｂＡ、Ｃ及びＨｂＡＯが得られたが、その再現性からマツクドナルドらの方法が好ましかった。

いずれかの単離技術によって得られたヘモグロビン含有フラクションを検査及び４１５ｎｍでの吸光度によって確認した。種々のヘモグロビンフラクションの純度ヲ、ベックマン３４４ＨＰＬＣシステム（ベックマン・インスツルメンツ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　Ｃａ）において、４．６Ｘ３０ｍＭ−フィクロアナライザーＭＡ７Ｃカートリッジ（バイオ−ラッド・ラボリドリーズ、　ＲｉｃｈＩＩＩａｎｄ、　ＣＡ、　ｌｌ５Ａ）を使用する分析陽イオン交換ＨＰＬＣによって評価した。ヘモグロビンの分別は、メーカーが添付したプロトコール（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、　ｌｌ５Ａ）に従って行った。即ち、２０ｕ１のヘモグロビン含有サンプルを予め２０ｍＭビス−トリス、［）Ｈ６，０で平衡にしたマイクロアナライザーＭＡ７Ｃカートリッジに注入し、同じビス−トリス緩衝液系での一次塩勾配（０から１．００ｍＡｌ　ＮａＣＩ）を使用することによって、流速１．５ｍｌ／分で６分を要して、ヘモグロビンフラクションを得た。ヘモグロビン含有フラクションは、ベックマン１６３可変波長検出器（ベックマン・インスツルメンツ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　Ｃａ）を使用した４１５ｎｍでノヘム吸光度によって検出した。ヘモグロビンフラクションは、４１５ｎｍでの吸光度によって検出し、既知量のヒトヘモグロビンＡ＋ｅ（パイオーラッド・ラボラトリーズ、　Ｒｉｃｈｎ＋ｏｎｄ、　ＣＡ、ＵＳＡ）を含有するスタンダードと比較した。精製したヘモグロビンフラクションは、直接結合または阻害ＥＬＦＡ測定法において使用する（実施例１０〜１２を参照）まで４℃で保存した。

実施例９：ヘモグロビン抗原の還元ヘモグロビン含有サンプル（例えば、精製したヘモグロビン、ヘモグロビン成分または患者からのＲＢＣ溶解産物）中に例え少しでも存在するＨｂＡｌｃを検出及び定量できるように、ヘモグロビン含有サンプルをまずＮａＢＨ，で還元し、サンプル中に存在する全てのＨｂＡ、Ｃのβ鎖のＮ−末端上のグルシド−ルーバリンを形成しなければならない。次いで、サンプル中に存在する還元されたＨｂＡ印は、抗血清中に、抗血清のＤＥ−５２部ｇＧフラクション中に、及びアフィニティー精製及びアフィニティー吸着した物質中に（全て実施例７に記載した如くして調製した）存在する抗グルシドールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体と反応することができる。固相吸着ヘモグロビンの還元は、直接結合ＥＬＦＡにおけるグルシ）　−ルーバリンの検出に必要であり、固相及び液相ヘモグロビンの両方の還元は、阻害ＥＬＦＡ測定に必要である（実施例１０〜１４参照）。固相吸着ヘモグロビン及び液相ヘモグロビンの還元は別々に説明する。

予めポリスチレンマイクロタイターウェルに吸着したヘモグロビン（実施例１０〜１４＠照）をＰＢＳ、ｐＨ７，３中の５０ｍＭ　ＮａＢＨ４を添加するコキによって還元した。還元溶液の容量は、ヘモグロビンのコーティングに使用した容量と等しかった。４℃で一夜還元した後、該プレートを、ウェルをＰＢＳＡ　（０゜１５ＭＮａＣ＋、１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０．０．０２％ＮａＮ＋、ｐＨ７゜３を含有する０、０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液）で満たし、デカンテーションするかまたは吸引することによって洗浄し、残ったＮａＢＨ，を除去した。次いで、該プレートを、ＰＢＳ、ｐＨ７，３中の１％（重Ｖ容量）卵アルブミンを使用したバックコーティングによって、実施例１０に記載した方法で処理した。

液相ヘモグロビンザンブルの還元は、還元されるヘモグロビン溶液の各容量に対して３倍容量の、０．０１％ＢＳＡ、ｐＨ７，３を含有するＰＢＳ中の５０ｍＭＮａＢＨ，（還元溶液）を添加することによって行った。この還元方法を使用して還元されなかったヘモグロビンの見掛は濃度は、４１５ｎｍでのヘム吸光度によって測定して０．５〜１．Ｏｍｇ／１０１であった。該ヘモグロビンを還元溶液と共に緩やかに渦を巻かせることによって混合し、次いで、３７℃で３時間反応させ、その後、該還元混合液をＰＢＳＡを使用して１：１０に希釈した。この希釈は、ＮａＢＨａ濃度を抗体の反応性に干渉しないように決定されたレベルの３．３７ｍＭ　Ｎ　ａ　ＢＨ。

に低下させ、この希釈され還元された物質は、阻害ＥＬＦＡにおける阻害因子としてすぐにでも利用できた（実施例１１参照）。

赤血球（ＲＢＣ）溶解産物から得られたヘモグロビンのＮａＢＨ，還元は、精製したＨｂＡｌｃまたはＨｂＡｏについて上記した方法と類似の方法で行った。生理食塩水で洗浄したＲＢＣを蒸留水で１：２０に希釈することによって溶血した。

不溶性の溶血片を静置または遠心分離することによって除去し、集めた溶解性上清溶解産物のヘモグロビン濃度を測定した。固相吸着溶解産物の還元は、ＨｂＡｌＣについて上記した如くして行った。液相溶解産物の還元は、未還元ヘモグロビンの初期濃度を０．５〜１−０ｍｇ／ｍｌの代わりに２ｍｇ／ｍｌを使用した点だけ上記の方法と相違した。

全血液溶解産物の使用（実施例１３及び１４）には、それら実施例において詳細に記載する還元実験方法において変動させることが必要である。

実施例１０コ直接結合−酵素結合蛍光測定法（直接結合ＥＬＦＡ）２００μｍの抗原（例えば、グルシド−ルーＶＧＧ−ＢＳＡ、グルシド−ルーＶＧＧ−チロ、グルシド−ルーヒトヘモグロビン、ＣＮＢＨ３コントロール、Ｈｂ　Ａ　Ｉ　Ｃ，Ｈｂ　Ａ　Ｏ、または、実施例１〜６及び８〜９で記載した如く調製した糖尿病患者由来のＲＢＣの溶解産物）をマイクロフルオル（Ｍｉｃｒｏｆ　Ｉｕｏｒ）　“Ｂ″ブラツクポリスチレン・マイクロタイター・プレート（ダイナ１ツク・ラボラトリーズ、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ、　ＬＩＳＡ）のウェルに加えた。該抗原がウェルに吸着できるように、該プレートを３７℃で２時間インキュベートした。該抗原に０．ＩＭＮａＣＯｓ、ｐＨ９，８中の５％ｇ／ｎ＋Ｉタンパクをコーティング濃度で添加した。

結合しなかった抗原をデカンテーションするかまたは吸引することによって除去し、予備的還元を必要とする吸着した抗原（例えば、ＨｂＡｌｃ、ＨｂＡ、及びＲＢＣ溶解産物）について実施例９に記載した如くして、ＮａＢＨ，還元を行った。該プレートを、ウェルをＰＢＳＡで満たし、デカンテーションするかまたは吸引することによって５回洗浄して、残存したＮａＢＨ４を除去した。既にグルシトールを持っている抗原については、この還元及びＰＢＳＡ洗浄処理を省略した。

続いて、残ったポリスチレンタンパク結合部位を、１％卵アルブミン（シグマ− ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ＞及び０．０２％ナトリウムアジド、ｐＨ７，３を含有するＰＢＳでウェルを満たすことによって遮蔽し、３７℃で１時間インキュベートした。デカンテーションまたは吸引の後、ＰＢＳＡで逐次希釈した２００ｕ１の抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体試料（例えば、抗血清、ＤＥ−５２部ｇＧフラクション、アフィニティー精製抗体、またはアフィニティー吸着抗体、全て実施例７の如くして調製されるンをウェルに添加し、給温室中で４℃で一夜インキユベートした。

次に、該マイクロタイターウェルを上記の如＜ＰＢＳＡで５回洗浄し、ＰＢＳＡでｌ：２０００に希釈したビオチン−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（ベクター・ラボラトリーズ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ、　ｔｌｓＡ）を２００ｕｌ／ウェル加え、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＡで５回洗浄した後、ＰＢＳＡで１ご２０００に希釈したストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ〔ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）　・リサーチ・ラボラトリーズ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯ，ＵＳＡＩを２００ｕｌ／ウェル加え、３７℃で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＡでの最終５回洗浄後、ＰＢＳ。

ｐＨ７，５中の０．１■１０１４−メチル−ウンベリフェリル−β−ガラクトピラノシド基質を２００ｕｌ該マイクロタイターのウェルに添加し、３６５ｎｔｓの励起波長と４５０ｎｍの発光波長を使用して、マイクロフルオル読み取り機（ダイナチック・・ｆンスッルメンツ、　Ｔｏｒｒａｎｃｅ、　Ｃａ、　ＵＳＡ）で、メチルウンベリフェロンの蛍光ヲ相対的蛍光単位（ＲＦＵ）として測定した。

抗原を欠くだけで上記と同様の方法で処理したコントロールウェル（抗原なしのコントロール）、抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体試料を欠くだけのコントロールウェル（第一抗体なしのコントローノリ及び遮蔽処理し及び基質を添加しただけのコントロールウェル（基質ブランク）を含めた。抗原なしのコントロール及び第一抗体なしのコントロールは、抗体の特異的結合及び標識剤についての正確な読み取りに役立つ一方、基質コントロールは非酵素的基質加水分解についての補正を可能にした。

Ｒ，ＢＣ溶解産物試料の直接結合測定については、上記の実験方法を少し変更した。このＲＢＣ溶解産物についての変更とは：あとの遮蔽処理がないこまと共に１０ｕｇ／ｍｌタンパクコーティング濃度を使用すること１５回のＰＢＳＡ洗浄の代わりにＰＢＳ、ｐＨ７，５で３回洗浄すること：ストレブトアビジンーβ− ガラクトンダーゼでの０．５時間のインキュベート以外は、全試薬を周囲温度で１時間インキュベートすること；及び固定飽和濃度（１：１００希釈）で抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体試料を使用することであった。

代表的な直接結合ＥＬＦＡ結果を図１〜３及び５〜７に示した。この結果は、次のようにまとめることができる。

グルシド−ルーＶＧＧ−ＢＳＡに対して調製し、グルシド−ルーＶＧＧ−セファロースを使用してアフィニティー精製した抗体は、グルシド−ルーＶＧＧ−ＢＳＡ及びグルシド−ルーＶＧＧ−テロを認識した（図１及び３）。これら抗体は、還元されたグリコジル化天然ヘモグロビン（図３）及び還元された精製ＨｂＡ＋ｃ（図２）とも反応したが、還元されたグリコジル化天然ヘモグロビン（図２におけるＨｂＡｏ）及びＣＮ　Ｂ　Ｈ，コントロール（図３におけるグルコースの不存在化で還元的にグリコジル化したヘモグロビン）とは反応しなかった。使用したＨｂＡｏは、イオン交換クロマトグラフィーによって調製したものであり、ＮａＢＨ４処理によって還元された、有効なε−アミノ基上でグリコジル化された分子を含有していたものと考えられる。

グルシド−ルーＶＧＧ−ＢＳＡを使用して調製しグルシド−ルーバリン−セファロースのカラムでアフィニティー精製した抗体は、グルシド−ルーＶＧＧ−セファロースで精製した抗体と同様な特異性を示した（図２を図５と比較のこと）。

同様に、グルシド−ルーＶＧＧ−ＢＳＡに対して調製し、架橋ヒトヘモグロビン（未還元グリコジル化バリン及びリジン残基を含有していたものと考えられる）を使用してアフィニティー吸着した抗体は、グルシド−ルーＶＧＧ−セファロースマタはグルシド−ルーバリン−セファロースでアフィニティー精製した抗体と同様な特異性を示した。図１〜３及び５〜７を参照のこと。

最後に、糖尿病患者由来のＲＢＣ溶解産物を使用した直接結合ＥＬＦＡの結果は、標準電気泳動法を使用して別途得られた１（ｂＡ−ｃの測定と相互によく関連している。典型的な回帰分析曲線である図４を参照のこと。

該電気泳動法は、グリコジル化ヘモグロビン測定のためのシバーコーニング電気泳動キット（シバ　コーニング、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ、カタログＮｏ、　４７００５５＞を使用して行った。該電気泳動法は、メーカーの説明書に従って行った。

実施例１１：阻害酵素結合蛍光測定法（阻害ＥＬＦＡ）実施例１Ｏの直接結合ＥＬＦＡと２カ所変更しただけの同じ方法で、固相吸着された還元ＨｂＡＩＣ抗原を使用して阻害Ｅ　Ｌ　Ｆ　Ａを行った。第一に、グルシトールーＶＧＧ−セファロース上でアフィニティー精製した抗−クルシトール−ＶＧＧ−ＢＳＡ抗体の一定濃度を使用した。使用した濃度は、固相吸着し、たＮａＢＨｌ−還元ＨｂＡ、ｃ抗原での直接結合ＥＬＦＡにおいて、５０％またはそれ未満の最大結合を得るのに必要な抗体の濃度である。

第二に、固定した濃度の抗体に、ＨｂＡ＋ｃ抗原または糖尿病患者由来のＲＢｃの溶解産物からなる阻害因子を濃度を変化させて混合した。この両者は、実施例９に記載した如くして予め還元し、次いで、抗体を添加する前にＰＳＢＡ中で逐次希釈したものである。３７℃で２時間インキュベートした後、ＨｂＡｌｃでコーティングし、ＮａＢＨ４で還元し゛、ＰＳＢＡで洗浄し、次いで、実施例９及び１０に記載した如くして、卵アルブミンで遮蔽したウェルに、２００ｕｌの抗体−阻害因子混合液を添加した。阻害結合ＥＬＦＡにおける抗体−阻害因子混合液の添加は、直接結合ＥＬＦＡにおける抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体試料の添加に対応している。

阻害ＥＬＦＡのためのコントロールは、抗原なしのフントロール、第一抗体なしのコントロール、基質ブランク、及び、阻害因子を欠く以外は液相還元ＨｂＡ、Ｃ阻害因子と同じく処理した、抗体と希釈した還元混合液からなる、ＮａＢＨ４還元の効果のためのコントロールであった。

抗体結合の代表的な阻害は、還元された液相ＨｂＡ＋ｃについては図８に及び還元された糖尿病患者からのＲＢＣ溶解産物サンプルについては図９に示されている。ＲＢＣ溶解産物は、電気泳動法によって８．４％ＨｂＡ工を含有することが予め明らかにされていた。回帰分析は、検討した５つのサンプルについて、阻害ＥＬＦＡにおいて５０％阻害を得るのに必要なＲＢＣ溶解産物の量と電気泳動法によって決定された同じサンプル中に存在するＨｂＡＩＣの量の間の一次的関係を証明している（図１０参照のこと）。

実施例１２：阻害酵素結合蛍光測定法（阻害ＥＬＦＡ）架橋ヒトヘモグロビンで吸着された抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体を抗体きして使用し、グルシド−ルーＶＧＧを阻害因子として使用した以外は、実施例１１を繰り返した。結果を１１図に示した。それから分かるように、試験したクルジトール　ＶＧＧが高濃度である場合には、グルシド−ルーＶＧＧは、還元されたＨｂＡ、Ｃに対する抗体の結合の１００％を阻害した。

実施例１０〜１２からのデータをひとまとめに考えると、グルシド−ルーＶＧＧ −セフｒロース若しくハクルントールーバリンーセファロースでアフィニティー精製したか、または、架橋ヒトヘモグロビンでアフィニティー吸着した抗−グルシトールーＶＧＧ−ＢＳＡ抗体は、グルシド−ルーバリンを特異的に検出していることが明らかである。該アフィニティー精製またはアフィニティー吸着した抗体は、依然として高い力価を有している。かくして、本発明の方法は、そのＮ− 末端アミノ酸上でグリコジル化されたタンパクを検出する免疫学的測定法において有用な、特異性が高く力価の高い抗血清及び抗体試料を、モノクローナル抗体を調製することなしに得る簡単な方法を提供するものである。もちろん、望ましいければ、モノクローナル抗体を使用してもよい。

実施例１３：全血溶解産物を使用する直接結合−酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）この実施例は、実施例１０に記載した方法の応用である直接結合測定法を説明する。）（ｂＡ＋ｃ源として全血を利用し、速可視化比色エンドポイント法（ｒｅａｄ　ｉ　１ｙ　ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を採用した。完全な測定は全部で約３〜４時間で行うことができる。

予めＥＤＴへ＝７−トしたベクタイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）管（バクトン１ジキンソン、　Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、　ＮＪ　０７０７０）中に捕集した血液１滴を、５．７５インチのノでスツール型使い捨てピペット　（サイエンティフィック・プロダクツ、　ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、ＩＬ。

ＵＳＡ）で、１２Ｘ７５ｍポリスチレン管（サイエンティフィック・プロダクツ。

ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、比、　ＵＳＡ）中の蒸留水１ｍｌに加えた。混合した後、室温で１５分間インキュベートすることによって、得られた全血溶解産物で該管をコートした。

吸引によってコーティング溶液を除去し、ＰＢＳ中の５０ｍＭ　ＮａＢＨ４］、ｍｌを加え、室温で１０分分間光を行った。

次いで、咳管をＰＢＳで３回洗浄した。管をＰＢＳで満たし、次いで、洗浄緩衝液を吸引することによって洗浄を行った。

ＰＢＳＡでＩ　：　１００に希釈した、抗−グルシト−ルーバリン反応性抗体（アフィニティー精製もアフィニティー吸着もしていないことを除いては、実施例７に記載した如く調製したもの、即ち、ＤＥ−５２精製ＩｇＧフラクション）を加え（各管に１ｍ１）、室温で４５分間インキュベートした。

ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳＡで１＝２０００に希釈した、］、ｍｌのビオチン−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ベクター・ラボラトリーズ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、　ＬＩＳＡ）を加え、室温で０．５時間インキュベートした。３回のＰＢＳ洗浄後、ＰＢＳＡで１＝２０００に希釈した、１１Ｔｌｌのストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（ベセスダ・リサーチ−ラボラトリーズ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯ，［１ＳＡ）を加え、室温で１５分間インキュベートした。４回のＰＢＳ洗浄後、０．１．Ｍ２−メルカプトエタノール及び５＋ｎＭＭｇＣ１□を含有する０、　１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液。

ｐ　Ｈ７，３中の０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）基質（シグマ・ケミカル社、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）　４ｍｇ／ｍｌ溶液の１ｆｆ１１を加え、室温で４０分間インキュベートした。既知量のＨｂＡｌｃを含有するスタンダード（バイオ−ラッド・ヘモグロビンＡＩＣ・ミニまたは／及びマイクロ・カラム・テスト・キャリブレータ、バイオ−ラッド・クリニカル・ディビジョン、　Ｈｅｒｃｕｌｅｓ。

（：Ａ、　ＵＳＡ）を使用し、スタンダードと得られた黄色ニトロフェノール生成物の全血溶解産物とを比較することによって、全血溶解産物中のＨｂＡ、ｃの相対量を決定した。

糖尿病患者由来の全血溶解産物中のＨｂＡｌｃの量を測定するこの方法を使用し７て得られた結果は、図１２に示したように、同じ患者からのＲＢＣ溶解産物の電気泳動法によって得られたＨｂＡｌｃのパーセントと相互によく関連している（相関係数は０．９７２４である）。該電気泳動測定は、実施例１０に記載した如くして行った。

実施例１４：阻害因子として全血溶解産物を使用する阻害酵素結合蛍光測定法この実施例は、実施例１１に記載した阻害測定方式の応用を記載したものである。

ＨｂＡ　ｌｃ源として全血溶解産物を使用した。

２００μｍの抗原（１１，４％ＨｂΔ、Ｃを含有していると測定されたパイオーラッド・ヘモグロビンＡ、ＩＣマイクロカラム・テスト・スタンダード）を０．１ＭＮａＨｃｏ、、ｐＨ９，８での総ヘモグロビンの濃度］、Ｏｍｇ／ｍｌで、マイクロフルオル“Ｂ”マイクロタイターウェルに加え、３７℃で２時間、ウェルをコートさせた。

結合しなかった抗原をデカンテーションするかまたは吸引することによって除去し、吸着した抗原をＰＢＳ中の５０ｍＭ　ＮａＢＨ４で該ウェルを満たすことによって還元し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、０．１％ツイーン２゜（シグマ・ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，［ｌＳＡ＞を含有するＰＢＳでウェルを洗浄し、１％卵アルブミン（ジグ？−ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＬＩＳＡ）及び０．０２％ナトリウムアジド、ｐＨ７，３を含有するＰＢＳでウェルを満たし、３７℃で１時間インキュベートして、全ての残存ポリスチレン・タンパク結合部位を遮蔽した。

コーティング、還元及びバックコーティングの間、実施例１３に記載した如く調製した抗−グルシト−ルーバリン反応性抗体をＮａＢＨ，−還元阻害因子（全血溶解産物またはパイオーラッド・ヘモグロビンＡ　Ｉ　Ｃ・キャリブレータ、バイオ−ラッド・クリニカル・ディビジョン、　Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、　ＣＡ、　ｌｌ５Ａからなるスタンダードのいずれか）と共にインキュベートした。これら阻害因子の還元は、還元溶液中のＮａＢＨａの濃度が５００−であり、かつ、還元時間が３７℃で１時間であったこ々を除いては、ＲＢＣ溶解産物について実施例９に記載した如くして行った。

あとの阻害測定法は、以下を除いては、実施例１１に記載したものと同一であった：（１）０．１％のツイーン２０を含有するＰＢＳ：＆浄を行ったこと、及び（２）ビオチン−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧでのインキュベーション時間が４℃で一夜であったこと。

阻害因子として糖尿病患者の全血溶解産物を使用した抗体結合の阻害を示す代表的な投与応答曲線を図１３に示す。ここに記載した阻害方法によって得られた、糖尿病患者由来の全血溶解産物中の１（ｂＡｉｃの量の測定結果を、同じ糖尿病患者由来のＲＢＣ溶解産物の電気泳動によって得られた結果と比較して、回帰分析を行った（電気泳動は実施例１０に記載した如くして行った）。試験した８糖尿病サンプルのうちの５についての２つの技術を比較した回帰分析結果のグラフを図１４に示す。これら５サンプルについての相関係数は０．９７６２であった。該８サンプルのうちの６、該８サンプルのうちの７及び咳８サンプルのうちの８サンプルの回帰分析によって、それぞれへ相関係数０．７０９８．０．４８９９及び０，０７７４が得られた。これら３つのサンプルが何故このようなばらついた結果を与えるのかについては未だ明らかではない。

図１３及び図１４においては、全血溶解産物のヘモグロビン濃度は、該溶解産物の４１４ｎｍにおける吸光度を、蒸留水に溶解して希釈した逐次希釈ヘモグロビンスタンダード（シグマ・ケミカル社、　ＳＬ　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ｌｌ５Ａ）の吸光度と比較することによって決定した。

実施例１５：全血溶解産物を使用する直接結合−酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）ＨｂＡ、Ｃ源として全血溶解産物を使用した直接結合ＥＬＩＳＡをマイクロタイター・プレートを使用して行った。完全な測定は全部で約３〜４時間で行うことができる。

血液サンプルを蒸留水で１２００に希釈することによって溶解し、続いて、ヘモグロビン濃度を０．１Ｍ　ＮａＣ０＊、ｐＨ９，６（：ｌＩ−ティング緩衝液）中１０μｇ／ｒｎＩになるように調整した。ヘモグロビン濃度は、該溶解産物の４１４ｎａ＋にあける吸光度を、蒸留水に溶解して希釈した逐次希釈ヘモグロビンスタンダード（シグマ・ケミカル社、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）の吸光度と比較することによって決定した。既知量のヘモグロビンＡ１ｃを含有するスタンダード（バイオ−ラッド・ヘモグロビンＡｒｃ−ミニ及び／またはマイクロカラム・テスト・キャリブレータ、バイオ−ラッド・クリニカル・ディビジョン、　Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、　ＣＡ、　［ｌ５Ａ）は、コーティング緩衝液で１０μｇ／ｆｆ１ｌに希釈した。

２００μｍの抗原（即ち、希釈した糖尿病患者全血溶解産物または既知量のヘモグロビンＡ　＋ｃを含有する希釈したスタンダード）をイムロン２プレート（ダイナチック・ラボラトリーズ、　Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、　ＶＡ、　ＵＳＡ）のウェルに加えた。該抗原がウェルの固体表面に吸着できるように、該プレートを３７℃で１時間インキュベートシた。コーティング緩衝液中１０μｇ／ｍｌのコーティング濃度で該抗原を添加した。

後の処理は、以下を除いては、実施例１０に記載した直接結合ＥＬＦＡにおいて使用したのと同様であった：１、ＰＢＳ、ｐＨ７，３中の５０ｍＭ　Ｎ　ａ　ＢＨ４での還元を室温で０．５時間行ったこと；２、抗−グルシト−ルーバリン−抗体（実施例１３に記載した如く調製した）でのインキュベーションを、抗体の１／２０希釈液を使用して、３７℃で４５分間行ったこと；３、ビオチン−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧでのインキュベーションを、抗体の１／２０００希釈液を使用して、３７℃で４５分間行ったこと：４、ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼでのインキュベーションを室温で２０分間行ったこと：５、試薬を添加した間の全ての洗浄を、０．１％ツイーン２０．ｐＨ７，３を含有するＰＢＳを使用して３回行ったこと；６、基質が、ａ）０．１Ｍ　２−メルカプトエタノール及び５ｍＭ　ＭｇＣＩ　２を含有する０、　１　Ｍ　Ｕン酸す）　ＩＪウム緩衝液、ｐＨ７，３（比胡基質緩衝液）中におけるＩ＋ｇ／ｍｌ濃度の０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）　（シグマ・ケミカル社、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ｌｌ５Ａ）であるか、または、ｂ）比色用基質Ｍ衝液中における０、６＋ｎｇ／ｍｌ濃度のクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）　（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、　ＩＮ、　ＵＳＡ）であったこと：及び７．０ＮＰＧ基質＆４０分間反応した後、４０５ｎｍで吸光度を測定したこさ。

ＣＰＲＧについては、反応時間が９分で５７０＋ｍで吸光度を測定したこと。

図１５は、直接結合ＥＬＩＳＡを使用して糖尿病患者由来の全血溶解産物中の）Ｉ　ｂ　Ａ　Ｉ　Ｃを測定するこ止によって得られた結果を、アミノフェニルボロネート・システム［ＧＩ　ｙｃ　−Ａｆ　ｆ　−Ｇｈｂ、　イソラボ（Ｉｓｏｌａｂ）社、　Ａｋｒｏｎ、　ＤＨ，ＵＳＡＩを使用して得られた結果との比較を示す。これは、メーカーの説明書に従って行い、同じ糖尿病患者由来のＲＢＣ溶解産物中のＨｂＡ、Ｃを測定した。直接結合ＥＬＩＳＡを使用して得られたＨｂＡ、ｒのパーセンテージとイソラボ・アミノフェニルポロネート・カラム・システムを使用して得られたＨ　ｂ　Ａ　＋。のバー七ン−ｒ　−ジは、０ＮＰＧ　（相関係数−０，９７０８）及びＣＰＲＧ　（相関係数−０，９７１２）基質の両方について同じであった。

ＦＩＧ、１ＦＩＧ、３ＦＩＧ、５ＦＩＧ、７ＦＩＧ、９ＦＩＧ、１００／。結合阻害ＦＩＧ、１２電気泳動法によるＨｂＡｌｃのパーセントＦＩＧ、１４回帰分析国際調査報告１−−＾−１−″φＭＴ／＋Ｉ＜Ｑｎ／ｎムロ６６１＋＋ｌｅ＋＊５ｌｌｅｎａｌ　Ａ帥ｋｌ１Ｍ＋ｔ　ｌ軸　ＤＩ”〒／１ＩｅＱｌ’ｌ／ｎＡ＆＋４ＰＣＴ１０Ｓ９０１０４６６６

Claims

【特許請求の範囲】

１．式：（Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌ）ｎ−キャリアーを有する免疫原として有用な化合物。ここで、Ｘは、そのＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基上で非酵素的にグリコシル化されたタンパクの、リジンを除くＮ−末端アミノ酸であり；Ｌは、結合手または連結基であり；Ｇｌｃ−ｏｌは、該グリコシル化されたタンパク上のＸに結合した糖の還元型であって、Ｇｌｃ−ｏｌは、Ｘのα−アミノ基に結合しており；キャリアーは該グリコシル化されたタンパク以外の免疫原性化合物であり；そしてｎは１から該キャリアー上の有効な結合部位の数までの数字である。
２．Ｇｌｃ−ｏｌがグルシトールである、請求項１記載の化合物。
３．Ｘがパリンである、請求項１記載の化合物。
４．Ｌがグリシン−グリシンである、請求項１記載の化合物。
５．キャリアーが、ウシ血清アルプミンまたはウシチログロブリンである、請求項１記載の化合物。
６．Ｘがパリンであり、Ｌがグリシン−グリシンである、請求項２記載の化合物。
７．キャリアーが、ウシ血清アルプミンまたはウシチログロブリンである、請求項６記載の化合物。
８．Ｎ−末端アミノ酸のα−アミノ基上で非酵素的にグリコシル化されたタンパクのＮ−末端アミノ酸上の糖を還元した後に、そのタンパクと反応性である抗体を調製する方法であって、請求項１記載の化合物で動物を免疫することを含む方法。
９．タンパクが、グルコースまたはその誘導体でグリコシル化される、請求項８記載の方法。
１０．グリコシル化されたタンパクがヘモグロビンである、請求項９記載の方法。
１１．グリコシル化されたタンパクがＨｂＡ１ｃであり、Ｇｌｃ−ｏｌがグルシトールであり、Ｘがパリンである、請求項１０記載の方法。
１２．Ｌがグリシン−グリシンである、請求項１１記載の方法。
１３．キャリアーが、ウシ血清アルプミンまたはウシチログロブリンである、請求項１２記載の方法。
１４．Ｘがパリンである、請求項８記載の方法。
１５．Ｌがグリシン−グリシンである、請求項８記載の方法。
１６．そのＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基上で非酵素的にグリコシル化されたタンパクの免疫学的測定法であって：該グリコシル化されたタンパクを含有するサンプルを用意すること；該Ｎ−末端アミノ酸上の糖残基を還元するために、該グリコシル化されたタンパクを還元剤と反応させること；該還元されたグリコシル化タンパクをＧｌｃ−ｏｌ−Ｘに向けられた抗体と反応させること、ここで、Ｘは、該グリコシル化されたタンパクの、リジンを除くＮ −末端アミノ酸であり、Ｇｌｃ−ｏｌは、該グリコシル化されたタンパク上のＸに結合した糖の還元型である；及び該抗体に結合した該還元されたグリコシル化タンパクを検出または定量すること、を含む免疫学的測定法。
１７．Ｘがパワンである、請求項１６記載の方法。
１８．タンパクが、グルコースまたはその誘導体でグリコシル化される、請求項１６記載の方法。
１９．グリコシル化されたタンパクがヘモグロビンである、請求項１８記載の方法。
２０．グリコシル化されたタンパクがＨｂＡ１ｃであり、Ｇｌｃ−ｏｌがグルシトールであり、Ｘがパリンである、請求項１９記載の方法。
２１．サンプルが、ＨｂＡ１ｃを放出するように溶血された全血である、請求項２０記載の方法。
２２．ＨｂＡ１ｃが比色的に検出または定量される、請求項２１記載の方法。
２３．更に、該放出されたＨｂＡ１ｃで個体表面をコーティングする処理を含む、請求項２１記載の方法。
２４．還元されたＨｂＡ１ｃが比色的に検出または定量される、請求項２３記載の方法。
２５．そのＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基上で非酵素的にグリコシル化されたタンパクを検出または定量するためのキットであって：Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘに向けられた第一抗体の入った容器、ここで、Ｘは、該グリコシル化されたタンパクの、リジンを除くＮ−末端アミノ酸であり、Ｇｌｃ−ｏｌは、該グリコシル化されたタンパク上のＸに結合した糖の還元型である、を含むキット。
２６．更に、グリコシル化されたタンパクのＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基上の糖残基を還元するための還元剤の入った容器を含む、請求項２５記載のキット。
２７．更に、抗体に結合した還元されたグリコシル化タンパクを検出または定量するのに有用な標識成分の入った容器を含む、請求項２６記載のキット。
２８．標識成分が、第一抗体に反応性である第二抗体である、請求項２７記載のキット。
２９．更に、抗体に結合した還元されたグリコシル化タンパクを検出または定量するのに有用な標識成分の入った容器を含む、請求項２５記載のキット。
３０．標識成分が、第一抗体に反応性である第二抗体である、請求項２９記載のキット。
３１．Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘに向けられた抗体であって、Ｘが、非酵素的にグリコシル化されたタンパクの、リジンを除くＮ−末端アミノ酸であり、Ｇｌｃ−ｏｌが、該グリコシル化されたタンパク上のＸに結合した糖残基の還元型である抗体。
３２．グリシトールーパリンに向けられた、請求項３１記載の抗体。
３３．請求項１記載の免疫原を調製する方法であって：還元的にＸをグリコシル化して、Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘを生成すること；連結基を使用する場合には、Ｇｌｃ −ｏｌ−Ｘをしにカップリングすること；及びＧｌｃ−ｏｌ−ＸまたはＧｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌを免疫原性キャリアーにカップリングすること、を含む方法。
３４．Ｇｌｃ−ｏｌがグルシトールであり、Ｘがパリンであり、Ｌがグリシン− グリシンである、請求項３３記載の方法。
３５．請求項１記載の免疫原を調製する方法であって：ＸをＬにカップリングして、Ｘ−Ｌを生成すること；還元的にＸ−Ｌをグリコシル化しこ、Ｇｌｃ−ｏｌ −Ｘ−Ｌを生成すること；Ｇｌｃ−ｏｌ−Ｘ−Ｌを免疫原性キャリアーにカップリングすること、を含む方法。
３６．Ｇｌｃ−ｏｌがグルシトールであり、Ｘがパリンであり、Ｌがグリシン− グリシンである、請求項３５記載の方法。