DE69028784T2

DE69028784T2 - Testverfahren von glykosylierten proteinen unter verwendung eines antikörpers gerichtet gegen reduzierte glykosylierte n-terminal-aminosäuren

Info

Publication number: DE69028784T2
Application number: DE69028784T
Authority: DE
Inventors: Byron Anderson; Lyman Davis
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 1989-08-23
Filing date: 1990-08-17
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2010-08-18
Also published as: DE69028784D1; EP0487621B1; EP0487621A1; AU6346690A; JPH05500111A; JP3124028B2; EP0487621A4; ATE143673T1; WO1991002978A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen und Quantifizieren glykosylierter Proteine. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf einen Immuntest zum Bestimmen und Quantifizieren von Proteinen, die an ihrer Amino-Terminal- (N-Terminal-) -Aminosäure glykosyliert sind. Eines dieser Proteine ist Hämoglobin A1c (HbA1c), und die Erfindung richtet sich insbesondere auf Immuntests zum Bestimmen und Quantifizieren von HbA1c. Die Erfindung betrifft auch Antikörper, die für reduzierte glykosylierte N-Terminal- Aminosäuren spezifisch sind, welche bei den Immuntests nach der Erfindung verwendet werden, sowie auf Immunogene und Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper.
Die (auch "Glykation" genannte) Glykosylierung von Proteinen in vivo kann entweder enzymatisch oder nicht-enzymatisch erfolgen. Bei der nicht-enzymatischen Glykosylierung wird ein Zucker kovalent an die epsilon-Aminogruppen verfügbarer Lysinreste oder an die alpha-Aminogruppe von zugänglichen Amino-Terminal- (N-Terminal-) -Aminosäuren des Proteins gekoppelt.
Die nicht-enzymatische Glykosylierung von Proteinen mit Glykose geht in zwei Stufen vor sich. Zunächst verbindet sich die Glukose mit der Aminogruppe des Lysins oder der N- Endaminosäure, um eine Aldiminverbindung (eine Schiff-Base) zu bilden. Diese Reaktion ist reversibel, und es erfolgt leicht eine Dissoziation in ein unmodifiziertes Protein und Glukose. Als nächstes wird das Zwischenprodukt Aldimin durch die Amadon-Umlagerung in einen stabilen Ketoamin-Abkömmling (1-Desoxyfructose) umgewandelt. Schließlich bildet das freie Carbonyl der Ketoamin-Abkömmlinge über einen Zeitraum von Wochen Quererbindungen zwischen dem glykosylierten Protein und benachbarten Proteinen, und die sich ergebenden Aggregate werden fortgeschrittene Glykosylierungsprodukte genannt.
Die nicht-enzymatische Glykosylierung erfolgt bei normalen Säugetieren und in einem viel größeren Ausmaß bei diabetischen Patienten. Von Diabetes heimgesuchte Patienten sind unfähig, Glukose in üblicher Weise zu metabolisieren, was zu erhöhten Mengen an Glukose in ihrem Blute und Urin führt. Bei Diabetikern und normalen Individuen wurde von Glukose gezeigt, daß sie sich nicht-enzymatisch an die Aminogruppen vieler Proteine, einschließlich von Hämoglobin, Kollagen, Albumin, Linsenkristalline, Fibrinogen, Lipoproteine, Ferritin, Myelin, Transferrin und Immunoglobuline, bindet, obwohl eine solche Glykosylierung in größerem Ausmaß bei Diabetikern als bei normalen Menschen stattfindet.
Die quantitative Messung glykosylierter Proteine bei Diabetes ist aus zwei Gründen klinisch von Bedeutung. Erstens gestattet die Messung des Spiegels an glykosyliertem Protein die Überwachung des Blutzuckerspiegels über einen ausgedehnten Zeitraum und erlaubt die Beurteilung der diabetischen Stoffwechselsteuerung. Der Zeitraum, über welchen die mittleren Glukosekonzentrationen im Blut festgestellt werden können, wird in weitem Ausmaße von der Zeitdauer bestimmt, während welcher ein gegebenes getestetes Protein für gewöhnlich im Kreislaufe verbleibt. Da Transferrin und menschliches Serumalbumin normalerweise während einer kurzen bis mittleren Zeitdauer im Kreislauf vorliegen (die Halbwertszeit von Transferrin beträgt etwa 3 Tage, und die Halbwertszeit von Albumin macht ungefähr 10-14 Tage aus), schafft die Messung der glykosylierten Formen ein Mittel zum Testen einer kurzzeitigen bis mittleren Glykämie. Hämoglobin liegt normalerweise während einer langen Zeit im Kreislauf vor (die Halbwertszeit von Hämoglobin beträgt etwa 2 bis 3 Monate), und die Messung glykosylierten Hämoglobins schafft ein Mittel zum Testen einer langandauernden Glykämie.
Zweitens ist die nicht-enzymatische Glykosylierung in die Entwicklung von Komplikationen von chronischem Diabetes verstrickt, einschließlich der Beschleunigung einer Kataraktbildung (auf Grund fortgeschrittener Glykosylierungsprodukte des kristallinen Linsenproteins) und der Atherogenese (auf Grund des Einschlusses von Lipoprotein in die Arterienwände), die zur Verengung der Blutgefäße des Herzens, des Gehirns, der Augen, der Nieren und der Peripherie beiträgt. Die Messung glykosylierter Proteine und ihrer fortgeschrittenen Produkte kann daher von prognostischem Wert für mit einer chronischen Hyperglykämie verbundene pathologische Folgeerscheinungen sein.
Die Hauptkomponente des menschlichen Hämoglobins (etwa 80-90% des gesamten Hämoglobins) ist HbA&sub0;. Es hat eine tetramere Struktur mit zwei alpha- und zwei beta-Ketten. HbA&sub0; wird an seinen N-Endaminosäuren nicht glykosyliert. Durch Ionenaustausch-Chromatographie isolierte Präparate von HbA&sub0; zeigten, daß sie einen geringen Anteil an HbA&sub0;-Molekülen enthielten, welche an die verfügbaren epsilon-Aminogruppen von Lysinen glykosyliert waren.
HbA1a1, HbA1a2, HbA1b und HbA1c sind kleinere Komponenten des menschlichen Hämoglobins, welche in ihrer Struktur mit HbA&sub0; identisch sind, mit Ausnahme des Vorliegens eines Zuckerrestes, der kovalent an den N-Terminal-Valinrest der beta-Kette angefügt ist. Die Zuckerreste, welche an die Valinreste von HbA1a1, HbA1a2 und HbA1c angefügt sind, sind jeweils Fruktose-Diphosphat, Glukose-6-Phosphat und 1-Desoxyfruktose. Der an Valin angefügte Zucker im HbA1b ist nicht bekannt.
Etwa 4 bis 5% des gesamten Hämoglobins ist bei normalen Personen HbA1c, doch ist der Anteil bei Diabetes wesentlich höher und beträgt im allgemeinen etwa 8 bis 10%, ist jedoch manchmal so hoch wie 20%. Auch variiert seine Konzentration in Bezug auf die Diabeteskontrolle in weitem Maße.
HbA1c ist das für klinische Zwecke am häufigsten gemessene glykosylierte Protein, und es wurde eine Anzahl von Tests entwickelt, um es zu messen. Siehe z.B. Furth, Analytical Biochemistry, 175, 347-60 (1988); Peacock, J. Clin. Pathol., 37, 841-51 (1984); Miedema und Casparie, Ann. Clin. Biochem., 21, 2-15 (1984); und das US-Patent Nr. 4,629,692. Es wird jedoch angenommen, daß zur Zeit klinisch nur vier Verfahren angewandt werden: (1) die Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von m-Amino-Phenylboronat-Kolonnen; (2) die Kationenaustausch-chromatographie; (3) die Elektrophorese; und (4) isoelektrisches Fokussieren.
Jede der vier Meßtechniken, welche zur Zeit in klinischem Gebrauch stehen, leidet an einem oder mehreren der folgenden Nachteile: Relativ hohe Kosten pro gemessener Probe; Mangel an Spezifität beim gemessenen Analyten; Empfindlichkeit aufleichte Veränderungen der Bedingungen, wie lonenstärke, pH-Wert und Temperatur; schwierige Standardisierung; Mangel an Reproduzierbarkeit; zeitaufwendig und arbeitsintensiv; Unmöglichkeit der Automatisierung; und Schwierigkeit, mehrere Proben gleichzeitig zu testen. Siehe US-Patent Nr. 4,629,692; Furth, Analytical Biochemistry, 175, 347-60 (1988); Peacock, J Clin. Pathol., 37, 841-51 (1984).
Immuntests zum Messen glykosylierter Proteine, insbesondere von HbA1c, sind bekannt Es wird jedoch angenommen, daß keiner für die Messung von HbA1c in klinischem Gebrauche steht. Diese verschiedenen Immuntesttechniken und die bei ihnen verwendeten Antigene und Antikörper werden nun erörtert.
Zunächst beschreibt die Europäische Patentanmeldung Nr. 201,187 die Herstellung monoklonaler Antikörper unter Benützung gereinigten HbA1c. Insbesondere berichtet die Anmeldung über die Herstellung monoklonaler Antikörper, welche sich bevorzugt an die glycierten Aminogruppen von Hämoglobin, wie jene der N-Endvalinreste der beta-Ketten von HbA1c binden. Insbesondere hemmte ein glyciertes Heptapeptid, dessen Sequenz der Sequenz des N-Endes der beta-Kette von HbA1c entspricht, die Bindung eines dieser monoklonalen Antikörper an HbA1c, wogegen das nicht-glycierte Heptapeptid und das reduzierte glycierte Heptapeptid diese Bindung nicht hemmten. Das Patent lehrt, daß diese monoklonalen Antikörper bei bekannten Immuntesttechniken zur Quantifizierung von HbA1c angewandt werden können. Es sei bemerkt, daß nur 2 von 320 Hybridomas monoklonale Antikörper erzeugten, welche mit HbA1c bevorzugt reagieren, was andeutet, daß von imunisierten Tieren normalerweise nur wenige für HbA1c spezifische Antikörper produziert werden.
Das US-Patent Nr. 4,629,692 (Dean) lehrt ein Immuntestverfahren zum Bestimmen der gesamten nicht-enzymatisch glykosylierten Proteine und Proteinfragmente in einem biologischen Fluid. Das Immuntestverfahren wendet einen Antikörper an, welcher selektiv Amadon-umgelagerte Glukosereste (d.h. 1-Desoxy-D-Fruktosylreste) erkennt und bindet. Das zum Herstellen des Antikörpers benutzte Immunogen ist Amadon-umgelagerte Glukose, die kovalent an ein Trägermolekül gebunden ist. Polylysin ist der bevorzugte Träger, und die Amadonumgelagerte Glukose ist vorzugsweise an die epsilon-Aminogruppen der Lysinreste angefügt. Das Immunogen wird durch nicht-enzymatisches Glykosylieren des Trägers in vitro hergestellt. Zwischen der Amadon-umgelagerten Glukose und dem Träger kann ein Verbindungsglied vorgesehen werden. Das bevorzugte Verbindungsglied ist Lysin. Andere Verbindungsglieder, einschließlich von Lysinanalogen und amino-funktionalisierten Aminosäuren, wie Ornithin und Hydroxylysin, können verwendet werden.
Der in der obigen Weise hergestellte Antikörper kann bei einem herkömmlichen Immuntest zum Quantifizieren der Gesamtheit der glykosylierten Proteine in einem biologischen Fluid, wie dem Serum, herangezogen werden. Um den Spiegel eines spezifischen glykosylierten Proteins, wie HbA1c, zu bestimmen, muß dieses erst von den anderen nicht-enzymatisch glykolysierten Proteinen abgetrennt werden. Beispielsweise lehrt das Dean-Patent, daß HbA1c durch Phenylboronataffinitäts-Chromatographie abgetrennt und dann unter Benützung des geoffenbarten Antikörpers quantifiziert werden kann.
Das US-Patent Nr. 4,658,022 (das '022-Patent) lehrt die Herstellung von Antikörpern zu einem linearen Peptidepitop eines Proteins. Das lineare Peptidepitop weist 2 bis 15 Aminosäuren von einem beliebigen Abschnitt (N-Terminal, C- Terminal oder ein anderer Abschnitt) der Sequenz des Proteins auf und kann mit Nicht-Peptidgruppen, wie Kohlehydraten, modifiziert sein. Das lineare Peptidepitop ist zum Zwecke der Immunisierung eines Tieres an einen Immunogenträger angekoppelt. Um den Immuntest durchzuführen, werden die Antikörper mit dem Protein in Kontakt gebracht, welches in ausreichender Weise denaturiert wurde, um das für die Herstellung des Antikörpers benutzte lineare Peptidepitop zu exponieren oder die Exponierung zu erhöhen. Die Verwendung monoklonaler Antikörper ist bevorzugt.
Das '022-Patent und das US-Patent 4,647,654 (das '654-Patent) lehren im oben beschriebenen System die Verwendung eines glykosylierten Peptides, das zumindest 2 Aminosäuren, vorzugsweise 5 bis 15 Aminosäuren, der N-Endsequenz von Hämoglobin enthält, das an einen Immunogenträger angekoppelt wird, um einen Antikörper herzustellen. Das '654- Patent lehrt, daß ein Verbindungsglied zwischen dem Peptidepitop und dem Träger verwendet werden kann, welches die Antigenität und die Ankopplungseigenschaften optimiert. Das Verbindungsglied kann eine oder mehrere Aminosäuren aufweisen, die in der normalen Sequenz von Hämoglobin nicht zu finden sind. Beide Patente lehren, daß auf diese Weise monoklonale Antikörper produziert werden können, welche für das glykosylierte synthetische Peptid und das entsprechende Epitop am HbA1c-Molekül spezifisch sind, wenn das HbA1c-Molekül denaturiert wird, um das Epitop zu exponieren. Diese Antikörper machen keine Quer-Reaktion mit HbA&sub0; oder mit nichtglykosylierten Peptiden durch. Die angewandten Immuntests sind herkömmlich, mit Ausnahme der Denaturierung des Hämoglobins. Es sei bemerkt, daß nur 9 von 200 Hybridomas einen monoklonalen, bevorzugt mit HbA1c regierenden Antikörper erzeugten, was darauf hinweist, daß normalerweise von immunisierten Tieren wenig Antikörper produziert werden, welche für HbA1c spezifisch sind.
Das US-Patent Nr. 4,478,744 (Mezei et al.) lehrt die Herstellung von Antikörpern zu einem Protein unter Benützung eines Peptid-Antigens, dessen Aminosäuresequenz einem Teil der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Bezüglich Hämoglobin lehrt das Patent die Herstellung von Antikörpern zu glykosyliertem Hämoglobin, insbesondere zu HbA1c, unter Verwendung eines Peptids, welches aus 4 bis 10, vorzugsweise aus 7, Aminosäuren besteht, dessen Sequenz der N-Endsequenz der beta-Kette von Hämoglobin entspricht. Das Peptid wird vor oder nach dem Ankoppeln an ein Immunogen- Trägerprotein oder Polypeptid glykosyliert. Die Peptidträgerkombination wird dazu benutzt, um ein Tier zu immunisieren, vorzugsweise ein solches, welches normalerweise kein HbA1c produziert. Mezei et al. lehren, daß die sich ergebenden Antikörper für HbA1c spezifisch sind und bei herkömmlichen Immuntests zum Quantifizieren von HbA1c verwendet werden können. Das oben erläuterte '654-Patent beschreibt jedoch Versuche, welche zeigen, daß ein nach dem Verfahren von Mezei et al. produziertes polyklonales Schaf-Antiserum keine merkbare Spezifität für HbA1c bei einem ELISA-Test besitzt, selbst wenn es affinitätsgereinigt ist (siehe Beispiel 8 des '654-Patentes).Sieheauchdieobenerörterte Europäische Patentanmeldung 201,187.
Das US-Patent Nr. 4,247,533 (Cerami et al.) sowie Javid et al., British Journal of Haematolocy, 38, 329 (1978) lehren die Herstellung von Antikörpern zu HbA1c. Die Antikörper werden mit kolonnengereinigtem menschlichen HbA1c durch Immunisieren eines Tieres erzeugt, vorzugsweise eines solchen, welches normalerweise kein HbA1c bildet. Der sich ergebende Antikörper reagierte in gleicher Weise gut mit HbA&sub0; und HbA1c und wurde daher wiederholt mit HbA&sub0; absorbiert. Der absorbierte Antikörper unterschied HbA&sub0; deutlich von seinen glykosylierten Abkömmimgen, machte jedoch noch eine leichte Quer-Reaktion mit menschlichem HbA1a und HbA1b sowie mit dem HbA1c von Hunden und Mäusen durch. Es zeigte auch in verblüffender Weise eine geringere Reaktivität mit NaBH&sub4;-reduziertem HbA1c als mit unreduziertem HbA1c. Auch versagten gewisse reduzierte Glykodipeptide, einschließlich reduzierten glykosylierten Valyl-Histidins, beim Hemmen der Reaktion des absorbierten Antikörpers mit HbA1c. Der absorbierte Antikörper war von geringer Affinität und niedrigem Titer Um dieses Problem zu lösen, wurde ein speziell modifizierter Radioimmuntest (RIA) angewandt. Das oben erörterte '654-Patent lehrt, daß die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens fraglich ist (siehe Spalte 2, Zeilen 38-41, des '654-Patentes).
Curties und Witztum, J. Clin. Invest., 72, 1427 (1983) beschreiben die Erzeugung und Charakterisation von sechs monoklonalen Antikörpern von Nagetieren, welche reduzierte, glykosylierte menschliche Plasma-Lipoproteine binden, aber nicht mit nicht-glykosylierten oder unreduzierten glykosylierten Plasma-Lipoproteinen reagieren. Die Antikörper wurden durch Immunisieren von Mäusen mit drei Injektionen von homologen Lipoprotein geringer Dichte (LDL) immunisiert, welches in Gegenwart von Glukose und von Natrium-Cyanborhydrid reduktiv glykosyliert worden war, gefolgt von einer Injektion von reduktiv glykosyliertem menschlichen LDL gerade vor dem Gewinnen von Milzzellen, um die Hybridomas herzustellen. Bei einer in Konkurrenz stehenden Inhibitions- RIA wurde das dominante, von diesen Antikörpern auf reduziertem glykosylierten LDL erkannte Epitop als Glucitol-Lysin, die reduzierte Hexosealkoholform von Glukose, konjugiert zur epsilon-Aminogruppe von Lysin, identifiziert (Glucitol- Lysin hemmte die Bindung jedes der Antikörper an reduziertes glykolysiertes LDL vollständig). Jeder der sechs Antikörper reagierte mit allen untersuchten reduzierten glykosylierten Proteinen, einschließlich von Lipoprotein hoher Dichte, von Albumin, Hämoglobin und Transferrin. Die Antikörper waren auch dazu imstande, Glucitol-Lysinreste an gesamten Plasmaproteinen und isolierte Lipoproteine von normalen und diabetischen Personen nach der Reduktion der Proteine mit NaBH&sub4; zu identifizieren und zu quantifizieren.
Witztum et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2757 (1983) beschreiben die Herstellung polyklonaler Antikörper durch Immunisieren von Meerschweinchen mit homologem glykosylierten oder reduktiv glykosyliertem LDL. Die Immunisation mit reduktiv glykosyliertem LDL erzeugte ein Antiserum mit hohem Titer, welches mit reduktiv glykosyliertem Meerschweinchen-LDL reagierte, aber nicht mit unreduziertem glykosylierten LDL. Glucitol-Lysin war ein hoch-wirksames Hemmmittel für die Bindung dieses Antikörpers an reduktiv glykosyliertes LDL, wie es auch andere mensöhliche, reduktiv glykosylierte Proteine waren, einschließlich von Hämoglobin, Albumin und Transferrin. In Abwesenheit eines Reduziermittels war glykosyliertes LDL auch immunogen, obwohl das Antiserum von niedrigerem Titer und geringerer Affinität war. Homologes reduktiv glykosyliertes Albumin war ebenfalls immunogen, und die Immunisierung mit dieser Verbindung erzeugte ein Antiserum, welches mit reduktiv glykosyliertem Albumin reagierte, aber nicht mit unreduziertem glykosylierten Albumin oder reduktiv glykosyliertem LDL. Alle Aktivitäten von Antikörpern wurden in einem Festphasen-RIA gemessen.
Nakayama et al., Clinica Chimica Acta, 158, 293-99 (1986) beschreiben ein RIA für glyciertes menschliches Serumprotein unter Verwendung eines Antiserums, welches durch Immunisieren von Meerschweinchen mit menschlichem reduktiv glyciertem Albumin erhalten worden war. Das Antiserum wurde auf Kolonnen von nativem menschlichen Serumalbumin affinitätsabsorbiert, und das absorbierte Antiserum erkannte reduktiv glyciertes Albumin und Glucitol-Lysin, aber nicht nicht-reduktiv glykosyliertes Albumin, natives menschliches Albumin, Lysin, Sorbitol oder Mannitol. Das Antiserum war auch dazu imstande, nach der Reduktion des Proteins mit NaBH&sub4; natives menschliches Serumalbumin und nicht-reduktiv glyciertes Albumin zu identifizieren und zu quantifizieren.
Go et al., Clinica Chimica Acta, 163, 63-73 (1987) berichten über die Entwicklung eines enzymgebundenen Immunsorbens-Tests (ELISA) für glykosylierte Proteine unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums, welches unter Verwendung von reduktiv glykosylierten Lipoproteinhomologen hoher und niedriger Dichte (HDL und LDL) als Immunogen hergestellt wurde. Der Artikel lehrt, daß das Antiserum für die Glukose- Lysin-Bindung spezifisch ist, und daß es in einer dosisabhängigen Weise alle getesteten reduzierten glykosylierten Proteine, einschließlich von Albumin, Fibrinogen, LDL, HDL, Polylysin und Hämoglobin, erkennt. Das Antiserum hat für native Proteine oder für unreduzierte glykosylierte Proteine keine Affinität Vom ELISA-Test wird berichtet, er sei empfindlich und dazu imstande, eine große Anzahl von Proben in einem relativ kurzen Zeitraume zu messen, aber der Artikel lehrt, daß die Bedingungen des Testes kritisch sind, und daß hauptsächliche Abweichungen vom beschriebenen Protokoll zu einem Verlust an Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit führen. Siehe Seite 66 von Go et al.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schafft einen Immuntest für ein Protein, wie HbA1c, welcher nicht-enzymatisch an der alpha-Aminogruppe seiner N-Endaminosäure glykosyliert ist. Es wird ein Antikörper mit hohem Titer und hoher Affinität hergestellt und beim Immuntest verwendet, welcher für Glc-ol-X eine Spezifität besitzt, wie unten beschrieben wird. In der Formel Glc-ol-X ist X die N-Endaminosäure des glykosylierten Proteins, und X kann aus den unten im einzelnen erörterten Gründen eine beliebige Aminosäure, außer Lysin, sein. Glc-ol ist die reduzierte Form des an X anhaftenden Zuckers am glykosylierten Protein.
Ein spezieller Antikörper, welcher auch ein Teil der Erfindung ist, wird durch Immunisieren eines Tieres mit einem Immunogen der Formel (Glc-ol-X-L)n-Träger hergestellt, worin:
X gleich Valin ist und Glc-ol wie oben definiert ist und Glc-ol an die alpha-Aminogruppe von X angefügt ist;
L eine Binde- bzw. Verbindungsgruppe ist;
der Träger eine andere immunogene Verbindung als das glykosylierte Protein ist; und
n von 1 bis zur Anzahl der verfügbaren Ankopplungsstellen am Träger ist.
Das zu testende glykosylierte Protein muß vor dem Kontaktieren mit dem Antikörper mit einem Reduziermittel behandelt werden, um den Immuntest durchzuführen. Dieser Schritt ist notwendig, um die glykosylierte N-Endaminosäure des Proteins in die Glc-ol-X-Form umzuwandeln. Auf diese Weise wird der Antikörper das glykosylierte Protein erkennen und sich daran binden. Der Antikörper wird das glykosylierte Protein in Gegenwart von nicht-glykosylierten Proteinen, von an die epsilon-Aminogruppe von Lysin glykosylierten Proteinen und von an andere N-Terminal-Aminosäüren glykosylierten Proteinen selektiv erkennen. Wenn jedoch eine Mehrzahl von Proteinen in einer Testprobe vorhanden sind, welche dieselbe glykosylierte N-Endaminosäure besitzen, muß ein Verfahren zum Identifizieren bzw. Separieren des interessierenden Proteins angewandt werden.
Die Erfindung umfaßt ferner eine spezielle (Glc-ol- VL)n-Träger-Verbindung, die als Immunogen benutzt wird, um den Antikörper herzustellen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung. Diese Verfahren umfassen das reduktive Glykosylieren von Valin oder Valin-L, um Glc-ol-Valin oder Glc-ol-Valin-L zu erzeugen. Das Glc-ol-Valin und das Glc-ol- Valin-L können dann entweder direkt an den Immunogenträger angekoppelt werden, oder es kann das Glc-ol-Valin an L angekoppelt werden, bevor es an den Träger angekoppelt wird.
Die Erfindung schafft auch eine Ausrüstung zum Feststellen oder Quantifizieren des glykosylierten Proteins. Die Ausrüstung umfaßt einen Behälter für Antikörper, welche auf Glc-ol-V gerichtet sind. Die Ausrüstung kann auch eine oder beide des Folgenden aufweisen: 1) einen Behälter für Reduziermittel zum Reduzieren des Zuckerrestes an der N- Terminal-Aminosäure des glykosylierten Proteins, oder 2) einen Behälter mit einer markierten Komponente, welche zum Feststellen oder Quantifizieren des an den Antikörper gebundenen glykosylierten Proteins zweckmäßig ist.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figuren 1-3:

Ist ein Diagramm von relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) gegen die Antikörperverdünnung. Die Daten im Diagramm wurden durch Ausführen eines mit einem enzymgebundenen Direktbindungs-Fluoreszenztests (ELFA) unter Verwendung von Anti-Glucitol-VGG-BSA-Antikörpern erhalten, welche in einer Kolonne von Glucitol-VGG-Sepharose affinitätsgereinigt worden waren. Die Antigene sind, wie angegeben.

Figur 4:

Ist ein typisches Diagramm von Regressionsanalyseergebnissen. Der Anteil an durch Elektrophorese festgestellten HbA1c in Lysaten roter Blutzellen (RBC) von Diabetikern ist an einer Achse, und der durch Direktbindungs- ELFA unter Verwendung von in einer Kolonne von Glucitol-VGG- Sepharose affinitätsgereingten Anti-Glucitol-VGG-BSA-Antikörpern festgestellte Anteil ist an der anderen Achse.

Figur 5:

Ist ein Diagramm von RFU gegen die Antikörperverdünnung. Die Daten im Diagramm wurden durch Ausführen eines ELFA unter Verwendung von Anti-Glucitol-VGG-BSA- Antikörpern durchgeführt, welche in einer Kolonne von Glucitol-Valin-Sepharose affinitätsgereinigt worden waren. Die Antigene sind, wie angegeben.

Figuren 6-7:

Ist ein Diagramm der RFU gegen die Antikörperverdünnung; Die Daten im Diagramm wurden durch Ausführen eines ELFA unter Verwendung von Anti-Glucitol-VGG-BSA- Antikörpern durchgeführt, welche mit quergebundenem menschlichen Hämoglobin affinitätsabsorbiert worden waren. Die Antigene sind, wie angegeben.

Figur 8:

Ist ein Diagramm, welches die Hemmung der Bindung von affinitätsgereinigten Anti-Glucitol-VGG-BSA- Antikörpern an reduziertes HbA1c durch reduziertes HbA1c zeigt. Die Antikörper waren in einer Kolonne von Glucitol- VGG-Sepharose affinitätsgereinigt worden.

Figur 9:

Ist ein Diagramm, welches die Hemmung der Bindung von affinitätsgereinigten Anti-Glucitol-VGG-BSA- Antikörpern an reduziertes HbA1c durch reduziertes Lysat von RBC's von einem Diabetikerpatienten zeigt. Die Antikörper waren in einer Kolonne von Glucitol-VGG-Sepharose affinitätsgereinigt worden.

Figur 10:

Ist ein Diagramm von Regressionsanalyseergebnissen. Der Anteil an durch Elektrophorese festgestellten HbA1c in Lysaten von RBC's von Diabetikern ist an einer Achse, und die Konzentration an zum Bewirken einer 50%igen Hemmung der Bindung von affinitätsgereinigtem Anti- Glucitol-VGG-BSA an reduziertes HbA1c in einem Inhibitions- ELFA-Test notwendigen Hemmittel ist an der anderen Achse. Die Hemmittel waren reduzierte RBC-Lysate. Die Antikörper waren in einer Kolonne von Glucitol-VGG-Sepharose affinitätsgereinigt worden.

Figur 11:

Ist ein Diagramm, welches die Hemmung der Bindung von affinitätsabsorbierten Anti-Glucitol-VGG-BSA- Antikörpern an reduziertes HbA1c durch Glucitol-VGG zeigt. Die Antikörper waren mit quergebundenem menschlichen Hämoglobin affinitätsabsorbiert worden.

Figur 12:

Ist ein Diagramm von Regressionsanalyseergebnissen. Der Anteil an durch Elektrophorese festgestelltem HbA1c in RBC-Lysaten von Diabetikern ist an einer Achse, und die durch einen Direktbindungs-ELFA unter Verwendung von DE-52-gereinigten Anti-Glucitol-VGG-BSA und reduzierten Gesamtblutlysaten von denselben Diabetikern festgestellte Absorbanz ist auf der anderen Achse.

Figur 13:

Ist ein typisches Diagramm, welches die Hemmung der Bindung von DE-52-gereinigten Anti-Glucitol-VGG- BSA-Antikörpern an reduziertes HbA1c durch reduzierte Gesamtblutlysate zeigt.

Figur 14:

Ist ein Diagramm von Regressionsanalyseergebnissen. Der Anteil an durch Elektrophorese festgestelltem HbA1c in RBC-Lysaten von Diabetikern ist an einer Achse, und der Anteil an reduziertem Gesamtblutlysat (ausgedrückt als Gesamthämoglobinkonzentration im Lysat) von denselben Diabetikern, welcher notwendig ist, um eine 50%ige Hemmung der Bindung von DE-52-gereinigten Anti-Glucitol-VGG- BSA-Antikörpern an reduziertes HbA1c zu ergeben, ist auf der anderen Achse.

Figur 15:

Ist ein Diagramm von Regressionsanalyseergebnissen. Der Anteil an durch das Verfahren mit einer Aminophenylboronatkolonne festgestelltem HbA1c in RBC-Lysaten von Diabetikern ist an einer Achse, und der Anteil an in Gesamtblutlysat von denselben Patienten durch einen Direktbindungs-ELISA unter Verwendung eines DE-52-gereinigten Anti- Glucitol-VGG-BSA-Antikörpers festgestelltem HbA1c ist auf der anderen Achse.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das zur Stimulierung der Produktion der Antikörper nach der vorliegenden Erfindung benutzte Immunogen weist einen oder mehrere Glc-ol-X-L-Rest(e) auf, der bzw. die an einen immunogenen Träger angekoppelt ist bzw. sind. X ist die N-Endaminosäure eines Proteins, welches an der alpha-Aminogruppe ihrer N-Endaminosäure glykosyliert ist. X kann eine beliebige Aminosäure, außer Lysin, sein, und das glykosylierte Protein mag ein beliebiges solches Protein sein, von dem gewünscht wird, einen Antikörper zu erzeugen, außer jenen, welche Lysin als N-Endaminosäure haben.
Der Grund, warum X nicht Lysin sein kann, ist der folgende. Glykosylierte Proteine enthalten für gewöhnlich Lysinreste, die an ihren epsilon-Aminogruppen glykosyliert sind. Es wird erwartet, daß zu Glc-ol-Lysin gebildete Antikörper, bei denen das Glc-ol an der alpha-Aminogruppe liegt, wahrscheinlich mit den gewöhnlicheren glykosylierten Lysinen, welche den Zuckerrest an ihre epsilon-Aminogruppe angefügt haben, querreagieren würde. Somit würden die Antikörper auf unspezifische Weise mit vielen verschiedenen glykosylierten Proteinen reagieren. Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine solche generalisierte, unspezifische Reaktion mit zahlreichen glykosylierten Proteinen zu vermeiden.
L in (Glc-ol-X-L)n-Träger kann ein Bindeglied sein, welches Glc-ol-X mit dem Träger verbindet. Wenn L ein Bindeglied ist, dann muß X mit einer funktionalen Gruppe, wie Carboxyl, Thiol oder Hydroxyl, enden, die bei einer Ankopplungsreaktion an eine geeignete Gruppe im Trägermolekül aktiv wird.
L kann auch jede beliebige Bindungsgruppe sein. Beispielsweise kann L eine aliphatische Kette mit etwa 1 bis ungefähr 20 Atomen unter Ausschluß von Wasserstoff sein. Normalerweise wird die Bindungsgruppe in einer funktionalen Gruppe, wie einer Amino-, Carboxyl-, Thiol-, Hydroxyl- oder Maleimidogruppe, enden, die bei einer Ankopplungsreaktion an eine geeignete Gruppe im Trägermolekül aktiv wird. Am gewöhnlichsten ist es, Amino- oder Carboxylderivate zu bilden und sie durch herkömmliche Peptidkondensationsreaktionen an das Gegenstück bildende Carboxyl- und Aminogruppen im Träger zu binden.
Bevorzugte Bindungsgruppen sind eine Aminosäure oder ein Peptid, welche weniger als zehn, vorzugsweise zwei, Aminosäuren enthalten. Die Kombination von X und der bzw. den Aminosäure(n) der Bindungsgruppe entspricht nicht der N-Terminalsequenz des glykosylierten Proteins, von dem gewünscht wird, einen Antikörper zu bilden. Die Aminosäure(n) der Bindungsgruppe und die gesamte Bindungsgruppe sind auch vorzugsweise relativ nicht-immunogen. Aus diesem Grunde sind die Aminosäure Glycin und das Dipeptid Glycin-Glycin besonders bevorzugte Bindungsgruppen.
Wenn L eine Aminosäure oder ein Peptid ist, so kann es durch bekannte peptidsynthetische Verfahren an X gebunden werden. Beispielsweise kann ein Festphasen-peptidsynthetisches Verfahren verwendet werden, wie eines von jenen, welche bei Merrifield, JACS, 85, 2149 (1963); Davis et al., Biochemistry International, 10, 394-414 (1985); Stewart und Young, Solid Phase Pedtide Synthesis (1969); im US-Patent Nr. 3,941,763; bei Finn et al. in The Proteins, dritte Auflage, Band 2, Seiten 105-253 (Neurath et al., herausgeg. 1976); und Erickson et al. in The Proteins, dritte Auflage, Band 2, Seiten 257-527 (Neurath et al., herausgeg. 1976) beschrieben sind. Diese Verfahren können auch dazu benützt werden, L herzustellen, wenn es ein Peptid ist. Geeignete synthetische Peptide, die für X, für L - wenn L ein Peptid ist - oder für X-L - wenn L eine Aminosäure oder ein Peptid ist - verwendet werden können, sind auch im Handel aus verschiedenen Quellen käuflich, einschließlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri; Peninsula Laboratories, Belmont, California; Bachem Inc, Torrance, California; und Vega Biochemicals, Tucson, Arizona.
Es ist bevorzut, daß X reduktiv glykosyliert wird, bevor es an den Träger angekoppelt wird, um die Bildung von Glc-ol-Lysinresten oder anderen Glc-ol-Resten zu verhindern, welche störende oder unspezifische Antikörper erzeugen könnten. Ferner ist es vorzuziehen, X reduktiv zu glykosylieren, bevor es an L angefügt wird, falls L eine Aminosäure oder ein Peptid mit epsilon-Aminogruppen ist.
Um X reduktiv zu glykosylieren (alleine oder nachdem es an L angefügt wurde), wird ein Überschuß eines Zuckers, der demjenigen entspricht, welcher an der N-Endaminosäure des interessierenden glykosylierten Proteins gefunden wird, mit X oder X-L in Gegenwart eines Kohlehydrat- Reduktionsmittels, wie Natrium-Cyanborhydrid [siehe Curtiss und Witztum, Clin. Invest., 112, 1427-1438 (1983) und Friedman et al, Int. J. Pept. Protein Res., 6, 183-185 (1974] Pyridin-Boran [siehe Wong et al. Anal. Biochem, 139, 58-67 (1984)] oder Natriumborhydrid [siehe Means und Feeney, Biochemistry, 2, 2191-2200, und Go et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 80, 2751-2761 (1983)] umgesetzt. Das reduktiv glykosylierte X oder X-L wird vom Kohlehydrat-Reduktionsmittel und seinem nicht-glykosylierten Gegenstück abgetrennt. Dies kann durch herkömmliche Mittel bewerkstelligt werden, wird jedoch bevorzugt unter Anwendung der Molekularsieb-Chromatographie und nötigenfalls durch Ionenaustausch-Chromatographie bewirkt.
Geeignete Träger sind Verbindungen, welche zum Stimulieren der Produktion von Antikörpern an in einem Wirtstier an sie angekopelten Haptenen imstande sind. Solche Träger sind herkömmlich und wohlbekannt. Sie sind im allgemeinen Verbindungen hohen Molekulargewichts. In den meisten Fällen wird der Träger ein Protein oder ein Polypeptid sein, obwohl andere Materialien, wie Kohlehydrate, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nukleinsäuren und dergl. ausreichender Größe und Immunigenität benützt werden können.
Geeignete immunogene Trägerproteine und -polypeptide werden im allgemeinen Molekulargewichte zwischen 4 000 und 10 000 000, und vorzugsweise größere als 15 000, haben. Solche geeigneten Träger umfassen Proteine, wie Albumine (z.B. Rinderserumalbumin, Ovalbumin, menschliches Serumalbumin), Immunoglobuline, Thyroglobuline (z.B. Rinderthyroglobulin), Hämocyanine (z.B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin) und Polypeptide, wie Polylysin oder Polyalaninlysin.
Als nächstes wird das Glc-ol-X-L an den Träger angekoppelt. Verfahren zur Durchführung dieser Kopplung sind wohlbekannt. Beispielsweise können die Glc-ol-X-L-Reste an den Träger mit konjugierenden Reagenzien, wie Glutaraldehyd, einem wasserlöslichen Carbodiimid, wie 1-(3-Dimethyl- Aminopropyl)-3-Äthylcarbodiimid-Hydrochlorid (ECDI), N-N- Carbonyl-Diimidazol, 1-Hydroxy-Benzotriazol-Monohydrat, N- Hydroxy-Succinimid, n-Trifluor-Acetylimidazol-Cyanogenbromid, 3-(2'-Benzothiazolyl-Dithio)-Propionat-Succinimid-Ester, Hydrazide oder Affinitätsmarkierungsverfahren angekoppelt werden. Siehe auch Pierce Handbook and General Cataloa (1989 wegen einer Liste möglicher Abkopplungsmittel.
Zusätzliche Referenzliteratur betreffend herkömmliche immunogene Trägermaterialien und Verfahren zum Ankoppeln von Haptenen daran sind: Erlanger, Methods in Enzymology, 70, 85-104 (1980); Makela und Seppala, Handbook Of Experimental Immunology (Blackwell 1986); Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds (Prentice-Hall 1976); Butler, J. Immunol. Meth., 7, 1-24 (1974); Weinryb und Shroff, Drug. Metab. Rev., 10, 271-83 (1979); Broughton und Strong, Clin. Chem., 22, 726-32 (1976); Playfair et al., Br. Med. Bull., 30, 24-31 (1974).
In der Formel (Glc-ol-x-L)n-Träger ist n die Anzahl an Glc-ol-X-L-Resten, welche an den Träger angefügt sind. Die Anzahl solcher Reste (die "epitope Dichte") am Trägermolekül wird von 1 bis zur Anzahl der am Trägermolekül verfügbaren Ankopplungsgruppen reichen. Die epitope Dichte an einem speziellen Träger wird vom Molekulargewicht des Trägers und der Dichte und Verfügbarkeit von Ankopplungsstellen abhängen. Optimale epitope Dichten fallen zwischen etwa 10% und ungefähr 50% der verfügbaren Ankopplungsgruppen am Trägermolekül.
Nachdem der Glc-ol-X-L-Träger synthetisiert worden ist, wird er zur Herstellung der Antikörper benutzt. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind wohlbekannt und herkömmlich. Beispielsweise können die Antikörper nach der vorliegenden Erfindung durch Injizieren des erfindungsgemäßen Immunogens in einer Mischung mit einem Adjuvans in ein geeignetes Wirtstier (wie ein Kaninchen, eine Ziege, ein Pferd oder ein anderes Säugetier) hergestellt werden. Die Injektionen mit dem Immunogen werden so lange fortgesetzt, bis ein Antiserum geeigneten Titers erhalten wird. Das Antiserum wird gewonnen und kann nötigen- oder gewünschtenfalls unter Benutzung bekannter Verfahren weiter gereinigt werden. Beispielsweise können die Antikörper affinitätsgereinigt werden oder können, wie etwa durch DE-52-Chromatographie, fraktioniert werden.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Antikörper durch somatische Zellhybridisation durch verschmelzen von Zellen von einem immunisierten Tier (wie Ratten, Hamstern, Mäusen oder anderen Säugetieren) mit einer unsterblichen Zellinie, wie Myelomzellen, hergestellt werden. Die verschmolzenen Zellen werden geklont, und es können monoklonale Antikörper geeigneter Spezifität durch Sichten der geklonten, verschmolzenen Zellen isoliert werden. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind wohlbekannt.
Somit kann ein erfindungsgemäß verwendeter Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, kann ein Antiserum oder eine gereinigte Fraktion davon sein (wie ein DE-52-affinitätsgereinigter oder ein affinitätsadsorbierter Antikörper), kann ein beliebiges der bekannten Isotypen oder Unterklassen (wie IgG, IgM etc) sein, oder kann ein Antikörperfragment [wie Fab, F(ab') oder F(ab')&sub2;] sein, welches dazu imstande ist, ein Antigen zu binden. Die einzige Anforderung ist, daß das letztuche Antikörperpräparat eine Spezifität für das Glc-ol-X-Epitop besitzt und dazu imstande ist, sich an dieses Epitop am reduzierten glykosylierten Protein zu binden, dessen Testung gewünscht wird.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können bei einem Immuntestverfahren benutzt werden, welches die Bestimmung oder Quantifizierung nicht-enzymatisch glykosylierter Proteine in einem biologischen Material erlaubt. Viele solcher Verfahren sind bekannt.
Die einzige notwendige Abänderung ist, daß das zu testende glykosylierte Protein mit einem Reduziermittel behandelt werden muß, bevor das Protein mit dem Antikörper in Kontakt gebracht wird, um den Immuntest durchzuführen. Dieser Verfahrensschritt ist dazu notwendig, um die glykosylierte N- Endaminosäure des Proteins in die Glc-ol-X-Form umzuwandeln.
Auf diese Weise wird der erfindungsgemäße Antikörper, welcher für Glc-ol-X spezifisch ist, das glykosylierte Protein erkennen und sich mit ihm binden. Es sind keine weiteren Bedingungen erforderlich. Insbesondere ist es nicht notwendig, das glykosylierte Protein durch verschiedene Denaturierungsbedingungen zu behandeln, wie es bei gewissen Testmethoden des Standes der Technik erforderlich ist.
Zweckmäßige Immuntestverfahren umfassen den Radio- Immuntest, den Enzym-Immuntest und den Fluoreszenz-Immuntest. Der Immuntest kann im in Betracht kommenden Bindungsformat durchgeführt werden oder kann ein immunometrischer Test sein. Er kann ein homogener oder heterogener Test sein. Geeignete homogene Methoden sind Fluoreszenz-Abschrecken und -Verstärken, der Energieübertragungs-Immuntest, der Immuntest mit sterischer Behinderung durch doppelten Antikörper, der substratmarkierte Immuntest, der Prothese-gruppenmarkierte Immuntest und der enzymmodulatormarkierte Immuntest.
Ein bevorzugtes Immuntestformat ist ein Direktbindungstest, bei welchem reduziertes glykosyliertes Protein in einer Probe, wie einem Lysat roter Blutkörperzellen (RBC) auf einer festen Oberfläche immobilisiert wird. Geeignete feste Oberflächen sind wohlbekannt und umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyäthylen, Nylon, Polyacrylamid und Agarosen. Das immobilisierte Antigen wird mit demjenigen Antikörper in Kontakt gebracht, der für Glc-ol-X spezifisch ist (primärer Antikörper). Der primäre Antikörper kann so markiert werden, daß der an das immobilisierte Antigen gebundene Antikörper festgestellt bzw. quantifiziert werden kann. Die Menge des Antigens (an seiner N-Endaminosäure glykosyliertes Protein) in der Probe kann quantifiziert werden, da die Menge an Markierungsstoff - der an die feste Oberfläche gebunden ist, nachdem ungebundenes Material weggewaschen wurde - der Menge an in der Probe vorliegendem Antigen proportional ist. Alternativ kann ein markierter sekundärer Antikörper, der sich spezifisch an den primären Antikörper bindet, als Mittel zum Feststellen und Quantifizieren des in der Probe vorliegenden interessierenden glykosylierten Proteins hinzugefügt werden, nachdem ungebundener primärer Antikörper weggewaschen wurde.
Besonders bevorzugte Direktbindungs-Immuntests sind jene Tests, welche in den Beispielen 10, 13 und 15 im einzelnen beschrieben werden. Insbesondere benützen die in den Beispielen 13 und 15 beschriebenen Direktbindungstests Lysate von gesamtem Blut, was die Tests sehr einfach durchführen läßt. Sie benutzen auch ein kolorimetrisches Bestimmungssystem. Ein solches System kann zum Quantifizieren glykosylierter Proteine angewandt werden, kann aber auch für einen gualitativen oder halb-quantitativen Test benutzt werden, da der Endpunkt mit freiem Auge beobachtet werden kann. Somit können solche Tests besonders wertvoll in Umgebungen sein, wo eine teure Ausrüstung und erfahrenes Laborpersonal nicht zur Verfügung stehen, wie in einer Arztpraxis, in der Wohnung eines Patienten oder in unterentwickelten Gegenden der Welt.
Geeignete Markierungsstoffe entweder für den primären oder für den sekundären Antikörper sind in der Technik wohlbekannt. Sie umfassen: 1) Enzyme (z.B. Meerrettich- Peroxydase, Malat-Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha- Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glukoseoxydase, beta- Galaktosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glukose-6- Phosphat-Dehydrogenase, Glukoamylase und Acetylcholin- Esterase); 2) Fluorophore (wie Fluorescein-Isothiocyanat, Phodamin, Phyco-Erithrin, Phyco-Cyanin, Allophyco-Cyanin, o- Phthaldehyd und Fluorecamin); 3) Radionukleotide (wie ¹²&sup5;I); 4) biolumineszierende Markierungsstoffe (wie Luziferin, Luziferase und Aequorin); 5) Chemolumineszierende Markierungsstoffe (wie Luminol, Isoluminol, aromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester); und 6) Biotin. Die Bindung und Feststellung dieser Markierungsstoffe kann unter Benützung von Fachleuten bekannten Standardtechniken erfolgen.
Ein alternativer und ebenfalls bevorzugter Aufbau für einen Immuntest ist ein Hemmungstest. Bei dieser Art von Test werden variierende Mengen an flüssiger Phase reduzierten glykosylierten Proteins, wie reduziertem HbA1c, in einem Lysat von RBC oder gesamtem Blut als Inhibitor benützt. Dieses Hemmittel wird mit einer festen Menge an reduziertem glykosylierten Protein gemischt und tritt gegen es auf, das auf einer festen Oberfläche (wie jene, welche oben beschrieben wurden) für eine begrenzte Anzahl verfügbarer Bindestellen am Anti-Glc-ol-X-Antikörper (dem primären Antikörper) immobilisiert wurde. Durch Vergleichen der Hemmung der primären Antikörperbindung, welche für bekannte Hemmittelkonzentrationen erhalten wurden, mit jenen , welche bei biologischen Proben erhalten wurden, kann die Menge an glykosyliertem Protein in der biologischen Probe festgestellt werden. Der primäre Antikörper kann entweder markiert werden, oder es kann ein markierter sekundärer Antikörper verwendet werden. Die Markierungsstoffe sind dieselben, welche oben beschrieben wurden. Ein besonders bevorzugter Hemmungstest ist der in Beispiel 11 beschriebene Inhibitions-ELFA.
Ein Sandwich- (Einfang-, Zwei-Stellen-) -Test ist ebenfalls möglich. Bei diesem Test wird ein Anti-Glc-ol-X- Antikörper auf einer festen Oberfläche, wie jenen, welche oben beschrieben wurden, immobilisiert. Das zu testende reduzierte glykosylierte Protein wird dann mit dem immobihsierten Anti-Glc-ol-X-Antikörper in Kontakt gebracht. Nach dem Wegwaschen ungebundenen Materials wird ein markierter Antikörper dem glykosylierten Protein hinzugefügt, und die Menge an gebundenem markierten Antikörper ist proportional der Menge an glykosyliertem Protein in der ursprünglichen Probe. Die Markierstoffe sind dieselben, die oben beschrieben wurden. Der zweite, markierte Antikörper hat keine Aktivität an Glc-ol-X, sondern ist an ein anderes Epitop des glykosylierten Proteins gerichtet. So ist diese Technik besonders zum Feststellen oder Quantifizieren glykosylierten Proteins dann geeignet, wenn es in einem Gemisch mit anderen Proteinen vorliegt, die an derselben N-Endaminosäure glykosyliert sind. Alternativ kann der markierte Antikörper der Antikörper zu Glc-ol sein, und der immobilisierte Antikörper kann der an ein anderes Epitop gerichtete Antikörper am glykosylierten Protein sein.
Schließlich ist ein Homogenfluoreszenz-Polarisationstest möglich. Bei einem solchen Test tritt ein reduziertes glykosyliertes Protein gegen Glc-ol-X-L oder Glc-ol-X auf, welches an ein fluoreszenzmarkiertes Trägermolekül niedrigen Molekulargewichtes (wie Poly-L-Lysin mit einem Molekulargewicht von 3600) für den Anti-Glc-ol-X-Antikörper angekoppelt ist. Der Anteil an Fluoreszenzpolarisation steht in umgekehrtem Verhältnis zum Anteil an reduziertem glykosylierten Protein in der Testprobe.
Die speziellen Konzentrationen, die Temperatur und die Inkubationszeit sowie andere Testbedingungen können, je nach solchen Faktoren wie der Konzentration des Antigens in der Probe, der Art der Probe u.dgl., variiert werden, welcher Immuntest auch immer angewandt wird. Fachleute werden dazu imstande sein, die operativen und die optimalen Testbedingungen für jede Bestimmung festzulegen, während sie Routineexperimente durchführen.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung zu testende biologische Material kann jegliches Biologische Fluid sein, welches das interessierende glykosylierte Protein enthält. Für gewöhnlich wird es Blut oder ein Bestandteil davon, wie RBC-Lysate, Serum oder Plasma, sein, kann aber auch von anderen geeigneten Fluiden gebildet sein, wie Speichel.
Die Erfindung umfaßt auch eine Ausrüstung zum Feststellen oder Quantifizieren eines Proteins, welches nicht-enzymatisch an die alpha-Aminogruppe seiner N-Endaminosäure glykosyliert ist. Die Ausrüstung ist eine Packungskombination von einem oder mehreren Reagenzien enthaltenden Behälter(n), welche für die Durchführung der erfindungsgemäßen Immuntests zweckmäßig sind. Geeignete Behälter für die Reagenzien der Ausrüstung umfassen Flaschen, Phiolen, Teströhrchen und Mikrotiterplatten.
Die Ausrüstung wird einen Behälter für einen auf Glc-ol-X ausgerichteten Antikörper aufweisen. Die Antikörper sind die oben beschriebenen, und sie können markiert werden, wenn sie dazu benützt werden sollen, das glykosylierte Protein festzustellen oder zu quantifizieren. Die Antikörper können in Lösung, können lyophilisiert oder können gebunden an eine feste Oberfläche vorliegen, wie jene, welche oben beschrieben worden sind.
Die Ausrüstung kann ferner einen Behälter für ein Reduziermittel zum Reduzieren des Zuckerrestes an der alpha- Aminogruppe der N-Endaminosäure des glykosylierten Proteins aufweisen. Diese Reduziermittel sind bekannt und herkömmlich und umfassen diejenigen, welche oben beschrieben worden sind.
Die Ausrüstung kann auch einen Behälter für eine markierte Komponente aufweisen, die zum Feststellen oder Quantifizieren des Anteiles des an den Antikörper gebundenen glykosylierten Proteins zweckmäßig ist. Diese markierte Komponente kann ein markierter, für den Anti-Glc-ol-X-Antikörper spezifischer Antikörper sein, kann ein markiertes, reduziertes glykosyliertes Protein oder Peptid sein oder kann markiertes Glc-ol-X oder Glc-ol-X-L, wie ein Glc-ol-X oder Glc-ol-X-L, welches an Poly-L-Lysin für die Fluoreszenzpolarisation angekoppelt ist, sein.
Schließlich kann die Ausrüstung andere Materialien enthalten, welche in der Technik bekannt sind und welche vom kommerziellen und vom Benützerstandpunkt wünschenswert sein können, wie Puffer, Enzymsubstrate, Verdünnungsmittel, Standards etc. Die Ausrüstung kann auch Behälter für die Durchführung des Immuntests umfassen, wie Teströhrchen und Mikrotiterplatten.
Die Erfindung ist im besonderen auf einen Immuntest für glykosyliertes Hämoglobin gerichtet. Insbesondere ist sie auf einen Immuntest für HbA1c gerichtet, und die Erfindung schafft einen Antikörper hohen Titers sowie hoher Affinität, welcher spezifisch mit Glucitol-Valin reagiert. Eine Beschreibung eines bevorzugten Verfahrens zum Herstellen eines solchen Antikörpers und von bevorzugten Immuntestverfahren, welche zum Feststellen oder Quantifizieren von HbA1c benützt werden kann, wird unten in den Beispielen beschrieben, doch könnten auch andere Immunogene, Hersteliverfahren für Antikörper und Immuntestverfahren angewandt werden, wie oben in allgemeinen Begriffen beschrieben wurde.
Kurz gesagt, wurde beim unten beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiel der Antikörper durch Immunisieren von Tieren mit dem Immunogen Glucitol-Valin-Glycin-Glycin-BSA hergestellt. Die sich ergebenden Antisera hatten einen hohen Titer mit halb-maximaler Bindung an Immunogene, welche bei einer Verdünnung von 1:40 000 bis 1:100 000 aufscheinende Glucitol-Valin-Epitope tragen.
Die IgG-Fraktionen der sich ergebenden Antisera wurden hergestellt und entweder unter Verwendung von Glucitol-Valin-Sepharose oder Glucitol-Valin-Glycin-Glycin- Sepharose affinitätsgereinigt. Der sich ergebende affinitätsgereinigte Antikörper stellte spezifisch das Glucitol- Valin-Epitop fest, wie durch die Ergebnisse der Beispiele 10- 12 gezeigt wird. Insbesondere wird die Bindung des affinitätsgereinigten Antikörpers an reduziertes HbA1c durch reduktiv glyciertes HbA1c, durch reduzierte RBC-Lysate und durch Glucitol-Valin-Glycin-Glycin spezifisch gehemmt. Die ungefähre Assoziationskonstante (funktionale Affinität) der Antikörper für HbA1c ist 1,5 bis 3,4 nM.
Es wurde auch festgestellt, daß die Affinitätsreinigung oder -adsorption zum Erhalt eines Antikörperpräparates nicht notwendig ist, welches spezifisch mit Glucitol-Valin- Epitopen reagiert. Siehe Beispiele 13-15.
Schließlich korrelieren quantitative Messungen von HbA1c in RBC-Lysaten und in Gesamtblutlysaten gut mit den durch Standardtechniken erhaltenen Ergebnissen. Siehe Beispiele 10, 11 und 13-15.

BEISPIELE

BEISPIEL 1: Herstellung von Glucitol-Valin-Glycin-Glycin

Durch Auflösen von 10 mg Valin-Glycin-Glycin-(VGG-)-Peptid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in 10 ml einer wäßrigen Lösung von 80 mM Glukose (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ, USA) und 12,5 mg/ml von frisch aufgelöstem NaCNBH&sub3; (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), welches in destilliertem Wasser präpariert worden war, wurde eine Reaktionslösung hergestellt. Die frisch hergestellte Reaktionslösung wurde unter Verwendung eines 0,2-um-Acrodisc- Filters (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI, USA) in ein Polystyrolröhrchen von 15 ml mit steriler Schraubkappe (Corning Glass Works, Corning, NY, USA) filtersterilisiert. Zu Vergleichszwecken wurde eine Mock-Reaktion durchgeführt, welche aus allen Reaktionsteilnehmern mit Ausnahme von Glukose bestand.
Die sterilisierte Reaktionslösung wurde 7-20 Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert, zu welcher Zeit reduktiv glyciertes VGG-Peptid durch Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Niederdruck-Econo-Kolonne von 1 x 50 cm (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) isoliert, welche ein Gesamtvolumen von 40 ml Bio-Gel P-2, 400 mesh (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) enthielt und zuvor mit entgastem, destillierten Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Fraktionierung wurde bei Raumtemperatur durch Beladen der Kolonne mit 1-2 ml der Reaktionslösung bewerkstelligt. Die Kolonne wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 ml/Std. betrieben, und es wurden Fraktionen von 1 ml unter Verwendung von destilliertem Wasser als Elutionslösungsmittel gesammelt.
Die gesammelten Fraktionen wurden anschließend unter Benützung von Bicinchoniminsäure (BCA) [Smith P.K. et al., Anal. Biochem., 150, 78-85 (1985), Lane et al., J. Immunol. Methods, 92, 261-270 (1986)], oder von Nieder-UV- Absorption [Waddle, J. Lab. Clin. Med., 48: 311-314 (1956)] nach Peptid untersucht. Sie wurden auch unter Verwendung von Phenol-Schwefelsäure [Dische et al., Arch. Biochem. Biophys., 22: 169 (1949)] nach neutralen Hexosen und unter Benützung von 2,4, 6-Trinitrobenzol-Sulfonsäure (TNBS) [Fields, Methods in Enzymology, 25b: 464-468 (1972)] nach freien Aminogruppen analysiert. Die Peptid enthaltenden Fraktionen (BCA-reaktiv), welche frei von Aminogruppen (keine Reaktion mit TNBS) und Hexose (keine Reaktion mit Phenol-Schwefelsäure) waren, wurden vereinigt, lyophilisiert, mit 1 ml destillierten Wassers rekonstituiert und mit den BCA-, TNBS- und Phenol-Schwefelsäure-Methoden erneut analysiert.
Das konzentrierte Material blieb BCA-reaktiv, reagierte aber nicht mit TNBS und Phenol-Schwefelsäure, was darauf hinwies, daß das isolierte Material aus von freier Glukose und NaCNBH&sub3; freiem Glucitol-N-Terminal-blockiertem VGG-Peptid bestand. Die Aminsäureanalyse zeigte das Vorliegen von Glycin aber nicht von Valin, was zu erwarten ist, wenn alle verfügbaren Valinreste reduktiv glyciert worden sind. Das gereinigte Material wurde anschließend an Proteinträger und Sepharose 48 angekoppelt (siehe Beispiele 3-5).

BEISPIEL 2: Herstellung von Glucitol-menschliches Hämoglobin

Menschliches Hämoglobin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) wurde mit Glukose auf dieselbe Weise reduktiv glyciert, wie oben für VGG beschrieben wurde. Das reduktiv glycierte Hämoglobin wurde von NaCNBH&sub3;&sub1; Glukosereaktionsteilnehmern und Reaktionsprodukten niedrigen Molekulargewichts durch erschöpfende Dialyse gegen Wasser unter Verwendung eines Spectropore-Zellulose-Dialyserohres (American Scientific Products, McGaw Park, IL, USA) mit einem Sperrpunkt für das durchschnittliche Molekulargewicht von etwa 12-14K separiert.
Das Ausmaß an Aminogruppenmodifikation wurde durch die TNBS-Methode von Fields, Methods in Enzymology, 25b, 464- 468 (1972) unter Anwendung einer Kontrollprobe von menschlichem Hämoglobin bestimmt, welches in Abwesenheit von Glukose als Maß für die insgesamt verfügbaren Hämoglobin-Aminogruppen reduziert worden war ("CNBH&sub3;-Kontrolle"). Unter Anwendung dieses Verfahrens wurde vom reduktiv glycierten Hämoglobin festgestellt, daß es 26% an mit Glucitol modifizierten verfügbaren Aminogruppen hatte. Das so hergestellte Glucitolmenschliches Hämoglobin wurde in einem enzymgebundenen Direktbindungs-Fluoreszenztest (ELFA) zur Charakterisierung der Antikörperspezifität verwendet (siehe Beispiel 10).

BEISPIEL 3: Herstellung von Glucitol-Valin-Glycin-Glycin- Rinderserumalbumin (Glucitol VGG-BSA)

Wie in Beispiel 1 hergestelltes Glucitol-Valin- Glycin-Glycin wurde unter Verwendung von 1-Äthyl-3-(3- Dimethyl-Aminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (EDCI) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und des Natriumsalzes von N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) durch eine Modifikation der Methode von Staros et al., Anal. Biochem., 156, 220-222 (1986) an Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) angekoppelt. Kurz gesagt, wurden nach dem Vorkühlen aller Reaktionsteilnehmer auf Eis 228 ul einer wäßrigen Lösung von 10-mg/ml von Sulfo-NHS zu 500 ul einer wäßrigen Lösung von 2,4 mg/ml von Glucitol-VGG hinzugefügt und gemischt. Sodann wurden 1,5 ml einer frisch hergestellten Lösung von 20 mg/ml von EDCI in destilliertem Wasser zugegeben, sofort gemischt und auf Eis 15 Minuten lang reagieren gelassen. Anschließend wurde BSA als 1160 ul einer wäßrigen Lösung von 5 mg/ml hinzugefügt. Diese Reaktionslösung wurde gemischt, und das Ankoppeln wurde über Nacht bei 4ºC fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei 4ºC gegen destilliertes Wasser unter Verwendung eins Spectrapore-Zellulose-Dialyserohres (American Scientific Products, Mcgaw Park, IL, USA) eines Sperrpunktes für das durchschnittliche Molekulargewicht von 12-14K erschöpfend dialysiert. Kontrollen, bei denen destilliertes Wasser für das Peptid oder für das Peptid und Carbodiimid oder für das Peptid, das Carbodiimid und das Sulfo-NHS substituiert worden war, wurden zur Testung sowohl des Ausmaßes an Konjugation als auch der Antikörper-Spezifität eingeschlossen.
Die TNBS-Aminogruppenbestimmung von Glucitol-VGG- BSA-Konjugat und der BSA-Konjugat-Kontrolle (ohne Glucitol- VGG, EDCI oder Sulfo-NHS), die so durchgeführt worden war, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, zeigte, daß 42% der 60 verfügbaren BSA-Aminogruppen nach der Konjugation mit Glucitol-VGG substituiert worden waren (d.h. es waren 25 Glucitol- VGG-Peptide/BSA-Trägermolekül). BEISPIEL 4: Herstellung von Glucitol-Valin-Glycin-Glycin--

Rinder-Thyroglobulin (Glucitol-VGG-Thyro)

Auf ähnliche Weise wurde Glucitol-VGG (welches so hergestellt worden war, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist) an Rinder-Thyroglobulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) angekoppelt. Die molaren Verhältnisse der Reaktionsteilnehmer waren identisch mit jenen, welches für die Ankopplung von Glucitol-VGG an BSA benutzt worden war, wie es oben im Beispiel 3 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß ein äquimolarer Anteil an 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholino-Äthyl)-Carbodiimid-metho-p-Toluolsulfonat (CMC) für das EDCI als wasserlösliches Carbodiimid substituiert worden war.
Die TNBS-Aminogruppenbestimmung des Glucitol-VGG- Thyro-Konjugats und der Thyroglobulin-Konjugatkontrolle (ohne Glucitol-VGG, CNC oder Sulfo-NHS), welche so durchgeführt wurde, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, zeigte, daß 26% der geschätzten 194 verfügbaren Thyroglobulin-Aminogruppen nach dem Konjugieren mit Glucitol-VGG substituiert waren.

BEISPIEL 5: Herstellung von Glucitol- Valin-Glycin-Glycin-Sepharose

Ein Immunosorbens von Glucitol-VGG-Sepharose wurde durch Hinzufügen von 254 mg CNC an 533 ul Glucitol-VGG (8,67 mg/ml in H&sub2;O) hergestellt. Nach dem Mischen und Solubilisieren des Carbodiimids wurde die Peptid-Carbodiimid-Lösung zu 2 ml AH-Sepharose 48 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) (vorgewaschen gemäß den Anleitungen des Herstellers) hinzugefügt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur durch Umkehren in einer Mikroprobenphiole von 4 ml (15x45 mm) mit Schraubkappe (American Scientific Products, McGaw Park, IL, USA) gemixt. Das Immunabsorbens wurde vor dem Gebrauch bei 4ºC in Gegenwart von 0,02% NaN&sub3; gelagert. Das Immunabsorbens wurde bei der Affinitätsreinigung verwendet, wie sie in Beispiel 7 beschrieben ist.

BEISPIEL 6: Herstellung von Glucitol- Valin-Sepharose

Ein Immunoabsorbens von Glucitol-Valin-Sepharose wurde so hergestellt, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, ausgenommen, daß 595 ul Glucitol-Valin (10 mg/ml in H&sub2;O) an Stelle des Glucitol-VGG benützt wurde. Das Glucitol-Valin wurde so hergestellt, wie es In Beispiel 1 für VGG beschrieben ist.
Dieses Immunoabsorbens wurde vor dem Gebrauch ebenfalls bei 4ºC in Gegenwart von 0,02% NaN&sub3; gelagert. Es wurde bei der Affinitätsreinigung verwendet, wie sie in Beispiel 7 beschrieben ist.

BEISPIEL 7: Herstellung von Glucitol-Valinreaktive Antiköroer

Anfänglich wurden weiße weibliche Neuseeland- Kaninchen (Langshaw-Farms, Augusta, MI, USA) durch das Verfahren von Vaitakaitis et al., Clin. Endo. Metab., 33, 988, (1971) mit 2 ml einer Emulsion immunisiert, welche aus einem vollständigen Freund-Adjuvans bestand, das 500 ug Glucitol-VGG-BSA enthielt, welches so hergestellt wurde, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Die folgenden Immunisierungen wurden mit Emulsionen des unvollständigen Freund-Adjuvans durchgeführt, welche 200 ug Glucitol-VGG-BSA enthielt. Diese anschließenden Immunisierungen wurden 5 Wochen nach der anfänglichen Injektion durchgeführt und danach Intervallen von 2-8 Wochen.
Den Tieren wurde 7-10 Tage nach jeder Immunisation durch die Methode von Nerenberg et al., J. Immol. Methods., 24, 19 (1978) vom Ohr Blut entnommen. Serumproben von jedem Kaninchen wurden durch einen enzymgebundenen Direktbindungs- Fluoreszenztest (ELFA) auf Antikörperreaktionen untersucht, der für alle der dritten Immunisierung folgenden Blutentnahmen so durchgeführt wurde, wie es im Beispiel 10 beschrieben ist. Die erhaltenen Sera wurden bis zur Verwendung bei -20ºC gefroren gelagert.
Die Reinigung der gewünschten Antikörper wurde durch IgG-Fraktionierung der Sera unter Verwendung von chargenweiser Ionenaustausch-Chromatographie auf DE-52 Zellulose (Whatman LTD, Springfield, Mill Maidstone Kent, England) durch das Verfahren von Reif, Immuncchemistry, 6, 723 (1969) erreicht. Mit ausgewählten Antisera wurden die IgG-Fraktionen anschließend durch Affinitäts-Chromatographie entweder auf Glucitol-Valin-Sepharose (hergestellt, wie in Beispiel 6 beschrieben) oder Glucitol-VGG-Sepharose (hergestellt, wie in Beispielsbeschrieben)weitergereinigtoderwurdenunter Verwendung von mit Glutaraldehyd querverbundenem menschlichen Hämoglobin affinitätsadsorbiert.
Die Affinitätsreinigung von Anti-Glucitol-VGG-BSA wurde so bewerkstelligt, indem entweder 1 ml Glucitol-VGG- Sepharose oder Glucitol-Valin-Sepharose in eine wegwerfbare Bio-Rad- Polypropylen-Econo-Kolonne (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) gegeben wurde. Die Matrix wurde dann mit 50 ml PBS (0,01 M Natriumphosphat in 0,15 M NaCl), pH 7,3, gewaschen, gefolgt von einer Waschung mit 3 ml Kaliumjodid (KI) in PBS, pH 8,0, und dann 50 ml PBS, pH 7,3. Anschließend wurde die gewaschene Matrix 2 Stunden lang bei 37ºC mit 14 ml einer DE-52-IgG-Fraktion von Antisera unter Drehung inkubiert. Das ungebundene Material wurde gesammelt, wonach die Matrix zweimal mit 10 ml PBS, pH 7,3, gewaschen wurde, und der gebundene Antikörper wurde durch Elution mit 3 ml 2M KI in PBS, pH 8,0, gesammelt, unmittelbar gefolgt von einer Dialyse des Eluats über Nacht bei 4ºC gegen 2 Liter PBS, pH 7,3. Der sich ergebende dialysierte, affinitätsgereinigte Antikörper wurde in Direktbindungs- und Hemmungs-ELFA-Tests verwendet (siehe Beispiele 10-11).
Das Entfernen der Antikörper in dem Anti-Glucitol- VGG-BSA-Präparat, das mit unreduziertem menschlichen Hämoglobin reagieren könnte,wurde durch Affinitätsadsorbieren der DE-52-IgG-Fraktionen von Antisera mit denaturiertem Glutaraldehyd-insolubilisierten menschlichen Hämoglobin erreicht, das, wie folgt, hergestellt wurde. Zweihundert mg menschlichen Hämoglobins (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), das in 10 ml PBS, pH 7,3 aufgelöst war, welches 1M KI enthielt, wurde in Wasser unter Anwendung einer Modifikation des Verfahrens von Avrameas und Terynck, Immunochemistry, 6, 53 (1969) bei einer letztlichen Glutaraldehydkonzentration von 0,5% quergebunden. Nach einer Reaktion von drei Tagen wurde unlösliches Hämoglobin durch Zentrifugieren erhalten und wurde auf einem Whatman-Papier Nr. 1 (Whatman LTD, Springfield, Mill Maidstone Kent, England) durch Vakuumfiltration unter Verwendung eines Coors-Buckner-Trichters (American Scientific Products, Mcgaw Park, IL, USA) gesammelt. Das quergebundene Hämoglobin an dem Filter wurde mit 1 Liter PBS, pH 7,3, ausgewaschen. Es wurde dann 15 min lang bei Raumtemperatur mit 500 ml 0,05M NH&sub4;Cl inkubiert, das durch Vakuumfiltration entfernt wurde. Als nächstes wurde das insolubihsierte Hämoglobin mit 400 ml PBS, pH 7,31 gewaschen, welches ebenfalls durch Vakuumfiltration entfernt wurde.
Das gewaschene, quergebundene Hämoglobin wurde zum Entfernen jeglicher möglicher hämoglobinreaktiver Antikörper aus den Anti-Glucitol-VGG-BSA-IgG-Fraktionen durch Inkubieren von 10 mg von mit Glutaraldehyd quergebundenem menschlichen Hämoglobin mit 2 ml einer DE-52-Fraktion von Antisera unter andauerndem Mischen während 3,5 Stunden auf einem Drehtisch bei 37ºC benützt. Der hämoglobinadsorbierte, DE-52-IgG-Antikörper, der nicht an das insolubilisierte Hämoglobin gebunden war, wurde vom unlöslichen Hämoglobin und jeglichen daran gebundenen Material unter Verwendung einer Pasteurpipette separiert und in Dirketbindungs-ELFA-Tests verwendet (siehe Beispiel 10).

BEISPIEL 8: Herstellung von menschlichem Hämoglobin A1c (HbA1c) und menschlichem Hämoglobin AO (HBAO)

Menschliches HbA1c und HbAO wurde von altem Blut aus einer örtlichen Blutbank gereinigt. Die durch Zentrifugieren erhaltenen roten Blutzellen (RBC's) wurden mit PBS, pH 7,3, gewaschen und mit 20 Teilen destillierten Wassers lysiert. Das restliche Stroma und die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt, und das erhaltene Lysat wurde entweder einer Modifikation der Ionenaustausch-Gelfiltrationsmethode von Lowrey und Soeldner, Anal. Biochemistry, 154, 424-430 (1986) oder einem Ionenaustauschverfahren von McDonald et al., J. Biol. Chem., 253, 2327-2332 (1987) unterworfen. Die Methode von Lowrey und Soeldner wurde durch Erhöhung des Kolonnenvolumens (2,5 x 42 cm), Erhöhen der Salzkonzentration im Beschickungslysat (100 mM NaCl), Verringerung der Durchflußgeschwindigkeit (15 ml/Std.) und Verringerung des Beschickungsvolumens an Hämeprotein (0,5 ml 10-fach konzentrierten Lysats) modifiziert. Obwohl durch das Mischbettverfahren HbA1c und HbAO hoher Reinheit erhalten wurden, wurde das Verfahren von Mcdonald et al. auf Grund seiner Reproduzierbarkeit bevorzugt.
Die durch beide Isolationstechniken erhaltenen Hämoglobin enthaltenden Fraktionen wurden durch Überprüfung und durch die Absorption bei 415 nm identifiziert. Die Reinheit der verschiedenen Hämoglobinfraktionen wurde durch analytischen Kationenaustausch-HPLC unter Verwendung einer 4,6 x 30 mM-MA7C-Mikroanalysatorkassette (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) in einem Beckman-344-HPLC-System (Beckman Instruments, Berkeley, Ca.) getestet. Die Hämoglobinfraktionierung wurde gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden 20 ul einer Hämoglobin enthaltenden Probe an der MA7C-Mikroanalysatorkassette injiziert, die zuvor mit 20 mM Bis-Tris, pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, und die Hämoglobinfraktionierung wurde durch die Verwendung eines linearen Salzgradienten (0 bis 100 mM NaCl) im selben Bis-Tris-Puffersystem während 6 Minuten bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 mumm erhalten. Die Hämoglobin enthaltenden Fraktionen wurden durch Hämeabsorption bei 415 nm unter Verwendung eines Detektors variabler Wellenlänge, Beckman 163, (Beckman Instruments, Berkeley, CA, USA) bestimmt. Die Hämoglobinfraktionen wurden durch Absorption bei 415 nm festgestellt und mit Standards verglichen, welche bekannte Mengen an menschlichem Hämoglobin A1c (Bio-Rad Clinical Division, Hercules, CA, USA) enthielten. Die gereinigten Hämoglobinfraktionen wurden bei 4ºC gelagert, bis sie bei Direktbindungs- oder Hemmungs-ELFA-Tests gebraucht wurden (siehe Beispiele 10-12).

BEISPIEL 9: Reduktion von Hämoglobin-Antigenen

Um dazu imstande zu sein, wenn überhaupt in den Hämoglobin (z.B. gereinigtes Hämoglobin, Hämoglobinbestandteile oder RBC-Lysate von Patienten) enthaltenden Proben vorhandenes HbA1c, festzustellen und zu quantifizieren, muß die Hämoglobin enthaltende Probe zuerst mit NaBH&sub4; reduziert werden, um Glucitol-Valin am N-Ende der beta-Ketten jeglichen in der Probe etwa vorhandenen HbA1c zu bilden. In der Probe vorliegendes reduziertes HbA1c kann dann mit in Antisera, in DE-52-IgG-Fraktionen von Antisera und in affinitätsgereinigten und affinitätsadsorbierten Materialien (welche alle so hergestellt wurden, wie es in Beispiel 7 beschrieben ist) vorhandenem Anti-Glucitol-VGG-BSA-Antikörpern reagieren. Die Reduktion von festphasen-adsorbiertem Hämoglobin ist für die Feststellung von Glucitol-Valin in einem Direktbindungs-ELFA erforderlich, und die Reduktion sowohl von Festphasen- als auch von Flüssigphasen-Hämoglobin ist für Hemmungs-ELFA-Tests notwendig (siehe Beispiel 10-14). Die Reduktion von festphasenadsorbiertem und von Flüssigphasen-Hämoglobin werden separat beschrieben.
Das zuvor an Polystyrol-Mikrotiter-Behälter adsorbierte Hämoglobin (siehe Beispiele 10-14) wurde durch die Zugabe von 50 mM NaBH&sub4; in PBS, pH 7,3 reduziert. Das Volumen der Reduktionslösung war gleich jenem, welches für eine Hämoglobinbeschichtung benützt wird. Nach der Reaktion über Nacht bei 4ºC wurden die Platten 5 mal durch Füllen und Dekantieren oder Aspirieren der Behälter mit PBSA (0,01 M Natriumphosphat-Puffer, welcher 0,15 M NaCl, 1% BSA, 0,1% Tween 20 und 0,02% NaN&sub3; enthielt, pH 7,3) gewaschen, um restliches Borhydrid zu entfernen. Die Platten wurden dann auf die in Beispiel 10 beschriebene Weise durch Rückenbeschichtung unter Verwendung von 1% (Gew./Vol.) Ovalbumin in PBS, pH 7131 bearbeitet.
Die Reduktion der Hämoglobinproben in Flüssigphase wurde durch Zugabe von 3 Volumina von 50 mM NaBH&sub4; in 0,01% BSA enthaltendem PBS, pH 7,3 ("Reduktionslösung") zu jedem Volumen der zu reduzierenden Hämoglobinlösung bewerkstelligt. Die vorgeschlagene Konzentration an unreduziertem Hämoglobin bei Verwendung dieses Reduktionsverfahrens ist 0,5-1,0 mg/ml, wie durch Hämeadsorption bei 415 festgestellt wird. Das Hämoglobin wurde mit der Reduktionslösung durch Anwendung von Turbulenz sanft gemischt und wurde dann 3 Stunden lang bei 37ºC umgesetzt, zu welcher Zeit das Reduktionsgemisch unter Verwendung von PBSA 1:10 verdünnt wurde. Diese Verdünnung senkt die NaBH&sub4;-Konzentration auf 3,75 mM NaBH&sub4;, eine Höhe, von der Bestimmt wurde, daß sie die Reaktivität der Antikörper nicht stört, und das verdünnte, reduzierte Material war für den Gebrauch als Hemmittel in einem Hemmungs-ELFA (siehe Beispiel 11) bereit.
Die NaBH&sub4;-Reduktion von von roten Blutzellen- (RBC-) - Lysaten erhaltenem Hämoglobin wurde auf ähnliche Weise, wie die oben für gereinigtes HbA1c oder HbAO beschriebene, durchgeführt. Die mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschenen RBC's wurden durch ihre Verdünnung 1:20 in destilliertem Wasser lysiert. Der unlösliche Rückstand wurde durch Absetzen oder Zentrifugieren entfernt, und die Hämoglobinkonzentration des gesammelten löslichen, obenauf schwimmenden Lysates wurde bestimmt. Die Reduktion von festphasenadsorbiertem Lysat wurde so durchgeführt, wie es oben für HbA1c beschrieben ist. Die Reduktion des Flüssigphasen-Lysates unterschied sich vom oben beschriebenen Verfahren nur durch die Verwendung einer anfänglichen Konzentration von 2 mg/ml an unreduziertem Hämoglobin an Stelle von 0,5-1,0 mg/ml.
Die Verwendung von Gesamtblutlysaten (Beispiele 13 und 14) erforderten Abänderungen des Reduktionsprotokolls, welche im einzelnen in diesen Beispielen beschrieben werden.

BEISPIEL 10: Enzymgebundener Direktbindungs- Fluoreszenztest ("Direktbindungs-ELFA")

Zweihundert Mikroliter Antigen (z.B. Glucitol-VGG- BSA, Glucitol-VGG-Thyro, Glucitol-menschliches Hämoglobin, CNBH&sub3;-Kontrolle, HbA1c, HbAO oder in der in den Beispielen 1- 6 und 8-9 beschriebenen Weise hergestellte Lysate von RBC's von Diabetikerpatienten) wurden in Gefäße von schwarzen Polystyrol-Mikrotiterplatten Microfluor "B" (Dynatech Laboratones, Alexandria, VA, USA) gefüllt. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, um es dem Antigen zu gestatten, sich an die Gefäße zu adsorbieren. Die Antigene wurden in einer Beschichtungskonzentration von 5 ug/ml Protein in 0,1 M NaHCO&sub3;, pH 9,8, zugegeben.
Ungebundenes Antigen wurde durch Dekantieren oder Aspirieren entfernt, und die NaBH&sub4;-Reduktion wurde so durchgeführt, wie es in Beispiel 9 an adsorbierten Antigenen beschrieben ist, welche eine vorausgehende Reduktion erfordern (d.h. HbA1c, HbAO und RBC-Lysate). Die Platten wurden 5 mal mit PBSA gewaschen, indem die Gefäße mit PBSA gefüllt und dekantiert oder aspiriert wurden, um restliches NaBH&sub4; zu entfernen. Die Verfahrensschritte der Reduktion und des Waschens mit PBSA wurden für Antigene ausgelassen, welche bereits Glucitol trugen.
Die verbleibenden Polystyrol-Proteinbindungsstellen wurden anschließend durch Einfüllen von 1% Ovalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und 0,02% Natriumazid enthaltendem PBS, pH 7,3, blockiert und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Nach dem Dekantieren oder Aspirieren wurden nacheinander in PBSA aufgelöste 200 ul eines Anti-Glucitol-VGG- BSA-Antikörperpräparates (z.B. Antiserum, eine DE-52-IgG- Fraktion, affinitätsgereinigter Antikörper oder affinitätsadsorbierter Antikörper, welche alle so präpariert worden waren, wie es in Beispiel 7 beschrieben ist) den Gefäßen hinzugefügt und über Nacht bei 4ºC in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
Die Mikrotitergefäße wurden als nächstes 5 mal mit PBSA in der oben beschriebenen Weise gewaschen, und es wurden 200 ul/Gefäß an 1:2000 mit PBSA verdünntem, mit Biotin markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Vector Laboratories, Burlingham, CA, USA) zugegeben und 2 Stunden lang bei 37ºC inkubieren gelassen. Anschließend an fünf Waschungen mit PBSA wurden 200 ul/Gefäß an 1:2000 mit PBSA verdünnter Streptavidin-β-Galaktosidase (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) hinzugefügt und 1,5 Stunden lang bei 37ºC inkubieren gelassen. Nach letztlichen fünf Waschungen mit PBSA wurden 200 ul an 0,1 mg/ml 4-Methyl-Umbelliferyl-β- D-Galaktopyranosid-Substrat in PBS, pH 7,5, den Gefäßen der Mikrotiterplatte hinzugefügt, und es wurde die Methyl-Umbelliferon-Fluoreszenz als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) unter Anwendung einer Erregungswellenlänge von 365 nm und einer Emissionswellenlänge von 450 nm in einem MicroFLUOR- Lesegerät (Dynatech Instruments, Torrance, Ca. USA) gemessen.
Die Kontrollgefäße wurden identisch behandelt, wie oben beschrieben ist, es fehlte bloß das Antigen ("Kontrollen ohne Antigen") bzw. fehlte nur das Anti-Glucitol-VGG-BSA- Antikörper-Präparat ("Kontrollen ohne primären Antikörper"), und es waren jene eingeschlossen, welche nur den Verfahrensschritt des Blockierens durchmachten und Substrat erhielten ("Leersubstrat"). Die Kontrollen ohne Antigen und die Kontrollen ohne primaren Antikörper dienten dazu, die Ablesungen um das unspezifische Binden von Antikörper und Markierungsreagenzien zu korrigieren, wogegen die Substrat-Kontrollen eine Korrektur für eine nicht-enzymatische Substrathydrolyse darstellten.
Das obige Protokoll wurde für den Direktbindungstest von RBC-Lysatpräparaten leicht abgeändert. Die Abänderungen für RBC-Lysate waren die folgenden: Die Verwendung einer Beschichtungskonzentration Von 10 ug/ml Protein ohne anschließenden Verfahrensschritt des Blockierens; die Verwendung von 3 PBS-Waschungen, pH 7,3, an Stelle von 5 PBSA-Waschungen; die 1 Stunde währende Inkubation aller Reagenzien bei Umgebungstemperatur, außer einer 0,5 Stunden dauernden Inkubation mit Streptavidin-β-Galaktosidase; und die Verwendung eines Anti-Glucitol-VGG-BSA-Antikörperpräparates bei fester Sättigungskonzentration (Verdünnung 1:100).
Repräsentative Ergebnisse der Direktbindungs-ELFA werden in den Figuren 1-3 und 5-7 gezeigt. Die Ergebnisse können, wie folgt, zusammengefaßt werden.
Gegen Glucitol-VGG-BSA- und unter Verwendung von Glucitol-VGG-Sepharose affinitätsgereinigte Antikörper erkannten Glucitol-VGG-BSA und Glucitol-VGG-Thyro (Figuren 1 und 3). Diese Antikörper reagierten auch mit nativem reduzierten glykosylierten Hämoglobin (Figur 3) und gereinigtem reduzierten HbA1c (Figur 2), reagierten aber nicht mit nativem reduzierten Hämoglobin (HbAO in Figur 2 und CNBH&sub3;- Kontrolle (reduktiv, in Abwesenheit von Glukose glyciertes Hämoglobin in Figur 3). Das verwendete HbAO war durch Ionenaustausch-Chromatographie präpariert worden, und von ihm würde man erwarten, daß es Moleküle enthält, welche an verfügbare, durch die NaBH&sub4;-Behandlung reduzierte epsilon-Aminogruppen glykolysiert worden sind.
Antikörper, welche unter Verwendung von Glucitol- VGG-BSA hergestellt und in Kolonnen von Glucitol-Valin-Sepharose affinitätsgereinigt waren, zeigten dieselben Spezifitaten wie auf Glucitol-VGG-Sepharose gereinigte Antikörper (vergleiche Figur 2 mit Figur 5). In ähnlicher Weise zeigten gegen Glucitol-VGG-BSA und unter Verwendung quergebundenen menschlichen Hämoglobins (von dem erwartet werden kann, daß es unreduzierte Valin- und Lysinreste enthält) affinitätsadsorbierte Antikörper dieselben Spezifitäten wie Antikörper, welche entweder mit Glucitol-VGG-Sepharose oder mit Glucitol- Valin-Sepharose affinitätsgereinigt worden waren. Siehe die Figuren 1-3 und 5-7.
Schließlich korrelierten die Ergebnisse der Direktbindungs-ELFA unter Verwendung von RBC-Lysaten von Diabetiker-Patienten gut mit denjenigen Meßergebnissen von HbA1c, welche unabhängig unter Verwendung eines Standard- Elektrophoresetestes erhalten worden waren. Siehe Figur 4, die eine typische Regressionsanalysekurve zeigt.
Der Elektrophoresetest wurde unter Verwendung einer Elektrophorese-Ausrüstung für die Messung glykosylierten Hämoglobins von Ciba-Corning (Ciba-Corning, Pab Alto, Ca., Katalog-Nr. 470055) durchgeführt. Der Elektrophoresetest wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers ausgeführt.

BEISPIEL 11: Fluoreszenztest enzymgebundener Hemmung ("Hemmungs-ELFA)

Der Hemmungs-ELFA wurde auf dieselbe Weise wie der Direktbindungs-ELFA von Beispiel 10 unter Verwendung von reduziertem, an eine Festphase adsorbierten HbA1c-Antigen, aber mit zwei Abänderungen, durchgeführt. Erstens wurde eine konstante Konzentration an auf Glucitol-VGG-Sepharose affinitätsgereinigtem Anti-Glucitol-VGG-BSA-Antikörper angewandt. Die verwendete Konzentration war diejenige Antikörperkonzentration, welche zum Erhalt von 50% oder weniger der maximalen Bindung bei einem Direktbindungs-ELFA mit an eine Festphase adsorbiertem, mit NaBH&sub4; reduzierten HbA1c-Antigen erforderlich ist.
Zweitens wurde der Antikörper fester Konzentration mit variierenden Konzentrationen eines Hemmitteis gemischt, welches aus HbA1c-Antigen oder Lysaten von RBC's von Diabetiker-Patienten bestand, von denen beide zuvor reduziert worden waren, wie dies in Beispiel 9 beschrieben wurde, und dann vor der Zugabe des Antikörpers nacheinander in PBSA verdünnt worden waren. Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 37ºC wurden 200 ul des Antikörper-Hemmittelgemisches in die Gefäße gegeben, die mit mit NaBH&sub4; reduziertem HbA1c beschichtet, mit PBSA gewaschen und mit Ovalbumin blockiert worden waren, wie dies in den Beispielen 9 und 10 beschrieben ist. Die Zugabe des Antikörper-Hemmittelgemisches beim Bindungshemmungs-ELFA entspricht der Zugabe des Anti-Glucitol- VGG-BSA-Antikörperpräparates beim Direktbindungs-ELFA.
Die Kontrollen für den Hemmungs-ELFA waren ohne Antigenkontrollen, ohne Primarantikörper-Kontrollen, wobei die Leersubstrate und Kontrollen für die Wirkung der NaBH&sub4;- Reduktion aus Antikörper und verdünntem Reduktionsgemisch bestanden, das auf identische Weise wie das in der Flüssigphase reduzierte HbA1c-Hemmittel behandelt worden war, aber das Hemmittel nicht enthielt.
Die repräsentative Hemmung der Antikörperbindung wird in Figur 8 für reduziertes Flüssigphasen-HbA1c gezeigt und in Figur 9 für eine Probe reduzierten RBC-Lysats von einem Diabetiker-Patienten. Vom RBC-Lysat war zuvor durch Elektrophorese gezeigt worden, daß es 8,4% HbA1c enthielt. Die Regressionsanalyse veranschaulicht eine lineare Korrelation zwischen den Mengen an RBC-Lysat, welche erforderlich sind, um im Hemmungs-ELFA eine 50%ige Hemmung zu erhalten, die für die fünf überprüften Proben durch Elektrophorese als in der Probe vorliegend festgestellt wurde (siehe Figur 10).

BEISPIEL 12: Fluoreszenztest enzymgebundener Hemmung ("Hemmungs-ELFA)

Das Beispiel 11 wurde wiederholt, ausgenommen, daß ein an quergebundenem menschlichen Hämoglobin absorbierter Anti-Glucitol-VGG-BSA-Antikörper als Antikörper und Glucitol- VGG als Hemmittel benutzt wurden. Die Ergebnisse sind in Figur 11 dargestellt. Wie man dort ersehen kann, hemmte Glucitol-VGG bei den getesteten höheren Konzentrationen von Glucitol-VGG 100% der Bindung des Antikörpers an reduziertes HbA1c.
Die zusammen genommenen Daten aus den Beispielen 10-12 veranschaulichen, daß ein Anti-Glucitol-VGG-BSA-Antikörper, welcher mit Glucitol-VGG-Sepharose oder Glucitol- Valin-Sepharose affinitätsgereinigt oder mit quergebundenem menschlichen Hämoglobin affinitätsabsorbiert worden war, Glucitol-Valin spezifisch feststellt. Der affinitätsgereinigte oder affinitätsabsorbierte Antikörper hat noch einen hohen Titer Somit eröffnet das erfindungsgemäße Verfahren einen leichten Weg, hoch-spezifische Antisera hohen Titers sowie Antikörperpräparate zu erhalten, welche im Immuntests zweckmäßig sind, um an ihrer N-Endaminosäure glykosylierte Proteine ohne die Herstellung monoklonaler Antikörper festzustellen. Natürlich können, falls gewünscht, monoklonale Antikörper benutzt werden.

BEISPIEL 13: Enzymgebundener Direktbindungs-Immunosorbenstest ("ELISA") unter Verwendung von Gesamtblutlysaten.

Dieses Beispiel beschreibt einen Direktbindungstest, der eine Adaptierung der in Beispiel 10 beschriebenen Methode darstellt. Als Quelle für HbA1c wird Gesamtblut verwendet, und es wird ein leicht zu visualisierender kolorimetrischer Endpunkt angewandt. Der ganze Test kann in einer Gesamtzeit von etwa 3-4 Stunden durchgeführt werden.
Ein zuvor in mit EDTA beschichteten Vacutainer- Röhrchen (Becton Dickinson, Rutherford, NJ 07070) gesammelter Blutstropfen wurde 1 ml destillierten Wassers in einem Polystyrol Röhrchen von 12 x 75 mm (Scientific Products, McGaw Park, IL, USA) mit einer Dispo-Pipette vom Pasteurtyp von 5,75 Zoll (Scientific Products, Mcgaw Park, IL, USA) hinzugefügt. Nach dem Mischen wurde das Röhrchen durch Inkubieren während 15 min. bei Raumtemperatur mit dem sich ergebenden Gesamtblutlysat beschichtet. Die Beschichtungslösung wurde durch Aspirieren entfernt, es wurde ein ml von 50 mM NaBH&sub4; in PBS zugegeben und es wurde die Reduktion 10 min. lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen.
Das Röhrchen wurde dann dreimal mit PBS gewaschen. Die Waschung bestand aus dem Füllen des Röhrchens mit PBS und anschließendem Aspirieren des Waschungspuffers.
Es wurde ein mit Anti-Glucitol-Valin reaktiver Antikörper (welcher, wie im Beispiel 7 beschrieben, hergestellt worden war, außer daß er nicht affinitätsgereinigt oder affinitätsabsorbiert worden war, d.h. eine DE-52-gereinigte IgG- Fraktion), gelöst in PBSA 1:100, hinzugefügt (1 ml pro Röhrchen) und 45 min. lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen.
Im Anschlusse an drei Waschungen mit PBS wurde ein ml von mit Biotin markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Vector Laboratories, Burlingham, CA, USA), welches 1:2000 mit PBSA verdünnt worden war, zugegeben und 0,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Nach drei Waschungen mit PBS wurde ein ml von in PBSA 1:2000 verdünnter Streptavidin-beta-Galaktosidase (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) hinzugefügt und 15 min. lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Im Anschlusse an vier PBS-Waschungen wurde 1 ml einer Lösung von o-Nitrophenylbeta-D-Galaktopyranosid (ONPG) von 4 mg/ml als Substrat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welches 0,1 M 2-Mercaptoäthanol und 5 mM MgCl&sub2; enthielt, hinzugefügt und 40 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Unter Verwendung von Standards, welche bekannte Mengen an HbA1c enthielten (Bio-Rad Hämoglobin A1c Mini- und/oder Micro Column Test Calibrators, Bio-Rad Clinical Division, Hercules, CA, USA) konnten die relativen Mengen an HbA1c in den Gesamtblutlysaten durch einen Vergleich zwischen den Standards und den Gesamtblutlysaten des erhaltenen gelben Nitrophenol-Produktes festgestellt werden.
Die unter Anwendung dieses Verfahrens zum Messen des Anteiles an HbA1c in Gesamtblutlysaten von Diabetiker- Patienten erhaltenen Resultate korrelierten gut mit dem Prozentsatz an HbA1c, der durch Elektrophorese von RBC-Lysaten von denselben Patienten erhalten wurden, wie in Figur 12 gezeigt wird (Korrelationskoeffizient 0,9724). Der Elektrophoresetest wurde so ausgeführt, wie es in Beispiel 10 beschrieben ist.

BEISPIEL 14: Fluoreszenztest enzymgebundener Hemmung unter Verwendung von Gesamtblutlysaten als Hemmittel.

Dieses Beispiel beschreibt eine Adaptierung des in Beispiel 11 beschriebenen Hemmungstestformates. Als Quelle für HbA1c wurden Gesamtblutlysate verwendet.
Zweihundert Mikroliter Antigen (Bio-Rad Hämoglobin Alc Micro Column Test Standard, im einem Test 11,4% HbA1c enthaltend) wurden in Mikrotiterbehälter Microfluor "B" in einer Konzentration von 10 µg/ml an Gesamthämoglobin in 0,1 M NaHCO&sub3;, pH 9,8, gegeben und die Behälter 2 Stunden lang bei 37ºC beschichten gelassen. Ungebundenes Antigen wurde durch Dekantieren oder Aspiration entfernt, und adsorbiertes Antigen wurde durch Füllen der Behälter mit 50 mM NaBH&sub4; in PBS reduziert und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Behälter wurden danach 5 mal mit 0,1% Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) enthaltendem PBS gewaschen, mit 1% Ovalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und 0,02% Natriumazid enthaltendem PBS, pH 7,3, gefüllt und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubieren gelassen, um jedwede verbleibenden Polystyrol-Protein-Bindungsstellen zu blockieren.
Während der Verfahrensschritte des Beschichtens, Reduzierens und Rückbeschichtens wurde ein, wie in Beispiel 13 beschrieben, hergestellter Anti-Glucitol-Valin reaktiver Antikörper mit durch NaBH&sub4; reduzierten Hemmitteln (entweder Gesamtblutlysaten oder Standards, welche aus Bio-Rad Hämoglobin A1c Calibrators, Bio-Rad Clinical Division, Hercules, CA, USA, bestanden) inkubiert. Die Reduktion dieser Hemmittel wurde so durchgeführt, wie es in Beispiel 9 für RBC-Lysate beschrieben ist, ausgenommen daß die Konzentration von NaBH&sub4; in der Reduktionsiösung 500 mM war und die Reduktionszeit 1 Stunde bei 37ºC betrug.
Die darauffolgenden Verfahrensschritte des Hemmungstests waren identisch mit jenen, welche in Beispiel 11 beschrieben wurden, mit den folgenden Ausnahmen:
(1) Die Waschungen wurden mit 0,1% Tween 20 enthaltendem PBS durchgeführt; und
(2) die Zeit der Inkubation mit mit Biotin markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG erfolgte über Nacht bei 4ºC.
Eine repräsentative Dosisreaktionskurve, welche die Hemmung einer Antikörperbindung unter Verwendung eines Gesamtblutlysates eines Diabetikers als Hemmittel darstellt, ist in Figur 13 gezeigt. Die Regressionsanalyse wurde unter Vergleich der Meßergebnisse für die Menge an HbA1c in Gesamtblutlysaten von Diabetikern durch das beschriebene Hemmungsverfahren mit den durch Elektrophorese von RBC-Lysaten derselben Patienten erhaltenen Ergebnissen durchgeführt (die Elektrophorese wurde so ausgeführt, wie es in Beispiel 10 beschrieben wurde). Ein Diagramm der Ergebnisse der Regressionsanalyse mit einem Vergleich der beiden Verfahren für 5 der 8 getesteten Diabetikerproben werden in Figur 14 gezeigt. Der Korrelationskoeffizient für diese fünf Beispiele betrug 0,9762. Die Regressionsanalyse von 6 von den 8, von 7 von den 8 und von 8 von den 8 Beispielen ergaben jeweils Korrelationskoäffizienten von 0,7098, 0,4899 und 0,0774. Es ist noch nicht bekannt, warum diese drei Beispiele solch divergente Resultate ergaben.
In den Figuren 13 und 14 wurde die Hämoglobinkonzentration der Gesamtblutlysate durch Vergleich der Absorbanz der Lysate bei 414 nm mit der Absorbanz eines in destilliertem Wasser aufgelösten und nacheinander verdünnten Hämoglobinstandards (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) bestimmt.

BEISPIEL 15: Enzymgebundener Direktbindungs-Immunosorbenstest (ELISA) unter Verwenduna von Gesamtblutlysaten.

Ein Direktbindungs-ELISA unter Verwendung von Gesamtblutlysaten als Quelle für HbA1c wurde unter Verwendung von Mikrotiterpiatten durchgeführt. Der vollständige Test kann in einer Gesamtzeit von ungefähr 3-4 Stunden durchgeführt werden.
Die Blutproben wurden durch Verdünnung 1:200 mit destilliertem Wasser lysiert, und die Hämoglobinkonzentration wurde anschließend auf 10 µg/ml in 0,1M NaHCO&sub3;, pH 9,6, ("Beschichtungspuffer") eingestellt. Die Hämoglobinkonzentrationen wurden durch Vergleich der Absorbanz der Lysate bei 414 um mit der Absorbanz eines in destilliertem Wasser aufgelösten und nacheinander verdünnten Hämoglobinstandards (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; USA) bestimmt. Standards, welche bekannte Mengen an Hämoglobin A1c (Bio-Rad Hämoglobin A1c Mmi- und/oder Micro Column Test Calibrators, Bio-Rad Clinical Division, Hercules, CA, USA) enthielten, wurden auf 10 µg/ml in einem Beschichtungspuffer verdünnt.
Zweihundert Mikroliter Antigen (d.h. verdünnte Diabetiker-Gesamtblutlysate oder verdünnte Standards, welche bekannte Mengen an Hämoglobin A1c enthielten) wurden in die Behälter von Immulon-2-Platten (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA, USA) gefüllt. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um das Antigen an die festen Flächen der Behälter adsorbieren zu lassen. Die Antigene wurden bei einer Beschichtungskonzentration von 10 µg/ml in einem Beschichtungspuffer zugegeben.
Die darauffolgenden Verfahrensschritte waren identisch mit jenen, welche bei dem in Beispiel 10 beschriebenen Direktbindungs-ELFA angewandt wurden, mit den folgenden Ausnahmen:
1. Die Reduktion mit 50 mM NaBH&sub4; in PBS, pH 7,31 erfolgte 0,5 Stunden lang bei Raumtemperatur.
2. Die Inkubation mit einem Anti-Glucitol-Valin- Antikörper (hergestellt, wie in Beispiel 13 beschrieben) erfolgte während 45 Minuten bei 37ºC unter Anwendung einer Verdünnung des Antikörpers von 1/20;
3. Die Inkubation mit Biotin markiertem Ziegen- Anti-Kaninchen-IgG dauerte 45 Minuten bei 37ºC unter Anwendung einer Verdünnung des Antikörpers von 1/2000;
4. Die Inkubation mit Streptavidin-β-Galaktosidase erfolgte während 20 Minuten bei Raumtemperatur;
5. Alle Waschungen zwischen der Zugabe von Reagenzien wurden dreifach unter Verwendung von 0,1% Tween 20 enthaltendem PBS, pH 7,3, durchgeführt;
6. Das Substrat war entweder: a) o-Nitrophenyl-β- D-Galaktopyranosid ("ONPG") (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; USA) bei einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M eines Natriumphosphatpuffers, pH 7,3, welcher 0,1 M 2-Mercaptoäthanol und 5 mM MgCl&sub2; enthielt ("kolorimetrischer Substratpuffer"); oder 2) Chlorphenol-Rot-β-D-Galaktopyranosid ("CPRG") (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) bei einer Konzentration von 0,6 mg/ml in einem kolonmetrischen Substratpuffer; und
7. Nach 40 Minuten Reaktion mit dem ONPG-Substrat wurde die Absorbanz bei 405 nm gemessen. Für CPRG betrug die Reaktionszeit 9 Minuten, und es wurde die Absorbanz bei 570 nm gemessen.
Figur 15 zeigt einen Vergleich der durch Messung von HbA1c in Gesamtblutlysaten von Diabetikern unter Anwendung des Direktbindungs-ELISA erhaltenen Ergebnisse mit jenen, welche unter Verwendung eines Aminophenyl-Boronat-Systems (Glyc-Aff-Ghb, Isolab Inc., Akron, OH, USA) erhalten wurden, der gemäß den Anleitungen des Herstellers zum Messen von HbA1c in RBC-Lysaten derselben Patienten durchgeführt wurde. Die Prozentzahlen von HbA1c, welche unter Anwendung des Direktbindungs-ELISA erhalten wurden und jene, welche unter Anwendung der Isolab-Kolonnensystems mit Aminophenylboronat erhalten wurden, waren sowohl für ONPG- (Korrelationskoäffizient = 0,9708) als auch für CPRG- (Korrelationskoeffizient = 0,9712) -Substrate ähnlich. Siehe Figur 15.

Claims

1. immuntest für ein Protein, welches an der alpha- Aminogruppe seiner N-Endaminosäure nicht-enzymatisch glykosyliert ist, welcher Immuntest folgendes aufweist:

- Bereitstellen einer das glykosylierte Protein enthaltenden Probe;

- Umsetzen, des glykosylierten Proteins mit einem Reduziermittel so, daß der Zuckerrest an der N-Endaminosäure reduziert wird;

- Kontaktieren des reduzierten glykosylierten Proteins mit einem auf Glc-ol-X gerichteten Antikörper, wobei X die N-Endaminosäure des glykosylierten Proteins ist, außer daß X nicht Lysin sein kann, und Glc-ol die reduzierte Form des an der alpha-Aminogruppe von X angehängten Zuckerrestes am glykosylierten Protein ist; und

- Bestimmen oder Quantifizieren des an den Antikörper gebundenen glykosylierten Proteins.

2. Immuntest nach Anspruch 1, bei dem X Valin ist.

3. Immuntest nach Anspruch 1, bei dem das Protein mit Glukose oder einem Derivat glykosyliert ist.

4. Immuntest nach Anspruch 3, bei dem das glykosylierte Protein Hämoglobin ist.

5. Immuntest nach Anspruch 4, bei dem das glykosylierte Protein HbA1c, Glc-ol Glucitol und X Valin ist.

6. Immuntest nach Anspruch 5, bei dem die Probe ganzes Blut ist, das zur Freisetzung von HbA1c lysiert worden ist.

7. Immuntest nach Anspruch 6, bei dem das HbA1c kolorimetrisch bestimmt oder quantifiziert wird.

8. Immuntest nach Anspruch 6, der ferner den Verfahrensschritt der Beschichtung einer festen Fläche mit dem freigesetzten HbA1c umfaßt.

9. Immuntest nach Anspruch 8, bei dem das reduzierte HbA1c kolorimetrisch bestimmt oder quantifiziert wird.

10. Antikörper, welcher auf Glc-ol-X gerichtet und spezifisch für die Verwendung in dem Immuntest nach den Ansprüchen 1 bis 9 angepaßt ist, bei dem X Valin und Glc-ol die reduzierte Form des an der alpha-Aminogruppe von Valin angehängten Zuckerrestes am glykosylierten Protein ist.

11. Antikörper nach Anspruch 10, der auf Glucitol Valin gerichtet ist.

12. Immunogen, das spezifisch für die Herstellung des auf Glc-ol-X gerichteten Antikörpers nach Anspruch 10 bestimmt ist und die Formel hat:

(Glc-ol-X-L)n-Träger

worin

X Valin ist;

L eine Binde- oder Verbindungsgruppe ist;

Glc-ol die reduzierte Form des an der alpha-Aminogruppe von Valin angehängten Zuckers am glykosylierten Protein ist;

der Träger eine andere immunogene Verbindung als das glykosylierte Protein ist; und

n von 1 bis zur Zahl der verfügbaren Kupplungsstellen am Träger ist.

13. Tmmunogen nach Anspruch 12, bei dem Glc-ol Glucitol ist.

14. Immunogen nach Anspruch 12, bei dem L Glycin-Glycin ist.

15. Immunogen nach Anspruch 12, bei dem der Träger Rinderserumalbumin oder Rinderthyroglobin ist.

16. Immunogen nach Anspruch 13, bei dem L Glycin-Glycin ist.

17. Immunogen nach Anspruch 16, bei dem der Träger Rinderserumalbumin oder Rinderthyroglobin ist.

18. Verfahren zum Herstellen des auf Glc-ol-X gerich teten Antikörpers nach Anspruch 10, welches Verfahren das Immunisieren eines Tieres mit dem Immunogen nach Anspruch 12 umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Protein mit Glukose oder einem Derivat glykosyliert ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das glykosylierte Protein Hämoglobin ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem das glykosylierte Protein HbA1c und Glc-ol Glucitol ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem L Glycin-Gly cin ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Träger Rinderserumalbumin oder Rinderthyroglobin ist.

24. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem L Glycin-Glycin ist.

25. Verfahren zum Herstellen des Immunogens nach Anspruch 12, welches folgendes umfaßt:

- reduzierendes. Glykosylieren von X, um Glc-ol-X herzustellen;

- Kuppeln von Glc-ol-X an L, falls eine Verbindungsgruppe verwendet werden soll; und

- Kuppeln von Glc-ol-X oder Glc-ol-X-L an einen Immunogenträger.

26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem Glc-ol Glucitol und L Glycin-Glycin ist.

27. Verfahren zum Herstellen des Immunogens nach Anspruch 12, welches folgendes umfaßt:

- Kuppeln von X an L, um X-L herzustellen;

- reduzierendes Glykosylieren von X-L, um Glc-ol-X-L herzustellen;

- Kuppeln von Glc-ol-X-L an einen Immunogenträger.

28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem Glc-ol Glucitol und L Glycin-Glycin ist.

29. Zusammensetzung für einen Immuntest nach Anspruch 1, welche folgendes aufweist:

einen Aufnehmer für einen ersten, auf Glc-ol-X gerichteten Antikörper, bei dem X Valin und Glc-ol die reduzierte Form des an Valin angehängten Zuckers am glykosylierten Protein ist.

30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, welche ferner einen Aufnehmer für ein Reduziermittel zum Reduzieren des an der alpha-Aminogruppe von X angehängten Zuckerrestes ist.

31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, welche ferner einen Aufnehmer für eine markierte, zum Bestimmen oder Quantifizieren von reduziertem glykosyliertem, an den Antikörper gebundenen Protein zweckmäßige Komponente aufweist.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 31, bei dem die markierte Komponente ein zweiter, mit dem ersten Antikörper reagierender Antikörper ist.

33. Zusammensetzung nach Anspruch 29, welche ferner einen Aufnehmer für eine markierte, zum Bestimmen oder Quantifizieren von reduziertem glykosyliertem, an den Antikörper gebundenen Protein zweckmßige Komponente aufweist.

34. Zusammensetzung nach Anspruch 33, bei dem die markierte Komponente ein zweiter, mit dem ersten Antikörper reagierender Antikörper ist.