EP1237927A2 - Antikörper und verfahren zu ihrer herstellung, deren verwendung, sowie immunisierungscocktails, immunoassay-sets und peptide - Google Patents

Antikörper und verfahren zu ihrer herstellung, deren verwendung, sowie immunisierungscocktails, immunoassay-sets und peptide

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Publication number
EP1237927A2
EP1237927A2 EP00985167A EP00985167A EP1237927A2 EP 1237927 A2 EP1237927 A2 EP 1237927A2 EP 00985167 A EP00985167 A EP 00985167A EP 00985167 A EP00985167 A EP 00985167A EP 1237927 A2 EP1237927 A2 EP 1237927A2
Authority
EP
European Patent Office
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haptoglobin
protein
immunization
antibodies
peptides
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00985167A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mark Hennies
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Publication of EP1237927A2 publication Critical patent/EP1237927A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4717—Plasma globulins, lactoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • Antibodies and processes for their preparation, their use, as well as immunization cocktails, immunoassay sets and peptides are included in the preparation, their use, as well as immunization cocktails, immunoassay sets and peptides.
  • the present invention relates to a method for producing protein-specific antibodies, protein-specific antibodies obtainable therewith, namely polyclonal, cross-reactive antisera with specificity for haptoglobin from at least two types of useful and domestic animals, and their use for determining haptoglobin in useful and domestic samples.
  • the invention further relates to immunization cocktails with protein and at least one protein fragment, peptides which are useful for producing the antisera, and immunoassay sets which are based on the antisera.
  • Plasma proteins the concentration of which varies with a host's response to infection, inflammation, or a traumatic event.
  • the increase in concentration in the plasma can be of different degrees, from a 100 to 500-fold very strong increase to a 3 to 4-fold increase in a moderate response to a 2-fold increase in the plasma level of a relatively weak response, cf. , Eckersall et al., Veterinary Medicine, Vol. 41, 643 (1999).
  • Haptoglobin belongs to the group of acute phase proteins. In cattle, the haptoglobin concentration rises up to 300 times during the acute phase response from a concentration of less than 0.01 g / 1 to 2-3 g 1 within 48 hours after infection. In pigs, on the other hand, there is only a moderate increase from about 1-2 mg / ml to about 5 mg / ml after turpentine injection (Eckersall et al, 1999).
  • haptoglobin Methods for the quantitative determination of haptoglobin are based on either biochemical or immunological methodology. Since the biochemical measuring method uses the binding of haptoglobin to hemoglobin, even the smallest traces of hemoglobin can impair the measuring accuracy.
  • Immunological measurement methods first require the production of suitable antibodies.
  • a monoclonal antibody directed against bovine haptoglobin as capture antibody and a rabbit directed against bovine haptoglobin as detection antibody Antiserum is used.
  • Haptoglobin concentrations in horse sera were determined immuno-turbidimetrically using a sheep antiserum directed against horse haptoglobin (Kent and Goodall, Equine Veterinary Journal, 23 (1), 59-66 (1991)).
  • a sheep antiserum directed against horse haptoglobin Kerbidimetrically using a sheep antiserum directed against horse haptoglobin (Kent and Goodall, Equine Veterinary Journal, 23 (1), 59-66 (1991)).
  • the immunoassays described so far are species-specific because it is generally assumed that only species-specific antisera and standards can meet the requirements for consistent and comparable immunochemical tests (Eckersall et al., 1999).
  • the production of a polyclonal antiserum usually starts from an active immunization, that is, the artificial generation of an immune response as a defense against a host organism.
  • the relevant antigen is administered to the host, and this stimulates antigen-reactive B cells to expand and differentiate.
  • Antibodies against a protein as an antigen are usually obtained by immunizing with the protein or else with synthetic polypeptides.
  • the pure antigen is ideally used to produce a specific antibody. If the high degree of purity required for this cannot be achieved or can only be achieved in a cumbersome manner, synthetic peptides with partial sequences of the protein can possibly also lead to antipeptide antibodies which cross-react with the complete protein.
  • the object on which the invention is based an immunological determination of proteins,
  • an immunological determination of proteins is achieved according to the invention by a special process for the production of protein-specific, in particular haptoglobin-specific antibodies.
  • This method uses at least one immunization cocktail that contains both protein and fragments of the protein.
  • the present invention therefore relates to a method for producing protein-specific antibodies by immunizing a host and in a manner known per se for obtaining the antibodies, characterized in that at least one immunization cocktail is administered to the host which contains protein and at least one protein fragment.
  • Protein-specific antibodies in the sense of the invention are antibodies with binding specificity for a specific protein.
  • the term protein includes polypeptides which can be essentially homogeneous structurally, but which also include a mixture of structurally different polypeptides, for example different phenotypes and isotypes of a protein, different species-specific variants of a protein due to evolutionary divergence or individual ones, mostly due to mutations Protein variants can be.
  • protein-specific antibodies in the sense of the invention can also be cross-reactive antibodies, polyclonal or monoclonal, with specificity for at least two structurally different proteins. Structural differences are to be understood in terms of antigen recognition and include different sequences as well as different spatial structures, such as conformities or derivatizations, e.g. Glycosylation.
  • Immunization means the generation of an immune response as an organism's defense against an antigen.
  • One or more antigens are administered to the host, preferably injected into the bloodstream or into a tissue.
  • the generation of an immune response is artificial, one speaks therefore of an active immunization.
  • the immunization is usually carried out according to a defined immunization scheme.
  • the primary immunization advantageously is followed by further immunizations to produce secondary immunological reactions.
  • the number of immunizations to be carried out depends primarily on the host and the respective development of the antibody titer. It is preferred according to the invention to carry out more than two and in particular three to five immunizations. According to a particular embodiment of the present invention, four immunizations are carried out.
  • the individual immunizations are usually carried out at intervals of several weeks, which should advantageously not exceed two months. Immunization intervals of two to seven and in particular three to six weeks are preferred. According to an advantageous embodiment of the present invention, the interval between the individual immunizations is about five weeks.
  • the immunization cocktails administered for the individual immunizations can be the same or preferably different.
  • at least one immunization cocktail contains protein and at least one protein fragment, while with the others in the conventional manner either protein or at least one
  • Protein fragment can be administered. However, it is advantageous if all immunization cocktails used within a method contain protein and at least one protein fragment, although these can differ in their respective composition, which is preferred in certain cases.
  • a higher vertebrate usually serves as the host.
  • Rodents in particular rabbits, mice, rats and hamsters, as well as goats and sheep, are preferred. According to an advantageous embodiment of the present invention, rabbits serve as the host.
  • the antibodies formed can be made in a manner known per se, for example from spleen,
  • full serum consists only partially of immunoglobulins, so that further purification steps for enriching the desired antibodies can follow.
  • salting-out e.g. by means of fractionated ammonium sulfate precipitation, ultrafiltration, re-buffering, dialysis, precipitation by dialysis against acidic buffers, various chromatographic methods such as ion exchange chromatography, gel permeation chromatography, hydrophobic chromatography, AfFinity chromatography, etc. can be used.
  • High-titered full sera are advantageously obtained over a reasonable period of time, usually several weeks or months, with the host finally bleeding out.
  • spleen tissue from the host and to fuse the splenic lymphocytes contained therein, which are antibody-producing B cells, with myeloma cells, then to select and clone suitable hybridomas which produce a desired antibody and then to produce monocional antibodies use.
  • the respective work steps are known to the person skilled in the art.
  • the antibodies obtained in this way in particular the monoclonal antibodies, can be modified, fragments of these antibodies or chimeric antibodies can be generated, depending on the task and area of use. Suitable techniques are known to the person skilled in the art.
  • an immunization cocktail is understood to be a mixture of antigen and, if necessary, adjuvants, in particular adjuvant.
  • adjuvants are substances in which the antigen is incorporated or at least injected together with the antigen and which enhance the immune response. These include depot-forming,
  • Macrophage activating and / or influencing adjuvants usually contain oils such as paraffin oil, squalene or fatty acid esters such as mannide monooleate, sorbitan monooleate etc., for the formation of oil-in-water or water-in-oil emulsions of the antigen.
  • Adjuvants can also contain killed pathogens, toxins or components thereof, such as killed Mycobacterium tubercolosis, pertusis vaccine, detoxified monophosphoryllipid A from S.
  • Freund's adjuvant is preferred according to the invention, in particular complete for the start immunization and incomplete for further immunizations.
  • Antigen according to the invention is composed of protein and at least one protein fragment.
  • the protein expediently has at least one antigenic determinant against which the protein-specific antibodies to be produced are directed.
  • at least part of the protein to be used as antigen corresponds to at least part of the protein against which the protein-specific antibodies are directed.
  • the protein to be used in accordance with the process can be a structurally essentially homogeneous polypeptide fraction, but a mixture of structurally different polypeptides is preferred, in particular a mixture of species-specific variants of a protein.
  • Protein suitable according to the invention can be obtained from natural sources. Another possibility is recombinant production. In both cases, the person skilled in the art is familiar with the relevant techniques from protein biochemistry and molecular biology. Pure protein is preferred.
  • Protein fragments which can be used according to the invention are preferably derived from the protein against that the protein-specific antibodies are directed. At least one antigenic fragment is advantageously used. As a rule, these are optionally derivatized peptides whose amino acid sequences comprise at least parts which are part of one or more polypeptides of the protein. Peptides with a length of 10 to 30 amino acids, preferably of 15 to 25 amino acids, are advantageous. For reasons of antigenicity, peptides which are particularly useful according to the invention are derived from, preferably glycosylation-free, surface areas and have a high antigenicity index. Particularly preferred are peptides whose sequence differs from homologous sequences that may be present in the host.
  • the immunization cocktail contains at least one type of fragment, advantageously 2 or more different fragments.
  • Protein fragments which can be used according to the invention can be prepared in a manner known per se.
  • peptides can be obtained from natural sources or synthesized from corresponding amino acids.
  • a natural source that can be used according to the invention is protein that can be digested enzymatically, for example.
  • the resulting fragments can be worked up and fragments of interest can be obtained and modified if necessary.
  • Peptide synthesis is preferably carried out chemically, in particular using known solid-phase synthesis systems.
  • functionalized resins are usually used, to which the peptides to be synthesized can be linked. Wang resins for FMOC solid phase peptide synthesis or Merrifield resins for BOC solid phase peptide synthesis are common examples.
  • the desired peptide After the desired peptide has been built up, it is then detached from the carrier, it being possible for protective groups which may be present to be split off simultaneously or subsequently. Any subsequent purification that may be required, for example via HPLC, provides the peptide in the desired purity, which can be determined, for example, by means of mass spectroscopy or NMR.
  • Immunization cocktails which can be used according to the invention can contain protein and protein fragments as a physical mixture, ie protein and fragments and any adjuvants present are mixed with one another in any order. However, it is preferred that at least some of the fragments are coupled to at least some of the protein. Coupling is understood according to the invention to mean any molecular interaction which leads to a binding of the fragments to the protein, so that a certain spatial arrangement with respect to one another is achieved. The interactions can be based on covalent, metal complex-like coordinative or hydrophobic bonds, hydrogen bonds, electrostatic attractive forces, van der Vaals forces and the like. Preferred according to the invention are covalent bonds. There can be direct or indirect interactions between proteins and protein fragments.
  • Indirect interactions are usually mediated via linkers, which can be homo- or heterobifunctional.
  • linkers which can be homo- or heterobifunctional.
  • Glutaraldehyde is preferred.
  • the handling of these reagents is well known to the person skilled in the art, for example protein and peptide can be reacted with an aqueous solution of glutaraldehyde at room temperature, an effective coupling being achieved after only a few hours.
  • the protein fragments themselves are not immunogenic, it is advantageous to also couple those fragments which are not coupled to the protein used as antigen according to the invention to other carriers, in particular carrier proteins. This is primarily the case when peptides with less than about 30 amino acids are to be used as protein fragments. If the carriers are also proteins, the above statements regarding the coupling of protein and protein fragments apply mutatis mutandis. If carriers of a different constitution are used, the coupling naturally depends on the functional groups present on the carrier. Homo- or heterobifunctional linkers are also available for these cases.
  • Strongly immunogenic carriers which can bring about an effective induction of antibodies are preferred as carriers. These include, for example, various albumins, such as bovine serum albumin, ovalbumin or human serum albumin, globulins, such as thyroglobulin, etc.
  • the hemocyanin of the horseshoe crab limulus polyphemus also called keyhole limpets hemocyanin (KLH), is preferred.
  • all protein fragments that are used for such an immunization cocktail are included in the coupling reaction with the protein used as an antigen in the immunization cocktail. Provided that the coupling reaction is complete, all fragments are thus coupled to at least a part of the protein.
  • the part of the fragments that is not coupled to the protein can be coupled to a further carrier, so that all protein fragments are coupled to a carrier, namely a part to the protein and another part to a further carrier, preferably also a protein ,
  • a carrier namely a part to the protein and another part to a further carrier, preferably also a protein
  • the protein component with regard to concentration, degree of coupling, type of protein, for example protein from only one animal species or from several animal species , different selection of animal species, and for the protein fragments with regard to the type and possibly number of different fragments, their concentration and the type of coupling partner as well as the ratio of fragment (s) to protein.
  • immunization cocktails which are administered in an early phase of the immunization contain uncoupled protein, conjugates of protein and at least one protein fragment, and conjugates of at least one protein fragment with other carrier proteins.
  • Immunization cocktails that are administered in a late phase of the immunization preferably contain uncoupled protein and conjugates of the protein with at least one protein fragment, but no conjugates of protein fragments with another carrier phrotein in this embodiment.
  • the early phase of the immunization can mean, for example, the start immunization and the second immunization, while the late phase of the immunization includes, for example, the third and the fourth immunization.
  • Immunization cocktails administered in the early phase of the immunization cocktails higher amounts of protein fragments than the immunization cocktails administered in the late phase of the immunization cocktail.
  • immunization cocktails are administered to the host which contain protein from at least two different animal species and whose protein components differ with regard to the number and / or type of animal-specific protein variants used.
  • a particular embodiment of the present invention relates to a method for manufacturing Haptoglobin-specific antibodies by immunizing a host and obtaining formed antibodies, which is characterized in that the host is administered at least one immunization cocktail which contains haptoglobin and at least one haptoglobin fragment.
  • Haptoglobin (short: Hp) is a group of chemically related glycoproteins from
  • haptoglobin thus stands for all haptoglobin phenotypes, isotypes and variants. Haptoglobins from different animal species are included as well as mutated or otherwise modified haptoglobins. Species-specific haptoglobins of humans and all types of useful and domestic animals, that is to say mammals, in particular rodents, for example mice, rats, hamsters, rabbit-like mammals, for example rabbits, dogs, cats, ungulates, for example pigs and cattle, unpaired horses, for example horses, are particularly included , and primates.
  • Haptoglobin which can be used according to the invention can be of natural or recombinant origin.
  • Haptoglobins of natural origin can be obtained, for example, from blood components such as sera or plasma.
  • haptoglobin can be obtained from human plasma.
  • Such a product is commercially available as an essentially salt-free lyophilized powder.
  • haptoglobins can also be obtained from other animal species; suitable cleaning processes for this purpose are known.
  • Non-hemolytic sera can advantageously be used, resulting in particularly high yields. The following procedural measures have proven to be particularly suitable:
  • the optimal concentration for the selective precipitation of haptoglobin can be determined in a preliminary experiment.
  • hemoglobin preferably bovine hemoglobin
  • a solid phase for example to activated CNBr-Sepharose.
  • haptoglobin is then used according to the invention for immunization. In addition, it is used as a standard in immunoassays, preferably in the form of the haptoglobin that is specific for the species on which haptoglobin is to be determined.
  • the immunization cocktails contain mixtures of haptoglobins from different animal species, preferably from pork, cattle, horses, dogs and / or humans. It is preferred to administer immunization cocktails whose haptoglobin composition differs in the course of a method.
  • immunization cocktails can be administered which contain a selection of three or four of the aforementioned haptoglobins on the one hand, and all of the aforementioned haptoglobins on the other hand.
  • the former are preferably administered at a comparatively early point in time, the latter preferably towards the end of the immunization.
  • the selection can also be varied with regard to the number or type of haptoglobins used.
  • the first immunization cocktail contains haptoglobins from pork, cattle, horses and humans, the second and the third immunization cocktail haptoglobins from pigs, dogs, horses and humans, and the fourth immunization cocktail haptoglobins from pigs, cattle, dogs, horses and Man.
  • Haptoglobin peptides are generally used as protein fragments. Particularly suitable peptides have a relatively high degree of homology to corresponding sequences of haptoglobins from different animal species and in particular those animal species whose haptoglobins are to be specifically recognized by the antibodies to be produced. A is preferred
  • Peptide sequences useful in the present invention include conserved regions of haptoglobins, i.e. their sequence is essentially nonspecific. Peptides that are not part of the hemoglobin binding site are beneficial.
  • suitable peptides have a length of from 10 to 30 amino acids, preferably from 15 to 25 amino acids.
  • Examples of such peptides that have proven to be particularly suitable are the amino acid sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. These peptides are also the subject of the present invention. If the protein fragments to be used are not or only weakly immunogenic, their immunogenicity can be increased by coupling them to carriers. For this purpose, a number of coupling options are available to the person skilled in the art, some of which have been explained above.
  • reaction with glutaraldehyde is preferred, for example by incubating the haptoglobin or haptoglobin mixture with the peptide or peptide mixture in water or an aqueous solvent.
  • This reaction can conveniently be carried out at ambient temperature, usually room temperature. However, it can also be expedient to cool or to warm slightly. As a rule, the reaction leads to the desired result within a few hours; a reaction time of, for example, 2 hours is in the usual range.
  • the glutaraldehyde concentration is generally in the ppm to% range, advantageously from 10 ppm to 1%, preferably from 100 ppm to 0.5%.
  • the optimization of the reaction parameters lies in the area of professional skill.
  • the haptoglobin fragments are coupled to at least some of the haptoglobin. If a haptoglobin mixture of haptoglobins from different animal species is used, the haptoglobin fragments can be coupled to haptoglobin of all animal species used or to a selection of haptoglobins of individual animal species. If a mixture of different haptoglobin fragments, for example a peptide mixture, is used, these can be coupled without differentiating according to the type of fragment, or certain types of fragments can be assigned to specific coupling partners.
  • haptoglobin and haptoglobin fragments thereof can be obtained according to the invention by reacting haptoglobin, preferably a mixture of haptoglobins from different animal species, with one or more haptoglobin fragments, preferably one or more haptoglobin peptides. If different fragments are used, this conversion is carried out for each type of fragment, preferably separately.
  • haptoglobin fragments it is not absolutely necessary to couple the entire amount of haptoglobin fragments to haptoglobin. If the fragments are not or only weakly immunogenic, it is advantageous in such a case to couple the fragments not coupled to haptoglobin to a further carrier, preferably to a carrier protein. KLH is preferred in connection with haptoglobin. Reference is made analogously to the above statements on the coupling reaction.
  • immunization cocktails contain the In an early phase of immunization, uncoupled haptoglobin, at least one haptoglobin-peptide and at least one KLH-peptide conjugate are administered.
  • Immunization cocktails administered in a late phase of the immunization contain uncoupled haptoglobin and at least one haptoglobin-peptide conjugate, but no KLH-peptide conjugate.
  • the haptoglobin-peptide conjugates are preferably mixtures of conjugates with haptoglobins from different animal species. It is also preferred to use different peptides, so that a conjugate mixture should also be used in this regard.
  • immunization cocktails containing haptoglobin-peptide and KLH-peptide conjugate can be administered in the first and in the second immunization, whereas the immunization cocktails administered in the third and fourth immunizations, however, haptoglobin-peptide conjugate do not contain a KLH-peptide conjugate.
  • the immunization cocktails preferably additionally contain uncoupled haptoglobin or a mixture of uncoupled haptoglobins from various animal species.
  • the antigen used in the immunization cocktails is composed of several components, for example uncoupled haptoglobin or a mixture of uncoupled haptoglobins from different animal species, one or more haptoglobin-peptide conjugates and / or one or more KLH-peptide conjugates.
  • the components to be used are first combined. It is advantageous to incubate the resulting component mixture first. This is conveniently done at ambient temperature, usually at room temperature. However, it may be appropriate to cool the mixture or to warm it slightly. The incubation period is usually a few minutes to a few hours, an incubation time of 1 hour has proven to be advantageous.
  • immunization cocktails usually contain other auxiliary substances, in particular adjuvants that are usually used for immunization.
  • adjuvants that are usually used for immunization.
  • the use of Freund's adjuvant is preferred.
  • complete Freund's adjuvant is used for the first immunization, whereas all further immunizations are carried out with incomplete Freund's adjuvant.
  • the antigen preferably as a component mixture described above, is added to the auxiliary material or components. As a rule, the antigen is emulsified.
  • Rabbits are particularly suitable as hosts for this embodiment.
  • the Immunization cocktails are injected, preferably subcutaneously. Four injections at five-week intervals have proven to be advantageous.
  • the antibody titers can be determined with an immunoassay, for example competitively with a sheep antiserum directed against host IgG and labeled haptoglobin.
  • the antibody titer can be determined after the third immunization and then antibodies can be obtained from animals which have a sufficient antibody titer.
  • Serum can be obtained from the blood obtained in a manner known per se, which contains the desired antibodies.
  • the full serum obtained can, if necessary, be further purified in a professional manner in order to enrich the antibody fraction contained therein and in particular the haptoglobin-specific antibodies.
  • Monoclonal haptoglobin-specific antibodies can also be obtained in this way. For this purpose, however, it is preferred to remove spleen tissue from the hosts and, based on the splenic lymphocytes obtained in this way, to establish hybridomas in the usual way which produce monoclonal antibodies.
  • the present invention also relates to the immunization cocktails described in connection with the method according to the invention. These contain, optionally in addition to other auxiliary substances, protein and at least one protein fragment and, if necessary, adjuvant, preferably in the configurations described above.
  • the present invention further relates to antisera which can be obtained by the above processes.
  • These can be full serums, i.e. blood obtained from the host after separation of the cellular and coagulable constituents, or fractions of this serum, in which in particular the immunoglobulin fraction and preferably the haptoglobin-specific immunoglobulin fraction is enriched.
  • Such fractions can be obtained using the methods described above in connection with the antibody purification.
  • the antisera according to the invention are polyclonal, ie they contain antibodies of different specificity, as a rule different classes and subclasses, normally all L chain isotypes are represented and several protein epitopes are recognized.
  • Antisera according to the invention are cross-reactive. In particular, they are specific for more than one haptoglobin, preferably for haptoglobin from at least two animal species, in particular useful and domestic species. Examples of particular embodiments are antisera with specificity for haptoglobin from pigs and horses or for haptoglobin from horses, dogs and cattle. In this context, specificity means the possibility of being able to detect a certain haptoglobin with sufficient sensitivity.
  • the required sensitivity can vary from animal species to animal species, depending on the concentration in which haptoglobin occurs in the healthy or sick animal.
  • the antisera according to the invention advantageously have sensitivities of less than 1 mg / ml sample, preferably less than 100 ⁇ g / ml sample and particularly preferably less than 10 ⁇ g / ml sample. This means that at least the specified concentration of haptoglobin per ml of sample can be detected with the antiserum according to the invention, advantageously also lower concentrations.
  • Another object of the present invention is the use of such a cross-reactive antiserum for haptoglobin determination in useful and domestic samples.
  • the samples are usually body fluids, for example blood, plasma, serum, saliva, milk and the like.
  • haptoglobin can also be determined in other samples derived from farm and domestic animals. Meat juice should be mentioned in this context.
  • the determination is carried out immunologically. In principle, this can be done with any analytical or diagnostic test method in which antibodies are used. These include agglutination and precipitation techniques, immunoassays, immunohistochemical procedures and immunoblot techniques, e.g. Western blotting.
  • immunoassays are preferred according to the invention. Both competitive immunoassays, ie antigen and labeled antigen (tracer) compete for antibody binding, are suitable, as are sandwich immunoassays, ie the binding of specific antibodies to the antigen is detected with a second, usually labeled antibody.
  • sandwich immunoassays ie the binding of specific antibodies to the antigen is detected with a second, usually labeled antibody.
  • assays can be both homogeneous, ie without separation into solid and liquid phases, and also heterogeneous, ie bound labels are separated from unbound labels, for example via antibodies bound to solid phases.
  • the various heterogeneous and homogeneous immunoassay formats can be assigned to specific classes depending on the labeling and measurement method, for example RIAs (radioimmunoassays), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), FIA (fluorescence immunoassay), LIA (luminescence immunoassay), TRFIA (temporal dissolved FIA), IMAC (immune activation), EMIT (enzyme multiplied immune test), TIA (turbodimetric immunoassay).
  • RIAs radioimmunoassays
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • LIA luminescence immunoassay
  • TRFIA temporary dissolved FIA
  • IMAC immunoassay
  • EMIT enzyme multiplied immune test
  • TIA turbodimetric immunoassay
  • haptoglobin determination is preferred for the haptoglobin determination according to the invention.
  • Labeled haptoglobin (tracer) competes with the haptoglobin of the sample to be quantified for binding to the antiserum used.
  • the amount of antigen in the sample can be determined from the amount of tracer displaced using a standard curve.
  • enzymes have proven to be advantageous.
  • systems based on peroxidases in particular horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and ⁇ -D-galactosidase, can be used.
  • Specific substrates are available for these enzymes. can be followed photometrically.
  • Suitable substrate systems are based on p-nitrophenyl phosphate (p-NPP), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / nitro blue tetrazolium (BCIP / NPT), fast red / naphthol-AS-TS phosphate for alkaline phosphatase; 2,2-azino-bis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), o-
  • these substrate systems are commercially available in ready-to-use form, for example in the form of
  • Tablets which can also contain other reagents, such as appropriate buffers and the like.
  • Labeled haptoglobin is used as the tracer.
  • the haptoglobin to be determined can be marked for the determination of haptoglobin of a specific animal species and used as a tracer.
  • an antigen for the production of the tracer which can be used in the determination of haptoglobin from at least two types of useful and domestic animals.
  • the antigen can be described as non-species-specific and a tracer based on it can be called a multi-species tracer.
  • the binding affinity of such multi-species tracers to the antiserum used in the immunoassay is expediently chosen so that haptoglobins of the animal species to be examined can displace the multi-species tracer.
  • Bovines, especially haptoglobin labeled with biotin can be used according to the invention as a multi-species tracer.
  • the coupling of markings to haptoglobin for the production of tracers can take place in a manner known per se. On the above statements on the coupling of haptoglobin Protein fragments are referred to accordingly.
  • suitably modified labels available for conjugation to proteins, for example biotin, avidin, extravidin or streptavidin-conjugated enzymes, maleimide-activated enzymes and the like.
  • These markings can be implemented directly with haptoglobin or - if necessary - with correspondingly derivatized haptoglobin to form the tracer. If, for example, a streptavidin-peroxidase conjugate is used, this first requires biotinylation of haptoglobin.
  • haptoglobin can be reacted with biotin amidocarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester, for example the caproate ester, biotin hydrazide, N-hydroxysuccinimidobiotin or 3- (N-maleimidopropionyl) biocitin
  • a bovine, biotinylated and haptoglobin coupled to a streptavidin-peroxidase conjugate is used as the tracer.
  • the antigen-antibody complex can be bound to the carrier, for example, via an anti-idiotypic antibody coupled to the carrier, for example an antibody directed against rabbit IgG, for the purpose of separation.
  • Carriers in particular microtiter plates, which are coated with corresponding antibodies, are known and some are commercially available.
  • hemoglobin is added to the test system.
  • the amount is usually such that all hemoglobin binding sites on saturated haptoglobin are saturated. This is an advantage when determining haptoglobin in strongly hemolytic samples and in whole blood.
  • the haptoglobin determination is used in particular to diagnose infections, inflammations, trauma (tissue injuries) or immunological stress. It can be indicated in acutely ill animals, can be used for therapy control and in stock management, can help in optimizing husbandry conditions and can be used as an early indicator of a successful vaccination, since the haptoglobin concentration is already there after a short time, usually already 24 hours after vaccination, correlated with the antibody titer in the plasma of the vaccinated individual.
  • the method according to the invention is suitable for determining haptoglobin quantitatively even in long-term samples (eg more than 2 years at -18 ° C), improperly stored samples (eg 5 days at room temperature) and heat-inactivated samples (eg 30 minutes at 56 ° C) ,
  • kits usually contains several containers for the separate arrangement of components. All components can be provided in ready-to-use dilution, as a concentrate for dilution or as dry matter or lyophilisate for dissolving or suspending; some or all of the components may be frozen or kept at ambient temperature until use. Sera are preferably snap frozen, for example at -20 ° C, so that in these cases an immunoassay should preferably be kept at freezing temperatures before use.
  • immunoassay Other components added to the immunoassay depend on the type of immunoassay. As a rule, standard protein, any necessary tracer and control serum are included with the antiserum. Furthermore, microtiter plates, preferably coated with antibodies, buffers, for example for testing, washing or for converting the substrate, and the enzyme substrate itself can be added.
  • the sample was stirred again at room temperature for one hour. The subsequent centrifugation corresponded to the above information.
  • the pellet obtained was dissolved in 10 ml of Tris buffer (0.1 M Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 7.0) and dialyzed against Tris buffer at 4 ° C. overnight.
  • Tris buffer 0.1 M Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 7.0
  • bovine hemoglobin (Sigma H 2500) was covalently coupled to activated CNBr-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech). The resulting material was converted into a
  • haptoglobin mainly depended on the haptoglobin concentration in the sera used for cleaning.
  • haptoglobin could be obtained from pig serum 4.8 mg, from bovine serum 0.6 mg, from horse serum 1.5 mg and from dog serum 1.6 mg.
  • Immunization cocktails were made with a mixture of haptoglobin from various animal species and two synthetic peptides.
  • the following stock solutions were made up: Origin and concentration of the stock solutions
  • haptoglobin mixtures were prepared with these stock solutions:
  • the antibody titer was determined using a competitive ELISA. Microtiter plates were coated with 5 ⁇ g ovine IgG / ml coating buffer (Na carbonate pH 9.6) and incubated at 4 ° C. overnight. The antibodies were obtained from sheep immunized against rabbit IgG. The antibodies contained in the sheep serum were obtained by affinity chromatography. The plates were then saturated with 2.5% casein solution at room temperature for two hours. After five washes with wash buffer, the antiserum to be tested could be applied. The antiserum was applied in various dilution levels from 1: 10,000 to 1: 100,000 in test buffer containing hemoglobin (1 mg / ml hemoglobin).
  • biotin-labeled haptoglobin was diluted of 8 ng ml pipetted onto the plates. After incubation at room temperature for one hour, the plates were washed three times. In the next step, the plates were incubated with streptavidin peroxidase for 30 minutes. The plates were then washed five times. TMB solution served as substrate; the color reaction was stopped after 20 minutes with 2 MH 2 S0 4 . The absorbance was determined at 450 nm in a plate photometer. The antibody titer was considered to be the one
  • a rabbit was withdrawn from the experiment because of low titer development. High-titre antisera could be obtained from the other rabbits. The weekly decrease was started one week after the third immunization.
  • Example 2 The binding of the antisera obtained in Example 2 to haptoglobin from pigs, cattle, horses, dogs and humans was investigated. The antisera were found to cross-react with all of the haptoglobins tested. In addition, haptoglobin could also be determined in cat serum, although the immunization cocktail used did not contain purified cat haptoglobin.
  • Pig haptoglobin could be sensitively detected in a concentration range from 30 to 1000 ng / ml serum.
  • the haptoglobin concentrations can also be determined on saliva or meat juice samples.
  • the values are at significantly lower concentrations than in serum, about 1000 times lower in saliva and about 10 times lower in meat juice.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung proteinspezifischer Antikörper, damit erhältliche proteinspezifische Antikörper, nämlich polyclonale, kreuzreaktive Antiseren mit Spezifizität für Haptoglobin aus wenigstens zwei Nutz- und Haustier-Species, und deren Verwendung zur Haptoglobin-Bestimmung in Nutz- und Haustierproben. Weiterhin betrifft die Erfindung entsprechende Immunisierungscocktails, Peptide, die zur Herstellung der Antiseren nützlich sind, und Immunoassay-Sets, die auf den Antiseren aufbauen. zur Immunisierung werden sowohl Protein als auch Proteinfragmente verwendet.

Description

Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung, deren Verwendung, sowie Immunisierungscocktails, Immunoassay-Sets und Peptide.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung proteinspezifischer Antikörper, damit erhältliche proteinspezifische Antikörper, nämlich polyclonale, kreuzreaktive Antiseren mit Spezifität für Haptoglobin aus wenigstens zwei Nutz- und Haustierarten, und deren Verwendung zur Haptoglobin-Bestimmung in Nutz- und Haustierproben. Weiterhin betrifft die Erfindung Immunisierungscocktails mit Protein und wenigstens einem Proteinfragment, Peptide, die zur Herstellung der Antiseren nützlich sind, und Immunoassay-Sets, die auf den Antiseren aufbauen.
Wichtige diagnostische Informationen zu entzündlichen, infektiösen oder traumatischen Erkrankungszuständen klinischen und auch subklinischen Ausmaßes werden zunehmend auf die Bestimmung von Akutphasen-Proteinen gestützt. Dies sind Plasmaproteine, deren Konzentration mit der Antwort eines Wirts auf eine Infektion, Entzündung oder ein traumatisches Ereignis variiert. Der Konzentrationsanstieg im Plasma kann dabei unterschiedlich stark ausgeprägt sein, von einem 100- bis 500-fachen sehr starken Anstieg über einen 3- bis 4-fachen Anstieg einer moderaten Antwort bis hin zu einem lediglich 2-fach erhöhten Plasmaspiegel einer relativ schwachen Antwort, vgl. Eckersall et al., Veterinary Medicine, Vol. 41, 643 (1999).
Haptoglobin gehört zur Gruppe der Akutphasen-Proteine. In Rindern steigt die Haptoglobin- Konzentration während der Akutphasen-Antwort ausgehend von einer Konzentration von weniger als 0,01 g/1 bis auf 2 - 3 g 1 innerhalb von 48 h nach Infektion bis zu 300-fach an. In Schweinen hingegen findet man lediglich einen moderaten Anstieg von etwa 1 - 2 mg/ml auf etwa 5 mg/ml nach Turpentin-Injektion (Eckersall et al, 1999).
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Haptoglobin beruhen entweder auf biochemischer oder immunologischer Methodik. Da die biochemische Meßmethode die Bindung von Haptoglobin an Hämoglobin ausnutzt, können bereits kleinste Spuren von Hämoglobin die Meßgenauigkeit beeinträchtigen.
Immunologische Meßmethoden erfordern zunächst die Herstellung geeigneter Antikörper. So beschreiben Godson et al. in Veterinary Immunology and Immunopathology, 51, 277-292 (1996) einen ELISA, bei dem als Fang-Antikörper ein gegen Rinder-Haptoglobin gerichteter monoclonaler Antikörper und als Nachweis-Antikörper ein gegen Rinder-Haptoglobin gerichtetes Kaninchen- Antiserum verwendet wird. Haptoglobin-Konzentrationen in Pferdeseren wurden immunturbidimetrisch unter Verwendung eines gegen Pferde-Haptoglobin gerichteten Schaf- Antiserums bestimmt (Kent und Goodall, Equine Veterinary Journal, 23 (1), 59-66 (1991)). In Comp. Biochem. Physiol., Vol. 119B, 2, 365-373 (1998) wird zur Haptoglobin-Bestimmung in Schweinen auf polyclonale Antikörper zurückgegriffen, die gegen menschliches Haptoglobin gerichtet und in Kaninchen und Ziegen hergestellt sind. Einen ko petitiven Immunoassay beschreiben McNair et al in Research in Veterinary Sience, 63, 145-149 (1997), wobei ein Europium-konjugierter monoclonaler Antikörper mit Spezifität für Rinder-Haptoglobin zur Anwendung kommt. Ein solcher Antikörper wird auch bei der Untersuchung durch Young et al. in Veterinary Immunology and Immunopathology, 49, 1-13 (1995) zu Validierung von Immunoassays für Rinder-Haptoglobin verwendet.
Trotz gegebenenfalls vorhandener Kreuzreaktivität der eingesetzten Antikörper sind die bisher beschriebenen Immunoassays tierartspezifisch ausgerichtet, denn es wird im allgemeinen davon ausgegangen, daß nur artspezifische Antiseren und Standards den Anforderungen an konsistente und vergleichbare immunchemische Tests gerecht werden können (Eckersall et al., 1999).
Der sinnvolle Einsatz einer quantitativen Haptoglobin-Bestimmung in der veterinärmedizinischen Diagnostik erfordert allerdings die Etablierung eines Testverfahrens, mit dem verschiedene Tierarten gleichermaßen unter Berücksichtigung eventueller tierartspezifischer Schwankungsbreiten mit annähernd gleicher Sensitivität untersucht werden können.
Die Herstellung eines polyclonalen Antiserums geht üblicherweise von einer aktiven Immunisierung aus, also der künstlichen Erzeugung einer Immunantwort als Abwehrleistung eines Wirtsorganismus. Hierzu wird dem Wirt das betreffende Antigen verabreicht, und dadurch werden antigenreaktive B- Zellen zur Expansion und Differenzierung angeregt. Üblicheweise werden Antikörper gegen ein Protein als Antigen erhalten, indem man mit dem Protein oder aber mit synthetischen Polypeptiden immunisiert.
Zur Herstellung eines spezifischen Antiköφers verwendet man idealerweise das reine Antigen. Kann der hierfür erforderliche hohe Reinheitsgrad nicht oder nur auf umständliche Art und Weise erreicht werden, können'gegebenenfalls auch synthetische Peptide mit Teilsequenzen des Proteins zu Antipeptid-Antiköφern führen, die mit dem vollständigen Protein kreuzreagieren.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe, eine immunologische Bestimmung von Proteinen, insbesondere von Haptoglobin, aus verschiedenen Tierarten, insbesondere aus wenigstens zwei Nutz- und Haustierarten, zu ermöglichen, wird erfindungsgemäß gelöst durch ein besonderes Verfahren zur Herstellung proteinspezifischer, insbesondere Haptoglobin-spezifischer Antiköφer. Bei diesem Verfahren wird wenigstens ein Immunisierungscocktail eingesetzt, der sowohl Protein als auch Fragmente des Proteins enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung proteinspezifischer Antiköφer durch Immunisierung eines Wirtes und in an sich bekannter Gewinnung der Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, daß dem Wirt wenigstens ein Immunisierungsocktail verabreicht wird, der Protein und wenigstens ein Proteinfragment enthält.
Proteinspezifische Antiköφer im Sinne der Erfindung sind Antiköφer mit Bindungsspezifität für ein bestimmtes Protein. Dabei umfaßt der Begriff Protein Polypeptide, die strukturell im wesentlichen homogen sein können, die aber auch ein Gemisch aus strukturell unterschiedlichen Polypeptiden, beispielsweise verschiedene Phänotypen und Isotypen eines Proteins, verschiedene auf die evolutionäre Divergenz zurückgehenden artspezifischen Varianten eines Proteins oder individuelle, meist auf Mutationen zurückzuführende Proteinvarianten sein können. Insofern können proteinspezifische Antiköφer im Sinne der Erfindung auch kreuzreaktive Antiköφer, polyclonal oder monoclonal, mit Spezifität für wenigstens zwei strukturell unterschiedliche Proteine sein. Strukturelle Unterschiede sind im Sinne der Antigenerkennung zu verstehen und umfassen unterschiedliche Sequenzen genauso wie unterschiedliche räumliche Strukturen, wie Konformitäten oder Derivatisierungen, z.B. Glykosylierungen.
Mit Immunisierung ist die Erzeugung einer Immunantwort als Abwehrleistung eines Organismus gegen ein Antigen gemeint. Dem Wirt werden ein oder mehrere Antigene verabreicht, vorzugsweise in die Blutbahn oder in ein Gewebe injiziert. Insoweit ist die Erzeugung einer Immunantwort künstlich, man spricht deshalb auch von einer aktiven Immunisierung. Die Immunisierung erfolgt in der Regel nach einem festgelegten Immunisierungsschema. Auf die Primärimmunisierung folgen vorteilhafterweise weitere Immunisierungen zur Erzeugung immunologischer Sekundärreaktionen.
Die Anzahl der vorzunehmenden Immunisierungen hängt in erster Linie vom Wirt und der jeweiligen Entwicklung des Antiköφertiters ab. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, mehr als zwei und insbesondere drei bis fünf Immunisierungen vorzunehmen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden vier Immunisierungen vorgenommen. Die einzelnen Immunisierungen erfolgen in der Regel im Abstand von mehreren Wochen, der vorteilhafterweise zwei Monate nicht übersteigen sollte. Bevorzugt sind Immunisierungsintervalle von zwei bis sieben und insbesondere von drei bis sechs Wochen. Gemäß einer vorteilhaften Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung beträgt der Abstand zwischen den einzelnen Immunisierungen etwa fünf Wochen.
Werden mehrere Immunisierungen vorgenommen, so können die zu den einzelnen Immunisierungen verabreichten Immunisierungscocktails gleich oder vorzugsweise verschieden sein. Erfindungsgemäß beinhaltet wenigstens ein Immunisierungscocktail Protein und wenigstens ein Proteinfragment, während mit den übrigen in herkömmlicher Weise entweder Protein oder wenigstens ein
Proteinfragment verabreicht werden können. Es ist allerdings von Vorteil, wenn sämtliche innerhalb eines Verfahrens verwendeten Immunisierungscocktails Protein und wenigstens ein Proteinfragment beinhalten, wobei sich diese jedoch in ihrer jeweiligen Zusammensetzung unterscheiden können, was in bestimmten Fällen bevorzugt ist.
Als Wirt dient in der Regel ein höheres Wirbeltier. Bevorzugt sind Nager, insbesondere Kaninchen, Mäuse, Ratten und Hamster, sowie Ziege und Schaf. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dienen Kaninchen als Wirt.
Die gebildeten Antiköφer lassen sich in an sich bekannter Weise beispielsweise aus Milz,
Lymphknoten und peripherem Blut gewinnen. Zur Gewinnung polyclonaler Antiseren wird dem Wirt vorzugsweise Blut entnommen und hieraus das Serum gewonnen. Dieses sogenannte Vollserum besteht nur zum Teil aus Immunglobulinen, so daß sich weitere Reinigungsschritte zur Anreicherung der erwünschten Antiköφer anschließen können. Bekanntermaßen kann hierzu auf das Aussalzen, z.B. mittels fraktionierter Ammoniumsulfat-Fällung, die Ultrafiltration, die Umpufferung, die Dialyse, die Präzipitation durch Dialyse gegen saure Puffer, verschiedene chromatographische Verfahren, wie die Ionenaustausch-Chromatographie, Gelpermeations-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, AfFinitäts-Chromatographie, etc. zurückgegriffen werden. Vorteilhafterweise werden hochtitrige Vollseren über einen angemessenen Zeitraum, in der Regel mehrere Wochen oder Monate, mit abschließendem Ausbluten des Wirtes gewonnen.
Zur Gewinnung monocionaler Antiköφer ist es bevorzugt, dem Wirt Milzgewebe zu entnehmen und die darin enthaltenen Milzlymphocyten, das sind Antiköφer produzierende B-Zellen, mit Myelomzellen zu fusionieren, dann geeignete, einen erwünschten Antiköφer produzierende Hybridome auszuwählen und zu clonieren und anschließend zur Produktion monocionaler Antiköφer einzusetzen. Die jeweiligen Arbeitsschritte sind dem Fachmann bekannt.
Weiterhin können die so gewonnenen Antikörper, insbesondere die monoclonalen Antiköφer, modifiziert werden, es können Fragmente dieser Antiköφer oder chimäre Antikörper erzeugt werden, je nach Aufgabenstellung und Einsatzgebiet. Geeignete Techniken sind dem Fachmann bekannt.
Unter Immunisierungscocktail (Vakzine) wird erfindungsgemäß ein Gemisch aus Antigen und erforderlichenfalls zu verwendenden Hilfsstoffen, insbesondere Adjuvans, verstanden. Adjuvantien sind Substanzen, in die das Antigen inkorporiert ist oder zumindest zusammen mit dem Antigen injiziert werden, und welche die Immunantwort verstärken. Hierzu gehören Depot bildende,
Makrophagen aktivierende und/oder Lymphocyten beeinflussende Adjuvantien. Diese enthalten in der Regel Öle wie Paraffinöl, Squalen oder Fettsäureester wie Mannidmonooleat, Sorbitanmonooleat etc., zur Ausbildung von Öl-in- Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen des Antigens. Adjuvantien können auch abgetötete Erreger, Toxine oder Bestandteile davon enthalten, wie abgetötetes Mycobakterium tubercolosis, Pertusis-Vaccine, detoxifiziertes Monophosphoryllipid A aus S.
Minnesota, Zellwandbestandteile des Tuberkelbacillus, etc. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Freund- Adjuvans, insbesondere komplettes für die Startimmunisierung und inkomplettes für weitere Immunisierungen.
Erfindungsgemäßes Antigen setzt sich zusammen aus Protein und wenigstens einem Proteinfragment. Zweckmäßigerweise weist das Protein wenigstens eine antigene Determinante auf, gegen die die herzustellenden proteinspezifischen Antiköφer gerichtet sind. In der Regel entspricht wenigstens ein Teil des als Antigen einzusetzenden Proteins wenigstens einem Teil des Proteins, gegen das die proteinspezifischen Antiköφer gerichtet sind. Beim verfahrensgemäß einzusetzenden Protein kann es sich um eine strukturell im wesentlichen homogene Polypeptid-Fraktion handeln, bevorzugt ist allerdings ein Gemisch aus strukturell unterschiedlichen Polypeptiden, insbesondere ein Gemisch aus artspezifischen Varianten eines Proteins. Zur weiteren Erläuterung dieses Merkmals sei sinngemäß auf die obigen Ausführungen zu dem Begriff Protein verwiesen.
Erfindungsgemäß geeignetes Protein kann aus natürlichen Quellen gewonnen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht in der rekombinanten Herstellung. In beiden Fällen sind dem Fachmann die einschlägigen Techniken aus der Proteinbiochemie und der Molekularbiologie bekannt. Bevorzugt wird möglichst reines Protein.
Erfindungsgemäß brauchbare Proteinfragmente leiten sich vorzugsweise von dem Protein ab, gegen das die proteinspezifischen Antiköφer gerichtet sind. Vorteilhafterweise verwendet man wenigstens ein antigenes Fragment. Es handelt sich in der Regel um gegebenenfalls derivatisierte Peptide, deren Aminosäuresequenzen zumindest Teile umfassen, die Teil eines oder mehrerer Polypeptide des Proteins sind. Vorteilhaft sind Peptide mit einer Länge von 10 bis 30 Aminosäuren, vorzugsweise von 15 bis 25 Aminosäuren. Aus Gründen der Antigenizität leiten sich erfindungsgemäß besonders brauchbare Peptide von, vorzugsweise glykosilierungsfreien, Oberflächenbereichen ab und weisen einen hohen Antigenitätsindex auf. Besonders bevorzugt sind Peptide, deren Sequenz sich von gegebenenfalls im Wirt vorhandenen homologen Sequenzen unterscheidet. Der Immunisierungscocktail enthält wenigstens eine Fragmentsorte, vorteilhafterweise 2 oder mehrere unterschiedliche Fragmente.
Erfindungsgemäß brauchbare Proteinfragmente sind in an sich bekannter Weise herstellbar. Peptide können beispielsweise aus natürlichen Quellen gewonnen oder aus entsprechenden Aminosäuren synthetisiert werden. Als natürliche Quelle bietet sich erfindungsgemäß brauchbares Protein an, das beispielsweise enzymatisch verdaut werden kann. Die resultierenden Fragmente können aufgearbeitet und interessierende Fragmente können gewonnen und erforderlichenfalls modifiziert werden. Eine Peptidsynthese erfolgt vorzugsweise auf chemischem Wege, insbesondere unter Anwendung bekannter Festphasen-Synthesesysteme. Dazu werden in der Regel funktionalisierte Harze verwendet, an welche die zu synthetisierenden Peptide geknüpft werden können. Wang-Harze für die FMOC-Festphasen-Peptidsynthese oder Merrifield-Harze zur BOC-Festphasen-Peptidsynthese sind geläufige Beispiele. Nach erfolgtem Aufbau eines erwünschten Peptids wird dieses dann vom Träger abgelöst, wobei gleichzeitig oder auch im Anschluß daran möglicherweise vorhandene Schutzgruppen abgespalten werden können. Eine gegebenenfalls erforderliche, sich anschließende Aufreinigung, beispielsweise über HPLC, liefert das Peptid in erwünschter Reinheit, die beispielsweise mittels Massenspektroskopie oder NMR festgestellt werden kann.
Erfindungsgemäß brauchbare Immunisierungscocktails können Protein und Proteinfragmente als physikalisches Gemisch enthalten, d.h. Protein und Fragmente sowie gegebenenfalls vorhandene Adjuvantien werden in beliebiger Reihenfolge miteinander vermischt. Bevorzugt ist es allerdings, daß wenigstens ein Teil der Fragmente an wenigstens einen Teil des Proteins gekoppelt ist. Unter Kopplung wird erfindungsgemäß jede molekulare Wechselwirkung verstanden, die zu einer Anbindung der Fragmente an das Protein führt, so daß eine bestimmte räumliche Anordnung zueinander erzielt wird. Den Wechselwirkungen können kovalente, metallkomplexartige koordinative, oder hydrophobe Bindungen, Wasserstoffbrücken-Bindungen, elektrostatische Anziehungskräfte, van-der-Vaals-Kräfte und ähnliches zugrundeliegen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind kovalente Bindungen. Es kann sich um direkte oder indirekte Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Proteinfragmenten handeln. Indirekte Wechselwirkungen werden in der Regel über Linker vermittelt, die homo- oder hetereobifunktionell sein können. Vorteilhafterweise greift man auf die üblicherweise zur Konjugation bzw. Quervernetzung von Proteinen eingesetzten Reagentien zurück, beispielsweise Maleimidocarbonsäure-NHS-ester, wie Maleimidoessigsäure-NHS-ester, m- Maleimidobenzoesäure-NHS-ester, etc., 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-NHS-ester und ähnliches. Bevorzugt ist Glutaraldehyd. Der Umgang mit diesen Reagentien ist dem Fachmann wohl vertraut, beispielsweise können Protein und Peptid bei Raumtemperatur mit einer wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd umgesetzt werden, wobei schon nach wenigen Stunden eine effektive Kopplung erzielt wird.
Für den Fall, daß die Proteinfragmente selbst nicht immunogen sind, ist es vorteilhaft, auch diejenigen Fragmente, die nicht an erfindungsgemäß als Antigen eingesetztes Protein gekoppelt sind, an andere Träger, insbesondere Trägeφroteine, zu koppeln. Dies ist vornehmlich dann der Fall, wenn Peptide mit weniger als etwa 30 Aminosäuren als Proteinfragmente verwendet werden sollen. Sofern es sich bei den Trägern ebenfalls um Proteine handelt, gelten obige Ausführungen zur Kopplung von Protein und Proteinfragmenten sinngemäß. Werden Träger anderer Konstitution verwendet, so richtet sich die Kopplung naturgemäß nach den auf dem Träger vorhandenen funktioneilen Gruppen. Homo- oder heterobifünktionelle Linker sind auch für diese Fälle erhältlich.
Als Träger werden stark immunogene Träger bevorzugt, die eine effektive Induktion von Antiköφern bewirken können. Hierzu gehören beispielsweise verschiedene Albumine, wie Rinderserumalbumin, Ovalbumin oder humanes Serumalbumin, Globuline, wie Thyreoglobulin, etc. Bevorzugt ist das Hämocyanin des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus, auch Keyhole Limpets Hämocyanin (KLH), genannt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden für wenigstens einen Immunisierungscocktail sämtliche Proteinfragmente, die für einen solchen Immunisierungscocktail verwendet werden, in die Kopplungsreaktion mit dem im Immunisierungscocktail als Antigen verwendeten Protein miteinbezogen. Vorausgesetzt die Kopplungsreaktion ist vollständig, sind somit sämtliche Fragmente an wenigstens einen Teil des Proteins gekoppelt. Alternativ kann der Teil der Fragmente, der nicht an das Protein gekoppelt ist, an einen weiteren Träger gekoppelt sein, so daß sämtliche Proteinfragmente an einen Träger gekoppelt, nämlich ein Teil an das Protein und ein anderer Teil an einen weiteren Träger, vorzugsweise ebenfalls ein Protein. Mit Blick auf die vorteilhafte Möglichkeit, innerhalb eines erfindungsgemäßen Verfahrens auch unterschiedliche Immunisierungscocktails einsetzen zu können, ergeben sich Variationsmöglichkeiten beispielsweise für die Protein-Komponente im Hinblick auf Konzentration, Grad der Kopplung, Art des Proteins, beispielsweise Protein aus nur einer Tierart oder aus mehreren Tierarten, unterschiedliche Auswahl der Tierarten, und für die Proteinfragmente im Hinblick auf die Art und gegebenenfalls Anzahl unterschiedlicher Fragmente, deren Konzentration und die Art des Kopplungspartners sowie das Verhältnis von Fragment(en) zu Protein.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten Immunisierungscocktails, die in einer frühen Phase der Immunisierung verabreicht werden, ungekoppeltes Protein, Konjugate aus Protein und wenigstens einem Proteinfragment, sowie Konjugate von wenigstens einem Proteinfragment mit anderen Trägeφroteinen. Immunisierungscocktails, die einer späten Phase der Immunisierung verabreicht werden, enthalten im Rahmen dieser Ausführungsform vorzugsweise ungekoppeltes Protein und Konjugate des Proteins mit wenigstens einem Proteinfragment, jedoch keine Konjugate von Proteinfragmenten mit anderem Trägeφrotein. Mit der frühen Phase der Immunisierung können beispielsweise die Startimmunisierung und die zweite Immunisierung gemeint sein, während zur späten Phase der Immunisierung beispielsweise die dritte und die vierte Immunisierung gehören.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die
Immunisierungscocktails, die in der frühen Phase der Immunisierung verabreicht werden, höhere Mengen an Proteinfragmenten als die Immunisierungscocktails, die in einer späten Phase des Immunisierungscocktails verabreicht werden.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden dem Wirt Immunisierungscocktails verabreicht, die Protein aus wenigstens zwei verschiedenen Tierarten enthalten und deren Proteinkomponenten sich im Hinblick auf die Anzahl und/oder Art verwendeter tierartspezifischer Proteinvarianten unterscheiden.
Bevorzugt ist im Rahmen der vorstehend erläuterten besonderen Ausfuhrungsformen die Verwendung von wenigstens zwei unterschiedlichen Proteinfragmenten, wobei man vorteilhafterweise hinsichtlich der Kopplung/Nichtkopplung die einzelnen Fragmentarten getrennt voneinander behandelt.
Eine besondere Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Haptoglobin-spezifischer Antiköφer durch Immunisierung eines Wirtes und Gewinnung gebildeter Antiköφer, das dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Wirt wenigstens ein Immunisierungscocktail verabreicht wird, der Haptoglobin und wenigstens ein Haptoglobinfragment enthält.
Unter Haptoglobin (kurz: Hp) wird eine Gruppe chemisch verwandter Glycoproteine des
Blutplasmas mit spezifischer Bindungsfälligkeit für Hämoglobin (Hb) verstanden. Im Sinne des zuvor definierten erfindungsgemäßen Begriffs „Protein" steht der Begriff „Haptoglobin" also für sämtliche Haptoglobin-Phänotypen, -Isotypen und -Varianten. Haptoglobine aus verschiedenen Tierarten sind genauso eingeschlossen wie mutierte oder auf andere Art und Weise modifizierte Haptoglobine. Insbesondere umfaßt sind tierartspezifische Haptoglobine von Menschen und sämtlichen Nutz- und Haustierarten, also von Säugern, insbesondere von Nagern, beispielsweise Mäusen, Ratten, Hamstern, hasenartigen Säugern, beispielsweise Kaninchen, Hunden, Katzen, Paarhufern, beispielsweise Schweinen und Rindern, Unpaarhufern, beispielsweise Pferden, und Primaten.
Erfindungsgemäß brauchbares Haptoglobin kann natürlichen oder rekombinanten Ursprungs sein. Haptoglobine natürlichen Ursprungs können beispielsweise aus Blutbestandteilen, wie Seren oder Plasma gewonnen werden. Beispielsweise kann Haptoglobin aus menschlichem Plasma gewonnen werden. Ein solches Produkt ist als im wesentlichen salzfreies lyophilisiertes Pulver kommerziell erhältlich. In ähnlicher Form lassen sich auch aus anderen Tierarten Haptoglobine gewinnen, geeignete Reinigungsverfahren zu diesem Zweck sind bekannt. In vorteilhafter Weise können nicht- hämolytische Seren verwendet werden, wodurch sich besonders hohe Ausbeuten ergeben. Folgende Verfahrensmaßnahmen haben sich als besonders geeignet erwiesen:
- Ammoniumsulfatfallung. Die optimale Konzentration zur selektiven Fällung von Haptoglobin kann per Vorversuch bestimmt werden.
- Affinitätschromatographische Reinigung. Dazu wird Hämoglobin, vorzugsweise bovines Hämoglobin an eine feste Phase, beispielsweise an aktiviertem CNBr-Sepharose, gekoppelt.
- Gelfiltration. Matrizes aus quervernetztem Dextran (Sephadex ), quervernetztem Polymer von
Allyldextran und N,N-Methylenbis(acrylamid)(Spephacryl ), Agarose (Sepharose®), hochquervernetzter Agarose (Superose ), und ähnliche gelbildende Materialien können zur erwünschten Abtrennung von Verunreinigungen eingesetzt werden. Bevorzugt sind quervernetzte Matrizes aus Agarose und Dextran (Superdex ). Das Haptoglobin wird dann erfindungsgemäß zur Immunisierung verwendet. Darüber hinaus findet es als Standard Anwendung in Immunoassays, vorzugsweise in Form desjenigen Haptoglobins, das spezifisch ist für diejenige Species, an der Haptoglobin bestimmt werden soll.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung Haptoglobin-spezifischer Antiköφer enthalten die Immunisierungscocktails Gemische von Haptoglobinen verschiedener Tierarten, vorzugsweise aus Schwein, Rind, Pferd, Hund und/oder Mensch. Bevorzugt ist es, im Zuge eines Verfahrens Immunisierungscocktails zu verabreichen, deren Haptoglobin- Zusammensetzung sich unterscheidet. So kann man beispielsweise Immunisierungscocktails verabreichen, die einerseits eine Auswahl von drei oder vier der zuvor genannten Haptoglobine, andererseits sämtliche zuvor genannten Haptoglobine enthalten. Erstere werden vorzugsweise zu einem vergleichsweise frühen Zeitpunkt, letztere vorzugsweise gegen Ende der Immunisierung verabreicht. Die Auswahl kann auch im Hinblick auf die Anzahl bzw. die Art der verwendeten Haptoglobine variiert werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens enthält der erste Immunisierungscocktail Haptoglobine aus Schwein, Rind, Pferd und Mensch, der zweite und der dritte Immunisierungscocktail Haptoglobine aus Schwein, Hund, Pferd und Mensch, und der vierte Immunisierungscocktail Haptoglobine aus Schwein, Rind, Hund, Pferd und Mensch.
Als Proteinfragmente werden in der Regel Haptoglobinpeptide verwendet. Besonders geeignete Peptide weisen einen verhältnismäßig hohen Homologiegrad auf zu entsprechenden Sequenzen von Haptoglobinen verschiedener Tierarten und insbesondere derjenigen Tierarten, deren Haptoglobine durch die herzustellenden Antiköφer spezifisch erkannt werden sollen. Bevorzugt ist ein
Homologiegrad von wenigstens 80%, insbesondere von wenigstens 90%, und besonders bevorzugt von nahezu 100%. Erfindungsgemäß brauchbare Peptidsequenzen umfassen konservierte Bereiche von Haptoglobinen, d.h. ihre Sequenz ist im wesentlichen tierartunspezifisch. Peptide, die nicht Teil der Hämoglobin-Bindungsstelle sind, sind von Vorteil.
In der Regel weisen geeignete Peptide eine Länge auf von 10 bis 30 Aminosäuren, vorzugsweise von 15 bis 25 Aminosäuren. Beispiele für derartige Peptide, die sich als besonders geeignet erwiesen haben, sind die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: l und SEQ ID NO:2. Diese Peptide sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Sind die zu verwendenden Proteinfragmente nicht oder nur schwach immunogen, so kann man ihre Immunogenität dadurch erhöhen, daß man sie an Träger koppelt. Dazu stehen dem Fachmann eine Reihe von Kopplungsmöglichkeiten zur Verfügung, von denen einige oben erläutert wurden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Umsetzung mit Glutaraldehyd, beispielsweise durch Inkubation des Haptoglobins oder Haptoglobin-Gemisches mit dem Peptid oder Peptid-Gemisch in Wasser oder einem wäßrigen Lösungsmittel. Diese Umsetzung kann bequemerweise bei Umgebungstemperatur, also in der Regel Raumtemperatur, durchgeführt werden. Es kann allerdings auch zweckmäßig sein, zu kühlen oder leicht zu erwärmen. In der Regel führt die Umsetzung innerhalb weniger Stunden zum erwünschten Ergebnis, eine Reaktionsdauer von beispielsweise 2 h liegt im üblichen Bereich. Die Glutaraldehyd-Konzentration liegt in der Regel im ppm- bis %-Bereich, zweckmäßigerweise von 10 ppm bis zu 1 %, vorzugsweise von 100 ppm bis 0,5 %. Die Optimierung der Reaktionsparameter liegt im Bereich des fachmännischen Könnens.
Erfindungsgemäß wird wenigstens ein Teil der Haptoglobin-Fragmente an wenigstens einen Teil des Haptoglobins gekoppelt. Wird ein Haptoglobin-Gemisch aus Haptoglobinen verschiedener Tierarten verwendet, so können die Haptoglobin-Fragmente an Haptoglobin aller verwendeten Tierarten oder an eine Auswahl von Haptoglobinen einzelner Tierarten gekoppelt sein. Wird ein Gemisch unterschiedlicher Haptoglobin-Fragmente, beispielsweise ein Peptid-Gemisch, verwendet, so können diese gekoppelt sein ohne nach Art des Fragments zu differenzieren, oder es können bestimmte Fragmentarten bestimmten Kopplungspartnern zugeordnet werden.
Brauchbare Konjugate aus Haptoglobin und Haptoglobin-Fragmenten davon sind erfindungsgemäß erhältlich, indem man Haptoglobin, vorzugsweise ein Gemisch aus Haptoglobinen unterschiedlicher Tierarten, mit einem oder mehreren Haptoglobin-Fragmenten, vorzugsweise einem oder mehreren Haptoglobin-Peptiden, umsetzt. Sofern verschiedene Fragmente zur Anwendung kommen, wird diese Umsetzung für jede Fragmentart, vorzugsweise getrennt voneinander, durchgeführt.
Wie vorstehend erläutert, ist es nicht unbedingt erforderlich, die gesamte Menge an Haptoglobin- Fragmenten an Haptoglobin zu koppeln. Sind die Fragmente nicht oder nur schwach immunogen, so ist es in einem solchen Fall von Vorteil, die nicht an Haptoglobin gekoppelten Fragmente an einen weiteren Träger, vorzugsweise an ein Trägeφrotein, zu koppeln. KLH wird im Zusammenhang mit Haptoglobin bevorzugt. Auf obige Ausführungen zur Kopplungsreaktion wird sinngemäß Bezug genommen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens enthalten Immunisierungscocktails, die in einer frühen Phase der Immunisierung verabreicht werden, ungekoppeltes Haptoglobin, wenigstens ein Haptoglobin-Peptid- und wenigstens ein KLH-Peptid-Konjugat. Immunisierungscocktails, die in einer späten Phase der Immunisierung verabreicht werden, enthalten ungekoppeltes Haptoglobin und wenigstens ein Haptoglobin-Peptid-Konjugat, jedoch kein KLH-Peptid-Konjugat. Bei den Haptoglobin-Peptid-Konjugaten handelt es sich vorzugsweise um Gemische von Konjugaten mit Haptoglobinen verschiedener Tierarten. Ebenfalls ist es bevorzugt, unterschiedliche Peptide zu verwenden, so daß auch diesbezüglich von einem Konjugat-Gemisch zu sprechen ist. Werden beispielsweise vier Immunisierungen vorgenommen, so kann man Haptoglobin-Peptid- und KLH- Peptid-Konjugat enthaltende Immunisierungscocktails bei der ersten und bei der zweiten Immunisierung verabreichen, wohingegen die bei der dritten und bei der vierten Immunisierung verabreichten Immunisierungscocktails Haptoglobin-Peptid-Konjugat, jedoch kein KLH-Peptid- Konjugat enthalten. Vorzugsweise enthalten die Immunisierungscocktails zusätzlich ungekoppeltes Haptoglobin bzw. ein Gemisch aus ungekoppelten Haptoglobinen verschiedener Tierarten.
Somit setzt sich das in den Immunisierungscocktails verwendete Antigen aus mehreren Komponenten zusammen, beispielsweise aus ungekoppeltem Haptoglobin bzw. einem Gemisch aus ungekoppelten Haptoglobinen verschiedener Tierarten, einem oder mehreren Haptoglobin-Peptid-Konjugaten und/oder einem oder mehreren KLH-Peptid-Konjugaten.
Zur Herstellung der Immunisierungscocktails werden die zu verwendenden Komponenten -zunächst zusammengegeben. Es ist von Vorteil, das resultierende Komponenten-Gemisch zunächst zu inkubieren. Dies erfolgt bequemerweise bei Umgebungstemperatur, in der Regel also bei Raumtemperatur. Es kann allerdings zweckmäßig sein, das Gemisch zu kühlen oder leicht zu erwärmen. Die Inkubationsdauer beträgt in der Regel einige Minuten bis wenige Stunden, eine Inkubationszeit von 1 h hat sich als vorteilhaft erwiesen.
Zusätzlich zum Antigen enthalten Immunisierungscocktails in der Regel weitere Hilfsstoffe, insbesondere üblicherweise zur Immunisierung eingesetzte Adjuvantien. Im Rahmen dieser Ausführungsform ist die Verwendung von Freund-Adjuvanz bevorzugt. Insbesondere verwendet man komplettes Freund-Adjuvanz für die erste Immunisierung wohingegen alle weiteren Immunisierungen mit inkomplettem Freund-Adjuvanz durchgeführt werden. Zur Herstellung der Immunisierungscocktails wird das Antigen, vorzugsweise als oben beschriebenes Komponenten- Gemisch, zu dem oder den Hilfsstoffen gegeben. In der Regel wird dabei das Antigen emulgiert.
Für diese Ausführungsform sind Kaninchen als Wirt besonders geeignet. Die Immunisierungscocktails werden, vorzugsweise subkutan, injiziert. Als vorteilhaft haben sich vier Injektionen im Abstand von jeweils fünf Wochen erwiesen. Die Antiköφertiter können mit einem Immunoassay, beispielsweise kompetitiv mit einem gegen Wirt-IgG gerichteten Schaf-Antiserum und markiertem Haptoglobin, bestimmt werden. So kann gegen Ende der Immunisierung entschieden werden, ob ein bestimmter Wirt zur Antiköφergewinnung geeignet ist. Werden beispielsweise vier Immunisierungen durchgeführt, so kann man nach der dritten Immunisierung den Antiköφertiter bestimmen und dann aus Tieren, die einen ausreichenden Antiköφertiter aufweisen, Antiköφer gewinnen.
Zur Gewinnung gebildeter Antiköφer ist es bevorzugt, den Wirten über mehrere Wochen oder
Monate Blut abzunehmen. Abschließend kann man den Wirt ausbluten lassen. Aus dem gewonnen Blut kann in an sich bekannter Weise Serum gewonnen werden, daß die erwünschten Antiköφer enthält. Das erhaltene Vollserum kann erforderlichenfalls in fachmännischer Weise weiter aufgereinigt werden, um die darin enthaltene Antiköφerfraktion und insbesondere die Haptoglobin- spezifischen Antiköφer anzureichern. Auch monoclonale Haptoglobin-spezifische Antiköφer können auf diese Art gewonnen werden. Hierzu ist es allerdings bevorzugt, den Wirten Milzgewebe zu entnehmen und ausgehend von den so gewonnenen Milzlymphocyten auf übliche Art und Weise Hybridome zu etablieren, die monoclonale Antiköφer produzieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die in Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beschriebenen Immunisierungscocktails. Diese enthalten, gegebenenfalls neben weiteren Hilfsstoffen, Protein und wenigstens ein Proteinfragment sowie erforderlichenfalls Adjuvans, vorzugsweise in den vorstehend beschriebenen Ausgestaltungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Antiseren, die mit obigen Verfahren erhalten werden können. Dies können Vollseren sein, d.h. aus dem Wirt gewonnenes Blut nach Abtrennung der zellulären und gerinnbaren Bestandteile, oder Fraktionen dieses Serums, in denen insbesondere die Immunglobulin-Fraktion und vorzugsweise die Haptoglobin-spezifische Immunglobulin-Fraktion angereichert ist. Derartige Fraktionen können mit den oben im Zusammenhang mit der Antiköφer-Aufreinigung beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Antiseren sind polyclonal, d.h. sie enthalten Antiköφer unterschiedlicher Spezifität, in der Regel unterschiedlicher Klassen und Subklassen, normalerweise sind sämtliche L- Ketten-Isotypen vertreten und es werden mehrere Proteinepitope erkannt. Erfindungsgemäße Antiseren sind kreuzreaktiv. Insbesondere sind sie spezifisch für mehr als ein Haptoglobin, vorzugsweise für Haptoglobin aus wenigstens zwei Tierarten, insbesondere Nutz- und Haustierarten. Beispiele besonderer Ausführungsformen sind Antiseren mit Spezifität für Haptoglobin aus Schweinen und Pferd oder für Haptoglobin aus Pferd, Hund und Rind. Spezifität bedeutet in diesem Zusammenhang die Möglichkeit, ein bestimmtes Haptoglobin mit ausreichender Sensitivität nachweisen zu können. Wie eingangs ausgeführt, kann die erforderliche Sensitivität von Tierart zu Tierart unterschiedlich sein, je nach dem in welcher Konzentration Haptoglobin im gesunden bzw. im kranken Tier auftritt. Die erfindungsgemäßen Antiseren weisen vorteilhafterweise Sensitivitäten von weniger als 1 mg/ml Probe, vorzugsweise von weniger als 100 μg/ml Probe und besonders bevorzugt von weniger als 10 μg/ml Probe auf. Damit ist gemeint, daß sich zumindest die jeweils angegebene Konzentration an Haptoglobin pro ml Probe mit dem erfindungsgemäßen Antiserum nachweisen läßt, vorteilhafterweise auch geringere Konzentrationen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines solchen kreuzreaktiven Antiserums zur Haptoglobin-Bestimmung in Nutz- und Haustieφroben. Bei den Proben handelt es sich in der Regel um Köφerflüssigkeiten, beispielsweise Blut, Plasma, Serum, Speichel, Milch und ähnliches. Es kann aber auch Haptoglobin in anderen von Nutz- und Haustieren abgeleiteten Proben bestimmt werden. Zu nennen ist in diesem Zusammenhang beispielsweise Fleischsaft.
Die Bestimmung erfolgt immunologisch. Prinzipiell kann dies mit jedem analytischen bzw. diagnostischen Testverfahren erfolgen, bei dem Antiköφer eingesetzt werden. Hierzu gehören Agglutinations- und Präzipitations-Techniken, Immunoassays, immunhistochemische Verfahren und Immunoblot-Techniken, z.B. Western-Blotting.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Einsatz in Immunoassays. Geeignet sind sowohl kompetitive Immunoassays, d.h. Antigen und markiertes Antigen (Tracer) konkurrieren um die Antiköφerbindung, als auch Sandwich-Immunoassays, d.h. die Bindung spezifischer Antiköφer an das Antigen wird mit einem zweiten, meist markierten Antiköφer nachgewiesen. Diese Assays können sowohl homogen, d.h. ohne eine Trennung in feste und flüssige Phase, als auch heterogen sein, d.h. gebundene Markierungen werden von ungebundenen getrennt, beispielsweise über festphasengebundene Antiköφer. Die verschiedenen heterogenen und homogenen Immunoassay- Formate können je nach Markierung und Meßmethode bestimmten Klassen zugeordnet werden, beispielsweise RIAs (Radioimmunoassays), ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), FIA (Fluoreszenz-Immunoassay), LIA (Lumineszenz-Immunoassay), TRFIA (zeitlich aufgelöster FIA), IMAC (Immunaktivierung), EMIT (Enzyme multiplied immune test), TIA (Turbodimetrischer Immunoassay).
Zur erfindungsgemäßen Haptoglobin-Bestimmung sind kompetitive Immunoassays bevorzugt. Dabei konkurriert markiertes Haptoglobin (Tracer) mit dem zu quantifizierenden Haptoglobin der Probe um die Bindung an das verwendete Antiserum. Aus der Menge des verdrängten Tracers läßt sich mit Hilfe einer Standardkurve die Antigenmenge in der Probe bestimmen.
Von den für diese Zwecke zur Verfügung stehenden Markierungen haben sich Enzyme als vorteilhaft erwiesen. Beispielsweise können Systeme auf Basis von Peroxidasen, insbesondere der Meerrettich- Peroxidase, der alkalischen Phosphatase und der ß-D-Galactosidase verwendet werden. Für diese Enzyme stehen spezifische Substrate zur Verfügung, deren Umsetzung sich z.B. photometrisch verfolgen läßt. Geeignete Substratsysteme basieren auf p-Nitrophenylphosphat (p-NPP), 5-Brom-4- chlor-3-indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium (BCIP/NPT), Fast-Red/Naphthol-AS-TS-Phosphat für die alkalische Phosphatase; 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS), o-
Phenylendiamin (OPT), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB) und 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon (MBTH) für Peroxidasen; o-Nitrophenyl-ß-D-galactosid (o-NPG), p-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid und 4- Methylumbelliphenyl-ß-D-galactosid (MUG) für die ß-D-Galactosidase. Diese Substratsysteme sind in vielen Fällen in gebrauchsfertiger Form kommerziell erhältlich, beispielsweise in Form von
Tabletten, die auch weitere Reagentien, wie zweckmäßige Puffer und ähnliches enthalten können.
Als Tracer wird markiertes Haptoglobin verwendet. In diesem Sinne kann man zur Bestimmung von Haptoglobin einer bestimmten Tierart das zu bestimmende Haptoglobin markieren und als Tracer einsetzen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, zur Herstellung des Tracers ein Antigen zu verwenden, welches bei der Bestimmung von Haptoglobin aus wenigstens zwei Nutz- und Haustierarten eingesetzt werden kann. Insoweit läßt sich das Antigen als tierartunspezifisch beschreiben und ein darauf aufbauender Tracer als Multispezies-Tracer bezeichnen. Die Bindungsaffinität solcher Multispezies-Tracer an das im Immunoassay eingesetzte Antiserum wird zweckmäßigerweise so gewählt, daß Haptoglobine der zu untersuchenden Tierarten den Multispezies-Tracer verdrängen können. Bovines, insbesondere mit Biotin markiertes Haptoglobin, können erfindungsgemäß als Multispezies-Tracer verwendet werden.
Die Kopplung von Markierungen an Haptoglobin zur Herstellung von Tracern kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Auf obige Ausführungen zur Kopplung von Haptoglobin an Proteinfragmente wird sinngemäß Bezug genommen. Darüber hinaus stehen eine Reihe zur Konjugation an Proteine zweckmäßig modifizierte Markierungen zur Verfugung, beispielsweise Biotin-, Avidin-, Extravidin- oder Streptavidin-koηjugierte Enzyme, Maleimid-aktivierte Enzyme und ähnliches. Diese Markierungen können direkt mit Haptoglobin oder - falls erforderlich - mit entsprechend derivatisiertem Haptoglobin zum Tracer umgesetzt werden. Wird beispielsweise ein Streptavidin-Peroxidase-Konjugat verwendet, so erfordert dies zunächst eine Biotinylierung von Haptoglobin. Entsprechendes gilt für die umgekehrte Anordnung. Auch zu diesem Zweck sind dem Fachmann geeignete Verfahren bekannt, beispielsweise kann Haptoglobin mit Biotinamidocarbonsäure-N-hydroxysuccinimidester, z.B. dem Caproatester, Biotinhydrazid, N- Hydroxysuccinimidobiotin oder 3-(N-Maleimidopropionyl)-biocitin umgesetzt werden, um an
Avidin-, Streptavidin-, Extravidin- oder Anti-Biotin-konjugierte Markierungen gekoppelt zu werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als Tracer ein bovines, biotinyliertes und an ein Streptavidin-Peroxidase-Konjugat gekoppeltes Haptoglobin als Tracer verwendet.
Wird ein heterogenes Immunoassay-Format gewählt, so kann zwecks Trennung der Antigen- Antiköφer-Komplexes beispielsweise über einen an den Träger gekoppelten anti-idiotypischen Antiköφer, beispielsweise einen gegen Kaninchen-IgG gerichteten Antiköφer, an den Träger gebunden werden. Träger, insbesondere Mikrotiteφlatten, die mit entsprechenden Antiköφem beschichtet sind, sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich.
Erforderlichenfalls wird dem Testsystem Hämoglobin zugesetzt. Die Menge ist in der Regel so bemessen, daß sämtliche Hämoglobin-Bindungsstellen auf vorhandenem Haptoglobin abgesättigt sind. Dies ist bei der Haptoglobin-Bestimmung in stark hämolytischen Proben und im Vollblut von Vorteil.
Die Haptoglobin-Bestimmung dient insbesondere zur Diagnose von Infektionen, Entzündungen, Traumata (Gewebsverletzungen) oder immunologischem Streß. Sie kann bei akut erkrankten Tieren angezeigt sein, zur Therapiekontrolle und in der Bestandsbetreuung eingesetzt werden, bei der Optimierung von Haltungsbedingungen behilflich sein und als frühzeitiger Indikator eines Impferfolgs genutzt werden, da die Haptoglobin-Konzentration bereits nach kurzer Zeit, in der Regel schon 24 Stunden nach Impfung, mit dem Antiköφertiter im Plasma des geimpften Individuums korreliert. Das erfindungsgemäße Verfiihren ist geeignet, Haptoglobin quantitativ auch in langzeitig gelagerten Proben (z.B. mehr als 2 Jahre bei -18°C), unsachgemäß aufbewahrten Proben (z.B. 5 Tage bei Raumtemperatur) und hitzeinaktivierten Proben (z.B. 30 Minuten bei 56°C) zu bestimmen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Immunoassay-Sets mit wenigstens einem vorstehend beschriebenen Haptoglobin-spezifischem Antiserum und weiteren Komponenten. Es handelt sich hierbei um eine Zusammenstellung, in der Regel als Veφackungseinheit, von Mitteln zur Durchführung einer erfindungsgemäßen Haptoglobin-Bestimmung. Zwecks möglichst einfacher Handhabung werden diese Mittel vorzugsweise im wesentlichen gebrauchsfertig bereitgestellt. Eine vorteilhafte Anordnung bietet den Immunoassay in Kit-Form an. Ein Kit umfaßt in der Regel mehrere Behältnisse zur getrennten Anordnung von Komponenten. Alle Komponenten können in gebrauchsfertiger Verdünnung, als Konzentrat zum Verdünnen oder als Trockensubstanz oder Lyophilisat zum Lösen oder Suspendieren bereitgestellt werden; einzelne oder sämtliche Komponenten können eingefroren sein oder bei Umgebungstemperatur bis zum Gebrauch aufbewahrt werden. Seren sind vorzugsweise schockgefroren, beispielsweise bei -20°C, so daß in diesen Fällen ein Immunoassay vor Gebrauch vorzugsweise bei Gefriertemperaturen zu halten ist.
Weitere, dem Immunoassay beigefügte Komponenten richten sich nach Art des Immunoassays. In der Regel sind zusammen mit dem Antiserum Standardprotein, gegebenenfalls erforderlicher Tracer und Kontrollserum beigefügt. Ferner können Mikrotiteφlatten, vorzugsweise mit Antiköφer beschichtet, Puffer, beispielsweise zum Testen, zum Waschen oder zur Umsetzung des Substrats, und das Enzymsubstrat selbst beigefügt sein.
Die folgenden Beispiele sollen die vorstehend beschriebene Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Rpiiςpiel 1
Haptoglobinreinigung
20 ml eines nicht hämolytischen Serums (Schwein, Rind, Pferd und Hund) wurden mit 8 ml gesättigter (NH )2S0 -Lösung versetzt, so daß sich eine (NH )2S04-Sättigungsgrad von etwa 30% ergab. Für die Herstellung der gesättigten (NH^SO^Lösung wurden 41,5 g (NFL^SO* in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Das mit Ammoniumsulfat versetzte Serum wure eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Probe 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (3200 g). Dem Überstand (ca. 25 ml) wurden 12 ml der gesättigten Ammoniumsulfatlösung zugesetzt. Daraus ergibt sich eine Sättigung von insgesamt ca. 60%. Die Probe wurde erneut eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die nachfolgende Zentrifugation entsprach den obigen Angaben. Das gewonnene Pellet wude in 10 ml Tris-Puffer (0, 1 M Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 7,0) gelöst und über Nacht bei 4°C gegen Tris-Puffer dialysiert.
Die weitere Aufreinigung erfolgte chromatographisch. Eluierte Fraktionen wurden photometrisch untersucht, indem die Extinktionen bei 280, 260 und 536 nm bestimmt wurden. Der Konzentrationsbestimmung von Haptoglobin wurde der Extinktionskoeffizient von humanem
Haptoglobin (Sigma H7605) bei 280 nm in PBS zugrundegelegt. Der Extinktionskoeffizient beträgt 1,45 und wurde in PBS ermittelt.
Zunächst wurde bovines Hämoglobin (Sigma H 2500) kovalent an aktivierte CNBr-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) gekoppelt. Das resultierende Material wurde in eine
Chromatographiesäule (Amersham Pharmacia Biotech C10/ 10) gegeben, die mit dem Tris-Puffer äquilibriert war. Die Flußrate der Säule betrug 1 ml/min. Das Dialysat (ca. 20 ml) der oben beschriebenen Fällung wurde nach Filtration durch einen 0,45 μm-Filter auf die Säule aufgetragen. Nicht-bindende Bestandteile wurden zunächst mit etwa 40 ml 0, 1 M Tris-Puffer ausgewaschen. Es schloß sich ein weiterer Waschschritt mit 12 ml 1.6 M Guanidinhydrochlorid an. Die Elution des Haptoglobins erfolgte mit 3,5 M Guanidinhydrochlorid. Nach etwa 6 ml Durchlauf konnten die haptoglobinhaltigen Fraktionen gewonnen werden. Die Fraktionsgröße betrug 1 ml, wobei ca. 5 Fraktionen gepoolt wurden. Die Probe wurde über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert.
Zur Abtrennung verbliebener Verunreinigungen wurde ein Gelfiltration über Superdex 200 in einer C16/70-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt.
Die Ausbeute an Haptoglobin hing vorwiegend von der Haptoglobinkonzentration in den für die Reinigung verwendeten Seren ab. Beispielsweise konnte aus Schweineserum 4,8 mg, aus Rinderserum 0,6 mg, aus Pferdeserum 1,5 mg und aus Hundeserum 1,6 mg Haptoglobin gewonnen werden. Rpjςpiel 7 Immunisierung
(1) Zusammensetzung der Immunisierungscocktails
Es wurden Immunisierungscocktails mit einem Gemisch von Haptoglobin aus verschiedenen Tierarten und zwei synthetischen Peptiden hergestellt. Folgende Stammlösungen wurden angesetzt: Herkunft und Konzentration der Stammlösungen
Mit diesen Stammlösungen wurden folgende Haptoglobin-Gemische zubereitet:
1. Startimmunisierung
2. und 3. Immunisierung
Anschließend wurden folgende Reaktionslösungen (in μl) angesetzt, getrennt voneinander zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, dann miteinander vereinigt und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert (GA = Glutaraldehyd). 1. Startimmunisierung
2. Immunisierung
4. Immunisierung
Die resultierenden Lösungen wurden dann in komplettem Freund-Adjuvans (7 ml, 4 ml, 3 ml bzw. 3 ml) emulgiert, portioniert (4 x 3 ml, 4 x 1,5 ml, 4 x 1,5 ml bzw. 3 x 1,5 ml) und den Kaninchen subkutan injiziert.
Insgesamt wurden vier Kaninchen in 5-wöchigem Abstand vier Immunisierungen unterzogen. Die mit den Immunisierungscocktails 1 - 4 verabreichten Komponenten sind nachfolgend zusammengestellt:
nur an Haptoglobin gekoppelt
Nach der 3. Immunisierung wurde eine Antiköφer-Titerbestimmung vorgenommen.
Dazu wurde der Antiköφertiter mit Hilfe eines kompetitiven ELISA bestimmt. Es wurden Mikrotiteφlatten mit 5 μg ovinem IgG/ml Beschichtungspuf er (Na-Carbonat pH 9,6) beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Antiköφer wurden aus Schafen gewonnen, die gegen Kaninchen-IgG immunisiert waren. Die im Schafserum enthaltenen Antiköφer wurden affinitätschromatographisch gewonnen. Anschließend wurden die Platten zwei Stunden bei Raumtemperatur mit 2,5% Caseinlösung abgesättigt. Nach fünfmaligem Waschen mit Waschpuffer konnte das zu testende Antiserum aufgetragen werden. Das Antiserum wurde in verschiedenen Verdünnungsstufen von 1 : 10.000 bis 1 : 100.000 in hämoglobinhaltigem Testpuffer (1 mg/ml Hämoglobin) aufgetragen. Im Anschluß wurde biotinmarkiertes Haptoglobin in einer Verdünnung von 8 ng ml auf die Platten pipettiert. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten dreimal gewaschen. Im nächsten Schritt wurden die Platten 30 Minuten mit Streptavidin- Peroxidase inkubiert. Anschließend wurden die Platten fünfmal gewaschen. Als Substrat diente TMB-Lösung; die Farbreaktion wurde nach 20 Minuten mit 2 M H2S04 abgestoppt. Die Extinktion wurde bei 450 nm im Plattenphotometer bestimmt. Der Antiköφertiter wurde als diejenige
Antiserumverdünnung definiert, die im verwendeten Testsystem eine Nettoextinktion von 1 ergab. Mit diesem Test konnten somit spezifisch alle Kaninchen-IgG nachgewiesen werden, die gegen Haptoglobin gerichtet waren.
Ein Kaninchen wurde wegen geringer Titerentwicklung aus dem Versuch genommen. Aus den übrigen Kaninchen konnten hochtitrige Antiseren gewonnen werden. Mit der wöchentlich durchgeführten Abnahme begann man eine Woche nach der 3. Immunisierung.
Reigpiel 3
Anwendung der Antiseren im Immunoassay
Es wurde die Bindung der in Beispiel 2 gewonnenen Antiseren an Haptoglobin aus Schwein, Rind, Pferd, Hund und Mensch untersucht. Es wurde festgestellt, daß die Antiseren mit allen getesteten Haptoglobinen kreuzreagierten. Darüber hinaus konnte Haptoglobin auch in Katzenserum bestimmt werden, obwohl der verwendete Immunisierungscocktail kein gereinigtes Katzen-Haptoglobin enthielt.
Schweine-Haptoglobin konnte in einem Konzentrationsbereich von 30 bis 1000 ng/ml Serum sensitiv nachgewiesen werden.
Ferner zeigte sich, daß die Konzentrationen im Vollblut mit den Serumkonzentration statistisch signifikant korrelierten (r = 0,85; p < 0,001) und dabei etwa um 40 % geringer waren als im Serum.
Prinzipiell lassen sich die Haptoglobin-Konzentrationen auch an Speichel- oder Fleischsaftproben ermitteln. Hier liegen die Werte bei deutlich geringeren Konzentrationen als im Serum, im Speichel etwa 1000-fach und im Fleischsaft etwa 10-fach niedriger.

Claims

P fl t p n t fl n s p r iϊ r h p
Verfahren zur Herstellung proteinspezifischer Antiköφer durch Immunisierung eines Wirtes und in an sich bekannter Gewinnung der Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, daß dem Wirt mindestens ein Immunisierungscocktail verabreicht wird, der Protein und wenigstens ein Proteinfragment enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Teil des (der) Proteinfragments(e) an wenigstens einen Teil des Proteins gekoppelt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Protein aus wenigstens zwei verschiedenen Tierarten verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Proteinfragment verwendet wird, das konservierte Sequenzen aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man haptoglobinspezifische Antiköφer herstellt, wobei man Haptoglobin und wenigstens ein Haptoglobinfragment verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Haptoglobin aus Schwein, Rind, Pferd, Hund und/oder Mensch verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß Haptoglobinpeptide der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO:2 verwendet werden.
8. Immunisierungscocktail aus Protein, wenigstens einem Proteinfragment und gegebenenfalls
Hilfsstoffen.
9. Peptide der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO:2.
10. Polyclonales, kreuzreaktives Antiserum mit Spezifität für Haptoglobin aus wenigstens zwei Nutz- und Haustierarten, erhältlich mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8.
11. Verwendung eines kreuzreaktiven Antiserums nach Anspruch 10 zur Haptoglobin- Bestimmung in Nutz- und Haustieφroben.
12. Verwendung nach Anspruch 11 zur Diagnose von Infektionen, Entzündungen, Traumata oder immunologischem Streß.
13. Immunoassay-Set mit wenigstens einem kreuzreaktiven Antiserum nach Anspruch 9 sowie weiteren Komponenten.
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