DE4310500A1 - Simultane Bestimmung von HbA1¶c¶ und Hämoglobinvarianten mit einer HbA1¶c¶-analogen Glykierung - Google Patents

Simultane Bestimmung von HbA1¶c¶ und Hämoglobinvarianten mit einer HbA1¶c¶-analogen Glykierung

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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur immunologi­ schen Bestimmung des Gehalt es an glykiertem Hämoglobin in einer Blutprobe, bei welchem man Antikörper verwendet, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper.
Hämoglobin, das den Transport von Sauerstoff und CO2 bewirkt und in den Erythrozyten lokalisiert ist, besteht aus vier Proteinketten, von denen jeweils zwei die gleiche Struktur haben. Überwiegend besteht es aus jeweils zwei nicht glykosylierten α- und β-Ketten. Das Hämoglobin liegt im Blut normalerweise zu mehr als 90% in dieser als HbA0 bezeichneten Form vor.
Sowohl von der α- als auch von der β-Kette des Hämoglobins sind Varianten mit einer veränderten Aminosäuresequenz bekannt, die die Transportfunktion des Hämoglobinmoleküls beeinträchtigen und zu sogenannten Hämoglobinopathien führen. Bei der bekanntesten dieser Hämoglobinopathien, der Sichelzellanämie, ist in Position 6 der β-Kette die hydro­ phile Glutaminsäure durch das hydrophobe Valin ersetzt. Hierdurch kommt es zu einer hydrophoben "Zyklisierung zwischen diesem Valin und dem Valin in Position 1 der β- Kette. Durch diese Struktur wird eine Aggregation der eine solche veränderte β-Kette enthaltenden HbS-Moleküle bewirkt, welche die Transportfunktion dieses veränderten Hämoglobins beeinflußt. Auch das HbC, ein anderes patholo­ gisches Hämoglobin, unterscheidet sich vom HbA durch einen Aminosäureaustausch in Position 6 der β-Kette. In diesem Fall ist die Glutaminsäure durch Lysin ersetzt. Daneben sind noch eine Vielzahl weiterer Hämoglobinvarianten mit einem definierten Aminosäureaustausch bekannt (z. B. HbA2, HbE).
Von diesen Hämoglobinvarianten werden in vivo durch nicht enzymatische Reaktion mit Glucose glykierte Hämoglobinderi­ vate gebildet. Diese nicht enzymatische Glykierung ist eine langsam, kontinuierlich und irreversibel ablaufende Reak­ tion, die im wesentlichen von der Blutglucosekonzentration abhängig ist. Die Glykierung verläuft über die Bildung einer Schiff′schen Base zwischen der Aldehydgruppe der Glucose und der freien Aminosäure des Hämoglobins. Das hierbei gebildete Aldimin lagert sich durch eine Amadori- Umlagerung zum N-(1-Desoxy-D-fructos-1-yl)-Rest um. In dieser umgelagerten Form ist das glykierte Hämoglobin stabil.
Das üblicherweise entstehende glykierte Hämoglobin wird mit HbA1c bezeichnet. Die oben genannten glykierten Hämoglobin­ varianten werden mit HbS1c oder HbC1c bezeichnet. Diese entstehen durch Glykierung der freien Aminogruppe des Valin- bzw. Lysinrestes, der sich am N-terminalen Ende der β-Kette des Hämoglobins befindet. Dabei werden die ver­ schiedenen Hämoglobinvarianten in gleichem Ausmaß glykiert wie das normale HbA0 (J. Sosenko et al., Diabetes Care 3 (1980), 590-593).
Die Konzentration der glykierten Hämoglobine im Blut ist abhängig von der Blutglucosekonzentration. Der Anteil der glykierten Hämoglobine am Gesamthämoglobin liegt bei Erwachsenen normalerweise im Bereich von 3-6%. Bei erhöhtem Blutzuckerspiegel nimmt dieser Anteil bis auf 15% zu. Die Bestimmung des Anteils an N-terminal glykiertem Hämoglobin ist daher ein zuverlässiger Parameter zur Kon­ trolle des Blutglucosespiegels. Da die Erythrozyten eine durchschnittliche Halbwertszeit von 120 Tagen aufweisen, bietet die Bestimmung von glykiertem Hämoglobin im Blut einen Parameter für den Blutglucosespiegel, der unabhängig von einer kurzzeitigen Erhöhung, z. B. nach einer kohle­ hydratreichen Mahlzeit, ist.
Die Bestimmung der glykierten Hämoglobine im Blut ist daher von großer Bedeutung für die Diagnose und Überwachung eines Diabetes mellitus. Es sind daher eine Reihe von chromato­ graphischen und elektrophoretischen Methoden zum Nachweis von HbA1c entwickelt worden. Die glykierten Hämoglobin­ varianten lassen sich mit diesen Methoden dagegen nicht simultan mit HbA1c bestimmen (J. Sosenko et al., Diabetes Care 3 (1980), 590-593, D. Goldstein et al., CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 21 (1984), 187-225 und Allen et al., Annual Clinical Biochemistry 29 (1992), 426-429). Mit Hilfe der affinitätschromatographi­ schen Methoden werden zwar auch die glykierten Hämoglobin­ varianten wie HbS1c oder HbC1c neben HbA1c simultan bestimmt, doch ist diese Methode nicht spezifisch für die Glykierung am N-Terminus der β-Kette, da alle Glykierungen des Hämoglobinmoleküls (z. B. an Lysin-Resten oder an der α-Kette) gleich erfaßt werden (D. Goldstein et al., CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 21 (1984), 187-225). Dadurch ergeben die chromatographischen Verfah­ ren bei einem Patienten mit einer der oben genannten Hämo­ globinopathien zu geringe Werte für den Anteil an N- terminal glykiertem Hämoglobin, während die affinitätschro­ matographischen Methoden allgemein höher messen. Daher sind diese bekannten Verfahren zur Diagnose und Überwachung eines Diabetes mellitus bei Blutproben von Patienten mit Hämoglobinopathien nicht anwendbar.
Es hat sich jetzt überraschenderweise gezeigt, daß mit Antikörpern, die erhältlich sind durch Immunisierung mit einem Immunogen, welches als Haptenteil das glykierte Oligopeptid Fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro oder einen Teil davon enthält, Antikörper erhalten werden, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen und für die Verwendung in immunologi­ schen Bestimmungsverfahren für HbA1c, HbS1c und HbC1c geeignet sind.
Gegenstand der Erfindung ist demnach die Verwendung von Antikörpern, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen und erhältlich sind durch Immunisierung mit mindestens einem Immunogen, welches als Haptenteil das glykierte Oligopeptid Fructose-Val-His, Fructose-Val-His-Leu, Fructose-Val-His- Leu-Thr und/oder Fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro enthält zur immunologischen, simultanen Bestimmung von HbA1c, HbS1c und HbC1c.
Daß derartig hergestellte Antikörper HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen, ist insbesondere auch deshalb überraschend, weil der Aminosäureaustausch in Position 6 der β-Kette von HbS und HbC auch zu einer Änderung der Tertiärstruktur im Bereich des vom Antikörper erkannten Epitops führt und demzufolge zu erwarten gewesen wäre, daß Antikörper, die mit dem oben genannten Immunogen erhalten werden, HbA1c, HbS1c und HbC1c differenzieren.
Mit diesen Antikörpern kann die simultane immunologische Bestimmung von N-terminal glykiertem Hämoglobin HbA1c, HbS1c und HbC1c über alle gängigen Immunoassays wie z. B. ELISA, Fluoreszenzimmunoassay, Radioimmunoassay, Fluores­ zenz-Polarisations-Immunoassay (FPIA), Cloned Enzyme Donor Immunoassay (CEDIA) oder Enzyme-Multiplied-Immunoassay- Technique (EMIT) erfolgen. Der Test kann dabei sowohl als homogener Test, z. B. als ein kompetitiver turbidimetrischer Immunoassay, als auch als heterogener Test durchgeführt werden.
Vorzugsweise erfolgt der Test nach dem Prinzip des Aggluti­ nationstests, wie z. B. TINIA oder dem Latex Particle- Enhanced Immunoassay (LPIA). Hierbei handelt es sich um einen kompetitiven Test, bei welchem das Antigen aus der Probe mit einem Polyhapten, in dem mehrere Haptene an ein hochmolekulares Trägerprotein gebunden vorliegen, um die Bindung an einen spezifischen Antikörper konkurriert. Vorzugsweise wird als Hapten, das an einen hochmolekularen Träger gebunden vorliegt, das zur Immunisierung verwendete Hapten (vorzugsweise Fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro) verwen­ det. In Abwesenheit von Antigen aus der Probe wird dieses Immunogen durch den im Test eingesetzten Antikörper zu großen Aggregaten vernetzt, welche eine bestimmte Trübung dieser Testlösung verursachen. Entsprechend der Menge an Antigen in der Probe wird hochmolekulares Polyhapten aus diesen Aggregaten durch das Antigen verdrängt. Damit nimmt die Trübung in einer zur Antigenmenge proportionalen Weise ab. Durch Vergleich mit der Trübungsabnahme, die bei Zugabe bekannter Mengen an glykiertem Hämoglobin beobachtet wird, kann die Menge an glykiertem Hämoglobin (HbA1c, HbS1c und HbC1c) in der Probelösung bestimmt werden. Als Standard können dabei HbA1c, HbS1c oder HbC1c allein oder als Gemi­ sche verwendet werden.
Weiterhin bevorzugt ist die Durchführung des erfindungs­ gemäßen Verfahrens nach dem Prinzip des CEDIA, EMIT, FPIA oder ELISA.
Beim CEDIA-Prinzip bewirkt das Antigen aus der zu analysie­ renden Probe die Assoziation von allein jeweils inaktivem Enzymakzeptor und Enzymdonor zu einem aktiven Enzym, dessen Aktivität somit proportional zur Menge an Antigen in der zu analysierenden Probe ist (Henderson et al., Clinical Chemistry 32 (1986), 1637-1641). Zum Nachweis werden hierbei bestimmte Enzyme wie z. B. die β-Galactosidase verwendet, die in zwei jeweils enzymatisch inaktiven Bestandteilen, nämlich einem großen Polypeptid (Enzym­ akzeptor) und einem kleinen Polypeptid (Enzymdonor) vorlie­ gen, wobei diese Bestandteile spontan zu einem enzymatisch aktiven Protein assoziieren. An den Enzymdonor wird das als Analyt nachzuweisende Hapten derart gebunden, daß die Assoziation des Enzymdonors mit dem Enzymakzeptor zum aktiven Enzym durch diese Bindung nicht verhindert wird. Diese Assoziation wird aber dann gehemmt, wenn an den Antigen-Enzymdonor-Komplex ein Antikörper gegen das Antigen bindet. In einer Reagenzlösung, in der Enzymakzeptor, Antigen-Enzymdonor-Komplex und der entsprechende Antikörper vorliegen, kann daher kein aktives Enzym gebildet werden und es wird keine enzymatische Aktivität gemessen. Nach Zugabe der Probelösung verdrängt nun das Antigen aus dieser Probelösung den Antikörper aus der Bindung an den Antigen- Enzymdonor-Komplex und ermöglicht so die Ausbildung des aktiven Enzyms.
Bei der Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) wird das nachzuweisende Hapten so kovalent mit dem Markerenzym gekoppelt, daß die Enzymaktivität erhalten bleibt. Nach Bindung eines Antikörpers an den Haptenanteil wird die Substratbindung an das Enzym sterisch jedoch behindert, so daß keine enzymatische Umsetzung des Substrats erfolgen kann. Wie beim CEDIA-Prinzip verdrängt dann auch hier das Antigen aus der zu bestimmenden Probelösung den Antikörper vom enzymgebundenen Hapten und ermöglicht so eine enzyma­ tische Aktivität, die proportional zur Konzentration des zu analysierenden Antigens in der Probelösung ist (Gunzer et al., Kontakte III, 1980, 3-11 und K. Rubenstein, Bio­ chemical and Biophysical Research Communications 47 (1972), 846-851).
Beim Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay (FPIA) wird das zu bestimmende Hapten mit einer fluoreszierenden Substanz markiert. Diese Moleküle absorbieren Lichtenergie und geben sie in einem Zeitraum von etwa 10-8 sec als Licht längerer Wellenlänge wieder ab. Wird der Fluorophor durch polari­ siertes Licht angeregt, so hängt der Polarisationsgrad des emittierten Lichts von der Rotationsgeschwindigkeit des Tracers (Analyt-Fluorophor-Konjugat) ab. Die Bindung des Tracers an einen Antikörper behindert die Rotation des Fluorophors. Der freie Tracer rotiert schneller und depola­ risiert das anregende Licht mehr als der größere, trägere Antikörper-Tracer-Komplex. Je mehr der Analyt in der Probe vorhanden ist, desto weniger Antikörper-Tracer-Komplexe entstehen und desto weniger Fluoreszenzpolarisation ist meßbar (W. Dandliker et al., Journal of Exp. Med. 122 (1965), 1029).
Bei Immunoassays nach dem ELISA-Prinzip wird die Bindung eines enzymmarkierten Antikörpers an ein vor oder während der Nachweisreaktion immobilisiertes Antigen aus der zu bestimmenden Probelösung über die Messung der Enzymmarkie­ rung in der festen Phase bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind monoklonale und polyklonale Antikörper, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen und erhältlich sind durch Immunisierung mit einem Immuno­ gen, das als Hapten das glykierte Oligopeptid Fructose-Val- His, Fructose-Val-His-Leu oder Fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro enthält, und Isolierung des Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren.
Ein weiterer Gegenstand sind monoklonale und polyklonale Antikörper, erhältlich durch Immunisierung eines Säugers mit einem Gemisch aus einem Immunogen, das als Hapten Fructose-Val-His-Leu-Thr enthält und mindestens einem weiteren Immunogen, welches als Haptenteil Fructose-Val- His, Fructose-Val-His-Leu und/oder Fructose-Val-His-Leu- Thr-Pro enthält, und Isolierung des Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen und erhält­ lich sind durch Immunisierung mit dem genannten Immunogen, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, und Isolierung des Antikörpers aus den Antikörper produzierenden Zellen nach bekannten Verfahren.
Das Immunogen kann analog den in EP-A 0 329 994 (die Gegen­ stand der Offenbarung der vorliegenden Patentanmeldung ist) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Hapten wird dabei an ein Trägerprotein wie z. B. KLH (keyhole limpet hemocyanin), β-Galactosidase oder Edestin gebunden. Vor­ zugsweise wird KLH als Trägerprotein verwendet. Die Kopp­ lung zwischen Hapten und Trägerprotein erfolgt zweckmäßig über Kopplungsgruppen wie z. B. Lysin, Cystein und die Maleinimidohexylgruppe.
Besonders bevorzugt wird ein Immunogen verwendet, welches eine hohe Beladungsdichte aufweist (Anzahl der gebundenen Haptengruppen entsprechend 5-25% des Gewichts des Trä­ gerproteins). Dabei wird ein Antiserum hoher Serumstärke erhalten. Unter einer hohen Serumstärke ist zu verstehen, daß das erhaltene polyklonale Antiserum im Reagenz zur Bestimmung der glykierten Hämoglobine in hohen Verdünnungen (1 : 8, vorzugsweise 1 : 10 und mehr) eingesetzt werden kann.
Mit diesem Immunogen werden dann die üblicherweise zur Gewinnung von Antikörpern verwendeten Tiere nach dem Fach­ mann bekannten Verfahren immunisiert. Vorzugsweise werden Kaninchen oder Schafe bzw. zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern Mäuse verwendet. Die polyklonalen Antikörper können entweder direkt oder vorzugsweise nach chromatogra­ phischer Reinigung an DEAE oder immunsorptiver Reinigung verwendet werden. Monoklonale Antikörper werden in üblicher Weise durch Immortalisierung der Milzzellen der immunisier­ ten Tiere, Klonierung derjenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, und Isolierung des Antikörpers nach bekannten Verfahren erhalten.
Ebenso ist es bevorzugt, zur Immunisierung ein Gemisch von mindestens zwei Immunogenen zu verwenden, die als Hapten­ teil Fructose-Val-His, Fructose-Val-His-Leu, Fructose-Val- His-Leu-Thr und Fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro enthalten.
Diejenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, werden in üblicher Weise über einen ELISA-Test zum Nachweis der Bindung an HbA1c, HbS1c und gegebenenfalls HbC1c identifiziert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die sowohl HbA1c als auch HbS1c und HbC1c erkennen, durch Immunisierung mit einem Immunogen, das als Hapten das glykierte Oligopeptid Fructose-Val-His, Fructose-Val-His-Leu oder Fructose-Val- His-Leu-Thr-Pro enthält, oder einem Gemisch von mindestens zwei solchen Immunogenen, und Isolierung des Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach bekannten Ver­ fahren.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen, durch Immunisierung mit einem Immunogen, das als Hapten das glykierte Oligopeptid Fructose-Val-His, Fructose-Val-His-Leu oder Fructose-Val- His-Leu-Thr-Pro enthält, oder einem Gemisch von mindestens zwei solchen Immunogenen, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immortali­ sierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, und Isolierung des Antikörpers aus den klonierten Zellen nach bekannten Verfahren.
Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein solches erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen, bei welchem ein Immunogen verwen­ det wird, bei dem der Haptenteil an KLH als Trägerprotein gebunden ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur immunologischen Bestimmung des Gehaltes an glykiertem Hämoglobin in einem Verfahren zur simultanen immunologischen Bestimmung des Gehaltes an HbA1c sowie glykierten Hämoglobinvarianten wie z. B. HbS1c und HbC1c in einer Blutprobe.
Die erfindungsgemäßen Antikörper erkennen zusätzlich noch weitere Glykierungsvarianten von Hb wie z. B. HbA21c und HbE1c.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur immunologischen Bestimmung des Gehaltes an N-terminal glykiertem Hämoglobin, welcher mindestens einen erfindungs­ gemäßen Antikörper enthält, sowie ein Verfahren zur immuno­ logischen, simultanen Bestimmung von HbA1c, HbS1c und HbC1c unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 Herstellung von Immunogenen zur Gewinnung von Antikörpern gegen glykierte Hämoglobine vom HbA1c-TYP 1.1 Verwendung von β-Galactosidase als Trägerprotein
Das Peptid Fructose-Val-His-Leu-Thr-Lys-OH wird gemäß den Angaben in EP-A 0 329 994 über eine Festphasensynthese an einem semiautomatischen Peptidsynthesizer der Firma Labortec (Bubendorf, Schweiz) synthetisiert und an β-Galactosidase gebunden. Dazu werden 10 mg Fructose-Val-His-Leu-Thr-Lys-OH in 1 ml 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7 aufgenommen und 6,2 mg Maleinimidohexansäure-N-hydroxysuccinimidester in 2 ml Ethanol zugegeben. Die Reaktionslösung wird 14 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend an Polycosil C18 aufgereinigt und die gemäß HPLC reinen Fraktionen lyophili­ siert.
Zur Herstellung des Immunogens werden 48 mg β-Galactosidase (β-Gal) (EIA-Qualität, Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 570 079) unter Argonatmosphäre in 2 ml mit Argon-begastem 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 gelöst und unter Sauerstoffausschluß 5 mg des lyophilisierten Peptids Fructose-Val-His-Leu-Thr-Lys(MH)-OH zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die gesamte Reaktionslösung auf eine AcA202-Säule (2×24 cm, Phar­ macia, Schweden), welche mit Argon-gesättigter 0,09%iger Natriumchloridlösung equilibriert wurde, aufgetragen. Anschließend wird mit dem gleichen Equilibrierungspuffer eluiert und die Proteinfraktionen, die das gewünschte Immunogen enthalten, gesammelt. Die Beladung der β-Galacto­ sidase mit den Haptengruppen kann durch Umsetzung einer Probe mit Ellmanns Reagenz bestimmt werden.
In analoger Weise werden die Immunogene Fructose-Val-His- Lys-(MH)-β-Gal, Fructose-Val-His-Leu-Lys-(MH)-β-Gal und Fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys-(MH)-β-Gal hergestellt.
1.2 Verwendung von KLH als Trägerprotein
Das Hapten Fructose-Val-His-Leu-Thr-Cys-OH wird gemäß den Angaben in EP-A 0 329 994 über eine Festphasensynthese an einem semiautomatischen Peptidsynthesizer der Firma Labortec (Bubendorf, Schweiz) synthetisiert.
Das Trägerprotein Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) wird mit Maleinimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimid (MHS) umgesetzt. Dazu werden 2 g KLH in 70 ml 0,1 mol/l Natrium­ hydrogencarbonat pH 8,35 gelöst. Der unlösliche Proteinan­ teil wird durch Zentrifugation abgetrennt. Anschließend wird der pH Wert der Lösung mit 0,1 mol/l NaOH auf pH 8,30 eingestellt. Zu dieser Proteinlösung gibt man 370 mg Maleinimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimid gelöst in 3 ml DMSO. Nach 15minütiger Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird der pH Wert mit O,1 mol/l HCl auf pH 7,0 eingestellt und das Produkt über eine Gelpermeationschromatographie an Ultrogel AcA 202 (2×24 cm, Pharmacia, Schweden) aufgerei­ nigt. Die Bestimmung der Anzahl an Maleinimidohexanoylgrup­ pen im erhaltenen Produkt erfolgt gemäß EP-A 0 329 994 (Beispiel 4) mit Ellmann′s Reagenz. In der Regel wird eine Beladung von 600-900 Maleinimidohexanoylgruppen je mol KLH erreicht.
Das so erhaltene KLH-Derivat wird ca. 15 min mit Argon gespült. Anschließend wird je mol Maleinimidohexanoyl­ gruppe 2 mol des Peptid-Haptens zugegeben und 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Aufreinigung erfolgt dann durch Abtrennung des nicht umgesetzten Peptids durch Gel­ permeationschromatographie an Ultrogel AcA 202 (2×24 cm, Pharmacia, Schweden).
Beispiel 2 Herstellung von polyklonalen Antiseren gegen HbA1c 2.1 Immunisierung
5 Schafe werden mit dem gemäß Beispiel 1.1 hergestellten Immunogen in komplettem Freund′schem Adjuvans immunisiert. Die Dosis beträgt jeweils 500 µg je Tier für die erste und jede weitere Folgeimmunisierung. 5 weitere Schafe wurden in derselben Weise immunisiert, jedoch mit jeweils 1 mg Immunogen je Tier und Immunisierung.
10 Schafe werden mit einem analogen Immunogen, bei dem das Hapten jedoch an KLH gebunden vorliegt (Herstellung gemäß Beispiel 1.2) in derselben Weise ebenfalls mit 500 µg bzw. 1 mg je Tier und Immunisierung immunisiert.
Nach 5 Monaten (KLH-Immunogen) bzw. 6 Monaten (β-Gal-Immu­ nogen) werden allen Tieren Serumproben entnommen und die Serumstärke der erhaltenen Antiseren über einen Trübungs­ test bestimmt.
Antiserumprüfung Verwendete Reagenzien
Hämolysereagenz:
20 mM MES pH 6,0
1% SDS
0,02% Kaliumhexacyanoferrat (III)
0,1% NaN3
0,5% Brÿ 35
Reaktionspuffer:
20 mM MES pH 6,0
150 mM NaCl
0,5% Brÿ 35
0,1% NaN3
3% PEG 6000
Polyhaptenlösung:
20 mM MES pH 6,0
150 mM NaCl
0,5% Brÿ 35
0,1% NaN3
6% PEG 6000
0,1% RSA
Polyhapten 30 µg/ml
Vorbereitung der Antiseren zur Messung
Die Seren werden 1+1 mit doppelt konzentriertem Reaktions­ puffer verdünnt, bei 4°C über Nacht inkubiert und der entstandene Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wird 1 Stunde lang im Eisbad inkubiert, durch einen 0,22 µm-Filter filtriert und der pH-Wert auf 6,0 einge­ stellt. Die so entstandene Antikörperlösung kann direkt in den Test eingesetzt werden oder mit Reaktionspuffer weiter verdünnt werden.
Messung
Zur Beurteilung der Antiserumstärke wird Antikörperlösung und Polyhaptenlösung gemischt und die entstehende Trübung photometrisch gemessen. Die Messung wird bei 37°C am Ana­ lysenautomaten Hitachi 704 durchgeführt. Der Ablauf ist wie folgt:
8 µl Hämolysereagenz und 350 µl Antikörperlösung werden gemischt und 5 min lang inkubiert. Anschließend werden 70 µl Polyhaptenlösung hinzugefügt und weitere 5 min inku­ biert. Die in dieser Zeit entstehende Trübung wird bei 340 nm (unter Verwendung der Referenzwellenlänge 700 nm) als Extinktion gemessen.
2.3 Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 (β-Gal-Immunogen) und 3 (KLH-Immunogen) zusammengefaßt. Bei niedrigen Antiseren­ verdünnungen (1 : 2/1 : 4) zeigen viele Tiere Meßsignale von 500 mE und mehr. Die zur Immunisierung verwendete Dosis des Immunogens zeigt keinen erkennbaren Einfluß auf die Serum­ stärke.
Tabelle 2
Maximales Meßsignal im kompetitiven Immuno­ assay bei Verwendung eines polyklonalen Antiserums, das durch Immunisierung mit einem an β-Galactosidase gebundenen Peptid- Hapten erhalten wurde
Tabelle 3
Maximales Meßsignal im kompetitiven Immunoassay bei Verwendung eines polyklonalen Antiserums, das durch Immunisierung mit einem an KLH gebundenen Peptid- Hapten erhalten wurde
Beispiel 3 Isolierung von HbA0 und HbS0 und in vitro Glykierung von HbS0 zu HbS1c
Kommerziell erhältliches HbS (Sigma, Kat.-Nr. H0392) bzw. humanes Erythrozyten-Hämolysat wird chromatographisch getrennt und das so aufgereinigte HbS0 in vitro mit Glucose zu HbS1c umgesetzt.
3.1. Isolierung von HbS0
Ein HbS-Präparat der Fa. Sigma wurde in 50 mmol/l MES pH 6,2 gelöst und anschließend gegen denselben Puffer 12 Stunden dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine mit dem obigen Puffer equilibrierte S-Sepharose HP Chromatographie- Säule der Fa. Pharmacia aufgetragen. Die Elution erfolgte durch einen LiCl-Gradienten. Die HbS0-Fraktion wurde iso­ liert. Sie enthielt keine glykierten Hämoglobine, wie mittels HPLC-Analytik unter Verwendung einer MonoSHbA1c- Säule der Fa. Pharmacia und deren Vorschrift zur Bestimmung von HbA1c gezeigt werden konnte.
3.2. Herstellung von glykiertem HbS
Ein Teil der HbS0-Fraktion wurde gegen einen 100 mmol/l Phosphat-Puffer pH 6,5 dialysiert und anschließend mit einem 2600fachen molaren Überschuß an Glucose umgesetzt. Nach 20 Stunden bei 37°C wurde die Reaktion abgebrochen und der Inkubationsansatz zur Entfernung der Glucose ausgiebig dialysiert. Das Dialysat wurde ebenfalls mittels HPLC analysiert. Das Chromatogramm wies einen Anteil von 11,1% glykiertem HbS auf.
3.3. Isolierung von HbA0
Durch Lyse von PBS gewaschenen Human-Erythrocyten in dest. Wasser wurden die enthaltenen Hämoglobine freigesetzt. Zelltrümmer und Erythrocyten-Ghosts wurden durch Zentrifu­ gation abgetrennt. Das so erhaltene Hämolysat wurde gegen 50 mM MES pH 6,2 dialysiert. Das Dialysat wurde an­ schließend auf eine mit dem obigen Puffer equilibrierte S- Sepharose HP Chromatographie-Säule der Fa. Pharmacia aufge­ tragen. Die Elution erfolgte durch einen LiCl-Gradienten. Die HbA0-Fraktion wurde isoliert. Sie enthielt keine gly­ kierten Hämoglobine, wie mittels HPLC-Analytik unter Ver­ wendung einer MonoS/HbA1c-Säule der Fa. Pharmacia und deren Vorschrift zur Bestimmung von HbA1c gezeigt werden konnte.
Beispiel 4 Simultane Bestimmung von HbA1c und HbS1c
Die Vollblut-Proben wurden zuerst mit einem speziellen Hämolysereagenz hämolysiert und anschließend an einem Photometer (BM/Hitachi 717 der Fa. Boehringer Mannheim GmbH) im Zweikanalverfahren vermessen. Im einen Kanal erfolgte der immunologische Nachweis von HbA1c in g/dl nach dem TINIA-Testprinzip durch turbidimetrische Messung bei 340 nm, während im anderen Kanal der Gesamthämoglobingehalt durch photometrische Messung bei 570 nm bestimmt wurde. Der prozentuale Gehalt an HbA1c wird nach folgender Formel berechnet:
Folgende Reagenzien wurden verwendet:
  • 1) Hämolysereagenz:
    20 mM Natriumphosphat pH 7,4
    0,9% TTAB (Tetradecyltrimethylammoniumbromid)
  • 2) Antikörperlösung (R1-HbA1c):
    20 mmol MES-Puffer, pH 6,2 (2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure)
    150 mmol NaCl
    3,0% PEG 6000 (Polyethylenglycol MG ca. 6000)
    0,5% Brÿ® 35
    1,0 mg/ml PAK <HbA1c<S-IgG(DE) (polyklonale Schafantikörper gegen HbA1c), hergestellt mit Immunogen Fructose- Val-His-Leu-Thr-MH-βGal
  • 3) Polyhaptenlösung (R2-HbA1c):
    20 mmol MES-Puffer, pH 6,2
    150 mmol NaCl
    6,0% PEG 6000
    0,5% Brÿ® 35
    30 µg/ml Polyhapten1) 1) Polyhapten: Fructose-Val-His-Leu-Thr, gekoppelt über Cys-Maleinimidohexansäure an Dextran wie in der deutschen Patentanmeldung P 41 40 142.5 beschrieben.
  • 4) Pufferlösung zur Gesamthämoglobinbestimmung (R1-Hb):
    20 mM Natriumphosphat, pH 7,4
    150 mMol NaCl
  • 5) Kalibratoren a-e:
    20 mmol Natriumphosphat, pH 7,4
    0,9% TTAB
    1,4 mg/ml Schafhämoglobin
    0, 0,05, 0,1, 0,16, 0,3 humanes HbA1c
4.1. Bestimmung von HbA1c
Zur Probe wurde das Hämolysereagenz in einem Verhältnis von 1+100 hinzugefügt und bei 25°C ca. 5 Minuten inkubiert. Zu 10 µl hämolysierter Probe wurden 250 µl Antikörperlösung (R1-HbA1c) hinzupipettiert. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37°C wurde der Probenleerwert bei 700/340 nm bichromatisch gemessen (E1). Ca. 20 sec nach der Messung wurden 50 µl Polyhaptenlösung zugegeben, sofort gerührt und weitere 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wird die Trübung bei 700/340 nm bichromatisch gemessen (E2).
Die probenspezifische Extinktionsdifferenz wird nach der Formel
ΔE = E2-K·E1
berechnet, wobei K den Volumenkorrekturfaktor darstellt.
Mit Hilfe der Kalibratoren a-e, die aufsteigende Konzen­ trationen an HbA1c enthalten, wurde eine Eichkurve erstellt und über die probenspezifische Extinktionsdifferenz AE kann die unbekannte HbA1c-Konzentration der Probe in g/dl abge­ lesen werden.
4.2. Bestimmung der Gesamthämoglobinkonzentration
Zur Bestimmung der Gesamthämoglobinkonzentration wird das in 4.1. erhaltene Hämolysat eingesetzt. Durch die im Hämo­ lysereagenz enthaltenen Reagenzien wird das Hämoblogin oxidiert und durch Anlagerung des Detergenzmoleküls ein charakteristisches Hämoglobinchromophor enthalten. 20 µl dieses Hämolysats werden zusammen mit 230 µl Puffer (R1-Hb) in die Küvette pipettiert, kurz gerührt und nach 5 Minuten Inkubation bei 37°C die Extinktion bichromatisch bei 660/570 nm gemessen. Mit Hilfe des Kalibrators a und phys. NaCl-Lösung (Nullstandard) wird eine Eichkurve er­ stellt und über die Extinktion der unbekannten Probe die Konzentration abgelesen.
Der prozentuale HbA1c-Gehalt wird über die Formel
berechnet.
Beispiel 5 Bestimmung der Spezifität der erfindungsgemäßen Antikörper
Zur Bestimmung der Spezifität der gemäß Beispiel 2 erhalte­ nen Antikörper wird die HbA1c-Bestimmung gemäß Beispiel 4 am Hitachi 717 durchgeführt. Hierzu werden HbA0 (nach Beispiel 3 aus Humanblut aufgereinigt), HbS0 (Sigma H0392 gemäß Beispiel 3 aufgereinigt), HbS1c-haltige Probe (in vitro gemäß Beispiel 3 hergestellt) und zwei Vollblutkon­ trollen mit bekannten HbA1c-Werten (BioRad, Lyphochek® Diabetes Control Level 1 and 2, Best.-Nr. 740) als Proben vermessen. Das Ergebnis ist in der Tabelle 1 zusammen­ gefaßt.
Tabelle 1
Hieraus ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen Antikörper sowohl HbA1c als auch HbS1c erkennen, nicht aber die ent­ sprechenden nicht-glykierten Hämoglobine HbA0 bzw. HbS0.

Claims (15)

1. Verwendung von Antikörpern, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen und erhältlich sind durch Immunisierung mit mindestens einem Immunogen, welches als Haptenteil das glykierte Oligopeptid Fructose-Val-His, Fructose-Val- His-Leu, Fructose-Val-His-Leu-Thr und/oder Fructose- Val-His-Leu-Thr-Pro enthält, zur immunologischen, simultanen Bestimmung von HbA1c, HbS1c und HbC1c.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip des Agglutinationstests erfolgt.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Bestimmung nach dem CEDIA- Prinzip erfolgt.
4. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Bestimmung nach dem EMIT-Prin­ zip erfolgt.
5. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Bestimmung nach dem FPIA-Prin­ zip erfolgt.
6. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Bestimmung nach dem ELISA- Prinzip erfolgt.
7. Antikörper, der HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung eines Säugers mit einem Immunogen, das als Haptenteil das glykierte Oligopeptid Fructose-Val-His, Fructose-Val-His-Leu und/oder Fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro enthält, und Isolierung des Antikörpers aus dem Serum der immuni­ sierten Tiere.
8. Antikörper, der HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung eines Säugers mit einem Gemisch aus einem Immunogen, das als Hapten Fructose-Val-His-Leu-Thr enthält und mindestens einem weiteren Immunogen, welches als Haptenteil Fructose- Val-His, Fructose-Val-His-Leu und/oder Fructose-Val- His-Leu-Thr-Pro enthält, und Isolierung des Antikör­ pers aus dem Serum der immunisierten Tiere.
9. Antikörper nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß er ein monoklonaler Antikörper ist und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem der in Anspruch 7 oder 8 genannten Immunogene, Immortalisie­ rung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonie­ rung derjenigen immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren und Isolierung des Antikörpers nach bekannten Verfahren.
10. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen, durch Immunisierung eines Säugers mit einem Immunogen, das als Haptenteil das glykierte Oligopeptid Fructose-Val-His, Fructose-Val- His-Leu oder Fructose-Val-His-Leu-Thr-Pro enthält, oder einem Gemisch von zwei solchen Immunogenen und Isolierung des Antikörpers aus dem Serum der immuni­ sierten Tiere.
11. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikör­ pern, die HbA1c, HbS1c und HbC1c erkennen, durch Immunisierung eines Säugers mit einem Immunogen, das als Haptenteil das glykierte Oligopeptid Fructose-Val- His-, Fructose-Val-His-Leu oder Fructose-Val-His-Leu- Thr-Pro enthält, oder mit einem Gemisch von zwei solchen Immunogenen, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen immor­ talisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, und Isolierung des Antikörpers nach bekannten Verfahren.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Immunogen verwen­ det wird, bei dem der Haptenteil an KLH als Trägerpro­ tein gebunden ist.
13. Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 7 bis 9 zur immunologischen Bestimmung des Gehaltes an N-terminal glykiertem Hämoglobin in einem Verfahren zur simultanen Bestimmung des Gehaltes an HbA1c, HbS1c und HbC1c in Blutproben.
14. Reagenz zur immunologischen Bestimmung von N-terminal glykiertem Hämoglobin, enthaltend mindestens einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9.
15. Verfahren zur immunologischen, simultanen Bestimmung von HbA1c, HbS1c und HbC1c unter Verwendung von Anti­ körpern nach den Ansprüchen 7 bis 9.
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