DE3781745T2

DE3781745T2 - Antikoerper zur verwendung fuer die bestimmung von menschlichem glycoalbumin.

Info

Publication number: DE3781745T2
Application number: DE8787111536T
Authority: DE
Inventors: William J Knowles; Vincent T Marchesi
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1986-08-22
Filing date: 1987-08-10
Publication date: 1993-02-04
Anticipated expiration: 2007-08-11
Also published as: CA1338782C; NZ221494A; ES2046187T3; IE872247L; EP0257421A3; AU7732887A; DK437087A; EP0257421B1; IE60443B1; FI873606A0; EP0257421A2; DK437087D0; DE3781745D1; AU591579B2; DK168710B1; FI873606A; IL83584A0; IL83584A

Description

Die Erfindung betrifft die Bestimmung der glykosilierten Form von Albumin, im folgenden als Glykoalbumin bezeichnet, in menschlichen Blutproben. Die Bestimmung des Ausmaßes der Glykosilierung von Albumin im Blut eines Patienten liefert eine nützliche Bewertungsgrundlage zur Kontrolle des Glukosespiegels bei Diabetikern. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch den glykosilierten Lysinrest an Position 525 im humanen Albumin erkennen.
Albumin ist das Hauptserumprotein des Blutes und hat eine Halbwertszeit im Blutstrom von 10 Tagen. Eine nichtenzymatische Glykosilierungsreaktion führt zu kovalenten Kopplung von Glukose an einem kleinen Prozentsatz der Albuminmoleküle bei allen Menschen. Da die Geschwindigkeit der nichtenzymatischen Glykosilierung vom Glukosespiegel im Blutkreislauf abhängt, zeigen Diabetiker mit einem höheren mittleren Blutglukosespiegel einen Anstieg an glykosiliertem Albumin. Die Schwere der diabetischen Erkrankung spiegelt sich daher im Prozentsatz an glykosiliertem Albumin wieder.
Eine analoge Reaktion findet zwischen Glukose und Hämoglobin statt, was zur Bildung von Hämoglobin A1c plus oder anderen glykosilierten Hämoglobinen führt. Hämoglobin hat eine Lebenszeit von 120 Tagen. Daher gibt die Bestimmung von glykosiliertem Hämoglobin den mittleren Glukosespiegel im Blutstrom für diesen Zeitraum wieder, wogegen eine Glykoalbuminbestimmung dem mittleren Glukosespiegel im Blutstrom von 10 Tagen entspricht. Die Bedeutung der Werte des glykosilierten Hämoglobins ist in hohem Maße weitverbreitet als klinisch wichtig zur genauen Bestimmung der Schwere der Diabeteserkrankung akzeptiert. Nachweisverfahren auf glykosiliertes Hämoglobin waren relativ leicht zu entwickeln, da das Hämoglobinmolekül gefärbt ist, und es daher einfach ist, quantitative Bestimmungen unter Verwendung billiger Spektralphotometer durchzuführen. Albumin ist farblos, und Verfahren zur Quantifizierung von Glykoalbumin erfordern, daß das Kohlenhydrat in ein gefärbtes Produkt derivatisiert wird, oder daß der Proteinteil des Glykoalbumins zu einem gefärbten Produkt umgesetzt wird. Aus diesem Grund gibt es gegenwärtig keine Glykoalbumintests zur Verwendung im großen Maßstab im klinischen Laboratorium.
Aus der Literatur sind eine Anzahl Glykoalbumintests vorgeschlagen worden. Von diesen sind solche bedeutend, die auf Boronatchromatographie und Thiobarbitursäuretests beruhen. Das Boratchromatographieverfahren umfaßt die kolorimetrische Bestimmung von gebundenem Protein, z. B. gebunden an Glykogel von Pierce Chemical Co. In diesem Test wird Serum auf eine Boronataffinitätssäule aufgegeben, worin alle cis-Diol-haltigen Substanzen (z. B. Glykoalbumin und andere Glykoproteine) gebunden werden. Diese Substrate werden anschließend eluiert und sowohl die gebundenen und die eluierten Fraktionen nach Zusatz eines Farbstoffes, welcher mit dem Protein unter Bildung eines gefärbten Produkts reagiert, quantitativ bestimmt. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens ist, daß viele Nichtalbuminproteine im Serum Glykoproteine sind (z. B. Immunoglobuline) und daher im Boronatchromatographietest gebunden und gemessen werden. Das Säulenverfahren erfordert mehrfache Schritte zur Trennung und Analyse und ist daher nicht gut zur Automatisierung geeignet. Es liegen auch Daten vor, die nahelegen, daß Glukose mit der Boronatbindung in Wechselwirkung tritt. Beim Thiobarbitursäuretest wird das Ketoamin-Proteinaddukt in 5-Hydroxymethylfurfural durch Hydrolyse mit Oxalsäure unter Bildung eines gefärbten Produktes umgewandelt. Der Hauptnachteil hier liegt darin, daß die Hydrolyse 2 bis 4 h bei 100ºC oder hoher erfordert. Die Hintergrundfärbung muß korrigiert werden, und gegenwärtig sind keine Standards oder Kalibriermittel erhältlich.
Die Reaktion von Glukose mit Albumin erfordert (a) die Bildung einer Schiff'schen Base zwischen dem C-1 der Glukose mit einer Aminogruppe des Albumins und (b) eine Amadori-Umlagerung unter Bildung eines 1-Deoxyfructosyl-Kohlenhydrats, das kovalent an den Stickstoff der Aminogruppe gekoppelt ist. Das Albuminmolekül hat 60 potentielle Stellen (Aminogruppen) für eine nichtenzymatische Glykosilierung. Diese bestehen aus 59 epsilon-Aminogruppen von Lysinresten und einer alpha-Aminogruppe am N-Terminus des Proteins. Von den 60 potentiellen Stellen ist im nativen Molekül nur ein Lysin glykosiliert; andere Lysine können jedoch in verschiedenem Ausmaß glykosiliert sein. Das bekannte Lysin wurde als Lysin 525 identifiziert (die 525ste Aminosäure, beginnend vom N-Terminus des Proteins - Garlick et al, J. Biol. Chem. 258: 6142 (1983)) und die Position wurde bestätigt. Der Grund für die spezifische Glykosilierung dieses Lysins und die rasche Glykosilierungsgeschwindigkeit von Albumin ist nicht vollkommen klar. Die Spezifität für Lysin 525 ist wahrscheinlich auf (a) die Nähe eines benachbarten Lysins an Position 524 zurückzuführen, wodurch der pKa-Wert der epsilon-Aminogruppe des Lysins 525 erniedrigt wird, welches es reaktiver bei der Glykosilierungsreaktion macht, sowie (b) auf die Freilegung der Lysin 525-Seitenkette In einer wäßrigen Umgebung des Albuminmoleküls und/oder (c) die dreidimensionale Struktur des Albuminmoleküls, welche durch einen unbekannten Mechanismus die Reaktivität des Lysins 525 für die Glykosilierungsreaktion steigert.
Man weiß, daß monoklonale Antikörper eine präzise Spezifität für eine Bindung an einer Vielzahl von organischen Verbindungen einschlißlich synthetischer Peptide aufweisen. Trotz dieser Technik und dem bestehenden Bedürfnis für einen Immuntest gegen Glykoalbumin wurde noch von keinem Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern berichtet, die zur Bestimmung von Glykoalbumin geeignet sind.
Die folgenden Definitionen werden im folgenden im Hinblick auf die Aminosäureeinheiten in den Peptiden verwendet: Definitionen Aminosäure Abkürzung Arginin Asparaginsäure Glutaminsäure Lysin Serin Asparagin Glutamin Glycin Prolin Threonin Alanin Histidin Cystein Methionin Valin Isoleucin Leucin Aminesäure Abkürzung Tyrosin Phenylalanin Tryptophan alpha-Aminobuttersäure
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Antikörper zur Verfügung zu stellen, die spezifisch für die Bindung an Glykoalbumin sind, und welche als Basis für einen Immuntest zur Bestimmung von Glykoalbumin in menschlichen Blutproben dienen können. Es besteht ein dringendes, nicht gelöstes Bedürfnis nach einem solchen Immuntest, welcher ein relativ einfaches und verläßliches Mittel zur Diagnose der Diabetes liefern würde.
Es ist insbesondere eine Aufgabe der Erfindung, monoklonale Antikörper zu erzeugen, die spezifisch an Humanalbumin binden, das am Lysinrest an Position 525 glykosiliert ist, d. h. die 525ste Aminosäure der Peptidkette, gezählt vom Ende mit der freien N-terminalen Aminogruppe. Im folgenden bedeutet eine glykosilierte Aminosäure eine Aminosäure mit einer Aminogruppe, die mit einem Deoxyfructosylrest durch eine nichtenzymatische Reaktion mit Glukose modifiziert wurde.
Die Erfindung stellt eine Lösung dieser und anderer Aufgaben zur Verfügung und bietet den Vorteil, daß ein Verfahren zur Gewinnung somatischer Zellhybridomas zur Verfügung gestellt wird, die monoklonale Antikörper mit der erwünschten Glykoalbumininspezifität ausscheiden. Solche Hybridomas werden aus üblichen Fusionsprodukten von Myelomazellen mit Lymphozyten aus einem Tier, vorzugsweise einer Maus, gebildet, die mit einem Immunogen immunisiert worden ist, welches ein geeignet glykosiliertes, chemisch an ein immunogenes Trägermaterial gebundenes Peptid enthält. Das glykosilierte Peptid im Immunogen wird synthetisch oder durch Proteolyse erhalten und enthält zunächst einen Lysinrest, dessen Aminogruppe nicht-enzymatisch glykosiliert ist, und zweitens mindestens eine weitere Aminosäureeinheit in einer Position, die der Peptidseguenz des Humanalbumins benachbart zum Lysinrest an Position 525 entspricht. Demzufolge bindet der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper an einen glykosiliertes Peptidrest der Formel:
worin Glyko-(NH) eine nichtenzymatisch glykosilierte epsilon-Aminogruppe im Lysinrest darstellt und AA&sub1; und/oder AA&sub2; eine Sequenz von Aminosäuren ist, vorzugsweise mit 1 bis 12 Aminosäuren, worin mindestens eine und vorzugsweise alle Aminosäureeinheiten in der Position entsprechend der Peptidsequenz des Humanalbumins benachbart an Lysin 525 sind, und falls nur AA&sub1; oder AA&sub2; eine solche Sequenz ist, dann ist das andere eine Bildung, eine terminale Amino- oder Carboxylgruppe oder zusätzliche Aminosäurereste.
Zusätzlich zu den oben genannten monoklonalen Antikörpen, einschließlich Fragmente davon, die eine Antikörperbindungsstelle enthalten, den Hybridomazell-Linien, die solche Antikörper ausscheiden, dem Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antokörper aus solchen Zell-Linien und dem Verfahren zur Gewinnung der Zell-Linien und der Immunogene zur Verwendung in einem solchen Verfahren, stellt die vorliegende Erfindung auch ein Immuntestverfahren zum Nachweis von Glykoalbumin in einer menschlichen Blutprobe wie z. B. Vollblutserum oder Plasma, zur Verfügung. In dem Verfahren wird die Blutprobe mit einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon in Kontakt gebracht. Wo es notwendig oder erwünscht ist, wird die Blutprobe zuerst zur Denaturierung behandelt oder in sonstiger Weise um das Epitop am Lysin 525 in einer wesentlichen Menge von in der Probe vorhandenen Glykoalbumin freizulegen. Anschließend wird die Bindung des Antikörperreagens an Glykoalbumin aus der Probe nach einem üblichen Immuntestprotokoll als Funktion der Menge des Glykoalbumins in der getesteten Probe bestimmt. Die vorliegende Erfindung stellt auch neue und geeignete Peptide und glykosilierte Formen davon zer Verfügung, die synthetisch hergestellt oder durch Proteolyse von Glykoalbumin oder nicht-glykosiliertem Albumin gewonnen werden, die als Peptidreste im Immunogen oder als Vorläufer davon dienen können.
Fig. 1 und 2 der Zeichnungen erläutern einige der bevorzugten glykosilierten Peptidfragmente oder Reste, die an übliches immunogenes Trägermaterial unter Bildung eines Immunogens gebunden werden können, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Strukturen (1) und (2) zeigen die Teilsequenz von Glykoalbumin in der Region des Lysins 525 und die Schnittstellen für die proteolytischen Enzyme Trypsin (gefüllte Dreiecke) und V8-Protease (offene Dreiecke). Das Sternchen über Lysin 525 kennzeichnet die Stelle der in vivo-Glykosilierung. Strukturen 3 bis 12 zeigen Peptidfragmente, die synthetisch hergestellt werden können. Die Sternchen an den anderen Stellen als Lysin 525 kennzeichnen die Stellen von einer zusätzlichen potentiellen Glykosilierung während der in vitro-Synthese. Die Sequenzen verlaufen in den Zeichnungen wie auch in der ganzen Beschreibung vom N-Terminus auf der linken bis zum C-Terminus auf der rechten Seite. Nähere Einzelheiten und Erklärungen sind in den folgenden Beispielen gegeben.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper ist im wesentlichen charakterisiert durch seine Spezifität zur Bindung an die glykosilierte Peptidsequenz in der Region des Lysin 525 im Humanalbumin. Dieser glykosilierte Rest ist das kennzeichnende Strukturmerkmal des Glykoalbumins. Ein erfindungsgemäßer Antikörper erfordert ein Epitop oder oder Determinante, welche mindestens die 1-Deoxyfructosyl-modifizierte Lysineinheit, gebildet nach Amadoriumlagerung des Reaktionsproduktes zwischen Glukose und der epsilon-Aminogruppe im Lysin, und eine Peptidsequenz, die davon ausgeht und mindestens eine der Aminosäureeinheiten in der Position entsprechend der Glykoalbuminsequenz benachbart zum Lysin 525 enthält. Die anderen Arninosäureeinheiten in der Peptidsequenz, die das Epitop charakterisieren, können die gleich oder verschieden sein, als solche, die in der nativen Glykoalbuminsequenz auftreten. Auf diese Weise wird das Epitop dadurch charakterisiert, daß es aus einem Kohlenhydrat und einer Peptidsequenz besteht, an welche der Antikörper bindet, und wie sie bei der glykosilierten Lysin 525-Sequenz im Glykoalbumin vorkommt. Vorzugsweise bindet der Antikörper spezifisch an ein glykosiliertes Peptidrest der Formel:
worin Glyko-(NH), AA&sub1; und AA&sub2; dieselben Bedeutungen wie oben haben. Es ist mindestens erforderlich, daß wenigstens eine der Aminosäuresequenzen AA&sub1; und AA&sub2; eine Aminosäure in einer Position entsprechend der Sequenz im Glykoalbumin um das Lysin 525 herum enthalten, um die Antikörperbindung für die Glykosilierung am Lysin 525 im Gegensatz zu anderen glykosilierten Lysineinheiten im Glykoalbumin oder irgendeinem anderen Protein oder Peptid, das in der Probe vorkommen kann, spezifisch zu machen. Vorzugsweise hat AA&sub1; und-oder AA&sub2; eine Sequenz von 1 bis 12 Aminosäuren, welche genau der Peptidsequenz benachbart dem Lysinrest an Position 525 im Glykoalbumin entspricht.
Die Sequenz des Glykoalbumins einschließlich von 12 Aminosauren an beiden Seiten des Lysins 525 ist wie folgt (in der Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus):
Besonders bevorzugt bindet der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper spezifisch an die Peptidreste der obigen Formel (A), worin AA&sub1; und AA&sub2; ausgewählt sind aus den folgenden: oder eine Bindung, und
Erfindungsgemäß werden Hybridoma-Zellinien zur Produktion von Antikörpern nur gegen den glykosilierten Lysin 525-Teil des Albuminmoleküls anstelle des gesamten Proteins erzeugt und solche Zellinien und ihre Antikörper werden durchmustert, um diese monoklonalen Antikörper, die anschließend selektiv mit dem glykosilierten Lysin 525-Epitop reagieren, zu identifizieren und isolieren.
Um solche Antikörper herzustellen, wird ein Fragment der Proteinkette, die der natürlich vorkommenden glykosilierten Peptidsequenz entspricht, an einen Träger gekoppelt und in ein Labortier injiziert, um eine Immunantwort auszulösen. Lymphozyten, wie Milzzellen aus dem immunisierten Tier, werden mit Myelomazellen fusioniert, um Hybridomas herzustellen, die kultiviert und auf Produktion von monoklonalen Antikörpern durchmustert werden. Die monoklonalen Antikörper werden nach solchen durchmustert, welche selektiv für das glykosilierte Peptid-Epitop sind, und die bestimmte Zellinie wird zur Verwendung bei der Produktion weiterer Mengen des monoklonalen Antikörpers kloniert. Überblick über solche Techniken für monoklonale Antikörper finden sich in Lymphocyte Hybridomas, Melchers et al, Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266:495 (1977), Science 208:692 (1980) und Methods in Enzymology 73 (Teil B): 3-46 (1981).
Zur Herstellung eines geeigneten Immunogens zur Injektion an ein Labortier, z. B. BALB/c-Mäuse, Ratten oder ähnliche muß entweder ein glykosiliertes Albuminfragment hergestellt und aus natürlich vorkommendem menschlichen Albumin oder Glykoalbumin isoliert werden oder chemisch synthetisiert und gereinigt werden. Das glykosilierte Peptidframent und seine nichtglykosilierten Formen oder Vorläufer, die erfindungsgemaß geeignet sind, haben die Formel:
worin mindestens AA&sub1; und/oder AA&sub2; eine Sequenz von 1 bis 12 Aminosäuren aufweist entsprechend der Peptidsequenz benachbart zum Lysin 525 im Humanalbumin, und falls nur AA&sub1; oder AA&sub2; in einer solchen Sequenz vorkommt, ist das andere eine Bindung; worin q und t unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, worin R und S unabhängig voneinander 0, 1 oder 2 sind, worin QNH eine epsilon-Aminogruppe im Lysin darstellt und Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist, und worin die N-terminale Aminogruppe im (NH&sub2;)AA&sub1; und eine beliebige Lysin-Einheit im AA&sub2; oder AA&sub2; glykosiliert oder nichtglykosiliert sein kann. Vorzugsweise ist Q die einzige Glykosilierung im Fragment. Normalerweise ist t gleich 1, falls q Null ist und umgekehrt, und wenn q oder t Null ist, dann ist r oder s ebenfalls Null.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Glykoalbumin aus menschlichem Blut isoliert und mit einem geeigneten Proteaseenzym oder Enzyme unter Erhalt von Peptidfragmenten geeigneter Größe gespalten, die glykosiliertes Lysin 525 und benachbarte Aminosäuren enthalten. Da Albumin im wesentlichen gegenüber Proteolyse in seiner nativen Konformation beständig ist, ist es normalerweise erforderlich, das Protein in einem Ausmaß zu denaturieren, wie es nötig für die erwünschte Proteolyse ist. Die erhaltenen Glykopeptidfragmente werden nach üblichen Verfahren, wie Chromatographie auf Gelen mit einer selektiven Affinität für Kohlenhydratreste und Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) isoliert. Präparationen von nichtglykosilierten Peptidfragmenten durch Spaltung von nichtglykosiliertem Albumin und anschließende Glykosilierung der Fragmente ist ebenfalls möglich, jedoch offensichtlich viel weniger erwünschtenswert, da die potentielle Glykosilierung an Stellen zusätzlich zum Lysin 525, z. B. anderen Lysineinheiten und der N-terminalen Gruppen auftreten kann. Die bevorzugten glykosilierten Peptidfragmente, erhalten durch Proteolyse von humanem Albumin, sind:
worin Q 1-Deoxyfructosyl ist. Chemische Synthese kann ebenfalls eingesetzt werden, um Peptidfragmente mit der gewünschten Sequenz unter Verwendung im Handel erhältlicher Vorrichtungen zur Peptidsynthese herzustellen. Anschließend an die Peptidsynthese wird das erhaltene Peptid unter geeigneten Bedingungen glykosiliert, z. B. in glukosegesättigtem Pyridin oder glukosegesättigtem Pyridin : Essigsäure (1:1) für 48 h bei Raumtemperatur. Während einer solchen Glykosilierung können die N-terminale Aminogruppe und die epsilon-Aminogruppen aller Lysineinheiten im bestimmten Peptid einschließlich und zusätzlich zu derjenigen entsprechend dem Lysin 525 glykosiliert werden. Solche Glykosilierung kann in verschiedenem Ausmaß während der Immunisierung durch das Tier tolieriert werden, welches nichtspezifisch im Hinblick auf eine solche Glykosilierung reagiert, aufgrund der entfernten Glykosilierungsstelle oder seiner Orientierung im Peptidfragment, oder kann selektiv durch Proteasenspaltung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren, insbesondere der möglicherweise glykosilierten N-terminalen Aminosäure, entfernt werden. Die bevorzugten glykosilierten und nichtglykosilierten Peptidfragmente, hergestellt durch Peptidsynthese, sind:
worin Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist, AA&sub3; ist L s-Glu-Arg, Arg oder eine Bindung; AA&sub4; ist Cys oder eine Bindung; AA&sub5; ist Arg oder eine Bindung; AA&sub6; ist Gln-Ile-L s, Ile-L s, L s, oder eine Bindung; AA&sub7; ist Tyr-Tyr-Cys, Tyr-Cys, Cys oder eine Bindung; AA&sub8; ist Cys-Tyr-Tyr, Cys-Tyr, Cys oder eine Bindung; und worin die N-terminale Aminogruppe und jede L s-Einheit im Peptid glykosiliert oder nichtglykosiliert sind. Die am meisten geeigneten glykosilierten Peptide der obigen Formel besitzen als Q 1-Deoxyfructosyl und die N-terminale Aminogruppe und alle anderen Lys-Einheiten sind nichtglykosiliert.
Die bevorzugten nichtglykosilierten Vorläuferpeptide haben die Formeln:
Eine spezifischere Glykosilierung des Lysins entsprechend dem Lysin 525 wird durch Kombination einer Lösung/Fest-Phase-Peptidsynthese, gekoppelt mit alpha-aminoblockiertem epsilon-Amino-1-deoxyfructosyl-Lysin erreicht. Bei dieser Synthese wird AA&sub2;-(Tyr) -(cys) -(COOH) nach üblichen Verfahren hergestellt. Lysin (alpha-aminoblockiertes epsilon-Deoxyfructosyl-Lysin) wird getrennt davon hergestellt und wird unter Verwendung klassischer Lösungs-Phasen-Chemie an den Aminoterminus eines solchen Peptids unter Bildung
gekoppelt, worin B eine Schutzgruppe auf der alpha-Aminogruppe des Lysins ist wie z. H. t-Butyloxycarbonyl (t-BOC), Dinitrophenyl (DNP), p-Fluorenylmethoxycarbonyl (fMOC), oder eine andere geeignete Schutzgruppe, die ohne Veränderung des QHN-Lys (1-Deoxyfructosyllysins) entfernt werden kann. Die Schutzgruppe kann nach ausgewählten chemischen Verfahren entfernt werden (entsprechend der bestimmten Schutzgruppe), die nicht die 1-Deoxyfructosylstruktur des Lysins verändert. Dieses Peptid kann direkt als Immunogen oder in einem Immuntest verwendet werden oder kann durch Zusatz von NH&sub2;-(Cys)q-(Tyr)r-AA&sub1; unter Bildung von
verlängert werden. Der Zusatz kann durch Verlängerung der Sequenz unter Verwendung klassischer Lösungs- oder Festphasenpeptidsynthese oder durch eine Segmentkondensation unter Bildung des Endprodukts erfolgen, worin zuvor gebildetes NH&sub2;-(Cys)q-(Tyr)r-AA&sub1; an QHN-Lys-AA&sub2;-(Tyr)s-(Cys)t-(COOH) kondensiert wird.
Die Einführung von terminalen Cys-Einheiten ermöglicht die selektive Kopplung des Peptids an immunogene Trägermaterialien, z. B. durch bekannte bifunktionelle Bindungsagentien, z. B. m-Maleinimidobenzoyl-N-sulfosuccinimidester (MBS). Wahlweise können die Peptidfragmente durch die C-terminale Carboxylgruppe unter Verwendung üblicher Peptidkondensationsverfahren, z. B. mit Carbodiimidkopplungsreagentien gekoppelt werden. Andere üblichen Verknüpfungsverfahren können ebenfalls eingesetzt werden.
Es ist ebenfalls im allgemeinen bevorzugt, eine, zwei oder mehr Tyr-Einheiten entweder als terminale Einheiten auf dem Peptid oder benachbart zur albuminspezifischen Sequenz und/oder der terminalen Aminosäure zur Verwendung für die Kopplung des Peptids an ein immunogenes Trägermaterial, z. B. benachbart zu einer terminalen Cys-Einheit, einzuführen. Das Vorliegen von Tyr-Einheiten in der nichtspezifischen Region des Peptidrests soll die Immunogenität der glykosilierten spezifischen Region des Peptids erhöhen, wodurch eine Antikörperantwort stimuliert wird.
Daher beginnen die besonders bevorzugten Ausführungsformen AA&sub1; und AA&sub2; in den hier gezeigten Formeln mit der Sequenz Cys-(Tyr)r- und enden mit der Sequenz -(Tyr)s-Cys, worin r und s ganze Zahlen von 1 bis 10 oder mehr, vorzugsweise 1 oder 2, sind.
Das zur Stimulation der entsprechenden Immunoglobulinproduktion verwendete Immunogen im allgemeinen Sinne umfaßt ein oder mehr glykosilierte Peptidreste, die chemisch an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind. Die allgemeine Formel für ein solches Immunogen ist:
worin Glyko-(NH), AA&sub1; und AA&sub2; dieselben Bedeutungen wie oben haben vorausgesetzt, daß AA&sub1; und AA&sub2; terminale Amino- oder Carboxylgruppen sein können, wenn m oder n Null ist; R ist eine Bindung oder eine Verbindungsgruppe; der Träger ist ein immunogenes Trägermaterial; m ist 1 und n ist Null oder umgekehrt; und p hat einen mittleren Wert von 1 bis zur Anzahl der verfügbaren Kopplungsstellen auf dem Träger. Die Reste AA&sub1; und AA&sub2; können Tyr- und Cys-Einheiten wie oben dargestellt umfassen.
Das immunogene Trägermaterial kann ausgewählt sein aus üblichen bekannten Materialien mit funktionellen Gruppen, die zur Kopplung des glykosilierten Peptidrests zur Verfügung stehen. In den meisten Fällen wird das Trägermaterial ein Protein oder Polypeptid sein, obwohl andere Materialien wie Kohlenhydrate, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nukleinsäure und ähnliche von ausreichender Größe und Immunogenität in gleicher Weise eingesetzt werden können. Meistens haben die immunogenen Proteine und Polypeptide ein Molekulargewicht zwischen 4.000 und 10.000.000, vorzugsweise größer als 15.000 und besonders bevorzugt größer als 50.000. Im allgemeinen sind Proteine aus einer Tierart immunogen, wenn sie in den Blutstrom einer anderen Art eingeführt werden. Besonders geeignete Proteine sind Albumine, Globuline, Enzyme, Hemocyanine, Gluteline, Proteine mit wesentlichen nichtproteinösen Bestandteilen und Ähnlichem. Als weiterer Verweis auf den Stand der Technik betreffend übliche immunogene Trägermaterialien und Verfahren zur Kopplung von Haptenen daran soll dienen: Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey USA, 1976); Butler, J. Immunol. Meth. 7:1-24(1976); Weinryb and Shroff, Drug Metab. Rev. 10:271-283(1974); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22:726-732(1976); und Playfair et al, Br. Med. Bull. 30:24-31(1974).
Der Buchstabe p in Formel (C) gibt die Anzahl der glykosilierten Reste wieder, die an dem Träger konjugiert sind, d. h. die Epitopendichte des Immunogens, und liegt im Bereich von 1 bis zur Anzahl der zur Kopplung auf dem Träger zur Verfügung stehenden Stellen, und kann bis 5000 hoch sein im Falle eines synthetischen Polypeptids von hohem Molekulargewicht sowie z. B. Polylysin. Die Epitopendichte auf einem bestimmten Träger hängt vom Molekulargewicht des Trägers und der Dichte der zur Verfügung stehenden Kopplungsstellen ab. Optimale Epitopendichten im Hinblick auf die Leichtigkeit und die Wiederholbarkeit der Synthese des Immunogens und der Immunantwort liegen im Bereich von ca. 10 % und 50 % der zur Verfügung stehenden Kopplungsgruppen auf dem Träger.
Die Verbindungsgruppe R kann im wesentlichen jede übliche und stabile Struktur sein. Eine solche Verbindungsgruppe R wird im allgemeinen als Bindung oder als aliphatische Kette, enthaltend zwischen 1 und 20 Atomen ausschließlich Wasserstoff und einschließlich Heteroatomen wie Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, vorliegen. Der glykosilierte Rest kann durch eine Vielzahl von Gruppen unter Ausbildung einer Bindungsgruppe R verbunden werden, einschließlich Methylen, Ether, Thioether, Imino und Ähnlichem. Dem Fachmann steht eine große Anzahl von Verbindungsgruppen zur Verfügung, aus denen er für die Herstellung des Immunogens auswählen kann. Normalerweise wird das glykosilierte Peptid hergestellt, so daß es in einer funktionellen Gruppe wie einer Amino-, Carboxyl-, Thio-, Hydroxyl- oder Maleinimidogruppe endet, die für eine Kopplungsreaktion an eine geeignete Gruppe auf dem Trägermolekül aktiv ist.
Insbesonders bevorzugte Immunogene der Formel (C) sind solche, worin:
(a) AA&sub1; eine terminale Aminogruppe ist, AA&sub2; ist Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu-Leu-Val-Cys, m ist Null und n ist 1;
(b) AA&sub1; ist (NH&sub2;)Arg-Gln-Ile-Lys, AA&sub2; ist Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Glu, m ist Null, und n ist 1;
(c) AA&sub1; ist (NH&sub2;)L s-Glu-Arg-Gln-Ile-L s, AA&sub2; ist Gln-Thr-Ala-Leu-Val-Tyr-Cys, m ist Null, und n ist 1;
(d) AA&sub1; ist Cys-Glu-Arg-Gln-Ile-L s und AA&sub2; ist Gln-Thr-Ala-Leu(COOH), m ist 1 und n ist Null; worin L s eine glykosilierte oder nichtglykosilierte Lysineinheit ist;
(e) AA&sub1; ist Gln-Ile-Lys, Ile-Lys, Lys oder eine terminale Aminogruppe, AA&sub2; ist Gln-Thr-Ala-Leu-Tyr-Tyr-Cys, m ist Null, und n ist 1;
(f) AA&sub1; ist Cys-Tyr-Tyr-Arg-Gln-Ile-Lys, AA&sub2; ist Gln-Thr, m ist 1, und n ist Null.
Der zur Verwendung im Immuntest ausgewählte Antikörper kann jeder beliebigen Immunoglobulinklasse zugehören z. B. IgG, IgM usw. und jeder der zugehörigen Unterklassen. Normalerweise wird der Antikörper aus der IgG-Klasse stammen, und falls erwünscht, ein Fragment eines solchen Antikörpers sein, welches eine Antikörperbindungsstelle, z. B. Fab, F(ab') und F(ab')&sub2;, enthält. Das ausgewählte Antikörperreagens kann in einem beliebigen Immuntestverfahren zur Bestimmung des Glykoalbumins in einer biologischen Flüssigkeit verwendet werden. Solche Immuntestverfahren umfassen die klassischen Techniken wie Immundiffusion, Immunelektrophorese, Agglutinationsverfahren und Komplementfixierung wie auch modernere Techniken, die die Verwendung von spezifisch nachweisbaren Markierungen, wie den Radioimmuntest und Nichtradioisotopenverfahren, umfassen. Die letzteren Techniken können in einer Vielzahl von Formaten eingesetzt werden, wie z. B. dem Verdrängungs-Bindungs-Format, bei welchem ein markiertes Reagens hergestellt wird, welches mit dem glykosilierten Analyten zur Bindung an das Antikörperreagens konkurriert. Die Menge des an das Antikörperreagens gebundenen markierten Reagenses oder die freie Spezies, die aus einem markierten Reagens besteht, welches nicht gebunden ist, wird in geeigneter Weise gemessen und kann mit der Menge des glykosilierten Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt werden. Bei Radioimmuntests muß die freie Spezies und die gebundene Spezies physikalisch voneinander unterscheidbar sein oder getrennt sein, um die Messung der Markierung zu erlauben, da das von der Markierung erzeugte Signal qualitativ dasselbe in beiden Spezien ist. Eine solche Technik ist als Heterogen bekannt, da sie eine Phasentrennung erfordert. Man kennt andere heterogene Immuntestverfahren einschließlich enzymmarkierten Immuntests, manchmal als ELISA-Techniken bezeichnet (s. U.S.-Patent Nr. 3,654,090) und Fluoreszenzimmuntests (s. U.S.-Patent Nr. 4,201,763; 4,133,639 und 3,992,631), insbesondere Partikelkonzentrations-Fluoreszenztests (s. offengelegte europäische Patentanmeldung 124,050).
In jüngster Zeit sind eine Anzahl von Immuntestverfahren entwickelt worden, welche den Trennungsschritt durch Verwendung einer Markierung umgehen, deren nachweisbares Signal durch Bindung des markierten Reagenses durch einen Bindungspartner, z. B. einen Antikörper, moduliert wird. Solche Techniken sind als homogen bekannt und zeigen Vorteile bei Verwendung in der vorliegenden Erfindung, da keine Trennungen erforderlich sind und keine Radioisotope verwendet werden. Solche Techniken sind Fluoreszenzlöschung und -verstärkung (s. U.S.-Patent Nr. 4,160,016), Energietransferimmuntest (s. U.S.-Patent Nr. 3,996,345) und der doppel-Antikörper-Sterische Hinderungstest (s. U.S.-Patent Nr. 3,935,074 und 3,998,943). Besonders bevorzugt sind homogene Immuntestverfahren, die eine Markierung verwenden, welche in einer enzymkatalysierten Reaktion teilnimmt. Beispiele davon sind die substratmarkierten Immuntests (s. U.S.-Patent Nr. 4,279,992 und U.K. Patentanmeldung 1,552,607). Der Immuntest mit prosthetischer Gruppen(FAD)-Markierung (s. U.S.-Patent Nr. 4,348,565), der enzymmodulatormarkierte Immuntest, z. B. Verwendung von Inhibitorenmarkierungen (s. U.S.-Patent Nr. 4,134,972 und 4,273,866) und der enzymmarkierte Immuntest (s. U.S.-Patent Nr. 3,817,837).
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind spezifisch für die Bindung an den glykosilierten Peptidrest, der das Lysin 525 im Humanalbumin enthält. Es kann in einigen Fällen erforderlich sein oder es ist besonders erwünscht, zur Verbesserung der Testdurchführung und das glykosilierte Lysin 525-Epitop im nativen Albuminmolekül freizulegen, um den erwünschten Immuntest durchzuführen. Sterischer Zugang zum Epitop kann nach jeder geeigneten Methode erreicht werden. Freilegung des Epitops im intakten Protein wird erreicht durch eine physikalische oder chemische Denaturierung oder Verdauung von mindestens einer Region des Epitops. Solche Denaturierung oder Verdauung kann auf eine Region des Epitops beschränkt sein oder eine allgemeinere oder im wesentlichen komplette Denaturierung der Tertiärstruktur und zusätzlich der Sekundärstruktur des Proteins, oder teilweise oder gesamte Verdauung des Proteins umfassen.
Falls notwendig oder erwünscht, kann die Denaturierung nach einer Vielzahl von Verfahren einschließlich üblicher Behandlung des Proteins durch physikalische Mittel wie z. B. Hitze, Ultraschall, hohem oder niedrigem pH, und bevorzugt chemische Denaturierung durch Wechselwirkung mit einem chaotropischen Agens oder Chaoptrop in Lösung erreicht werden. Geeignete chaotropische Mittel umfassen normalerweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Guanidin, Harnstoff und eine Reihe von Detergentien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und andere, ohne Beschränkung, einschließlich Deoxycholat und bestimmte Gallensalze, 3-(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium-1-propansulfonat, organische Lösungsmittel wie Methanol, Propanol, Acetonitril und bestimmte Salze wie Kaliumthiocyanat. Nichtionische Detergentien wie Triton X-100, Nonidet NP-40 und Octyl-glykoside können auch als Mittel zur Proteindenaturation eingesetzt werden. Zugabe von Reagentien (z. B. Mercaptoethanol oder Dithiothreitol), die Disulfidbindungen reduzieren, kann zur wirksamen Beschleunigung des Denaturierungsprozesses führen. Die Proteindenaturierung kann besonders wirksam durchgeführt werden, wenn eine Kombination von chemischen und/oder chemischen und physikalischen Mitteln eingesetzt werden (z. B. Guanidin und Hitze, Guanidin und SDS, oder Guanidin und Dithiothreitol). Natürlich müssen solche Denaturierungsbedingungen, die zu einer wesentlichen Insolubilisierung, Aggregation oder Präzipitation des Proteins in einer Weise führen, daß nur eine unwesentliche Menge des freigelegten Epitops in der Lösung für die Antikörperbindung zugänglich ist, vermieden werden. Eine ausreichende Menge des denaturierten Proteins muß in der Lösung oder Suspension verbleiben, um eine geeignete Immunbehandlung zu erreichen. Das Ausmaß der notwendigen Solubilisierung hängt von den Umständen der erwünschten oder beabsichtigten Bindung ab.
Die Erfindung wird im folgenden durch Beispiele erläutert, die jedoch nicht beschränkend ausgelegt werden sollen.

Beispiel 1: Isolierung von natürlich vorkommendem Albumin und Glykoalbumin

Vollblut aus einem gesunden menschlichen Spender wurde in einer Citratdextroselösung gesammelt und in rote Blutkörperchen und Plasma durch Zentrifugation getrennt. Die Plasmafraktion wurde auf einer 100 ml-Boronat-Agarosesäule (Glykogel, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) in 0.25 M Ammoniumacetat, 50 mM MgCl&sub2;, pH 8,0, chromatographiert. Die gebundene Fraktion (enthaltend primär Glykoalbumin und Immunoglobulin) wurde mit 0,1 M Tris, 0,2 M Sorbitol, 10 mM EDTA, pH 8,0, eluiert. Um das Glykoalbumin von dem Immunoglobulin abzutrennen, wurden die gebundenen Fraktionen in 50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, dialysiert und auf eine 100 ml DEAE Affi-Gel-Blue-Säule (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) aufgegeben. Die Säule wurde mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, mit einem Gradienten von Null bis 1,4 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde bei 280 nm getestet und das Glykoalbumin durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese identifiziert. In einigen Experimenten wurde das Plasma auf DEAE-Affi-Gel Blue vor der Glykogelsäule chromatographiert. Die Reihenfolge der Trennung hat keinen Einfluß auf die endgültige Reinheit des Albumins oder Glykoalbumins.
Nichtglykosiliertes Albumin wurde nach der Trennung auf der DEAE-Affi-Gel-Blue-Säule wie oben aus der am Glykogel nicht gebundenen Fraktion gereinigt. Das Albumin und Glykoalbumin wurden in Phosphatpuffer-gepufferten Salzlösung (PBS, 7,2 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 2,8 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 127 mM NaCl, pH 7,4) dialysiert, die 0,05 % Natriumazid enthielt, lyophilisiert und zur weiteren Verwendung bei -80ºC aufbewahrt.

Beispiel 2: Erzeugung und Isolierung von enzymatisch gespaltenen Glykopeptiden aus dem Glykoalbumin

Humanes Serumalbumin hat 59 Lysinreste, von denen eines die Haupt- Stelle der Glykosilierung im nativen Molekül ist. Zur Herstellung eines Peptids, welches das glykosilierte Lysin an Stelle 525 enthält, wurde die bekannte Proteinsequenz des Albumins verwendet, gekoppelt mit der einheitlichen Spezifität der beiden Proteasen Trypsin und Staphylococcus aureus V8-Protease. Trypsin spaltet die Peptidbindung auf der Carboxyseite des Lysins und Arginins, jedoch nicht auf der Carboxyseite eines glykosilierten Lysins. Staph V8 spaltet auf der Carboxyseite von Asparaginsäure und Glutaminsäure. Daher sollte eine tryptische Verdauung oder eine V8-Verdauung die entsprechenden Peptide liefern, die das glykosilierte Lysin an Position 525 [s. Strukturen (1) und (2) in der Zeichnung - die gefüllten und die offenen Dreiecke bedeuten die Spaltungsstellen für Trypsin und V8-Protease] enthalten.
In seiner nativen Konformation ist Albumin im wesentlichen gegen Proteolyse beständig. Zur Optimierung der Freilegung des Proteins für eine Protease wurde das Glykoalbumin in 8 M Harnstoff, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 7,85, 2 h bei Raumtemperatur denaturiert. Die denaturierte Proteinlösung wurde langsam zu 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 7,85 gegeben, die ein Verhältnis von 1:50 an Protease zu Protein gegen (Enzymgewicht : Glukoalbumingewicht) enthielt. Die erhaltene Endkonzentration an Harnstoff ist 0,8 M, und die Lösung wird bei 37ºC 16 h stehengelassen. Anschließend wird Enzym (äquivalent zum Gewicht der ersten Zugabe) zugegeben und die Lösung 8 h inkubiert. Die Lösung wird auf eine Boronat Affi-Gel 601-Säule (BioRad, Richmond, CA, USA) aufgegeben, um die kohlenhydrathaltigen Peptide selektiv zu binden. Die Säule wird sorgfältig mit 50 mM Ammoniumbicarbonat gewaschen und die gebundenen Peptide mit 0,1 M Essigsäure eluiert. Die eluierten Peptide werden getrocknet, in 20 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, resuspendiert und auf eine Altex-ODS (4,1 mm x 25 cm) HPLC-Säule (Rainin, Emeryville, CA, USA) aufgegeben. Ein Gradient von 1 % Acetonitril/min bis zu einer Endkonzentration von 60 % Acetonitril im obigen Puffer wurde verwendet, um die gebundenen Komponenten zu eluieren. Die Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet und unter Argon 24 h in 6 N HCl, enthaltend 0,02 % Phenol, hydrolysiert. Die Hydrolysate wurden getrocknet und analysiert unter Verwendung einer OPA-Vorsäulenderivatisierung (Benon and Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. 72:619-622, 1975) und Trennung der Aminosäure-OPA-Addukte auf einer HPLC C-18-Säule (Supelco, Bellefonte, PA, USA) analysiert. Die Aminosäuren wurden durch Vergleich mit bekannten Standards identifiziert und quantifiziert (Standard H; Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). Die erwarteten und die gefundenen Werte für die tryptischen und V8-Peptide sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Staph VI-Proteasepeptid Aminosäure erwartet gefunden Tryptisches Peptid Aminosäure erwartet gefunden

Beispiel 3: Kopplung von proteolytisch gespaltenen Glykopeptiden an ein Trägerprotein

Die C-terminale Carbonsäure wurde selektiv aktiviert und an Amine von Trägerproteinen gekoppelt (Cell 34:587-596, 1983). 2 mg EDCI (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, Pierce Chemical Co.) in 200 ul 0,01 N HCl wurden zu 2 mg des trockenen Glykopeptids aus Beispiel 1 zugegeben. Diese Lösung wurde schnell zu 6 mg Keyhole-Limpet-Hemocyanin (KLH) in 2 ml H&sub2;O gegeben, was zu einem Präzipitat führte. Der pH der Lösung wurde auf 9, 0 mit 0,1 M Ammoniumcarbonat erhöht. Es wurde 3 h gerührt und anschließend gegen PBS dialyisiert. Der Thiobarbitursäuretest (Fluckinger und Wintehralter, FEBS Letters 71:356-350, 1976) deutete auf mindestens 2 Kohlenhydrate/100,000 MG von KLH unter Verwendung von Fructose als Standard hin.

Beispiel 4: Chemische Synthese von Albuminpeptiden

(a) Peptide wurden auf dem Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) synthetisiert.
Die carboxylterminale Aminosäure wurde an das Harz durch Phenylacetamidomethylbindung mit einer Substitution von 0,7 mM pro Gramm Harz gekoppelt. Typischerweise wurde 0,5 mMol Peptid pro Synthese hergestellt. Das N-terminale t-BOC wurde mit 60 %iger Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) entfernt und das alpha-Amin mit 10 %igem Diisopropylethylamin in Dimethylformamid (DMF) neutralisiert. t-BOC-Aminosäuren (2 mMol) wurden in vorgebildete synthetische Anhydride durch Zusatz von 1 mMol Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml Dichlormethan umgewandelt. Die Seitenketten der t-BOC-Aminosäuren wurden wie folgt geschützt Arg(TOS), Asp(OBzl), Cys(4-CH Bzl), Glu(OBzl), His(TOS), Lys(Cl-Z), Ser(Bzl), Thr(Bzl) and Tyr(Br-Z). Die t-BOC-Aminosäuren Ala, Asn, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp und Val wurden nicht geschützt. Das Dicyclohexylaminsalz von t-BOC-L-His(Tos) wurde in die freie Säure durch Ionenaustausch auf einem AG-50-X8(H+)-Harz (Bio-Rad) innerhalb einer Stunde für die Kopplung umgewandelt. Die t-BOC-Aminosäure Asn, Arg und Gln (2 mMol) wurden unter Verwendung von vorgebildeten Hydroxybenztriazol (HOBt) aktiven Estern, gebildet durch Addition von 2 mMol HOBt und 2 mMol DCC, gekoppelt. Das N-terminale t-BOC wurde vom fertigen Peptid entfernt und der Peptidrest über Nacht im Vakuum getrocknet.
Die Peptide wurden voll von ihren Schutzgruppen befreit und vom Harz durch Behandlung mit wasserfreien HF-haltigen 10 %igen Anisol 60 min bei 0ºC gespalten. Das Harz wurde mit Ethylacetat gewaschen und das Peptid aus dem Harz mit 1,0 N Essigsäure extrahiert. Der Extrakt wurde unmittelbar in flüssigem Stickstoff gefroren, lyophilisiert und bei -20ºC bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

(b) ALB K14C

LYS-GLU-ARG-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-TYR-CYS

Dieses 14-aminosäurehaltige Peptid hat eine Albuminsequenz von 12-Aminosäuren mit TYR als vorletzte Aminosäure und einem C-terminalen CYS. Die Sulfhydrylgruppe des CYS kann selektiv an Träger- oder Fluoreszenzreagentien (s. Beispiele 6 und 9) gekoppelt werden. Während der in vitro-Glykosilierung ist es wahrscheinlich, daß die N-terminale und die epsilon-Aminogruppen des N-terminalen Lysins glykosiliert werden [s. Struktur (3) in der Zeichnung). Jedoch, proteolytische Verdauung mit V8 entfernt das terminale LYS-GLU oder Verdauung mit Trypsin entfernt das terminale LYS-GLU-ARG, was zu einem kürzeren Peptid führt, welchem das möglicherweise glykosilierte N-terminale Lysin fehlt.

(c) ALB C11L

CYS-GLU-ARG-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU

Dieses Peptid hat 10 Aminsäuren der Albuminsequenz plus ein N-terminales CYS zur selektiven Kopplung. Die N-terminale Aminogruppe des CYS ist wahrscheinlich glykosiliert, da sie jedoch dem Träger oder der Markierung am nächsten ist, sollte sie keinen Effekt auf die Produktion von gegen Glykoalbumin spezifische Antikörper ausühen [s. Struktur (4) in der Zeichnung]. Diesem Peptid fehlen die C-terminalen hydrophoben Aminosäuren VAL und TYR, und es hat eine bessere Löslichkeit in wäßrigen und Pyridinpuffern.

(d) ALB Q12C

GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-GLU-LEU-CYS

Dieses Peptid hat 11 Aminosäuren der Albuminsequenz plus ein C-terminales CYS zur selektiven Kopplung, [s. Struktur (5) in der Zeichnung]. Das erwünschte Lysinepitop (525) liegt 4 Aminosäuren vom N-Terminus entfernt, welches seine Freilegung und Antigenität steigert.

(e) ALB R11E

ARG-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-GLU

Dieses Pepotid hat 11 Aminosäuren der Albuminsequenz [s. Struktur (6) in der Zeichnung]. Das N-terminale ARG kann unter Verwendung von Trypsin entfernt werden, falls die N-terminale Aminogruppe während der in vitro-Glykosilierung glykosiliert wird. Das erwünschte Lysinepitop (525) ist 4 Aminosäuren vom N-Terminus entfernt, was seine Freilegung und Antigenität steigert. Das Peptid ist ebenfalls in wäßrigen und Pyridinpuffern gut löslich.

(f) ALB Q9C

L S-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-GLU-LEU-VAL-CYS

N-t-BOC-L-Lysin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) wurde in 95 %igem Pyridin, 5 %iger Essigsäure oder 10 %igem Pyridin in mit Glukose gesättigtem absolutem Methanol, 7 Tage bei 50ºC inkubiert. Die Lösung wurde zu einem Sirup eingedickt und N-t-BOC-epsilon-1-deoxyfructosyllysin, HPLC-gereinigt auf einer C-18-Säule (Altex ODS, 4,1 mm x 25 cm) (Lösungsmittel A = 50 mM Triethylamin-acetat pH 6,0; Lösungsmittel B = A:Acetonitril 50:50). Das Produkt hat einen Rf von 0,81 auf Kieselgel unter Verwendung von Chloroform:Methanol:Essigsäure (14:5:1) und war nichtreaktiv gegenüber Amin-Nachweisreagentien, sofern es nicht kurzzeitig HCl-Dämpfen und einer Erwärmung auf 100ºC ausgesetzt wurde.
Das N-T-BOC-epsilon-1-Deoxyfructosyllysin wird an den N-Terminus des synthetisierten Peptids GLN-THR-ALA-LEU-VAL-GLU-LEU-VAL-CYS gekoppelt. Das Peptid hat acht Aminosäuren der Albuminsequenz plus ein C-terminales CYS zur Kopplung [s. Struktur (7) in der Zeichnung]. Im Anschluß an die Entfernung des t-BOC hat das erhaltene Peptid ein Lysin 525, welches nur an der epsilon-Aminogruppe glykosiliert ist. Zur Kopplung wird ein Äquivalent von t-BOC-epsilon-Deoxyfructosyllysin in Dichlormethan mit 0,5 Äquivalent Dicyclohexylcarbodiimid 15 min bei Raumtemperatur unter Argon umgesetzt. Ein gleiches Volumen von Dimethylformamid wird zugesetzt und anschließend 0,25 Äquivalent Mole des synthetisierten Peptids zugegeben. Nach 30 min wird die Lösung getrocknet, in 25 %iger TFA in Dichlormethan für 30 min resuspendiert, wiederum getrocknet und das Produkt über HPLC auf einer C-28-Säule gereinigt.

(g) Tryptische Kondensation des glykosilierten Produktes von ALB Q9C (AA&sub1;) with AA&sub2;.

Das N-terminale Verlängerungspeptid B-GLN-ILE-LYS wird in üblicher Weise durch Lösungs- oder Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Das HPLC-gereinigte Peptid wird mit TPCK-behandeltem Trypsin (Cooper Biomedical Malvern, PA, USA) in 30 %igem Isopropanol oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel (Fruton, Advances in Enzymology 53:239-306, 1981) inkubiert und eine äquimolare Menge LYS-GLN-THR-ALA-LEU-GLU-LEU-VAL-CYS (das Produkt aus Beispiel 4f) werden tugegegben. Nach 24 h wird das erhaltene Produkt B-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-VAL-GLU-LEU-VAL-CYS durch HPLC isoliert. Die terminale Schutzgruppe (B) kann durch Verfahren entfernt werden, die keinen Einfluß auf den 1-Deoxyfructosylrest am Lysin 525 haben.

(h) ALB Q7C

L S-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

Dieses Peptid wird in Experimenten verwendet, die analog zu solchen, wie für (f) ALB Q9C beschrieben, sind, wo das N-t-BOC-epsilon-1-Deoxyfructosyllysin an das N-terminale GLN unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid wie in (f) beschrieben, gekoppelt wird. Dieses Peptid (ALB Q7C) hat am C-Terminus eine TYR-TYR-CYS-Struktur, von der man glaubt, daß sie die Immunantwort gegen ein synthetisches Peptidimmunogen verstärkt. Die Kleinheit des Albuminteils der Sequenz (5 Aminosäuren) sollte ein Epitop von beschränkter Größe zur Verfügung stellen und daher die Immunantwort auf den glykosilierten Lysinrest fokussieren.

(i) ALB K8C

LYS-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

ALB K8C ist ein kleines Peptid, das das gewünschte glykosilierte Lysin am N-Terminus und die Nichtalbuminsequenz TYR-TYR-CYS am C-Terminus enthält. Dieses Peptid ist in 0,1 %iger TFA und absolutem Methanol sehr gut löslich, was eine Reinigung über HPLC und Glykosilierung in entsprechenden Lösungsmitteln erlaubt.

(j) ALB K9C

LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

ALB K9C entspricht den Eigenschaften von ALB K8C plus einem zusätzlichen Lysinrest am N-Terminus.

(k) ALB I10C

ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

ALB I10C hat die Eigenschaften von (j) ALB K9C mit einem zusätzlichen ILE-Rest am N-Terminus.

(l) ALB Q11C

GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR-ALA-LEU-TYR-TYR-CYS

ALB Q11C hat die Eigenschaften von (k) I10C mit einem zusätzlichen GLN-Rest am N-Terminus.

(m) ALB C10T

CYS-TYR-TYR-ARG-GLN-ILE-LYS-LYS-GLN-THR

ALB C10T wurde mit der Nicht-Albuminsequenz (CYS-TYR-TYR) am N-Terminus synthetisiert, um Antikörperbildung zu bevorzugen, die vorzugsweise an das glykosilierte Lysin und die C-terminale Sequenz dieses Peptids binden.

Beispiel 5: Glykosilierung synthetischer Peptide

Die vier synthetischen Peptide aus Tabelle 2 wurden wie aufgeführt glykosiliert. Das Q9C-Peptid wurde durch Glykosilierung wie in Beispiel 4(f) beschrieben hergestellt. Tabelle 2 (a) Pyridin, 0,25 M Glukose (b) 50 % Pyridin, 50 % H&sub2;O, 0,125 M Glukose (c) PBS, 1,0 M Glukose (d) 95 % Pyridin, 5 % Essigsäure 0,25 M Glukose, pH 7,0
Die Reaktionen wurden von Raumtemperatur bis 50ºC 1 bis 20 Tage durchgeführt. Die Proben wurden zu einem Sirup eingedickt und auf eine Altex C-18-Säule (1 x 25 cm) unter Verwendung eines 0,1 % TFA bis 0,1 % TFA, 60 % Acetonitril-Gradienten, aufgegeben. Die Peakfraktionen wurden gesammelt, auf Kohlenhydrat hin untersucht und zur Produktion von Glykopeptid-MBS-Trägerproteinimmunogenen eingesetzt.
Die nichtglykosilierten Peptide wurden ebenfalls auf KLH-MBS gekoppelt und anschließend in vitro in PBS, enthaltend 1,0 M Glukose (pH 9,5 oder 7,4) bei 37ºC 7 bis 14 Tage glykosiliert. Thiobarbitursäureanalyse lieferte einen Wert von 10 bis 40 Kohlenhydraten/100.000 MG KLH.
Peptide aus Beispiel 4 (i) bis (m) wurden bei erhöhten Temperaturen (50 bis 80ºC) 70ºC in glukosegesättigtem Methanol 24 h glykosiliert. Das Methanol wurde durch Niederdruck entfernt und das Glykopeptid über HPLC gereinigt. Es wurde gezeigt, daß dies eine sehr elegante Methode zur Anheftung der Glukose an Lysinaminogruppen in synthetischen Peptiden und an das N-t-BOC-L-LYSIN aus Beispiel 4 (f) ist.
Glykosilierung von N-t-BOC-L-LYSIN in glukosegesättigtem Methanol bei 50 bis 80ºC für 24 h war besonders erfolgreich. Die Sequenzanalyse (Beispiel 6 unten) identifizierte das Produkt (nach Entfernen der alpha-Aminoschutzgruppe) als epsilon-Deoxyfructosyl-Lysin. FAB-Massenspektroskopie lieferte das vorhergesagte Molekulargewicht des glykosilierten N-t-BOC-L-LYSIN-Derivats.

Beispiel 6: Sequenzanalyse zur Bestimmung der Position und der quantitativen Menge der glykosilierten Lysinreste

Es wurde ein Verfahren zur Bestimmung der Position und der quantitativen Menge der glykosilierten Lysinreste unter Verwendung automatisierter Gasphasen-Edman-Sequenzabbauverfahren entwickelt. Während üblicher Sequenzanalysen reagieren beide Aminogruppen auf dem Lysin mit PITC (Phenylisothiocyanat) unter Bildung eines Lysins mit einer PTC-Gruppe (Phenylthiocarbamyl) an der epsilon-Aminogruppe und einem PTH (Phenylthiohydantoin) an der alpha-Aminogruppe. Ein glykosiliertes Lysin hat jedoch keine PTC-Gruppe an der epsilon-Aminofunktion, da das Kohlenhydrat das Amin gegen die Reaktion mit PITC abblockt.
Das Lysinprodukt ist daher PTH-Lysin. Bei der Sequenzanalyse von natürlich vorkommenden Glykoalbuminpeptiden aus Beispiel 2 haben die Anmelder den PTH-Lysinrest identifiziert, da er eine ganz bestimmte Retentionszeit bei der Chromatographie auf der C-18-Umkehrphasensäule zeigt, die zur Trennung und quantitativen Bestimmung der verschiedenen PTH-Aminosäuren verwendet wurde. Alle glykosilierten synthetischen Peptide wurden sequenziert, um das bestimmte glykosilierte Lysin bei Mehrfachlysinpeptiden zu identifizieren und das Verhältnis von Lysin zu Glykolysin quantitativ zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, daß mehr als 75 % der Lysinreste die korrekte Glykosilierung am Lysin zeigen, wenn die Glykosilierung in Methanol durchgeführt wird.

Beispiel 7: Kopplung synthetischer Glykopeptide an Trägerproteine

Synthetische CYS-haltige Glykopeptide werden an Trägern gekoppelt wie von Lerner et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3403, 1981) beschrieben. Dabei wird KLH mit einem 50-fachen molaren Überschuß von Sulfo-MBS (Pierce Chemical Co.,) 25 min bei Raumtemperatur in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,2, umgesetzt und das KLH-MBS-Konjugat vom nichtumgesetztem Sulfo-MBS durch Gelfiltration im selben Puffer abgetrennt. Das KLH-MBS-Konjugat wurde sofort zu dem getrockneten Glykopeptid gegeben (2-facher molarer Überschuß von Glykopeptid zum Maleinimid des Trägers) und über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt.
Bei Peptiden, denen das CYS fehlt, wurde die C-terminale Carbonsäure an die Aminogruppen der Trägerproteine wie in Beispiel 3 beschrieben gekoppelt.

Beispiel 8: Immunisierung

Das ausgewählte Glykopeptid MBS-KLH-Konjugat aus Beispiel 7 wurde mit einem gleichen Volumen an Freund'schen kompletten Adjuvans emulgiert. Mäuse (BALB/cBy) wurden mit 200 ug Konjugat injiziert und nach 30 und 60 Tagen mit dem Konjugat in inkomplettem Adjuvans geboostet. Drei Tage vor der Fusion wurde den Mäusen 50 ug IV injiziert. Die Mäuse wurden getötet und ihre Milz zur Fusion nach Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975) verwendet.

Beispiel 9: Durchmustern der Habridoma-Überstände nach glykoalbuminspezifischen Antikörpern

(a) ELISA-Test

Albumin und Glykoalbumin aus Beispiel 1 wurden auf getrennte Polystyrolmikrotiterplatten (2 µg pro 100 ug/Vertiefung) über Nacht bei 4ºC beschichtet. Die Platten wurden mit PBS, 0,05 % Tween-20 gewaschen. Die Überstände aus jeder Zellinie wurden in Albumin- oder Glykoalbuminbeschichteten Platten 60 min inkubiert. Die Platten wurden viermal mit PBS + 0,05 Tween-20 und 200 ul eines Sekundärantikörpers, der in jede Vertiefung zugegeben wurde, gewaschen (1:2000-Verdünnung von Kaninchenanti-Maus-IgG-Peroxidase, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN, USA). Nach 60 min wurden die Platten viermal in PBS + 0,05 % Tween gewaschen und 200 ul der Substratlösung (24,3 mM Zitronensäure, 51,4 mM Natriumphosphat, pH 5,3, enthaltend 2,2 mM o-Phenylendiamin und 5,2 mM Wasserstoffperoxid) wurde zugegeben. Die Reaktion wurde nach 20 min durch Zugabe von 50 ul 8 M H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und das Produkt der Peroxidasereaktion bei 492 nm abgelesen. Die monoklonalen Antikörper, die für das Glykoalbumin spezifisch sind, reagieren mit dem Glykoalbumin und nicht mit Albumin.

(b) Partikelkonzentrationsfluoreszenzimmuntest

Albumin und Glykoalbumin wurden auf getrennte Polystyrolpartikel beschichtet (Pandex Laboratories, Mundelein, IL, USA). Hybridomaüherstände (20 ul) wurden in jede Vertiefung gegeben und anschließend 20 ul Albumin- oder Glykoalbumin-beschichtete Partikel. Nach 30 min wurde eine 1:5000-Verdünnung eines Ziege-anti-Maus-IgG-FITC (s. Beispiel 10) zugegeben und die Inkubation für weitere 30 min fortgesetzt. Die gesamten nichtgebundenen Reaktanten wurden durch Filtration entfernt und die Fluoreszenz gemessen. In einer spezifischen Antwort binden die Antikörper aus dem Hybridomaüberstand an Glykoalbumin, jedoch nicht an Albumin beschichtete Partikel.

(c) Partikelkonzentrationsfluoreszenzimmuntest mit vorhergehenden Dissoziation von Albumin/Glykoalbumin vom monoklonalen Antikörper

Ziege-anti-Mauspartikel (Pandex Laboratories) wurden mit Hybridomaüberständen inkubiert, um die Mausantikörper abzufangen. Einige Prozent der monoklonalen Mausantikörper binden an das natürlich vorkommende Glykoalbumin in den Zellkulturmedien, die zum Wachstum der Hybridomazellen verwendet werden. Nichtgebundene Komponenten werden durch Filtration abgetrennt, wodurch die Ziege-anti-Mauspartikel mit mausgebundenen Immunglobulinen aus den Hybridomazellen und umgekehrt Glykoalbumin, gebunden an das Mausimmunoglobulin zurückbleiben. Zwanzig (20) ul 100 mM Glycin, pH 3,0, wurde zugegeben, um alle Komplexe zu dissoziieren. Zwanzig Minuten später werden 20 ul 50 mM Tris-Base, die Fluoreszein-markiertes Glykoalbumin enthält, unter Verwendung von Sulphydryl-spezifischen Fluoreszein-5-maleinimid zugegeben. Der erhaltene pH-Wert von 7,5 renaturiert das Mausimmunglobulin, welches bevorzugt an den Überschuß des fluoreszenten Glykoalbumins bindet. Der mausimmunglobulinfluoreszente Glykoalbuminkomplex wird durch die vorhandenen Ziege-anti-Mauspartikel oder durch Zusatz von frischen Ziege-anti-Mauspartikel abgefangen. Die nichtgebundenen Reagentien werden durch Filtration entfernt und das Meßsignal ist proportional zu den Maus-anti-Glykoalbumin-Antikörpern im Hybridomaüberstand.

(d) Verbessertes Wachstumsmedium

Fetales Kalbsserum, das zur Haltung und zum Wachstum von Myelomazellen und Hybridomazellen verwendet wurde, hat eine signifikante Konzentration von Rinderalbumin und wahrscheinlich auch Glykoalbumin, von dem man weiß, daß es dieselbe Aminosäuresequenz wie Humanalbumin in der Umgebung des glykosilierten Lysins an Position 525 hat. Es ist daher hochwahrscheinlich, daß ein kleiner Anteil von Anti-Glykoalbumin-Antikörpern, die in das Gewebekulturmedium ausgeschieden werden, unmittelbar an die glykosilierten Albumininoleküle binden und nicht in einem Standard-ELISA- Test bestimmt werden können. Zur Eliminierung der Bindung von Antikörper an Glykoalbumin als dem Medium, werden Myelomazellen und Hybridomazellen an ein Wachstum in serum- (und albumin)-freien Medien gewöhnt. Die zur Zeit verwendeten Medien sind im Handel erhältlich (HL-1, Ventrex, Portland, Maine, USA). Das Durchmustern der Hybridomaüberstände im HL-1-Medium vereinfacht die Identifizierung von Klonen, die Antiglykoalbumin-Antikörper ausscheiden.

(e) Wachstum von Hybridomazellen in glykoalbuminhaltigen Medien

Wie in Beispiel 9 (d) beschrieben, verhindert das Vorliegen von Glykoalbumin im Medium den Nachweis auf Anti-Glykoalbumin-spezifische Antikörper. Es ist daher notwendig, Glykoalbumin aus dem Medium durch einen selektiven Adsorptionsprozeß zu entfernen. Dies wird bewerkstelligt durch selektive Bindung des Albumins und Glykoalbumins aus dem fetalen Kalbsserum durch Passage durch eine Affi-Gel-Blue-Säule, (BioRad Labs, Richmond, CA, USA), entsprechend der Gebrauchsanweisung. Die Albuminfraktion zeigt unter diesen Bedingungen eine Affinität für den blauen Reaktiv-Farbstoff und kann unter Verwendung von 1,4 M Natriumchlorid eluiert werden. Die eluierte Fraktion, die ca. 90 % Albumin und 10 % Glykolalbumin enthält, wird auf eine Glyko-Gel B (Boronatsäule - Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) aufgegeben. Diese Säule bindet selektiv Glykoalbumin. Die ungebundene Fraktion enthält Nichtglykoalbumin und wird zu den nichtgebundenen Fraktionen der Affi-Gel-Säule gegeben, die alle Serumkomponenten enthält außer Albumin. Die endgültige Mischung ist fetales Kalbsserum ohne Glykoalbumin und wird zur Herstellung von Medien für das Wachstum von Hybridomas, die Anti-Glykoalbumin-spezifische Antikörper produzieren, verwendet.

Beispiel 10: Fluoreszenzmarkierung synthetischer Glykopeptide

Die Glykopeptide können bequem unter Verwendung von sulfhydrylspezifischer Fluoreszeinkonjugate markiert werden. Ein zweifacher molarer Überschuß von Fluoreszein-5-maleinimid in Dimethylformamid (40 mg/ml) wird zum Glykopeptid (10 mg/ml) in 100 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, pH 7,1, gegeben. Die Probe wird 20 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das Glykopeptid-Fluoreszeinkonjugat wird über HPLC auf einer Altex C-18-4,1 mm x 25 cm-Säule unter Verwendung von 20 mM Natriumphosphat bis 20 mM Natriumphosphat, 50 % Acetonitril-Gradienten gereinigt.

Beispiel 11: Immuntest für Glykoalbumin in klinischen Proben

Glykoalbumin-spezifische Antikörper werden auf auf Polystyrolpartikel (0,8 um) (Pandex Laboratories) beschichtet. Antikörper-beschichtete Perlen (20 ul) werden mit einer geeigneten verdünnten Blutprobe inkubiert, z. B. 1:800. Die Probe kann Serum, Plasma oder Vollblut sein. Das Diluens kann in physiologischen Puffern oder in denaturierenden Lösungen vorliegen, die rote Blutkörperchen lysieren können und optimal das Glykoalbuminepitop freilegen. Anschließend an eine geeignete Inkubation (z. B. 5 min) wird synthetische. Glykopeptidfluoreszeinkonjugat (Beispiel 10) zur Bindung an unbesetzte Antikörperbindungsstellen auf den Partikeln zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation (z. B. 20 min) werden alle nichtgebundenen Reaktanten durch Filtration entfernt und das Fluoreszein quantitativ bestimmt. Das Fluoreszeinsignal ist daher invers proportional zur Menge des konkurrierenden Glykoalbumins in der klinischen Probe.
Es ist selbstverständlich, daß die Beschreibung und die Beispiele zur Verdeutlichung dienen, jedoch nicht als beschränkend für die vorliegende Erfindung ausgelegt werden sollen, und daß andere Ausführungsformen und Modifikationen des Erfindungsgedankens für den Fachmann offensichtlich sind.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon, enthaltend eine Antikörperbindungsstelle, die spezifisch an ein Epltop im glykosilierten nativen humanen Albumin bindet, wobei das Epitop die glykosilierte Form des Lysinrests an Position 525 umfaßt.

2. Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1, der spezifisch an ein glykosiliertes Peptidepitop der Formel

bindet, worin Glyko-(NH) eine nichtenzymatisch glykosilierte epsilon-Aminogruppe im Lysinrest darstellt und AA&sub1; und/oder AA&sub2; eine Sequenz von Aminosäuren ist, worin mindestens eine der Aminosäureeinheiten an einer Position entsprechend der Peptidsequenz des humanen Albumins benachbart zum Lysinrest an Position 525 ist, und falls nur AA&sub1; oder AA&sub2; eine solche Sequenz ist, ist die andere eine Bindung, eine terminale Amino- oder Carboxylgruppe oder zusätzliche Aminosäurereste.

3. Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach Anspruch 1 oder 2, der spezifisch an das Epitop im glykosilierten nativen humanen Albumin bindet, das durch physikalische oder chemische Denaturierung oder Verdauung zur Freilegung des Epitops zur Antikörperbindung behandelt wurde.

4. Monoklonaler Antikörper oder Fragment nach Anspruch 3, worin das Epitop zur Bindung durch Denaturation mit einem chaotropen Agens freigelegt wird.

5. Immunogen der Formel

worin Glyko-(NH) eine nichtenzymatische glykosilierte epsilon-Aminogruppe im Lysinrest darstellt, AA&sub1; und/oder AA&sub2; ist eine Sequenz von Aminosäuren, worin mindestens eine Aminosäureeinheit in einer Position entsprechend der Peptidsequenz des humanen Albumin benachbart zum Lysin rest an Position 525 ist, und falls nur AA&sub1; oder AA&sub2; eine solche Sequenz ist, ist die andere eine Bindung oder eine terminale Amino- oder Carboxylgruppe oder zusätzlich Aminosäurereste; R ist eine Bindung oder eine Bindungsgruppe, der Träger ist ein immunogenes Trägermaterial, m ist 1 und n ist Null oder umgekehrt; und p ist im Mittel von 1 bis zur Anzahl der zugänglichen Kopplungsstellen auf dem Träger.

6. Immuntestverfahren zur Bestimmung von glykosiliertem Albumin in einer humanen Blutprobe, umfassend die Schritte:

a) Inkontaktbringen der Blutprobe mit einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, welches eine Antikörperbindungsstelle enthält, die spezifisch an das Epitop im glykosilierten nativen humanen Albumin bindet, wobei das Epitop die glykosilierte Form des Lysinrests an Position 525 umfaßt, und

b) Bestimmen der Bindung des monoklonalen Antikörpers oder Fragments an das glykosilierte humane Albumin als Funktion seiner Menge in der zu testenden Probe.

7. Immuntestverfahren nach Anspruch 6, worin die Blutprobe physikalisch oder chemisch zur Denaturierung oder Verdauung glykosilierten Albumins behandelt wird, um darin das Epitop zur Bindung freizulegen, vorzugsweise durch Behandlung mit einem chaotropen Agens.

8. Peptid der Formel

worin AA&sub1; und/oder AA&sub2; eine Sequenz von 1 bis 12 Aminosäuren entsprechend der Peptidseguenz, benachbart zum Lysinrest an Position 525 im humanen Albumin ist, und falls nur AA&sub1; oder AA&sub2; eine solche Sequenz ist, ist die andere eine Bindung, und worin die N-terminale Aminogruppe in (NH&sub2;)AA&sub1; mit den Lysineinheiten in AA&sub1; oder AA&sub2; glykosiliert oder nichtglykosiliert sein können; worin q und t unabhängig voneinander Null oder 1 sind; worin r und s unabhängig voneinander Null, 1 oder 2 sind; worin QNH die epsilon-Aminogruppe im Lys darstellt, und worin Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist.

9. Peptid, ausgewählt aus der Gruppe

worin Q 1-Deoxyfructosyl ist;

worin Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist; AA&sub3; ist L s-Glu-Arg, Arg, oder eine Bindung; und AA&sub4; ist Tyr-Cys oder eine Bindung; und worin die N-terminale Aminogruppe in (NH&sub2;)AA&sub3; und die L s-Einheiten im Peptid glykosiliert oder nichtglykosiliert sind;

worin Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist und AA&sub4; Cys oder eine Bindung ist; und worin die N-terminale Aminogruppe (NH&sub2;)AA&sub4; und die L s-Einheit im Peptid glykosiliert oder nichtglykosiliert sind;

worin Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist, AA&sub4; ist Cys oder eine Bindung, und die N-terminale Aminogruppe im (NH&sub2;)Gln und die L s-Einheit im Peptid glykosiliert oder nichtglykosiliert sind;

worin Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist, AA&sub5; ist Arg oder eine Bindung, und die N-terminale Aminogruppe auf dem (NH&sub2;)AA&sub5; und die L s-Einheit im Peptid sind glykosiliert oder nichtglykosiliert;

worin Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist, AA&sub6; ist Gln-Ile-L s, Ile-L s, L s, oder eine Bindung; AA&sub7; ist Tyr-Tyr-Cys, Tyr-Cys, Cys oder eine Bildung; und worin die N-terminale Aminogruppe im (NH&sub2;)AA&sub6; und den L s-Einheiten im Peptid glykosiliert oder nichtglykosiliert sind; und

worin Q Wasserstoff oder 1-Deoxyfructosyl ist; AA&sub8; ist Cys-Tyr-Tyr, Cys-Tyr-Cys, oder eine Bindung; und die N-terminale Aminogruppe (NH&sub2;)AA&sub8;m und L s sind glycosiliert oder nichtglykosiliert.

10. Immuntestkit, enthaltend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4.