CN1165300A - 用于测定糖化白蛋白的干检验装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过用展开剂同时测定全血中的白蛋白和糖化白蛋白来测定糖化白蛋白的干检验装置，该装置包括一个其上具有一个展开层的衬底；一个血细胞分离层；一个含有使白蛋白着色的染料和使糖化白蛋白着色的染料的试剂层；一个其上固定有白蛋白结合物质的测定层；以及一个吸收残余展开剂的残余液体吸收层。

Description

用于测定糖化白蛋白的干检验装置

本发明涉及一种用于同时测定白蛋白和糖化白蛋白的检验装置，其中糖化白蛋白是临床检验中白蛋白的糖化蛋白质。

众所周知，血清中的白蛋白或者红血球中的血红蛋白能与葡萄糖发生非酶促反应，从而产生相应的糖化蛋白质即分别产生糖化白蛋白或糖化血红蛋白。由于在蛋白质存在于体液中期间糖化蛋白的浓度反映血糖的浓度，因此糖化蛋白浓度的测定对于体外诊断糖尿病和监测糖尿病是非常有用的。

反映血糖浓度的糖化蛋白包括血红蛋白A_1c(Hb A_1c)(即糖化血红蛋白)、糖化白蛋白和果糖胺。Hb A_1c浓度反映前1-2个月的血糖浓度，而糖化白蛋白和果糖胺的浓度反映前1-2个星期的血糖浓度，因此比Hb A_1c浓度表现出更快的反应和更大的差异。

换言之，糖化白蛋白或果糖胺的浓度比Hb A_1c浓度更适宜作为短期血糖控制的指标。利用基于果糖胺的还原性质的比色分析可测定果糖胺的浓度，此测定易受血液中存在的其它还原物质(例如胆红素和抗坏血酸)的影响。另外，由于所测得的果糖胺含量用绝对值表示，因此受到样品中蛋白质的量的影响。因此，用相对值表示的糖化白蛋白的浓度被认为是比果糖胺浓度更可靠的标志。

在临床检验中，糖化白蛋白浓度通常以与总的白蛋白的比率来表示，并且范围在11-16％的糖化白蛋白浓度通常被认为是判定正常的标准。因此，需要同时测定总的白蛋白和糖化白蛋白，以便得知糖化白蛋白的浓度。

可利用电泳法、离子交换色谱法、利用对硼酸的亲合性的高压液色谱法(HPLC) (例如：Akazawa et al，Igaku ToYakugaku，29：269-274(1993)；Fujitaet al，Kiki·Shiyaku，17：689-694(1994))、酶免疫测定法、利用一种结合剂的测定法(美国专利5,110,745)，以及其它类似方法来测定糖化蛋白。在这些方法中，HPLC主要用于临床检验领域中。然而，HPLC在准确性和分离性都可靠的情况下，测定每个样品太耗费时间，因此不能一次测定大量样品。

最近业已将硼酸的亲合性与免疫测定法结合起来使用(例如：Aka-zawa et al，Igaku To Yakugaku，29：269-274(1993)；Nakano et al，Kiki·Shi-yaku，16：1017-1021(1993)；Fujita etal，Kiki·Shiyaku，17：689-694(1994))。免疫测定法在对糖化蛋白的特异性方面一般是极好的并且适于测定大量样品。

另外，已经报导了一种用于检测糖化蛋白的硼酸诱导的酶试剂(例如：Miyake et al，Igaku To Yakugaku，28：871-875(1992)；Miyake et al，IgakuTo Yakugaku，28：876-882(1992)；Kana-tsuna et al，The Clinical Report，26：5585-5589(1992))。

而且，业已报导了针对人糖化白蛋白的单克隆抗体(例如：EP-B-0257421，美国专利5,173,422、5,223,392和5,225,354)。

在目前情况下，在临床实验室或大医院中可借助较大型设备来进行上述的HPLC和免疫测定法。因此业已需要研究一种测定糖化蛋白的方法，利用这种方法，中小型医院的医生、一般实践者、甚至病人自己即能借助简单的小型设备在短时间内检验样品。对于相应于这种需求的方法还没有报导过。

为了测定糖化白蛋白，血清或血浆被用作样品，从而为了除去血细胞必须对血样品进行预处理，以便得到血清或血浆。血清的分离不仅伴随着复杂的操作过程而且还具有所谓的生物危害感染的危险。血清分离的困难对于利用于检验装置实现糖化蛋白测定也已是个障碍。

本发明的一个目的是提供一种用于同时测定总的白蛋白和糖化白蛋白以便得知糖化白蛋白浓度的干检验装置，利用这种装置，中小型医院的医生、一般实践者、甚至病人自己即能借助简单小型的光学设备检验血样，而无需血清分离这样的预处理过程。

业已利用一种干检验装置来完成本发明的这个和其它目的，此干检验装置通过利用一种展开剂同时测定白蛋白和糖化白蛋白来测定糖化白蛋白，其包括：

(A)一个其上具有一展开层的衬底；

(B)一血细胞分离层；

(C)一含有使白蛋白着色的染料(此后通常称为染料1)和使糖化白蛋白着色的染料(此后通称为染料2)的试剂层；

(D)一固定有白蛋白结合物质的测定层；以及

(E)一吸收残余展开剂的残余液体吸收层。

其中，所述的血细胞分离层、所述的试剂层、所述的测定层和所述的残余液体吸收层按序排列在所述的展开层上(此后称为第一实施例)。

在按照本发明的第一实施例的干检验装置中，使白蛋白着色的染料和使糖化白蛋白着色的染料最好具有不同的吸收波长或者不同的荧光发射波长。

另外，利用一种干检验装置来完成本发明的这个或其它目的，此干检验装置通过利用一种展开剂来测定全血中的糖化白蛋白，该检验装置全部由能使液体扩散通过其的材料制成，并且包括：

(A)一个具有一个能进行光学测定的通孔或透光区域的衬底；

(B)一个其上固定有白蛋白结合物质的测定层，所述测定层叠加在所述衬底上，以便覆盖所述通孔或透光区域；

(C)一个叠加在所述测定层上的展开层；

(D)一个含有使白蛋白着色的染料和使糖化白蛋白着色的染料的试剂层，所述试剂层叠加在所述展开层上；

(E)一个包括一血细胞分离膜的血细胞分离层，所述血细胞分离层叠加在所述试剂层上；以及

(F)一个吸收残余展开剂的残余液体吸收层，所述残余液体吸收层的配置可使其环绕在所述测定层的周围，

其中，所述使白蛋白着色的染料和所述使糖化白蛋白着色的染料具有不同的光学性质(此后称为第二实施例)。

按照第二实施例的检验装置定那种衬底上配有一单个层状结构并且可在一个测定层中同时测定糖化白蛋白和白蛋白的类型。

而且，利用一种干检验装置业已完成这个和其它目的，此干检验装置通过利用一种展开剂来测定全血中的糖化白蛋白，并且全部由能使液体扩散通过的材料制成，其包括：

(A)一个具有两个能进行光学测定的通孔或透光区域的衬底；

(B)一个层状结构，包括：

(a)一个其上固定有白蛋白结合物质的测定层，该测定层叠加在衬底上以便覆盖所述通孔或透光区域中的一个；

(b)一个叠加在所述测定层上的展开层；

(c)一个含有使白蛋白着色的染料的试剂层，所述试剂层叠加在展开层上；

(d)一个包括一血细胞分离膜的血细胞分离层，所述血细胞分离层叠加在所述试剂层上；以及

(e)一个吸收残余展开剂的残余液体吸收层，所述残余液体吸收层的配置可使其环绕在所述测定层的周围；以及

(C)一个层状结构，包括：

(a)一个其上固定有白蛋白结合物质或糖化白蛋白结合物质的测定层，所述测定层叠加在所述衬底上以便覆盖另一通孔或透光区域；

(b)一个叠加在所述测定层上的展开层；

(c)一个含有使糖化白蛋白着色的染料的试剂层，该试剂层叠加在所述展开层上；

(d)一个包括一血细胞分离膜的血细胞分离层，所述血细胞分离层叠加在试剂层上；以及

(e)一个吸收残余展开剂的残余液体吸收层，所述残余液体吸收层的配置可使其环绕在所述测定层的周围(此后称作第三实施例)。

按照第三实施例的检验装置是那种衬底上配有两个层状结构，一个用于测定糖化白蛋白，另一个用于测定白蛋白和糖化白蛋白的类型。在第三实施例中，因为使白蛋白着色的染料和使糖化白蛋白着色的染料将在各自的层状结构中被检测，所以它们可以具有相同的光学性质。

图1A至3B的每一组是按照本发明的第一实施例的检验装置的一个例子的平面图和剖面图(分别标为检验装置11、12和13)。

图4A和4B是图1所示检验装置11放大的平面图和剖面图(标为检验装置11’)。

图5是按照本发明的第二实施例的检验装置21的剖面图。

图6是按照本发明的第三实施例的检验装置31的剖面图。

在按照本发明的第一、二、三实施例的检验装置中，可如下简单地完成糖化白蛋白的测定：首先将血样滴在检验装置或装置上并用一种展开剂使样品展开；其次用一种(或若干种)染料使白蛋白和糖化白蛋白着色，然后将这两种蛋白捕获在测定层中。用光测设备对如此被着色和捕获的白蛋白和糖化白蛋白分别进行光学测定并由测定值计算糖化白蛋白对白蛋白的比率。

按照本发明的第二和第三实施例的检验装置具有如下优点：即使样品由于重力被向下展开，血样也能够被展开。

所施加的血样包括预先分离的血清或血浆以及全血。虽然在使用血清或血浆时血细胞分离层不是必需的，但是本发明的检验装置是为检验全血而设计的，从而甚至病人自己也能在家里进行测定。

如果需要的话，试剂层中可含有蛋白变性剂，此蛋白变性剂可使白蛋白和糖化白蛋白变性，以便尽可能多地暴露它们的抗原决定基，借此使它们更易于结合到各自的抗体上。

JP-A-5-87809公开了一种测定糖化白蛋白的方法，包括利用一种固相抗体捕获白蛋白和糖化白蛋白并用一种硼酸衍生物仅标记糖化白蛋白(“JP-A”在此处意指“未审查的日本专利申请”)。在这种方法中，施加的样品(即含有糖化白蛋白的白蛋白)量超过了固相中的抗体的已知量，并且所给量的白蛋白被捕获而没有被标记。固相抗体的捕获容量必须总是恒定的。因为捕获容量易受各种因素影响，所以可产生误差，并且固相的制备和保存应严格控制，而且还需要技术。另外，需要大量的样品。

在测定糖化白蛋白时，由于血红蛋白本身是红色的，因此只标记糖化白蛋白。另一方面，由于白蛋白是无色的，因此必须用各自的标记物质来标记白蛋白和糖化白蛋白。结果，在本发明中，白蛋白被标记，从而可以测定包括糖化白蛋白的总的白蛋白。

在本发明中染料被用作标记物，这是因为染料非常便宜并且比酶或放射性物质更稳定，而且只要所购得的光测设备能够进行双波长分光光度测定，就能区分两种不同的染料，从而可测定白蛋白和糖化白蛋白。另外，染料的一个非常大的优点即是许多染料都能发射荧光。此处用于染料的术语“光学性质”意指吸收波长和荧光发射波长。

以下将参照附图描述本发明的实施例。图1A-4B的每一组是按照第一实施例的检验装置的平面图和剖面图，图5和图6分别是按照本发明的第二和第三实施例的检验装置的剖面图。本发明的检验装置的本质特征在于能够迁移液体的若干个层彼此叠加，从而形成一个液体可通过其向下展开的层状结构。

检验装置11

图1A和1B是按照第一实施例的检验装置的一个例子的平面图和剖面图，包括其上具有两个展开层2和2’的衬底1，这两个展开层由能够传送展开剂的相同材料制成。展开层2上按序具有作为展开起点的位置P、作为样品施加点的位置E、包括一个血细胞分离膜的血细胞分离层3、用包括一种光学变性剂的染料1涂覆的试剂层4、其上固定有一种白蛋白结合物质的测定层5和可吸收残余展开剂的残余液体吸收层6。展开层2’上按所列出的顺序有作为展开起点的位置P’、作为样品施加点的位置E’、包括一个血细胞分离膜的血细胞分离层3’、用包括一种光学变性剂的染料2涂覆的试剂层4’、其上固定有一种白蛋白结合物质或一种结合糖化白蛋白而不结合非糖化白蛋白的物质(此后称作糖化白蛋白结合物质)的测定层5’和可吸收残余展开剂的残余液体吸收层6’。

当在测定层5’中使用糖化白蛋白结合物时，在试剂层4’中可用使白蛋白和糖化白蛋白都着色的一种染料取代染料2。

检验装置11有两个展开层，白蛋白和糖化白蛋白通过不同的试剂层并且结合在不同的测定层中。

首先将血样滴在检验装置11的位置E处，然后将展开剂加在位置P处，由此血样被展开，并且用血细胞分离层3的血细胞分离膜除去血细胞。然后用试剂层4中的光学变性剂使血中的白蛋白变性并且用染料1给白蛋白染色。如此被染色的白蛋白被捕获在测定层5中，而其它物质被残余液体吸收层6吸收。糖化白蛋白也可以用染料1进行染色并被捕获在测定层5中。

另一方面，将等量的血样滴在位置E’处，然后将展开剂加在位置P’处，由此血样被展开，并且用血细胞分离层3’的血细胞分离膜除去血细胞。然后用试剂层4’中的光学变性剂使血中的糖化白蛋白变性并且用染料2给糖化白蛋白染色。如此被染色的糖化白蛋白被捕获在测定层5’中，而其它物质被残余液体吸收层6’吸收。

可光学检测被捕获在测定层5中的白蛋白-染料1复合物或白蛋白-和糖化白蛋白-染料1复合物的颜色以及被捕获在测定层5’中的糖化白蛋白-染料2复合物的颜色，从而得到各自染料的浓度。由染料浓度得到白蛋白和糖化白蛋白的量，并且由此计算出糖化白蛋白对总的白蛋白(糖化白蛋白和非糖化白蛋白)的比率。

如图4A和4B(检验装置11)所示，分开地配置在检验装置11中的残余液体吸收层6和6’可用一个被两个展开层共用的残余液体吸收层7来代替。

在图1A和1B所示出的检验装置11中，展开层2和2’安排在靠近衬底1的一端，以便使测定者中可以将衬底的另一端夹在手指间。当然，展开层也可以安排在衬底1的任意位置上。这还可应用到以后所描述的检验装置12、13、21和31中。

本发明所用的材料是从常规材料中选择的。衬底：

用于检验装置11中的衬底包括主要由聚苯乙烯、聚酯、乙酸纤维素等制成的膜、片或板。衬底可以是透光的，也可以是不透光的。由于从衬底的反面进行样品展开之后还要进行光度测定，因此希望使用透明衬底，例如，优选的是透明的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)衬底。展开层：

展开层包括主要由纤维素、纤维素衍生物(例如乙酸纤维素、硝基纤维素)、玻璃纤维等制成的滤纸或多孔基质。被切成条的展开层(如图1A和1B所示)可用双面胶带、粘合剂或热熔性粘合剂物理固定到衬底上。按照已知的色谱技术来决定带的宽度和长度。血细胞分离膜：

用于本发明的血细胞分离膜包括主要由聚四氟乙烯、聚砜、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、混有纤维素的酯类等构成的滤膜。变性剂：

用于本发明的变性剂包括表面活性剂、酸、皂角苷、以及胍及其盐。变性剂用于使白蛋白和糖化白蛋白变性，以便尽可能多地暴露出它们的抗原决定基，借此使这两种蛋白更易于结合到抗体上。虽然对于一些抗体变性剂并不总是必需的，但是变性剂的加入不会产生副作用。吸收剂：

构成残余液体吸收层的吸收剂要求具有足够的用于在展开之后吸收展开剂的孔容积。可用的吸收剂包括主要由纤维素、纤维素衍生物(例如乙酸纤维素或硝基纤维素)、玻璃纤维等制成的滤纸或多孔基质。展开剂：

能够用于展开血样的展开剂最好包括一般用于免疫测定或色谱的那些展开剂，例如含有痕量蛋白、盐、螯形化合物、表面活性剂、以及类似物质的缓冲液。所提到的展开剂的型例子是含有0.1％的牛血清白蛋白、0.9％氯化钠、0.01％  EDTA、以及0.01％ Triton x-100的0.1M磷酸盐缓冲液。染料：

用于给白蛋白染色的染料1包括那些对白蛋白具有特殊的亲合力而对其它蛋白使没有亲合力的染料。染料1包括使白蛋白着色而不使糖化白蛋白着色的染料，以及使白蛋白和糖化白蛋白都着色的染料。

例如，诸如溴甲酚红紫、溴甲酚蓝、溴甲酚绿以及CibacronBlue F3 G-A这些指示剂是优选的。

通过以抗白蛋白抗体、以下的测定层中所描述的离子交换剂、或者它们的组合物媒介还可以使用那些对白蛋白没有特殊亲合力的染料。例如，结合到抗白蛋白抗体上的蒽醌染料、偶氮染料、吖嗪染料、三嗪染料、藻红素染料、香豆素染料、吖啶染料、若丹明染料、荧光染料和酞蔷染料可用作染料1。对于上述所列举的染料，通过测定其荧光强度可检测那些染料的发射。给白蛋白特异染色的染料由于其价廉、稳定以及不以抗体作媒介即能结合到白蛋白上的这些优越性而非常有用。

用于给糖化白蛋白染色的染料2包括那些对糖化白蛋白有特殊亲合力的染料。通过以抗糖化白蛋白抗体、二羟基硼酸衍生物、以下的测定层中所描述的离子交换剂、或者这些物质的组合作媒介可以使用那些对糖化白蛋白没有特异性的染料。例如，可以使用结合到二羟基硼酸衍生物或者抗糖化白蛋白抗体上的蒽醌染料、偶氮染料、吖嗪染料、三嗪染料、藻红素染料、香豆素染料、吖啶染料、若丹明染料、荧光染料和酞菁颜料。二甲苯苯胺硼酸和二甲氨基萘磺酰基抗糖化白蛋白抗体是特别适宜的。抗糖化白蛋白本选自于那些能识别糖化白蛋白的葡糖抗原决定基的抗体。如果使用离子交换剂，则检验装置的构成必须使染料2与离子交换剂的复合物不与白蛋白结合。

抗白蛋白抗体和抗糖化白蛋白抗体既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。不仅可以使用抗体分子而且还可以使用通过酶催处理抗体分子而得到的抗体活性片段例如Fab、Fab’和(Fab’)₂。

当使用染料与二羟基硼酸的结合物时，因为抗糖化白蛋白抗体具有一个葡糖抗原决定基，所以最好通过利用糖肽酶或聚糖酶的酶处理来除去葡糖链或者使用上述提到的Fab、Fab’、或(Fab’)₂片段。测定层：

检验装置11的测定层包括一种其上通过化学键固定有白蛋白结合物的基质。白蛋白结合物的例子包括抗白蛋白抗体、离子交换剂、以及它们的组合。用于本发明的白蛋白结合物能结合到白蛋白和糖化白蛋白两种物质上。抗白蛋白抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且如上所述进行过酶处理。适宜的离子交换剂包括二乙氨基乙基纤维素和羧甲基化聚乙烯醇。

用于捕获糖化白蛋白的测定层5’可包括白蛋白结合物或糖化白蛋白结合物。糖化白蛋白结合物的例子包括抗糖化白蛋白抗体、二羟基硼酸衍生物、以及它们的组合。这些物质不结合白蛋白，但是结合糖化白蛋白，因为它们能识别糖化白蛋白的糖抗原决定基。抗糖化白蛋白抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且如上所述进行过酶处理。

当染料1和2需要以抗体作媒介并且测定层中的血蛋白结合物含有抗体时，这些抗体应该具有不同的抗原决定基并且同时结合到一个抗原上。构成：

通过利用本领域公知的任何方法和相应的试剂浸渍、涂覆或与展开层结合而将以上所述的各个层配置在展开层上。例如，将待施加的物质溶解在浸渍溶液中，并且通过浸渍或用喷墨印刷机喷涂，然后进行干燥而将溶液加到展开层上。因为试剂层中的试剂应该从初始位置渗出并用展开剂展开，所以可通过浸渍或涂覆来简单地加入该试剂。另一方面，测定层中的特异性结合物质必须通过化学键固定到展开层上，以便不会从其位置上迁移出来(参见KOSOMEN-EKI SOKUTEIHO，Igakushoin(1987))。

一个基本需要是将染料1和2(每一种染料选自于前述的染料中)组合起来，从而使它们独自并特异性地给白蛋白和糖化白蛋白染色。这种组合的一个合适的例子是作为染料1的溴甲酚红紫和作为染料2的二甲苯苯胺硼酸。由于检验装置11具有一个专门用于白蛋白测定的测定层和一个专门用于糖化白蛋白测定的测定层，因此染料1和2可以是相同种类的染料或具有相同的吸收波长，也可以有所区别。

                     检验装置12

图2A和2B是按照本发明的第一实施例的检验装置的另一个例子的平面图和剖面图，其包括其上具有一个展开层2的衬底1。

展开层2上按所列出的顺序具有作为展开起点的位置P、作为样品施加点的位置E、包括一个血细胞分离膜的血细胞分离层3、用包括一种光学变性剂的染料1和2涂覆的试剂层4、其上固定有白蛋白结合物的测定层5、以及吸收残余展开剂的残余液体吸收层6。

检验装置12具有一个展开层，并且白蛋白和糖化白蛋白通过一个试剂层，并被捕获在一个测定层中。

首先将血样滴在检验装置12的位置E处，然后将展开剂加在位置P处，由此血样被展开，并且用血细胞分离层3的血细胞分离膜除去血细胞。试剂层4中的光学变性剂使血中的白蛋白和糖化白蛋白变性，并且用染料1给白蛋白染色，用染料1和2或染料2给糖化白蛋白染色。如此被染色的白蛋白和糖化白蛋白被捕获在测定层5中，而其它物质被残余液体吸收层6吸收。

被捕获在测定层5中的白蛋白-染料1复合物或者白蛋白-染料1复合物与糖化白蛋白-染料1和2复合物中的染料1的颜色以及糖化白蛋白-染料2复合物或者糖化白蛋白-染料1和2复合物中的染料2的颜色可分开进行光学检测，以便得到各自染料的浓度。由染料浓度可得到白蛋白和糖化白蛋白的量，由此计算出糖化白蛋白对总的白蛋白的比率。

由于检验装置12只有一个展开层，因此与具有两个展开层的检验装置11相比结构更简单，成本更低。滴一次血样即可测定糖化白蛋白，从而测定也较为简单。

构成检验装置12的衬底、展开层、以及其它各个层的材料与检验装置11相同。然而，当一种着色染料用作染料1时，染料1不仅可以使白蛋白着色，而且可以使糖化白蛋白着色。在这种情况下，染料1和2都可以使糖化白蛋白着色。因此，应该选择染料1和2以使它们能够光学区分开，即应该具有不同的吸收波长，从而在一个测定层中可观察到染料1和2。这是第一实施例的检验装置11和12的区别。当然，染料2应该只标记糖化白蛋白。

当染料1和2需要以抗体作媒介并且测定层中的特异性结合物含有抗体时，这些抗体应该具有不同的抗原决定基并且同时结合到一个抗原上。

                      检验装置13

图3A和3B是按照本发明的第一实施例的检验装置的又一个例子的平面图和剖面图，其包括其上具有一个展开层2的衬底1。

展开层2上按所列出的顺序具有作为展开起点的位置P、作为样品施加点的位置E、包括一个血细胞分离膜的血细胞分离层3、用包括一种光学变性剂的染料1和2涂覆的试剂层4、其上固定有糖化白蛋白结合物的测定层5’、其上固定有白蛋白结合物的测定层5、以及吸收残余展开剂的残余液体吸收层6。

检验装置13具有一个展开层，白蛋白和糖化白蛋白通过一个试剂层并被捕获在不同的测定层中。

首先将血样滴在检验装置13的位置E处，然后将展开剂加在位置P处，由此血样被展开，并且用血细胞分离层3的血细胞分离膜除去血细胞。试剂层4中的光学变性剂使血中的血蛋白和糖化白蛋白变性，并且用染料1给白蛋白染色，用染料1和2或染料2给糖化白蛋白染色。如此被染色的糖化白蛋白被捕获在测定层5’中，如此被染色的白蛋白被捕获在测定层5中，而其它物质被残余液体吸收层6吸收。

分别被捕获在测定层5’和5中的糖化白蛋白-染料1和2复合物或者糖化白蛋白-染料2复合物中的染料2的颜色以及白蛋白-染料1复合物或者白蛋白-染料1复合物与糖化白蛋白-染料1和2的复合物中的染料的颜色可分开进行光学检测，以便得到各自染料的浓度。由染料浓度可得到白蛋白和糖化白蛋白的量，由此计算出糖化白蛋白对总的白蛋白的比率。

检验装置13具有与检验装置12一样的优点。另外，由于检验装置13具有一个专门用于白蛋白的测定层和一个专门用于糖化白蛋白的测定层，因此即使染料1和2的种类相同或者具有相同的吸收波长，也能将二者区分开。染料1既可以是只给白蛋白特异染色的染料，也可以是给白蛋白和糖化白蛋白都染色的染料，而染料2应该只标记糖化白蛋白。

如果测定层的一层(层5’)上固定有抗糖化白蛋白抗体，而另一测定层(层5)上固定有抗白蛋白抗体，则只可以使用使白蛋白和糖化白蛋白同时着色的染料。在这种情况下，使白蛋白着色的染料和使糖化白蛋白着色的染料具有完全相同的吸收波长，并且由于具有两个分开的测定层，因此还能将这两种区分开。

                     检验装置21

图5是按照本发明的第2实施例的检验装置的一个例子的剖面图，其包括其上具有一个层状结构(层结构)的衬底1。

检验装置2 1按所列出的顺序包括具有通孔7的衬底1，通孔上层压着有层8；其上固定有白蛋白结合物的测定层5；展开层2；其上载有包括光学变性剂的染料1和2的试剂层4；以及包括一个血细胞分离膜的血细胞分离层3。测定层5被吸收残余展开剂的残余液体吸收层6环绕着，从而形成一个层状结构。这个层状结构用具有一个通孔的罩9覆盖着，通过罩9上的这个通孔施加血样和展开剂。

在将血样滴到血细胞分离层3上，其次将展开剂加到这一层上之后，血样被展开，并且用血细胞分离膜分开血细胞。试剂层4中的光学变性剂使血浆中的白蛋白和糖化白蛋白变性，白蛋白用染料1染色，而糖化白蛋白用染料1和2或染料2染色。用染料1染色的白蛋白和用染料1和2或染料2染色的糖化白蛋白被捕获在测定层5中，而其它物质被残余液体吸收层6吸收。

都被捕获在测定层5中的白蛋白-染料1复合物或者白蛋白-和糖化白蛋白-染料1复合物的颜色以及糖化白蛋白-染料2复合物的颜色可分开进行检测，以便得到各自染料的浓度。由染料浓度得到白蛋白和糖化白蛋白的量，由此计算出糖化白蛋白对白蛋白的比率。

用于检验装置21的制备中的衬底、血细胞分离膜、吸收剂、展开剂、染料1和2、变性剂、测定层以及类似组分与用于检验装置11的相同。

当使用不透光的衬底时，要制备一个如图5所示的通孔。

用于检验装置21中的透明层包括主要由聚酯、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、以及类似物质制成的膜或片。配置透明层是为了支撑覆盖衬底的通孔的测定层。因此，当测定层本身具有一定的强度时或者衬底本身是透光的时，透明层不是必需的。假设在图5中衬底是不透光的，则衬底要有一个通孔，并且透明层配置在测定层之下。

罩9的材料不受特别限定，可以与用于衬底的相同，即可以是主要由聚酯、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、以及类似物质制成的膜或片。罩9是为了保证几个层叠压在一起。当用少量粘合剂使几个层固定在一起时，罩9是不必需的。

可以与检验装置11相同的方式用相应试剂和类似物质浸渍或涂覆主要由纤维素、纤维素衍生物(例如乙酸纤维素、硝基纤维素)、玻璃纤维、以及类似物质制成的滤纸或多孔基质来制备构成检验装置21的每一层。

在检验装置21中，可在同一层中测定被染色的白蛋白和被染色的糖化白蛋白。为了在一个测定层中清楚地区分开染料1和2，染料1和2必须具有不同的光学性质(例如吸收波长和荧光发射波长)。

由于检验装置21只有一个层状结构，因此它与以后将描述的具有两个层状结构的检验装置31相比结构更简单，成本更低。只滴加一次血样即能测定出糖化白蛋白，从而测定更简便。

                      检验装置31

图6是按照本发明的第三实施例的检验装置的一个例子的剖面图，其包括其上具有两个层状结构(层结构)的衬底1。

检验装置31按所列出的顺序包括具有两个通孔7和7’的衬底1，每个通孔上层压着透明层8或8’；其上固定有白蛋白结合物的测定层5或5’；展开层2或2’；其上载有染料1的试剂层4或者其上载有包括一种光学变性剂的染料2的试剂层4’；以及包括一个血细胞分离膜的血细胞分离层3或3’。测定层5和5’的每一层分别被残余液体吸收层6或6’环绕着，从而形成相应的层状结构。两个层状结构用在每个层状结构上具有一个通孔的罩9覆盖着，可通过此通孔施加血样和展开剂。

在测定层5中，白蛋白(和糖化白蛋白)被染色。在测定层5’中，只有糖化白蛋白被染色。这样，可得到糖化白蛋白对总的白蛋白的比率。

虽然构成检验装置31的每一层的材料与检验装置21相同，但是检验装置31的优点在于：由于是在分开的两个测定层上各自观察染料1和2，因此即使染料1和2的光学性质相同并且在光学上是不可分辨的，也能将它们彼此区分开。

当染料1和2需要以抗体作媒介并且测定层中的白蛋白-和/或糖化白蛋白结合物含有抗体时，这些抗体应该具有不同的抗原决定基并且同时结合到一个抗原，这与检验装置21相同。

作为检验装置31的一种改进，测定层5上可固定有白蛋白结合物质，而测定层5’上可固定有糖化白蛋白结合物质。在这种情况下，测定层5捕获白蛋白和糖化白蛋白，而测定层5’只捕获糖化白蛋白，借此能够计算出糖化白蛋白对总的白蛋白的比率。在这种改进的装置中，使白蛋白和糖化白蛋白都着色的染料还可以用来代替染料2。此时，这种染料和染料1可以是相同种类的染料或具有相同的光学性质，也可以有所区别。

以上虽然参考特定的例子对本发明进行了描述，但是应该理解本发明包括各种在本发明的精髓和范围内做出的各种改进和变化。即，按照最终用途可以改变以上所述的检验装置的结构。例如，衬底不是必需的，衬底部分可以用作展开层或层状结构。

本发明提供了用于同时测定糖化白蛋白和白蛋白的新型、实用的检验装置，这种装置易于用手拿操作，并且因此而适合于家庭使用。

虽然已经参考特定的例子对本发明进行了详细的描述，但是对于本领域的技术人员在不脱离本发明的精髓和范围内所做的各种变型和改进都是显而易见的。

Claims (29)

1.一种通过利用一种展开剂同时测定全血中的白蛋白和糖化白蛋白来测定糖化白蛋白的干检验装置，包括：

(A)一个其上具有一展开层的衬底；

(B)一个血细胞分离层；

(C)一个含有一种使白蛋白着色的染料和一种使糖化白蛋白着色的染料的试剂层；

(D)一个其上固定有白蛋白结合物质的测定层；以及

(E)一个吸收残余展开剂的残余液体吸收层，

其中所述血细胞分离层、所述的试剂层、所述测定层、以及所述残余液体吸收层按序排列在所述的展开层上。

2.如权利要求1所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白着色的染料和所述使糖化白蛋白着色的染料具有不同的吸收波长和不同的荧光发射波长。

3.如权利要求1所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白着色的染料通过以抗白蛋白抗体、离子交换剂、或者它们的组合作媒介给白蛋白染色；所述使糖化白蛋白着色的染料通过以抗糖化白蛋白抗体、二羟基硼酸衍生物、离子交换剂、或者这些物质的组合物媒介给糖化白蛋白染色。

4.如权利要求1所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白着色的染料是一种不用媒介即能给白蛋白特异染色的染料。

5.如权利要求4所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白着色的染料选自于溴甲酚红紫、溴甲酚红蓝、溴甲酚红绿、以及CibacronBlue F3 G-A。

6.如权利要求1所述的干检验装置，其特征在于所述白蛋白结合物质是一种抗白蛋白抗体、离子交换剂、或者它们的组合。

7.如权利要求1所述的干检验装置，其特征在于所述检验装置具有两个展开层，白蛋白和糖化白蛋白通过不同的试剂层并结合在不同的测定层中。

8.如权利要求7所述的干检验装置，其特征在于白蛋白被捕获在一个其上固定有抗白蛋白抗体、离子交换剂、或者它们的组合的测定层中；而糖化白蛋白被捕获在一个其上固定有抗糖化白蛋白抗体、二羟基硼酸衍生物、或者它们的组合的测定层中。

9.如权利要求7所述的干检验装置，其特征在于所述的两个展开层共用一个残余液体吸收层。

10.如权利要求1所述的干检验装置，其特征在于所述检验装置具有一个展开层，白蛋白和糖化白蛋白通过一个试剂层并被捕获在一个测定层中。

11.如权利要求1所述的干检验装置，其特征在于所述检验装置具有一个展开层，白蛋白和糖化白蛋白通过一个试剂层并被捕获在不同的测定层中。

12.如权利要求11所述的干检验装置，其特征在于白蛋白被捕获在一个其上固定有抗白蛋白抗体、离子交换剂、或者它们的组合的测定层中；糖化白蛋白被捕获在一个其上固定有抗糖化白蛋白抗体、二羟基硼酸衍生物、或者它们的组合的测定层中。

13.如权利要求1所述的干检验装置，其特征在于所述试剂层还含有一种血液变性剂。

14.一种通过利用一种展开剂测定全血中糖化白蛋白的干检验装置，该装置全部由能使液体迁移通过的一种材料制成，其包括：

(A)一个具有一个能进行光学测定的通孔或透光区域的衬底；

(B)一个其上固定有白蛋白结合物质的测定层，所述测定层层压在所述衬底上，以便覆盖所述通孔或透光区域；

(C)一个层压在所述测定层上的展开层；

(D)一个含有一种使白蛋白着色的染料和一种使糖化白蛋白着色的染料的试剂层，所述试剂层层压在所述展开层上；

(E)一个包括一个血细胞分离膜的血细胞分离层，所述血细胞分离层层压在所述试剂层上；以及

(F)一个吸收残余展开剂的残余液体吸收层，所述残余液体吸收层的配置环绕在所述测定层的周围，并且所述使白蛋白着色的染料和所述使糖化白蛋白着色的染料具有不同的光学性质。

15.如权利要求14所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白着色的染料和所述使糖化白蛋白着色的染料具有不同的吸收波长或荧光发射波长。

16.如权利要求14所述的干检验装置，其特征在于所述的使白蛋白着色的染料通过以抗白蛋白抗体、离子交换剂、或者它们的组合作媒介来给白蛋白染色；所述使糖化白蛋白着色的染料通过以抗糖化白蛋白抗体、二羟基硼酸衍生物、离子交换剂、或者这些物质的组合作媒介给糖化白蛋白染色。

17.如权利要求14所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白着色的染料不用媒介即能给白蛋白特异染色。

18.如权利要求17所述的干检验装置，其特征在于所述第一染料选自于溴甲酚红紫、溴甲酚蓝、溴甲酚绿和Cibacron Blue T3 G-A。

19.如权利要求14所述的干检验装置，其特征在于所述白蛋白结合物质是抗白蛋白抗体、离子交换剂、或者它们的组合。

20.如权利要求14所述的干检验装置，其特征在于包括所述测定层、所述展开剂、所述试剂层、所述血细胞分离层以及所述残余液体吸收层的层状结构用一个具有一通孔的罩覆盖着，通过所述通孔施加血样和展开剂。

21.如权利要求14所述的干检验装置，其特征在于所述试剂层还含有一种血液变性剂。

22.一种通过利用一种展开剂测定全血中糖化白蛋白的干检验装置，该装置全部由能使液体迁移通过的一种材料制成，其包括：

(A)一个具有两个能进行光学测定的通孔或透光区域的衬底；

(B)一个层状结构，包括：

(a)一个其上固定有白蛋白结合物质的测定层，该测定层层压在衬底上，以便覆盖其中一个所述通孔或透光区域；

(b)一个层压在所述测定层上的展开层；

(c)一个含有一种使白蛋白着色的染料的试剂层，所述试剂层层压在展开层上；

(d)一个包括一血细胞分离膜的血细胞分离层，所述血细胞分离层层压在所述试剂层上；以及

(e)一个吸收残余展开剂的残余液体吸收层，使所述残余液体吸收层的配置环绕在所述测定层的周围；以及

(C)一个层状结构，包括：

(a)一个其上固定有一种白蛋白结合物质或一种糖化白蛋白结合物质的测定层，所述测定层层压在所述衬底上，以便覆盖另一通孔或透光区域；

(b)一个层压在所述测定层上的展开层；

(c)一个含有一种使糖化白蛋白着色的染料的试剂层，该试剂层层压在所述展开层上；

(d)一个包括一血细胞分离膜的血细胞分离层，所述血细胞分离层层压在试剂层上；以及

(e)一个吸收残余展开剂的残余液体吸收层，使所述残余液体吸收层的配置环绕在所述测定层的周围。

23.如权利要求22所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白着色的染料通过以抗白蛋白抗体、离子交换剂、或者它们的组合作媒介给白蛋白染色；而所述使糖化白蛋白着色的染料通过以抗糖化白蛋白抗体、二羟基硼酸衍生物、离子交换剂、或者这些物质的组合物媒介给糖化白蛋白染色。

24.如权利要求22所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白染色的染料不用媒介即可给白蛋白特异染色。

25.如权利要求24所述的干检验装置，其特征在于所述使白蛋白着色的染料选自于溴甲酚红紫、溴甲酚蓝、溴甲酚绿和CibacronBlue F3 G-A。

26.如权利要求22所述的干检验装置，其特征在于所述白蛋白结合物质是抗白蛋白抗体、离子交换剂、或者它们的组合。

27.如权利要求22所述的干检验装置，其特征在于所述糖化白蛋白结合物质是抗糖化白蛋白抗体、二羟基硼酸衍生物、或者它们的组合。

28.如权利要求22所述的干检验装置，其特征在于包括所述测定层、所述展开层、所述试剂层、所述血细胞分离层、以及所述残余液体吸收层的层状结构用一个具有一通孔的罩覆盖着，通过所述通孔施加血样和展开剂。

29.如权利要求22所述的干检验装置，其特征在于所述试剂层还含有一种血液变性剂。

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