CN103823071A - 一种直接测定糖化血红蛋白比例的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定糖化血红蛋白比例的方法，该方法包括：在磁珠表面固定血红蛋白抗体，通过抗原-抗体反应将待测样品中的糖化血红蛋白和血红蛋白引入磁珠表面；将上述引入了糖化血红蛋白和血红蛋白的磁珠与含二茂铁结构单元的硼酸或其衍生物接触，使磁珠上的糖化血红蛋白进一步反应形成“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物；分离磁珠，解离“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”中的二茂铁硼酸；用含葡萄糖氧化酶的电极测定解离出的二茂铁硼酸，根据其响应电流测算出待测样品中糖化血红蛋白比例。利用本发明的方法，无需测定血红蛋白总量就能测算出血液中糖化血红蛋白比例，测定结果具有较高的准确性，且操作简便、成本低廉。

Description

一种直接测定糖化血红蛋白比例的方法
技术领域
本发明涉及一种测定糖化血红蛋白比例的方法，无需测定血红蛋白总量就能测算出血液中糖化血红蛋白占血红蛋白浓度百分比，更具体地说，本发明特别是一种将磁珠分离与酶电极检测相结合的直接测定糖化血红蛋白比例的方法。
背景技术
糖尿病是一组病因和发病机制尚未完全明了的内分泌代谢疾病，目前发病率仅次于心血管疾病和肿瘤。根据医学杂志《The New England Journal of Medicine》(2010年3月份)报道，我国的糖尿病患者数目已达9200万。目前临床已广泛开展检测患者血糖工作，实现了医院大型生化分析仪集中监测和患者使用手持式血糖仪家庭式即时检测的立体网络。但是，血糖测定只是代表即刻的血糖水平，提示患者当时的身体状况，并不能作为评价疾病控制程度的指标。
近车来，糖化血红蛋白(HbA1C)的检测日益受到临床的高度重视。HbA1C是指血液中和葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白。血红蛋白β亚基N端的缬氨酸的氨基与葡萄糖的自由醛基可逆缩合为醛亚胺(席夫碱)，而后醛亚胺发生Amadori重排反应，形成较为稳定的N末端果糖基结构及顺式二醇结构单元。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的糖化血红蛋白含量也会较高。人体内红细胞的寿命一般为120天，在红细胞死亡之前，血液中HbA1C含量也保持相对不变。因此HbA1C水平反应了检测前120天内的平均血糖水平，而与取血时间、病人是否空腹及是否使用胰岛素等因素无关，是判定糖尿病长期控制的良好指标。
常用的糖化血红蛋白检测方法有微柱法离子交换层析、亲和层析、高压液相、免疫凝集、离子捕获法、电泳法等。但是这些检测方法需用大型仪器，必须在医院由专人进行检测，结果需要数天才能反馈给医生和患者，检测极为不便，不能满足即时检测的需求。近年来，便携式糖化血红蛋白分析仪得到了很大发展，例如，美国Bayer公司的A1CNow+糖化血红蛋白测定仪，该仪器利用两条显色试纸条及小型光学分析仪器检测糖化血红蛋白比例；美国Bio-Rad公司的in2it糖化血红蛋白检测仪，该仪器采用硼酸盐亲合色谱法检测糖化血红蛋白比例；挪威Nycocard Reader II分析仪，采用硼酸亲合层析法检测糖化血红蛋白比例。这些方法一般需要进行血红蛋白和糖化血红蛋白两个指标的分别测定，然后计算出糖化血红蛋白的比例。多指标测定不仅使检测设备复杂化、检测成本升高；而且，每个指标的检测误差会累积传递到最终检测结果的误差中，导致最终结果的准确度难以提高。
因此，需要对现有的测定糖化血红蛋白比例的方法进行改进，简化操作，并提高测定结果的精确度。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新颖的测定糖化血红蛋白比例的方法，无需测定血红蛋白总量就能测算出血液中糖化血红蛋白占血红蛋白浓度百分比，以简化操作、降低成本，并提高测定结果的准确性。
为达到上述目的，本发明提供了一种测定糖化血红蛋白比例的方法，该方法是一种将磁珠分离与酶电极检测相结合的直接测定糖化血红蛋白比例的方法。
具体地说，本发明提供的测定糖化血红蛋白比例的方法包括：
在磁珠表面固定血红蛋白抗体，通过抗原-抗体反应将待测样品中的糖化血红蛋白和血红蛋白引入磁珠表面；
将上述引入了糖化血红蛋白和血红蛋白的磁珠与含二茂铁结构单元的硼酸或其衍生物接触，糖化血红蛋白N末端的果糖基含顺式二醇结构，与二茂铁硼酸分子的硼酸基发生成环反应，使磁珠上的糖化血红蛋白与含二茂铁结构单元的硼酸或其衍生物反应形成“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物；
分离磁珠，解离“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”中的二茂铁硼酸；
用含葡萄糖氧化酶的电极测定解离出的二茂铁硼酸，根据其响应电流测算出待测样品中糖化血红蛋白比例。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定糖化血红蛋白比例的方法中，所述的磁珠可以选用现有技术中任何能在其表面固定血红蛋白抗体的磁性微粒。根据本发明的具体实施方案，所述磁珠优选为表面含羧基(-COOH)、羟基(-OH)和/或氨基(-NH2)等可反应基团的磁性微粒。这种微粒其外层一般由高分子聚合物包裹，而含有羧基、羟基或氨基等可反应基团。对于表面含羧基的磁性微粒，可通过EDAC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)和NHS(N-Hydroxysuccinimide)对磁珠表面的羧基进行活化，活化后的羧基与血红蛋白抗体的氨基反应，从而联接固定上抗体。对于表面含羟基的磁性微粒，可以通过氯化氰法活化，活化后的羟基与血红蛋白抗体的氨基反应，从而联接固定上血红蛋白抗体。对于表面含氨基的磁性微粒，可以通过戊二醛交联法联接固定上血红蛋白抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定糖化血红蛋白比例的方法中，所述血红蛋白抗体为既能与血红蛋白免疫亲合反应、又能与糖化血红蛋白免疫亲合反应的抗体。由于血红蛋白与糖化血红蛋白只存在蛋白质分子末端氨基是否糖基化的微小差异，因此结合血红蛋白的抗体一般也能结合糖化血红蛋白。这样的血红蛋白抗体可以商购得到，或者按照现有技术的记载自行制备得到。血红蛋白抗体在磁珠表面的固定化可以参照所属领域中固定其他蛋白的操作进行，本发明中，可以将血红蛋白抗体配制成一定的溶液，加入已活化的磁珠，室温振荡反应即可。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定糖化血红蛋白比例的方法中，所述待测样品为全血样品，该样品经红细胞裂解后释放出糖化血红蛋白和血红蛋白。细胞裂解液一般含有表面活性剂SDS或者胆酸钠等。也可以采用将血液用缓冲液大比例稀释、超声波破碎等方法来裂解红细胞，从而释放血红蛋白和糖化血红蛋白。
将释放出血红蛋白和糖化血红蛋白的样品与表面联接上血红蛋白抗体的磁珠反应，样品用量大于磁珠表面的抗体含量，使磁珠表面的抗体能与样品中过量的抗原反应。血红蛋白和糖化血红蛋白按它们自身在血液中的比例通过抗原-抗体免疫亲合作用而引入到磁珠表面。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定糖化血红蛋白比例的方法中，含二茂铁结构单元的硼酸或其衍生物可以是硼酸基直接接在二茂铁上的化合物，如购自Sigma公司的二茂铁硼酸(Ferroceneboronic acid)；也可以是硼酸基通过其他基团间接接在二茂铁上的化合物，如氨基苯硼酸与二茂铁甲酸缩合形成的化合物二茂铁甲酰氨基苯硼酸、氨基苯硼酸与二茂铁乙酸缩合形成的化合物二茂铁乙酰氨基苯硼酸、氨基苯硼酸与甲基二茂铁甲酸缩合形成的化合物甲基二茂铁甲酰氨基苯硼酸，等。本发明中通过将引入了血红蛋白和糖化血红蛋白的磁珠与二茂铁硼酸或其他含二茂铁结构单元的硼酸衍生物反应，糖化血红蛋白N末端果糖基的顺式二醇结构与硼酸基反应，形成“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物。
根据本发明的具体实施方案，通过磁珠分离，将“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物和反应剩余的二茂铁硼酸分开。在磁珠分离后的“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物中加入其他包含顺式二醇结构的多羟基化合物(这里的“其他包含顺式二醇结构的多羟基化合物”是指除糖化血红蛋白以外的包含顺式二醇结构的多羟基化合物)，例如山梨醇，解离出与糖化血红蛋白结合的二茂铁硼酸。
根据本发明的具体实施方案，可以向解离出的二茂铁硼酸溶液中加入一定浓度的葡萄糖，形成葡萄糖测定液；也可在含顺式二醇结构的多羟基化合物中先加入葡萄糖，再解离“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物，解离后的溶液直接为葡萄糖测定液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定糖化血红蛋白比例的方法中，含葡萄糖氧化酶的电极是指电极表面放置有葡萄糖氧化酶。所述电极可以是丝网印刷电极、磁控溅射电极、玻碳电极、石墨电极、金属电极或其他类型的电极。本发明中是将葡萄糖氧化酶滴加在电极表面、吸附在电极表面、共价结合在电极表面或其他方式放置于电极表面，从而得到本发明的含葡萄糖氧化酶的电极。电极表面置有葡萄糖氧化酶，在二茂铁硼酸的参与下，可以用于葡萄糖浓度的测定。当电极表面放置的葡萄糖氧化酶用量一定和测定液中的葡萄糖浓度一定时，电极响应电流与二茂铁硼酸浓度成正比。电极表面放置的葡萄糖氧化酶用量可以在0.1个活性单位～10个活性单位之间，无严格限制，只要能产生电极可以检测到的酶催化反应信号即可，优选1个活性单位的酶用量。测定液中的葡萄糖浓度可以在5～30mmol/L之间，使酶反应过程中有足够量的底物，优选10mmol/L。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定糖化血红蛋白比例的方法中，用于葡萄糖浓度的测定时，可以将放置有葡萄糖氧化酶的电极插入葡萄糖溶液中测定；也可以将葡萄糖溶液滴加在电极表面测定；还可以在葡萄糖氧化酶电极表面构建虹吸通道，通过虹吸进样方式测定；以及其他的可行的测定方式。
在本发明的一具体实施方式中，在丝网印刷碳工作电极表面放置葡萄糖氧化酶，并贴装虹吸进样通道制成酶电极，并与恒电位仪组成测试系统，对血液样品中的糖化血红蛋白比例进行了测定，充分证明了本发明的方法切实可用于血液中的糖化血红蛋白比例测定。
综上所述，本发明提供了一种无需测定血红蛋白总量就能测算出血液中糖化血红蛋白比例的方法，测定结果具有较高的准确性；本发明的方法在磁珠上进行糖化血红蛋白比例识别和样品处理，具有操作简单的特点；并且，该方法以具有广泛市场基础的葡萄糖氧化酶电极直接测定磁珠处理后试剂，具有成本低廉、易于推广的特点。
附图说明
图1为本发明一具体实施例中测定糖化血红蛋白比例时响应电流与血液样品中的糖化血红蛋白比例的关系图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的测定方法的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，可以按照所属领域熟知的常规条件进行，或按照制造厂商所建议的条件进行，未标明温度的检测过程是在常温操作。
实施例1
取60μl浓度为50mg/ml的Thermo Fisher公司磁珠(产品名：Sera-Mag MagneticSpeedbeads Carboxylate-modified)，该磁珠的粒径为1μm，表面含羧基(-COOH)。用50mM pH＝6.0MES溶液清洗磁珠3次，加入60μl pH＝6.0的MES溶液，加入2.88克EDAC，加入200mg/ml的NHS，加水补至600μl，37℃反应30min，保持磁珠悬浮状态，从而实现磁珠表面羧基的活化。
用600μl pH＝6.0的MES溶液清洗活化后的磁珠3次，弃上清液。加入60μl pH＝6.0的MES溶液，加入33μl浓度为9mg/ml的血红蛋白抗体，补水至溶液总体积为600μl，室温振荡反应4小时，从而实现磁珠表面抗体的联接。所选用的血红蛋白抗体为按照现有技术的常规操作制备的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体(也可选用现有的商购商品)，为IgG1亚类，培养液效价为1∶40000，亲合常数在109～1010M-1之间。
用一块大小为1.5cm×2cm的磁铁贴紧试管管壁，磁珠与反应液分离，磁珠分离后移去上清液，用600μl0.1M PBS清洗磁珠三次，加入600μl 0.1M pH＝7.2PBST(0.05％Tween，1％BSA)封闭过夜，从而实现磁珠表面残余位点的封闭。
取不同糖化血红蛋白百分比的全血样品，用含0.3％SDS的裂解液以1∶50倍处理，再用0.1M pH＝7.2PBS(0.1％Tween)稀释5000倍，取5ml血液处理液。
往5ml血液处理液中加入1.5mg联接上抗体的磁珠，免疫反应30min，从而实现将血红蛋白和糖化血红蛋白引入磁珠表面。
用0.1M pH＝8.0的磷酸盐缓冲液(PB)洗涤上面的磁珠3次，弃上清液。加入600μl5.0μM的二茂铁硼酸溶液，反应30min，形成“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物。
用0.1M pH＝8.0PB洗涤上面的磁珠3次，弃上清液。加入60μl含10mM葡萄糖、1mM山梨醇的PB溶液，反应30min，从而实现二茂铁硼酸从“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物中的解离。取上清液，待测。
葡萄糖氧化酶电极的制备方法为：采用丝网印刷技术在0.25mm厚PET塑料底板上制作尺寸为35mm×6mm的电极组，其中工作电极采用从Acheson(日本)公司购买的导电碳油墨印刷制作，参比电极采用从Acheson(日本)公司购买的银/氯化银印刷油墨制作；在工作电极表面滴加1μl含1000U/ml葡萄糖氧化酶的溶液，自然晾干酶液；用从美国Adhesives Research Inc.公司购买的双面胶片和亲水盖片与PET底板粘合，双面胶片上设有开槽，组成虹吸进样通道。
葡萄糖氧化酶电极和恒电位仪(CHI 6600，上海辰华仪器公司)组成测试系统，测定上面制备的上清液，其响应电流与血液样品中的糖化血红蛋白比例有图1所示的关系，证明本发明的方法可用于血液中的糖化血红蛋白比例测定。
实际应用检测实施例：
从北京华信医院取得两个不同糖化血红蛋白比例的血液样品，经该医院采用的美国Bio-Rad公司的D-10糖化血红蛋白分析仪检测，样品1的糖化血红蛋白比例为6.2％，样品2的糖化血红蛋白比例为12.6％。采用实施例1中的方法对两例血样样品进行检测，得到两例样品的响应电流，用图1的线性相关性方程对响应电流进行换算，得到如下表所示的测定结果。
Figure BDA00002416807300061

Claims (9)

1.一种测定糖化血红蛋白比例的方法，该方法包括：
在磁珠表面固定血红蛋白抗体，通过抗原-抗体反应将待测样品中的糖化血红蛋白和血红蛋白引入磁珠表面；
将上述引入了糖化血红蛋白和血红蛋白的磁珠与含二茂铁结构单元的硼酸或其衍生物接触，使磁珠上的糖化血红蛋白与含二茂铁结构单元的硼酸或其衍生物反应形成“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物；
分离磁珠，解离“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”中的二茂铁硼酸；
用含葡萄糖氧化酶的电极测定解离出的二茂铁硼酸，根据其响应电流测算出待测样品中糖化血红蛋白比例。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磁珠为表面含羧基、羟基(-OH)和/或氨基的磁性微粒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述血红蛋白抗体为既能与血红蛋白免疫亲合反应、又能与糖化血红蛋白免疫亲合反应的抗体，所述在磁珠表面固定血红蛋白抗体的方法包括：
对于表面含羧基的磁性微粒，通过EDAC和NHS对磁珠表面的羧基进行活化，活化后的羧基与血红蛋白抗体的氨基反应，从而联接固定上抗体；
对于表面含羟基的磁性微粒，通过氯化氰法对磁珠表面的羟基活化，活化后的羟基与血红蛋白抗体的氨基反应，从而联接固定上血红蛋白抗体；
对于表面含氨基的磁性微粒，通过戊二醛交联法联接在磁珠表面固定上血红蛋白抗体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品为全血样品，该样品经红细胞裂解后释放出糖化血红蛋白和血红蛋白；将释放出血红蛋白和糖化血红蛋白的样品与表面联接上血红蛋白抗体的磁珠反应，血红蛋白和糖化血红蛋白按它们自身在血液中的比例通过抗原-抗体免疫亲合作用而引入到磁珠表面。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含二茂铁结构单元的硼酸或其衍生物为含二茂铁结构单元的硼酸衍生物为硼酸基直接接在二茂铁上的化合物如二茂铁硼酸；或者为硼酸基通过其他基团间接接在二茂铁上的化合物，如二茂铁甲酰氨基苯硼酸、二茂铁乙酰氨基苯硼酸、甲基二茂铁甲酰氨基苯硼酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述解离“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”中的二茂铁硼酸的步骤包括：
在磁珠分离后的“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物中加入其他包含顺式二醇结构的多羟基化合物，从而解离出与糖化血红蛋白结合的二茂铁硼酸。
7.根据权利要求1或6所述的方法，该方法还包括：
向解离出的二茂铁硼酸溶液中加入一定浓度的葡萄糖，形成葡萄糖测定液；或者在含顺式二醇结构的多羟基化合物中先加入葡萄糖，再解离“磁珠-糖化血红蛋白-二茂铁硼酸”复合物，解离后的溶液直接为葡萄糖测定液；
然后用含葡萄糖氧化酶的电极测定葡萄糖测定液中的二茂铁硼酸，根据其响应电流测算出待测样品中糖化血红蛋白比例。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，含葡萄糖氧化酶的电极是将葡萄糖氧化酶滴加在电极表面、吸附在电极表面、共价结合在电极表面或其他方式放置于电极表面而得到的，其中所述电极选自丝网印刷电极、磁控溅射电极、玻碳电极、石墨电极或金属电极。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，用含葡萄糖氧化酶的电极测定解离出的二茂铁硼酸溶液时，是将放置有葡萄糖氧化酶的电极插入葡萄糖溶液中测定；或是将葡萄糖溶液滴加在电极表面测定；或是在葡萄糖氧化酶电极表面构建虹吸通道，通过虹吸进样方式测定。
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