CN101986156A - 一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附格列苯脲衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜上有用格列苯脲衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线T线，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线，两条线竖向平行排列。其具体步骤：制备人工结合抗原；制备格列苯脲衍生物的单克隆抗体；制成胶体金溶液；获得抗格列苯脲衍生物单克隆抗体的胶体金标记物和金标结合垫。本发明具有特异性强，敏感度高，简便、快速、时效性强，结果显示形象、准确的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方法，属于生物学免疫方法的检测技术领域。
背景技术
格列苯脲是磺脲类口服降血糖药，适用于单用饮食控制疗效不满意的轻、中度非胰岛素依赖型糖尿病，病人胰岛B细胞有一定的分泌胰岛素功能，并且无严重的并发症，用于非胰岛素依赖型（成年型、肥胖型）的糖尿病患者。近几年来，一些不法生产企业为牟取暴利，在未经获得批准的情况下，在治疗糖尿病的中药或是保健品中非法加入价格相对低廉、起效快的格列苯脲等降糖西药是十分普遍的现象，据五个省市对市面上销售的32种宣称具有降糖作用中药及中药保健品进行的抽样化验检查发现，70%的药物中都非法添加有降糖西药成分。格列苯脲的降糖作用为甲苯磺丁脲的100-200倍，治疗量范围大，降糖作用 ，半减期12-14小时，维持时间长，易引起低血糖昏迷，特别是老年人。因为老年人摄食少，抗胰岛素激素如胰高血糖素，肾上腺素分泌反应障碍均可诱发低血糖，再者老年人糖尿病性植物神经病变，急性低血糖症状可以被掩盖，低血糖昏迷如持续6小时以上引起大脑功能损害可能是不可逆的，主要是神经元广泛变性、坏死，大小神经胶质细胞浸润。神经系统中大脑皮质、海马回，小脑、尾状核，苍白球处低血糖最为明显。所以格列苯脲必须由医生处方才可使用。在治疗糖尿病的中药或保健产品非法加入格列苯脲而不标明药物成分和剂量，使得医生和患者都无法预知和掌握可能有的毒副作用，极易导致出现药物不良反应；而一些患者往往会在服用医生治疗用处方药的同时服用保健食品，造成摄入过量药物中毒，加剧病情，严重的甚至危及患者生命。所以，为了保证人民群众的饮食用药安全，我们必须加大力度打击这种现象。然而近年来，不法分子非法生产的手段日趋隐蔽，而且由于中药成分比较复杂，检测难度较大，需要精密的分析仪器和专业技术人员，因而造成监管部门监督抽验成本很大，收效却不甚理想。
发明内容
本发明的目的是为了克服以上的不足，提供一种能快速、灵敏、简便地检测格列苯脲衍生物的格列苯脲胶体金层析检测试纸条及制备方法。
本发明是通过以下技术方案来实现：一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附格列苯脲衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜上有用格列苯脲衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线T线，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线，两条线竖向平行排列。衬板为不吸水的PCV韧性材料。包被膜为硝酸纤维素膜，或混合纤维素膜。吸水垫为植物纤维棉纸。格列苯脲衍生物的金标抗体为胶体金标记的抗格列苯脲衍生物的单克隆抗体复合物，偶联格列苯脲衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。
一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条的制备方法，制备偶联格列苯脲衍生物的载体牛血清白蛋白BSA，用于制备相应的检测线T线；制备偶联格列苯脲衍生物的载体鸡卵清白蛋白，用于制备单克隆抗体，制备格列苯脲衍生物金标抗体，用于制备吸附格列苯脲衍生物金标抗体的聚酯纤维毡；制备羊抗鼠IgG抗体，用于制备对照线C线，包括如下步骤：
（A）将格列苯脲衍生物与载体牛血清白蛋白BSA/鸡卵清白蛋白OVA进行偶联制备人工合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亚胺（EDC）：往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺（DMF）及那非类原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺（DMF）完全溶解后，快速称取浓度为 60%的氢化钠（NaH），并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；将无水乙醇和上述步骤所得的烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至pH值为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺（EDC）；
b、生成人工合成抗原：将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、二甲基甲酰胺（DMF）、半抗原化合物平衡至室温；取上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为：半抗原化合物：水溶性碳化二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺=1：8-12：13-16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤中所得的二甲基甲酰胺溶解，为保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的溶液记为二号反应液；当所述水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液（BSA / OVA），将载体蛋白与硼酸缓冲液按1:0.15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液；将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3-5℃条件下避光搅拌，待反应完全后，生成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为：1:15-25；等所有反应结束后，将四号反应液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋中还装有0.01-0.02M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0-7.5，将透析袋在3-5℃的条件下进行透析，每隔3-5小时换一次磷酸盐缓冲液；经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合成抗原。
（B）将人工合成抗原OVA按常规方法免疫制备格列苯脲衍生物的单克隆抗体细胞株，用Babc小鼠免疫制备抗体腹水，将腹水纯化得到高纯度的单克隆抗体蛋白，测定蛋白浓度，备胶体金标记用；
（C）用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；
（D）用0.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液至最适PH值（8.5-9.0），将适量纯化的单克隆抗体纯水透析（4hr）后，加入胶体盆中，室温电磁搅拌（15-30min），逐滴加入1%络蛋白溶液，使络浓度为0.1%，持续搅拌5min，4℃下15000rpm离心10min，弃去上清去沉淀物，将沉淀物用重悬液重新恢复至原体积混匀，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20,4℃保存备用，即获得抗格列苯脲衍生物单克隆抗体的胶体金标记物，重悬液为含5%海藻的0.02Tris-HCL缓冲液；
（E）将1：20-1:10稀释的格列苯脲衍生物胶体进标记抗体喷涂吸附于聚酯纤维毡中，27℃保温干燥，制备格列苯脲衍生物金标结合垫；
（F）在包被膜上用格列苯脲衍生物偶联的载体牛血清白蛋白BSA溶液包被直线式检测线T线，用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线，两条线竖向平行排列；
（G）试纸条的组装：将样品垫、金标组合垫、包被膜和吸水垫依次粘附在衬板上，样品垫置于衬板的一端，吸水垫置于衬板的另一端，包被膜置于衬板的中间，金标结合垫置于样品垫和包被膜之间，即得到用于免疫检测的格列苯脲衍生物胶体金层析检测试验纸大板，将大板按顾客要求分切成2.5mm-7.0mm宽度规格的试纸条，密封干燥保存。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高特异性高亲和力静电吸附的单克隆抗体为基础制备而成。
2、简便、快速、时效性强，使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，将样品用提取液混合后，取上清液进行检测，在5min即可判定检测结果。
3、结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线T线和C线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线C线时， 表示在被检样品中含有被检物，显示两条红色线T线和C线时，表示在被减样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确、简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
4、制备方法采用喷涂工艺，简单快速，喷涂均匀，干燥快。
附图说明：
图1为本发明的剖面结构示意图；
图2为本发明的俯视结构示意图；
图中标号：1-衬板、2-样品垫、3-金标结合垫、4-包被膜、5-吸水垫、6-T线、7-C线。
具体实施方式：
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
如图1、图2所示一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，由衬板1和在衬板1上依次衔接的样品垫2、金标结合垫3、包被膜4和吸水垫5组成，金标结合垫3为吸附格列苯脲衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜4上有用格列苯脲衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线T线6，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线7，两条线竖向平行排列。衬板1为不吸水的PCV韧性材料。包被膜4为硝酸纤维素膜，或混合纤维素膜。吸水垫5为植物纤维棉纸。格列苯脲衍生物的金标抗体为胶体金标记的抗格列苯脲衍生物的单克隆抗体复合物，偶联格列苯脲衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。制备偶联格列苯脲衍生物的载体牛血清白蛋白BSA，用于制备相应的检测线T线6；制备偶联格列苯脲衍生物的载体鸡卵清白蛋白，用于制备单克隆抗体，制备格列苯脲衍生物金标抗体，用于制备吸附格列苯脲衍生物金标抗体的聚酯纤维毡；制备羊抗鼠IgG抗体，用于制备对照线C线7，包括如下步骤：
（A）将格列苯脲衍生物与载体牛血清白蛋白BSA/鸡卵清白蛋白OVA进行偶联制备人工合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亚胺（EDC）：往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺（DMF）及那非类原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺（DMF）完全溶解后，快速称取浓度为 60%的氢化钠（NaH），并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；将无水乙醇和上述步骤所得的烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至pH值为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺（EDC）；
b、生成人工合成抗原：将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、二甲基甲酰胺（DMF）、半抗原化合物平衡至室温；取上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为：半抗原化合物：水溶性碳化二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺=1：8-12：13-16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤中所得的二甲基甲酰胺溶解，为保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的溶液记为二号反应液；当所述水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液（BSA / OVA），将载体蛋白与硼酸缓冲液按1:0.15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液；将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3-5℃条件下避光搅拌，待反应完全后，生成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为：1:15-25；等所有反应结束后，将四号反应液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋中还装有0.01-0.02M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0-7.5，将透析袋在3-5℃的条件下进行透析，每隔3-5小时换一次磷酸盐缓冲液；经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合成抗原。
（B）将人工合成抗原OVA按常规方法免疫制备格列苯脲衍生物的单克隆抗体细胞株，用Babc小鼠免疫制备抗体腹水，将腹水纯化得到高纯度的单克隆抗体蛋白，测定蛋白浓度，备胶体金标记用；
（C）用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；
（D）用0.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液至最适PH值（8.5-9.0），将适量纯化的单克隆抗体纯水透析（4hr）后，加入胶体盆中，室温电磁搅拌（15-30min），逐滴加入1%络蛋白溶液，使络浓度为0.1%，持续搅拌5min，4℃下15000rpm离心10min，弃去上清去沉淀物，将沉淀物用重悬液重新恢复至原体积混匀，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20,4℃保存备用，即获得抗格列苯脲衍生物单克隆抗体的胶体金标记物，重悬液为含5%海藻的0.02Tris-HCL缓冲液；
（E）将1：20-1:10稀释的格列苯脲衍生物胶体进标记抗体喷涂吸附于聚酯纤维毡中，27℃保温干燥，制备格列苯脲衍生物金标结合垫3；
（F）在包被膜4上用格列苯脲衍生物偶联的载体牛血清白蛋白BSA溶液包被直线式检测线T线6，用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线7，两条线竖向平行排列；
（G）试纸条的组装：将样品垫2、金标组合垫3、包被膜4和吸水垫5依次粘附在衬板1上，样品垫2置于衬板1的一端，吸水垫5置于衬板1的另一端，包被膜4置于衬板1的中间，金标结合垫3置于样品垫2和包被膜4之间，即得到用于免疫检测的格列苯脲衍生物胶体金层析检测试验纸大板，将大板按顾客要求分切成2.5mm-7.0mm宽度规格的试纸条，密封干燥保存。
格列苯脲胶体金层析试纸条的检测反应原理： 格列苯脲属于小分子物质。本发明采用竞争法，即样品中的格列苯脲和固定在包被膜4上的包被抗原M2-BSA竞争胶体进标记的抗格列苯脲单克隆抗体。当试纸条以样品垫2末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解金标垫上干燥的金标抗体，若待测样品中不存在待测药物，则金标抗体会直接泳动到检测线和硝酸纤维膜上的M2-BSA发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，形成红色线条，然后其他未结合的金标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与对照线上的羊抗鼠二抗发生第二次免疫反应，同样形成红色线条，这样包被膜4上就会有两条红色线条，表示样品为阴性。若待测样品中存在待测药品，则金标抗体首先会和样品中的检测物发生免疫反应，当未发生反应的金标抗体有剩余时，才会在检测线上与M2-BSA发生免疫反应，形成红色线条，其颜色强度弱于阴性时的线条强度；而当金标抗体全部和样品中的格列苯脲发生免疫结合时，就不会再有抗体与对照线包被原结合，从而检测线就不会有红色线条出现。对照线是为检验金标免疫层析方法本身是否存在待测药物，对照线都应该显现。如果对照线不显色，则说明试纸否有效而设定的，所以无论样品中是条失效。
本发明特异性强，敏感度高，检出最低限量可达到5ppb；简便、快速、时效性强，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果；结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广。
Claims (6)
1.一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：由衬板（1）和在衬板（1）上依次衔接的样品垫（2）、金标结合垫（3）、包被膜（4）和吸水垫（5）组成，金标结合垫（3）为吸附格列苯脲衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜（4）上有用格列苯脲衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线T线（6），和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线（7），两条线竖向平行排列。
2.根据权利要求1所述一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：所述衬板（1）为不吸水的PCV韧性材料。
3.根据权利要求1或2所述一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：所述包被膜（4）为硝酸纤维素膜，或混合纤维素膜。
4.根据权利要求1所述一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：所述吸水垫（5）为植物纤维棉纸。
5.根据权利要求1所述一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，特征在于：格列苯脲衍生物的金标抗体为胶体金标记的抗格列苯脲衍生物的单克隆抗体复合物，所述偶联格列苯脲衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。
6.一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于：制备偶联格列苯脲衍生物的载体牛血清白蛋白BSA，用于制备相应的检测线T线（6）；制备偶联格列苯脲衍生物的载体鸡卵清白蛋白，用于制备单克隆抗体，制备格列苯脲衍生物金标抗体，用于制备吸附格列苯脲衍生物金标抗体的聚酯纤维毡；制备羊抗鼠IgG抗体，用于制备对照线C线（7），包括如下步骤：
（A）将格列苯脲衍生物与载体牛血清白蛋白BSA/鸡卵清白蛋白OVA进行偶联制备人工合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亚胺（EDC）：往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺（DMF）及那非类原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺（DMF）完全溶解后，快速称取浓度为 60%的氢化钠（NaH），并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；将无水乙醇和上述步骤所得的烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至pH值为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺（EDC）；
b、生成人工合成抗原：将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、二甲基甲酰胺（DMF）、半抗原化合物平衡至室温；取上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为：半抗原化合物：水溶性碳化二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺=1：8-12：13-16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤中所得的二甲基甲酰胺溶解，为保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的溶液记为二号反应液；当所述水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液（BSA / OVA），将载体蛋白与硼酸缓冲液按1:0.15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液；将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3-5℃条件下避光搅拌，待反应完全后，生成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为：1:15-25；等所有反应结束后，将四号反应液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋中还装有0.01-0.02M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0-7.5，将透析袋在3-5℃的条件下进行透析，每隔3-5小时换一次磷酸盐缓冲液；经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合成抗原；
（B）将人工合成抗原OVA按常规方法免疫制备格列苯脲衍生物的单克隆抗体细胞株，用Babc小鼠免疫制备抗体腹水，将腹水纯化得到高纯度的单克隆抗体蛋白，测定蛋白浓度，备胶体金标记用；
（C）用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；
（D）用0.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液至最适PH值（8.5-9.0），将适量纯化的单克隆抗体纯水透析（4hr）后，加入胶体盆中，室温电磁搅拌（15-30min），逐滴加入1%络蛋白溶液，使络浓度为0.1%，持续搅拌5min，4℃下15000rpm离心10min，弃去上清去沉淀物，将沉淀物用重悬液重新恢复至原体积混匀，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20,4℃保存备用，即获得抗格列苯脲衍生物单克隆抗体的胶体金标记物，所述重悬液为含5%海藻的0.02Tris-HCL缓冲液；
（E）将1：20-1:10稀释的格列苯脲衍生物胶体进标记抗体喷涂吸附于聚酯纤维毡中，27℃保温干燥，制备格列苯脲衍生物金标结合垫（3）；
（F）在包被膜（4）上用格列苯脲衍生物偶联的载体牛血清白蛋白BSA溶液包被直线式检测线T线（6），用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线（7），两条线竖向平行排列；
（G）试纸条的组装：将样品垫（2）、金标组合垫（3）、包被膜（4）和吸水垫（5）依次粘附在衬板（1）上，样品垫（2）置于衬板（1）的一端，吸水垫（5）置于衬板（1）的另一端，包被膜（4）置于衬板（1）的中间，金标结合垫（3）置于样品垫（2）和包被膜（4）之间，即得到用于免疫检测的格列苯脲衍生物胶体金层析检测试验纸大板，将大板按顾客要求分切成2.5mm-7.0mm宽度规格的试纸条，密封干燥保存。
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2010
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